專利名稱：生物物質(zhì)檢測用元件、方法及裝置、帶電物質(zhì)移動裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因、蛋白質(zhì)等生物物質(zhì)的檢測用的生物物質(zhì)檢測用元件、生物物質(zhì)檢測周方法及裝置、以及帶電物質(zhì)移動裝置。
人們知道，患者在感染C型肝炎后，經(jīng)過肝硬化向肝癌轉(zhuǎn)變，采用干擾素治療是治療方法之一。但是報告顯示，在日本人中干擾素的照射只對2～3成的人有效，即使有效副作用也很大。為此，預(yù)先對干擾素的治療效果進(jìn)行預(yù)測，只有希望得到期待的效果時才使用的預(yù)測治療(テイラ一メイド)醫(yī)療最近開始引起關(guān)注。
在干擾素的治療效果預(yù)測中，迄今為止已知的方法均通過基因水平來調(diào)查病毒的類型或病毒的量。認(rèn)為日本人中多數(shù)對1b型效果不明顯；對2a型雖然有效果，但當(dāng)病毒的量超過106copy/mL時，大多效果也不明顯。在實際的診斷中多將以上方法組合使用，然而也有難于進(jìn)行預(yù)測的情況。最近，有報道采用以存在于編碼MxA蛋白質(zhì)的啟動子區(qū)中的堿基多態(tài)性(SNP)為指標(biāo)的方法進(jìn)行干擾素的治療效果預(yù)測。據(jù)說對G/G型，干擾素的治療效果較低，而對G/T、T/T型具有較好的作用。
通過上述的解析基因水平的方法，對干擾素的治療效果的預(yù)測成為可能一直在進(jìn)行。但到目前為止，均采用復(fù)雜的、昂貴的現(xiàn)有技術(shù)(電泳、微板+EIA等)進(jìn)行，在臨床檢查中迫切尋求更簡便的方法。
在此背景下，采用被稱為DNA芯片的生物物質(zhì)檢測元件進(jìn)行的基因檢測技術(shù)為人們所關(guān)注(Beattie等，1993，F(xiàn)odor等1991，Khrapko等1989，Southern等1994)。DNA芯片是將多種序列不同的DNA探針固定在數(shù)cm的見方的玻璃或硅的芯片上制得的，在芯片上使以熒光色素、放射性同位素(RI)標(biāo)記的樣品基因、或未標(biāo)記的樣品基因與標(biāo)記的寡核苷酸的混合物進(jìn)行反應(yīng)。若在樣品中存在與芯片上的DNA探針的互補(bǔ)的序列，則會得到芯片上特定部位發(fā)出的信號。如果預(yù)先知道固定化的DNA探針的序列及位置，就可以簡單地知道樣品中基因的堿基序列。上述的DNA芯片，通過一次試驗可得到關(guān)于堿基序列的很多的信息，作為臨床診斷技術(shù)，有可利用的可能性(Pease等1994，Parinov等1996)。
圖25為采用DNA芯片的電化學(xué)基因檢測方法原理的模式圖。
現(xiàn)有的代表性的DNA芯片，從芯片一端設(shè)置的樣品液導(dǎo)入部將由基因的水溶液組成的樣品液導(dǎo)入，流過固定化在矩陣狀分量中的各種DNA探針上后，通過芯片另一端設(shè)置的樣品液排出部排出。DNA芯片整體為樹脂制的封套所覆蓋，固定DNA探針的部分，為讀取熒光等光學(xué)信號制成透明的。
上述的現(xiàn)有的DNA芯片的問題在于，樣品液在由芯片的一端流向另一端的過程中，形成被導(dǎo)入矩陣狀排列的DNA探針上的構(gòu)成，樣品液很難均一地流過DNA探針之上，使基因很難與DNA探針確實地進(jìn)行反應(yīng)，容易使檢測的結(jié)果產(chǎn)生波動。
另外，一般樣品液中的基因的濃度很稀薄，特別是使用沒有基因濃縮作用的現(xiàn)有的DNA芯片時，有必要采用PCR法等基因擴(kuò)增法預(yù)先對作為檢測對象的基因進(jìn)行擴(kuò)增。
在采用DNA芯片通過電化學(xué)方法測定基因的生物物質(zhì)檢測裝置中，現(xiàn)有采用如圖27所示的，向容器100中容納的適當(dāng)?shù)碾娊赓|(zhì)溶液中的電極施加電壓，同時進(jìn)行電流測定。即容器中插有稱為對極、參比極及作用極的電極101、102和103。
參比極102、對極101是提供基準(zhǔn)電位的電極，用以維持設(shè)定的電位。在參比極102和對極101之間連接著電壓計106。該電壓計106測定對極101的電位。在對極101和作用極103之間連接著可變直流電源104。通過此可變直流電源104施加電壓。通過使此可變直流電壓源104施加的電壓變化(具體地來說，掃描)從而產(chǎn)生電流的變化。通過電流計105測定，對是否存在基因進(jìn)行檢測。
如圖28為采用圖27顯示構(gòu)造的生物物質(zhì)檢測裝置，使用核酸插入劑用電化學(xué)方法進(jìn)行基因檢測的順序。首先，供給樣品液(步驟S1)。使樣品液附著在固定化于作用極上的DNA探針(與特定的DNA反應(yīng)的單鏈DNA鏈)上，將樣品液中的DNA轉(zhuǎn)變成單鏈狀態(tài)進(jìn)行雜交。然后，將未附著于DNA探針上的樣品液清洗(步驟S2)，繼而為提高檢測的靈敏度，供給與雙鏈DNA進(jìn)行特異性反應(yīng)的插入劑(核酸插入劑)(步驟S3)，進(jìn)而將多余的插入劑清洗(步驟S4)。最后，在對極101和作用極103之間加以電壓，測定插入劑產(chǎn)生的氧化電流，即測定插入劑產(chǎn)生的電化學(xué)信號(步驟5)。
圖26表示使用Hoechst 33258為插入劑的電流-電位特性曲線。
現(xiàn)有的生物物質(zhì)檢測裝置由于對一個作用極(DNA芯片)僅測定一次電流，很難提高基因檢測的靈敏度。圖29表示使用電化學(xué)DNA芯片，測定某個質(zhì)粒(YRBYRB259)時電流隨濃度的變化。可見由于本底電流較高，難以對低濃度的基因進(jìn)行檢測。由于一般樣品液中的基因的濃度很稀薄，有必要采用PCR法等基因擴(kuò)增法預(yù)先對作為檢測對象的基因進(jìn)行擴(kuò)增。
按照本發(fā)明的實施方式，提供一種檢測含有帶電的生物物質(zhì)的樣品液中的該生物物質(zhì)的生物物質(zhì)檢測裝置。該生物物質(zhì)檢測裝置包括基板及在基板上沿圓周方向以一定距離間隔排列的生物物質(zhì)檢測用元件。該生物物質(zhì)檢測用元件包含分別固定化了與特定的生物物質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)的配體各個電極。向基板上前述的電極排列的中央部分導(dǎo)入樣品液，使此樣品液向電極的方向呈放射狀移動。
如此，在沿著圓周方向配置的生物物質(zhì)檢測用元件排列的電極的排列的中央部分的樣品液導(dǎo)入部將樣品液導(dǎo)入，均勻地供給到在生物物質(zhì)檢測用元件周圍部分設(shè)置的配體固定化部的該電極上，從而使對樣品液中的生物物質(zhì)的檢測在均一的條件下進(jìn)行變?yōu)榭赡堋?br> 在基板上的樣品液接受部(導(dǎo)入樣品液的位置)至少設(shè)置一個第1電極，在基板上的第1電極周圍沿著圓周方向按一定間隔，固定分別與特定的生物物質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)的配體而成的多個的第2電極，構(gòu)成生物物質(zhì)檢測用元件，通過驅(qū)動此生物物質(zhì)檢測用元件的驅(qū)動電路，向第1電極施加與生物物質(zhì)所帶電荷同極性的電壓，向第2電極的至少一部分施加與生物物質(zhì)所帶電荷相反極性的電壓進(jìn)行驅(qū)動動作，利用靜電作用力使生物物質(zhì)在第1電極上效果明顯地移動。
另外，通過驅(qū)動生物物質(zhì)檢測用元件的驅(qū)動電路，分別向第2電極中圓周方向的一部分的電極施加與所帶電荷相反極性的電壓，另一部分的電極施加與所帶電荷相同極性的電壓，同時將施加該同極性的電壓及相反極性的電壓的電極的位置按順序變化進(jìn)行驅(qū)動動作，使樣品液中的檢測對象生物物質(zhì)沿第2電極排列的圓周方向移動，可與該第2電極的各個固定的配體均勻地有效進(jìn)行充分的反應(yīng)。
本發(fā)明的實施方式中，在生物物質(zhì)檢測用元件中的第1電極與第2電極之間的以同心圓狀配置再至少設(shè)置兩個環(huán)狀電極，通過驅(qū)動生物物質(zhì)檢測用元件的驅(qū)動電路，施加對此至少兩個環(huán)狀電極極性的控制的電壓，進(jìn)行驅(qū)動動作，使樣品液中的生物物質(zhì)在濃縮的同時向第2電極的方向移動。
這樣，通過使導(dǎo)入到生物物質(zhì)檢測用元件的中央部的樣品液中的生物物質(zhì)一邊濃縮，一邊按順序地向周邊部分移動，最終以濃縮狀態(tài)供給到固定著配體的第2電極，不用像現(xiàn)有的使用基因擴(kuò)增法預(yù)先對檢測對象進(jìn)行擴(kuò)增，使檢測對象的生物物質(zhì)與配體充分地進(jìn)行反應(yīng)，從而提高檢測的效率。
基于本發(fā)明的實施方式的生物物質(zhì)檢測用元件得到的檢測信號，可以是電流、電位等電信號，也可以是熒光、發(fā)光、顯色等光學(xué)信號。
另外，本發(fā)明的目的在于，提供一種可以使生物物質(zhì)與配體在均一的條件下進(jìn)行反應(yīng)、且可以對樣品液中的生物物質(zhì)進(jìn)行濃縮從而進(jìn)一步提高檢測靈敏度的生物物質(zhì)檢測方法。
按照本發(fā)明的實施方式，提供一種對含有帶電的生物物質(zhì)的樣品液中的該生物物質(zhì)的檢測方法。該生物物質(zhì)檢測方法中，向基板上排列的分別固定化了與特定的生物物質(zhì)反應(yīng)的配體的電極形成的生物物質(zhì)檢測元件上供給樣品液后(a)向生物物質(zhì)檢測元件上供給插入劑，(b)基于特定的生物物質(zhì)與配體反應(yīng)，測定插入劑的電化學(xué)信號，以及(c)將配體上附著的插入劑的除去，通過將上述一系列的步驟反復(fù)操作，進(jìn)行生物物質(zhì)的檢測。
因此，使用基板上排列的分別固定化了與特定的生物物質(zhì)反應(yīng)的配體的電極形成的生物物質(zhì)檢測元件，樣品液和插入劑經(jīng)過清洗步驟，可以反復(fù)供給到生物物質(zhì)檢測元件上，著眼于此，通過(a)向生物物質(zhì)檢測元件供給插入劑，(b)基于特定的生物物質(zhì)與配體反應(yīng)，測定插入劑的電化學(xué)信號，以及(c)將配體上附著的插入劑除去，上述一系列步驟的反復(fù)操作，進(jìn)行電化學(xué)信號的累計，可以進(jìn)行對生物物質(zhì)的高靈敏度的檢測。
另外，本發(fā)明的實施方式提供一種帶電物質(zhì)的移動裝置。這個帶電物質(zhì)的移動裝置具備基板、在基板上沿規(guī)定的方向排列的多個的電極和使樣品液中的帶電物質(zhì)在該電極上沿規(guī)定的方向移動的驅(qū)動該電極的驅(qū)動電路。驅(qū)動電路上多個的電極中一部分施加與帶電物質(zhì)的帶電極性相反的電壓，同時將施加與帶電物質(zhì)的帶電極性相反電壓的電極的位置沿電極的排列方向依次變化。
這種帶電物質(zhì)的移動裝置應(yīng)用于基因檢測裝置時，在多個電極上分別固定著與特定的帶電物質(zhì)反應(yīng)的配體。由于帶電物質(zhì)在電極上沿排列方向依次移動，可使生物物質(zhì)與固定在電極上的各配體高效率地反應(yīng)。
另外，涉及本發(fā)明的實施方式的帶電物質(zhì)的移動裝置中，與向驅(qū)動電路的多個的電極中施加與帶電物質(zhì)的帶電極性相反的電壓相對，也可以向電極的排列方向上相鄰的至少一個電極施加與帶電物質(zhì)的帶電極性相同極性的電壓。這樣鄰接向電極施加電壓后，規(guī)定的電極上通過靜電吸引力捕獲的帶電物質(zhì)因的電極的靜電斥力被關(guān)入該規(guī)定的電極上，可以對帶電物質(zhì)進(jìn)行濃縮，在檢測生物物質(zhì)時，可以提高檢測靈敏度。
附圖的簡略的說明

圖1為顯示本發(fā)明的第1種實施方式的包含生物物質(zhì)檢測用元件的生物物質(zhì)檢測裝置的構(gòu)成的剖視圖。
圖2A為第1種實施方式的上部支架的頂視2B為第1種實施方式的上部支架的剖視2C為第1種實施方式的上部支架的底視3A為第1種實施方式的下部支架的頂視3B為第1種實施方式的下部支架的剖視3C為第1種實施方式的下部支架的底視4為第1種實施方式的生物物質(zhì)檢測用元件的平面圖和生物物質(zhì)檢測用元件的驅(qū)動電路的連線示意5A-5C為第1種實施方式的生物物質(zhì)檢測用元件的基本動作的說明6A-6C為用于說明第1種實施方式的生物物質(zhì)檢測用元件中檢測對象生物物質(zhì)在作用極上的移動動作的7A-7C為用于說明第1種實施方式的變形例的元件的電極構(gòu)成和生物物質(zhì)檢測用元件中檢測對象生物物質(zhì)的濃縮以及向周邊部分的移動動作的8A-8C為用于說明第1種實施方式的變形例的生物物質(zhì)檢測用元件中檢測對象生物物質(zhì)在作用極上的移動動作的9為第1種實施方式的另一變形例的生物物質(zhì)檢測用元件的構(gòu)成的平面示意10為第1種實施方式的再一變形例的生物物質(zhì)檢測用元件的平面圖和生物物質(zhì)檢測用元件的驅(qū)動電路的連線示意11為顯示本發(fā)明的第2種實施方式的生物物質(zhì)檢測裝置構(gòu)成的剖視12為說明第2種實施方式中生物物質(zhì)的檢測順序的流程13為本發(fā)明的第2種實施方式的變形例的生物物質(zhì)檢測元件構(gòu)成的剖視14為適用于本發(fā)明的第3種實施方式的帶電物質(zhì)移動裝置的生物物質(zhì)檢測裝置的構(gòu)成的剖視15為第3種實施方式的生物物質(zhì)檢測元件的簡略構(gòu)成的平面16A-16C為第3種實施方式的生物物質(zhì)檢測元件的第1個驅(qū)動例的示意17A-17C為第3種實施方式的生物物質(zhì)檢測元件的第2個驅(qū)動例的示意18A-18C為第3種實施方式的生物物質(zhì)檢測元件的第3個驅(qū)動例的示意19A-19C為第3種實施方式的生物物質(zhì)檢測元件的第4個驅(qū)動例的示意20A-20C為第3種實施方式的其他生物物質(zhì)檢測元件的電極構(gòu)成和該生物物質(zhì)檢測用元件中檢測對象生物物質(zhì)的濃縮及移動動作的說明21A-21B為第3種實施方式的其他生物物質(zhì)檢測元件的構(gòu)成的剖視22為第3種實施方式的變形例的生物物質(zhì)檢測元件的構(gòu)成的剖視23為適用于本發(fā)明第4種實施方式的帶電物質(zhì)移動裝置的生物物質(zhì)處理裝置的簡略構(gòu)成的示意24為適用于本發(fā)明第5種實施方式的帶電物質(zhì)移動裝置有關(guān)的生物物質(zhì)處理裝置的簡略構(gòu)成中膠團(tuán)結(jié)構(gòu)的示意25為電化學(xué)基因檢測方法的原理說明26為電化學(xué)基因檢測方法中DNA結(jié)合物質(zhì)(Hoechst 33258)的電流-電位應(yīng)答的示意27為使用現(xiàn)有的電化學(xué)檢測的生物物質(zhì)檢測裝置的構(gòu)成的剖視28為使用現(xiàn)有的電化學(xué)檢測的生物物質(zhì)的檢測順序的流程29為使用現(xiàn)有的電化學(xué)檢測方法的生物物質(zhì)的檢測得到的基因檢測結(jié)果例的示意圖發(fā)明詳述以下，參照附圖對本發(fā)明的實施方式進(jìn)行說明。(第1種實施方式)圖1為本發(fā)明的第1種實施方式的生物物質(zhì)檢測裝置的構(gòu)成的剖視圖。在基臺1的上面的中央部分有突出的、用以承載生物物質(zhì)檢測元件5的元件裝載部分2，生物物質(zhì)檢測用元件5將在后面詳細(xì)說明，圖中兩側(cè)分別有樣品液通過孔3，中央部分的下面有與樣品液通過孔3相連的樣品液排出口4。
在基臺1上，主要為使裝載在元件載置部分2上的生物物質(zhì)檢測元件5由上下兩側(cè)固定的同時，將樣品液導(dǎo)向元件5，使通過元件5的樣品液導(dǎo)向樣品液通過孔3，配置了上部支架6及下部支架7。關(guān)于上部支架6及下部支架7的構(gòu)造，將在后面詳細(xì)說明。
在上部支架6的中央部分設(shè)有樣品液導(dǎo)入部分8，在樣品液導(dǎo)入部分8上連接著樣品液供給管10的前端口。樣品液供給管10在圖上未顯示的后端口部分連接著圖上未顯示的樣品液源，樣品液受到來自樣品液的適當(dāng)?shù)恼龎汉蟊粚?dǎo)入樣品液導(dǎo)入部分8。導(dǎo)入到樣品液導(dǎo)入部分8的樣品液被引導(dǎo)到生物物質(zhì)檢測元件5上，在這里供生物物質(zhì)檢測之后，經(jīng)過上部支架6及下部支架7形成的樣品液引導(dǎo)槽9及基臺1上形成的樣品液通過孔3，受到樣品液排出口4適當(dāng)?shù)呢?fù)壓后向外排出。
在上部支架6上有長方形的貫通孔11，通過貫通孔11插入接觸電極15，可以使接觸電極15的前端與生物物質(zhì)檢測元件5上起到作用極的作用的電極相接觸。通過使用接觸電極15可以將生物物質(zhì)檢測信號用電流、電位等電信號的形式采集。
圖2A、2B和2C分別顯示了上部支架6的頂視圖、剖視圖和底視圖。圖2C中以箭頭表示樣品液經(jīng)過的路徑。在上部支架6上與生物物質(zhì)檢測元件5相對的下面的中央部分12(與基臺1上的元件裝置部分2相對的部分)向下側(cè)略微突出，在中央部分12的周圍，形成了與圖1中顯示的樣品液引導(dǎo)槽9連接的環(huán)狀的樣品液通路13。上部支架6的下面設(shè)有形成樣品液引導(dǎo)槽9的凹部9A。
上部支架6的中央部分形成的樣品液導(dǎo)入部分8的前端呈細(xì)的形狀的孔，由此樣品液導(dǎo)入部分8導(dǎo)入的樣品液，首先呈放射狀向四周擴(kuò)散，通過這個過程，將其導(dǎo)向到生物物質(zhì)檢測元件5的配體固定部分上。之后樣品液通過樣品液通路13導(dǎo)向到樣品液導(dǎo)引槽9，經(jīng)前述基臺上形成的樣品液通過孔3由樣品液排出口4向外排出。
圖3A、3B、3C分別表示下部支架7的頂視圖、剖視圖和底視圖。下部支架7的中央部分上形成了圖1中所示的基臺1上的元件裝置部分2插入的孔14。另外，圖中下部支架7的左右兩側(cè)形成了圖1中顯示的樣品液引導(dǎo)槽9另外的一部分形成的矩形的凹部9B及與凹部9B相連的圓形孔9C。
這樣，由樣品液供給管10供給的樣品液，通過上部支架6和下部支架7的引導(dǎo)從生物物質(zhì)檢測元件5的中央部分導(dǎo)入，向元件5的周圍設(shè)置的配體固定部分上均一地供給后由下方排出。從而使樣品液中的生物物質(zhì)的檢測可以在均一的條件下進(jìn)行。
如圖1中所示，生物物質(zhì)檢測元件5由上部支架6和下部支架7固定。此時，生物物質(zhì)檢測元件5相對于生物物質(zhì)檢測裝置是固定的，也就是構(gòu)成了電極一體型也可以，如將上部支架6取走，也可構(gòu)成與生物物質(zhì)檢測裝置相對可脫離的電極分離型。
接下來，參照圖4對本實施方式中生物物質(zhì)檢測元件5的具體結(jié)構(gòu)進(jìn)行說明。
生物物質(zhì)檢測元件5如圖4所示由在元件基板20上的電極21、22、23及電極板24構(gòu)成。電極21、22、23可以與元件基板20的表面在同一面上，或與元件基板20的表面有一定距離埋設(shè)于表面之下亦可。電極21、22、23及電極板24由元件基板20上形成的例如多層布線等相連接。
這里，設(shè)在中央部分的圓形電極21起到對極的作用。以電極21為中心形成的圓形的電極23，發(fā)揮作為為給對極作電位基準(zhǔn)的參比極的作用。在電極23的內(nèi)側(cè)圓周上，按設(shè)定距離配置多個圓形電極22，這些電極22發(fā)揮著檢測生物物質(zhì)的作用極的功能。電極21、22、23的表面上覆蓋著圖中未顯示的絕緣性薄膜，此絕緣性薄膜已進(jìn)行了光刻處理。通過這種處理，電極21、22、23的表面的一部分露出用以采集電信號的導(dǎo)體部分。關(guān)于絕緣性薄膜的光刻處理將在后面詳細(xì)敘述。
作為作用極的電極22上，至少固定著一種特異性的檢測用的配體。即，電極22兼作為配體固定化部。固定化在電極22上的各種各樣的配體，隨檢測對象的生物物質(zhì)的不同，可以選擇基因、基因探針、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段、輔酶、受體及糖鏈中的任一種。
這里，在電極22的各個上固定化不同的配體，一次就可以對多個生物物質(zhì)進(jìn)行檢測。若在各個電極22上固定化相同的配體，也可以一次對大量生物物質(zhì)進(jìn)行檢測。利用光刻技術(shù)，可以預(yù)先對元件基板20上的多個電極22(配體固定化部分)形成圖形，可以提高生物物質(zhì)檢測元件5的批量生產(chǎn)性能。
當(dāng)檢測對象的生物物質(zhì)為基因時，在電極22上作為配體固定著DNA探針。眾所周知，DNA探針是與特定的基因反應(yīng)的單鏈基因。樣品液中的基因為單鏈的狀態(tài)時，只有與電極22上固定的DNA探針相應(yīng)的具有特定堿基序列的基因才會被電極22捕獲，即DNA探針與這個基因進(jìn)行相補(bǔ)的結(jié)合(雜交)。
對以上構(gòu)成進(jìn)行具體說明如下，首先，元件基板20所使用的基板材料沒有特殊的限定，例如，可使用玻璃、石英玻璃、氧化鋁、藍(lán)寶石、鎂橄欖石、碳化硅、氧化硅、氮化硅等無機(jī)絕緣材料。另外，基板材料也可以用聚乙烯、乙烯、聚丙烯、聚異丁烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚對苯二甲酸乙二酯、不飽和聚酯、含氟樹脂、聚氯乙烯、聚偏氯乙烯、聚醋酸乙烯、聚乙烯醇、聚乙烯乙縮醛、丙烯酸樹脂、聚丙烯腈、聚苯乙烯、縮醛樹脂、聚碳酸酯、聚酰胺、酚醛樹脂、脲醛樹脂、環(huán)氧樹脂、三聚氰胺樹脂、苯乙烯丙烯腈共聚物、丙烯腈丁二烯苯乙烯共聚物、硅氧烷樹脂、聚苯醚、聚砜等有機(jī)材料。進(jìn)而，若如后面所述采用光學(xué)方法對生物物質(zhì)進(jìn)行檢測時，基板材料也可適當(dāng)采用尼龍和纖維素等纖維薄膜的材料。
電極21、22、23的適用材料也沒有特殊的限定，特別對作為作用極的電極22的材料(含有配體固定化點)，在用電化學(xué)方法對生物物質(zhì)進(jìn)行檢測時，可使用如金、金合金、銀、鉑、汞、鎳、鈀、硅、鍺、鎵、鎢等的金屬單質(zhì)和至少含這些金屬2種以上的合金，或者用石墨、玻璃態(tài)碳(グラシ一カ一ボン)等的碳等、或它們的氧化物、化合物，或氧化硅等的半導(dǎo)體化合物，CCD、FET、CMOS等各種半導(dǎo)體器件上使用的物質(zhì)。
電極21、22、23的制法可用電鍍、印刷、濺鍍、蒸鍍等。作為蒸鍍法，可用阻抗加熱法、高頻加熱法以及電子束加熱法中的任一種。作為濺鍍法可使用直流兩極濺射、偏壓濺射、非對稱交流濺射、吸氣濺射以及高頻濺射中的任一種。進(jìn)一步，作為電極，也可以使用聚吡咯、聚苯胺等的電解聚合膜或?qū)щ娦愿叻肿印?br> 電極21、22、23的表面覆蓋的絕緣性薄膜所用的絕緣材料也沒有特殊的限定，優(yōu)選光聚合物、光刻膠材料。作為光刻膠材料，使用光曝光用光刻膠、遠(yuǎn)紫外用光刻膠、X線用光刻膠、電子射線用光刻膠。曝光用光刻膠中主原料可舉環(huán)化橡膠、聚肉桂酸、酚醛清漆樹脂等。遠(yuǎn)紫外用光刻膠中可用環(huán)化橡膠、酚醛樹脂、聚甲基異丙烯酮(PMIPK)、聚甲基丙烯酸甲酯等。另外，X線用光刻膠，除COP、丙烯酸甲酯之外，可使用薄膜手冊(オ-ム公司)上記載的物質(zhì)。電子射線用光刻膠，可使用PMMA等《薄膜手冊》(オ-ム公司)上記載的物質(zhì)。此時，所用的光刻膠的厚度希望在10nm～1mm。
由于作為作用極的電極22被光刻膠材料所覆蓋后進(jìn)行光刻，可以將電極22的面積控制為定值。因此，可以使DNA探針等配體的固定化量在各個電極22間分布均一，可使生物物質(zhì)的檢測的重現(xiàn)性良好。以往，一般在最后將光刻膠材料除去，但當(dāng)電極22上固定化DNA探針用于基因檢測時，也可以不將光刻膠材料除去而直接將其作為電極22的一部分使用。此時，使用的刻蝕材料必須為耐水性高的材料。
電極21、22、23上形成的絕緣薄膜也可以采用光刻膠材料之外的材料。例如，Si、Ti、Al、Zn、Pb、Cd、W、Mo、Cr、Ta、Ni等的氧化物、氮化物、碳化物及它們的合金等也可采用。這些材料通過濺鍍、蒸鍍或CVD等形成薄膜后，采用光刻法對電極的外露部分形成圖形，控制面積一定。
電極21、22、23通過電極板24與驅(qū)動電路25相連。驅(qū)動電路25通過對電極21、22、23各電極施加規(guī)定極性的電壓，使導(dǎo)入到生物物質(zhì)檢測元件5的中央部分的樣品液向周圍呈放射狀擴(kuò)散，導(dǎo)向到作用極電極22上，進(jìn)而在電極22上使樣品液中的檢測對象的生物物質(zhì)依次沿電極22的排列方向移動。
這個動作可以參照圖5進(jìn)行說明。檢測對象的生物物質(zhì)為基因時，將作為樣品液的基因的水溶液由樣品液供給管10通過樣品液導(dǎo)入部8導(dǎo)入到生物物質(zhì)檢測元件5上，供給中央部分的電極21上。基因的帶電極性為負(fù)。
導(dǎo)入樣品液時，由如圖5所示的驅(qū)動電路25，分別向作為對極的電極21施加與基因的帶電極性相同的負(fù)極性的電壓，向作為作用極的電極22施加與基因的帶電極性相反的正極性的電壓，向作為參比電極的電極23分別施加負(fù)極性的電壓。因此，供給到電極21上的樣品液受到被施加在與基因的帶電極性相同的負(fù)極性的電壓的電極21上的靜電反作用力的作用，向周邊部分呈放射狀移動。此時，如前面敘述若向樣品液施加若干的負(fù)壓，則樣品液可以以更快的速度移動。
由電極21向周邊部分移動的樣品液最后將到達(dá)電極22。這里，因為電極22上施加了與基因的帶電極性相反的正極性的電壓，基因在靜電作用力的作用下，在電極22上被捕獲。這種情況下，在電極22的外周設(shè)置的環(huán)狀的參比電極電極23，與電極21一樣，被施加與基因的帶電極性相同的負(fù)極性的電壓，電極22上的基因受到電極23的靜電斥力的作用，在電極22上形成向內(nèi)閉合的形狀，不會向電極23之外擴(kuò)散。
這樣在電極22上樣品液中的基因被捕獲后，固定在電極22上的DNA探針與樣品液中特定的基因反應(yīng)而結(jié)合。這為雜交。此時，電極22上的基因因如上述在電極23的靜電斥力的作用下向內(nèi)閉合而被濃縮，與配體的反應(yīng)即雜交可以高效率地進(jìn)行。
接下來如圖5B所示，使電極21和電極22施加的電壓的極性與圖5A相同，僅通過在電極23上施加與基因的帶電極性相反的正極性的電壓，使電極22上樣品液中的基因中，與配體未反應(yīng)的基因因電極23的靜電吸引力而與電極22脫離，被捕獲到電極23上。
之后，若在電極22與電極23上均施加以相同的負(fù)極性電壓，則被捕獲在電極23上的、也就是未與配體進(jìn)行反應(yīng)的基因會更向外移動，與樣品液一起從元件基板20上經(jīng)過樣品液導(dǎo)向槽9和樣品液通過孔3，由樣品液排出口4排出。
另外，也可以控制施加電壓的極性從圖5A的狀態(tài)不是到圖5B而是到圖5C所示的狀態(tài)。也說是說，向電極21上施加電壓的極性為正極性，向電極22上施加電壓的極性為負(fù)極性。同時，向電極23上施加電壓的極性為正極性。另外，電極21的極性為負(fù)極性也可以。由于電極21是正極性，使電極22上的基因從該電極脫離的效果增強(qiáng)。但在中央殘留有不要的基因，其后所以必須進(jìn)行沖洗步驟。另外，當(dāng)電極21是負(fù)極性時，電極22上附著的不要的基因被外側(cè)電極23吸引，使后清洗步驟容易。對于電極21的極性采用正或負(fù)極性來說，優(yōu)選考慮包括清洗步驟的整個系統(tǒng)加以決定。
上述動作說明中，如圖5A、5B所示那樣，對多個的電極22全部施加同檢測對象基因帶電極性相同(負(fù)極性)極性的電壓，利用電極22在圓周上排列，通過動態(tài)切換向電極22上施加的電壓，也可以使樣品中的基因在電極22上按排列方向(圓周方向)依次移動。
參照圖6進(jìn)行說明，首先，如圖6A所示，對電極22中以虛線包圍的相鄰的2個電極組施加正極性電壓，與該電組鄰接的電極施加負(fù)極性電壓。以電極22的排列方向的圓周方向看。施加在電極22上的極性為…正-正-負(fù)-正-正-負(fù)-正-正-負(fù)-正…。
下一步，在規(guī)定的單位時間后，如圖6B所示，在施加正極性電壓的2個電極性的位置分別錯開1個電極，隨之，與2個電極組相鄰的施加負(fù)極性電壓的電極的位置也分別錯開1個電極。進(jìn)一步，在規(guī)定單位時間后，如圖6C所示，在施加正極性電壓的2個電極組的位置和施加負(fù)極性電壓的電極的位置分別錯開1個電極。圖6B、6C的例中，施加正極性電壓的2個電極組的位置和施加負(fù)極性電壓的電極的位置按順時針方向挪動。以下，每單位時間，也就是規(guī)定周期進(jìn)行這樣的切換施加電壓的極性。
這樣，通過對電極22邊切換極性邊施加電壓，樣品液中的檢測對象生物物質(zhì)(例如基因)以圓周方向移動到相鄰的電極22的排列上，可與電極22上固定的配體(例如DNA探針)均一高效地反應(yīng)。也就是說，檢測對象生化學(xué)物質(zhì)通過在電極22排列上的移動過程，必在與該檢測對象生物物質(zhì)有互補(bǔ)關(guān)系的固定配體的電極上的位置，此時，可與該配體發(fā)生反應(yīng)。
此時，因為被配體固定化部分的電極22捕獲的檢測對象的生物物質(zhì)(此例中為基因)受到電極22中施加的與檢測對象的生物物質(zhì)帶電極性相反的電壓的電極的靜電斥力的作用，非特異性結(jié)合的生物物質(zhì)被強(qiáng)制排除，可以使檢測精度顯著提高。
在圖6的例子中，將向相鄰的2個電極22施加以第1種極性的電壓(上例中為負(fù)極性)，向與這兩個電極相鄰的施加相反的第2種極性的電壓(上例中為正極性)的動作沿電極22的排列方向上的錯開一個電極依次進(jìn)行，但并不是限定于此。令施加第1種極性的電壓的電極的個數(shù)為n，施加第2種極性的電壓的電極的個數(shù)為m，將施加電壓進(jìn)行切換時錯開的電極的個數(shù)為p時，n、m、p均可選擇1以上的任意數(shù)。最簡單的情況時，n＝m＝p＝1也可以，此時，在電極22的每個電極上施加的電壓的極性周期性地按負(fù)極性正極性交替進(jìn)行切換。
接下來，參照圖7對發(fā)明中另一實施方式的生物物質(zhì)檢測元件的電極構(gòu)成進(jìn)行說明。
在圖7所示的生物物質(zhì)檢測元件中，中央部分設(shè)置有發(fā)揮作為對極功能的圓形的電極31，其外側(cè)按規(guī)定間隔排列圓環(huán)狀的電極34A，進(jìn)一步在其外側(cè)相隔一定間隔再排列另一個圓環(huán)狀的電極34B。電極34B的外側(cè)圓周上，與前面的實施方式相似，按規(guī)定間隔排列著多個的圓形的電極32，這些電極32發(fā)揮作用極的功能。在電極32的外側(cè)圓周上按設(shè)定間隔設(shè)置有圓環(huán)狀的電極33A，33B，電極33A，33B發(fā)揮參比極的功能。
在這樣的構(gòu)成中，用圖中未表示的電路將圖7中各電極31，34A，32，33A，33B上施加的電壓的極性進(jìn)行切換，可以使樣品液中的生物物質(zhì)一邊濃縮一邊向周邊移動。
也就是說，首先如圖7A所示，向電極31施加負(fù)極性的電壓，向電極34A施加正極性的電壓，向電極34B施加負(fù)極性的電壓，進(jìn)而向電極32施加正極性的電壓，向電極33A，33B施加負(fù)極性的電壓。此時，如前面的實施方式一樣，生物物質(zhì)檢測元件的中央部分導(dǎo)入的樣品液中的帶負(fù)電極性生物物質(zhì)(如基因)就會受到被施加的與其帶電極性同極性電壓的中央部分電極31的靜電斥力的作用，向周邊移動。
這里，因為處于電極31外側(cè)位置的電極34A上施加與樣品液中生物物質(zhì)的帶電極性相反的電壓，處于電極34A外周側(cè)位置的電極34B上施加與樣品液中生物物質(zhì)的帶電極性相同的電壓，從電極31上移動到電極34A上的生物物質(zhì)在電極34A的靜電吸引力和電極34A兩側(cè)位置的電極31及電極34B的靜電斥力的作用下，在電極34A上閉合而被濃縮。
接下來，在驅(qū)動電路的作用下，如圖7B所示，將電極34A上施加的電壓變?yōu)樨?fù)極性，將電極34B上施加的電壓變?yōu)檎龢O性。其他電極31，32，33A，33B上施加的電壓的極性與圖7A的狀態(tài)保持一致。在圖7A中被關(guān)閉在電極34A上的檢測對象生物物質(zhì)，在圖7B的狀態(tài)下因電極34A的靜電斥力的作用和電極34B靜電吸引力的作用而向電極34B上移動。
接下來，在驅(qū)動電路的作用下，如圖7C所示，圖7B的狀態(tài)中僅將電極34B上施加的電壓變?yōu)樨?fù)極性，則在電極34B上移動的檢測對象生物物質(zhì)，會受到電極34A，34B的靜電斥力的作用和電極32靜電吸引力的作用而向電極32上移動。這種狀態(tài)下，電極32上的檢測對象生物物質(zhì)會受到電極32靜電吸引力的作用及其兩側(cè)位置的電極34A和電極33A的靜電斥力的作用而被關(guān)閉在電極32上，從而被濃縮。
這樣生物物質(zhì)檢測元件的中央部分導(dǎo)入的樣品液中的生物物質(zhì)(如基因)就會一邊被濃縮一邊向周邊移動，最終可以以濃縮的狀態(tài)供給于固定有配體的電極32上。也就是說，本實施方式中的固定有配體的電極32上的檢測對象生物物質(zhì)為濃縮的狀態(tài)，不必采用過去的PCR法等基因擴(kuò)增法預(yù)先對檢測對象生物物質(zhì)進(jìn)行擴(kuò)增，可以使檢測對象生物物質(zhì)和配體進(jìn)行高效率的反應(yīng)，提高檢測效率。
另外，本實施方式中的生物物質(zhì)檢測元件也可以同前面的實施方式一樣，如圖8顯示，通過將作用極電極32上施加的電壓的極性進(jìn)行切換，使樣品液中的生物物質(zhì)在電極32上沿排列方向(圓周方向)按順序移動。
也就是說，首先，如圖8A所示，向電極32之中用虛線圈起來的相鄰的2個電極組上施加正極性的電壓，向與這個電極組相鄰的電極施加負(fù)極性的電壓。然后，在設(shè)定時間之后，如圖8B所示，將施加正極性的電壓的2個的電極組位置錯開一個電極，同時將與2個的電極組相鄰的施加負(fù)極性的電壓的電極的位置也錯開一個電極。再經(jīng)過規(guī)定時間之后，如圖8C顯示將施加正極性的電壓的2個的電極組的位置和施加負(fù)極性的電壓的電極的位置分別錯開一個電極。然后，像這樣每隔單位時間即規(guī)定周期，就將施加電壓進(jìn)行切換，使樣品液中的檢測對象生物物質(zhì)(如基因)沿圓周相鄰的電極32的方向移動，與分別固定化在電極32上的配體進(jìn)行均一的高效率的反應(yīng)。
圖9表示第1種實施方式的另一變形例的生物物質(zhì)檢測元件的構(gòu)成的平面圖。
本實施方式中的生物物質(zhì)檢測元件中，在元件基板40的中央上部配置作為對極的圓形的第1電極41，周邊部分配置有作為圓環(huán)狀的參比電極的第3電極43，這與前面的兩個實施方式是一樣的。與前面的兩個實施方式不同的是作用極的第2電極42A、42B如圖所示在同心圓上排成兩列。此例中作為作用極的電極雖排成兩列，但也可排成三列以上。
這樣，由于作為作用極的電極排成多列，可以使檢測對象生物物質(zhì)與固定化在這些電極上的配體的反應(yīng)更確實地進(jìn)行，可以進(jìn)一步提高檢測效率。
圖10表示本發(fā)明中又一種的實施方式中生物物質(zhì)檢測元件和驅(qū)動電路的構(gòu)成。本實施方式中的生物物質(zhì)檢測元件5上，除去了前面的實施方式中說明的第1電極21，在除去電極21的位置上，也就是第2電極的排列的中央部分作為樣品液受入部25。還有，伴隨電極21的除去，電極21和驅(qū)動電路5之間的連線也被除去。
前面的實施方式中，如圖5A中所說明的，通過分別向第1電極21施加與基因帶電極性同樣的負(fù)極性的電壓，向第2電極22施加與基因帶電極性相反的正極性的電壓，供給于電極21上的樣品液受到基因的帶電極性和電極21的靜電斥力的作用，很容易地向電極22呈放射狀的移動。
然而，如果前述的由樣品液排出口4將樣品液向外排出時，適當(dāng)增加對樣品液的負(fù)壓，則供給到樣品液受入部25的樣品液就會像前面的實施方式中敘述的那樣即使不利用電極21的靜電斥力，僅在第2電極22的靜電吸引力的作用下就可以向電極22的方向移動。
另外，同樣的變化也適用于圖7～圖9所示的構(gòu)成中，如除去圖7～圖8中的第1電極31或圖9所示的第1電極41，也可以在除去電極31和電極41的位置上構(gòu)成樣品液接受部。
作為本發(fā)明的生物物質(zhì)檢測元件及生物物質(zhì)檢測裝置的檢測對象樣品檢體沒有特殊的限定，例如血液、血清、白細(xì)胞、尿、糞便、精液、唾液、組織、培養(yǎng)細(xì)胞、咳痰均可使用。這里，當(dāng)檢測對象物為基因時，應(yīng)從以上樣品檢體中提取出如基因等。對提取方法沒有特殊的限定，苯酚-氯仿法等液液萃取法、使用載體的固液萃取法等均可利用。另外，也可以采用市售的核酸提取方法QIAamp(QIAGEN公司出品)、Sumaitest(住友金屬公司出品)等。
然后，將提取出的基因的樣品溶液導(dǎo)入到前面的實施方式中說明的生物物質(zhì)檢測元件(DNA芯片)上，在固定化了配體DNA探針的電極上進(jìn)行雜交反應(yīng)。反應(yīng)溶液可為例如離子強(qiáng)度0.01～5的范圍內(nèi)，pH5～10的范圍內(nèi)的緩沖液。此溶液中可適量添加雜交反應(yīng)促進(jìn)劑如硫酸葡聚糖、鮭精DNA、牛胸腺DNA、EDTA、表面活性劑等。這里，添加提取的樣品基因，在導(dǎo)入到生物物質(zhì)檢測元件之前必須經(jīng)過90℃以上的溫度使其熱變性。未反應(yīng)的樣品基因由樣品液排出口4回收，必要時可以再次導(dǎo)入到生物物質(zhì)檢測元件中。
提取的基因預(yù)先用FITC、Cy3、Cy5、堿性蕊香紅等熒光色素、生物素、半抗原、氧化酶或磷酸酯酶等酶、二茂鐵、醌等的電化學(xué)活性物質(zhì)標(biāo)記，或者是使用這些物質(zhì)標(biāo)記的第二探針，從而可以進(jìn)行檢測。用熒光色素標(biāo)記時，可以進(jìn)行光學(xué)測定。
使用電化學(xué)活性的DNA結(jié)合物質(zhì)進(jìn)行測出時，按以下的順序進(jìn)行測出。
DNA探針使選擇結(jié)合的DNA結(jié)合物質(zhì)作用于在固定化的電極(作用極)的表面形成的雙鏈DNA的部分，進(jìn)行電化學(xué)檢測。這里，所用的DNA結(jié)合物質(zhì)沒有特別的限制，可使用。例如，Hoechst 33258、吖啶橙，喹吖因、道諾霉素、金屬嵌入劑、二吖啶橙等二嵌入劑、三嵌入劑、多嵌入劑等。進(jìn)一步，將這些嵌入劑用電化學(xué)活性金屬配合物加二茂鐵、輔酶R(viologen)等修飾也可以。
DNA結(jié)合物質(zhì)的濃度，因種類而異，一般在1ng/ml～1mg/ml的范圍使用。這時，用離子強(qiáng)度為0.001～5、pH5～10的緩沖液。
作為作用極的電極與DNA結(jié)合物質(zhì)反應(yīng)后，清洗，進(jìn)行電化學(xué)測定。電化學(xué)測定通過3電極型，即，參比電極、對極、作用極，或者2電極型，即對極、作用極進(jìn)行測定。測定時，施加的電位在DNA結(jié)合物質(zhì)發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)的電位以上，測定由DNA結(jié)合物質(zhì)而來的反應(yīng)電流。這時，電位可定位掃描、或脈沖施加、或施加定電位。測定用電勢恒定器、數(shù)字萬用表、信號發(fā)生器等的裝置控制電流、電壓。
采用圖1～圖3、圖7和圖8中說明的生物物質(zhì)檢測元件作為構(gòu)成電極一體型預(yù)測干擾素治療效果所使用DNA芯片，進(jìn)行以下實驗。
首先，取人白細(xì)胞染色體DNA，使用適合的引物對MxA基因部分的100bp左右的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增后將熱變性的片段導(dǎo)入到DNA芯片上。另外，預(yù)先在DNA芯片的電極32上將與MxA基因中存在的SNP(堿基多態(tài)性)相關(guān)聯(lián)的DNA探針固定化。導(dǎo)入樣品后，放置2小時，用緩沖液清洗，使DNA結(jié)合物質(zhì)(Hoechst 33258)進(jìn)行作用，即使不采用電學(xué)方法對帶電進(jìn)行控制，也可以對干擾素的治療效果進(jìn)行預(yù)測，但由于液體的流動方式不同結(jié)果產(chǎn)生的波動很明顯。
為此，如圖8中說明，通過切換施加在各電極上的電壓，使導(dǎo)入的基因在濃縮的同時向周邊部分移動，基因在電極32上呈被捕獲的狀態(tài)，如圖7所示，通過切換施加在每個電極32上的電壓的極性，使基因在電極32的排列上移動，即使不用PCR擴(kuò)增也可以進(jìn)行精度良好的治療效果的預(yù)測。
采用實施方式中說明的生物物質(zhì)檢測元件構(gòu)成作為電極分離型生物物質(zhì)檢測芯片，進(jìn)行以下實驗。
預(yù)先在尼龍膜上固定與各種的人腫瘤的標(biāo)記物相對應(yīng)的抗體。以與膜相接觸的形狀，在膜的下部配置各電極。以人血清為樣品進(jìn)行腫瘤標(biāo)記物檢測時，可確實地進(jìn)行重現(xiàn)性良好、直到0.1ng/ml級的高靈敏度的檢測。還有，此時使用西洋蘿卜提取的過氧化物酶標(biāo)記物作為第2抗體，適用于發(fā)光檢測用的基質(zhì)。
(第2種實施方式)圖11為本發(fā)明第2種實施方式的生物物質(zhì)檢測裝置的結(jié)構(gòu)剖視圖?；_1的中央上部有承載生物物質(zhì)檢測元件5用的突出的元件載置部分，進(jìn)一步，圖中兩側(cè)均有使樣品液、插入液及清洗液等通過的液通過孔3，中央部分的下面有與液通過孔3相連的液排出口4。在基臺1上，主要地為使載置在元件載置部分2上的生物物質(zhì)檢測元件5從上下兩側(cè)固定的同時，將樣品液導(dǎo)向元件5，使通過元件5的樣品液導(dǎo)向樣品液通過孔3，以此為主配置了上部支架6及下部支架7。在上部支架6的中央部分設(shè)有液導(dǎo)入部分8，在該液導(dǎo)入部分8上連接著液供給管10。液供給管10上可以選擇性地任意連接通過控制部分50控制的樣品液供給部分51、插入液供給部分52和清洗液供給部分52。進(jìn)一步，由控制部分50控制的檢測部分54如后面所述對插入液產(chǎn)生的電化學(xué)信號進(jìn)行檢測，輸出生物物質(zhì)檢測的結(jié)果。由液供給管10導(dǎo)入到樣品液導(dǎo)入部分8的樣品液被引導(dǎo)到生物物質(zhì)檢測元件5上，在這里供生物物質(zhì)檢測之后，經(jīng)過上部支架6及下部支架7形成的樣品液引導(dǎo)槽9及基臺1上形成的樣品液通過孔3，從液排出口4向外排出。在上部支架6上有長方形的貫通孔11，由貫通孔11插入接觸電極15，可以使接觸電極15的前端與生物物質(zhì)檢測元件5上作為作用極的作用的電極接觸。通過使用接觸電極15可以將生物物質(zhì)檢測信號用電流、電位等電信號形式采集。
另外，在圖11所示的生物物質(zhì)檢測裝置中，上部支架6及下部支架7的詳細(xì)構(gòu)成與圖2、圖3所示的相同。生物物質(zhì)檢測元件5的詳細(xì)的構(gòu)成與圖4所示相同。如上所述，當(dāng)檢測對象生物物質(zhì)為基因時，在電極22上固定有作為配體的DNA探針。預(yù)先使樣品液中的基因成為單鏈的狀態(tài)。只有具有與電極22上固定的特定的DNA探針相對應(yīng)的堿基序列的基因才可以被電極22捕獲。最后，DNA探針與這個基因進(jìn)行互補(bǔ)結(jié)合(雜交)。圖4中其他如元件基板20使用的基板材料，電極21、22、23使用的材料，電極21、22、23的制法，電極21、22、23表面覆蓋的絕緣性薄膜的絕緣材料等均與上面所述相同，此處省略其詳細(xì)的說明。
這里，參照圖12所示的流程圖對本實施方式中生物物質(zhì)的檢測順序進(jìn)行說明。
首先，最初在控制部分50的控制下，樣品液供給部51將含有檢測對象生物物質(zhì)的樣品液供給導(dǎo)供給管10(步驟S1)。供給導(dǎo)供給管10中的樣品液經(jīng)過液導(dǎo)入部8導(dǎo)入到生物物質(zhì)檢測元件5上，在受到驅(qū)動電路25施加的電壓的電極21～23的靜電力的作用下，由電極21向電極22上，進(jìn)而向電極23上依次移動(參照圖4)。最終該樣品液由生物物質(zhì)檢測元件5上脫離，沿液體導(dǎo)引槽9及液體通過孔3經(jīng)由液體排出口4排出。
在這個過程中，樣品液附著在固定化于電極22的配體上進(jìn)行雜交。具體地說，例如，檢測對象生物物質(zhì)為基因，配體為DNA探針，也就是與特定的基因反應(yīng)的單鏈DNA時，樣品液附著在DNA探針上從而使DNA成單鏈狀態(tài)。
接下來，進(jìn)行第一次清洗(步驟S2)，在這個第一次清洗步驟中，在控制部分50的控制下，清洗液供給部53將清洗液供給倒供給管10中。從而將生物物質(zhì)檢測裝置內(nèi)不必的樣品液，具體地說，就是附著在電極22上的樣品液之外的樣品液清洗、除去。除去的不要的樣品液與清洗液一起排出。
接下來，在控制部分50的控制下，插入液供給部53將為了提高生物物質(zhì)檢測靈敏度的插入劑，例如與雙鏈DNA特異性反應(yīng)的核酸插入劑供給到供給管10中(步驟S3)。然后進(jìn)行第二次清洗(步驟S4)。
在這個第二次清洗步驟中，在控制部分50的控制下，清洗液供給部53將清洗液供給到供給管10中。從而將不要的插入劑，就是除附著在電極22上的插入劑之外的插入劑清洗、除去。除去的不要的樣品液與清洗液經(jīng)過與步驟S1的樣品液供給步驟的清洗液排出路徑一起排出。
接下來，在控制部分50的控制下，檢測部分54在對極電極21和作用極電極22之間施加電壓。檢測部分54測定電極21和電極22之間流過的電流，該電流就是來自于插入到固定在電極22上的配體與樣品液中特定的生物物質(zhì)的結(jié)合部分并附著在該結(jié)合部分的插入劑的氧化電流(步驟S5)。
接下來，進(jìn)行第三次清洗(步驟S6)。在這個第三次清洗步驟中，在控制部分50的控制下，清洗液供給部53將清洗液供給到供給管10中。特別是在此步驟中，將包括附著在固定于電極22上的配體上、用于電化學(xué)信號測定的插入劑的所有插入劑清洗、除去。
在上述的步驟S1～S6中反復(fù)進(jìn)行步驟S3～S6，直到判斷達(dá)到預(yù)先設(shè)定的規(guī)定次數(shù)的步驟S7。即反復(fù)進(jìn)行(a)插入劑的供給、(b)電流測定(通過插入劑進(jìn)行電化學(xué)信號的測定)、及(c)將附著在配體上的插入劑的去除等一系列的步驟。
檢測部分54將這一系列的步驟中測定的多次的測定結(jié)果，即對依賴于檢測對象物質(zhì)的電流(氧化電流)的值進(jìn)行累加計算。據(jù)此，僅對依賴于檢測對象物質(zhì)的插入劑而產(chǎn)生的電化學(xué)信號進(jìn)行累加計算，其他的像背景電流的隨機(jī)噪音成分在累加計算過程中被消去。因此，可以對特定的生物物質(zhì)進(jìn)行高靈敏度的檢測。
圖13為第2種實施方式的變形例的生物物質(zhì)檢測元件的構(gòu)成的平面圖。
這個生物物質(zhì)檢測元件中，元件基板40上的一端(圖中左端)設(shè)置有液體導(dǎo)入部41，另一端(圖中右端)有液體排出部43，中央部分排列有矩陣狀的作為作用極的電極42。由液體導(dǎo)入部41導(dǎo)入各樣品液、插入劑、清洗液等，在電極42上移動后，從液體排出部43排出。
使用這樣組成的生物物質(zhì)檢測元件時，也按圖12所示的順序步驟操作，可以對特定的生物物質(zhì)進(jìn)行與上述同樣的高靈敏度的檢測。
作為本發(fā)明的生物物質(zhì)檢測元件及生物物質(zhì)檢測裝置的對象的樣品檢體沒有特殊的限定，例如血液、血清、白細(xì)胞、尿、糞便、精液、唾液、組織、培養(yǎng)細(xì)胞、咳痰等均可使用。這里，當(dāng)檢測對象為基因時，應(yīng)從以上的樣品檢體中提取出如基因等。對提取方法沒有特殊的限定，苯酚-氯仿法等液液萃取法、使用載體的固液萃取法等均可利用。另外，也可以采用市售的核酸提取方法QIAamp(QIAGEN公司出品)、Sumaitest(住友金屬公司出品)等。
然后，將提取出的基因的樣品溶液導(dǎo)入到前面的實施方式中說明的生物物質(zhì)檢測元件(DNA芯片)上，在固定化了作為配體的DNA探針的電極上進(jìn)行雜交反應(yīng)。反應(yīng)溶液可為例如離子強(qiáng)度0.01～5、pH5～10范圍內(nèi)的緩沖液。此溶液中可適量添加雜交反應(yīng)促進(jìn)劑如硫酸葡聚糖、鮭精DNA、牛胸腺DNA、EDTA、表面活性劑等。此時添加提取的樣品基因，在導(dǎo)入到生物物質(zhì)檢測元件之前必須經(jīng)過90℃以上的溫度使其熱變性。未反應(yīng)的樣品基因由樣品液排出口4回收，必要時可以再次導(dǎo)入到生物物質(zhì)檢測元件中。
萃取的基因預(yù)先用FITC、Cy3、Cy5、堿性蕊香紅等熒光色素、生物素、半抗原、氧化酶或磷酸酯酶等的酶、二茂鐵、醌等的電化學(xué)活性物質(zhì)標(biāo)記，或者是使用這些物質(zhì)標(biāo)記的第二探針，從而可以進(jìn)行檢測。用熒光色素標(biāo)記時，可以進(jìn)行光學(xué)測定。
采用具有電化學(xué)活性的DNA活性物質(zhì)進(jìn)行檢測時，按以下順序進(jìn)行檢測。
DNA探針使選擇結(jié)合的DNA結(jié)合物質(zhì)作用于在固定化的電極(作用極)的表面形成的雙鏈DNA的部分，進(jìn)行電化學(xué)檢測。這里，所用的DNA結(jié)合笏質(zhì)沒有特別的限制，可使用例如，Hoechst 33258、吖啶橙、喹吖因、道諾霉素、金屬嵌入劑、二吖啶橙等二嵌入劑、三嵌入劑、多嵌入劑等。進(jìn)一步，將這些嵌入劑用電化學(xué)活性金屬配合物如二茂鐵、輔酶R(viologen)等修飾也可以。
DNA結(jié)合物質(zhì)的濃度隨種類的不同而不同，一般使用范圍為1ng/ml～1mg/ml。此時采用離子強(qiáng)度0.001～5、pH5～10的范圍內(nèi)的緩沖液。
作為作用極的電極與DNA結(jié)合物質(zhì)反應(yīng)，清洗，進(jìn)行電化學(xué)測定。電化學(xué)測定通過3電極型，即，參比電極、對極、作用極，或者2電極型，即對極、作用極進(jìn)行測定。測定時，施加的電位在DNA結(jié)合物質(zhì)發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)的電位以上，測定由DNA結(jié)合物質(zhì)而來的反應(yīng)電流。這時，電位可定位掃描、或脈沖施加、或施加定電位。測定用電勢恒定器、數(shù)字萬用表、信號發(fā)生器等的裝置控制電流、電壓。
采用圖11所示的生物物質(zhì)檢測元件5構(gòu)成作為預(yù)測電極檢測型干擾素治療效果所使用的DNA芯片，進(jìn)行以下實驗。
首先，取人白細(xì)胞基因DNA，使用適合的引物對MxA基因部分的100bp左右的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增后將熱變性的片段導(dǎo)入到DNA芯片上。另外，預(yù)先在DNA芯片的電極32上固定與MxA基因中存在的SNP(堿基多態(tài)性)相關(guān)的DNA探針。導(dǎo)入樣品后，放置2小時，用緩沖液清洗，使DNA結(jié)合物質(zhì)(Hoechst 33258)進(jìn)行作用時，雖然濃度很高時不采用電學(xué)方法對帶電進(jìn)行控制也可以對干擾素的治療效果進(jìn)行預(yù)測，但由于液體的流動方式不同結(jié)果很容易產(chǎn)生波動。
為此，如圖8中說明通過切換施加在各電極上電壓的極性，使導(dǎo)入的基因在濃縮的同時向周邊部分移動，基因在電極32上呈被捕獲的狀態(tài)，如圖7所示通過切換施加在每個電極32上電壓的極性，使基因在電極32的排列上移動，進(jìn)而如圖12說明的步驟S3-S6顯示的一系列步驟多次反復(fù)操作，最終不進(jìn)行PCR擴(kuò)增也可以進(jìn)行精度良好的治療效果的預(yù)測。第3種實施方式本發(fā)明的第3種實施方式涉及一種為了移動如基因、蛋白質(zhì)等的生物物質(zhì)之類的帶電物質(zhì)的帶電物質(zhì)移動裝置。特別是，涉及對生物物質(zhì)檢測裝置適合的帶電物質(zhì)移動裝置。本發(fā)明的實施方式提供一種帶電物質(zhì)移動裝置，它可使帶電物質(zhì)移動以使生物物質(zhì)之類的帶電物質(zhì)與帶電物質(zhì)檢測用元件上的各配體高效反應(yīng)。另外，提供一種帶電物質(zhì)移動裝置，也能使樣品中的檢測對象的帶電物質(zhì)濃縮，在用生物物質(zhì)檢測裝置時，可達(dá)到檢測靈敏度的提高。
圖14表示本發(fā)明的帶電物質(zhì)移動裝置適用的第3種實施方式的生物物質(zhì)檢測裝置構(gòu)成的剖視圖?；_1中央上部具有突出的元件載置部2，用于搭載生物物質(zhì)檢測用元件5，對該元件后面將進(jìn)行詳細(xì)說明，進(jìn)一步地，分別在圖中左側(cè)有樣品液通過孔3、中央下部有與樣品通過孔3連通的樣品排出口4。
基臺1上，主要為了從上下端保持元件載置部2上裝載的生物物質(zhì)檢測元件5，同時，向元件5導(dǎo)入樣品液，引導(dǎo)通過元件5的樣品液到樣品液通過孔3，設(shè)置了上部支架6和下部支架7。
上部支架的中央部分設(shè)置樣品液導(dǎo)入部8，該樣品液導(dǎo)入部8與樣品液供給管10連接。從樣品液供給管10來的、導(dǎo)入樣品液導(dǎo)入部8的樣品液，被導(dǎo)入生化學(xué)檢測用元件5上，在這里供生物物質(zhì)檢測。之后，經(jīng)過由上部支架6和下部支架7形成的樣品液導(dǎo)引槽9和基臺1上形成的樣品液通過口3，從樣品液排出口4排出到外部。
上部支架6中形成長方形的貫通孔11，通過貫通孔用插入接觸電極15，可使接觸電極15的前端與作為生物物質(zhì)檢測用元件5上的作用極功能的電極接觸。由于使用該接觸電極15，可得到生物物質(zhì)檢測用信號的電流、電位等的電信號。
圖15表示第3種實施方式的生物物質(zhì)檢檢測元件5的構(gòu)成的平面圖。在元件基板20上的圖14中表示的樣品液導(dǎo)入部8的正下方位置，設(shè)置凹部形成的樣品液接受部21。進(jìn)一步，在元件基板20上，形成一端與樣品液接受部連通的螺旋狀的樣品液導(dǎo)引溝22，在這個導(dǎo)引溝22的底部有沿著螺旋排列的發(fā)揮作為作用極功能的多個圓形的電極23。元件基板20的樣品溝22的另一端設(shè)有樣品液排出部24，此樣品液排出部24與圖14中表示的樣品液導(dǎo)入通道9相連通。
電極23中固定至少一個種類的特異性檢測用配體。也就是說，電極23兼是配體固定化部。電極23的各自被固定化的配體，按檢測對象的生物物質(zhì)，例如選自基因、基因探針、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段、輔酶、受體以及糖鏈中的任一種。
如果電極23上各自固定不同的配體，一次可檢測多種生物物質(zhì)。另外，電極23上各自固定相同的配體也可以一次檢測大量生物物質(zhì)。利用光刻術(shù)，預(yù)先在基板20上形成多個電極23(配體固體化部)的圖形，可提高生化學(xué)檢測元件5的批量生產(chǎn)性。
電極23，例如通過在元件基板20上形成的多層布線分別與電極板25相連。電極板25與驅(qū)動對電極23施加規(guī)定的電壓的驅(qū)動電路26相連接。對該驅(qū)動電路26的動作，后面作詳細(xì)說明。
這樣，從樣品液供給管10供給的樣品液，通過上部支架6和下部支架7的引導(dǎo)從中央部被導(dǎo)入生物物質(zhì)檢測用元件5，均一地供給在元件5周邊部設(shè)置的配體固定化部，從下方被排出。因此，樣品液中的生物物質(zhì)的檢測能在均一條件下進(jìn)行。
檢測對象的生物物質(zhì)是基因時，電極23上作為配體固定的是DNA探針。所謂DNA探針是指眾所周知的、與特定的基因反應(yīng)的單鏈基因。若樣品中的基因以單鏈狀態(tài)存在，僅與固定在電極23上的DNA探針相應(yīng)的具有特定序列的基因被電極23捕獲，結(jié)果，DNA探針和該基因進(jìn)行互補(bǔ)結(jié)合(雜交)。
進(jìn)一步對以上的構(gòu)成具體說明，首先，用于元件基板20的基板材料沒有特別的限制，例如，可使用玻璃、石英玻璃、氧化鋁、藍(lán)寶石、鎂橄欖石、碳化硅、氧化硅、氮化硅等無機(jī)絕緣材料。另外，基板材料也可以用聚乙烯、乙烯、聚丙烯、聚異丁烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚對苯二甲酸乙二醇酯、不飽和聚酯、含氟樹脂、聚氯乙烯、聚偏氯乙烯、聚醋酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚乙烯乙縮醛、丙烯酸樹脂、聚丙烯腈、聚苯乙烯、縮醛樹脂、聚碳酸酯、聚酰胺、酚醛樹脂、脲醛樹脂、環(huán)氧樹脂、三聚氰胺樹脂、苯乙烯丙烯腈共聚物、丙烯腈丁二烯苯乙烯共聚物、硅氧烷樹脂、聚苯醚、聚砜等有機(jī)材料。進(jìn)一步地，用后述光學(xué)的方法進(jìn)行生物物質(zhì)的檢測時，作為基板材料，也可以使用尼龍、纖維素之類的纖維薄膜。
電極23中使用的電極材料也沒有特別的限制，對含有配體固定化點的電極，用電化學(xué)檢測生物物質(zhì)的場合下，可使用如金、金的合金、銀、汞、鎳、鉑、鈀、硅、鍺、鎵、鎢等的金屬單質(zhì)和至少含這些金屬2種以上的合金，或者用石墨、玻璃態(tài)碳等的碳等、或它們的氧化物、化合物，或氧化硅等的半導(dǎo)體化合物，CCD、FET、CMOS等各種半導(dǎo)體器件上使用的物質(zhì)。
作為電極23的制作法，可用電鍍、印刷、濺鍍、蒸鍍等。作為蒸鍍法，可用阻抗加熱法，高頻加熱法以及電子束加熱法中的任一種。作為濺鍍法可使用直流兩極濺射、偏壓濺射、非對稱交流濺射、吸氣濺射以及高頻濺射中的任一種。進(jìn)一步，作為電極，也可以使用聚吡咯、聚苯胺等的電解聚合膜或?qū)щ娦愿叻肿印?br> 對電極23表面覆蓋的絕緣性薄膜使用的絕緣材料無特別的限制。例如，優(yōu)選光聚合物、光刻膠材料。作為光刻膠材料，使用光曝光用光刻膠、遠(yuǎn)紫外用光刻膠、X線用光刻膠、電子射線用光刻膠。曝光用光刻膠中主原料可舉環(huán)化橡膠、聚肉桂酸、酚醛清漆樹脂等。遠(yuǎn)紫外用光刻膠中可用環(huán)化橡膠、酚醛樹脂、聚甲基異丙烯酮(PMIPK)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)等。另外，X線用光刻膠，除COP、丙烯酸甲酯之外，可使用《薄膜手冊》(オ-ム公司)中記載的物質(zhì)。電子射線用光刻膠，可使用PMMA等的薄膜手冊中(オ-ム公司)記載的物質(zhì)。此時，所用的光刻膠的厚度希望在10nm～1mm。
由于作用極電極23用光刻膠被覆而進(jìn)行光刻術(shù)，可使電極23的面積為一定。由此，DNA探針等的配體的固定化量在各自的電極23間變得均一，可使生物物質(zhì)的檢測的重現(xiàn)性良好。以往，一般將光刻膠材料最后除去，可是電極23在用于固定DNA探針的基因檢測用時，不除去光刻膠材料，也可作為電極23的一部分。這種情況下，所用的光刻膠材料必須使用耐水性高的物質(zhì)。
電極23的上部形成的絕緣薄膜也可以使用光刻膠材料以外的材料。例如，可使用Si、Ti、Al、Zn、Pb、Cd、W、Mo、Cr、Ta、Ni等的氧化物、氮化物、碳化物、除此之外的合金。這些材料可用濺鍍、蒸鍍或CVD等形成薄膜后，用光刻膠形成電極露出部分的圖形，控制面積一定。
以下，參照圖16A-16C，17A-17C，18A-18C，和19A-19C，對驅(qū)動電路26的驅(qū)動動作進(jìn)行說明。驅(qū)動電路26，由于在電極23上施加規(guī)定極性的電壓，可以使5上的中央部設(shè)置的樣品液接受部21接受的樣品液中的檢測對象生物物質(zhì)依次沿電極23的排列方向移動。
檢測對象生物物質(zhì)是基因時，基因水溶液的樣品液從樣品液供給管10通過樣品液導(dǎo)入部8供給生物物質(zhì)檢測用元件5上的樣品液接受部21中，由導(dǎo)引溝22導(dǎo)入電極23上?；虻膸щ娦允秦?fù)性，圖16A-16C，17A-17C，18A-18C和19A-19C表示檢測對象是基因時的驅(qū)動例。這些圖中任意一個均表示電極23的電壓施加狀態(tài)隨時間的推移，電壓施加狀態(tài)(電壓的極性)按A→B→C的順序推移。
對圖16A-16C的驅(qū)動例進(jìn)行說明。首先，圖16A所示那樣，在離樣品液接受部21最近的電極23-1上，施加同基因帶電性相反的正極性電壓，在與電極23-1相鄰的電極23-2上施加負(fù)極性電壓。因此，供給樣品液接受部21的樣品液，由于受到施加基因帶電性相反電壓的電極23-1的靜電吸引力，向電極23-1上移動。此時，給樣品液施加若干負(fù)壓，液品液可更快地移動與電極23-1相鄰的電極23-2中因為施加了與基因帶電性相同極性的電壓，基因被電極23-1捕獲。
接下來，如圖16B所示，在電極23-1上施加為使其極性反轉(zhuǎn)為負(fù)極性的電壓，再在相鄰的電極23-2上施加使其極性反轉(zhuǎn)為正極性的電壓。此時，樣品液中的基因由于受到施加與其帶電性相同電壓的電極23-1的靜電排斥力，受到施加帶電性相反電壓的電極23-2靜電吸引，基因從電極23-1上移動到電極23-2上，被電極23-2捕獲。
然后，如圖16C所示，在電極23-2上施加電壓極性反轉(zhuǎn)為負(fù)極性的電壓，再在相鄰的電極23-3上施加電壓極性反轉(zhuǎn)為正極性的電壓，這樣，樣品中的基因從電極23-2上移動到電極23-3上而被捕獲。
以下，同樣依次移動施加與樣品中的基因帶電性相同的電壓的電極位置和施加與其帶電性相反的電壓的電極的位置，可使基因依次向相鄰電極上移動。在此移動過程中，某電極上保持有與特定的基因互補(bǔ)序列的固定在電極上的配體時，這些基因與配體發(fā)生反應(yīng)形成結(jié)合。即，發(fā)生雜交。
這樣，基因在生物物質(zhì)檢測用元件5上，沿著電極23的排列方向依次移動電極，從樣品液排出部24排出到元件5的外部。
圖17A-17C表示本實施方式的驅(qū)動電路的另一種驅(qū)動例。圖16A-16C所示的驅(qū)動例中，例如參照圖16B，只對與電極23中捕獲基因的電極23-2的基因的移動方向相反的一側(cè)電極23-1施加與基因的帶電極性相同的負(fù)極性的電壓，但如圖17B所示，在移動方向一側(cè)的電極23-3也可施加負(fù)極性的電壓。圖17A-17C表示分別同圖16A-16C設(shè)定時間的相同的電壓施加狀態(tài)，圖17A表示最初的狀態(tài)，同圖16一樣，圖17B-17C從中被施加正極性的電壓的電極來看，基因的移動方向前后(電極23的排列方向的兩側(cè))的電極施加負(fù)極性的電壓。
這樣，電極23中相對于捕獲基因的施加正極性電壓的電極，通過在基因移動方向前后的兩電極施加負(fù)極性的電壓，由這兩電極產(chǎn)生的靜電斥力，在捕獲基因的電極上基因被關(guān)進(jìn)去，可濃縮基因。因此，能高效進(jìn)行基因的檢測，不必預(yù)先擴(kuò)增基因，或者擴(kuò)增的程度可以緩和。
然后，圖18A-18C的驅(qū)動例中，在電極23中相鄰2個電極上施加正極性電壓，與2個電極組相鄰的電極施加與其相反的電壓，在電極23的排列方向上每次錯開1個電極進(jìn)行動作。
進(jìn)一步，圖19A-19C是同時對全部的電極23施加電壓的驅(qū)動例。與18A-18C時相同，在電極23中相鄰的2個電極組施加正極性的電壓，與這2個電極組相鄰的電極施加與其相反極性的電壓，在電極23的排列方向中分別每次錯開1個電極進(jìn)行動作。
另外，電極23中施加與基因的帶電極性相反極性的正極性電壓的電極數(shù)定為n，施加同極性的負(fù)極性電壓的電極定為m，切換施加電壓的極性時，錯開的電極數(shù)定為p，n、m、p均可以在1以上的任意數(shù)中進(jìn)行選擇。最單純時為n＝m＝p＝1也可以，其他情況，著眼于電極23中的1個，施加電極的極性周期地交互切換為正極性和負(fù)極性。
圖20A-20C是說明第3種實施方式中其他的生物物質(zhì)檢測用元件的電極構(gòu)成和該生物物質(zhì)檢測用元件中檢測對象生物物質(zhì)的濃縮和移動動作。同圖所示那樣，方式中生物物質(zhì)檢測用元件的元件基板的中央部配置樣品液接受部31，以它為中心在周圍形成導(dǎo)引溝32，此導(dǎo)引溝32的底部排列固定了配體的電極33。在樣品液接受部31中供給的樣品液被導(dǎo)到導(dǎo)引溝32內(nèi)到達(dá)電極33上。
對這樣構(gòu)成中，通過沒有圖示的驅(qū)動電路，如圖20A-20C中所示那樣，同圖19A-19C所示驅(qū)動例相同，通過在電極33上施加電壓，可使樣品溶液中的基因等檢測對象生物物質(zhì)沿圓周在電極33上移動。
也就是說，首先，如圖20A所示，電極33中在以虛線圍著的相鄰2個電極組上施加正極性的電壓，在與這個電極組相鄰的電極上施加負(fù)極性電壓。然后，在規(guī)定單位時間后，如圖20B所示在施加正極性的電壓的2個電極組的位置，只錯開1個電極，隨之，與2個電極組相鄰的施加負(fù)極性電壓的電極的位置也只錯開1個電極。進(jìn)一步，再經(jīng)過規(guī)定的單位時間后，如圖20C所示那樣，施加正極性電壓的2個電極組的位置和施加負(fù)極性電壓的電極的位置只錯開1個電極。以下，每單位時間這樣切換施加電壓的極性，即通過以規(guī)定的周期進(jìn)行切換，樣品液中的檢測對象生物物質(zhì)(例如基因)以圓周方向在相鄰電極33的排列上移動，可與電極33上各自固定的配體均一高效地反應(yīng)。
這樣，導(dǎo)入在生化學(xué)檢測用元件上的樣品液中的檢測對象生物物質(zhì)在濃縮的同時，可以使其在電極33上依次地移動。即，按照本實施方式，檢測對象生物物質(zhì)在固定配體的電極33上變?yōu)闈饪s狀態(tài)，所以不用像以前那樣預(yù)先用PCR法等進(jìn)行基因擴(kuò)增，擴(kuò)增檢測對象生物物質(zhì)，可使檢測對象生物物質(zhì)與配體高效反應(yīng)，提高檢測效率。
圖21A-21B表示第3種實施方式的其他的生物物質(zhì)檢測裝置構(gòu)成的平面圖和剖視圖。
這個生物物質(zhì)檢測裝置中，在基臺40的中央形成的突出部40A上的中央部，設(shè)置樣品液接受部41，以樣品液接受部41為中心形成凹部42，以及在凹部42內(nèi)以樣品液接受部41為中心以放射狀形成扇形的多個電極43。電極43上固定配體。進(jìn)一步，在基臺40上設(shè)置導(dǎo)引通過生物物質(zhì)檢測用元件的樣品液到樣品液排出口的樣品液通過孔44。
這樣的生物物質(zhì)檢測裝置中，電極43由未表示出來的驅(qū)動電路按圖20A-20C說明的情況同樣進(jìn)行驅(qū)動，一邊使檢測對象生物物質(zhì)濃縮，一邊使其沿電極43排列的圓周方向依次移動，可使檢測對象生物物質(zhì)與配體高效反應(yīng)。
圖22表示第3種實施方式的變形例的生物物質(zhì)檢測用元件構(gòu)成的平面圖。
在元件基板50上相對方向的2個角近旁，設(shè)置樣品液接受部51和樣品液排出部54。進(jìn)一步，在樣品液接受部51和樣品液排出部54之間形成曲折形狀的樣品液導(dǎo)引溝52，在樣品液導(dǎo)引溝52內(nèi)設(shè)置固定了配體的電極53。
使用這樣構(gòu)成的生物物質(zhì)檢測用元件時，電極53由未圖示出來的驅(qū)動電路，經(jīng)與圖16A-16C，17A-17C，18A-18C，19A-19C說明的同樣驅(qū)動動作，使檢測對象生物物質(zhì)在電極53排列的圓周方向移動，進(jìn)一步使移動中的檢測用生物物質(zhì)濃縮，與配體高效反應(yīng)。第4種實施方式圖23表示涉及適用于本發(fā)明的帶電物質(zhì)移動裝置和第4種實施方式的生物物質(zhì)處理裝置的簡略構(gòu)成圖。該生物物質(zhì)處理裝置具有多個反應(yīng)步驟。如圖23所示，基板60上配置多個反應(yīng)室61A～61F，這些反應(yīng)室61A～61F通過樣品液導(dǎo)引溝62適當(dāng)?shù)乇宦?lián)絡(luò)。樣品液導(dǎo)引溝62中，排列有電極63。電極63，例如也可以固定有配體。
對這種生物物質(zhì)處理裝置，通過沒有圖示的電極63的驅(qū)動電路，與按照16A-16C、17A-17C、18A-18C、19A-19C說明相同的驅(qū)動動作，使處理對象生物物質(zhì)按電極63排列的圓周方向依次移動，進(jìn)一步，移動中使處理對象生物物質(zhì)濃縮，可以在反應(yīng)室61A～67F內(nèi)高效反應(yīng)，處理作為處理對象的生物物質(zhì)。第5種實施方式圖24表示涉及適用于本發(fā)明的帶電物質(zhì)移動裝置的第5種實施方式的生物物質(zhì)處理裝置的膠團(tuán)結(jié)構(gòu)的示意圖。
本實施方式是處理不帶電荷的生物物質(zhì)的使用裝置，例如由表面活性劑等形成的膠團(tuán)結(jié)構(gòu)。
所謂膠團(tuán)結(jié)構(gòu)是用膠團(tuán)被覆非電荷物質(zhì)，強(qiáng)制使其帶電的結(jié)構(gòu)。圖24中，生物物質(zhì)被帶電為負(fù)電性。這樣，通過膠團(tuán)結(jié)構(gòu)使強(qiáng)制帶電的生物物質(zhì)移動的情況下，也可用上述各實施方式中說明構(gòu)成的生物物質(zhì)移動裝置、生物物質(zhì)處理裝置。
作為由本發(fā)明而來的使用生物物質(zhì)移動裝置的生化學(xué)檢測用元件以至生物物質(zhì)檢測裝置的對象，樣品檢體沒有特別的限制，例如可以使用血液、血清、白細(xì)胞、尿、便、精液、唾液、組織、培養(yǎng)細(xì)胞、咳痰等。這里，當(dāng)檢測對象物質(zhì)是基因時，從這些樣品檢體中，例如進(jìn)行基因提取。提取方法沒有特別的限制，可以用酚-氯仿等的液液提取法、用載體的固液提取法。另外，也可利用市售的核酸提取方法QIAamp(QIAGEN公司制)、Sumaitest(住友金屬公司制)等。
然后，將這樣萃取的基因的樣品溶液按照前述的實施方式說明導(dǎo)入生物物質(zhì)檢測用元件(DNA芯片)上，在固定了DNA探針配體的電極上進(jìn)行雜交反應(yīng)。反應(yīng)溶液例如制成離子強(qiáng)度0.01～5、pH為5～10的緩沖液。在此溶液中可添加雜交促進(jìn)劑硫酸葡聚糖、鮭精DNA、牛胸腺DNA、EDTA、表面活性劑等。此時添加經(jīng)提取的樣品基因，必須在向生物物質(zhì)檢測用元件的導(dǎo)入前經(jīng)過90℃以上使其熱變性。沒有反應(yīng)的樣品基因從樣品液排出口4回收，必要時也可再次導(dǎo)入生物物質(zhì)檢測用元件中。
萃取的基因預(yù)先用FITC、Cy3、Cy5、堿性蕊香紅等熒光色素、生物素、半抗原、氧化酶或磷酸酯酶等酶、二茂鐵、醌等的電化學(xué)活性物質(zhì)標(biāo)記，或者是也可以使用這些物質(zhì)標(biāo)記的第二探針進(jìn)行檢測。用熒光色素標(biāo)記時，可以進(jìn)行光學(xué)檢測。
使用電化學(xué)活性的DNA結(jié)合物質(zhì)進(jìn)行檢測時，按以下的順序進(jìn)行檢測。
DNA探針使選擇結(jié)合的DNA結(jié)合物質(zhì)作用于在固定化的電極(作用極)的表面形成的雙鏈DNA的部分，進(jìn)行電化學(xué)檢測。這里，所用的DNA結(jié)合物質(zhì)沒有特別的限制，可使用例如，Hoechst 3258、吖啶橙、喹吖因、道諾霉素、金屬嵌入劑、二吖啶橙等二嵌入劑、三嵌入劑、多嵌入劑等。進(jìn)一步，將這些嵌入劑用電化學(xué)活性金屬配合物如二茂(絡(luò))鐵、輔酶R(viologen)等修飾也可以。
DNA結(jié)合物質(zhì)的濃度，因種類而異，一般在1ng/ml～1mg/ml的范圍使用。這時，用離子強(qiáng)度為0.001～5、pH5～10的緩沖液。
作為作用極的電極與DNA結(jié)合物質(zhì)反應(yīng)后，清洗，進(jìn)行電化學(xué)測定。電化學(xué)測定通過3電極型，即，參比電極、對極、作用極，或者2電極型，即對極、作用極進(jìn)行測定。測定時，施加的電位在DNA結(jié)合物質(zhì)發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)的電位以上，測定由DNA結(jié)合物質(zhì)而來的反應(yīng)電流。這時，電位可定位掃描、或脈沖施加、或施加定電位。測定用電勢恒定器、數(shù)字萬用表、信號發(fā)生器等的裝置控制電流、電壓。
實施例4構(gòu)成圖11說明的生物物質(zhì)檢測用元件，作為干擾素治療效果預(yù)測用DNA芯片，進(jìn)行以下的實驗。
首先，從人白細(xì)胞中取染色體DNA，用適當(dāng)?shù)膯觿xA基因部分100bp左右的片段PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增后，使熱變性物導(dǎo)入DNA芯片。另外，預(yù)先在DNA芯片的電極33上將MxA基因中存在的SNP(堿基多態(tài)性)相關(guān)的DNA探針固定。樣品液導(dǎo)入后，驅(qū)動電極23，最終將被觀測的剩余液體用緩沖液清洗，使與DNA結(jié)合物質(zhì)作用，得知可預(yù)測的干擾素治療效果。
進(jìn)一步，這種情況下，如圖19A-19C說明，切換施加在電極23上的電壓的極性，使導(dǎo)入基因的一邊濃縮，一邊向周邊移動，由基因在電極23上被捕獲的狀態(tài)，切換施加在各個電極23上的電壓的極性，使基因在電極23排列上移動，這樣，即使不進(jìn)行PCR擴(kuò)增，也可進(jìn)行高精度的治療效果的預(yù)測。
實施例5圖22說明的生物物質(zhì)檢測用元件構(gòu)成腫瘤標(biāo)記物檢測用芯片，進(jìn)行以下的實驗。
為了構(gòu)成腫瘤標(biāo)記物檢測用芯片，將抗各種人腫瘤標(biāo)記物的抗體固定在電極53的表面。為防止非特異性吸附，使其與1％牛血清白蛋白作用。同實施例1操作，按順序變化電極的極性，人血清作為樣品進(jìn)行腫瘤標(biāo)記物的測定，直至0.1ng/ml級別均能以高靈敏度、重現(xiàn)性良好地檢測。另外，此時，作為第2抗體，使用由西洋蘿卜而來的過氧化物酶標(biāo)記的物質(zhì)，最后使發(fā)光檢測體系用的基質(zhì)流出。
另外，通過上述實施方式對生物物質(zhì)移動裝置進(jìn)行了說明。但本發(fā)明并不只限定于生物物質(zhì)移動裝置，對有規(guī)定帶電極性的帶電物質(zhì)移動裝置全部都適用。
其他的優(yōu)點和修飾對本領(lǐng)域的技術(shù)人員將很容易接受。因此，本發(fā)明在更廣范圍內(nèi)并不限于在此所描述的特定的細(xì)節(jié)和實施例。相應(yīng)地，不脫離附錄的權(quán)利要求和它們的等同物所限定的一般的發(fā)明概念的暗示或領(lǐng)域，可以進(jìn)行各種修飾。
權(quán)利要求
1.生物物質(zhì)檢測裝置，是將含有帶電生物物質(zhì)的樣品液導(dǎo)入并檢測該生物物質(zhì)的生物物質(zhì)檢測裝置，其中包括基板；生物物質(zhì)檢測用元件，具有設(shè)在該基板上導(dǎo)入上述樣品液的位置的至少一個的第1電極、和在該基板上的該第1電極的周圍沿著圓周方向以規(guī)定的間隔排列，并且分別固定著與特定的生物物質(zhì)反應(yīng)的配體而構(gòu)成的多個第2電極；和驅(qū)動電路，通過在前述第1電極上施加與上述生物物質(zhì)所帶電同極性的電壓，在電極的至少一部分上施加與前述帶電極性相反的電壓的驅(qū)動動作，驅(qū)動前述生物物質(zhì)檢測用元件。
2.權(quán)利要求1所述的生物物質(zhì)檢測裝置，其中還包括，前述第1電極與第2電極的排列之間以同心圓狀排列的至少2個環(huán)狀電極，前述驅(qū)動電路，為了使前述樣品液中的生物物質(zhì)向前述第2電極的方向移動，還進(jìn)行施加電壓控制前述至少2個環(huán)狀電極的極性的驅(qū)動動作。
3.權(quán)利要求1所述的生物物質(zhì)檢測裝置，其中，前述驅(qū)動電路中，前述第2電極中圓周方向的一部分電極施加與前述帶電極性相反的電壓，另一部分施加與前述帶電極性相同的電壓，并且，使該相反極性和相同極性的電壓的位置依次變化進(jìn)行驅(qū)動動作。
4.權(quán)利要求3所述的生物物質(zhì)檢測裝置，其中，前述生物物質(zhì)檢測用元件還包括，在前述第1電極和第2電極排列之間以同心圓狀配置的前述至少2個環(huán)狀電極，前述驅(qū)動電路，為了使前述樣品液中的生物物質(zhì)向前述第2電極的方向移動，還進(jìn)行施加電壓控制前述至少2個環(huán)狀電極的極性的驅(qū)動作用。
5.生物物質(zhì)檢測用元件，是將含有帶電生物物質(zhì)的樣品液導(dǎo)入并檢測該生物物質(zhì)的生物物質(zhì)檢測元件，其中包括基板；設(shè)在該基板上的導(dǎo)入前述樣品液的位置上的至少一個第1電極；和在該基板上的該第1電極的周圍沿著圓周方向以規(guī)定的間隔排列，并且分別固定著與特定的生物物質(zhì)反應(yīng)的配體而構(gòu)成的多個第2電極。
6.權(quán)利要求5所述的生物物質(zhì)檢測用元件，其中還具有，在第1電極和第2電極排列之間以同心圓狀配置至少2個的環(huán)狀電極。
7.權(quán)利要求6所述的生物物質(zhì)檢測用元件，其中還具有，配置在基板上的前述第2電極排列的外周的至少一個第3電極。
8.權(quán)利要求7所述的生物物質(zhì)檢測用元件，其中還具有，在電極和第2電極的排列間以同心圓狀配置至少2個環(huán)狀電極。
9.生物物質(zhì)檢測裝置，是檢測樣品液中含有的帶電生物物質(zhì)的生物物質(zhì)檢測裝置，包括基板；生物物質(zhì)檢測用元件，具有在該基板上沿圓周方向以規(guī)定的間隔排列、分別固定有與特定生物物質(zhì)反應(yīng)的配體的多個電極；樣品液導(dǎo)入器，將前述樣品液導(dǎo)入到前述基板上的前述電極排列的中央部；樣品液移動結(jié)構(gòu)，通過電控制前述生物物質(zhì)檢測用元件，使由導(dǎo)入器導(dǎo)入到前述基板上的中央部分的樣品液向前述電極方向，以放射狀移動。
10.生物物質(zhì)檢測方法，是檢測樣品液中含有的帶電生物物質(zhì)的，其中包括將前述樣品液供給在基板上排列有分別固定有與特定的生物物質(zhì)反應(yīng)的配體的電極而形成的生物物質(zhì)檢測用元件后，反復(fù)進(jìn)行以下一系列步驟，檢測所述生物物質(zhì)(a)向前述生物物質(zhì)檢測用元件上供給插入劑，(b)基于與前述特定生物物質(zhì)與前述配體的反應(yīng)，測定前述插入劑的電化學(xué)信號，以及，(c)除去附著在前述配體上的插入劑。
11.生物物質(zhì)檢測裝置，是檢測樣品液中含有的帶電生物物質(zhì)的生物物質(zhì)檢測裝置，包括基板；生物物質(zhì)檢測用元件，具有在該基板上沿圓周方向以規(guī)定的間隔排列的、分別固定有與特定生物物質(zhì)反應(yīng)的配體多個電極；樣品液導(dǎo)入器，將前述樣品液導(dǎo)入到前述基板上的前述電極排列的中央部；樣品液移動結(jié)構(gòu)，使由導(dǎo)入器導(dǎo)入到前述基板上的中央部分的樣品液向前述電極方向，以放射狀移動；和反復(fù)進(jìn)行以下一系列步驟的控制器(a)向前述生物物質(zhì)檢測用元件上供給插入劑，(b)基于與前述特定生物物質(zhì)與前述配體的反應(yīng)，測定前述插入劑的電化學(xué)信號，以及，(c)除去附著在前述配體上的插入劑。
12.生物物質(zhì)檢測裝置，是導(dǎo)入含有帶電生物物質(zhì)的樣品液并檢測該生物物質(zhì)的生物物質(zhì)檢測裝置，其中包括，基板；生物物質(zhì)檢測用元件，具有設(shè)在前述基板上導(dǎo)入前述樣品液的位置的至少一個第1電極，以及，該基板上的該第1電極的周圍沿圓周方向以規(guī)定的間隔排列、分別固定有與特定的生物物質(zhì)反應(yīng)的配體的多個第2電極；驅(qū)動電路，通過對前述第1電極施加與前述生物物質(zhì)帶電極性相同極性的電壓、對第2電極的至少一部分施加與前述帶電極性相反極性的電壓的驅(qū)動動作，驅(qū)動前述生物物質(zhì)檢測用元件；和控制反復(fù)進(jìn)行以下一系列步驟的控制器(a)向前述生物物質(zhì)檢測用元件上供給插入劑，(b)基于與前述特定化學(xué)物質(zhì)與前述配體的反應(yīng)，測定前述插入劑的電化學(xué)信號，以及，(c)除去附著在前述配體上的插入劑。
13.權(quán)利要求12所述的生物物質(zhì)檢測裝置，其中，前述驅(qū)動電路中，對前述第2電極中的圓周方向的一部分的電極施加同前述帶電極性相反的電壓，對其他部分施加與前述帶電極性相同的電壓，而且，使該相反極性和相同極性的電壓的位置依次變化，進(jìn)行驅(qū)動動作。
14.權(quán)利要求12所述的生物物質(zhì)檢測裝置，其中，前述生物物質(zhì)檢測用元件還具有，在前述第1電極與第2電極排列之間以同心圓配置的至少2個環(huán)狀電極。
15.一種移動具有規(guī)定帶電極性的帶電物質(zhì)移動裝置，其中包括，基板；前述基板上以規(guī)定的排列方向排列的多個電極；和驅(qū)動電路，對前述多個電極中的電極的一部分施加與前述帶電物質(zhì)的帶電極性相反的電壓，而且，使施加該反極性的電壓的電極位置沿前述排列方向依次變化，進(jìn)行驅(qū)動動作，使前述帶電物質(zhì)在前述多個電極上沿前述排列方向移動。
16.權(quán)利要求15所述的裝置，其中，前述驅(qū)動電路中，相對于前述多個的電極中施加前述相反極性的電壓的電極，對在前述排列方向相鄰的至少一個電極施加與前述帶電極性相同的電壓。
17.權(quán)利要求15所述的裝置，其中，前述帶電物質(zhì)至少一種是生物物質(zhì)，在前述多個電極上分別固定有與特定的生物物質(zhì)反應(yīng)的配體。
全文摘要
公開了一種生物物質(zhì)檢測裝置，能檢測樣品液中含有的基因、蛋白質(zhì)等的帶電生物物質(zhì)。生物物質(zhì)檢測用元件包括基板、在基板上形成的至少一個的第1電極，以及，在基板上的第1電極的周圍沿圓周方向以規(guī)定間隔排列、分別固定有與特定生物物質(zhì)反應(yīng)的配體的多個第2電極。向基板上的第1電極導(dǎo)入樣品液。導(dǎo)入的樣品液通過電控制使其沿第2電極的方向以放射狀移動。
文檔編號G01N33/543GK1410548SQ02141990
公開日2003年4月16日 申請日期2002年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月31日
發(fā)明者笠原章裕, 石森義雄 申請人:株式會社東芝