專利名稱：一種蛋白質(zhì)芯片及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)芯片及其制備方法和應(yīng)用，尤其涉及用無細(xì)胞離體一步到位的蛋白質(zhì)體外合成法制備蛋白質(zhì)芯片以及其在臨床診斷、醫(yī)學(xué)研究、新藥開發(fā)和檢驗(yàn)、蛋白質(zhì)組研究等領(lǐng)域相關(guān)應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在人類基因組DNA序列被測(cè)定和其它大量物種的基因組被逐步迅速測(cè)定的背景下，目前迫在眉睫的任務(wù)是發(fā)展一套高效、快捷和實(shí)用的方法或技術(shù)來研究基因組所編碼的蛋白質(zhì)的功能，以獲得對(duì)細(xì)胞內(nèi)各生物過程和途徑的全面完整的理解。微列陣技術(shù)作為目前一種高效、全面和快捷的方法已在研究基因表達(dá)、基因突變和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控等領(lǐng)域發(fā)揮出其特有的快速獲取大量、平行數(shù)據(jù)的作用。由于蛋白質(zhì)在實(shí)現(xiàn)基因功能上比mRNA更進(jìn)一步，所以目前研發(fā)蛋白質(zhì)微列陣技術(shù)來研究大量蛋白質(zhì)，甚至整個(gè)蛋白質(zhì)組的功能已成為大規(guī)模和后基因組生物學(xué)的前沿。蛋白質(zhì)芯片技術(shù)借用大量已成熟的DNA芯片技術(shù)，已發(fā)展出了包括低密度的金屬表面的SELDI芯片、高密度的三維凝膠片芯片、高密度圓柱狀芯片等形式。如文獻(xiàn)1(Zhu H.et al.Science.2001，2932101-5)報(bào)告了如何在高密度平滑玻璃表面制備蛋白質(zhì)組芯片及其應(yīng)用的工作。如何將蛋白質(zhì)高效固定于固體表面是制作蛋白質(zhì)芯片的另一重要的問題。目前存在的固體表面包括用二價(jià)鎳、環(huán)氧基或醛基活化的PDMS或玻璃表面，其他還有硝酸纖維、金屬或Poly-L-lysine覆蓋等表面。
然而，蛋白質(zhì)芯片領(lǐng)域中最大的障礙是資金的高投入、研發(fā)的長(zhǎng)周期及其技術(shù)的高度復(fù)雜性。目前的采用的方法包括基因克隆、活體細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)、大規(guī)模高效率蛋白質(zhì)提純和蛋白質(zhì)芯片的制備和應(yīng)用這四部分。目前這四部分都是分步單獨(dú)進(jìn)行，每一步的實(shí)施均要求專門的設(shè)備和人力，每一步的產(chǎn)品也得分門別類地記錄和保存。其中真核生物的基因克隆一項(xiàng)需消耗大量的人力、物力、空間和時(shí)間；蛋白質(zhì)的表達(dá)和大規(guī)模提純不但消耗大量的人力、物力，還必須掌握專門技術(shù)，目前世界上只有屈指可數(shù)的幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室可以做到，另外，蛋白質(zhì)的保存期在-80攝氏度冰箱內(nèi)也少于6個(gè)月；而蛋白質(zhì)芯片的制作過程也因?yàn)榈鞍踪|(zhì)自身的不穩(wěn)定性，必須在嚴(yán)格控制的條件下反復(fù)調(diào)試才能實(shí)現(xiàn)，更重要的是一旦制成蛋白質(zhì)芯片，該芯片不但難于保存(＜7天)，而且無法運(yùn)輸，更不能形成產(chǎn)品。
因此，在蛋白質(zhì)芯片領(lǐng)域中，如何以低成本克隆大量真核生物的基因、高效獲取多種蛋白質(zhì)以及蛋白質(zhì)芯片的實(shí)用化和商品化仍是這個(gè)領(lǐng)域的瓶頸。目前已有的方法還無法適應(yīng)研究像人類這樣復(fù)雜的蛋白質(zhì)組的研究工作。而且，蛋白質(zhì)芯片在臨床診斷、生物醫(yī)學(xué)及基礎(chǔ)研究中如何發(fā)揮更有效的作用還有待進(jìn)一步的突破。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服蛋白質(zhì)自身的不穩(wěn)定性，必須在嚴(yán)格控制的條件下反復(fù)調(diào)試才能實(shí)現(xiàn)，更重要的是一旦制成蛋白質(zhì)芯片，該芯片不但難于保存(＜7天)，而且無法運(yùn)輸，更不能形成產(chǎn)品的缺陷；以及克服傳統(tǒng)制備方法必須先克隆基因表達(dá)片段，經(jīng)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)、合成蛋白質(zhì)純化的繁雜步驟的缺陷；從而提供一種保存時(shí)間長(zhǎng)的、實(shí)用化和商品化的蛋白質(zhì)芯片及其應(yīng)用。以及提供一種制作過程簡(jiǎn)單，無需利用活體細(xì)胞表達(dá)蛋白和繁瑣的純化步驟的蛋白質(zhì)芯片制備方法。
本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)芯片包括一基片，基片上有親和層，以及親和層上有生物大分子層，其中生物大分子層為編碼基因片段，或編碼基因片段的產(chǎn)物膜層。
所用的基片是常規(guī)的生物芯片基片材料；可以是玻璃、石英或表面鍍膜的固體復(fù)合材料；該表面鍍膜的固體復(fù)合材料最好是鍍金屬膜(如金、銀、銅、鋅)的陶瓷、塑料、石墨或聚合硅烷(如二甲基硅烷)。本發(fā)明的蛋白質(zhì)芯片，其基片層結(jié)構(gòu)可以是平滑形(基片表面為一連續(xù)的平面)，如圖1A所示；也可以是微孔形(基片表面設(shè)有分隔設(shè)置的且不會(huì)互相滲漏的腔體，該腔體可以是由基片材料本身形成分隔裝置得到的，如圖1B，腔體也可在基片上粘貼一層格柵狀膠材得到)，根據(jù)需要腔體的直徑或長(zhǎng)度可以為幾納米到幾百微米；基片層結(jié)構(gòu)也可以是島狀突起形(基片表面為一個(gè)個(gè)柱狀的凸起物)，如圖1C所示。當(dāng)微孔形芯片的腔體為0.1nm～3nm時(shí)，稱之為毛細(xì)微孔形芯片，如圖1D所示；微孔形、島狀突起形和毛細(xì)微孔形芯片尤其適用于不同樣品的同時(shí)檢測(cè)，用者可根據(jù)其需要采用適當(dāng)?shù)男酒?br> 基片層表面須經(jīng)化學(xué)修飾而激活，以達(dá)到固定親合層的目的。在用玻璃或石英材料作基片時(shí)，可由簡(jiǎn)單的酸堿處理而獲得表面激活的羥基，以用于共價(jià)結(jié)合硅烷化合物的親合層；在用陶瓷、塑料、石墨或聚二甲基硅烷等材料作基片時(shí)，可采用金、銀、銅、鋅等金屬鍍膜實(shí)現(xiàn)表面激活，以達(dá)到共價(jià)連接巰基烷類化合物單分子膜的目的。
所述的蛋白質(zhì)芯片，其基片上的親和層是一種與蛋白質(zhì)能高度特異親合的單分子膜，該單分子膜為有機(jī)長(zhǎng)鏈，其上共價(jià)結(jié)合有親和分子(見圖3中標(biāo)號(hào)4所示)，親和分子可以是生物素、抗生物素蛋白(Avidin)、抗體變異區(qū)、谷胱甘肽、聚丙烯酰胺膠、瓊脂糖凝膠或螯合劑，這些螯合劑螯合金屬離子Ni2+、Fe3+、Cu2+、Ga2+或Ca2+等，如EDTA，EGTA，NTA(tetradentatenitrolotriacetic acid)，IDA(iminodiacetic acid)或TCE(tris(carboxymethyl)ethylenediamine)，三亞氨乙酰乙酸(tridentate iminodiacetic acid)等。這些解離常數(shù)(Kd)在10-7以上的分子可與合成的蛋白質(zhì)上的親合標(biāo)記非常選擇性地牢固結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)高度特異地固定蛋白質(zhì)的目的，避免了非特異性結(jié)合造成的高背景。而且，由于不同編碼基因產(chǎn)物上的親合標(biāo)記總在同一位置出現(xiàn)，蛋白質(zhì)能以完全一致的空間取向通過特異親合標(biāo)記固定于芯片表面，從而最大限度地保持了生物大分子的自然構(gòu)相。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)芯片，其親和層上的生物大分子層為編碼基因片段，或編碼基因片段的產(chǎn)物。編碼基因片段在實(shí)施例中選用RNA或DNA，選用的RNA可以是mRNA、tRNA以及人工合成的RNA等，選用的DNA可以是cDNA、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、人工合成的DNA以及基因組中的核苷酸片段等。也可以采用逆向PCR(RT-PCR)技術(shù)直接從活體組織內(nèi)提取的mRNA中擴(kuò)增目標(biāo)基因表達(dá)片段。該編碼基因不拘泥于用來合成蛋白質(zhì)，還可設(shè)計(jì)模板用于合成人工隨機(jī)短肽(Random peptide)，抗體隨機(jī)變異區(qū)(如Phage display技術(shù)所描述的)，或含有其它蛋白結(jié)合變異區(qū)(如Affibody技術(shù)所描述的)的人工隨機(jī)短肽或蛋白質(zhì)。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種所述蛋白質(zhì)芯片的制備方法，包括如下步驟(2)基片表面的處理和活化清潔固體基片，并將基片表面進(jìn)行活化使其共價(jià)連接親和層的單分子膜?；瑢颖砻骓毥?jīng)化學(xué)修飾而激活，以達(dá)到固定親合層的目的，在用玻璃或石英材料作基片時(shí)，可由簡(jiǎn)單的酸堿處理而獲得表面激活的羥基，以用于共價(jià)結(jié)合親合層；在用陶瓷、塑料、石墨或聚二甲基硅烷等材料作基片時(shí)，可采用金、銀、銅、鋅等金屬鍍膜實(shí)現(xiàn)表面激活，以達(dá)到共價(jià)連接巰基烷類化合物單分子膜的目的。
(3)生物大分子層的制備將基因擴(kuò)增產(chǎn)物加到上述步驟(1)得到的結(jié)合有親和層的基片上，制得生物大分子層為編碼基因片段的蛋白質(zhì)芯片。
由該方法制得的蛋白質(zhì)芯片是一種前體蛋白質(zhì)芯片，在使用的時(shí)候必須通過如下步驟利用無細(xì)胞體外轉(zhuǎn)錄-翻譯系統(tǒng)把從DNA到mRNA、mRNA到蛋白質(zhì)、溶液中游離蛋白質(zhì)到表面固定蛋白質(zhì)這一系列反應(yīng)和變化在同一反應(yīng)體系內(nèi)一步完成，即一步到位完成。該使用方法具體包括步驟(3)即基因擴(kuò)增產(chǎn)物的翻譯過程(參見圖3)1)體積比(20～200)∶(1～10)∶1將體外轉(zhuǎn)錄翻譯反應(yīng)液，100mM乙酸鎂和1mM蛋氨酸混合；2)將本發(fā)明制得的生物大分子層為編碼基因片段的蛋白質(zhì)芯片浸沒于上述步驟1)制成的混合液中，30℃溫育1到3小時(shí)，實(shí)現(xiàn)從編碼基因片段到蛋白質(zhì)的生化反應(yīng)，并同時(shí)完成從游離蛋白質(zhì)到表面固定蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化。
3)用緩沖液清洗步驟2)得到的蛋白質(zhì)芯片，制得的蛋白質(zhì)芯片即可使用或冷藏待用。
所述的使用步驟進(jìn)一步優(yōu)選在步驟2)中將蛋白質(zhì)芯片浸沒于步驟1)制成的混合液之后，還包括用震蕩或超聲波清洗儀除去芯片表面的氣泡。
該發(fā)明還可在2cm×5cm的固體表面內(nèi)形成1000到100000個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，即高密度蛋白質(zhì)芯片或高密度蛋白質(zhì)微列陣。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及所述的蛋白質(zhì)芯片在臨床診斷、醫(yī)學(xué)研究、新藥開發(fā)和檢驗(yàn)、蛋白質(zhì)組研究等領(lǐng)域的用途。例如，該蛋白質(zhì)芯片可用于勾勒小到細(xì)胞器、細(xì)胞、大到各種體液、組織、器官、系統(tǒng)，甚至整個(gè)生物的蛋白質(zhì)組成輪廓，從而發(fā)現(xiàn)疾病特異的生物標(biāo)記，以用于對(duì)各種惡性疾病的早期臨床診斷；又如，該蛋白質(zhì)芯片可用于發(fā)現(xiàn)組織或疾病特異表達(dá)的蛋白質(zhì)，從而促進(jìn)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的研究；又如，該蛋白質(zhì)芯片可用于新藥開發(fā)和檢驗(yàn)，通過對(duì)蛋白質(zhì)與藥物小分子間相互作用的研究，可以發(fā)現(xiàn)哪些藥物小分子具有能與某種疾病或癌癥相關(guān)蛋白作用而達(dá)到抑制病變的目的，從而發(fā)現(xiàn)新藥；又如，該蛋白質(zhì)芯片可用于蛋白質(zhì)組的基礎(chǔ)研究，蛋白質(zhì)芯片可作為實(shí)驗(yàn)平臺(tái)來研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-DNA、蛋白質(zhì)-RNA、蛋白質(zhì)-脂肪、蛋白質(zhì)-抗體、蛋白質(zhì)-短肽、蛋白質(zhì)-多聚糖之間的相互作用，蛋白質(zhì)芯片還可作為實(shí)驗(yàn)平臺(tái)來研究真核生物蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄后修飾和尋找各種酶的下游底物，從而為勾勒生物體內(nèi)的各種生物途徑的網(wǎng)絡(luò)圖提供豐富的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
本發(fā)明拓展了蛋白質(zhì)芯片與下游實(shí)驗(yàn)的結(jié)合配套，如在表面金屬覆蓋的蛋白質(zhì)芯片上可以用表面等離子體共振(SPR)的檢測(cè)手段研究蛋白質(zhì)與其它分子間的結(jié)合和解離常數(shù)，從而解決了以往無法大規(guī)模同步測(cè)定多種蛋白質(zhì)與其它分子間的結(jié)合或解離常數(shù)的難題。還可在表面金屬覆蓋的微孔蛋白質(zhì)芯片上可以結(jié)合質(zhì)譜的檢測(cè)手段確定何種分子與蛋白質(zhì)芯片上的蛋白質(zhì)結(jié)合，從而大大縮短了檢測(cè)周期，提高了檢測(cè)效率。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)芯片和現(xiàn)有的蛋白質(zhì)芯片相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)(1)本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)芯片是一種前體蛋白質(zhì)芯片，在保持了現(xiàn)有的蛋白質(zhì)芯片的高密度、高效率的特點(diǎn)，其蛋白質(zhì)點(diǎn)陣密度可達(dá)1000-100000個(gè)蛋白質(zhì)、抗體或人工短肽點(diǎn)每10平方厘米。本發(fā)明只需將編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)或短肽的編碼序列制成前體芯片，然后實(shí)現(xiàn)原位蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄、合成，完全省略了傳統(tǒng)方法的克隆基因活體細(xì)胞表達(dá)合成蛋白質(zhì)和用芯片制備儀來制備蛋白質(zhì)芯片的四大步驟的全新的一步到位制備方法。該方法有效地解決了蛋白質(zhì)不易保存和隨時(shí)間降解的問題。使用者可根據(jù)需要隨時(shí)由前體蛋白質(zhì)芯片轉(zhuǎn)化為新鮮的蛋白質(zhì)芯片，最大程度地避免了蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的問題，該前體芯片可于室溫下保存(～5年)和運(yùn)輸，大大促進(jìn)了蛋白質(zhì)芯片的實(shí)用化和商品化。
(2)本發(fā)明提供的由基片層、特異親合層和編碼基因片段層構(gòu)成的蛋白質(zhì)芯片，節(jié)省了大量消耗在克隆真核生物基因外顯子的人力、物力、費(fèi)用和時(shí)間，而且節(jié)省了保存這些克隆的大量空間，也省略了用活體細(xì)胞表達(dá)蛋白質(zhì)和繁復(fù)的蛋白質(zhì)提純步驟，有效避免了由于保存多套克隆帶來的交叉污染的可能，并解決了由于細(xì)胞株的生長(zhǎng)差異而造成的蛋白質(zhì)產(chǎn)量不均一的情況，進(jìn)而消除了由此導(dǎo)致的固定在芯片表面上的蛋白質(zhì)量的巨大差異，從而大大降低了因固定在芯片表面蛋白質(zhì)數(shù)量和質(zhì)量上的差異而造成的實(shí)驗(yàn)誤差。
(3)本發(fā)明的蛋白質(zhì)芯片采用了具高度特異性的親合層，可使編碼基因產(chǎn)物以完全一致的空間取向通過特異親合標(biāo)記固定于芯片表面，從而最大限度地保持了生物分子的自然構(gòu)相。固定于表面的模板可用于合成蛋白質(zhì)、短肽、抗體變異區(qū)等生物分子，本發(fā)明極大地提高了蛋白質(zhì)芯片在實(shí)際應(yīng)用上的靈活性。
(4)本發(fā)明進(jìn)一步拓展了蛋白質(zhì)芯片與各種下游實(shí)驗(yàn)的結(jié)合配套，如在表面金屬覆蓋的蛋白質(zhì)芯片上可以用表面等離子體共振(SPR)的檢測(cè)手段研究蛋白質(zhì)與其它分子間的結(jié)合和解離常數(shù)，從而解決了以往無法大規(guī)模同步測(cè)定蛋白質(zhì)與其它分子間的結(jié)合和解離常數(shù)的難題；該蛋白質(zhì)芯片可以結(jié)合質(zhì)譜的檢測(cè)手段研究何種分子與蛋白質(zhì)芯片上的蛋白質(zhì)結(jié)合，從而大大縮短了檢測(cè)周期，提高了檢測(cè)效率。
(5)本發(fā)明還拓展了蛋白質(zhì)芯片在藥物篩選、藥效測(cè)定、藥物目標(biāo)蛋白的確定、藥物副作用的測(cè)定等領(lǐng)域中的應(yīng)用，為實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)臨床監(jiān)測(cè)、新藥發(fā)現(xiàn)和普及蛋白質(zhì)組的基礎(chǔ)研究打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。


圖1A為平滑基片蛋白質(zhì)芯片的構(gòu)造截面1B為微孔基片蛋白質(zhì)芯片的構(gòu)造截面1C為島狀突起基片蛋白質(zhì)芯片的構(gòu)造截面1D為毛細(xì)微孔基片蛋白質(zhì)芯片的構(gòu)造截面圖其中，1為基片2為親合層3為生物大分子層I表示放大圖2為實(shí)施例1中基片表面的處理其中1為基片 2為金屬鍍膜3為親合層S1為鍍膜步驟S2為結(jié)合親和層步驟圖3為一步到位法制備蛋白質(zhì)芯片其中1為基片2為金屬鍍膜 3為親合層4為親和分子5為蛋白質(zhì)6為親和標(biāo)記具體實(shí)施方式
實(shí)施例1在高密度島狀突起玻璃基片上制備蛋白質(zhì)芯片步驟一基片表面的處理和活化(參見圖2所示)
1)用純水將高密度島狀突起石墨基片沖洗三次，再用100％乙醇將載玻片沖洗三次。
2)于真空蒸發(fā)臺(tái)內(nèi)將待鍍的石墨基片置于樣品臺(tái)上，把待鍍金屬置于蒸發(fā)舟內(nèi)，在金的熔點(diǎn)下于10-2Pa將金鍍于石墨基片的表面。
3)鍍好的石墨基片置于含有10-巰基癸烷-NTA(Ca2+)的溶液中，在室溫反應(yīng)三小時(shí)以上，得到連接有親和層的基片。
4)再用磷酸鹽緩沖液(PBS)在搖床上清洗上述3)得到的基片三次。
5)用70％乙醇清洗五次，再用95％乙醇清洗三次，最后用100％乙醇清洗三次。制好的連接有親和層的基片于干燥無灰塵條件下保存。
步驟二制備島狀突起前體蛋白質(zhì)芯片(參見圖3所示)1)儲(chǔ)存于-80℃冰箱內(nèi)擴(kuò)增基因產(chǎn)物于室溫融化，并于3000rpm離心5分鐘。
2)將步驟一中制備的連接有親和層的島狀突起基片排列在芯片合成儀的工作平臺(tái)上，將盛有基因產(chǎn)物的384孔板(見實(shí)施例4)置于機(jī)器內(nèi)部的原料平臺(tái)上。
3)在芯片合成儀的控制計(jì)算機(jī)上輸入制備一步到位前體蛋白質(zhì)芯片各種參數(shù)，并啟動(dòng)程序。
4)取下芯片合成儀完成印制前體蛋白質(zhì)芯片，于干燥無灰塵條件下保存芯片。
步驟三從島狀突起前體蛋白質(zhì)芯片制備島狀突起蛋白質(zhì)芯片1)80∶2∶1的比例將體外轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)、100mM乙酸鎂和1mM蛋氨酸混合。
2)用芯片合成儀將上一步制成的混合物點(diǎn)在步驟二制備的前體芯片上的島狀突起上(大約0.3納升)；或者，將該前體芯片表面置于步驟三1)制成的混合物中，然后用震蕩或超聲波清洗儀除去氣泡。
3)將第二步加好混合物的前體芯片置于保濕的密閉容器內(nèi)，于30℃在搖床上培養(yǎng)1到3小時(shí)，從而制得島狀突起蛋白質(zhì)芯片。
4)最后用磷酸鹽緩沖液(PBS)在搖床上清洗島狀突起蛋白質(zhì)芯片共三到五次。制得的島狀突起蛋白質(zhì)芯片可立即使用，也可儲(chǔ)存于4℃冰箱中待用如步驟三所述，在具有親合性的單分子膜的芯片表面可一步完成從前體蛋白質(zhì)芯片到蛋白質(zhì)芯片的三步反應(yīng)，即從DNA模板到mRNA的基因轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，從mRNA模板到蛋白質(zhì)的基因翻譯反應(yīng)，從合成的處于游離狀態(tài)的蛋白質(zhì)通過其上連接的親和標(biāo)記特異結(jié)合親和層上的親和小分子而固定到芯片表面的過程。整個(gè)反應(yīng)可在30℃保濕的條件下溫育幾小時(shí)，最后經(jīng)洗滌完成蛋白質(zhì)芯片的制備。
實(shí)施例2在高密度微孔基片上制備蛋白質(zhì)芯片步驟一芯片表面的處理和活化1)用水將高密度微孔玻璃基片(腔體是直徑為7微米的圓孔)沖洗三次，再用100％乙醇將載玻片沖洗三次。
2)將玻璃基片置于0.2M的NaOH溶液中浸泡過夜，然后用高純水清洗3遍，再用無水乙醇沖洗一遍。
3)將清洗后的玻璃基片置于含有(CH3O)3-Si-(CH2)20-生物素的溶液中，在室溫反應(yīng)三小時(shí)以上，得到連接有親和層的基片。
4)再用磷酸鹽緩沖液(PBS)在搖床上清洗上述3)得到的基片三到五次。
5)用70％乙醇清洗五次，再用95％乙醇清洗三次，最后用100％乙醇清洗三次。制好的連接有親和層的基片于干燥無灰塵條件下保存。
步驟二制備高密度微孔前體蛋白質(zhì)芯片與實(shí)施例1中步驟二完全相同。
步驟三從高密度微孔前體蛋白質(zhì)芯片制備高密度微孔蛋白質(zhì)芯片1)20∶8∶1的比例將體外轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)、100mM乙酸鎂和1mM蛋氨酸混合。
2)用芯片合成儀將第一步制成的混合物分裝于實(shí)施例5中的高密度微孔前體芯片上的微孔內(nèi)(大約每孔0.3納升)；或者，將高密度微孔前體芯片表面置于第一步制成的混合物中，然后用震蕩或超聲波清洗儀除去微孔中的氣泡。
3)將第二步加好混合物的前體芯片置于保濕的密閉容器內(nèi)，于30攝氏度在搖床上培養(yǎng)1到3小時(shí)，從而高密度微孔突起蛋白質(zhì)芯片。
4)最后用磷酸鹽緩沖液(PBS)在搖床上清洗島狀突起蛋白質(zhì)芯片三到五次。制得的高密度微孔蛋白質(zhì)芯片可立即使用，也可儲(chǔ)存于4℃冰箱中待用。
實(shí)施例3在平滑基片上制備蛋白質(zhì)芯片步驟一芯片表面的處理和活化1)用水將平滑形石英基片沖洗三次，再用100％乙醇將載玻片沖洗三次。
2)石英基片置于0.2M的HCl溶液中浸泡過夜，然后用高純水清洗3遍，再用無水乙醇沖洗一遍。
3)將清洗后的石英基片置于含有(CH3O)-Si-(CH2)22-谷胱甘肽的溶液中，在室溫反應(yīng)三小時(shí)以上，得到連接有親和層的基片。
4)再用磷酸鹽緩沖液(PBS)在搖床上清洗上述3)的基片共三到五次。
5)用70％乙醇清洗五次，再用95％乙醇清洗三次，最后用100％乙醇清洗三次。制好的連接有親和層的基片于干燥無灰塵條件下保存。
步驟二制備高密度平滑前體蛋白質(zhì)芯片與實(shí)施例1中步驟二完全相同。
步驟三從高密度平滑前體蛋白質(zhì)芯片制備高密度平滑蛋白質(zhì)芯片1)80∶5∶1的比例將體外轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)、100mM乙酸鎂和1mM蛋氨酸混合。
2)將高密度平滑前體芯片表面置于第一步制成的混合物中，覆蓋玻片，然后用震蕩或超聲波清洗儀除去氣泡。
3)將第二步加好混合物的前體芯片置于保濕的密閉容器內(nèi)，于30攝氏度在搖床上培養(yǎng)1到3小時(shí)，從而高密度微孔突起蛋白質(zhì)芯片。
4)最后用磷酸鹽緩沖液(PBS)在搖床上清洗島狀突起蛋白質(zhì)芯片三到五次。制得的高密度微孔蛋白質(zhì)芯片可立即使用，也可儲(chǔ)存于4℃冰箱中待用。
實(shí)施例4在毛細(xì)微孔基片上制備蛋白質(zhì)芯片步驟一芯片表面的處理和活化1)用水將毛細(xì)微孔形的二甲基硅烷基片(腔體是直徑為2納米的圓孔)沖洗三次，再用100％乙醇將載玻片沖洗三次。
2)在真空蒸發(fā)臺(tái)內(nèi)將待鍍的二甲基硅烷基片置于樣品臺(tái)上，把待鍍金屬銅置于蒸發(fā)舟內(nèi)，在銅的熔點(diǎn)下于10-2Pa將銅鍍于石墨基片的表面。
3)鍍好銅的二甲基硅烷基片置于含有HS-(CH2)22-抗生物素蛋白的溶液中，在室溫反應(yīng)三小時(shí)以上，得到連接有親和層的基片。
4)再用磷酸鹽緩沖液(PBS)在搖床上基片三到五次。
5)用70％乙醇清洗五次，再用95％乙醇清洗三次，最后用100％乙醇清洗三次。制好的連接有親和層的基片于干燥無灰塵條件下保存。
步驟二制備高密度平滑前體蛋白質(zhì)芯片與實(shí)施例1中步驟二完全相同。
步驟三從高密度平滑前體蛋白質(zhì)芯片制備高密度平滑蛋白質(zhì)芯片1)100∶10∶1的比例將體外轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)、100mM乙酸鎂和1mM蛋氨酸混合。
2)高密度平滑前體芯片表面置于第一步制成的混合物中，覆蓋玻片，然后用震蕩或超聲波清洗儀除去氣泡。
3)將第二步加好混合物的前體芯片置于保濕的密閉容器內(nèi)，于30攝氏度在搖床上培養(yǎng)1到3小時(shí)，從而高密度微孔突起蛋白質(zhì)芯片。
4)最后用磷酸鹽緩沖液(PBS)在搖床上清洗島狀突起蛋白質(zhì)芯片三到五次。制得的高密度微孔蛋白質(zhì)芯片可立即使用，也可儲(chǔ)存于4℃冰箱中待用。
實(shí)施例5基因模板的制備1)取10克活體組織用液氮研碎，迅速加入20毫升RNA抽提液，于冰上保溫30分鐘。
2)按Promega公司的mRNA抽提試劑盒的說明操作，可得到大約5微克mRNA。
3)將上述所得mRNA稀釋至2納克/微升，再取1微升作為RT-PCR反應(yīng)模板，加入預(yù)先混好的45微升RT-PCR反應(yīng)混合物中，再加入4ul基因特異引物，置于PCR反應(yīng)儀中進(jìn)行反應(yīng)。
4)取5微升體積反應(yīng)產(chǎn)物用作凝膠檢測(cè)，剩余DNA可用標(biāo)準(zhǔn)的PEG沉淀法或硫酸銨沉淀法除去未反應(yīng)的引物，并根據(jù)凝膠檢測(cè)結(jié)果將擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物以0.1微克/微升重新溶于3xSSC緩沖液中。
5)將PCR產(chǎn)物分裝于384孔板中，并儲(chǔ)存于-80℃冰箱內(nèi)待用。
實(shí)施例6蛋白質(zhì)芯片用于藥物靶蛋白的發(fā)現(xiàn)1)將新鮮制備的蛋白質(zhì)芯片用大體積清洗緩沖液在搖床上清洗共三到五次，待用。
2)將帶有生物素標(biāo)記的人工合成的化合物納巴霉素(Rapamycin)用磷酸鹽緩沖液稀釋，取120微升化合物稀釋液加于蛋白質(zhì)芯片表面，然后用蓋玻片覆蓋，盡量避免氣泡。
3)蛋白質(zhì)芯片置于保濕的環(huán)境中于室溫下溫育一小時(shí)。
4)將整個(gè)蓋玻片覆蓋的蛋白質(zhì)芯片沒于大體積清洗緩沖液中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。
5)取200微升稀釋好的由Cy-3熒光標(biāo)記的鏈霉抗生物素(Streptavidin)溶液加到蛋白質(zhì)芯片表面，然后用蓋玻片覆蓋，盡量避免氣泡。
6)蛋白質(zhì)芯片置于保濕的環(huán)境中于室溫下溫育一小時(shí)。
7)將整個(gè)蓋玻片覆蓋的蛋白質(zhì)芯片沒于大體積清洗緩沖液中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。將整個(gè)蛋白質(zhì)芯片沒于大體積超純水中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。
8)蛋白質(zhì)芯片用離心機(jī)在3000轉(zhuǎn)的速度下離心5分鐘干燥。
9)用激光芯片掃描儀掃描蛋白質(zhì)芯片以獲取數(shù)據(jù)，能與藥物小分子結(jié)合的蛋白質(zhì)可在掃描圖上顯示熒光亮點(diǎn)。這些蛋白質(zhì)的名稱可于數(shù)據(jù)庫(kù)中查得，例如，發(fā)現(xiàn)了與啤酒酵母中蛋白質(zhì)Frp1具有高度同源性的人類的未知功能的蛋白質(zhì)。
實(shí)施例7蛋白質(zhì)芯片用于新藥發(fā)現(xiàn)1)新鮮制備的蛋白質(zhì)芯片用大體積清洗緩沖液在搖床上清洗共三到五次，待用。
2)將帶有生物素標(biāo)記的人工合成的化合物文庫(kù)用磷酸鹽緩沖液稀釋，取120微升化合物稀釋液加于蛋白質(zhì)芯片表面，然后用蓋玻片覆蓋，盡量避免氣泡。蛋白質(zhì)芯片置于保濕的環(huán)境中于室溫下溫育一小時(shí)。
3)將整個(gè)蓋玻片覆蓋的蛋白質(zhì)芯片沒于大體積清洗緩沖液中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。
4)取200微升稀釋好的由Cy-3熒光標(biāo)記的Streptavidin溶液加到蛋白質(zhì)芯片表面，然后用蓋玻片覆蓋，盡量避免氣泡。
5)蛋白質(zhì)芯片置于保濕的環(huán)境中于室溫下溫育一小時(shí)。
6)將整個(gè)蓋玻片覆蓋的蛋白質(zhì)芯片沒于大體積清洗緩沖液中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。將整個(gè)蛋白質(zhì)芯片沒于大體積超純水中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。
7)蛋白質(zhì)芯片用離心機(jī)在3000轉(zhuǎn)的速度下離心5分鐘干燥。用激光芯片掃描儀掃描蛋白質(zhì)芯片以確定哪些蛋白質(zhì)可與藥物分子結(jié)合。
8)從新選用步驟7中的可與藥物分子結(jié)合的蛋白質(zhì)制備微孔蛋白質(zhì)芯片，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)步驟，然后將反應(yīng)后的芯片置于高效質(zhì)譜儀中逐一鑒定與蛋白質(zhì)結(jié)合的藥物分子的結(jié)構(gòu)，達(dá)到新藥發(fā)現(xiàn)的目的。
實(shí)施例8蛋白質(zhì)芯片用于確認(rèn)藥物的副作用1)新鮮制備的蛋白質(zhì)芯片用大體積清洗緩沖液在搖床上清洗共三到五次，待用。
2)將帶有熒光標(biāo)記的藥物小分子用磷酸鹽緩沖液稀釋，取120微升稀釋液加到蛋白質(zhì)芯片表面，然后用蓋玻片覆蓋，盡量避免氣泡。
3)蛋白質(zhì)芯片置于保濕的環(huán)境中于室溫下溫育一小時(shí)。
4)將整個(gè)蓋玻片覆蓋的蛋白質(zhì)芯片沒于大體積清洗緩沖液中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。
5)將整個(gè)蓋玻片覆蓋的蛋白質(zhì)芯片沒于大體積清洗緩沖液中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。將整個(gè)蛋白質(zhì)芯片沒于大體積超純水中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。
6)蛋白質(zhì)芯片用離心機(jī)在3000轉(zhuǎn)的速度下離心5分鐘干燥。
7)用激光芯片掃描儀掃描蛋白質(zhì)芯片以獲取數(shù)據(jù)，能與藥物小分子結(jié)合的蛋白質(zhì)可在掃描圖上顯示熒光亮點(diǎn)。這些蛋白質(zhì)的身份可于數(shù)據(jù)庫(kù)中查得。
8)通過分析數(shù)據(jù)，立刻可以確認(rèn)除了預(yù)期與該藥物結(jié)合的蛋白質(zhì)外，還有其它哪些蛋白質(zhì)可以與該藥物結(jié)合，這些附加蛋白質(zhì)即構(gòu)成該藥物的副作用譜。通過分析這些附加蛋白質(zhì)的功能，可更加深入地了解該藥物的副作用的機(jī)理。
實(shí)施例9蛋白質(zhì)芯片用于識(shí)別新的生物標(biāo)記
1)新鮮制備的蛋白質(zhì)芯片用大體積清洗緩沖液在搖床上清洗共三到五次，待用。
2)分別用Cy-3熒光標(biāo)記和Cy-5熒光標(biāo)記分別標(biāo)記從癌組織和正常組織提取的蛋白質(zhì)，在除去多余的熒光標(biāo)記后，混合并用磷酸鹽緩沖液稀釋蛋白質(zhì)混合物，取120微升混合物稀釋液加到蛋白質(zhì)芯片表面，然后用蓋玻片覆蓋，盡量避免氣泡。
3)蛋白質(zhì)芯片置于保濕的環(huán)境中于室溫下溫育一小時(shí)。
4)將整個(gè)蓋玻片覆蓋的蛋白質(zhì)芯片沒于大體積清洗緩沖液中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。將整個(gè)蛋白質(zhì)芯片沒于大體積超純水中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。
5)蛋白質(zhì)芯片用離心機(jī)在3000轉(zhuǎn)的速度下離心5分鐘干燥。
6)用激光芯片掃描儀在兩個(gè)頻率下掃描蛋白質(zhì)芯片以獲取數(shù)據(jù)，能與癌組織中的蛋白質(zhì)結(jié)合的芯片上的蛋白質(zhì)可在掃描圖上顯示綠色熒光亮點(diǎn)；能與正常組織中的蛋白質(zhì)結(jié)合的芯片上的蛋白質(zhì)可在掃描圖上顯示紅色熒光亮點(diǎn)。這些蛋白質(zhì)的身份可于數(shù)據(jù)庫(kù)中查得。
7)通過比較芯片上各個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)所顯示的紅綠色的比率，可確定能特異識(shí)別癌組織中超常表達(dá)的蛋白質(zhì)或其它生物大分子的蛋白，這些蛋白質(zhì)即可作為早期癌癥臨床診斷的生物標(biāo)記。
實(shí)施例10蛋白質(zhì)芯片用于傳染病的臨床診斷(以肝炎檢測(cè)為例)1)新鮮制備的蛋白質(zhì)芯片用大體積清洗緩沖液在搖床上清洗共三到五次，待用。該蛋白質(zhì)芯片上載有可以識(shí)別甲、乙、丙、丁、戊肝炎抗原的12種抗體。每個(gè)蛋白質(zhì)芯片分為30個(gè)區(qū)，可同時(shí)測(cè)試20個(gè)病人和陰性、陽性對(duì)照。
2)取20個(gè)病人和一個(gè)健康人的血樣各0.5ml，于3000轉(zhuǎn)離心5分鐘，取出血清500vl，并用磷酸鹽緩沖液稀。取120微升混合物稀釋液分別加到蛋白質(zhì)芯片表面的各個(gè)區(qū)域內(nèi)，然后用蓋玻片覆蓋，盡量避免氣泡。
3)蛋白質(zhì)芯片置于保濕的環(huán)境中于室溫下溫育一小時(shí)。
4)將整個(gè)蓋玻片覆蓋的蛋白質(zhì)芯片沒于大體積清洗緩沖液中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。將整個(gè)蛋白質(zhì)芯片沒于大體積超純水中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。
5)蛋白質(zhì)芯片用離心機(jī)在3000轉(zhuǎn)的速度下離心5分鐘干燥。將芯片沒入磷酸鹽緩沖液稀釋好的帶有Cy3熒光標(biāo)記的抗人IgG的山羊抗體的緩沖液中，室溫溫育一小時(shí)。
6)將整個(gè)蓋玻片覆蓋的蛋白質(zhì)芯片沒于大體積清洗緩沖液中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。將整個(gè)蛋白質(zhì)芯片沒于大體積超純水中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。
7)蛋白質(zhì)芯片用離心機(jī)在3000轉(zhuǎn)的速度下離心5分鐘干燥。
8)用激光芯片掃描儀掃描蛋白質(zhì)芯片以獲取數(shù)據(jù)，通過鑒定病人血清在蛋白質(zhì)芯片上呈現(xiàn)的陽性類別，可確定病人感染的肝炎病毒的類型，從而達(dá)到診斷的目的。
實(shí)施例11蛋白質(zhì)芯片用于確認(rèn)過敏病人血清中與過敏相關(guān)的抗體1)鮮制備的蛋白質(zhì)芯片用大體積清洗緩沖液在搖床上清洗共三到五次，待用。該蛋白質(zhì)芯片上載有30種已知的過敏原(allergen)。每個(gè)蛋白質(zhì)芯片分為30個(gè)區(qū)，可同時(shí)測(cè)試20個(gè)病人和陰性、陽性對(duì)照。
2)取20個(gè)病人和一個(gè)健康人的血樣各0.5ml，于3000轉(zhuǎn)離心5分鐘，取出血清500vl，并用磷酸鹽緩沖液稀。取120微升混合物稀釋液分別加到蛋白質(zhì)芯片表面的各個(gè)區(qū)域內(nèi)，然后用蓋玻片覆蓋，盡量避免氣泡。
3)蛋白質(zhì)芯片置于保濕的環(huán)境中于室溫下溫育一小時(shí)。
4)將整個(gè)蓋玻片覆蓋的蛋白質(zhì)芯片沒于大體積清洗緩沖液中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。將整個(gè)蛋白質(zhì)芯片沒于大體積超純水中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。
5)蛋白質(zhì)芯片用離心機(jī)在3000轉(zhuǎn)的速度下離心5分鐘干燥。將芯片沒入磷酸鹽緩沖液稀釋好的帶有Cy3熒光標(biāo)記的抗人IgE的山羊抗體的緩沖液中，室溫溫育一小時(shí)。
6)將整個(gè)蓋玻片覆蓋的蛋白質(zhì)芯片沒于大體積清洗緩沖液中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。將整個(gè)蛋白質(zhì)芯片沒于大體積超純水中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。
7)蛋白質(zhì)芯片用離心機(jī)在3000轉(zhuǎn)的速度下離心5分鐘干燥。
8)用激光芯片掃描儀掃描蛋白質(zhì)芯片以獲取數(shù)據(jù)，通過鑒定病人血清在蛋白質(zhì)芯片上呈現(xiàn)的陽性類別，可確定導(dǎo)致病人產(chǎn)生過敏的類型，從而達(dá)到診斷的目的。
實(shí)施例12蛋白質(zhì)芯片用于確認(rèn)酶的底物(以磷酸激酶為例)1)制備的蛋白質(zhì)芯片用大體積清洗緩沖液在搖床上清洗共三到五次，待用。該蛋白質(zhì)芯片上載有1000種人類的蛋白質(zhì)。
2)取純化的人的磷酸激酶(CD2)蛋白用磷酸鹽緩沖液稀至1納克/微升。取120微升混合物稀釋液加到蛋白質(zhì)芯片表面，然后用蓋玻片覆蓋，盡量避免氣泡。
3)蛋白質(zhì)芯片置于保濕的環(huán)境中于30度下溫育半小時(shí)。
4)將整個(gè)蓋玻片覆蓋的蛋白質(zhì)芯片沒于大體積清洗緩沖液中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。將整個(gè)蛋白質(zhì)芯片沒于大體積超純水中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。
5)蛋白質(zhì)芯片用離心機(jī)在3000轉(zhuǎn)的速度下離心5分鐘干燥。將芯片沒入磷酸鹽緩沖液稀釋好的帶有Cy3熒光標(biāo)記的抗磷酸化酪氨酸的山羊抗體的緩沖液中，室溫溫育一小時(shí)。
6)將整個(gè)蓋玻片覆蓋的蛋白質(zhì)芯片沒于大體積清洗緩沖液中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。將整個(gè)蛋白質(zhì)芯片沒于大體積超純水中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。
7)蛋白質(zhì)芯片用離心機(jī)在3000轉(zhuǎn)的速度下離心5分鐘干燥。
8)用激光芯片掃描儀掃描蛋白質(zhì)芯片以獲取數(shù)據(jù)，芯片上那些呈陽性的蛋白質(zhì)即該磷酸激酶(CD2)的底物。
實(shí)施例13蛋白質(zhì)芯片用于篩選特異性抗體(以白介素-1為例)1)選擇噬菌體呈現(xiàn)載體克隆人工重組片段，以獲得108的噬菌體呈現(xiàn)載體文庫(kù)。將文庫(kù)分成均一的104份，然后用PCR擴(kuò)增DNA模板，最后用點(diǎn)樣儀制備前體蛋白質(zhì)芯片。
2)采用實(shí)施例2闡述的方法制備蛋白質(zhì)芯片。
3)新鮮制備的蛋白質(zhì)芯片用大體積清洗緩沖液在搖床上清洗共三到五次，待用。
4)用生物素標(biāo)記試劑盒標(biāo)記白介素-1，在除去未反應(yīng)的生物素之后，用磷酸鹽緩沖液稀釋標(biāo)記好的蛋白。
5)取120微升標(biāo)記好的蛋白加到蛋白質(zhì)芯片表面，然后用蓋玻片覆蓋，盡量避免氣泡。
6)蛋白質(zhì)芯片置于保濕的環(huán)境中于室溫下溫育一小時(shí)。
7)將整個(gè)蓋玻片覆蓋的蛋白質(zhì)芯片沒于大體積清洗緩沖液中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。
8)蛋白質(zhì)芯片用離心機(jī)在3000轉(zhuǎn)的速度下離心5分鐘干燥。用激光芯片掃描儀掃描蛋白質(zhì)芯片以獲取數(shù)據(jù)，能與標(biāo)記蛋白結(jié)合的人工抗體群可在掃描圖上顯示熒光亮點(diǎn)。
9)重復(fù)步驟1至步驟8，可進(jìn)一步確定特異的抗白介素-1人工抗體。
實(shí)施例14蛋白質(zhì)芯片用于研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用10)新鮮制備的蛋白質(zhì)芯片用大體積清洗緩沖液在搖床上清洗共三到五次，待用。
11)用生物素標(biāo)記試劑盒標(biāo)記待研究的蛋白質(zhì)，在除去未反應(yīng)的生物素之后，用磷酸鹽緩沖液稀釋標(biāo)記好的蛋白。
12)取120微升標(biāo)記好的蛋白加到蛋白質(zhì)芯片表面，然后用蓋玻片覆蓋，盡量避免氣泡。
13)蛋白質(zhì)芯片置于保濕的環(huán)境中于室溫下溫育一小時(shí)。
14)將整個(gè)蓋玻片覆蓋的蛋白質(zhì)芯片沒于大體積清洗緩沖液中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。
15)取200微升稀釋好的由Cy-3熒光標(biāo)記的Streptavidin溶液加到蛋白質(zhì)芯片表面，然后用蓋玻片覆蓋，盡量避免氣泡。
16)蛋白質(zhì)芯片置于保濕的環(huán)境中于室溫下溫育一小時(shí)。
17)將整個(gè)蓋玻片覆蓋的蛋白質(zhì)芯片沒于大體積清洗緩沖液中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。將整個(gè)蛋白質(zhì)芯片沒于大體積超純水中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。
18)蛋白質(zhì)芯片用離心機(jī)在3000轉(zhuǎn)的速度下離心5分鐘干燥。用激光芯片掃描儀掃描蛋白質(zhì)芯片以獲取數(shù)據(jù)，能與標(biāo)記蛋白結(jié)合的蛋白質(zhì)可在掃描圖上顯示熒光亮點(diǎn)。這些蛋白質(zhì)的名稱可于數(shù)據(jù)庫(kù)中查得。
實(shí)施例15蛋白質(zhì)芯片用于研究蛋白質(zhì)-DNA間的相互作用1)鮮制備的蛋白質(zhì)芯片用大體積清洗緩沖液在搖床上清洗共三到五次，待用。
2)用生物素標(biāo)記試劑盒標(biāo)記待研究的DNA分子，在除去未反應(yīng)的生物素之后，用磷酸鹽緩沖液稀釋標(biāo)記好的DNA。
3)取120微升標(biāo)記好的DNA加到蛋白質(zhì)芯片表面，然后用蓋玻片覆蓋，盡量避免氣泡。
4)蛋白質(zhì)芯片置于保濕的環(huán)境中于室溫下溫育一小時(shí)。
5)將整個(gè)蓋玻片覆蓋的蛋白質(zhì)芯片沒于大體積清洗緩沖液中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。
6)取200微升稀釋好的由Cy-3熒光標(biāo)記的Streptavidin溶液加到蛋白質(zhì)芯片表面，然后用蓋玻片覆蓋，盡量避免氣泡。
7)蛋白質(zhì)芯片置于保濕的環(huán)境中于室溫下溫育一小時(shí)。
8)將整個(gè)蓋玻片覆蓋的蛋白質(zhì)芯片沒于大體積清洗緩沖液中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。將整個(gè)蛋白質(zhì)芯片沒于大體積超純水中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。
9)蛋白質(zhì)芯片用離心機(jī)在3000轉(zhuǎn)的速度下離心5分鐘干燥。用激光芯片掃描儀掃描蛋白質(zhì)芯片以獲取數(shù)據(jù)，能與標(biāo)記DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)可在掃描圖上顯示熒光亮點(diǎn)。這些蛋白質(zhì)的名稱可于數(shù)據(jù)庫(kù)中查得。
實(shí)施例16蛋白質(zhì)芯片用于研究蛋白質(zhì)-生物大分子間的相互作用的結(jié)合和解離常數(shù)1)鮮制備的蛋白質(zhì)芯片用大體積清洗緩沖液在搖床上清洗共三到五次，待用。
2)蛋白質(zhì)芯片置于SPR儀中，取120微升螢光標(biāo)記好的生物大分子加到蛋白質(zhì)芯片表面，同時(shí)用SPR儀觀測(cè)生物大分子與芯片上固定的蛋白質(zhì)之間的結(jié)合曲線。
3)待反應(yīng)完成后，用含去污劑的清洗緩沖液洗脫結(jié)合在芯片上蛋白質(zhì)的生物大分子，同時(shí)用SPR儀觀測(cè)生物大分子與芯片上固定的蛋白質(zhì)之間的解離曲線。
4)通過數(shù)據(jù)分析，可大規(guī)模、高效測(cè)定各個(gè)生物大分子與芯片上固定的蛋白質(zhì)之間的結(jié)合和解離常數(shù)。
實(shí)施例17蛋白質(zhì)芯片用于研究蛋白質(zhì)-脂類分子間的相互作用1)鮮制備的蛋白質(zhì)芯片用大體積清洗緩沖液在搖床上清洗共三到五次，待用。
2)取120微升熒光標(biāo)記好的脂類分子加到蛋白質(zhì)芯片表面，然后用蓋玻片覆蓋，盡量避免氣泡。
3)蛋白質(zhì)芯片置于保濕的環(huán)境中于室溫下溫育一小時(shí)。
4)將整個(gè)蓋玻片覆蓋的蛋白質(zhì)芯片沒于大體積清洗緩沖液中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。
5)蛋白質(zhì)芯片用離心機(jī)在3000轉(zhuǎn)的速度下離心5分鐘干燥。用激光芯片掃描儀掃描蛋白質(zhì)芯片以獲取數(shù)據(jù)，能與標(biāo)記多糖結(jié)合的蛋白質(zhì)可在掃描圖上顯示熒光亮點(diǎn)。這些蛋白質(zhì)的名稱可于數(shù)據(jù)庫(kù)中查得。
實(shí)施例18蛋白質(zhì)芯片用于研究蛋白質(zhì)-多糖間的相互作用1)制備的蛋白質(zhì)芯片用大體積清洗緩沖液在搖床上清洗共三到五次，待用。
2)生物素標(biāo)記試劑盒標(biāo)記待研究的多糖，在除去未反應(yīng)的生物素之后，用磷酸鹽緩沖液稀釋標(biāo)記好的蛋白。
3)取120微升標(biāo)記好的多糖加到蛋白質(zhì)芯片表面，然后用蓋玻片覆蓋，盡量避免氣泡。
4)蛋白質(zhì)芯片置于保濕的環(huán)境中于室溫下溫育一小時(shí)。
5)將整個(gè)蓋玻片覆蓋的蛋白質(zhì)芯片沒于大體積清洗緩沖液中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。
6)取200微升稀釋好的由Cy-3熒光標(biāo)記的Streptavidin溶液加到蛋白質(zhì)芯片表面，然后用蓋玻片覆蓋，盡量避免氣泡。
7)蛋白質(zhì)芯片置于保濕的環(huán)境中于室溫下溫育一小時(shí)。
8)將整個(gè)蓋玻片覆蓋的蛋白質(zhì)芯片沒于大體積清洗緩沖液中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。將整個(gè)蛋白質(zhì)芯片沒于大體積超純水中，在搖床上清洗三次，每次15分鐘。
蛋白質(zhì)芯片用離心機(jī)在3000轉(zhuǎn)的速度下離心5分鐘干燥。用激光芯片掃描儀掃描蛋白質(zhì)芯片以獲取數(shù)據(jù)，能與標(biāo)記多糖結(jié)合的蛋白質(zhì)可在掃描圖上顯示熒光亮點(diǎn)。這些蛋白質(zhì)的名稱可于數(shù)據(jù)庫(kù)中查得。
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)芯片，包括基片，基片上的親和層，以及親和層上的生物大分子層，其特征在于所述的生物大分子層為編碼基因片段，或編碼基因片段的產(chǎn)物膜層。
2.按權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)芯片，其特征在于所述的基片包括玻璃、石英或表面鍍膜的固體復(fù)合材料。
3.按權(quán)利要求2所述的蛋白質(zhì)芯片，其特征在于所述的表面鍍膜的固體復(fù)合材料包括鍍金屬膜的陶瓷、塑料、石墨或聚合硅烷。
4.按權(quán)利要求1或2或3所述的蛋白質(zhì)芯片，其特征在于所述的基片是平滑形、具有毛細(xì)微孔形或島狀突起形。
5.按權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)芯片，其特征在于所述的親和層是結(jié)合生物素、抗生物素蛋白、抗體變異區(qū)、聚丙烯酰胺膠、瓊脂糖凝膠或螯合劑作為親和分子的單分子膜層。
6.一種權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)芯片的制備方法，包括如下步驟(1)基片表面的處理和活化清潔固體基片，并將基片表面進(jìn)行活化使其共價(jià)連接親和層的單分子膜；(2)生物大分子層的制備將基因擴(kuò)增產(chǎn)物加到上述步驟(1)得到的結(jié)合有親和層的基片上，制得生物大分子層為編碼基因片段的蛋白質(zhì)芯片。
7.按權(quán)利要求6所述的蛋白質(zhì)芯片的制備方法，其特征在于還包括步驟(3)基因擴(kuò)增產(chǎn)物的翻譯過程1)按體積比(20～200)∶(1～10)∶1將體外轉(zhuǎn)錄翻譯反應(yīng)液，100mM乙酸鎂和1mM蛋氨酸混合；2)將權(quán)利要求10制得的蛋白質(zhì)芯片浸沒于上述步驟1)制成的混合液中，30℃溫育1到3小時(shí)，實(shí)現(xiàn)從編碼基因片段到蛋白質(zhì)的生化反應(yīng)，并同時(shí)完成從游離蛋白質(zhì)到表面固定蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化；3)用緩沖液清洗步驟2)得到的蛋白質(zhì)芯片，制得的蛋白質(zhì)芯片即可使用或冷藏待用。
8.按權(quán)利要求6所述的蛋白質(zhì)芯片，其特征在于編碼基因片段的產(chǎn)物膜層為人工隨機(jī)片段、短肽、蛋白質(zhì)或抗體。
9.按權(quán)利要求6所述的蛋白質(zhì)芯片，其特征在于編碼基因片段是RNA或DNA。
10.按權(quán)利要求6所述的蛋白質(zhì)芯片的制備方法，其特征在于所述的步驟(1)中將基片進(jìn)行活化包括將玻璃或石英基片表面用酸或堿處理或鍍膜。
11.按權(quán)利要求7所述的蛋白質(zhì)制備方法，其特征在于所述的步驟2)中將蛋白質(zhì)芯片浸沒于步驟1)制成的混合液之后還包括用震蕩或超聲波清洗儀除去芯片表面的氣泡。
12.一種權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)芯片在篩選藥物靶蛋白、篩選新藥、蛋白質(zhì)組研究、分析藥物副作用和臨床診斷中的應(yīng)用。
13.按權(quán)利要求12所述的蛋白質(zhì)芯片在臨床診斷中的應(yīng)用包括為傳染病的臨床診斷、人心血管病、癌癥早期診斷或過敏病人血清中與過敏相關(guān)的抗體的確認(rèn)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)芯片及其制備方法和應(yīng)用。該發(fā)明包括以全新的概念制成可商品化的、高密度的、由基片層、特異親合層和生物大分子層構(gòu)成蛋白質(zhì)芯片，其蛋白質(zhì)點(diǎn)陣密度每10平方厘米內(nèi)可達(dá)1000－100000個(gè)蛋白質(zhì)、抗體或人工短肽點(diǎn)。該發(fā)明還涉及用芯片制備儀形成高密度可進(jìn)行原位基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的基因轉(zhuǎn)錄片段的前體蛋白質(zhì)芯片，然后用無細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)在前體蛋白質(zhì)芯片上一步制備高密度蛋白質(zhì)芯片的方法。該發(fā)明解決了現(xiàn)有蛋白質(zhì)芯片技術(shù)中費(fèi)用高昂、周期長(zhǎng)、步驟繁冗以及不易保存和運(yùn)輸?shù)碾y題，極大促進(jìn)了蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的實(shí)用化和商品化。該發(fā)明在臨床診斷、醫(yī)學(xué)研究、新藥開發(fā)和檢驗(yàn)、蛋白質(zhì)組研究等領(lǐng)域內(nèi)具有廣泛的用途。
文檔編號(hào)G01N33/50GK1512176SQ0215976
公開日2004年7月14日 申請(qǐng)日期2002年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月30日
發(fā)明者陳正豪, 朱衡 申請(qǐng)人:陳正豪