專利名稱：Ret寡核苷酸微芯片及其用于檢測遺傳性癌癥的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用于檢測RET基因突變熱點區(qū)中突變的RET寡核苷酸微芯片，其生產(chǎn)方法及其用于檢測遺傳性癌癥的方法。
為了檢驗高風險家族成員的種系突變，研制出一種寡核苷酸微芯片(下文稱為“寡芯片(寡芯片)”)。它被用于檢驗高風險家族成員中是否存在種系突變，早期檢測遺傳性癌癥，并為種系突變成員提供一種正規(guī)的醫(yī)學治療方法。該檢驗的結果還緩解了無種系突變家族成員對癌癥的恐懼心理。
通常，該技術涉及實驗寡核苷酸與固定在固體基質，即玻璃片或凝膠表面的寡核苷酸雜交。該寡核苷酸涂布的固體基質可以用以下兩種方法制備直接在固體基質表面合成寡核苷酸，或者在固體基質表面固定預先合成的寡核苷酸。前者應用一種光刻寡核苷酸合成技術承載光保護羥基的表面通過光刻掩蔽照射，在光脫保護區(qū)產(chǎn)生游離羥基，然后，該羥基與脫氧核糖核苷氨基亞磷酸酯偶聯(lián)(Pease，A.C.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 915022～5026，1994)。
在后面的方法中，將攜帶均聚物尾巴的寡核苷酸和末端脫氧核糖核苷酰轉移酶點到尼龍膜上，通過UV照射共價結合(Saiki，R.K.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 866230～6234，1989)。還報道了一種改進方法，其在膜的羧基和結合到寡核苷酸5′端的氨基接頭之間形成酰胺鍵，以避免當應用加熱或紫外照射時導致的非特異性固定(Zhang，Y.等，Nucleic Acids Res.193929～3933，1991)。
放射性標記或無標記的目的DNA與上述制備的DNA芯片的雜交方法已經(jīng)成功用于檢測RAS點突變、囊性纖維化刪除和各種點突變，以及DNA測序(Cantor，C.R.等，Genomics 131378～383，1992)。它還曾被用于檢測基因突變和研究基因多態(tài)型(Lipshutz，R.J.等，Biotechniques19442～447，1995)。而且，該技術期望對有效確定腫瘤形成和HLA基因型以及診斷遺傳性疾病提供一種有力的工具(Saiki，R.K.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 866230～6234，1989)。
然而，用于檢測基因突變的寡芯片不容易生產(chǎn)，因此，僅有很少一部分寡芯片商業(yè)化，例如Affymetrix(Santa Clara，CA 95051)，并且它們的應用僅限于檢測很少幾個基因的突變，例如p53、ATM和BRCA1。Affymetrix銷售的寡芯片應用光刻法直接將寡核苷酸合成到固體基質表面生產(chǎn)。然而，該寡芯片存在一些問題，例如其生產(chǎn)成本較高；需要應用昂貴的設備；不可能在固體基質表面固定純化的高質量寡核苷酸；固體基質表面產(chǎn)生的雜交產(chǎn)物的量不足以定量分析。
另一方面，2型多發(fā)性內分泌瘤(MEN2)綜合癥以常染色體顯性方式遺傳，并具有高度滲透性。它還有三種亞型，即MEN2A、MEN2B和FMTC(家族性甲狀腺髓樣癌)，RET基因的突變在MEN2綜合癥中發(fā)揮重要作用在95％以上的MEN2病例中，觀察到RET基因的9個密碼子(密碼子609、611、618、620、630、634、768、804和918)之一發(fā)生錯義突變。為了考察RET基因的這些突變熱點區(qū)是否存在突變，應用了一些工具例如SSCP(單鏈構象多態(tài)型)、PTT(蛋白質截斷實驗)、以及基于凝膠的測序。然而，這些工具相對費時費力，因此有必要研究一種改進的方法。
因此本發(fā)明試圖研究以符合上述需要，研制了一種RET寡芯片，它通過用自動微點陣儀將寡核苷酸固定到固體基質表面生產(chǎn)，該寡核苷酸被設計用于檢測RET基因的突變熱點區(qū)的錯義突變。本發(fā)明的RET寡芯片還能夠用于研究與RET基因有關的信號傳導基質和腫瘤發(fā)生。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明的一個目的在于提供一種RET寡芯片，其可以用作檢測RET基因突變和遺傳性癌癥的快速可靠的遺傳診斷設備。
按照本發(fā)明的一方面，提供了一種用于檢測RET突變的RET寡核苷酸微芯片，其包括固定在固體基質表面的多種寡核苷酸，其中所述寡核苷酸被設計用于檢測RET基因突變熱點區(qū)的錯義突變。
按照本發(fā)明的另一方面，提供了一種應用所述微芯片檢測遺傳性癌癥的方法。
圖1本發(fā)明RET寡芯片的外觀；圖2本發(fā)明RET寡芯片的一個實施例，它在一個3.7cm×7.6cm的玻璃表面印刻了總共268個寡核苷酸點；圖3用于通過分析雜交反應后來自各寡核苷酸點的信號強度確定極限值的Sigma曲線(SigmaPlot)，其中實線表示極限值，虛線表示背景的平均值；圖4應用本發(fā)明的RET寡芯片檢測各密碼子中是否存在RET基因突變，a在外顯子10(密碼子609、611、618、和620)和外顯子11(密碼子630和634)上的雜交b在外顯子13(密碼子768)和外顯子14(密碼子804)上的雜交發(fā)明詳述本發(fā)明提供了一種用于檢測RET突變的RET寡核苷酸微芯片，它包括用自動微點陣儀固定到固體基質表面的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸能夠檢測RET基因突變熱點區(qū)上的錯義突變。
首先，寡核苷酸被設計用于檢測8個密碼子(密碼子609、611、618、630、634、768、和804)上可產(chǎn)生的錯義突變型和一個密碼子918上的錯義突變型。
如上所述，RET基因是形成REN2綜合癥的原因，REN2綜合癥以常染色體顯性方式遺傳并具有高度滲透性和多種臨床表征。主要的RET突變限于9個密碼子(密碼子609、611、618、620、630、634、768、804和918)的錯義突變。MEN2綜合癥具有3個亞型2A型多發(fā)性內分泌瘤(MEN2A)、MEN2B、和家族性甲狀腺髓樣癌(FMTC)。已經(jīng)鑒定在MEN2A家族中外顯子10(密碼子609、611、618、和620)和外顯子11(密碼子630和634)有98％的錯義突變，在FMTC家族中有85％的錯義突變。已知密碼子768和804的錯義突變是5～10％ FMTC病例的病因。另外，外顯子16(密碼子918)的錯義突變在95％的MEN2B病例中發(fā)現(xiàn)。
本發(fā)明提供了各種能夠用于檢測上述RET基因突變熱點區(qū)錯義突變的寡核苷酸，這些錯義突變在所有檢查病例中的發(fā)生幾率超過了95％。因此，本發(fā)明的RET寡芯片以大于95％的可信度檢測突變是可能的。另外，因為本發(fā)明的RET寡芯片中使用的寡核苷酸被設計用來檢測8個密碼子上的所有可能錯義突變，因此檢測這些密碼子上尚未發(fā)現(xiàn)的任何錯義突變也是可能的。在密碼子918，發(fā)生的主要突變是Met→Thr型突變，因此，本發(fā)明使用的寡核苷酸被設計用來檢測這種類型突變。也就是說，本發(fā)明人將基因特征考慮在內特別設計了用于檢測RET基因熱點區(qū)突變的寡核苷酸，本發(fā)明的RET寡芯片在檢測RET基因突變時具有更高的準確性和效率。
按照本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明的RET寡芯片具有67種點樣并固定到固體基質表面的上的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸能夠檢測RET基因9個熱點上的各種錯義突變。每個寡核苷酸水平點樣4次，以增加測量信號的準確性，結果如表1、圖1和圖2所示。首先點1和50位，然后點26到50位，最后點51到67位。1和50位分別是外顯子10和11的陽性對照。其它寡核苷酸為2-33是外顯子10(密碼子609、611、618、和、620)；34-49是外顯子11(密碼子630和634)；51-58是外顯子13(密碼子768)；59-65是外顯子14(密碼子804)；和66-67是外顯子16(密碼子918)。
具體地說，對于密碼子609、611、618、620、630、634、和768，點了具有7種錯義突變的寡核苷酸(M)和一種野生型寡核苷酸(W)；對于密碼子804，點了具有6種錯義突變的寡核苷酸(M)和一種野生型寡核苷酸(W)；對于密碼子918，點了具有主要突變類型的寡核苷酸(M)和一種野生型寡核苷酸(W)。為了說明得更具體，用于密碼子609、611、618、620、630、和634的是7種如下取代得到的寡核苷酸分別用CGC(精氨酸)、AGC(絲氨酸)、GGC(甘氨酸)、TTC(苯丙氨酸)、TAC(酪氨酸)、TCC(絲氨酸)和TGG(色氨酸)取代TGC(半胱氨酸)。用于密碼子768的是7種如下取代得到的寡核苷酸分別用CAG(谷氨酰胺)、AAG(賴氨酸)、GCG(丙氨酸)、GGG(甘氨酸)、GTG(纈氨酸)、GAC(天冬氨酸)和GAT(天冬氨酸)取代GAG(谷氨酸)。對于密碼子804，使用6種突變的寡核苷酸分別用CTG(亮氨酸)、ATG(蛋氨酸)、TTG(亮氨酸)、GAG(谷氨酸)、GCG(丙氨酸)和GGG(甘氨酸)取代GTG(纈氨酸)。密碼子918的突變體是用ACC(蘇氨酸)取代ATG(蛋氨酸)得到的寡核苷酸。
為各個密碼子都設計了一種野生型寡核苷酸(W)，用于直接與突變型比較。例如，對于密碼子618，點了8個寡核苷酸，一個用于檢測正常堿基序列，其余的檢測突變的堿基序列?？偣矠?個熱點密碼子上的56種錯義突變型設計了56個突變寡核苷酸和用于野生型和陽性對照的11個寡核苷酸(參見表1a和1b)。設計的陽性對照是針對大多數(shù)突變已經(jīng)被鑒定出來的外顯子10和11的。
SEQ ID Nos.4、20、和44中分別描述的三種寡核苷酸被設計具有16個堿基的較短長度而不是20個堿基。初步實驗表明當使用20個堿基的寡核苷酸時，常發(fā)生某些G-A錯配(4、20、和44位)，從而表現(xiàn)出非特異性信號。例如，在SEQ ID Nos.4(-GGC-)和8(-TGC-)中描述的寡核苷酸情況下，樣品DNA中的互補序列(-ACG)原則上僅與SEQ ID No.8的寡核苷酸雜交。然而，也可能與表現(xiàn)G-A錯配恒定結合親合力水平的SEQ ID No.4的寡核苷酸非特異性雜交。據(jù)報道，G-T和G-A錯配略微使雙鏈不穩(wěn)定，而A-A、T-T、C-T、和C-A錯配導致顯著不穩(wěn)定(IkutaS.等，Nucleic Acids Res.15797-811，1987)。還報道提高清洗溫度能夠清晰分辨精確匹配雙鏈與錯配雙鏈(Ikuta S.等，Nucleic Acids Res.15797-811，1987)，當室溫為約60℃時，則不可能充分分辨特異性信號與非特異性信號。因此，為了減少本發(fā)明中由于非特異性雜交導致的實驗誤差，寡核苷酸的長度在三個情況下(4、20、和44位)從20個堿基減少到16個堿基，以便降低G-A錯配導致的不穩(wěn)定作用。這些16個堿基的寡核苷酸用精確匹配寡核苷酸分析。
可以利用包括以下步驟的方法，用自動微點陣儀將多達67個寡核苷酸固定到固體基質表面生產(chǎn)本發(fā)明的RET寡芯片1)在微量點樣溶液中混合每一種寡核苷酸，然后分配到平板的孔中；2)用微點陣儀將寡核苷酸點到固體基質表面；3)將寡核苷酸固定到固體基質表面，并清洗；4)將固體基質浸泡到95℃水中，使固定的寡核苷酸變性，然后用硼氫化鈉溶液處理固體基質；和5)清洗并干燥固體基質。
步驟(1)中使用的每種寡核苷酸優(yōu)選具有功能基團，該基團可以用于與固體基質表面形成穩(wěn)定的結合。例如，各寡核苷酸可以連接有含5’氨基功能的12碳間隔區(qū)，例如H2N-(CH2)12-寡核苷酸。該氨基可與固體基質表面的醛基發(fā)生Schiff堿反應，在其間形成牢固結合。12碳間隔區(qū)通過促進寡核苷酸和熒光標記的目的DNA之間接觸，而增強雜交速率。
步驟(1)中使用的微量點樣溶液可以含有適當?shù)柠}和聚合物，以便有利于將寡核苷酸點到固體基質上。
步驟(2)中使用的固體基質可以用玻璃、改良硅膠、塑料盒、或聚合物例如聚碳酸酯或其凝膠制得。固體基質表面可以涂布化合物，其有助于寡核苷酸與基質底物結合?？梢杂糜谕坎嫉膬?yōu)選化合物具有例如醛基或氨基這樣的功能基團。在一個優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明使用了一個用乙醛涂布的玻璃片。
按照步驟(1)和(2)的一個實施方式，將總共268種寡核苷酸用自動針式微點陣儀以指定方式排列到固體基質上。各寡核苷酸點優(yōu)選為直徑100到500μm的圓形。固體基質的優(yōu)選實施例是尺寸約為3.7cm×7.6cm的玻璃片，該玻璃片可以容納約100到10000個點。優(yōu)選地，可以將總共268種寡核苷酸點，直徑各自為130μm，以300μm的間隔排列成多列和多排(參見圖2)。
在步驟(3)中，通過在寡核苷酸的氨基和固體基質的醛基之間經(jīng)Schiff堿反應形成共價鍵的方式，將寡核苷酸固定到固體基質表面。游離未反應的寡核苷酸用SDS、SSC、SSPE等從固體基質上清洗除去。
在步驟(4)中，將固定的寡核苷酸變性，通過硼氫化鈉處理減少和滅活保留在固體基質上的未反應醛基。
通過上述方法生產(chǎn)的本發(fā)明的RET寡芯片可以有利地檢測基因突變，本發(fā)明的方法比任何常規(guī)基因突變檢測方法更簡單、更經(jīng)濟用這些常規(guī)方法例如SSCP(單鏈和構象多態(tài)型)、PTT(蛋白質截斷實驗)、RFLP(限制性片段長度多態(tài)型)、克隆、直接測序等檢查是否存在基因突變平均須花費幾天到數(shù)月。然而，當使用本發(fā)明的RET寡芯片分析RET基因突變的DNA樣品僅花費不到9小時。另外，本發(fā)明的RET寡芯片可以以比常規(guī)芯片更少的生產(chǎn)成本更簡單地生產(chǎn)。一旦合成所需的寡核苷酸后，可以大量生產(chǎn)本發(fā)明的玻璃片。使用本發(fā)明的RET寡芯片所需的試劑量遠遠少于任何常規(guī)方法中所需的試劑量本發(fā)明的RET寡芯片用針式微點陣儀可容易地生產(chǎn)，而現(xiàn)有的Affymetrix寡芯片必須用復雜和昂貴的光刻技術制備。
另外，用本發(fā)明的RET寡芯片純化和修飾寡核苷酸是可能的，相比較而言，通過在固體基質表面直接合成寡核苷酸制備的Affymetrix寡芯片不可能純化或修飾寡核苷酸。因此，本發(fā)明的RET寡芯片能夠提供比以前可能得到的更好的實驗準確度。
本發(fā)明提供了一種用RET寡芯片檢測遺傳性癌癥的方法，包括以下步驟1)從受試患者的血液制備熒光標記的DNA樣品；2)使標記的DNA樣品與RET寡芯片上的寡核苷酸點反應；3)清洗反應后的寡芯片，除去未結合的樣品DNA；4)用熒光讀數(shù)儀檢測特定寡核苷酸點的雜交模式；和
5)檢查是否存在基因突變。
在步驟(1)中，通過將熒光染料加入到從受試患者得到的血液DNA樣品中制備DNA樣品?？梢詰眠m當軟件用熒光讀數(shù)儀分析熒光染料標記的DNA與寡芯片上某寡核苷酸點的雜交。優(yōu)選的熒光染料包括，但不限于Cy5和Cy3。
在步驟(2)中，將步驟(1)中制備的熒光染料標記的DNA樣品與雜交溶液混合，然后轉移到各種寡核苷酸點中。在45～60℃、水蒸汽飽和的保溫箱中進行雜交反應3-9小時。然后清洗寡芯片，除去未結合的樣品DNA，并干燥(步驟3)，應用合適的軟件用熒光讀數(shù)儀分析產(chǎn)生的熒光(步驟4)。在步驟(5)中，在99％可靠范圍內設置一個最大值作為極限值，認為熒光值高于極限值的任何信號對于突變的存在是陽性的。
本發(fā)明的RET寡芯片可以有效地用于診斷諸如MEN2A、MEN2B、FMTC等的遺傳性癌癥。因為RET基因屬于受體酪氨酸激酶家族，在細胞信號轉導途徑中起作用，因此本發(fā)明的RET寡芯片可以用作研究癌癥細胞的有效診斷工具。
下述實施例和實驗例僅為說明的目的提供，并不是想限制本發(fā)明的范圍。實施例1用RET寡芯片檢查RET突變(步驟1) RET寡芯片的生產(chǎn)如下生產(chǎn)67種寡核苷酸，設計用于檢測RET基因的9個突變熱點密碼子上的共56種錯義突變(表1a和1b)。SEQ ID Nos.1和50中描述的寡核苷酸10-PC和11-PC為陽性對照，SEQ ID Nos.9、17、25、33、41、49、58、65、和67中描述的寡核苷酸為野生型。其它寡核苷酸各自在一個熱點密碼子上存在SEQ ID Nos.2到8描述的寡核苷酸在密碼子609上有錯義突變；SEQ ID Nos.10到16描述的寡核苷酸在密碼子611上有錯義突變；SEQ ID Nos.18到24描述的寡核苷酸在密碼子618上有錯義突變；SEQ ID Nos.26到32描述的寡核苷酸在密碼子620上有錯義突變；SEQ ID Nos.34到40描述的寡核苷酸在密碼子630上有錯義突變；SEQ ID Nos.42到48描述的寡核苷酸在密碼子634上有錯義突變；SEQ ID Nos.51到57描述的寡核苷酸在密碼子768上有錯義突變；SEQID Nos.59到64描述的寡核苷酸在密碼子804上有錯義突變；和SEQ IDNo.66描述的寡核苷酸在密碼子918上有錯義突變。<表1a>
<表1b>
a陽性對照；b突變的；c氨基酸；d野生型所有67個寡核苷酸，各自具有一個5’-末端用可與醛基發(fā)生Schiff堿反應的氨基殘基修飾的12碳間隔區(qū)，從MWG-Biotech(Ebrsberg，德國)得到，然后固定到玻璃片上。每種寡核苷酸各20pmole/μl，與微量點樣溶液(TeleChem International Inc，Sunnyvale，CA)混合，混合比例為1∶1，得到的寡核苷酸10pmol/μl的終體積，將每種寡核苷酸各40μl轉移到96孔平板上。當將該96孔平板置于針式微點陣儀(Microsys 5100 Cartesian，Cartesian Technologies Inc，Irvine，CA)后，將各寡核苷酸印跡到醛基涂布的玻璃片上(26×76×1mm，CEL Associates Inc，Houston，TX)。每點直徑130μm，以300μm的間隔多列多排排列。點印寡核苷酸的玻璃片用0.2％ SDS清洗兩次，然后用蒸餾水清洗一次。將玻璃片浸泡到熱水(95℃)中，使寡核苷酸變性，然后放入硼氫化鈉溶液5分鐘，使未反應的醛基失活。然后，用0.2％ SDS清洗玻璃片2次，用蒸餾水洗一次，離心，干燥。(步驟2)DNA樣品的制備從與5個MEN2A家族有關的23位個體采集學樣(表2)。23位中22位(SNU-MEN1A-I，II，III，IV)經(jīng)常規(guī)方法確認為MEN2A患者，剩余的一位(SNU-MEN2A-V)是未知受試者。<表2>
在表2中，術語“受影響成員”指表現(xiàn)MEN2A臨床癥狀的MEN2A患者，術語“基因攜帶者”指未表現(xiàn)MEN2A臨床癥狀的突變RET基因攜帶者。
用Ficoll-Paque(Amersham Pharmacia-biotech Ltd，Uppsala，Sweden)和TRI試劑(Molecular Research Center，Cincinati，OH)，按照生產(chǎn)商的說明，提取各血樣中的總基因組DNA。為了產(chǎn)生熒光標記的DNA樣品，用提取出的DNA作為模版和SEQ ID Nos.68到77中描述的5對引物(MWG-Biotech，Ebersberg，Germany)進行PCR擴增(表3)。按照Takiguchi-Shirahama，S.等，Hum.Genet.95187-190，1995的描述使用外顯子10和11的PCR引物，按照Shuffenecker I.等，Am.J.Hum.Genet.62233-237，1997的描述使用外顯子14的PCR引物，按照Karaga，H.J.等，Eur.J.Endocrinol.139410-415，1998的描述使用外顯子13和16的PCR引物。PCR反應液的組成為100ng基因組DNA、10pmol各種引物、40μM dCTP、20μM熒光染料Cy5-dCTP(MEN)或Cy3-dCTP(Amersham-biotech Ltd.，Buckinghamshire，UK)，體積為25μl。在程序化熱循環(huán)儀(Perkin Elmer Cetus 9600；Roche Molecular Systems，Inc.，NJ)中，94℃變性5分鐘開始反應。PCR條件為94℃30秒、60℃30秒、和72℃1分鐘，循環(huán)35次，最后在72℃延長7分鐘。每種外顯子單獨擴增。PCR擴增后，用純化試劑盒(Qiagen Inc，Valencia，CA)純化Cy5-或Cy3-標記的PCR產(chǎn)物，然后用0.25 U DNase I(Takara，Shiga，Japan)在25℃消化10分鐘。剩余的酶在95℃滅活10分鐘，并通過上述純化程序除去，收集Cy5-或Cy3-標記的DNA樣品。<表3>
(步驟3)雜交反應和分析將步驟(2)中制備的各外顯子的Cy5-或Cy3-標記的DNA樣品單獨混合，然后重懸浮于預熱的1×UniHyb溶液(TeleChem International Inc，Sunnyvale，CA)中，至體積為2～4μl。將2μl混合的DNA樣品滴到步驟(1)制備的玻璃片上，然后用一塊蓋玻片覆蓋這塊玻璃片。將這塊玻璃片在飽和蒸汽試管中于60℃保溫3小時進行雜交反應。將該雜交后的玻璃片置于2×SSC+0.2％ SDS緩沖液中室溫下漂洗10～30分鐘，然后，在蒸餾水中漂洗5分鐘，隨后離心和干燥。用ScanArray Lite(ParkardInstrument Co，Meriden，CT)掃描玻璃片，用定量微點陣分析軟件(QuantArray，version 2.0)分析。為了確定極限值，所有數(shù)據(jù)用Sigma Plot(SPSS Inc.，San Rafael，CA)進行分析，計算平均值和標準差。
將99％可信度范圍的最大值設置為極限值，分析存在RET各密碼子突變的陽性信號(圖3和4)。圖4(a)顯示外顯子10(密碼子609、611、618、和620)和外顯子11(密碼子630和634)上發(fā)生的雜交的范圍。據(jù)報道超過95％的MEN2A突變發(fā)生在外顯子10和外顯子11。Fig.4(b)表明外顯子13(密碼子768)和14(密碼子804)上的雜交。經(jīng)鑒定大多數(shù)FMTC突變發(fā)生在外顯子13和外顯子14上；而觀察到大多數(shù)MEN2B突變發(fā)生在外顯子16(密碼子918)上。
22個樣品(SNU-MEN2A-I，II，III，IV)的雜交結果與之前的測序數(shù)據(jù)一致。至于未知的SNU-MEN2A-V樣品，應用本發(fā)明的RET寡芯片的雜交實驗表明密碼子634發(fā)生了從TGC(半胱氨酸)到TGG(色氨酸)的突變，而不是之前用常規(guī)方法確定的野生型序列。為了確定該突變在密碼子634位上，進行克隆和直接測序。將外顯子11的PCR產(chǎn)物連接到PCR-TOPO載體上，用TA克隆系統(tǒng)(Invitrogen，Caelsbad，CA)進行亞克隆。用Taq雙脫氧末端循環(huán)測序試劑盒和ABI 377 DNA序列儀(Perkin-Elmer，F(xiàn)oster City，CA)進行雙向測序。結果證實SNU-MEN2A-V樣品在密碼子634上有一個突變(48C634W，TGC→TGG，外顯子11)。也就是說，本發(fā)明的RET寡芯片能夠檢測到直接測序辨認錯誤的RET基因突變。
雖然描述和說明了本發(fā)明的實施方式，顯然在不偏離僅由所附權利要求范圍限定的本發(fā)明實質的情況下，可以進行各種改變和修飾。
序列表<110>國立癌中心<120>RET寡核苷酸微芯片及其用于檢測遺傳性癌癥的方法<130>PCA11254/PJG<160>67<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>10-PC<400>1ggggattaaa gctggctatg g 21<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>609M-(R)<400>2ctatggcacc cgcaactgct t 21<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>609M-(S)<400>3ctatggcacc agcaactgct t 21<210>4<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>609M-(G)<400>4tggcaccggc aactgc 16<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>609M-(F)<400>5ctatggcacc ttcaactgct tc 22<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>609M-(Y)<400>6ctatggcacc tacaactgct tc 22<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>609M-(S)<400>7tatggcacct ccaactgctt c 21<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>609M-(W)<400>8tatggcacct ggaactgctt c 21<210>9<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>609M-(C)<400>9tatggcacct gcaactgctt c 21<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>611M-(R)<400>10acctgcaacc gcttccctga 20<210>11<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>611M-(S)<400>11cacctgcaac agcttccctg a 21<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>611M-(G)<400>12acctgcaacg gcttccctga 20<210>13<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>611M-(F)<400>13acctgcaact tcttccctga g 21<210>14<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>611M-(Y)<400>14acctgcaact acttccctga g 21<210>15<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>611M-(S)<400>15acctgcaact ccttccctga g 21<210>16<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>611M-(W)<400>16acctgcaact ggttccctga g 21<210>17<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>611W-(C)<400>17acctgcaact gcttccctga g 21<210>18<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>618M-(R)<400>18aggagaagcg cttctgcgag 20<210>19<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>618M-(S)<400>19gaggagaaga gcttctgcga g 21<210>20<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>618M-(G)<400>20gagaagggct tctgcg 16<210>21<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>618M-(F)<400>21aggagaagtt cttctgcgag 20<210>22<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>618M-(Y)<400>22aggagaagta cttctgcgag 20<210>23<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>618M-(S)<400>23aggagaagtc cttctgcgag 20<210>24<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>618M-(W)<400>24aggagaagtg gttctgcgag 20<210>25<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>618W-(C)<400>25gaggagaagt gcttctgcga g 21<210>26<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>620M-(R)<400>26aagtgcttcc gcgagcccga 20<210>27<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>620M-(S)<400>27aagtgcttca gcgagcccga 20<210>28<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>620M-(G)<400>28aagtgcttcg gcgagcccga 20<210>29<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>620M-(F)<400>29aagtgcttct tcgagcccga 20<210>30<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>620M-(Y)<400>30aagtgcttct acgagcccga 20<210>31<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>620M-(S)<400>31aagtgcttct ccgagcccga 20<210>32<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>620M-(W)<400>32aagtgcttct gggagcccga 20<210>33<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>620W-(C)<400>33aagtgcttct gcgagcccga 20<210>34<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>630M-(M)<400>34gatccactgc gcgacgagct 20<210>35<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>630M-(S)<400>35gatccactga gcgacgagct 20<210>36<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>630M-(G)<400>36gatccactgg gcgacgagct 20<210>37<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>630M-(F)<400>37gatccactgt tcgacgagct 20<210>38<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>630M-(Y)<400>38gatccactgt acgacgagct 20<210>39<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>630M-(S)<400>39gatccactgt ccgacgagct 20<210>40<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>630M-(W)<400>40gatccactgt gggacgagct 20<210>41<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>630W-(C)<400>41gatccactgt gcgacgagct 20<210>42<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>634M-(R)<400>42gacgagctgc gccgcacggt 20<210>43<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>634M-(S)<400>43gacgagctga gccgcacggt 20<210>44<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>634M-(G)<400>44cgagctgggc cgcacg 16<210>45<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>634M-(F)<400>45gacgagctgt tccgcacggt 20<210>46<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>634M-(Y)<400>46gacgagctgt accgcacggt 20<210>47<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>634M-(S)<400>47gacgagctgt cccgcacggt 20<210>48<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>634M-(W)<400>48gacgagctgt ggcgcacggt 20<210>49<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>634W-(C)<400>49gacgagctgt gccgcacggt 20<210>50<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>11PC<400>50ccgctgtcct cttctccttc 20<210>51<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>768M-(Q)<400>51tccccgagtc agcttcgaga 20<210>52<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>768M-(K)<400>52ctccccgagt aagcttcgag a 21<210>53<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>768M-(A)<400>53tccccgagtg cgcttcgaga 20<210>54<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>768M-(G)<400>54tccccgagtg ggcttcgaga 20<210>55<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>768M-(V)<400>55tccccgagtg tgcttcgaga 20<210>56<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>768M-(D)<400>56tccccgagtg accttcgaga 20<210>57<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>768M-(D)<400>57tccccgagtg atcttcgaga c 21<210>58<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>768W-(E)<400>58tccccgagtg agcttcgaga 20<210>59<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>804M-(L)<400>59ctcctcatcc tggagtacgc 20<210>60<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>804M-(M)<400>60cctcctcatc atggagtacg c 21<210>61<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>804M-(L)<400>61cctcctcatc ttggagtacg c 21<210>62<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>804M-(E)<400>62ctcctcatcg aggagtacgc 20<210>63<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>804M-(A)<400>63ctcctcatcg cggagtacgc 20<210>64<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>804M-(G)<400>64ctcctcatcg gggagtacgc 20<210>65<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>804W-(V)<400>65ctcctcatcg tggagtacgc 20<210>66<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>918M-(T)<400>66cagttaaatg gacggcaatt gaat24<210>67<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>918W-(M)<400>67cagttaaatg gatggcaatt gaat24<210>68<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>Exon-10F<400>68gtaggaattc gacacgagcc tggggagc28<210>69<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>Exon-10R<400>69catcgaattc ttgttggacc tcagatgtgc 30<210>70<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>Exon-11F<400>70gtaggaattc gcagcctgta cccagtggtg 30<210>71<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>Exon-11R<400>71catcgaattc accggaagag gagtagctg 29<210>72<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>Exon-13F<400>72taatacgact cactataggg cttccaggag cgatcgttt39<210>73<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>Exon-13R<400>73atttaggtga cactatagca ccctgcagct ggcctt 36<210>74<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>Exon-14F<400>74tggctcctgg aagacccaa 19<210>75<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>Exon-14R<400>75tgcacgcacc ttcatctcg 19<210>76<211>43<212>DNA<213>人工序列<220><223>Exon-16F<400>76taatacgact cactataggg agagttagag taacttcaat gtc 43<210>77<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>Exon-16R<400>77atttaggtga cactatagta acctccaccc caagaga 3權利要求
1.一種用于檢測RET突變的RET寡核苷酸微芯片，包括固定在固體基質表面的多種寡核苷酸，其中所述寡核苷酸被設計用來檢測RET基因突變熱點的錯義突變型。
2.權利要求1的RET寡核苷酸微芯片，其中熱點是密碼子609、611、618、620、630、634、768、804和918。
3.權利要求1的RET寡核苷酸微芯片，其中寡核苷酸被設計用來檢測密碼子609、611、618、620、630、634、和768上的7種錯義突變，密碼子804上的6種錯義突變，密碼子918上的一種錯義突變，9種各密碼子的野生型，和2種外顯子10和11的陽性對照。
4.權利要求3的RET寡核苷酸微芯片，其中密碼子609的錯義突變的寡核苷酸為SEQ ID Nos.2到8描述的那些，密碼子611的錯義突變?yōu)镾EQ ID Nos.10到16，密碼子618的錯義突變?yōu)镾EQ ID Nos.18到24，密碼子620的錯義突變?yōu)镾EQ ID Nos.26到32，密碼子630的錯義突變?yōu)镾EQ ID Nos.34到40，密碼子634的錯義突變?yōu)镾EQ ID Nos.42到48，密碼子768的錯義突變?yōu)镾EQ ID Nos.51到57，密碼子804的錯義突變?yōu)镾EQ ID Nos.59到64，和密碼子918的錯義突變?yōu)镾EQ ID No.66。
5.權利要求1至4中任何一個的RET寡核苷酸微芯片的生產(chǎn)方法，包括1)將各種寡核苷酸混合到微量點樣溶液中，然后分配到平板的孔中；2)用微量點陣儀將寡核苷酸點到固體基質的表面；3)將寡核苷酸固定到固體基質表面，并清洗；4)將固體基質浸泡到95℃水中，使固定的寡核苷酸變性，然后用硼氫化鈉溶液處理固體基質；和5)清洗和干燥固體基質。
6.權利要求5的生產(chǎn)方法，其中步驟(1)中使用的每種寡核苷酸具有一個5’氨基修飾的12碳間隔區(qū)。
全文摘要
本發(fā)明設計一種用于檢測RET基因突變熱點區(qū)突變的RET寡核苷酸微芯片,其生產(chǎn)方法及其用于檢測遺傳性癌癥的方法,其中有選擇地設計了特定寡核苷酸,用來檢測RET基因突變熱點上的各種錯義突變。
文檔編號G01N33/53GK1422963SQ0210530
公開日2003年6月11日 申請日期2002年2月21日 優(yōu)先權日2001年11月19日
發(fā)明者樸在甲, 金日鎮(zhèn), 姜曉貞, 樸在賢 申請人:國立癌中心