專利名稱：鑲嵌式高通量三維立體生物檢測技術(shù)及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型的鑲嵌式高通量三維立體生物檢測技術(shù)及試劑盒的制備方法。該技術(shù)靈敏快速、信息量大，制備方法簡便、成本低，能同時(shí)檢測樣品中多種不同的化學(xué)物質(zhì)、生物分子、微生物或細(xì)胞等成分，可廣泛地用于生物學(xué)、醫(yī)藥學(xué)、預(yù)防醫(yī)學(xué)、動植物學(xué)、農(nóng)牧業(yè)、食品與衛(wèi)生、能源與化工、環(huán)境監(jiān)測以及醫(yī)學(xué)診斷與檢測等領(lǐng)域。
固相吸附試驗(yàn)常被用于檢測或分析被檢樣品或樣品溶液、生物體液(如血液、血清、血漿、腦脊液、尿液等，淚液、汗液、消化液和精液等分泌液，組織液、滲出液、嘔吐物、糞便、組織/細(xì)胞勻漿液等)中的化學(xué)物質(zhì)、生物分子以及微生物或細(xì)胞等生物體。
固相吸附試驗(yàn)中的微孔板、微顆粒或微珠作為固相常被用于通過吸附或結(jié)合捕獲被分析物，以便將目的物從復(fù)雜的樣品混合物或懸液中分離出來。根據(jù)實(shí)驗(yàn)的不同，固相微顆粒和微孔板可用多種不同的材料，如玻璃、塑料、乳膠、葡聚糖、瓊脂糖、磁性材料、陶瓷、金屬等制成。在傳統(tǒng)的固相吸附試驗(yàn)中，微孔板、微顆粒作為固相主要是通過其吸附或結(jié)合能力，輔助捕獲液相中的對應(yīng)分子，借助重力、壓力、離心、過濾、磁力等，經(jīng)過一步或多步操作很方便的將未結(jié)合的分子(液相或稱游離相)與結(jié)合分子(固相)分離。
在樣品的檢測分析試驗(yàn)中，大部分情況下需要在同一個(gè)容器里、同時(shí)進(jìn)行兩項(xiàng)或多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，以便對樣品中多種不同成分的有無、含量和來源等做出平行的定性、定量、定位等檢測分析；或?qū)我环N分子的多種不同特性(如單一蛋白分子具有多個(gè)不同的表位或抗原決定簇)進(jìn)行平行檢測與分析。在此情況下，傳統(tǒng)的固相吸附試驗(yàn)所存在的問題是對超過3種以上的不同被檢測物，由于難以區(qū)分，很難同時(shí)進(jìn)行。也就是說，用傳統(tǒng)的固相吸附試驗(yàn)方法，在一個(gè)試驗(yàn)中所要檢測或分析被檢測物的數(shù)量受固相系統(tǒng)的限制或制約。
在現(xiàn)代免疫檢測和蛋白質(zhì)組學(xué)分析和研究中，需要對同一樣品中大量的、多種不同化學(xué)物質(zhì)、抗原、抗體或蛋白質(zhì)等成分進(jìn)行快速、靈敏的高通量檢測，以分析化學(xué)物資、抗原、抗體或蛋白的種類、數(shù)量、組成、變異以及多態(tài)性、翻譯后修飾、個(gè)體的感染狀態(tài)或個(gè)體免疫系統(tǒng)的功能狀態(tài)等。傳統(tǒng)解決辦法是首先通過分離純化等技術(shù)和工藝，分別純化大量的各種不同的生物探針，如藥物分子、蛋白酶分子、生長因子與受體、抗原和各種不同特異性的抗體等，再分別將生物探針固相化在不同的微孔板或微珠等固相基質(zhì)的表面，分別與樣品中對應(yīng)的化學(xué)物質(zhì)、抗體或/和抗原分別反應(yīng)，再分別進(jìn)行檢測分析，因此如要檢測十幾種成分就需進(jìn)行十幾次不同的實(shí)驗(yàn)，異常繁瑣復(fù)雜。現(xiàn)有的生物芯片技術(shù)(如Affymatrix公司等提供的技術(shù)方案)雖將檢測分析集成為一體，使樣品的高通量檢測被簡化，但其生物探針的制備和固相化技術(shù)與工藝依然十分復(fù)雜。Illumina公司通過一種帶有電磁波發(fā)射裝置的微珠所建立的檢測技術(shù)，雖進(jìn)一步簡化了生物探針的制備和固相化技術(shù)，但是由于電磁波發(fā)射裝置的存在，不僅制造成本較高，同時(shí)也使得微珠的大小和固相中生物探針的容量和檢測靈敏度等受到限制，同時(shí)還需解決電磁屏蔽等問題。本發(fā)明的目的就是要提供一種技術(shù)和工藝更為簡單，能克服上述種種困惑，即簡便靈敏、快速及時(shí)，又可同時(shí)檢測樣品中多種不同物質(zhì)成分的技術(shù)。
本發(fā)明的主要技術(shù)特征是，將表面分別包被有不同生物分子或帶有不同化學(xué)物質(zhì)的微珠，分別鑲嵌在檢測板的不同微孔中，微孔間有微管相連，并與進(jìn)/出液口形成微流路與外界相通，樣品通過微流路與微珠表面的包被分子反應(yīng)，各孔的反應(yīng)結(jié)果可用目測或用儀器記錄分析，根據(jù)微珠或微孔在檢測板中的排列位置和順序，對樣品中的化學(xué)物質(zhì)、生物靶分子、細(xì)胞和微生物等多種不同成分的有無、性質(zhì)、含量、來源、組織和細(xì)胞學(xué)定位等同時(shí)進(jìn)行鑒定分析。
本項(xiàng)發(fā)明同時(shí)還提供了一種基于鑲嵌式高通量三維立體生物檢測技術(shù)制備試劑盒的方法，其主要技術(shù)特征在于試劑盒由鑲嵌有微珠，帶有微流路的多孔檢測板及各種相關(guān)的配套試劑分別組成。根據(jù)檢測板各微孔反應(yīng)的有無與強(qiáng)弱，以及各微孔在檢測板中的排列位置和順序，可對不同樣品中多種不同成分同時(shí)進(jìn)行比對分析，利用試劑盒中所提供的試劑和方法還可對檢測板中各孔所捕獲的樣品成分，做分子量、等電點(diǎn)、糖基化、磷酸化和氨基酸序列等進(jìn)一步分析。該試劑盒不僅大大簡化了同一樣品進(jìn)行多因素檢測分析的操作步驟，縮短了操作時(shí)間，降低了工作強(qiáng)度，更增加了檢測結(jié)果的精確件、靈敏度、重現(xiàn)性和可比性，而且還可同時(shí)對檢測樣品中多種不同的物質(zhì)成分做進(jìn)一步的不同分析，使用更方便，操作更快捷，并且可廣泛地應(yīng)用于環(huán)境檢測、疾病診斷、新藥開發(fā)、疫苗研究和蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)、研究領(lǐng)域。
為了達(dá)到上述目的本發(fā)明所采用的技術(shù)方案，其基本特征在于鑲嵌式高通量三維立體生物檢測技術(shù)及試劑盒的制備至少包括下述步驟和成分①檢測板由微孔板、微流路和微珠等組成；微孔板由板體(1)和板蓋(2)組成；微流路由微孔(3)、微槽(4)和/或微管(5)、進(jìn)液孔(6)、出液孔(7)、密封圈(8)等結(jié)構(gòu)組成，可分別或共同位于板體(1)和/或板蓋(2)上；微珠(9)可通過表面帶有不同活性基團(tuán)的手臂分子或涂層(10)等包被不同的化學(xué)分子(11)或生物分子(12)，按一定的順序分別鑲嵌在檢測板不同的微孔中(見

圖1-5)。微珠表面包被的化學(xué)或生物分子與樣品中被檢測的目的物分別具有結(jié)合特異性(如抗原/半抗原與抗體、激素/細(xì)胞因子與受體、配基與配體等)或生物專一性(如酶與底物、藥物與靶分子)等；②被檢樣品，如水源、生物體液等各種液體，直接或經(jīng)過處理，如組織/細(xì)胞經(jīng)裂解液的裂解，由進(jìn)液孔(6)進(jìn)入檢測板、沿微流路，經(jīng)微槽(4)和/或微管(5)流經(jīng)各微孔(3)與微珠(9)表面包被的化學(xué)物質(zhì)(11)或生物分子(12)等混合，并相互作用或特異性結(jié)合；樣品中未結(jié)合的游離物沿微流路經(jīng)出液孔(7)流出；③用標(biāo)記分子(13)，如熒光素(FITC，Cy3，Cy5，Texas Red等)、同位素(125L，32P，35S等)、生物素和半抗原，酶(HRP，AP，半乳糖苷酶，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，尿素梅和熒光素酶等)、膠體金、稀土離子(如Eu，Sm，Tb和Dy等)及其螯合物(如Eu3+-DTPA)等物質(zhì)直接標(biāo)記被檢樣品；或用標(biāo)記分子的不同標(biāo)記產(chǎn)物-標(biāo)記物(14)，如熒光抗體、酶標(biāo)抗體、生物素化抗體、生物素化酶、Eu3+-DTPA-抗體等標(biāo)記物，標(biāo)記被檢樣品(間接標(biāo)記)；④洗液流洗去除檢測板中殘留的和非特異性結(jié)合的標(biāo)記物(14)、樣品或樣品標(biāo)記物等⑤目測觀察或用檢測儀分析檢測板微孔中標(biāo)記分子(13)如熒光、顯色產(chǎn)物或發(fā)光產(chǎn)物、放射性的有無、強(qiáng)弱或深淺，并據(jù)此分析被檢樣品中被檢物的有無、含量、組成、來源、組織/細(xì)胞學(xué)定位或排列順序等。
⑥標(biāo)記物為酶(15)時(shí)，如HRP(辣根過氧化物酶)，AP(堿性磷酸酶)、熒光素酶(Luciferase)等，觀察結(jié)果前需先加入顯色劑或發(fā)光試劑等底物試劑(16)，如OPD(鄰苯二胺)、DAB(二氨基聯(lián)苯胺)或發(fā)光試劑(如魯米諾、甲基傘形酮磷酸酯、對羥基苯乙酸)等。
本發(fā)明的特征還在于微孔板由板體(1)和板蓋(2)組成，板體和板蓋上可分別具有微孔(3)、微槽(4)和/或微管(5)、進(jìn)液孔(6)、出液孔(7)、密封圈(8)、驅(qū)動孔(19)、定位孔(20)和視窗(21)等部分或全部結(jié)構(gòu)；微孔(3)按一定的格式排列，其間有微槽(4)或微管(5)直接或間接兩兩相連；板體(1)和板蓋(2)為任何可加工成型的、透光的、不透光的或反光的硬質(zhì)或軟質(zhì)材料，如玻璃、塑料、高分子合成材料、陶瓷、金屬、非金屬等多種不同材料或復(fù)合材料等，經(jīng)精加工而成的具有方形、長方形、園盤型或其它外觀形狀的實(shí)體結(jié)構(gòu)(見圖1-4)。板體(1)和板蓋(2)分別或共同經(jīng)不同的化學(xué)修飾或表面處理，①產(chǎn)生反光層，反射光信號；②獲得惰性化學(xué)涂層，如辛胺、泰富隆(Teflon)涂層、硅化等處理以減少樣品和/或標(biāo)記物(14)等對板體和板蓋的非特異性吸附；③獲得具有不同反應(yīng)活性基團(tuán)的分子表面或涂層，如氨基、羧基、醛基、羥基、巰基、溴乙?；?、酰肼基、環(huán)化亞胺碳酸鹽基團(tuán)等(見圖6，圖7)，以便于不同的化學(xué)分子(11)，如藥物、激素等半抗原分子，或蛋白酶、生長因子、抗體等不同生物分子(12)的包被(見圖8)，與微珠配合，增加比表面積，以提高檢測靈敏度。
本發(fā)明的特征還在于微流路由微孔(3)、微槽(4)和/或微管(5)、與外界相通的進(jìn)液孔(6)、出液孔(7)、密封圈(8)等結(jié)構(gòu)共同組成；上述結(jié)構(gòu)可分別位于板體或板蓋上，也可全部位于板體或板蓋上，其在板體或板蓋上的不同位置與組合，可形成具有不同幾何特征，滿足不同實(shí)驗(yàn)需求的微流路，見圖3-5。
本發(fā)明的特征還在于；微珠(9)是由任何可加工成型的材質(zhì)，如玻璃、塑料、葡聚糖、聚蔗糖、瓊脂糖、高分子合成材料、纖維素、乳膠、硅膠、層析基質(zhì)、陶瓷、金屬、非金屬、磁性材料或復(fù)合材料等，經(jīng)精加工而成的，大小均一、具有不同外觀形狀的多孔或?qū)嵭捏w；可直接吸附化學(xué)和生物分子；或經(jīng)射線照射、化學(xué)修飾或表面處理后，獲得帶有不同化學(xué)活性基團(tuán)的手臂分子表面或涂層(10)，通過手臂分子上的活性化學(xué)基團(tuán)微珠可進(jìn)一步與不同的生物分子(12)，如抗原、抗體、激素、細(xì)胞因子、受體、配基與配體等，或化學(xué)分子(11)等連接將其包被在微珠表面，生成具有不同結(jié)合特性的藥物微珠(17)和生物微珠(18)，如免疫微珠、蛋白微珠、核酸微珠等(見圖6-8)。
本發(fā)明的特征還在于微珠(9)和微孔(3)均可或分別通過其手臂分子涂層或表面所帶有的化學(xué)活性基團(tuán)，如溴乙酰基、酰肼基、環(huán)化亞胺碳酸鹽基團(tuán)、氨基、醛基、巰基等與化學(xué)/藥物分子、蛋白分子上的活性基團(tuán)如羧基、氨基、醛基、巰基等分別形成酰胺鍵、肽鍵、醚鍵、二硫鍵；或通過疏水表面與蛋白質(zhì)分子的疏水基團(tuán)相互作用，分別連接或包被不同的化學(xué)分子或生物分子，以分別獲得對不同化學(xué)或生物分子具有不同結(jié)合能力的微珠或微孔(見圖7，圖8)；當(dāng)微孔(3)也進(jìn)行包被處理時(shí)，其表面所包被的化學(xué)(11)或生物分子(12)與嵌入該孔的微珠(9)所包被的化學(xué)(11)或生物分子(12)一致，即同一孔中，微孔和微珠表面的包被分子完全相同。
本發(fā)明的特征還在于生物微珠(18)還可以用下述方法制備，其基本步驟至少包括①將包被有抗原特異性抗體(22)的抗體微珠(23)與含有過量特異性抗原(24)的化合物共育，通過抗原抗體反應(yīng)將抗原(24)吸附在微珠表面，待充分反應(yīng)后，用緩沖液充分漂洗以去除雜質(zhì)和未結(jié)合的抗原；②加入戊二醛或炭二亞胺等雙功能交聯(lián)劑，使抗原與抗體交聯(lián)，以避免或減少抗體結(jié)合的特異性抗原分子的解吸附或脫落(見圖9A)；③反應(yīng)完成后緩沖液充分漂洗，去除交聯(lián)劑并封閉殘留的交聯(lián)位點(diǎn)，獲得帶有特異性抗原的生物微珠-抗原免疫微珠(25)。
本發(fā)明的特征還在于生物微珠(18)也可以用下述方法制備，其基本步驟至少包括①將包被有抗小鼠免疫球蛋白Fc段抗體(26)的生物微珠(27)與含有小鼠單克隆抗體(28)的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)液或腹水共育，通過抗原抗體反應(yīng)將單克隆抗體吸附在微珠表面，待充分反應(yīng)后，用緩沖液漂洗；②加入戊二醛或炭二亞胺等雙功能交聯(lián)劑(見圖9B)；③緩沖液充分漂洗以去除交聯(lián)劑并封閉殘留的交聯(lián)位點(diǎn)，即獲得包被有小鼠抗特異性抗原單克隆抗體的生物微珠-抗體免疫微珠(29)。
本發(fā)明的特征還在于可采用下述方法進(jìn)行定量分析①在同一塊微孔板上包被同一種化學(xué)或生物分子的微孔和鑲嵌微珠的數(shù)量可有1個(gè)或1個(gè)以上的復(fù)孔，當(dāng)樣品沿微流路逐孔流經(jīng)各微孔及其復(fù)孔時(shí)，對應(yīng)的被檢測物被不斷結(jié)合，并不斷地從標(biāo)本液中去除，因此，各微孔及其復(fù)孔的結(jié)合量，因前后排列順序的不同逐漸減少，根據(jù)各微孔與復(fù)孔反應(yīng)的有無與強(qiáng)弱變化，即可進(jìn)行定量分析；②在進(jìn)行定量分析時(shí)，可按此方法設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)對照物或參照物，借助計(jì)算機(jī)分析可繪出被檢物濃度-反應(yīng)孔數(shù)量及其強(qiáng)弱變化曲線，結(jié)合標(biāo)本體積，獲得定量分析結(jié)果。
本發(fā)明的特征還在于本發(fā)明所述的試劑盒至少裝有一塊檢測板，每個(gè)微孔中至少鑲嵌一粒微珠，微珠表面分別包被某種化學(xué)分子或生物分子，并可與下述成分分別或共同組成不同的試劑盒①至少有一管組織/細(xì)胞或微生物樣品處理液，處理液中主要含有適量的去垢劑，如Triton X-100，NP40，Chaps等和蛋白酶抑制劑，如PMSF，EDTA，TPCK，TLCK，aprotinin，leupeptin，antipain等，以保證樣品充分裂解和溶解，同時(shí)保證蛋白分子不被降解；②至少有一管為蛋白質(zhì)濃度檢測分析試劑，如Folin-酚試劑，Bradford試劑等；③至少有一種含標(biāo)記分子或標(biāo)記物的試劑，如FITC，Cy3，Cy5，Texas Red，125I、32P、35S，地高辛，生物素-親合素系統(tǒng)，熒光抗體、酶標(biāo)抗體等，可用于樣品的直接或間接標(biāo)記；④至少有一管洗滌液或其濃縮液，如含有適量BSA或小牛血清、脫脂牛奶、Tween 20等的PBST，或TBST緩沖液，可用于檢測板的漂洗或流洗，以去除各種非特異性吸附物；⑤在標(biāo)記物為酶類時(shí)，至少有一種顯色底物或發(fā)光底物，如OPD或DAB與過氧化氫/脲、魯米諾，甲基傘形酮磷酸酯，ATP等；⑥至少有一管裝有表面具有某種化學(xué)活性基團(tuán)或包被了某種生物分子的微珠，如包被抗CEA，抗AFP，抗P53，抗Erb-2等的單克隆抗體或多克隆抗體的玻璃微珠、SepheroseCL-4B或聚苯乙烯微珠等；⑦至少有一管蛋白質(zhì)磷酸化分析試劑，如細(xì)菌堿性磷酸酶，馬鈴薯磷酸酶等；⑧至少有一管為蛋白水解酶，如胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，羧肽酶等，用于微珠捕獲蛋白的消解，以便進(jìn)行蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析或氨基酸序列分析；⑨至少有一管為電泳樣品緩沖液；如含適量SDS或尿素、鹽酸胍等不同蛋白質(zhì)變性劑的SDS-PAGE電泳樣品緩沖液或含有尿素或Chaps等的IEF電泳樣品緩沖液；⑩至少有一管為蛋白質(zhì)糖基化分析試劑，如PNGase F等；
本發(fā)明的特征還在于在完成基本檢測分析后，還可用試劑盒中的試劑通過下述不同的方法對檢測板各不同孔所結(jié)合的樣品成分分別做質(zhì)譜分析、氨基酸序列測定、蛋白質(zhì)磷酸化以及糖基化等進(jìn)一步分析前的處理①直接在感興趣的各微孔中加入蛋白水解酶或磷酸酶或電泳樣品緩沖液或蛋白質(zhì)糖基化分析等試劑，對微孔和微珠的結(jié)合物在原位做進(jìn)一步分析前的樣品處理；②將微孔中的生物微珠取出，在微量反應(yīng)容器中分別加入蛋白水解酶或磷酸酶或電泳樣品緩沖液或蛋白質(zhì)糖基化分析等試劑做進(jìn)一步分析前的樣品處理；③將新鮮樣品分別與感興趣微孔的復(fù)本微珠共育，以同樣的條件重復(fù)微孔板的操作步驟，將樣品中感興趣的物質(zhì)成分與樣品液分離，加入蛋白水解酶或磷酸酶或電泳樣品緩沖液或蛋白質(zhì)糖基化分析等試劑，對結(jié)合物做進(jìn)一步分析前的樣品處理。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)1信息量大。樣品經(jīng)一次檢測分析，可同時(shí)獲得成千上萬種不同成分的平行分析結(jié)果與數(shù)據(jù)資料，解決了傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)信息量小的問題。2.易于制備、成本低。本發(fā)明所述的微珠可選用各種商售產(chǎn)品為原材料，如如多肽固相合成用的基質(zhì)材料多孔玻璃珠、聚苯乙烯珠等，溴化氰活化的Sepharose-4B等各種層析基質(zhì)、硅膠珠等，將生物分子的分離純化及固相合成等與生物微珠的制備融為一體，省略了繁雜的生物分離純化過程；3.自由組合，靈活易變。可完全依照使用目的的不同，自由組合，或靈活地改變微孔板中任何一孔鑲嵌微珠的種類和結(jié)合特性以改變檢測的內(nèi)容，而無需變動全部排列順序和格式；4.靈敏度高。本技術(shù)方法所用的固相基質(zhì)采用了三維立體結(jié)構(gòu)，即微珠與微孔均可或分別作固相。每個(gè)微珠相當(dāng)于固化了抗原/抗體或配基/配體的親和層析基質(zhì)，與傳統(tǒng)方法相比，有更大的比表面積和比結(jié)合容量。同時(shí)由于通過手臂分子上的化學(xué)活性基團(tuán)連接藥物或生物蛋白分子，消除了空間位阻對分子結(jié)合的影響，進(jìn)一步提高了比結(jié)合容量。為提高反應(yīng)靈敏度，還可采用多孔微珠和微孔作固相，使比表面積遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過現(xiàn)有技術(shù)和方法。當(dāng)樣品逐孔流過串珠樣排列的微孔時(shí)，可與固相中的生物探針特異結(jié)合(具有過濾、親和層析、分離與濃縮效用)；同時(shí)被固相吸附后的樣品液不再與樣品原液混合，減少了被檢測物(如抗原/抗體等)因反復(fù)擴(kuò)散、平衡而被稀釋的影響，故更加靈敏。此外，由于省略了復(fù)雜的分離純化和苛刻的解吸附過程，故所獲得的固相化的被包被物的生物活性將會更高，同時(shí)純度也將進(jìn)一步提高，這一因素也將進(jìn)一步提高檢測分析的靈敏性；5.操作簡便，節(jié)省樣品與試劑。采用本發(fā)明所述的高密度微孔板進(jìn)行檢測分析，樣品、標(biāo)本、標(biāo)記物、洗液和底物沿微流路逐一流經(jīng)各孔，改變了傳統(tǒng)和現(xiàn)有技術(shù)分別反應(yīng)、清洗或在較大的容器中反應(yīng)和浸洗的操作方式，因此可解決因樣品不易獲得和標(biāo)記物價(jià)格昂貴所帶來的困擾，可大量節(jié)約試劑，并且易于實(shí)現(xiàn)全自動化操作；6.定量分析更準(zhǔn)確。本方法將數(shù)十種甚至數(shù)千種化學(xué)物質(zhì)和生物分子的檢測分析集中在一塊檢測板上同時(shí)進(jìn)行，根據(jù)檢測板中各微孔中熒光、膠體金沉積、發(fā)光的有無，或成色產(chǎn)物的生成與否，對照其排列位置，不僅可以確定樣品的組成及各組分的來源、含量，組織/細(xì)胞定位，同時(shí)又便于不同樣品間和同一樣品不同成分間的平行比對。微珠的包被可在同一試管中一次性大量制備，從而可保證各復(fù)孔和各檢測板之間的檢測結(jié)果的平行一致。在需要對某一成分進(jìn)行定量分析時(shí)，通過增加相同包被物平行包被的復(fù)孔數(shù)量，配合微流路解決了定量分析的問題；7.保留了傳統(tǒng)和現(xiàn)有檢測方法重復(fù)性好，準(zhǔn)確性高、可靠性強(qiáng)等優(yōu)特點(diǎn)。8.用途更廣泛。本發(fā)明不僅可直接用于疾病的診斷、新藥的開發(fā)和蛋白質(zhì)組學(xué)等現(xiàn)代生命科學(xué)的研究與開發(fā)；而且還可以對感興趣的微孔還可直接在檢測板中進(jìn)行氨基酸序列與變異、蛋白質(zhì)的糖基化、磷酸化、以及分子功能與組織/細(xì)胞及亞微或超微結(jié)構(gòu)定位等進(jìn)一步分析。
圖中所示為板體1、板蓋2、微孔3、微槽4，鑲嵌在微孔3中的微珠9以及經(jīng)微槽4與微孔3相通的進(jìn)液孔6、出液孔7，和密封墊8等結(jié)構(gòu)；板蓋2可與微槽4形成微管5，圖中微孔3與微槽4、進(jìn)液孔6、出液孔7和密封墊8形成微流路。圖2為3種典型檢測板的外觀結(jié)構(gòu)示意中2A，2B，2C分別為3種典型檢測板的外觀結(jié)構(gòu)示意圖，圖中所示為進(jìn)液孔6、出液孔7，驅(qū)動孔19，定位孔20和視窗21等結(jié)構(gòu)。圖3是圖2A中虛線框A部分的放大圖。
圖3A為平面示意圖，圖中所示為板體1、微孔3、不連續(xù)的微槽4，鑲嵌在微孔3中的微珠9，以及與微槽4相通的出液孔7、密封墊8；圖3B為圖3A的A-A剖面圖，圖中所示為板體1、板蓋2、微孔3、微槽4，微管5，鑲嵌在微孔3中的微珠9，出液孔7、密封墊8等；圖中微孔3上端的微槽4與板蓋2形成微管5，并與下端的微管5將微孔3兩兩相連，與進(jìn)液孔6、出液孔7等形成完整的微流路。圖4是圖2A中虛線框B部分的放大圖。
圖4A為平面示意圖，圖中所示為微孔3、微槽4，鑲嵌在微孔3中的微珠9；圖4B為圖4A的A-A剖面圖，圖中所示為板體1、板蓋2、微孔3、鑲嵌在微孔3中的微珠9；圖中微孔3兩端的微槽4與板蓋形成微管5將微孔3兩兩相連，與進(jìn)液孔6，出液孔7等形成完整的微流路。圖5是具有不同微流路的檢測板的局部放大圖。
圖中所示為微孔3、微槽4，鑲嵌在微孔3中的微珠9；圖中兩個(gè)相鄰微孔的側(cè)壁上有微管5，其上端的開口與微槽4相通，微槽4與板蓋2形成微管5，微管5上下兩端的開口將微孔3兩兩相連，并與進(jìn)/出液孔等形成完整的微流路。圖6是微珠9的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖6A顯示呈多面體的微珠9，表面連有帶活性基團(tuán)R的手臂分子10；圖6B是多面體微珠9的剖面圖，顯示多孔結(jié)構(gòu)，微珠9的表面通過帶活性基團(tuán)的手臂分子10連接化學(xué)/藥物分子11，生成藥物微珠17；圖6C是球體微珠9的外觀結(jié)構(gòu)示意圖，表面通過帶活性基團(tuán)的手臂分子10連接生物分子12，獲得生物微珠18。
圖6D是用纖維膜制成的片狀微珠9，表面吸附生物分子12，產(chǎn)生生物微珠18。圖7是部分手臂分子的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖中以微珠為例，顯示微珠9的表面分子或涂層10所帶各種不同化學(xué)基團(tuán)的分子結(jié)構(gòu)。圖中10為帶有化學(xué)活性基團(tuán)的手臂分子圖中各微珠手臂分子10所帶的活性基團(tuán)分別為圖7.1為醛基；圖7.2為羧基；圖7.3為環(huán)氧乙基；圖7.4為乙二醇；圖7.5為氨基；圖7.6為巰基；圖7.7為吖內(nèi)酯基團(tuán)；圖7.8為氰酸酯基團(tuán)；圖7.9為環(huán)化亞胺碳酸鹽基團(tuán)；圖7.10為酰基咪唑基團(tuán)；圖7.11為咪唑碳酸鹽基團(tuán)；圖7.12為碘乙?；鶊F(tuán)；圖7.13為溴乙?；鶊F(tuán)；圖7.14二硫吡啶基團(tuán)；圖7.15為二硫硝基苯甲酸基團(tuán)；圖7.16為亞氨基二乙酸基團(tuán)；圖7.17為偶氮鹽基團(tuán)；圖7.18為辛胺基團(tuán)；圖7.19為NHS基團(tuán)；圖7.20為三氟乙?；酋Ｂ然鶊F(tuán)；圖7.21為對甲基苯基磺酰氯基團(tuán)；圖7.22為肼基基團(tuán)；圖7.23為酰肼基基團(tuán)；圖7.24為氰尿酰氯基團(tuán)；圖8.為蛋白或抗體包被反應(yīng)示意8A中顯示微珠9表面的手臂分子10的化學(xué)活性基團(tuán)-溴乙?；鶊F(tuán)與蛋白分子12上的巰基反應(yīng)，將蛋白分子連接在微珠表面，生成生物微珠(18)；圖8B中顯示微珠9表面手臂分子10的化學(xué)活性基團(tuán)-酰肼基團(tuán)與半抗原藥物分子(11)上的醛基反應(yīng)，將藥物分子連接在微珠表面，生成藥物微珠(17)；圖8C中顯示微珠9表面手臂分子10的化學(xué)活性基團(tuán)-吖內(nèi)酯基團(tuán)與抗體分子(22)上的氨基反應(yīng)，將抗體蛋白分子連接在微珠表面；圖8D中顯示微珠9表面手臂分子10的化學(xué)活性基團(tuán)-環(huán)化亞胺碳酸鹽基團(tuán)與抗體分子(22)上的氨基反應(yīng)，將蛋白分子連接在微珠表面；圖9抗原免疫微珠和抗體免疫微珠的分子結(jié)構(gòu)示意9A為抗原免疫微珠25的分子結(jié)構(gòu)示意圖，圖中微珠9借助手臂分子10將抗原特異性抗體22包被在其表面；抗原24通過抗原抗體反應(yīng)，被抗體22吸附在微珠9的表面，再經(jīng)蛋白質(zhì)偶聯(lián)反應(yīng)將抗原24與抗體22通過化學(xué)鍵連接生成抗原免疫微珠25；圖9B為抗體免疫微珠29的分子結(jié)構(gòu)示意圖，圖中微珠9借助手臂分子10將抗小鼠免疫球蛋白Fc段抗體26(抗抗體)包被在其表面，小鼠單克隆抗體28(在此為抗原)通過抗原抗體反應(yīng)被抗抗體26吸附在微珠9的表面，再經(jīng)蛋白質(zhì)偶聯(lián)反應(yīng)，小鼠單克隆抗體28與抗抗體26通過化學(xué)鍵連接生成抗體免疫微珠29。圖10.為幾種具有代表性的實(shí)驗(yàn)方法基本原理示意10.1為直接法。圖10.2為間接法。圖10.3為夾心法。圖10.4和圖10.5為競爭法，后者為雙標(biāo)記法。圖10.6為橋聯(lián)法(直接標(biāo)記)。圖中顯示微珠9，帶活性基團(tuán)的手臂分子10，半抗原藥物分子11，不同標(biāo)記分子13和13’，不同特異性標(biāo)記物14和14’，HRP酶15，底物16，已知特異性抗體22，已知特異性抗原24，未知被檢抗原30，未知被檢抗體31，半抗原物分子的靶蛋白32，親合素或鏈親合素33，生物素34，生色產(chǎn)物或發(fā)光產(chǎn)物35。
本發(fā)明在實(shí)施中的基本操作步驟和方法如下一.檢測板的制備檢測板的制備方法包括以下基本方法和步驟1.表面處理微孔板和微珠的表面處理因所選材料的不同而略有不同，每種材料其具體處理方法和條件都有多種，本發(fā)明在此將《生物分子固定化技術(shù)及應(yīng)用》(蔣中華等，1998年，化學(xué)出版社)及中國專利號為01207812.3和申請?zhí)枮?0120798.9的專利為主要參考文獻(xiàn)。運(yùn)用公知的各種生物大分子固相化技術(shù)，處理各種材料的微珠和微孔板，使其表面帶有特定的活性基團(tuán)(如羥基、羧基、羰基、醛基、氨基、巰基、親水/疏水基團(tuán)，陽離子/陰離子和金屬基團(tuán)等，見圖7)，可與化學(xué)分子、藥物分子和生物分子上的活性基團(tuán)反應(yīng)，而具有特定的吸附能力。如多孔玻璃微珠經(jīng)嚴(yán)格清洗后用二甲苯浸洗，再經(jīng)70％的乙醇漂洗、烘干然后在2％丙氨基-三乙基硅烷無水丙酮溶液(APES，3-Aminopropyltriethoxysilane，Sigma公司，目錄號A3648)中浸泡30秒，用無水丙酮和蒸餾水順序漂洗，干燥(Weetall，H.H.，Biochem.Biophys.Acta，1970；2121)?；蛞陨淌鄣慕?jīng)表面處理的各種層析基質(zhì)(如溴化氰活化的Sepharose-4B)，多肽與寡核苷酸固相合成用的基質(zhì)，帶各種活性基團(tuán)的玻璃珠(Sigma公司)等作為微珠的固相基質(zhì)材料。
微孔板也可依據(jù)實(shí)驗(yàn)要求做不同的表面處理。如進(jìn)行硅化處理或泰富隆(Teflon)涂層處理，僅僅作為反應(yīng)容器或微流路，以減少實(shí)驗(yàn)中的非特異性吸附。2.包被微珠和微孔板的包被方法主要是①生物分子，如抗原、抗體、細(xì)胞因子和酶等蛋白分子分別溶解在磷酸鹽、碳酸鹽等不同緩沖液中，直接與經(jīng)表面處理的聚苯乙烯微珠、玻璃珠、溴化氰活化的Sepharose-4B等共育，使待包被的生物分子與微珠表面的活性基團(tuán)充分反應(yīng)，并被固相化在微珠和微孔板的表面，用水或緩沖液充分流洗，以去除未固相化的游離生物分子；②對生物小分子，如半抗原、藥物分子、皮質(zhì)激素、甾體類激素等化學(xué)分子可直接通過活性基團(tuán)連接在微珠上；③先連接在蛋白分子載體上，再將載體分子連接在微珠上；④原位合成。運(yùn)用固相化學(xué)合成技術(shù)，將小肽、藥物分子、先導(dǎo)化合物等直接在微珠表面合成。3.鑲嵌微珠人工或用全自動機(jī)械手系統(tǒng)，將不同包被處理的微珠(具有不同的結(jié)合特性)，按一定順序分別嵌入微孔板的各個(gè)微孔中。4.封蓋使微孔、微槽與進(jìn)/出液孔形成微流路，并只能通過進(jìn)/出液孔與外界相通。5.封閉經(jīng)進(jìn)/出液孔用封閉緩沖液以封閉去除微珠、微孔板或蓋板(或蓋膜)等表面可能殘留的活性基團(tuán)或非特異性結(jié)合位點(diǎn)，以減少檢測中可能出現(xiàn)的非特異性結(jié)合。由此即獲得能與化學(xué)分子、生物分子、抗體和/或抗原，酶/底物或拮抗劑、配基/配體、核酸探針、核酸/蛋白等特異性結(jié)合，并可用于對結(jié)合物進(jìn)行檢測的三維立體鑲嵌式高通量生物檢測板。常用的封閉液添加劑有牛血清白蛋白(0.5-5％)、脫脂牛奶(1-6％)、酪蛋白(0.5-2％)、白明膠(0.1-0.5％)，正常動物血清(0.5-5％)和去垢劑等(如Tween 20，NP40，TritonX-100)等。無微流路蜂巢式檢測板需封蓋前封閉，使用時(shí)揭掉粘封的蓋膜，經(jīng)視窗21即可添加樣品或漂洗，漂洗方式則采用浸洗。二.樣品的檢測分析樣品的檢測分析一般包括以下基本步驟和方法1.樣品的制備根據(jù)檢測目的的不同，生物樣品在檢測前將分別進(jìn)行不同的處理。常見樣品處理方法包括①加入適量緩沖液以調(diào)節(jié)樣品濃度或蛋白濃度，離子強(qiáng)度和酸堿度等；②細(xì)胞、微生物等顆粒抗原用裂解緩沖液配合勻漿或超聲粉碎等處理使之成為真性溶液；③離心或過濾去除懸浮物或顆粒物，如血細(xì)胞等。2.樣品的標(biāo)記①直接標(biāo)記。運(yùn)用公知的生物分子標(biāo)記技術(shù)，分別用生物素、酶、熒光素、膠體金、同位素或稀土離子及其螫合劑等物質(zhì)或其衍生物等標(biāo)記分子作為指示劑直接標(biāo)記樣品或待檢標(biāo)本。②采用間接標(biāo)記。用上述標(biāo)記分子的標(biāo)記物標(biāo)記樣品，但標(biāo)記反應(yīng)是在完成加待檢樣品和流洗等步驟后進(jìn)行。3.加待檢樣品將樣品或處理樣品經(jīng)進(jìn)液孔加入檢測板中，使之與各孔中的微珠表面已固相化的不同化學(xué)分子、生物分子等進(jìn)行反應(yīng)。被檢樣品中與固相對應(yīng)的生物分子被捕獲并特異結(jié)合或吸附，剩余的和未結(jié)合的部分經(jīng)出液孔流出檢測板。4.流洗或浸洗借助檢測板的微流路，用洗液流洗，蜂巢式檢測板可通過進(jìn)/出液孔流洗或經(jīng)視窗(21)浸洗，以去除板中殘留的被檢樣品(未結(jié)合物或稱游離物)或標(biāo)記物等。5.結(jié)果分析根據(jù)標(biāo)記分子的不同，目測或用掃描儀等儀器觀察并記錄各孔反應(yīng)的有無以及強(qiáng)弱(如生成產(chǎn)物顏色的深淺、膠體金沉積、熒光強(qiáng)度、放射強(qiáng)度等的強(qiáng)弱變化)。對照微珠的排列位置，借助計(jì)算機(jī)分析即可以確定該樣品中，被檢測物的組成以及各組分的含量。但是在標(biāo)記物為蛋白酶時(shí)，操作中必須增加添加底物等操作步驟才能觀察檢測結(jié)果，其檢測結(jié)果為呈色反應(yīng)或發(fā)光反應(yīng)。
本發(fā)明在實(shí)施中，上述操作步驟依據(jù)其包被物、被檢測物、標(biāo)記物和顯示結(jié)果等的不同，可有多種組合方式。以抗原抗體的檢測為例，下面結(jié)合附圖詳細(xì)說明1.直接法將包被了不同特異性抗體(22，22’，22”)的生物微珠-抗體微珠(23，23’，23”)分別鑲嵌在不同的微孔(3)中，封蓋，加封閉液封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。將樣品用標(biāo)記分子(熒光素13)標(biāo)記后，直接經(jīng)進(jìn)液孔(6)加入檢測板中。樣品流經(jīng)微孔時(shí)，其中的未知抗原(30，30’，30”)與各微孔中抗體微珠(23，23’，23”)表面包被的對應(yīng)抗體分子(22，22’，22”)分別結(jié)合，未結(jié)合的部分隨樣品液經(jīng)出液孔(7)流出。用洗液(如PBST，50mM PB，pH7.0-7.6，100Mm NaCl，0.05％Tween 20)流洗，去除殘留的樣品和非特異結(jié)合的樣品，熒光顯微鏡或掃描儀觀察并記錄檢測結(jié)果。微孔中有熒光，表示被檢樣品中有與抗體(22，22’，22”)對應(yīng)的未知抗原(30，30’，30”)，反之則為陰性。分析阻性孔反應(yīng)的強(qiáng)弱，即可知道樣品中被檢樣品成分含量的變化。見圖10.1。2.間接法將乙肝24A、丙肝24D、艾滋病24G、梅毒24K、瘧原蟲24N等不同特異性抗原多肽(24)通過固相多肽合成儀原位合成獲得抗原包被的生物微珠(18A，18D，18D，18K，18N等)，分別鑲嵌在不同的微孔(3)中，封蓋，加封閉液封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。將處理好的樣品(如患者血清，含未知抗體31)，不標(biāo)記直接經(jīng)進(jìn)液孔(6)加入檢測板中反應(yīng)，樣品流經(jīng)各微孔時(shí)，其中的未知抗體(31A，31D，31G，31K，31N)與各微孔(3)中抗原微珠(18)表面包被的抗原分子(24)結(jié)合，未結(jié)合的部分隨樣品液經(jīng)出液孔(7)流出。流洗以去除殘留的和未反應(yīng)的樣品，加入標(biāo)記分子(熒光素13)標(biāo)記的抗人免疫球蛋白抗體(抗抗體)的標(biāo)記物(14)反應(yīng)，流洗去除未結(jié)合的游離標(biāo)記物，觀察并記錄檢測結(jié)果。如只有鑲嵌包被乙肝抗原24A的抗原微珠所在的孔反應(yīng)陽性，就表示被檢者血清中有與乙肝抗原對應(yīng)的未知抗體31A，由此可推斷，患者可能有或有過乙肝的感染，無其它相應(yīng)病原體的感染。見圖10.2。3.夾心法將包被了不同特異性抗體(22，22’，22”)，如大鼠抗小鼠不同類、亞類、型和亞型抗體的單克隆抗體的纖維素膜片(抗體微珠23，23’，23”)，分別鑲嵌在不同的微孔(3)中，封蓋，加封閉液封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。經(jīng)進(jìn)液孔(6)將待檢樣品(含小鼠單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)液)加入檢測板(可用蜂巢式微孔板)中反應(yīng)，樣品流經(jīng)微孔時(shí)，其中的未知抗體(30，30’，30”)(在此作為抗原)與各微孔(3)中纖維素膜片上包被的抗體分子(22)分別結(jié)合，未結(jié)合的部分隨樣品液經(jīng)出液孔(7)流出。流洗或浸洗以去除未反應(yīng)的游離抗原-小鼠單克隆抗體(30)，再加入膠體金(13’)標(biāo)記的兔(或羊等)抗小鼠免疫球蛋白的抗體(種特異性抗抗體14’)進(jìn)行反應(yīng)，流洗去除未結(jié)合的游離標(biāo)記物，目測各孔的反應(yīng)，陽性孔既表示被檢培養(yǎng)液中的單克隆抗體為該型和該亞型的抗體。見圖10.3。4.競爭法將包被了不同特異性抗體(22)的抗體微珠(23)分別鑲嵌在不同的微孔(3)中，封蓋，加封閉液封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。將熒光素Cy3(標(biāo)記分子13)標(biāo)記的已知樣品(抗原標(biāo)記物24)與未標(biāo)記的待檢樣品(抗原30)混合，然后加入檢測板，待檢樣品(抗原30)與標(biāo)記的已知抗原(31)競爭結(jié)合檢測板中包被的固相化抗體(22)，流洗或浸洗去除游離的已知樣品(抗原標(biāo)記物31)和待檢樣品(抗原30)，用熒光顯微鏡或掃描儀等儀器觀察記錄各孔熒光反應(yīng)的有無與強(qiáng)弱變化，見圖10.4。熒光強(qiáng)的表示待檢樣品中該抗原無或含量較低，反之則表明含量較高。對照標(biāo)準(zhǔn)曲線，可做出較為精確的定量分析。實(shí)施中也可以分別用不同顏色的熒光素(13’)，如用Cy5標(biāo)記待檢樣品(抗原30)既雙標(biāo)記，或多標(biāo)記實(shí)驗(yàn)進(jìn)行，見圖10.5。5.橋聯(lián)法將包被了不同化學(xué)藥物分子(半抗原11)的藥物微珠(17)分別鑲嵌在不同的微孔(3)中，封蓋，加封閉液封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。加入親合素或鏈親合素(33)標(biāo)記的待檢樣品(藥物11的靶蛋白分子32)，緩沖液流洗或浸洗去除樣品中未結(jié)合的游離藥物靶蛋白分子，再加入生物素(34)標(biāo)記的HRP(酶15)；緩沖液流洗或浸洗去除未結(jié)合的游離酶標(biāo)記物，加入底物(16)，陽性孔生成有色產(chǎn)物或發(fā)光產(chǎn)物(35)，觀察各孔的顏色變化或發(fā)光強(qiáng)弱，判斷分析結(jié)果。在前述的操作方法1-4中，均可采用橋聯(lián)法進(jìn)行，以運(yùn)用其放大作用提高檢測的靈敏度。
實(shí)施中，在同一檢測系統(tǒng)中，常需同時(shí)進(jìn)行對應(yīng)抗原和抗體的檢測，以判斷患者的免疫力、感染狀態(tài)及傳染性。最簡捷的解決方案是直接法和直接橋聯(lián)法，但直接法因靈敏度低，而較少采用；其次是雙標(biāo)記或多標(biāo)記法，再其次是采用分區(qū)板法(申請?zhí)枮?0120798.9)。本發(fā)明在實(shí)施中也可選用中國專利號為01207812.3和申請?zhí)枮?0120798.9所述的微孔板和專用檢測板及技術(shù)方案。在以酶為標(biāo)記物和需要對感興趣的反應(yīng)孔做進(jìn)一步分析時(shí)，優(yōu)選本發(fā)明所述的檢測板，特別是具有圖5所示微流路特征的檢測板。
檢測板中的鑲嵌微珠在進(jìn)行免疫學(xué)檢測時(shí)將優(yōu)選多孔和實(shí)心的聚苯乙烯珠和玻璃珠。聚苯乙烯微珠將采用同位素照射、濃硫酸/重鉻酸鉀或硝酸浸泡等處理；并根據(jù)靈敏度和后續(xù)分析處理等需要的不同分別采用多聚賴氨酸或戊二醛處理，也可以選用商售聚苯乙烯珠、玻璃珠和多肽固相合成用的固相基質(zhì)。
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。實(shí)施例I三維立體鑲嵌式高通量生物檢測技術(shù)在預(yù)防先天畸形和宮內(nèi)感染中的應(yīng)用。
風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒、柯薩基病毒、弓形體是引起宮內(nèi)感染并導(dǎo)致胎兒畸形的主要病原體；乙肝、梅毒和艾滋病等是可以通過垂直傳播引起新生兒感染的傳染性疾病的病原體。對育齡和妊娠婦女開展上述病原體感染的檢測診斷是預(yù)防先天性畸形和新生兒感染的重要手段，在實(shí)施中的具體操作步驟如下1.包被微珠的制備①微珠的制備可因所選固相基質(zhì)材料的不同而有所不同，在此僅以聚苯乙烯微珠為例。經(jīng)同位素照射的聚苯乙烯塑料微珠用洗液(濃硫酸和重鉻酸鉀溶液)浸泡過夜，蒸餾水漂洗、烘干。用0.1-5％的戊二醛溶液浸泡處理，漂洗，分裝于不同的試管中；或用0.05-0.5mg/ml的多聚賴氨酸浸泡處理，分別加入含上述病原微生物不同抗原(0.5-100ug/ml)的碳酸緩沖液(CB，50mM，pH8.6-10.0)，常溫孵育6小時(shí)或4℃過夜。CB充分漂洗后，加入封閉液(PBS，50mM pH6.8-7.8，NaCl 100mM，含1-5％正常血清和其它封閉液添加劑)封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。
②以氨基酸合成儀通過固相合成的上述病原微生物的特異性半抗原小肽為抗原，直接以其固相載體微珠與合成產(chǎn)物為包被微珠(不經(jīng)裂解或斷鏈處理)，分裝于微量反應(yīng)管中加入封閉液(PBS，50mM pH6.8-7.8，NaCl 100mM，含1-5％正常血清和其它封閉液添加劑)封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。2.檢測板的制備
從進(jìn)液孔(6)端開始，將上述封閉處理的微珠依序嵌入微孔板的微孔中，加蓋封板。經(jīng)進(jìn)液孔加入封閉液，常溫孵育6小時(shí)或4℃過夜。3.檢測樣品待檢者血清20ul，PBS適量稀釋，取100ul經(jīng)進(jìn)液孔加入檢測板中，室溫孵育20分鐘；PBST(PBS含0.01-0.2％Tween 20)流洗5-10分鐘；加入含Cy3標(biāo)記的羊抗人IgG和Cy5標(biāo)記的羊抗入IgM混合液100ul，室溫孵育20分鐘；PBSA(PBST含2％BSA)流洗5-10分鐘。4.觀察結(jié)果檢測板置熒光顯微鏡或掃描儀分析結(jié)果。Cy3陽性表示有感染史，超過標(biāo)準(zhǔn)值提示有近期感染；Cy5陽性表明近期感染，可能處于帶毒狀態(tài)，有傳染性，不宜妊娠。實(shí)施例II三維立體鑲嵌式高通量生物檢測技術(shù)在細(xì)胞蛋白質(zhì)組表達(dá)譜研究中的應(yīng)用。
對個(gè)體而言，盡管全身各組織器官的細(xì)胞所攜帶的基因都相同，但表達(dá)的蛋白種類和數(shù)量則千差萬別。研究細(xì)胞蛋白質(zhì)組表達(dá)譜不僅有助于了解細(xì)胞的正常功能和調(diào)控機(jī)制，而且還可以幫助人類了解病理或異常狀態(tài)下的功能狀態(tài)和調(diào)控機(jī)制，為疾病的診斷、治療提供標(biāo)志分子或靶分子。1.微珠的制備①微珠的制備在此以經(jīng)過進(jìn)一步顆粒篩分的商售多孔玻璃珠為固相基質(zhì)，按廠商產(chǎn)品說明書要求將純化的抗不同蛋白質(zhì)抗原的單克隆抗體與之共育，反應(yīng)完成后，充分漂洗并封閉殘留的活化基團(tuán)，將封閉處理的包被微珠分裝于不同的試管中。
②將包被有抗小鼠免疫球蛋白Fc段抗體(26)的抗抗體微珠(27)與含有小鼠單克隆抗體(28)的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)液或腹水共育，通過抗原抗體反應(yīng)將單克隆抗體吸附在微珠表面，待充分反應(yīng)后，用緩沖液漂洗；加入戊二醛處理30-60分鐘，Tris緩沖液充分漂洗，獲得包被有小鼠抗特異性抗原單克隆抗體的生物微珠-抗體免疫微珠(29)。2.檢測板的制備從進(jìn)液孔端開始，將包被有不同特異性單克隆抗體的微珠依序嵌入微孔板的微孔中，加蓋封板，經(jīng)進(jìn)液孔加入封閉液，常溫孵育6小時(shí)或4℃過夜。3.檢測樣品裂解處理的組織或細(xì)胞液，取適量測定蛋白濃度，經(jīng)熒光標(biāo)記后，取適量調(diào)整體積至300-500ul，經(jīng)進(jìn)液孔緩慢加入檢測板中，室溫孵育30-60分鐘；流洗5-10分鐘。4.觀察結(jié)果熒光顯微鏡或掃描儀分析結(jié)果。比較不同來源或經(jīng)不同處理的組織細(xì)胞的蛋白質(zhì)組表達(dá)譜，分析差異譜帶與功能或疾病的關(guān)系，確定感興趣的蛋白譜帶。5.質(zhì)譜分析對分析中感興趣的蛋白譜帶，對照檢測板中微珠的排列，取出相應(yīng)的微珠置微量反應(yīng)試管中，加入解吸附液，然后取適量進(jìn)行質(zhì)譜分析以測定蛋白質(zhì)的分子量；或在原反應(yīng)孔中加入胰蛋白酶(蛋白質(zhì)水解酶)，室溫或37℃反應(yīng)2-6小時(shí)或消化過夜，取適量點(diǎn)樣進(jìn)行質(zhì)譜分析，獲得蛋白指紋圖譜，通過計(jì)算機(jī)檢索以分析蛋白質(zhì)的氨基酸順序。6.蛋白質(zhì)磷酸化分析取適量酶水解液，加入適量體積的細(xì)菌堿性磷酸酶(溶于HEPES 20mmol/L，pH7.0，含NaCl 150mmol/L，0.1％Triton X-100，10％甘油)，30℃反應(yīng)60分鐘，取適量進(jìn)行質(zhì)譜分析；或?qū)?fù)孔中的微珠取出置微量反應(yīng)試管中，加入磷酸酶，待反應(yīng)徹底后加入解吸附液，然后取適量進(jìn)行質(zhì)譜分析，對照未經(jīng)磷酸酶處理的微珠分析結(jié)果，以測定和分析蛋白質(zhì)有無磷酸化以及磷酸化的可能部位。7.蛋白質(zhì)糖基化分析將微珠取出置微量反應(yīng)試管中或在原孔中，加入PNGase試劑(溶于Tris-HCl緩沖液中，20mmol/L，pH7.2，含50mmol/L NaCl，lmmol/L EDTA)適量，37℃反應(yīng)60-120分鐘，取適量進(jìn)行質(zhì)譜或色譜分析，以測定和分析蛋白質(zhì)有無糖基化及糖基化的程度。8.蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和分子量測定取適量細(xì)胞裂解液，根據(jù)步驟4的分析結(jié)果，與對應(yīng)微珠反應(yīng)，充分漂洗后，分裝于不同的微量試管中，分別加入專用等電聚焦和SDS-PAGE電泳樣品緩沖液，取出適量分別電泳，以測定等電點(diǎn)和分子量。實(shí)施例III三維立體鑲嵌式高通量生物檢測技術(shù)在新藥開發(fā)研究中的應(yīng)用。
在新藥的研究開發(fā)中，通常是根據(jù)靶蛋白分子的三維晶像結(jié)構(gòu)或已知的藥物分子結(jié)構(gòu)，合成大量具有不同細(xì)微結(jié)構(gòu)差異的新的化合物-先導(dǎo)化合物。對新合成的先導(dǎo)化合物需進(jìn)行結(jié)合力，結(jié)合特異性，代謝途徑和代謝速度等的高通量分析，以分析新合成的先導(dǎo)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)與藥效和藥性及其與毒性的關(guān)系。1.微珠的制備微珠的制備以商售的活化或修飾的玻璃微珠(Sigma公司)，聚苯乙烯等樹脂為載體基質(zhì)，運(yùn)用不同的藥物合成途徑和技術(shù)路線進(jìn)行固相合成，可獲得具有不同化學(xué)基團(tuán)和分子結(jié)構(gòu)的各種先導(dǎo)化合物。新獲得的先導(dǎo)化合物連同固相合成載體，不經(jīng)解鏈處理，作為包被微珠直接使用。2.檢測板的制備從進(jìn)液孔端開始，將帶有先導(dǎo)化合物的樹脂顆?；蛭⒅橐佬蚍謩e嵌入微孔板的不同微孔中，加蓋膜或蓋板封板，經(jīng)進(jìn)液孔加入封閉液，封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。3.檢測樣品熒光標(biāo)記的靶蛋白分子溶于PBS或TBS(Tris-HCl)等適宜緩沖液中，取適量體積(50-500ul)經(jīng)進(jìn)液孔加入檢測板中，室溫孵育30-60分鐘，用PBS或TBS流洗5-10分鐘。4.觀察結(jié)果用激光共焦顯微鏡、掃描儀或熒光顯微鏡記錄結(jié)果。5.流洗分別用不同酸堿度的緩沖液系統(tǒng)(如醋酸緩沖液、PBS或TBS等)和不同離子強(qiáng)度的緩沖液流洗5-10分鐘。6.每次流洗后用激光共焦顯微鏡、掃描儀或熒光顯微鏡記錄結(jié)果。分析檢測板各孔在不同流洗條件下，熒光強(qiáng)度的變化，以獲得各不同先導(dǎo)化合物與靶蛋白分子的親合力，結(jié)合穩(wěn)定性，細(xì)微結(jié)構(gòu)變化對先導(dǎo)化合物與靶分子結(jié)合穩(wěn)定性的影響。
本發(fā)明把固相合成技術(shù)和吸附層析、毛細(xì)管電泳等分離技術(shù)與生物芯片等分析技術(shù)相結(jié)合，是一種全新概念的生物學(xué)分析檢測技術(shù)，集數(shù)種技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)于一身，具有信息量大、定量準(zhǔn)確、靈敏度高、制造成本低等突出優(yōu)點(diǎn)，可廣泛用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥物學(xué)，環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域。
權(quán)利要求
1.一種可檢測樣品中的化學(xué)/生物分子、細(xì)胞、細(xì)菌和病毒等的鑲嵌式高通量三維立體生物檢測技術(shù)及試劑盒的制備方法，該技術(shù)和試劑盒至少包括下述成分或步驟①檢測板由微孔板、微流路和微珠等組成；微孔板由板體(1)和板蓋(2)組成；微流路由微孔(3)、微槽(4)和/或微管(5)、進(jìn)液孔(6)、出液孔(7)、密封圈(8).等結(jié)構(gòu)組成，可分別或共同位于板體(1)或板蓋(2)上；微珠(9)可通過表面帶有不同活性基團(tuán)的手臂分子或涂層(10)等包被不同的化學(xué)分子(11)或生物分子(12)，并按一定的順序分別鑲嵌在不同的微孔(3)中；②被檢樣品直接或經(jīng)過處理后由進(jìn)液孔(6)進(jìn)入微孔板、沿微流路，經(jīng)微槽(4)和/或微管(5)流經(jīng)微孔(3)與微珠(9)表面包被的化學(xué)分子(11)、生物分子(12)等相互作用或特異性結(jié)合；未結(jié)合的樣品成分沿微流路經(jīng)出液孔(7)流出；③用標(biāo)記分子(13)或其不同標(biāo)記物(14)標(biāo)記被檢樣品；④洗液漂洗去除檢測板中非特異性結(jié)合的和殘留的樣品、標(biāo)記物(14)或樣品標(biāo)記物等；⑤目測或用掃描儀等檢測各微孔中標(biāo)記分子(13)的有無與含量，分析被檢樣品中被檢物的有無、含量、組成、來源、組織/細(xì)胞學(xué)定位或排列順序等；⑥標(biāo)記物為酶(15)時(shí)，觀察結(jié)果前需加入底物(16)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微孔板由板體(1)和板蓋(2)組成，板體和板蓋上可分別具有微孔(3)、微槽(4)或微管(5)、進(jìn)液孔(6)、出液孔(7)、密封圈(8)、驅(qū)動孔(19)、定位孔(20)和視窗(21)等部分或全部結(jié)構(gòu)；微孔按一定的格式排列，其間有微槽(4)或微管(5)直接或間接兩兩相連；在蜂巢式微孔板可無微孔和微管或無微流路(通過視窗21添加樣品和漂洗)板體(1)和板蓋(2)為任何可加工成型的、透光的、不透光的或反光的硬質(zhì)或軟質(zhì)材料，可加工成方形、長方形、園盤型或其它外觀形狀；板體(1)和板蓋(2)分別或共同經(jīng)不同的化學(xué)修飾或表面處理可獲得具有惰性或活性基團(tuán)的分子表面或涂層(10)，活性基團(tuán)的涂層或分子表面可進(jìn)一步包被不同的化學(xué)分子(11)或生物分子(12)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流路由微孔(3)、微槽(4)或微管(5)、與外界相通的進(jìn)液孔(6)、出液孔(7)和密封圈(8)等結(jié)構(gòu)組成；上述結(jié)構(gòu)可分別位于板體或板蓋上，也可全部位于板體(1)或板蓋(2)上。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微珠(9)是由任何可加工成型的材質(zhì)，經(jīng)精加工而成的，大小均一、具有不同外觀形狀的多孔或?qū)嵭捏w；經(jīng)射線照射、化學(xué)修飾或表面處理后，表面可獲得帶有不同化學(xué)活性基團(tuán)的手臂分子或涂層(10)；手臂分子上的活性化學(xué)基團(tuán)可進(jìn)一步與不同的化學(xué)分子(11)或生物分子(12)等連接，將其包被在微珠表面，生成具有不同結(jié)合特性的藥物微珠(17)和生物微珠(18)等。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、權(quán)利要求2和權(quán)利要求4所述的包被是指在微珠(9)和微孔(3)的涂層或手臂分子(10)上，分別連接不同的化學(xué)分子(11)或生物分子(12)，獲得具有不同結(jié)合特性的微珠或微孔。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、權(quán)利要求4和5所述的微珠可以用下述方法制備，其步驟至少包括①將包被有抗原特異性抗體(22)的抗體微珠(23)與含有過量特異性抗原(24)的緩沖液共育，通過抗原抗體反應(yīng)將特異性抗原(24)吸附在微珠表面，待充分反應(yīng)后，用緩沖液充分漂洗；②加入戊二醛或炭二亞胺等雙功能交聯(lián)劑；③緩沖液充分漂洗，獲得帶有特異性抗原的生物微珠-抗原免疫微珠(25)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1、權(quán)利要求4和5所述的微珠可以用下述方法制備，其步驟至少包括①將包被有抗小鼠免疫球蛋白Fc段抗體(26)的抗抗體微珠(27)與含有小鼠單克隆抗體(28)的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)液或腹水共育，通過抗原抗體反應(yīng)將單克隆抗體吸附在微珠表面，待充分反應(yīng)后，用緩沖液漂洗；②加入戊二醛或炭二亞胺等雙功能交聯(lián)劑；③充分漂洗，獲得包被有小鼠抗特異性抗原單克隆抗體的生物微珠-抗體免疫微珠(29)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，可采用下述方法進(jìn)行定量分析在同一塊微孔板上包被同一種化學(xué)或生物分子的微孔(2)和鑲嵌微珠(4)的數(shù)量可有1個(gè)或1個(gè)以上的復(fù)孔，當(dāng)樣品沿微流路逐孔流經(jīng)各微孔及其復(fù)孔時(shí)，對應(yīng)的被檢測物被不斷結(jié)合，并不斷地從標(biāo)本液中去除，因此，各微孔及其復(fù)孔的結(jié)合量，因前后排列順序的不同逐漸減少，根據(jù)各微孔與復(fù)孔反應(yīng)的有無與強(qiáng)弱變化，即可進(jìn)行定量分析；在進(jìn)行定量分析時(shí)，可按此方法設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)對照物或參照物，借助計(jì)算機(jī)分析繪出被檢物濃度-反應(yīng)孔數(shù)量及其強(qiáng)弱變化曲線，結(jié)合標(biāo)本體積，獲得定量分析結(jié)果。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，至少裝有一塊檢測板，其每個(gè)微孔中至少鑲嵌一粒微珠，微珠表面分別包被某種化學(xué)或生物分子，并與下述成分分別或共同組成不同的試劑盒①至少有一管組織/細(xì)胞或微生物樣品處理液；②至少有一管為蛋白質(zhì)濃度檢測分析試劑；③至少有一種含標(biāo)記分子或標(biāo)記物的樣品標(biāo)記試劑；④至少有一管洗滌液或其濃縮液；⑤在標(biāo)記物為酶類時(shí)，至少有一種顯色底物或發(fā)光底物；⑥至少有一管裝有表面具有某種化學(xué)活性基團(tuán)或包被了某種生物分子的微珠；⑦至少有一管蛋白質(zhì)磷酸化分析試劑；⑧至少有一管為蛋白水解酶；⑨至少有一管為電泳樣品緩沖液；⑩至少有一管為蛋白質(zhì)糖基化分析試劑；
10.根據(jù)權(quán)利要求1和權(quán)利要求9所述的檢測方法和試劑盒，在完成檢測分析后，還可以通過下述不同的方法和試劑盒中的試劑對微孔板各不同孔所結(jié)合的樣品成分分別做質(zhì)譜分析、氨基酸序列測定、蛋白質(zhì)磷酸化以及糖基化等進(jìn)一步分析前的處理(1)直接在感興趣的微孔中加入蛋白水解酶或磷酸酶或電泳樣品緩沖液或蛋白質(zhì)糖基化分析等試劑，對微孔和微珠的結(jié)合物在原位做進(jìn)一步分析前的樣品處理；(2)將微孔中的生物微珠取出，在微量反應(yīng)容器中分別加入蛋白水解酶或磷酸酶或電泳樣品緩沖液或蛋白質(zhì)糖基化分析等試劑做進(jìn)一步分析前的樣品處理；(3)將新鮮樣品分別與感興趣微孔的復(fù)本微珠共育，以同樣的條件重復(fù)微孔板的操作步驟，將樣品中感興趣的物質(zhì)成分吸附在微珠上，充分漂洗去除未結(jié)合的樣品混合物，加入蛋白水解酶或磷酸酶或電泳樣品緩沖液或蛋白質(zhì)糖基化分析等試劑，對結(jié)合物做進(jìn)一步分析前的樣品處理。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鑲嵌式高通量三維立體生物檢測技術(shù)及試劑盒的制備方法，該技術(shù)靈敏快速、信息量大，制造簡便、成本低，可對樣品中多種不同的生物/化學(xué)成分、細(xì)胞或微生物等同時(shí)進(jìn)行檢測分析。主要特征在于將包被不同化學(xué)或生物分子的微珠，分別鑲嵌在檢測板的不同微孔中，微孔間有微管相連，并同進(jìn)/出液口形成微流路與外界相通，樣品經(jīng)微流路與微珠表面的包被分子反應(yīng)，其結(jié)果用目測或儀器記錄分析?？蓮V泛地用于環(huán)境檢測、醫(yī)藥研究、疾病診斷和蛋白質(zhì)組學(xué)等領(lǐng)域的研究與開發(fā)。
文檔編號G01N33/531GK1464307SQ0212132
公開日2003年12月31日 申請日期2002年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月14日
發(fā)明者趙翀 申請人:趙翀