專利名稱:氟蟲腈免疫檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種氟蟲腈免疫檢測(cè)方法。
何藝兵于2000年在《農(nóng)藥科學(xué)管理》第3期上公開了一種氣相色譜分析法,儀器設(shè)備要求比較高,測(cè)試前還需對(duì)樣品作必要的提取和凈化,不僅所需時(shí)間長(zhǎng),樣品提取方法復(fù)雜,且親體農(nóng)藥和代謝物檢測(cè)條件不同,需要多殘留檢測(cè),很不方便。
朱國(guó)念等2000年在《農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)》第2期報(bào)道了類似氟蟲腈模擬稻田生態(tài)第中降解途徑研究,其分析方法中也需要對(duì)樣品進(jìn)行提取和凈化,并進(jìn)行色譜檢測(cè),采用本方法對(duì)氟蟲腈及代謝物對(duì)實(shí)測(cè)水、土和水稻植株的最低檢出濃度分別為0.028-0.37mg/L、0.001-0.008mg/kg和0.001-0.009mg/kg。
國(guó)外也有學(xué)者對(duì)氟蟲腈的檢測(cè)技術(shù)也展開研究,公開了一些關(guān)于氣相色譜或色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的檢測(cè)方法,最低檢出濃度為0.005mg/kg。平均回收率為85.4-95.8%,變異系數(shù)為2.3-12.0%,檢測(cè)結(jié)果一般需要兩天,檢測(cè)過(guò)程復(fù)雜。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種氟蟲晴免疫檢測(cè)方法,其特征在于a、在96微孔板內(nèi)每孔加入100ul包被液,4℃過(guò)夜或37℃溫育2小時(shí);b、取出96微孔板,棄去包被液,用PBST洗滌三次,甩干,并在每孔中加入200ul封閉液,37℃溫育1小時(shí);
c、取出酶標(biāo)板,用PBST洗滌三次,甩干,A1-6、B1-6、C1-6依序?qū)㈩A(yù)先處理的樣品與等體積酶標(biāo)抗體混合液混合,每孔100ul,A7、B7、C7孔加入100ul的PBS,A8、B8、C8加入50ul的抗體和50ul的PBS,37℃溫育2小時(shí);d、取出酶標(biāo)板,用PBST洗滌三次,甩干,每孔中加入現(xiàn)配的底物液100ul,37℃溫育15分鐘;e、每孔中加入50ul,2M硫酸溶液終止反應(yīng);f、終止反應(yīng)后,立即用吸水紙吸干酶標(biāo)板底部,將酶標(biāo)板置于酶標(biāo)儀上,在450nm波長(zhǎng)下,以A8、B8、C8孔為空白調(diào)零,測(cè)定各孔的OD值;g、設(shè)定A8、B8、C8孔的平均值調(diào)零,以A7、B7、C7的平均值為B0同時(shí)測(cè)定A、B、C孔1~6各列的平均值,確定樣品中的氟蟲腈含量。
酶標(biāo)板各孔的樣品、標(biāo)準(zhǔn)品(標(biāo)樣)、對(duì)照、空白孔的具體位置參見表一。
表一
本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于本方法可以在環(huán)境監(jiān)控、食品安全、農(nóng)藥毒理或藥理等應(yīng)用或研究領(lǐng)域使用,由于本方法可以直接對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè),具有操作簡(jiǎn)單,測(cè)試過(guò)程短,流動(dòng)性強(qiáng),適合基層及市場(chǎng)監(jiān)測(cè)部門對(duì)水產(chǎn)品、蔬菜食品領(lǐng)域中的污染情況進(jìn)行快速檢測(cè)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明包括固相抗原間接ELISA和直接ELISA兩種類型。間接ELISA的測(cè)定原理為將銳勁物半抗原一蛋白復(fù)合物與固相載體(聚苯乙烯微量滴定板)結(jié)合洗除未吸附抗原,加入待測(cè)氟蟲腈(標(biāo)樣或樣品)和抗體混合液,競(jìng)爭(zhēng)溫育后,在固相載體表面形成抗原-抗體復(fù)合物;洗除未與固相抗原結(jié)合的抗體,然后加入酶標(biāo)SPA后加入酶底物,在酶的催化作用下,底物發(fā)生降解反應(yīng),產(chǎn)生有色產(chǎn)物,通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)出酶底物的降解量(多少以顯色后的OD值高低表示),酶量與所加的氟蟲腈含量呈負(fù)相關(guān),根據(jù)標(biāo)樣濃度與所得的相應(yīng)的OD值,并經(jīng)數(shù)學(xué)換算后可得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)于未知樣品,只要在同樣條件下測(cè)定反應(yīng)后的OD值,就可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,用內(nèi)插法得知氟蟲腈的含量。直接ELSA是將酶直接標(biāo)記到抗體上,使固相抗原和游離抗原直接與酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng),使得測(cè)定時(shí)間大大縮短。
實(shí)施例1包被抗原的制備方法。
先把氟蟲腈吡唑環(huán)上的腈基改造成羧基利用活化酯法把羧基與卵清蛋白的氨基進(jìn)行偶聯(lián),得到氟蟲腈-卵清蛋白偶聯(lián)物,獲得包被抗原稀釋抗原。
實(shí)施例2固相間接檢測(cè)步驟。
1、包被在96微孔板內(nèi)每孔加入100ul包被液,4℃過(guò)夜或37℃溫育2小時(shí);2、封閉取出96微孔板,棄去包被液,用PBST洗滌三次,甩干,并在每孔中加入200ul封閉液,37℃溫育1小時(shí);3、加樣取出酶標(biāo)板,用PBST洗滌三次,甩干,將樣品去除懸浮雜物后,與等體積抗體混合液混合,按表一所示注入96微孔板內(nèi),每孔100ul,同時(shí),酶標(biāo)板A7、B7=、C7孔加入100ul的PBS,A8、B8、C8加入50ul的抗體和50ul的PBS,37℃溫育2小時(shí);4、加酶標(biāo)SPA取出酶標(biāo)板,用PBST洗滌,甩干,于每孔中加入100ul酶標(biāo)SPA稀釋液,37℃溫育45分鐘;5、加底物液取出酶標(biāo)板,用PBST洗滌三次,甩干。于每孔中加入現(xiàn)配的底物液,37℃溫育15分鐘。
6、終止反應(yīng)每孔中加入50ul2M硫酸溶液終止反應(yīng)。
7、讀數(shù),加硫酸后立即用吸水紙吸干紙吸干酶標(biāo)板底部,將酶標(biāo)板置于酶標(biāo)儀上,在450nm波長(zhǎng)下,以A8、B8、C8孔為空白調(diào)零,測(cè)定各孔的OD值。
8、設(shè)定對(duì)照孔A7、B7、C7孔的OD值的平均值為B0,1至6列的A、B、C孔的OD值平均值為B(n=1,2,3,4,5,6),同一樣品的重復(fù)孔的OD值平均值為Byp(yp代表不同的樣品)。每組數(shù)據(jù)都以三次重復(fù)的平均值為準(zhǔn)。以氟蟲腈標(biāo)樣濃度的常用對(duì)數(shù)log[c]為橫坐標(biāo)(X),對(duì)應(yīng)的抑制率I=100%[(B0-Byp)/B0]為縱坐標(biāo)(Y),可得一條Y=a+bx直線。將Byp經(jīng)換算成Yyp,然后代入直線中,可得Xyp,對(duì)Xyp取反對(duì)數(shù),即可得知樣品中氟蟲腈含量Cyp。
實(shí)施時(shí),所述的抗體可以采用單克隆抗體也可以采用多克隆抗體,所述的樣品可以采用蔬果類或液體質(zhì)。在本實(shí)施例中,所述的抗體為單克隆抗體,所述的樣品為液體質(zhì)。
實(shí)施例3固相直接檢測(cè)步驟。
1、包被在96微孔板內(nèi)每孔加入100ul包被抗原稀釋液,4℃過(guò)夜或37℃溫育2小時(shí);2、封閉取出96微孔板,棄去包被液,用PBST洗滌三次,甩干,并在每孔中加入200ul封閉液,37℃溫育1小時(shí);3、加樣取出酶標(biāo)板,用PBST洗滌三次,甩干,將樣品用丙酮與水以955進(jìn)行提取,將提取液凈化和濃縮,處理后的樣品與等體積抗體混合液混合,按表一所示注入96微孔板內(nèi),每孔100ul,同時(shí),酶標(biāo)板A7、B7=、C7孔加入100ul的PBS,A8、B8、C8加入50ul的抗體和50ul的PBS,37℃溫育2小時(shí)。
4、加底物液取出酶標(biāo)板,用PBST洗滌三次,甩干。于每孔中加入現(xiàn)配的底物液,37℃溫育15分鐘。
5、終止反應(yīng)每孔中加入50ul的2M硫酸溶液終止反應(yīng)。
6、讀數(shù),加硫酸后立即用吸水紙吸干紙吸干酶標(biāo)板底部,將酶標(biāo)板置于酶標(biāo)儀上,在450nm波長(zhǎng)下,以A8、B8、C8孔為空白調(diào)零,測(cè)定各孔的OD值。
7、設(shè)定對(duì)照孔A7、B7、C7孔的OD值的平均值為B0,1至6列的A、B、C孔的OD值平均值為B(n=1,2,3,4,5,6),同一樣品的重復(fù)孔的OD值平均值為Byp(yp代表不同的樣品)。每組數(shù)據(jù)都以三次重復(fù)的平均值為準(zhǔn)。以氟蟲腈標(biāo)樣濃度的常用對(duì)數(shù)log[c]為橫坐標(biāo)(X),對(duì)應(yīng)的抑制率I=100%[(B0-Byp)/B0]為縱坐標(biāo)(Y),可得一條Y=a+bx直線。將Byp經(jīng)換算成Yyp,然后代入直線中,可得Xyp,對(duì)Xyp取反對(duì)數(shù),即可得知樣品中氟蟲腈含量Cyp。
實(shí)施時(shí),所述的抗體可以采用多克隆抗體或單克隆抗體,所述的樣品可以采用蔬果類或液體質(zhì)。在本實(shí)施例中,所述的抗體為多克隆抗體,所述的樣品為蔬果類。
權(quán)利要求
1.一種氟蟲晴免疫檢測(cè)方法,其特征在于a、在96微孔板內(nèi)每孔加入100ul包被抗原稀釋液,4℃過(guò)夜或37℃溫育2小時(shí);b、取出96微孔板,棄去包被液,用PBST洗滌三次,甩干,并在每孔中加入200ul封閉液,37℃溫育1小時(shí);c、取出酶標(biāo)板,用PBST洗滌三次,甩干,A1-6、B1-6、C1-6依序?qū)㈩A(yù)先處理的樣品與等體積酶標(biāo)抗體混合液混合,每孔100ul,A7、B7、C7孔加入100ul的PBS,A8、B8、C8加入50ul的抗體和50ul的PBS,37℃溫育2小時(shí);d、取出酶標(biāo)板,用PBST洗滌三次,甩干,每孔中加入現(xiàn)配的底物液100ul,37℃溫育15分鐘;e、每孔中加入50ul的2M硫酸溶液終止反應(yīng);f、終止反應(yīng)后,立即用吸水紙吸干酶標(biāo)板底部,將酶標(biāo)板置于酶標(biāo)儀上,在450nm波長(zhǎng)下,以A8、B8、C8孔為空白調(diào)零,測(cè)定各孔的OD值;g、設(shè)定A8、B8、C8孔的平均值調(diào)零,以A7、B7、C7的平均值為B0,同時(shí)測(cè)定A、B、C孔1~6各列的平均值,確定樣品中的氟蟲腈含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氟蟲晴免疫檢測(cè)方法,其特征在于步驟C中在加入預(yù)先處理好的樣品與等體積抗體的混合液,37℃溫育2小時(shí)后,取出酶標(biāo)板,用PBST洗滌、甩干,于每孔中加入100ul酶標(biāo)SPA稀釋液,37℃溫育45分鐘后,再進(jìn)行后序測(cè)試。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的氟蟲腈免疫檢測(cè)方法,其特征在于所述的包被液是采用氟蟲腈改型并與卵清蛋白偶聯(lián)形成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的氟蟲晴免疫檢測(cè)方法,其特征在于所述的樣品為蔬果類,應(yīng)定量后用丙酮與水以95∶5進(jìn)行提取,將提取液凈化和濃縮,處理后的樣品與等體積抗體混合,進(jìn)行檢測(cè)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的氟蟲晴免疫檢測(cè)方法,其特征在于所述的樣品為液體質(zhì),則去除懸浮雜物,處理后的樣品與等體積抗體混合液進(jìn)行檢測(cè)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的氟蟲腈免疫檢測(cè)方法,其特征在于所述的抗體是多克隆抗體或單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種氟蟲腈免疫檢測(cè)方法,其特征是將包被抗原稀釋液溫育處理;加入封閉液,溫育;將預(yù)先處理的樣品與等體積的酶標(biāo)抗體混合,溫育;取出酶標(biāo)板,加入底物液,溫育;加入硫酸溶液終止反應(yīng);在450mm波長(zhǎng)下,測(cè)定OD值,并設(shè)定通過(guò)檢測(cè)確定樣品中的氟蟲腈含量。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是可以在環(huán)境監(jiān)控、食品、農(nóng)藥毒理或藥理等應(yīng)用或研究領(lǐng)域使用。由于本方法可以直接對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè),具有操作簡(jiǎn)單,測(cè)試過(guò)程短、流動(dòng)性強(qiáng)、特別適合于基層及市場(chǎng)監(jiān)測(cè)部門對(duì)水產(chǎn)品、蔬菜食品領(lǐng)域中的污染情況進(jìn)行快速檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N33/02GK1414390SQ0214853
公開日2003年4月30日 申請(qǐng)日期2002年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月13日
發(fā)明者劉賢金, 顏春榮, 董鍵, 余向陽(yáng) 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所