專利名稱：異硫氰酸苯酯衍生化法測定微透析樣品中氨基酸的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種異硫氰酸苯酯衍生化法測定腦內微透析樣品中氨基酸的方法，屬生物醫(yī)學領域。
氨基酸作為腦內一種很重要的神經遞質，參與了腦內許多生理和病理過程。因此對在麻醉和清醒動物上，在體監(jiān)測藥理和病理條件下或行為過程中引起的其釋放變化，具有十分重要的意義。但由于透析得到的樣品量少，含遞質氨基酸濃度很低，又難以前處理濃集，且大多數氨基酸無紫外吸收和熒光發(fā)射，為提高分析的檢測靈敏度通常將其衍生化。迄今為止，對于其透析樣品的衍生都是采用熒光試劑主要為鄰苯二甲醛(0PA)與2-巰基乙醇連用，在堿性條件下與氨基酸反應產生熒光產物，然后進行HPLC熒光或電化學檢測。OPA法的主要缺點是二級氨基酸不能直接反應，須經氧化后測定；另外其衍生化產物穩(wěn)定性較差。
本發(fā)明是這樣實現的該方法由樣品的采集(即腦內微透析術)、樣品的衍生和干燥以及樣品的洗脫(即HPLC分離)等組成。實驗前一周，在動物特定部位埋植透析導管。待恢復后，安裝透析探針，并以一定流速灌流人工腦脊液。灌流速度為1.5μl/min，灌流液的組分(mmol/L)為NaCl147、KCl2.4、CaCl21.2、MgCl21.0、NaHCO35.0、pH7.4。灌流3小時平衡后每20分鐘收集樣品一次。然后，在樣品中加入10μl 5pmol/μL蛋氨酸砜溶液作為內標，再干燥液為甲醇∶水∶三乙胺＝2∶2∶1(體積比)，衍生化試劑為甲醇∶異硫氰酸苯酯∶三乙胺∶水＝7∶1∶1∶1(體積比)。樣品真空干燥后加入再干燥液20μl，混勻，再真空干燥。向再干燥后的樣品中加入衍生化試劑40μl，混勻，室溫下放置20分鐘使充分反應后真空干燥，干燥后的樣品放入冰箱-21℃冷凍保存。最后樣品經反相HPLC洗脫。洗脫液A為含2％乙腈的70mmol/L醋酸鈉緩沖溶液(pH＝6.38)、洗脫液B為按乙腈∶甲醇∶重蒸餾水＝45∶15∶40(體積比)的比例配制的溶液；流速為1ml/min；色譜柱溫為35℃；檢測紫外，254nm；檢測限為1pmol。
本發(fā)明具有簡便快速、衍生產物穩(wěn)定、分析時間短、化學選擇性和分析靈敏度高(可達1pmol)、一、二級氨基酸均可檢測的分析方法，由此可實現微透析與反相高壓液色譜紫外檢測技術結合對腦內痕量活性物質的動態(tài)監(jiān)測。
圖2為標準氨基酸溶液經異硫氰酸苯酯衍生并于冰箱-21℃冷凍保存6個月后的色譜分離圖。
圖3為老年沙土鼠海馬微透析樣品經異硫氰酸苯酯衍生后的色譜分離圖。
圖4為KMBZ-009(10mg/kg)和Aniracetam(100mg/kg)對短暫性缺血再灌老年沙土鼠海馬微透析樣品中Asp釋放的影響。
圖5為KMBZ-009(10mg/kg)和Aniracetam(100mg/kg)對短暫性缺血再灌老年沙土鼠海馬微透析樣品中Glu釋放的影響。
圖6為KMBZ-009(10mg/kg)和Aniracetam(100mg/kg)對短暫性缺血再灌老年沙土鼠海馬微透析樣品中Gly釋放的影響圖7為KMBZ-009(10mg/kg)和Aniracetam(100mg/kg)對短暫性缺血再灌老年沙土鼠海馬微透析樣品中β-Ala釋放的影響圖8為KMBZ-009(10mg/kg)和Aniracetam(100mg/kg)對短暫性缺血再灌老年沙土鼠海馬微透析樣品中Tau釋放的影響圖9為KMBZ-009(10mg/kg)和Aniracetam(100mg/kg)對短暫性缺血再灌老年沙土鼠海馬微透析樣品中GABA釋放的影響其中Asp代表天門冬氨酸，Glu代表谷氨酸，Gly代表甘氨酸，β-Ala代表β-丙氨酸，Tau代表?；撬?，GABA代表γ-氨基丁酸，In.S.代表內標。
缺血組與假手術組比較，++表示p＜0.01，+表示0.01＜p＜0.05。給藥組(KMBZ-009和Aniracetam)與缺血組比較，**表示p＜0.01，*表示0.01＜p＜0.05。
二、樣品的衍生和干燥在收集的樣品中加入10μl 5pmol/μL蛋氨酸砜作內標，真空冷凍干燥后，加入再干燥液(甲醇∶水∶三乙胺＝2∶2∶1)20μl，混勻，再冷凍干燥。向再干燥后的樣品中加入衍生化試劑(甲醇∶異硫氰酸苯酯∶三乙胺∶水＝7∶1∶1∶1)40μl，混勻，室溫下放置20min使充分反應后真空干燥。干燥后的樣品放入冰箱-21℃冷凍保存。樣品測定時加入30μl洗脫液A溶解衍生化并干燥后的樣品，取20μl溶液進樣。
三、樣品的洗脫色譜柱Hypersil ODS2C18柱[300mm×4.0mm(i.d.)]和保護柱[20mm×4.0mm(i.d.)]。洗脫液A為含2％乙腈的70mmol/L醋酸鈉緩沖溶液(無水醋酸鈉2.87g溶于500ml重蒸餾水，用冰醋酸調pH至6.38。經孔徑為0.45μm的濾膜過濾后，取濾液490ml，加乙腈10ml，混勻)；洗脫液B為按乙腈∶甲醇∶重蒸餾水＝45∶15∶40(體積比)的比例配制。流速1ml/min。洗脫梯度如下表所示。柱溫35℃，檢測紫外，254nm。檢測限為1pmol。
測定氨基酸含量的洗脫液梯度Time Flow A BCurve(min)(ml/min) (％) (％)0.00 1.00 100 0 69.00 1.00 7525 6
18.00 1.005446 819.00 1.000 100620.00 1.000 100621.00 1.00100 0 630.00 1.00100 0 6結果由圖可知。采用本法氨基酸的衍生產物穩(wěn)定，且所需測定的遞質氨基酸和內標氨基酸在16min內基本上都能得到基線分離(見

圖1、圖2和圖3)。對于短暫性腦缺血再灌沙土鼠海馬遞質氨基酸含量的變化及KMBZ-009和Aniracetam的影響，由圖4、圖5、圖6、圖7、圖8和圖9所示，與假手術組相比，沙土鼠腦缺血再灌10min其海馬部位興奮性和抑制性氨基酸遞質均有所升高，其中Asp和Glu的含量升高極顯著(p＜0.01)。再灌30min后各氨基酸基本恢復到基礎水平。缺血前1小時給服KMBZ-009(10mg/kg)或Aniracetam(100mg/kg)后，二者均能顯著地降低由腦缺血再灌所導致的興奮性氨基酸(Glu、Asp)釋放的增加，從而對缺血再灌所致的遲發(fā)性神經元損傷起保護作用。
權利要求
1.一種采用異硫氰酸苯酯衍生化法測定腦內微透析樣品中痕量氨基酸的方法，由腦內微透析、樣品的衍生和干燥、樣品的洗脫等組成，其特征在于1.1腦內微透析過程中灌流液組分為NaCl147、KCl2.4、CaCl21.2、MgCl21.0、NaHCO35.0、pH7.4，組分單位mmol/L，灌流速度為1.5μl/min，灌流3小時平衡后每20分鐘收集樣品一次；1.2樣品的衍生和干燥過程中向樣品中加入10μl 5pmol/μL蛋氨酸砜溶液作為內標，再干燥液為甲醇∶水∶三乙胺＝2∶2∶1，衍生化試劑為甲醇∶異硫氰酸苯酯∶三乙胺∶水＝7∶1∶1∶1，樣品真空干燥后加入再干燥液20μl，混勻，再真空干燥，向再干燥后的樣品中加入衍生化試劑40μl，混勻，室溫下放置20分鐘使充分反應后真空干燥，干燥后的樣品放入冰箱-21℃冷凍保存；1.3.樣品的洗脫過程中的洗脫液A為含2％乙腈的70mmol/L醋酸鈉緩沖溶液，其pH＝6.38；洗脫液B為乙腈∶甲醇∶重蒸餾水＝45∶15∶40；流速為1ml/min；色譜柱溫為35℃；檢測紫外，254nm；檢測限為1pmol。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種異硫氰酸苯酯衍生化法測定腦內透析樣品中氨基酸的方法，屬生物醫(yī)學領域。該方法由樣品的采集(即腦內微透析)、樣品的衍生和干燥以及HPLC分離等組成。實驗前一周，在動物特定部位埋植透析導管。待恢復后，安裝透析探針，并以一定流速灌流人工腦脊液，間隔一定時間收集一次透析樣品。然后，在樣品中加入一定量的內標試劑，經冷凍干燥、異硫氰酸苯酯衍生、再干燥、稀釋等步驟處理后，樣品經反相HPLC洗脫，紫外檢測。本發(fā)明具有簡便快速、衍生產物穩(wěn)定、分析時間短、化學選擇性和分析靈敏度高(可達1pmol)、一、二級氨基酸均可檢測的分析方法，由此可實現微透析與反相高壓液色譜紫外檢測技術結合對腦內痕量活性物質的動態(tài)監(jiān)測。
文檔編號G01N33/52GK1435691SQ0211328
公開日2003年8月13日 申請日期2002年1月26日 優(yōu)先權日2002年1月26日
發(fā)明者余嗣明, 蔡景霞 申請人:中國科學院昆明動物研究所