專利名稱：試劑紅細胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于血型鑒定的試劑紅細胞的組成及其制備方法，涉及輸血醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
血型是人類血液型別的一種標志，到目前為止，人類的血型系統(tǒng)已經(jīng)超過二十種，其中與輸血關(guān)系最大的是ABO血型系統(tǒng)。ABO血型系統(tǒng)是以人體紅細胞上的抗原與血清中抗體而定型的，凡紅細胞上含有A抗原，而血清中含有抗B抗體的血型稱為A型；紅細胞上含有B抗原，而血清中含有抗A抗體的血型稱為B型；紅細胞上含有A和B抗原，而血清中無抗A、抗B抗體的稱為AB型；紅細胞上不含有A、B抗原，而血清中含有抗A和抗B抗體的血型稱為O型。
正確鑒定血型是安全輸血的首要步驟，ABO血型鑒定的原理是基于抗原-抗體反應(yīng)產(chǎn)生細胞凝集，從而通過正定型(細胞定型試驗)和反定型(血清定型試驗)，準確鑒定ABO血型。由于ABO血型錯誤引起的輸血反應(yīng)時有發(fā)生，中國衛(wèi)生部早在1994年就已經(jīng)要求對獻血人員的血液鑒定ABO血型的準確度必須達到100％。已知試劑紅細胞是血型血清學(xué)中鑒定抗體所使用的必不可少的試劑，用于準確進行人紅細胞的ABO血型的反定型鑒定及不規(guī)則抗體鑒定，而試劑紅細胞的使用在國內(nèi)目前尚無實現(xiàn)標準化，各血液中心和采血站點使用的紅細胞都是自己配制，既不標準同時保存期也短，一般只能使用三天左右，一些廠家生產(chǎn)的紅細胞也因保質(zhì)期短且容易溶血等質(zhì)量問題難以在臨床推廣應(yīng)用。這種現(xiàn)狀給醫(yī)院血庫及采血站點準確檢測ABO血型帶來了諸多不便和定型錯誤的隱患，更由于試劑紅細胞來源的困難，致使一些醫(yī)院只做ABO正定型，不做反定型，導(dǎo)致血型定型差錯現(xiàn)象的出現(xiàn)，甚至造成嚴重的輸血事故。
在醫(yī)院和血站，紅細胞一般用生理鹽水來保存，都是隨時配制，一方面是細胞的濃度得不到保證，當(dāng)保存3天以上，抗原水平即明顯減弱，容易產(chǎn)生定型錯誤，引起嚴重的輸血反應(yīng)，因此就不能使用了；另一方面隨時配制過程中紅細胞不經(jīng)篩選，因此抗原強度得不到檢測確認，制備得到的紅細胞抗原的反應(yīng)強度很難保障；再次，由于制備過程缺乏過濾程序，使得已經(jīng)形成凝集顆粒的紅細胞得不到驅(qū)除，從而使定型容易產(chǎn)生假陽性的結(jié)果；同時，除紅細胞外，其他細胞成分如白細胞、血小板混雜其中，由于混入的其他細胞成分非常容易裂解、聚集，從而產(chǎn)生很多細胞碎片，影響定型結(jié)果的判定，同時會引起紅細胞的破裂。
在歐美一些先進國家的血液中心，由于血型鑒定的自動化程度提高，用于儀器檢測的嚴格標準化的試劑紅細胞已經(jīng)有專門的供應(yīng)商來提供。所謂標準化試劑紅細胞，關(guān)鍵在于提出一個可在體外有效儲存紅細胞的保養(yǎng)液體系，在歐美一般稱阿氏液，據(jù)記載，其常見的組成為氯霉素0.33克枸櫞酸單水(C6H8O7·H2O)0.55克葡萄糖(C6H12O6)20.5克肌苷(inosine)2.0克硫酸新霉素(Neomycin sulphate)0.5克氯化鈉4.2克枸櫞酸三鈉(C6HsNa3O7·2H2O)8.0克蒸餾水至1000mL該保存液的pH為6.8±0.2，滲透壓為340±10mOsm/kg，用這種阿氏液制備的試劑紅細胞在4℃可保存一個月，如果從國外訂貨，除去運輸時間，一般到達最終使用者手里就只有2周左右的有效期，還不考慮長途運輸對細胞膜的穩(wěn)定性及細胞活力的影響，檢測的成本對于很多使用者來說是很高的。也有廠家使用了這種阿氏液，但在實際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)其效果難以令人滿意，很難在臨床推廣。
因此，可以說試劑紅細胞來源和質(zhì)量沒有保障，直接影響和制約了血型鑒定技術(shù)的發(fā)展和高準確度儀器鑒定的使用。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于目前國內(nèi)輸血領(lǐng)域的現(xiàn)狀，本發(fā)明提出了一種紅細胞保存液的組成，可以較長時間地保存和穩(wěn)定紅細胞，從而實現(xiàn)試劑紅細胞的標準化生產(chǎn)和提供，更好地滿足準確鑒定ABO血型的要求。
本發(fā)明還提供了這種標準化試劑紅細胞的制備方法，達到保證試劑紅細胞性質(zhì)穩(wěn)定的目的。
根據(jù)本發(fā)明的第一個方面，提供了一種可以較長時間保存的試劑紅細胞標準品，其包括具有如下濃度的組分枸櫞酸三鈉 23-25毫摩爾濃度(mM)磷酸二氫鉀(KH2PO4) 1.5mM磷酸氫二鈉(Na2HPO4) 1mM氯化鈉(NaCl)68-72mM葡萄糖(Glucose) 50-55mM蔗糖(Sucrose) 19-22mM腺嘌呤(Adenine) 1.5-1.7mM肌苷(Inosine) 4.5-4.8mM硫酸新霉素(Neomycin Sulfate)0.033-0.040％氯霉素(Chloramphenicol) 0.01-0.02％以上組分用蒸餾水定容。
根據(jù)本發(fā)明的具有上述保存液的試劑紅細胞，是將經(jīng)過準確鑒定了ABO血型的紅細胞加入上述保存液中調(diào)配而成，紅細胞濃度為1.7±0.1％，用此試劑紅細胞檢測標準定型血清，其效價均不低于128。一般在2-8℃的條件下有效期不低于2個月，該試劑紅細胞用稀釋8倍后的標準定型血清檢測，紅細胞凝集強度達到4+。
本發(fā)明的試劑紅細胞的制備方法包括按比例配制紅細胞保存液和加入紅細胞調(diào)配，其中，所加入的紅細胞事先經(jīng)過了過濾和洗滌，去除其中已發(fā)生了凝集的紅細胞和蛋白成分。
本發(fā)明提出了一種標準化的紅細胞保存液體系，其特點在于設(shè)計了新的緩沖體系，采用磷酸-檸檬酸鹽緩沖體系，使體系的pH值維持在6.6-6.9。與已有記載的單一枸櫞酸緩沖體系相比，緩沖能力更強，有利于保持整個體系處于要求的緩沖范圍，同時保證了整個保存液的離子強度。
采用了更有效的營養(yǎng)體系，從其組成可以看出，本發(fā)明的保存液采用糖類及核苷酸作為添加劑，經(jīng)應(yīng)用效果證明，一則可以保證紅細胞的新鮮度，二則可以有效的控制紅細胞的沉降速度，三則可以使紅細胞易于懸浮，避免紅細胞聚集粘合。
本發(fā)明的保存液還具有較好的滲透壓調(diào)節(jié)能力，除了利用鹽類來調(diào)節(jié)，使得其滲透壓與紅細胞在體內(nèi)的一致，來防止紅細胞溶血，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方案，保存液中還包括分子量不高于40000的葡聚糖，其濃度為0.02-0.04％，該大分子物的加入更有利于穩(wěn)定紅細胞膜。
本發(fā)明的雙抗生素防腐系統(tǒng)，通過一定量的抗生素的協(xié)同作用，有效防止細菌的繁衍，獲得較長時間的保存期。
另一方面，為了保證本發(fā)明的試劑紅細胞的質(zhì)量，在制備過程中還需要對紅細胞進行篩選和處理，即，首先要選擇適當(dāng)?shù)募t細胞，一般應(yīng)該滿足的條件是選擇在三天以內(nèi)采集正常人的血液紅細胞，要求各檢查項目全部合格，即HBsAg(-)，HCV Ab(-)，HIV Ab(-)，梅毒(-)，ALT在正常值范圍內(nèi)，紅細胞無溶血現(xiàn)象，在保證不含任何輸血傳染疾病因子的前提下，挑選抗原水平強的血液作為原料，用于制備試劑紅細胞。原料血在配制試劑紅細胞之前，還應(yīng)該用抗-A及抗-B抗體準確鑒定待用紅細胞的ABO血型。對篩選得到的原料血紅細胞樣本需要進行過濾，可用濾器過濾或濾紙過濾，目的是驅(qū)除原料血液中的白細胞、血小板以及已經(jīng)凝集的紅細胞凝結(jié)塊，防止已凝集顆?；煸谠噭┘t細胞中，產(chǎn)生假的凝集反應(yīng)；然后通過洗滌去除非細胞成分的血漿蛋白，包括血型抗體成分，同時進一步去除部分白細胞及血小板，防止其破裂后產(chǎn)生的細胞膜及內(nèi)容物對試劑產(chǎn)生不良影響。最后用保養(yǎng)液調(diào)節(jié)紅細胞的濃度，制成適合定型使用的標準濃度試劑紅細胞。
根據(jù)本發(fā)明方法制備得到的試劑紅細胞，其上清液為白色透明液體(微帶乳光)，無任何菌落生長，并且細胞懸浮后顏色鮮艷，保存期內(nèi)始終為鮮紅色，不會變成暗紫色，有效期不低于2個月(本發(fā)明提供的試劑紅細胞保存期可長達6個月)。
綜上所述，本發(fā)明的試劑紅細胞之所以可以具有長的保存期，是在于整個體系各種成分的協(xié)同作用，營養(yǎng)體系保證紅細胞在保存過程中的能量消耗能得到及時的補充，保持紅細胞的新鮮度和活力；緩沖體系由于緩沖能力增強，使紅細胞在保存過程中因為細胞正常代謝而產(chǎn)生的對體系pH值的影響得到消除，維持正常細胞所需要的pH；而防腐體系則采用雙抗生素協(xié)同作用，來防止細胞在保存過程中因為細菌繁殖而失效溶血；保存液中的糖成分采用三種糖類，葡萄糖可以給紅細胞提供代謝所必須的能量，其他兩種糖類(蔗糖和葡聚糖)可改變體系的粘稠度并穩(wěn)定細胞膜。由此看出，保養(yǎng)液中的各種成分都是互相牽制，協(xié)同作用，達到保持紅細胞活力并延長細胞保存期的目的。
本發(fā)明的紅細胞濃度可低于目前常規(guī)操作的濃度。一般檢測要求2-4％的濃度，但是在實際測定中發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)在鑒定中時常出現(xiàn)的假陰性現(xiàn)象與細胞濃度偏高有關(guān)；目前國內(nèi)主要是采用試管法和玻片法進行血型鑒定，本發(fā)明將紅細胞濃度標準定在1.7％左右，不僅可以滿足常規(guī)手工試管方法檢測的需要，同時隨著我國自動化血液檢測儀器的大量使用，此濃度細胞還可以充分滿足自動化血型儀對細胞濃度的要求；再者，紅細胞濃度的降低，使得細胞在保存過程中的總代謝量降低，使紅細胞在保存過程中的營養(yǎng)等得到更好的保障；而本發(fā)明對于紅細胞的事先過濾和洗滌處理，和特定保存液的使用，有效保證了紅細胞的活力和純度，也為降低紅細胞濃度提供了保障。
總之，本發(fā)明的實施提供了標準化的試劑紅細胞產(chǎn)品，各醫(yī)院和血站可以直接從生產(chǎn)供應(yīng)商處得到標準一致的試劑紅細胞，為準確鑒定獻血員的ABO血型，保證安全輸血創(chuàng)造了條件。
以下通過具體實施例詳細說明本發(fā)明的實施和所具有的有益效果，旨在幫助閱讀者更好地理解本發(fā)明的精神和實質(zhì)，并不能對本發(fā)明的實施范圍構(gòu)成任何限定。
實施例1、保存液的配制枸櫞酸三鈉·2H2O 25mM磷酸二氫鉀(KH2PO4) 1.5mM磷酸氫二鈉(Na2HPO4) 1mM氯化鈉(NaCl)70mM葡萄糖(Glucose) 50mM蔗糖(Sucrose) 20mM腺嘌呤(Adenine) 1.5mM肌苷(Inosine) 4.5mM
硫酸新霉素(Neomycin Sulfate)0.038％氯霉素(Chloramphenicol) 0.015％葡聚糖(分子量≤40000)(Dextran) 0.030％將除抗生素以外的上述組分先用約500-600mL的蒸餾水溶解，然后加入抗生素混勻，添加蒸餾水至1000mL，得保存液，測定pH在6.6-6.9，滲透壓為340±10mOsm/kg。
2、紅細胞的選擇使用三天內(nèi)采集的正常人的原料血，檢測各項指標，要求HBsAg(-)，HCVAb(-)，HIV Ab(-)，梅毒(-)，ALT在正常值范圍內(nèi)，紅細胞無溶血現(xiàn)象。
用抗-A和抗-B抗體準確鑒定待用紅細胞的ABO血型，選擇合適準確血型的紅細胞樣本，用白細胞濾器過濾除去白細胞、已凝集的紅細胞和其它蛋白凝集顆粒，然后用生理鹽水洗滌5-6次，除去血漿蛋白及細胞碎片，收集得到適用的血細胞。
3、試劑紅細胞的調(diào)配和檢驗將上述紅細胞加入保存液，利用分光光度計準確調(diào)節(jié)細胞濃度達到1.7％±0.1％，用效價為128的標準定型血清(美國Immucol標準定型血清)檢查，首先確保紅細胞血型正確無誤，然后用此細胞檢查已知效價為128的標準定型血清(“長春博得德”標準定型血清)，保證其檢查所得的效價不低于128。
4、凝集強度用此細胞檢查已知效價為128的標準定型血清，將標準定型血清(“長春博得德”標準定型血清)按照1∶2的倍比稀釋共8管，要求紅細胞至少于前3管(即1∶2、1∶4及1∶8稀釋)均產(chǎn)生4+(即紅細胞全部凝集產(chǎn)生一大凝塊)的強陽性凝集反應(yīng)。
5、保存試驗1)上述試劑紅細胞保存了2個月以上，在此保存期內(nèi)，該試劑紅細胞具有以下檢測結(jié)果-外觀無溶血現(xiàn)象發(fā)生，且紅細胞和保存液的液面之間的界面清晰，紅細胞顏色鮮紅，無任何細菌滋生跡象，無紅細胞凝集塊。
-所有紅細胞均容易用保存液懸浮，不存在紅細胞粑底不懸浮現(xiàn)象。
-用已知效價為128的標準定型血清檢查紅細胞抗原的反應(yīng)強度，將標準定型血清按照1∶2的倍比稀釋共8管，紅細胞至少于前3管(即1∶2、1∶4及1∶8稀釋)均產(chǎn)生4+(即紅細胞全部凝集產(chǎn)生一大凝塊)的強陽性凝集反應(yīng)，并且測得的標準血清的效價不低于128。并且在抗原反應(yīng)強度與保存前相比較沒有變化。
-保存期內(nèi)，上清保存液中的血紅蛋白含量不高于1.2g/L。
2)用前面提到的阿氏液在同樣條件下保存，有效期為1個月，在1個月后，細胞顏色逐漸變成深褐色，且細胞和上清保存液的界面變得模糊，細胞不易懸浮，上清保存液中的游離血紅蛋白含量明顯增高，保存2個月時，達到4g/L以上。
權(quán)利要求
1.一種試劑紅細胞，由紅細胞保存液和其中所調(diào)配的紅細胞樣本組成，其中紅細胞保存液包括具有如下濃度的組分枸櫞酸三鈉 23-25毫摩爾濃度磷酸二氫鉀 1.5毫摩爾濃度磷酸氫二鈉 1毫摩爾濃度氯化鈉 68-72毫摩爾濃度葡萄糖 50-55毫摩爾濃度蔗糖 19-22毫摩爾濃度腺嘌呤 1.5-1.7毫摩爾濃度肌苷 4.5-4.8毫摩爾濃度硫酸新霉素 0.033-0.040％氯霉素 0.01-0.02％以上組分用蒸餾水定容。
2.權(quán)利要求1所述的試劑紅細胞，其中，所述的紅細胞樣本來自經(jīng)過了過濾和洗滌的原料血。
3.權(quán)利要求1或2所述的試劑紅細胞，其中，該試劑紅細胞的有效期不低于2個月。
4.權(quán)利要求1或2所述的試劑紅細胞，其中，紅細胞濃度為1.7±0.1％。
5.權(quán)利要求4所述的試劑紅細胞，其中，該試劑紅細胞用稀釋8倍后的標準定型血清檢測，紅細胞凝集強度達到4+。
6.權(quán)利要求1或2所述的試劑紅細胞，其保存液組成中還含有分子量≤40000的葡聚糖，其濃度為0.02-0.04％。
7.權(quán)利要求1-6任一項所述的試劑紅細胞的制備方法，包括按比例配制紅細胞保存液和加入紅細胞調(diào)配，其中，所加入的紅細胞事先經(jīng)過了過濾和洗滌，去除其中已發(fā)生了凝集的紅細胞和蛋白成分。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種可長期保存的試劑紅細胞，尤其提出了一種細胞保存體系，其中包括磷酸－檸檬酸鹽緩沖體系、由糖類及核苷酸組成的營養(yǎng)體系、雙抗生素防腐體系，并通過鹽類和大分子物有效調(diào)節(jié)滲透壓，穩(wěn)定紅細胞膜。本發(fā)明的試劑紅細胞在調(diào)配前需要對紅細胞進行篩選和處理，以保證紅細胞膜上的血型抗原強度。本發(fā)明的試劑紅細胞在2－8℃下的有效期在2個月以上。
文檔編號G01N33/80GK1501084SQ02148958
公開日2004年6月2日 申請日期2002年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月14日
發(fā)明者范道旺, 孫蕓, 朱家明 申請人:北京市紅十字血液中心