專利名稱：一種用激光分選提取液相細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生命科學(xué)領(lǐng)域，特別是一種用激光分選提取液相細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的技術(shù)。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有的細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)分離方法主要有三種流式細(xì)胞儀(FACS)、玻璃微針?lè)ê图す鈴椛浼夹g(shù)(LPC)。
流式細(xì)胞儀(FACS)分選效率高，廣泛用于大量細(xì)胞或細(xì)胞內(nèi)組分的分離與富集。但其樣品制備過(guò)程繁瑣，而且由于是在非目視狀態(tài)下分離，對(duì)分離對(duì)象有嚴(yán)格的要求。當(dāng)被分選的細(xì)胞器大小的區(qū)別不夠明顯時(shí)，通過(guò)流式細(xì)胞儀得到的樣品純凈度較差，仍然含有幾種不同染色體的混合物。
玻璃微針?lè)?981年Scanlenghe等最早采用玻璃微針挑出果蠅中期染色體鋪片中的單條染色體，目前已有應(yīng)用。但該方法操作難度大，對(duì)使用人員的實(shí)驗(yàn)技能要求很高，因此效率低，不易推廣。特別是這種方法只能用于對(duì)鋪片染色體的分離與挑選，生物樣品已失去活性。
激光彈射技術(shù)(LPC)類似于玻璃微針挑取法。先進(jìn)的激光彈射技術(shù)大大降低了對(duì)操作者實(shí)驗(yàn)技能的要求，但同樣只能在干的鋪片上操作，存在影響生物組織活性的問(wèn)題，而且要求專用樣品制備膜，價(jià)格昂貴，推廣應(yīng)用受到限制。
以上方法共同存在的缺點(diǎn)是，分選的樣品都是已經(jīng)從細(xì)胞中提取出來(lái)的細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)，細(xì)胞的活性已經(jīng)受到干擾或失去活性。
本發(fā)明的目的在于解決上述問(wèn)題，提出一種新的具有高選擇性，無(wú)損傷的液相中細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)分選提取的方法，在保持細(xì)胞活性的情況下實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的實(shí)時(shí)分選，提取目標(biāo)物質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)解決方案是一種用激光分選提取液相細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)(以下簡(jiǎn)稱細(xì)胞器)的技術(shù)，其特征是用兩束激光，即光刀(激光微束)和光鑷(光阱)對(duì)細(xì)胞或細(xì)胞器進(jìn)行有目的的損傷和分選，通過(guò)計(jì)算機(jī)控制載有樣品的樣品載物臺(tái)在顯微鏡工作范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)微米精度操控，顯微操作分選過(guò)程由攝錄系統(tǒng)實(shí)時(shí)顯示于視屏上并記錄存儲(chǔ)。
具體分離方法是使待分離的細(xì)胞隨樣品載物臺(tái)移至光刀在視場(chǎng)中的作用位點(diǎn)，用光刀對(duì)細(xì)胞膜或結(jié)構(gòu)進(jìn)行破壞，釋放出細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)。移動(dòng)樣品載物臺(tái)，使被選中的目標(biāo)細(xì)胞器隨樣品載物臺(tái)移至光鑷在視場(chǎng)中的光阱中心，細(xì)胞器被光鑷俘獲。再次移動(dòng)樣品載物臺(tái)，周圍的雜質(zhì)及細(xì)胞殘骸隨樣品載物臺(tái)一起運(yùn)動(dòng)，而被光鑷俘獲的細(xì)胞器由于受到光阱的束縛而固定不動(dòng)，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)細(xì)胞器與周邊環(huán)境的相對(duì)運(yùn)動(dòng)，用這種方法把該細(xì)胞器相對(duì)移動(dòng)到一個(gè)比較空曠的視場(chǎng)中，遠(yuǎn)離細(xì)胞碎片，與其它細(xì)胞或細(xì)胞殘骸的完全分離；最后用微吸管或微分選室，從樣品中提取被光鑷俘獲的目標(biāo)細(xì)胞器，完成分選工作。
激光光鑷是20世紀(jì)80年代新發(fā)展起來(lái)的生命科學(xué)研究手段，主要用于在微米、亞微米尺度上對(duì)單個(gè)的細(xì)胞器，包括細(xì)胞、細(xì)胞器以及生物大分子進(jìn)行顯微操作和研究，該方法一經(jīng)出現(xiàn)就在生命科學(xué)，基因工程，分散體系，大氣污染，微機(jī)械等領(lǐng)域得到應(yīng)用。本發(fā)明是綜合了光鑷和光刀的全光學(xué)生物微操作、微加工技術(shù)，在對(duì)微米、亞微米量級(jí)的細(xì)胞器進(jìn)行顯微操作的同時(shí)進(jìn)行精細(xì)的操控和加工，因?yàn)楣獾肚懈畹木_性(損傷范圍只有1微米，損傷位置可以精細(xì)調(diào)節(jié))，細(xì)胞器可以不受損傷，其形態(tài)依然保持完整，整個(gè)分離過(guò)程都在細(xì)胞器的液體生存環(huán)境中，并且通過(guò)光來(lái)完成，沒(méi)有直接接觸分選物，所以最大程度上避免了分選過(guò)程中可能發(fā)生的污染和其它意外。
本發(fā)明可直接從細(xì)胞中提取細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)單個(gè)目標(biāo)細(xì)胞器的挑選與操控。與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有樣品制備容易、分選效率高、自動(dòng)化程度高、操作易掌握、無(wú)損傷以及操作尺度小(達(dá)亞微米量級(jí))等優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明由于完全在液體環(huán)境中進(jìn)行操作，操作條件溫和，可以保持細(xì)胞組分生物活性的條件下(例如對(duì)單條染色體的分選)分選其細(xì)胞組分。
附圖

圖1為本發(fā)明的裝置示意2為用本發(fā)明提取水稻單條染色體的過(guò)程示意圖參見(jiàn)圖1，在實(shí)施例中采用的倒置生物顯微鏡，使用100×物鏡，數(shù)值孔徑(是物鏡的一個(gè)參數(shù)，表征它的集光本領(lǐng))1.25。熒光經(jīng)M(M、M1、M2都是雙向分束鏡，對(duì)不同波長(zhǎng)的光可產(chǎn)生反射或透射效應(yīng))反射進(jìn)入顯微物鏡，光鑷光束經(jīng)過(guò)從M1透過(guò)，再由M2反射進(jìn)入顯微物鏡，光刀光束被M3(全反鏡)反射，再經(jīng)過(guò)M1、M2耦合、從M透過(guò)進(jìn)入顯微物鏡。這樣熒光光束、光鑷光束和光刀光束經(jīng)過(guò)反射和透射后合并成一束，經(jīng)過(guò)M進(jìn)入物鏡并被聚焦后照射在樣品(樣品載物臺(tái)中間有通光孔，光可以從中透過(guò))上，樣品載物臺(tái)通過(guò)計(jì)算機(jī)控制在顯微鏡工作范圍內(nèi)以微米精度運(yùn)動(dòng)。照明光由上至下照射樣品，通過(guò)顯微鏡物鏡在CCD(感光元件)上成像，CCD輸出的視頻信號(hào)送入錄像機(jī)進(jìn)行記錄，同時(shí)在計(jì)算機(jī)屏幕上實(shí)時(shí)顯示并采集實(shí)驗(yàn)中的動(dòng)態(tài)圖象。
參見(jiàn)圖2圖2-1結(jié)構(gòu)完整的細(xì)胞器—染色體被包裹在細(xì)胞內(nèi)；圖2-2光刀精確作用于細(xì)胞，細(xì)胞壁局部穿孔、破裂，而細(xì)胞內(nèi)染色體物質(zhì)不受傷害；圖2-3細(xì)胞壁被光刀破壞，內(nèi)部的染色體開(kāi)始散落到細(xì)胞外部。(由于細(xì)胞骨架的作用，染色體仍然相對(duì)集中)；圖2-4光鑷捕獲住染色體群中一個(gè)目標(biāo)染色體，光鑷將其與染色體群及細(xì)胞碎片分離，并移至微吸管口；圖2-5微吸管(收集染色體所用的空心玻璃微吸管使用NARISHIGE公司產(chǎn)PP-830型拉制儀拉制，尖端直徑為2微米)接近被光鑷捕獲的染色體；圖2-6微吸管將染色體吸入管內(nèi)；圖2-7將吸取了染色體的微吸管從培養(yǎng)液中提出，完成整個(gè)分選過(guò)程。
權(quán)利要求
1.一種用激光分選提取液相細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)(以下簡(jiǎn)稱細(xì)胞器)的技術(shù)，其特征是用兩束激光，即光刀(激光微束)和光鑷(光阱)，對(duì)細(xì)胞或粒子進(jìn)行有目的的損傷和分選，通過(guò)計(jì)算機(jī)控制載有樣品的樣品載物臺(tái)實(shí)現(xiàn)微米精度的操控，顯微操作分選過(guò)程由攝錄系統(tǒng)實(shí)時(shí)顯示于視屏上并記錄存儲(chǔ)。具體分離方法是使待分離的細(xì)胞器隨樣品載物臺(tái)移至光刀在視場(chǎng)中的作用位點(diǎn)上，用光刀對(duì)細(xì)胞膜或結(jié)構(gòu)進(jìn)行破壞，釋放出細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)；移動(dòng)樣品載物臺(tái)，使被選中的目標(biāo)細(xì)胞器隨樣品載物臺(tái)移至光鑷在視場(chǎng)中的光阱中心，細(xì)胞器被光鑷俘獲。再次移動(dòng)樣品載物臺(tái)，周圍的雜質(zhì)及細(xì)胞殘骸隨樣品載物臺(tái)一起運(yùn)動(dòng)，而被光鑷俘獲的細(xì)胞器由于受到光阱的束縛而固定不動(dòng)，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)細(xì)胞器與周邊環(huán)境的相對(duì)運(yùn)動(dòng)，用這種方法把該細(xì)胞器相對(duì)移動(dòng)到一個(gè)比較空曠的視場(chǎng)中，與其它細(xì)胞器或細(xì)胞殘骸的完全分離；最后用微吸管或微分選室，從樣品中提取被選中的目標(biāo)細(xì)胞器，最終完成分選工作。
全文摘要
一種用激光分選提取液相細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的技術(shù)，其特征是兩束激光，光刀(激光微束)和光鑷(光阱)，對(duì)細(xì)胞或細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)進(jìn)行有目的的損傷和分選，通過(guò)計(jì)算機(jī)控制載有樣品的樣品載物臺(tái)在顯微鏡工作范圍內(nèi)以微米精度移動(dòng)，分別用光刀和切割細(xì)胞、光鑷俘獲目標(biāo)細(xì)胞器，移動(dòng)樣品載物臺(tái)使目標(biāo)細(xì)胞器遠(yuǎn)離雜質(zhì)或細(xì)胞殘骸，最后用微吸管或微分選室提取目標(biāo)細(xì)胞器，最終使該細(xì)胞器與其它細(xì)胞器或細(xì)胞殘骸的完全分離。本發(fā)明可直接從細(xì)胞中提取細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)單個(gè)目標(biāo)細(xì)胞器的挑選與操控。與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有樣品制備容易、分選效率高、自動(dòng)化程度高、操作易掌握、無(wú)損傷以及操作尺度小(達(dá)亞微米量級(jí))等優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明由于完全在液體環(huán)境中進(jìn)行操作，操作條件溫和，可以保持細(xì)胞組分生物活性的條件下(例如對(duì)單條染色體的分選)分選其它細(xì)胞組分。
文檔編號(hào)G01N21/66GK1438479SQ02160678
公開(kāi)日2003年8月27日 申請(qǐng)日期2002年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月31日
發(fā)明者李銀妹, 王浩威, 樓立人 申請(qǐng)人:上海中科大光鑷科技有限公司