專利名稱：測定昆蟲對殺蟲劑抗性的方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及測定昆蟲對殺蟲劑抗性的方法和試劑盒，更具體地提供了用來測定昆蟲對含有機(jī)磷酸酯和氨基甲酸酯殺蟲劑抗性的田間使用的方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
化學(xué)殺蟲劑目前仍然是防治如瘧疾、登革熱、絲蟲病等疾病傳播媒介的最重要的試劑。自1940年發(fā)明第一種合成殺蟲劑DDT以后，上述疾病的傳播造成的死亡人數(shù)已大大減少?？墒?，持續(xù)地使用殺蟲劑導(dǎo)致攜帶上述疾病，主要是昆蟲媒介的抗性的發(fā)展，昆蟲的抗藥性降低了防治媒介的效果并因此造成疾病傳播?？剐缘臏y定主要是基于世界衛(wèi)生組織(WHO)的標(biāo)準(zhǔn)試驗方法，這些方法對使用者來講是特別不易使用的，花費(fèi)時間長，需要許多昆蟲樣本，使用的試劑盒的貨架壽命短并需要熟練的人員進(jìn)行試驗并解釋試驗結(jié)果。結(jié)果，一般都不知道許多種昆蟲媒介的敏感性水平，而昆蟲的敏感性會影響防治的結(jié)果。
在防治疾病傳播媒介中的一個重大突破應(yīng)該是開發(fā)快速田間試劑盒。
通常，抗性的生化基礎(chǔ)是下述3種機(jī)理以有機(jī)磷酸酯和氨基甲酸酯為靶標(biāo)的非特定酯酶水平的增加；復(fù)合功能的氧化酶對擬除蟲菊酯的活性提高；和對有機(jī)磷和氨基甲酸酯的非敏感性乙酰膽堿酯酶。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了使用單個昆蟲測定昆蟲中乙酰膽堿酯酶敏感性的方法和試劑盒，本方法可快速和簡便的使用，且獲得的結(jié)果非常容易解釋。
根據(jù)本發(fā)明的試劑盒包含一種容器，該容器分別包括下述容器
I.一種中性至酸性pH的磷酸緩沖液II.碘化乙酰基膽堿III.5，5-二硫-雙-(2-硝基苯甲酸)IV.殘殺威(一種氨基甲酸酯殺蟲劑)和V.水混溶有機(jī)溶劑。
用于田間的試劑盒還包括進(jìn)行試驗的設(shè)備，例如混合容器、試驗試管、如Eppendorf試管、移液管和微檢測盤。
緩沖液的pH優(yōu)選為6-7，更優(yōu)選大約6.8。
pH緩沖液優(yōu)選為磷酸鉀。
殘殺威優(yōu)選使用5-25mg/l的70％乙醇溶液。
水混溶有機(jī)溶劑優(yōu)選為丙酮。
本發(fā)明方法包含下述步驟以任何順序在緩沖液中將單個昆蟲勻漿，優(yōu)選用杵在如Eppendorf試管的小試管中研磨，在緩沖溶劑中制備碘化乙酰膽堿的溶液，在緩沖液中制備5，5-二硫-雙-(2-硝基苯甲酸)溶液，并在緩沖液中制備殘殺威溶液，然后將昆蟲勻漿液滴入檢測盤的孔中，將碘化乙酰膽堿和5，5-二硫-雙-(2-硝基苯甲酸)溶液滴入一些孔中，并將5，5-二硫-雙-(2-硝基苯甲酸)、碘化乙酰膽堿和殘殺威溶液滴入其它孔中，并檢測兩種細(xì)胞樣品染色的黃色度的不同。
如果需要可將殘殺威和碘化乙酰膽堿溶液預(yù)混合。
可用肉眼評價結(jié)果，如果需要更準(zhǔn)確的結(jié)果，可在410nm用免疫測定讀數(shù)器掃描。
包括殘殺威的細(xì)胞，如果在保溫一段時間后黃色變淺，說明乙酰膽堿酯酶是敏感的，且昆蟲對有機(jī)磷和氨基甲酸酯殺蟲劑是非抗性的。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是最先獲得了僅需要單個的昆蟲進(jìn)行測定，就可測定乙酰膽堿酯酶敏感性的田間試劑盒，在試驗中使用本方法可以快速獲得試驗結(jié)果(通常在30分鐘內(nèi)獲得結(jié)果)，且可以不需要儀器，通過目測和比色計讀數(shù)。本試劑盒和方法花費(fèi)的人力少且不需要特殊訓(xùn)練即可使用。而且，本試劑盒具有長的貨架壽命，可在室溫下穩(wěn)定數(shù)周。
應(yīng)用本試劑盒可以
1.相當(dāng)簡單地測定抗性2.確保用于防治害蟲和疾病媒介的化學(xué)殺蟲劑是有效的，從而減少死亡率、費(fèi)用和人力3.能夠經(jīng)常和定期地監(jiān)測靶標(biāo)昆蟲的敏感性和4.對新防治藥劑和防治策略的設(shè)計進(jìn)行支持，并理解昆蟲的作用方式。
將丙酮倒入碘化乙酰膽堿中并在孔中混合形成溶液，然后向其中加入9ml緩沖液。將其中10ml緩沖液倒入5，5-二硫-雙-(2-硝基苯甲酸)中，并在孔中混合形成溶液，1.8ml碘化乙酰膽堿溶液與4ml緩沖液混合，然后加入0.2ml并在孔中混合。
用杵在Eppendorf試管中用一滴緩沖液中將一只蚊子勻漿，然后用緩沖液稀釋到Eppendorf試管的0.5ml標(biāo)記。將勻漿液靜置5分鐘使碎片落下后，將一滴勻漿液滴入到四孔檢測盤的每個孔中。將一滴未被稀釋的碘化乙酰膽堿溶液和一滴5，5-二硫-雙-(2-硝基苯甲酸)溶液滴入2個孔中。一滴殘殺威溶液滴入另外兩個孔中。然后將一滴5，5-二硫-雙-(2-硝基苯甲酸)溶液滴入到這兩個孔中。將盤保溫30分鐘，然后評價兩個系列孔中的樣品的顏色。如果在包括殘殺威溶液的第二對孔中的黃色，比第一對孔中的要淺，蚊子的乙酰膽堿酯酶是敏感的，且因此對有機(jī)磷和氨基甲酸酯殺蟲劑不具備抗性。
肉眼檢查顏色或在410nm用免疫測定讀數(shù)器掃描。
權(quán)利要求
1.一種用單個昆蟲測定乙酰膽堿酯酶敏感性的方法，其中包含下述步驟以任何順序在中性至酸性pH磷酸緩沖液中將單個昆蟲勻漿，在中性至酸性pH磷酸緩沖的水混溶有機(jī)溶劑中制備碘化乙酰膽堿的溶液，在緩沖液中制備5，5-二硫-雙-(2-硝基苯甲酸)溶液，并在緩沖液中制備殘殺威溶液，將昆蟲勻漿液滴入檢測盤的孔中，然后將碘化乙酰膽堿和5，5-二硫-雙-(2-硝基苯甲酸)溶液滴入一些孔中，并將5，5-二硫-雙-(2-硝基苯甲酸)、碘化乙酰膽堿和殘殺威溶液滴入其它孔中，并在兩種系列的細(xì)胞樣品之間檢測黃色度的不同。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于其中使用一種試劑盒，其為分別包括下述容器的一種容器I.一種中性至酸性pH的磷酸緩沖液II.碘化乙酰基膽堿III.5，5-二硫-雙-(2-硝基苯甲酸)IV.殘殺威和V.水混溶有機(jī)溶劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的方法，其特征在于其中緩沖液是pH6-7的緩沖液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其特征在于其中緩沖液是pH6.8的緩沖液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的方法，其特征在于其中緩沖液是磷酸鉀。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一的方法，其特征在于其中使用的殘殺威是5-25mg/l的乙醇溶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一的方法，其特征在于其中殘殺威和碘化乙酰膽堿溶液是預(yù)混合的。
8.一種使用單個昆蟲在昆蟲中測定乙酰膽堿酯酶敏感性的試劑盒，其中包含一種容器，該容器分別包括下述容器I.一種中性至酸性pH的磷酸緩沖液II.碘化乙酰膽堿III.5，5-二硫-雙-(2-硝基苯甲酸)IV.殘殺威V.水混溶有機(jī)溶劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的試劑盒，其特征在于其中緩沖液是pH6-7的緩沖液。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或權(quán)利要求9的試劑盒，其特征在于其中緩沖液是pH6.8的緩沖液。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征在于其中緩沖液是磷酸鉀。
12.根據(jù)權(quán)利要求8-11任一的試劑盒，其特征在于其中使用的殘殺威額是5-25mg/l的乙醇溶液。
13.根據(jù)權(quán)利要求8-12任一的試劑盒，其特征在于其中還包含進(jìn)行試驗的設(shè)備。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的試劑盒，其特征在于其中包含試驗試管、移液管和小生測盤。
全文摘要
一種用單個昆蟲測定昆蟲體中乙酰膽堿酯酶敏感性的方法，其中包含下述步驟以任何順序在中性至酸性pH磷酸緩沖液中將單個昆蟲勻漿，在中性至酸性pH磷酸緩沖的水混溶有機(jī)溶劑中制備碘化乙酰膽堿的溶液，在緩沖液中制備5，5－二硫－雙－(2－硝基苯甲酸)溶液，并在緩沖液中制備殘殺威溶液，將昆蟲勻漿液滴入檢測盤的孔中，將碘化乙酰膽堿和5，5－二硫－雙－(2－硝基苯甲酸)溶液滴入－些孔中，并將5，5－二硫－雙－(2－硝基苯甲酸)殘殺威溶液滴入其它孔中，并在兩部分細(xì)胞樣品之間檢測黃色度的不同。本發(fā)明還涉及一種使用單個昆蟲在昆蟲中測定乙酰膽堿酯酶敏感性的試劑盒，其中包含一種容器，該容器分別包括下述容器I.一種中性至酸性pH的磷酸緩沖液，II.碘化乙酰膽堿，III.5，5－二硫－雙－(2－硝基苯甲酸)，IV.殘殺威，V.水混溶有機(jī)溶劑。
文檔編號G01N33/15GK1502982SQ02158930
公開日2004年6月9日 申請日期2002年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月26日
發(fā)明者李·漢·林, 納茲尼·瓦西·艾哈邁德, 瓦西 艾哈邁德, 李 漢 林 申請人:醫(yī)藥研究院