專利名稱：生長(zhǎng)激素結(jié)合蛋白活性測(cè)定試劑盒及其配制與測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種測(cè)定人和動(dòng)物血清中的生長(zhǎng)激素結(jié)合蛋白活性的醫(yī)學(xué)指標(biāo)測(cè)定試劑盒及其配制與測(cè)定方法。
背景技術(shù)：
人和動(dòng)物血清中的生長(zhǎng)激素結(jié)合蛋白(growth hormone binding protein，GHBP)對(duì)生長(zhǎng)激素的分布、代謝和生理活動(dòng)具有重要作用。GHBP是一個(gè)由238～246個(gè)氨基酸組成的單鏈蛋白，分子量約61kDa，屬于酸性蛋白質(zhì)，等電點(diǎn)約5.0。GHBP的主要生理作用是結(jié)合垂體產(chǎn)生的生長(zhǎng)激素在血中將生長(zhǎng)激素運(yùn)輸?shù)饺斫M織細(xì)胞，能使生長(zhǎng)激素有效儲(chǔ)存并延長(zhǎng)生長(zhǎng)激素活性，GHBP還能通過(guò)與生長(zhǎng)激素以及與生長(zhǎng)激素受體結(jié)合的增減來(lái)調(diào)節(jié)生長(zhǎng)激素的生理功能。GHBP可以作為肝生長(zhǎng)激素受體活性的外周監(jiān)測(cè)指標(biāo)。人血中GHBP的來(lái)源與生長(zhǎng)激素受體密切相關(guān)，GHBP的氨基酸序列與生長(zhǎng)激素受體的胞外結(jié)構(gòu)域部分是完全一樣的。測(cè)定血清的GHBP活性可以間接反映生長(zhǎng)激素功能的發(fā)揮情況，并且反映身體內(nèi)組織器官的生長(zhǎng)激素受體的活性在不同生理、病理?xiàng)l件下的變化情況(測(cè)定生長(zhǎng)激素受體的活性很復(fù)雜，并且取組織器官標(biāo)本損傷身體；而測(cè)定GHBP活性只要取少量血相對(duì)無(wú)損傷)。
目前GHBP測(cè)定方法中，早先有的利用凝膠層析法分離GHBP復(fù)合物再測(cè)定，此法比較費(fèi)時(shí)煩瑣；現(xiàn)在多利用放射免疫分析法，特別是利用利用放射免疫分析法和活性炭吸收方法結(jié)合起來(lái)測(cè)定GHBP活性。由于測(cè)定GHBP活性的方法比較復(fù)雜，所以國(guó)內(nèi)有關(guān)測(cè)定GHBP活性的報(bào)道很少，經(jīng)過(guò)檢索文獻(xiàn)只有幾篇相關(guān)的報(bào)道。這些報(bào)道中，張宇瑾、王德芬、史愛(ài)生、曹畿生血清生長(zhǎng)激素結(jié)合蛋白測(cè)定方法及其臨床意義，中華內(nèi)分泌代謝雜志，1994第3期，170～174；這篇論文全文只有一句話簡(jiǎn)介他們的測(cè)定方法，沒(méi)有所用試劑的配制和測(cè)定步驟等詳細(xì)具體內(nèi)容。邱寧巖、張靜馨、李慧萍、包蔭堂人血清生長(zhǎng)激素結(jié)合蛋白活性的快速測(cè)定法及其初步臨床應(yīng)用，標(biāo)記免疫分析與臨床，1998年第2期，93～96；該論文全文有一句話交代“溫育緩沖液”的配方，另一句話介紹“分離劑”的配方，此外沒(méi)有有關(guān)所用試劑的配制和測(cè)定步驟等詳細(xì)具體內(nèi)容。這些少數(shù)論文提到的測(cè)定GHBP活性的方法給一般醫(yī)院和研究單位測(cè)定GHBP活性有指導(dǎo)和參考意義，但參考這些方法對(duì)具體實(shí)施測(cè)定操作尚有困難?？傊?，高級(jí)的檢測(cè)技術(shù)人員對(duì)測(cè)定GHBP活性的技術(shù)有所了解，而實(shí)施檢測(cè)還需要做不少實(shí)驗(yàn)摸索，一般的檢測(cè)技術(shù)人員無(wú)法根據(jù)所檢索到的文獻(xiàn)技術(shù)內(nèi)容予以利用或者直接進(jìn)行檢測(cè)。此外，其他少數(shù)文獻(xiàn)中提到測(cè)定人GHBP的內(nèi)容，但沒(méi)有介紹具體方法，一般是采用國(guó)外試劑或國(guó)外測(cè)定GHBP的試劑盒。經(jīng)過(guò)檢索國(guó)內(nèi)一些生物技術(shù)公司有測(cè)定生長(zhǎng)激素結(jié)合蛋白的試劑盒供應(yīng)均為國(guó)外產(chǎn)品，沒(méi)有測(cè)定生長(zhǎng)激素結(jié)合蛋白活性的試劑盒。
本發(fā)明目的是提供一種醫(yī)學(xué)指標(biāo)測(cè)定試劑盒包括其配制與測(cè)定方法，能夠在具有放射性計(jì)數(shù)儀器的醫(yī)院或?qū)嶒?yàn)室，比較方便測(cè)定人和動(dòng)物血清中的生長(zhǎng)激素結(jié)合蛋白相對(duì)結(jié)合活性。

發(fā)明內(nèi)容
生長(zhǎng)激素結(jié)合蛋白活性放射免疫分析試劑盒及其配制與測(cè)定方法，試劑盒由5份溶劑和一份使用說(shuō)明書(shū)構(gòu)成。其溶劑分別是標(biāo)記生長(zhǎng)激素(125I-hGH)，未標(biāo)記生長(zhǎng)激素(hGH)，葡聚糖包膜炭(Dextran charcoal)，通用緩沖液(general buffer)，分析緩沖液(testbuffer)。試劑盒也可由3份溶劑和一份使用說(shuō)明書(shū)構(gòu)成，其溶劑分別是標(biāo)記生長(zhǎng)激素(125I-hGH)，未標(biāo)記生長(zhǎng)激素(hGH)，葡聚糖包膜炭(Dextran charcoal)；而通用緩沖液和分析緩沖液則以使用說(shuō)明書(shū)中列出配方由用戶自己配制。
試劑盒的規(guī)格一般以可測(cè)定50個(gè)血清樣本為一個(gè)包裝，也可以將測(cè)定100～200個(gè)樣本的規(guī)格為一個(gè)包裝。
原理是血清樣品與標(biāo)記生長(zhǎng)激素(125I-hGH)在室溫下共同孵育一段時(shí)間，分離出與GHBP結(jié)合的125I-hGH和沒(méi)有結(jié)合的125I-hGH。結(jié)合的125I-hGH與總125I-hGH放射性強(qiáng)度比即可反映GHBP的相對(duì)值。
5瓶試劑的制造方法如下(1)標(biāo)記生長(zhǎng)激素(125I-hGH)標(biāo)記方法因氯胺T方法(可參照有關(guān)文獻(xiàn)如Davis S.L.Plasma levels of prolactin，growth hormone and insul in in sheep following the infusion of arginine，leucine andphenylalanine.Endocrinology.1972，91773～780)以125I標(biāo)記人重組生長(zhǎng)激素約15秒，特異活性范圍在從90至120μCi/μg。
純化方法采用Biorad AG1×8樹(shù)脂(50～100目)層析，除去游離125I。再以1×50cm BiogelP100層析過(guò)柱，以PBS(含0.5％BSA)在4℃條件下洗脫，除去凝聚的125I-hGH，得到單體125I-hGH。標(biāo)記生長(zhǎng)激素(125I-hGH)可直接向美國(guó)杜邦公司購(gòu)買，國(guó)內(nèi)有關(guān)公司也有供應(yīng)。一般要求保證送到用戶使用時(shí)125I-hGH的比放射性約有60μCi/μg。
(2)未標(biāo)記生長(zhǎng)激素(hGH)沒(méi)有標(biāo)記過(guò)的重組人生長(zhǎng)激素。技術(shù)要求是該未標(biāo)記生長(zhǎng)激素以通用緩沖液稀釋后分加到每個(gè)非特異性結(jié)合(NSB)試管中時(shí)，保持hGH在試管孵育反應(yīng)溶液中濃度為2μg/ml。一般每個(gè)非特異性結(jié)合試管中孵育反應(yīng)溶液總體積為500μl，因此加入每個(gè)非特異性結(jié)合試管中為1μg的hGH。
(3)葡聚糖包膜炭(Dextran charcoal)2％葡聚糖和2％活性炭溶于PBS。制法先將2％葡聚糖(Dextran)在40～70℃溫度條件下攪拌溶解，待葡聚糖溶解后，加入活性炭(charcoal，50～200目)，室溫下攪拌1～5小時(shí)。葡聚糖包膜炭的配制的方法、要求與質(zhì)量也是分析準(zhǔn)確的必要條件。
(4)通用緩沖液(general buffer)PBS(pH 7～7.5)
(5)分析緩沖液(test buffer)PBS含0.5％BSA和75mMgCl2。
該試劑盒要求在4℃條件下保存。
本試劑盒的測(cè)定方法設(shè)置4～8個(gè)總“非特異性結(jié)合”(NSB)測(cè)定管，目的為使非特異性結(jié)合測(cè)定計(jì)數(shù)平均放射性計(jì)數(shù)準(zhǔn)確，并且考察加樣操作的準(zhǔn)確性；除此總NSB外，每個(gè)測(cè)定血樣另外特地設(shè)置2個(gè)對(duì)應(yīng)的“非特異性結(jié)合(NSB)”測(cè)定管，使測(cè)定結(jié)果更精確。
該試劑盒組成結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，按照其使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作測(cè)定，步驟分明，使用方便，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。一般具有放射性計(jì)數(shù)儀器的醫(yī)院或?qū)嶒?yàn)室，測(cè)定技術(shù)人員都可進(jìn)行測(cè)定。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合表1和表2與實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，其中表1是本發(fā)明實(shí)施方式步驟的示意，表2是試劑盒使用說(shuō)明書(shū)中必須列出的測(cè)定加樣次序和數(shù)量的清單。
測(cè)定操作時(shí)先用通用buffer稀釋125I-hGH，一邊稀釋一邊取100μl的125I-hGH到放射性計(jì)數(shù)儀上測(cè)試，直到所稀釋的125I-hGH達(dá)到每100μl的計(jì)數(shù)約20000cpm為止。
所有各個(gè)試管中均加入100μl的125I-hGH。
設(shè)置6個(gè)總計(jì)數(shù)管，目的為使總計(jì)數(shù)管平均放射性計(jì)數(shù)準(zhǔn)確，并且考察加樣操作的準(zhǔn)確性。各總計(jì)數(shù)管除加100μl125I-hGH外，再加400μl分析buffer，總孵育反應(yīng)溶液總體積為500μl。
設(shè)置6個(gè)總“非特異性結(jié)合”(NSB)測(cè)定管，目的為使非特異性結(jié)合測(cè)定計(jì)數(shù)平均放射性計(jì)數(shù)準(zhǔn)確，并且考察加樣操作的準(zhǔn)確性；這6個(gè)非特異性結(jié)合測(cè)定管各管除加100μl125I-hGH外，加入混合血清(即取自各測(cè)定血清等量混合物稱為混合血清)50μl，再加50μl未標(biāo)記生長(zhǎng)激素，加入300μl通用buffer，總孵育反應(yīng)溶液總體積為500μl。此外，為確保測(cè)定的精確性，對(duì)每個(gè)血清測(cè)定樣本還設(shè)置2個(gè)“非特異性結(jié)合”(NSB)測(cè)定管，這些對(duì)應(yīng)血清樣本的血清測(cè)定樣本NSB各管除加100μl125I-hGH外，加入所測(cè)血清50μl，再加50μl未標(biāo)記生長(zhǎng)激素，加入300μl通用buffer，總孵育反應(yīng)溶液總體積為500μl。具體計(jì)算結(jié)合活性時(shí)，以該2個(gè)對(duì)應(yīng)于所測(cè)血清樣本的NSB的平均數(shù)為準(zhǔn)。
對(duì)每個(gè)樣品測(cè)定管設(shè)置為2個(gè)同樣的試管(平行管)，以減少加樣和測(cè)定的誤差。每測(cè)定管中除125I-hGH外，加入所要測(cè)定的血清50μl，再加350μl分析buffer，孵育反應(yīng)溶液總體積為500μl。
所有試管按照加樣清單的程序加完125I-hGH、未標(biāo)記GH、測(cè)試樣本血清、通用buffer或分析buffer等試劑后，各管都要經(jīng)過(guò)強(qiáng)烈混懸，氣溫高時(shí)室溫下孵育8小時(shí)，氣溫低時(shí)室溫下孵育過(guò)夜。
將葡聚糖包膜炭(Dextran charcoal)放置在4℃條件下預(yù)冷。該懸浮液極容易發(fā)生沉淀，為保證加入到各管中葡聚糖包膜炭的數(shù)量均勻，需要在其加滴到各管的過(guò)程中保持該溶液處于不停地?fù)u蕩混懸狀態(tài)。各管加葡聚糖包膜炭溶液500μl。
所有試管加完葡聚糖包膜炭后，經(jīng)過(guò)強(qiáng)烈混懸，進(jìn)行2000g和4℃條件下離心分離。
對(duì)各總計(jì)數(shù)管除去上清液，回收沉淀；對(duì)各樣品測(cè)定管和各非特異性結(jié)合測(cè)定管回收各自的上清液，除去沉淀。
對(duì)總計(jì)數(shù)管的沉淀以及各樣品測(cè)定管和各非特異性結(jié)合測(cè)定管各自的上清液進(jìn)行放射性計(jì)數(shù)，每管計(jì)數(shù)1分鐘。按照記錄的各管計(jì)數(shù)cpm，以下列公式計(jì)算各血清樣本的特異性結(jié)合活性SB(％)＝[(TB-NSB)/TC]×100％公式中SB＝特異性結(jié)合活性TB＝樣品測(cè)定管的cpmNSB＝非特異性結(jié)合測(cè)定管的cpmTC＝總計(jì)數(shù)管的cpm
表1 “生長(zhǎng)激素結(jié)合蛋白活性放射免疫分析試劑盒”實(shí)施方式步驟原理

以上各管強(qiáng)烈混懸，氣溫高時(shí)室溫下孵育8小時(shí)，氣溫低時(shí)室溫下孵育過(guò)夜

以上各管強(qiáng)烈混懸，2000g 4℃條件下離心

表2 “生長(zhǎng)激素結(jié)合蛋白活性放射免疫分析試劑盒”操作加樣清單

權(quán)利要求
1.一種用于人和動(dòng)物生長(zhǎng)激素結(jié)合蛋白活性測(cè)定試劑盒，其特征在于，試劑盒構(gòu)成包括5種配制的溶劑和一份使用說(shuō)明書(shū)，5種特定配制的溶劑是(1)標(biāo)記生長(zhǎng)激素，(2)未標(biāo)記生長(zhǎng)激素，(3)葡聚糖包膜活性炭，(4)分析緩沖液，(5)通用緩沖液。
2.一種用本權(quán)利要求1所述的試劑盒測(cè)定人和動(dòng)物生長(zhǎng)激素結(jié)合蛋白活性的方法，其特征在于除設(shè)置4～8個(gè)總“非特異性結(jié)合”(NSB)測(cè)定管外，每個(gè)測(cè)定血樣另外特地設(shè)置2個(gè)對(duì)應(yīng)的“非特異性結(jié)合(NSB)”測(cè)定管。
3.一種對(duì)本權(quán)利要求1所述的試劑盒中試劑的配制方法，其特征在于“葡聚糖包膜活性炭”溶劑的配制，先將2％葡聚糖(Dextran)在30～70℃條件下攪拌溶解，待葡聚糖溶解后，加入活性炭(charcoal，50～100目)，室溫下攪拌1～5小時(shí)。
4.根據(jù)本權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒也可由3份溶劑和一份使用說(shuō)明書(shū)構(gòu)成。其溶劑分別是標(biāo)記生長(zhǎng)激素、未標(biāo)記生長(zhǎng)激素、葡聚糖包膜炭；而通用緩沖液和分析緩沖液則以使用說(shuō)明書(shū)中列出配方由用戶自己配制。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種用于人和動(dòng)物血清中的生長(zhǎng)激素結(jié)合蛋白活性測(cè)定試劑盒及其配制與測(cè)定方法。其特征是試劑盒由標(biāo)記生長(zhǎng)激素、未標(biāo)記生長(zhǎng)激素、葡聚糖包膜炭、通用緩沖液和分析緩沖液等5種配制的溶劑和一份使用說(shuō)明書(shū)組成。測(cè)定血清中生長(zhǎng)激素結(jié)合蛋白活性的方法，除設(shè)置4～8個(gè)總“非特異性結(jié)合”(NSB)測(cè)定管外，每個(gè)測(cè)定血樣另外特地設(shè)置2個(gè)對(duì)應(yīng)的“非特異性結(jié)合(NSB)”測(cè)定管，使測(cè)定結(jié)果更精確。葡聚糖包膜炭的配制方法與要求及其質(zhì)量也是測(cè)定準(zhǔn)確的必要條件。該試劑盒能夠在具有放射性計(jì)數(shù)儀器的醫(yī)院或?qū)嶒?yàn)室，比較方便地測(cè)定人和動(dòng)物血清中的生長(zhǎng)激素結(jié)合蛋白相對(duì)結(jié)合活性。
文檔編號(hào)G01N33/60GK1502992SQ02154619
公開(kāi)日2004年6月9日 申請(qǐng)日期2002年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月26日
發(fā)明者賀淹才 申請(qǐng)人:華僑大學(xué)