專利名稱：肝再生相關基因的基因圖板的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及包含一組基因的基因圖板(gene panel)、該基因圖板的制造方法及其用途，其中，在肝再生過程中的肝細胞內，所述基因的表達量與其在正常狀態(tài)下的表達量相比有所改變。本發(fā)明的上述方面可應用于診斷、醫(yī)藥等領域。
背景技術：
肝癌治療中進行部分肝切除、或在肝病治療中將部分切除的肝進行移植后，使剩余或移植的肝盡快再生至關重要。但在許多情況下肝再生十分困難。而且，成人常有脂肪肝，脂肪肝常導致再生效果差，從而在部分肝切除后引起一些問題。另外，為了補償因肝炎而受損的肝臟，加速肝再生也非常重要。再生延遲可使肝炎惡化并可引起預后很差的暴發(fā)性肝炎。
因此需要加速肝再生的醫(yī)療保健，而且篩選加速肝再生的藥物非常重要。但是，盡管有這種需求，目前還沒有發(fā)現(xiàn)能有效加速肝再生的治療劑，也沒有能有效篩選加速肝再生的藥物的方法。
已知在大鼠中進行部分肝切除術時，肝再生可迅速開始，一周左右肝細胞群大小即可恢復到肝切除術之前的大小。據(jù)認為通過兩種或兩種以上相關基因的相互作用可加速肝再生，但怎樣的基因功能在怎樣的時機影響肝再生過程的總體狀況仍然是未知的。由于人們認為肝再生涉及許多基因，所以檢測與肝再生相關的大量重要基因以掌握肝再生的總體狀況非常重要。到目前為止，在組合了肝再生中所涉及的基因和蛋白的培養(yǎng)系統(tǒng)中進行了肝再生復制的嘗試，無一獲得成功。另外，已有利用在肝再生過程中觀察到的表達改變?yōu)橹笜诉M行基因篩選的報道(Xu W等，Biochem.Biophys.Represents.Commun.，278(2)318-25，2000；Kar S和Carr BI，Biochem.Biophys.Represents.Commun.，212(1)21-6，1995；Mohn KL，等，Mol.Cell Biol.，11(1)381-90.1991；Sobczak J等，Exp.Cell Res.，169(1)47-56，1987；Huber BE等，Hepatology，6(2)209-19，1986)。但在這些篩選中僅檢測了少數(shù)類型的基因表達。

發(fā)明內容
本發(fā)明是基于上述情況完成的，其目的在于提供包括在肝再生過程中肝細胞內與正常狀態(tài)相比表達量發(fā)生改變的一組基因的基因圖板(gene panel)，以及利用所述基因圖板篩選加速肝再生的藥物的方法。
本發(fā)明人認為加速肝再生可通過下述方式進行，即，使肝再生過程所涉及基因的行為接近于肝再生被加速時所觀察到的這些基因的模式。然后，利用部分肝切除的大鼠檢測肝再生過程不同基因的表達分布圖(expression profile)，以獲得肝再生相關基因的表達信息，由此完成了本發(fā)明。
即本發(fā)明提供下述內容(1)一種基因圖板(gene panel)，其包括在肝再生過程中肝細胞內與正常狀態(tài)相比表達量發(fā)生改變的基因的名稱，以及上述基因的表達分布圖(expression profile)。
(2)如(1)所述的基因圖板，其中，基因表達水平的改變是指與正常狀態(tài)下模型動物中表達水平相比，部分肝切除后的模型動物中基因表達水平的改變。
(3)如(1)或(2)所述的基因圖板，其中，所述表達分布圖包括肝再生全過程的表達分布圖。
(4)如(1)到(3)中任意一項所述的基因圖板，其中，所述的基因圖板包括用于分析所述基因表達分布圖的一組PCR引物的序列信息。
(5)如(2)到(4)中任意一項所述的基因圖板，其中，所述的模型動物是大鼠。
(6)如(1)到(5)中任意一項所述的基因圖板，其中，該基因圖板包括表1、6和7中編號1-166所示的166種基因中的至少6種基因的表達分布圖。
(7)如(6)所述的基因圖板，其中，至少6種基因選自表1和6中編號1-151所示的151種基因。
(8)如(6)所述的基因圖板，其中，至少6種基因選自表1和6中編號1-137所示的137種基因。
(9)如(6)到(8)中任意一項所述的基因圖板，其中，至少6種基因是表1中編號為5，17，36，46，67和68所示的基因。
(10)一種制備基因圖板的方法，該基因圖板包括在肝再生過程中肝細胞內與正常狀態(tài)相比表達水平發(fā)生改變的基因的表達分布圖，該方法包括下述步驟(a)測定正常狀態(tài)模型動物的肝細胞中各種基因的表達水平和肝再生過程中該基因的表達水平；(b)將測得的表達水平分別進行比較；和(c)鑒定在肝再生過程中表達水平發(fā)生改變的一組基因，由所獲得的有關基因名稱和表達水平變化信息制備表達分布圖。
(11)如(10)中所述的方法，其中，在步驟(a)中分析肝再生全過程的基因表達水平。
(12)如(11)所述的方法，其中，在肝再生之前、之中或之后施用加速肝再生的物質。
(13)如(12)所述的方法，其中，所述的加速肝再生的物質是L-丙氨酸。
(14)如(10)到(13)中任意一項所述的方法，其中，基因表達水平通過選自下述的一種或多種方法進行分析，所述方法為基因芯片法、ATAC-PCR法和Taqman PCR(SYBR Green)法。
(15)如(14)所述的方法，其中，利用基因芯片法和ATAC-PCR方法分析基因表達水平。
(16)如(14)所述的方法，其中，利用Taqman PCR(SYBR Green)方法分析基因表達水平。
(17)一種篩選與肝再生有關的藥物的方法，該方法包括將某種藥物施用于模型動物、肝組織或細胞，并繪制構成(1)中所述基因圖板的基因的表達分布圖。
(18)一種評價肝狀態(tài)的方法，該方法包括針對受試者的肝，繪制構成(1)中所述基因圖板的基因的表達分布圖。
(19)一組引物，其可用于制備如(10)所述的基因圖板的方法、用于如(17)中所述的篩選方法或用于如(18)所述的評價方法，該引物包括SEQ IINOS1-127和135-192中的全部或部分寡核苷酸。
下面詳細說明本發(fā)明。
<1>本發(fā)明的基因圖板本發(fā)明的基因圖板是包括在肝再生過程中肝細胞內與正常狀態(tài)相比表達水平發(fā)生改變的一組基因的名稱，以及上述基因的基因表達分布圖的基因圖板。
本發(fā)明的基因圖板的制備步驟如下(a)測定正常狀態(tài)下模型動物的肝細胞中基因的表達水平和肝再生過程中該基因的表達水平的步驟；(b)分別對基因表達水平進行比較的步驟；(c)鑒定在肝再生過程中表達水平發(fā)生變化的一組基因，由有關基因名稱及表達水平改變的信息繪制表達分布圖的步驟。
所謂肝再生是指，肝臟的部分細胞受損或者由于切除等原因而喪失時，通過修復其狀態(tài)，恢復為原始的正常肝狀態(tài)的一種現(xiàn)象。例如在為治療肝癌進行部分肝切除或者在肝病治療中的部分切除肝移植后，剩余肝或移植肝中可觀察到上述現(xiàn)象。
基因的表達水平與基因的表達量、表達強度或表達頻率是同義詞，通常根據(jù)相應于該基因的轉錄產物的生成量、翻譯產物的活性等進行分析。
可以利用在基因表達分析中常用的方法測定基因表達水平。優(yōu)選的方法包括，基因芯片法、基因微陣列法、基因宏陣列(macroarray)法等。在這些方法中，使用將基因片段排布并固定到特定的平板(通常為玻片)上得到的物質。將這種芯片與熒光標記的mRNA雜交，再測定mRNA的類型和數(shù)量。
另外，作為本發(fā)明中優(yōu)選的方法，也可以例舉ATAC-PCR法和TaqmanPCR(SYBR Green)法。ATAC-PCR法是由Kato等(Kato，K.等，Nucl.Acids Res.，25，4694-4696，1997)開發(fā)的定量PCR技術，其特征在于，它能對痕量樣品的表達進行定量。另外，常規(guī)的定量PCR方法最多只能對幾十種基因的表達進行定量，而ATAC-PCR方法可以對1000多種基因的表達進行定量。Taqman PCR(SYBR Green method)是一種常用的定量RT-PCR的技術(Schmittgen TD，Methods，25，383-385，2001)，其特征在于，引物易于設計。而且，過程簡單，可在短時間內測定大量基因的表達(40-150個基因/2小時)。
除上述方法之外，基因表達分析法的例子還包括body map法(Gene，174，151-158，1996)、基因表達順次分析法(SAGE)(美國專利申請第527,154號和第544,861號，歐洲專利公開第0761822號)、基因表達微量分析法(MAGE)(日本專利公開第2000-232888號)等。
下面概要描述一下body map法。將載體上的poly-T序列和mRNA3′末端的poly-A尾相連，用所述載體的poly-T序列作為引物合成cDNA。接著，用限制酶MboI消化所述cDNA。由于cDNA上一個MboI位點平均存在300個堿基對，載體上的cDNA被分割成平均300個堿基對的片段。此時，最靠近poly-A尾的cDNA片斷仍然與載體相連。帶有這一cDNA片段的載體環(huán)化后被引入大腸桿菌中，構建cDNA文庫。從該文庫中任意篩選出約1000個克隆，對每個克隆鑒定平均300個堿基對的核苷酸序列。在這些序列中，收集包含相同序列的克隆，得到每種序列的類型和出現(xiàn)頻率，以構建基因表達分布圖。在數(shù)據(jù)庫中對每一cDNA序列進行同源性檢索(BLAST search)，將與已知基因具有相同序列的克隆命名為該基因的名稱。如果該序列沒有在數(shù)據(jù)庫中注冊，則推測該序列所對應的基因并不存在。
為了利用BLAST檢索進行同源性檢索，需要至少11個堿基對的信息。有大約100萬種基因具有含10個核苷酸的序列。這一類型數(shù)遠遠多于預期存在于人體中的100,000種基因的類型數(shù)。也就是說，如果是11個堿基對的信息，即可對具有該序列的基因進行鑒定，并可以進行基因表達分布圖的分析。因此，為了利用需要大量序列的bodymap法有效地分析基因表達分布圖，body map中具有約300個堿基對的cDNA片段可進一步分割成具有11個或更多堿基對的小片段(稱作“標簽”)，這些小片段可進一步彼此連接成多種片段，插入到載體中，構建連接標簽數(shù)據(jù)庫。如象在body map法中那樣，任意篩選出約1000個克隆，確定連接標簽的DNA序列，則可以預期應用與body map法相同的方法可獲得更多基因的表達信息。每一個標簽代表一種基因序列，標簽的出現(xiàn)頻率代表該基因的表達頻率。因為一個測序反應所能確定的DNA序列的長度通常為約600個堿基對，所以一次測序反應最多能確定約50個標簽的DNA序列。也就是說，與body map法相比，可以以高出最多約50倍的效率進行基因表達分布圖分析。
SAGE法就是一種基于上述內容的分析基因表達分布圖的方法。SAGE方法如下進行用在3′端與生物素結合的poly-T作為引物制備cDNA，接下來和body map法一樣用限制酶，如MboI(指“鉚定酶”)消化上述cDNA，使含有與生物素結合的3′端的cDNA片段被吸附在抗生物素蛋白小珠上。將小珠分成兩份，分別使兩種接頭(A或B)中的一個與上述兩份吸附在小珠上的cDNA片段(約13bp)連接。II類限制性酶如BsmFI(指＂標簽酶＂)的切位點被加在每一接頭的前面。用標簽酶將cDNA片段從小珠上切下來，酶切位點被平末端化，與接頭A相連的標簽及與接頭B相連的標簽彼此連接。所得產物稱作雙標簽(ditag)。用識別接頭A和接頭B的引物通過PCR對所得的雙標簽進行擴增。該擴增的雙標簽相互相連形成多種片段，將其整合到載體中并測序。每個測序反應可得到約50個標簽序列。收集這些標簽序列信息，了解基因表達頻率的狀況。
MAGE法是上述方法經修改的方法，是一種能夠高效率、高精確度分析基因表達頻率的方法，在該方法中利用具有poly-T序列的載體引物由mRNA合成cDNA，在載體上該cDNA序列被標簽化，所得的標簽通過可鑒定標簽末端的序列相連接形成多聯(lián)體，分析該多聯(lián)體的核苷酸序列。
本發(fā)明中，只要可以分析基因表達水平，對基因表達分析方法沒有特別的限定，任何目前已知的方法和未來將開發(fā)出的方法均可以應用。上述方法中，特別優(yōu)選基因芯片法、基因微陣列法、ATAC-PCR法和Taqman PCR(SYBR Green)法。
本發(fā)明中，基因表達水平可基于一種方法得到的結果進行分析，也可以基于兩種或兩種以上方法所獲得的結果進行分析。盡管用一種方法分析能夠獲得一定程度的結果，但結合兩種或兩種以上的方法能夠獲得更高精度的分析。特定地，對于兩種或兩種以上的方法(如基因芯片法和ATAC-PC方法)所得的結果，可計算相關系數(shù)。當該相關系數(shù)是某一特定值或更高時，可以假定相應的基因表達水平發(fā)生了變化。
各種人或動物(如小鼠)的基因芯片、基因微陣列和基因宏陣列都是可商購的，它們均可用于本發(fā)明。
本發(fā)明中，通過測定正常狀態(tài)下肝細胞中各種基因的表達水平和肝再生過程中這些基因的表達水平，再分別比較它們的表達水平，由此分析基因表達水平的變化。例如利用模型動物(如部分肝切除的大鼠)測定肝切除后所述動物肝細胞內基因的表達水平，由此分析肝再生過程中基因的表達水平。另一方面，正常狀態(tài)下的基因表達水平典型地是在即將進行肝切除前測定的。優(yōu)選地，在肝再生過程中自始至終分析上述基因的表達水平。
如上所述，鑒定出一組在肝再生過程中表達水平發(fā)生改變的基因。通過分別將分析的表達水平改變的信息分配給各鑒定的基因，制作這些基因的表達分布圖。
另外，在本發(fā)明中對于與正常狀態(tài)下相比在肝再生過程中表達水平發(fā)生改變的基因，也就是被認為肝再生過程所涉及的基因的候補者，可以提及的是推測在L-丙氨酸代謝過程中所涉及的基因。
已知L-丙氨酸可促進肝再生(Maezono K等，Hepatology 24(5)，1996；日本專利公開第5-229940號)。另外，肝切除后的人血漿中L-丙氨酸濃度升高(Nijveldt RJ等，Liver 21(1)56-63，2001)，在肝切除后的大鼠肝組織中L-丙氨酸積累(Brand HS等，JHepatology，23，333-340，1995)等均已有報道。作為支持上述發(fā)現(xiàn)的數(shù)據(jù)，如下文(本發(fā)明的實施例部分)所述，在作為肝再生模型的70％部分肝切除大鼠中觀察到，轉運L-丙氨酸的氨基酸轉運系統(tǒng)A(ATA2)的mRNA水平提高。另外，由于在相似的肝再生模型中也觀察到L-丙氨酸轉運活性提高(Joan-Vicenc等，F(xiàn)EBS LETTERS，329(1，2)189-193，1993；Freeman TL等，BBRC，278，729-732，2000)，暗示了在肝再生過程中肝細胞對L-丙氨酸攝入量提高的可能性。
另外，當采用MeAIB(非代謝，系統(tǒng)A-特異底物，α-(甲基氨基)異丁酸)的處理使ATA2的Ala轉運活性受到抑制時，DNA對[3H]胸腺嘧啶脫氧核苷的攝入降低(Freeman TL等，Hepatology，30(2)437-4445 1999)。由此，說明當L-丙氨酸向肝細胞內的轉運受到抑制時，肝再生的加快也受到抑制。這也有力地表明肝再生的加快與ATA2(Ala)相關。
而且，在外科手術領域早已有報道稱在受到侵襲(如肝切除)的狀態(tài)下，肝臟中的能量代謝顯著增長，以L-丙氨酸為代表的氨基酸主要作為肌蛋白分解產物供給，并用作糖異生(Felig P等，Metabolism，22，179-207，1973)及蛋白合成的底物。如上所述，通常認為在肝再生過程中L-丙氨酸通過糖異生提供能量。事實上，已有報道稱在肝再生模型大鼠中，在肝切除后9或18小時L-丙氨酸的氧化作用受到抑制，血漿葡萄糖水平升高，肝糖原積累，果糖-1，6-二磷酸酶和PEPCK的活性提高(Klain GJ等，J.Nutr.Biochem.，1(Nov.)，578-584(1990))。
上述發(fā)現(xiàn)揭示出L-丙氨酸加速肝再生，并假定其作用機理是基于肝再生過程中L-丙氨酸增加的能量供給。因此，如下述實施例中所示，在肝再生過程中對L-丙氨酸代謝所涉及的59種大鼠基因的表達進行了分析。結果，發(fā)現(xiàn)在這些基因中表達發(fā)生改變的有17種基因。據(jù)此，制備本發(fā)明的基因圖板時，在上述步驟(a)之前，先選擇出與L-丙氨酸代謝相關的基因。
如實施例3中所示，即使是那些未觀察到其表達在肝再生過程中發(fā)生改變的基因，如果在肝再生之前、之中或之后施用L-丙氨酸，則可以觀察到表達發(fā)生改變。這樣的基因也可以包含在所述的基因圖板中。另外，除L-丙氨酸之外，其他具有加速肝再生作用的物質(肝再生加速物)也可以在肝再生之前、之中或之后施用。該肝再生加速物質包括肝抽提物和黃素腺嘌呤二核苷酸(每1ml 15μl肝抽提物，10mgFAD)的混合物、肝水解物、柴胡桂枝湯、小柴胡糖、二氯乙酸二異丙胺、胎盤水解物、纈氨酸(WO 0113912)、血管內皮生長因子/血管滲透因子(VEGF/VPF)(WO 0132213)、大環(huán)內酯化合物(JP 3240728)、TCF II(JP 10194986)、TGF-β釋放/激活/合成抑制劑(JP 8333249)、葡萄糖-1-磷酸、葡萄糖-6-磷酸(JP 2202821)、desialated血清類黏蛋白(JP 6122025)等。
本發(fā)明的基因圖板至少包括上述經鑒定的各種基因的名稱、以及各基因的表達分布圖。對于基因的名稱，只要基因間彼此可以區(qū)分開，對基因的命名法沒有特殊的限定。典型地，可使用由所述基因編碼的產物的名稱、在GenBank等數(shù)據(jù)庫中使用的登記號或基因名、基因芯片上的探針對名稱或基因名稱等等。
在本發(fā)明中，術語＂表達分布圖＂指有關基因圖板中所包含的各基因的表達水平改變的信息。在優(yōu)選的實施方案中，全過程測定并記錄表達水平。在表達分布圖中，基因的表達水平可用絕對值或相對值表示。
本發(fā)明的基因圖板的一個優(yōu)選實施方案中，按照在肝切除后特定時間的表達水平將所述基因分類。例如，將在肝切除后1hr和6hr(肝再生的早期階段)表達水平明顯升高的基因歸為一組(組1和組2)，表達水平在這一階段反而下降的歸為一組(組6和組7)，在肝切除24hr和48hr(肝再生的中期階段)表達水平明顯升高的基因歸為一組(組3和組4)，表達水平在這一階段反而下降的歸為一組(組8和組9)，在肝切除后7天(肝再生的晚期階段)表達水平明顯升高的基因歸為一組(組5)，以及表達水平在這一階段反而下降的歸為一組(組10)。此處所述的＂顯著＂是指在基因芯片法中基因的表達水平與肝切除前相比升高或下降3倍以上，或者在Taqman-PCR(SYBR Green)法中，如果在顯著性測定中觀察到差異，則認為存在表達差異。
在本發(fā)明的基因圖板的一個實施方案中，如表1列出的那樣，這些組可排列成表達升高或降低后表達水平維持的時間長度的順序或從最長時間開始的升高或降低持續(xù)時間的長度的順序。
另外，優(yōu)選地所述基因圖板還包括在肝切除后特定時間肝重的信息。例如，可在肝再生的早期階段(肝切除后1hr和6hr)、肝再生的中期階段(肝切除后24hr和48hr)以及肝再生的晚期階段(肝切除后7天)將肝取出測定各個肝重。
本發(fā)明的基因圖板可包括用于分析各基因表達水平的PCR引物的序列信息。引物的例子包括含SEQ ID NOS1到127和135到192的全部或部分寡核苷酸的引物。除引物的序列信息外，還可以包括在ATAC-PCR法和/或Taqman PCR(SYBR Green)方法中使用的接頭的核苷酸序列信息。SEQ ID NOS1-127表示用于ATAC-PCR方法中的引物，SEQ ID NOS135-192代表用于Taqman PCR(SYBR Green)方法中的引物。對于接頭的核苷酸序列，可以例舉的是具有SEQ ID NOS128-133的核苷酸序列的接頭。
<2>本發(fā)明的篩選方法基于本發(fā)明的基因圖板，通過構建定量或半定量測定基因圖板中所包含的基因表達的系統(tǒng)可進行各種篩選實驗。
例如，可通過對模型動物、肝組織或細胞施用藥物、繪制構成本發(fā)明基因圖板的基因的表達分布圖來篩選與肝再生有關的藥物。也就是說，提供與所述基因圖板中的表達分布圖類似的基因表達分布圖的藥物可加速肝再生。
另外，通過篩選可進一步提高或降低本發(fā)明基因圖板中已升高或降低的基因表達水平的藥物，能夠篩選加速肝再生的物質。在這種情況下，可通過關注大約6種類型基因的表達改變來進行篩選。基于此種觀念的篩選實例參見下文中的實施例。
作為上述6種基因，例如表1((1)-(11))中所示基因圖板的137種基因類型中的Nos.5(氨基酸轉運系統(tǒng)A(ATA2))，17(高移動性組蛋白2)，36(核RNA解旋酶)，46(肝核蛋白p47)，67(白血病相關的胞質磷蛋白stathmin)和68(脫氧-UTP酶(dUTpase))的基因。
繪制基因表達分布圖的方法包括應用固定有組成基因圖板的基因片段的玻片、尼龍膜等的DNA微陣列和DNA宏陣列方法、ATAC-PCR方法、應用Taqman探針的方法、應用SYBR Green的定量PCR方法等?？衫靡环N方法或利用兩種或兩種以上的方法相結合繪制表達分布圖。
下面將詳細描述篩選方法的具體實例。
作為初級篩選，用待篩選的藥物處理培養(yǎng)的肝細胞，或者將所述藥物施用于大鼠。一段時間后，從所述細胞或肝臟中制備RNA。測定經藥物處理前后基因的表達水平，將那些表達分布圖與基因圖板中表達分布圖類似的藥物篩選出來。將經藥物處理后的肝細胞中的基因表達模式分組，篩選出與基因圖板的分組類似的藥物。所述分組是依照與制備基因圖板相同的方式，按一定時間的表達水平將基因分類進行的。
對于肝細胞的培養(yǎng)條件，可使用通常的培養(yǎng)條件，也可以向培養(yǎng)基中添加破壞肝細胞的物質，如半乳糖胺、重金屬離子或四氯化碳等。期望通過在通常的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)細胞，能夠篩選出加速肝再生或使所培養(yǎng)的肝細胞增殖的物質。而且期望通過在存在有破壞肝細胞的物質的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，可以篩選出細胞破壞后通過肝再生加速肝功能恢復的物質。
作為二級篩選，將在初級篩選結果的基礎上預期具有加速肝再生活性的候補藥物施用于部分肝切除的大鼠，經過特定的時間間隔，例如在肝再生的早期階段(肝切除后1hr或6hr)、肝再生的中間階段(肝切除后的24或48hr)和肝再生的晚期階段(肝切除后7天)取出肝臟。稱取肝重并由該肝臟提取RNA，測定基因表達的改變。將所得的數(shù)據(jù)與經部分肝切除但未施用藥物的大鼠的肝重變化及基因表達改變數(shù)據(jù)相比較，用以評估藥物對肝再生的效果。
上述的篩選也可用除大鼠之外的其他實驗室動物進行。在此種情況下，優(yōu)選對相應于大鼠基因的同系物新制造基因圖板，進行篩選。
除了篩選表達改變與所述基因圖板中的類似的藥物之外，利用所述的基因圖板還可進行下述的藥物篩選。認為在肝再生早期階段發(fā)生改變的基因組(例如上述的組1，2，6和7)對肝再生的引發(fā)而言是重要的。因此，預期通過篩選用所述藥物處理后給出類似于這些組中的這些基因的模式的藥物，可獲得對引發(fā)肝再生有效的藥物。
另外，認為在肝再生中期階段表達改變開始的基因(例如上述的組3，4，8和9)可加速肝再生引發(fā)后肝細胞的增殖或分化。因此，期望通過篩選經所述藥物處理后給出類似于這些基因的模式的藥物，可獲得對加速肝細胞的增殖或分化起到積極作用的藥物。
認為在肝再生晚期階段表達改變開始的基因組(例如上述的組5和10)對肝再生的終止和重建完成后的正常肝細胞功能起重要作用。因此，期望通過篩選經所述藥物處理后給出類似于這些基因的模式的藥物，可得到對肝細胞增殖起負面作用的藥物或對重建完成后正常肝細胞功能有效的藥物。對肝細胞增殖起負面作用的藥物可用于阻止肝細胞的過度增殖，預期可能將其用作肝癌等的藥物。
如上所述，認為本發(fā)明的基因圖板可用于篩選在肝再生的各階段(例如，引發(fā)、細胞增殖、分化及細胞增殖終止等)有效的藥物，并且通過使用作為上述篩選結果所獲得的藥物，可創(chuàng)造更有效的肝再生試劑。
已知L-丙氨酸具有肝再生效果。但是，由于L-丙氨酸在活體中容易代謝、消失，所以未能獲得有效的藥效。因此，需要具有與L-丙氨酸相同藥效的藥物，并且通過改進的藥物動力學賦予其更優(yōu)越的特性，如延長的效果。另外，由于原料難以獲得，往往作為兩種或多種成分的混合物起作用，因而存在雖然已知藥效但其數(shù)量不足以作為藥物使用的物質(例如天然藥物)。因此，需要對肝再生有作用且能充足供應的物質。本發(fā)明可高敏感性和高有效性地篩選用作藥物的物質。
<3>本發(fā)明的評價肝狀態(tài)的方法本發(fā)明的基因圖板可用于評估肝病(如肝炎及肝硬化)中患病的肝臟是否表現(xiàn)出向再生方向發(fā)展的系統(tǒng)。此外，通過檢測每一病人的基因表達改變模式，可以對每位病人進行適當?shù)乃幬镏委煛＠?，篩選對特異性正、負控制本發(fā)明基因圖板中的特定基因(基因組)的一系列藥物。然后，通過檢測患有肝病病人的基因圖板中的基因表達來篩選肝再生所需的藥物。


圖1顯示接頭的結構。
圖2到4顯示在肝再生過程中，施用L-丙氨酸后，表達發(fā)生改變的L-丙氨酸代謝所涉及基因的相對表達水平(將β-肌動蛋白表達水平視為1000，以此為基準的相對表達水平)。
本發(fā)明的最佳實施方式通過下述實施例對本發(fā)明進行更詳細的介紹。
實施例1<1>再生肝臟的制備對10周齡的F344/DvCrj(Fischer)大鼠實施麻醉。切開腹部，將肝的左葉和中間葉從切口擠出。在左葉和中間葉之間、右葉和尾葉之間用縫線縫合。將右葉和尾葉留在體內，將左葉和中間葉切除。然后用縫線將切口縫合。對于切除后0小時檢測的動物，不進行縫合，接著摘除剩余的肝臟。在肝切除后的第1，6，12，24和168小時再將切口打開，提取剩余的肝臟(再生肝)。剩余肝臟(右葉和尾葉)的重量約占大鼠肝臟(右葉、左葉、中間葉和尾葉)總重的30％。
每組制備三只肝再生模型大鼠，在提取肝臟時測定剩余肝臟的重量。所述重量分別為切除后0hr2+0.3g(1.6g)；切除后1hr1.7±0.3g(1.4g)，切除后6hr2.1±0.5g(2.1g)；切除后24hr2.5±0.5g(3.0g)；切除后48hr2.5±0.5g(2.0g)；切除后7天5.6±0.3g(5.8g)(括號中的數(shù)值是利用下述基因芯片法進行測定時使用的再生肝臟的重量)。
<2>總RNA純化向1g大鼠肝臟中加入10ml ISOGEN(Nippon Gene)，將肝臟勻漿化。將所得勻漿離心，收集上清液。以每添加1ml ISOGEN向所得上清液中添加200μl氯仿，輕輕攪拌。將混合物在室溫下放置2min，然后4℃下以15000rpm離心10min，將水層轉到新的離心管中。向該水層中添加等體積的2-丙醇，在室溫下放置5min，然后4℃下以15000rpm離心15min。棄去上清液，向沉淀顆粒中添加70％的乙醇，4℃下以15000rpm離心15min。棄除70％的乙醇，清洗所得的顆粒。將清洗后的顆粒在室溫下干燥5min后，添加DEPC(焦碳酸二乙酯)處理水，溶解所得顆粒。用1％的瓊脂糖凝膠電泳驗證由上述步驟所得的總RNA級分被純化。
如上所述，在對大鼠進行部分肝切除后的第0，1，6，24，48和168hr，從每個殘留的肝臟(再生肝)中純化總RNA，利用GeneChip(Affymetrix)和ATAC-PCR方法檢測各種基因表達水平的變化。
<3>通過GeneChip進行基因表達分析用GeneChip依照Affymetrix建議的方法進行基因表達分析。步驟如下(1)探針合成(i)雙鏈cDNA合成首先，利用Gibco BRL制造的SUPERSCRIPT Choice System由<2>中制備的總RNA合成雙鏈cDNA。將15μg的總RNA和100pmol的T7-(dT)24引物溶于DEPC-處理的水中至體積11μl。70℃下反應10min，然后將反應混合物在冰上冷卻，添加4μl 5x第一鏈cDNA緩沖液(Gibco BRL)、2μl 0.1xDTT(dithiothreitol，二硫蘇糖醇，GibcoBRL)和1μl的10mM dNTP混合物(Gibco BRL)，在42℃下保溫2min。向反應混合物中添加2μg的反轉錄酶(Superscript II RT)，42℃下反應1hr。
向上述反應混合物中添加DEPC-處理的水、30μl 5x第二鏈反應緩沖液、3μl 10mM dNTP、1μl 10U/μl DNA連接酶、4μl 10U/μlDNA聚合酶I和2U/μl RNase H，在16℃下反應2hr。然后向上述反應混合物中添加2μl 5U/μl T4 DNA聚合酶，再在16℃下反應5min。向反應混合物中添加10μl 0.5M EDTA。向這一反應混合物中加入等體積的溶液(苯酚∶氯仿＝1∶1)，豎直搖動含有上述混合物的管子，將其混合。將上述混合物4℃下以15000rpm離心10min，將水層轉移到新的離心管中。向該水層添加1/10體積的3M醋酸鈉和3倍體積的100％乙醇，充分混合。將所述混合物在-80℃下放置10min，然后4℃下以15000rpm離心10min。將沉淀的顆粒用70％乙醇洗兩次，室溫下干燥5min后，加入12μl DEPC-處理的水。
(ii)生物素標記的cRNA探針的合成隨后，應用Enzo生產的Bio Array High Yield RNA TranscriptLabeling Kit由上述合成的雙鏈cDNA合成生物素標記的cRNA探針。將5μl雙鏈cDNA、17μl DEPC-處理水、4μl 10x HY緩沖液、4μl 10x生物素標記的核糖核甙酸、4μl 10x DTT、4μl 10x RNA酶抑制劑混合物和2μl 20x T7 RNA聚合酶混合，于37℃下反應4h。
然后，利用Qiagen生產的RNeasy將未反應的生物素標記的核糖核甙酸從上述合成的生物素標記cRNA探針溶液中除去。向生物素標記的cRNA探針溶液中添加160μl DEPC-處理的水，與700μl RLT緩沖液混合，然后添加500μl 100％乙醇，充分混合。將每700μl所得溶液添加到RNeasy微型旋轉柱(RNeasy mini spin column)中，以8000rpm離心15sec。將洗脫溶液再次添加到RNeasy微型旋轉柱中，以8000rpm離心15sec。接下來將500μl RPE緩沖液添加到RNeasy微型旋轉柱中，以8000rpm離心15sec。將500μl的RPE緩沖液再次添加到RNeasy微型旋轉柱中，以15000rpm離心2min。
將如上所述用生物素標記的cRNA探針吸附并經洗滌的RNeasy微型旋轉柱轉移到新的離心管中。向RNeasy微型旋轉柱中添加30μlDEPC-處理的水，室溫下放置1min。將所述混合物以8000rpm離心15sec，以洗脫純化的生物素標記cRNA探針溶液。
接下來，經純化的生物素標記cRNA探針溶液片段化。所述生物素標記cRNA探針溶液和5x裂解緩沖液(fragmentation buffer)(加入量為溶液終體積的1/5)混合，以獲得濃度為0.5μg/μl的生物素標記cRNA探針，使其在94℃下反應35min。反應混合物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，以確認所述探針已被切割成長度約100個堿基的片段。
(2)雜交先用實驗用芯片(TEST2 Chip)對片段化的生物素標記cRNA探針進行評估以確保探針無誤，然后進行所需的雜交實驗。大鼠芯片組(RG-U34A，RG-U34B，RG-U34C)用于所需實驗。這3種大鼠芯片組總共包括7000種已知的大鼠基因和17000種未知的基因。使用上述實驗芯片和大鼠芯片組的雜交均通過下述步驟進行。
添加60μg片段化的生物素標記cRNA探針、12μl對照寡核苷酸B2(5nM)、12μl 100x對照cRNA雞尾酒、12μl鯡精DNA(10mg/ml)、12μl乙?；腂SA(50mg/mg)和600μl 2x MES雜交緩沖液，用DEPC-處理水將總體積調節(jié)到1200μl(此后稱作“雜交雞尾酒”)。將所述雜交雞尾酒于99℃下加熱5min以進行熱變性，在45℃下放置5min，室溫下以15000rpm離心5min。對于雜交，將80μl的上清液添加到實驗芯片(TEST2 Chip)中，或將200μl上清液添加到各大鼠芯片組(RG-U34A，RG-U34B，RG-U34C)中。
將GeneChip返回至室溫，與1x MES緩沖液(80μl TEST2芯片和200μl大鼠芯片組)以60rpm在45℃下預雜交10min。接下來，去除預雜交液，加入上述經熱變性的雜交雞尾酒。在60rpm、45℃下雜交16hr。
(3)洗滌、染色和掃描從GeneChip中去除上述的雜交雞尾酒，加入非嚴謹洗滌緩沖液，用Fluidic Station(Affymetrix)進行清洗和染色。TEST2 Chip的清洗和染色依照Fluidic Station的Mini_eukl方法進行，大鼠芯片組的清洗和染色依照EukGE-WS2方法進行。清洗和染色完成后，用掃描儀掃描芯片以獲得圖象數(shù)據(jù)。
(4)數(shù)據(jù)分析用基因芯片分析程序組(GeneChip Analysis Suite)進行雜交的數(shù)據(jù)分析。將總基因表達水平平均值定為100，用以此為基礎的相對值(平均差)表示各基因的表達水平(表1(1)-(11))。在表中，基因芯片探針組名稱為Affymetrix命名的與各基因對應的管理用識別號。UniGene是在GenBank注冊的DNA序列數(shù)據(jù)庫，其按照基因(轉錄產物)的類型和種進行編制。
表中0hr一欄表示部分肝切除后0hr測定的大鼠肝中的基因表達水平。類似地，1hr、6hr、24hr、48hr和7d各欄分別表示在部分肝切除后的第1，6，24，48hr和7d大鼠肝中的基因表達水平。0hr/0hr，1hr/0hr，6hr/0hr，24hr/0hr，48hr/0hr和7d/0hr各欄中的數(shù)值分別表示以部分肝切除后第0hr的基因表達水平為基準，在部分肝切除后0，1，6，24，48hr和7d的基因表達水平相對值。所述的數(shù)值截止到小數(shù)點后兩位。另外，將0或更低的表達水平數(shù)值視為1以便于獲得表達比率。
使用已知基因(包括所有ORF的序列結構已在GenBank數(shù)據(jù)庫注冊的基因，不包括僅部分序列已知的基因，如EST)制備基因圖板。
與正常肝中的表達水平相比，在再生肝中有77種已知基因的表達水平顯著升高(升高約3倍以上，如表1中黑體字所示)。與正常肝中的表達水平相比，有60種已知基因在再生肝中的表達水平顯著降低(降低到約1/3或更少，如表1中斜體字所示)。它們當中，7種已知基因在肝再生過程中表達量顯著升高，也顯著降低。即，在肝再生過程中觀察到137種已知基因表達水平顯著改變(比肝切除前表達水平升高或降低了3倍或更多)。
表1(1)

表1(2)

表1(3)

表1(4)

表1(5)

表1(6)

表1(7)

表1(8)

表1(9)

表1(10)

表1(11)

相關系數(shù) ＞＝0.7 34.000 45％相關系數(shù) ＞＝0.5 50.000 67％ATAC-PCR測定的基因數(shù) 75.000
<4>通過ATAC-PCR進行基因表達分析ATAC-PCR是由Kato等開發(fā)的技術(Kato，K等，Nucl.Acids Res.，25，4694-4696，1997)，基于利用熒光引物的競爭RT-PCR。通過ATAC-PCR可方便地對大量基因進行定量表達分析。ATAC-PCR方法的實驗過程依Kato等的方法進行(Kato，K等，Nucl.Acids Res.，25，4694-4696，1997)。
首先，由利用5′生物素化的寡dT引物合成的cDNA合成雙鏈DNA，再用特定的限制酶消化(此處以使用MboI為例進行說明)。接下來，用DNA連接酶將用限制酶MboI消化的雙鏈DNA與具有相同于用限制酶消化部位的序列的末端序列的接頭(制備不同長度的6種)連接起來。6種接頭中，3種與對照cDNA(由肝切除前的大鼠肝臟制備的cDNA)相連，并以10∶3∶1的比例混合。剩余的3種接頭與由肝切除后1，6，24，48hr和7d的大鼠肝臟制備的cDNA相連。
將連接反應產物混合，用鏈霉抗生物素蛋白包被的小珠回收雙鏈cDNA的3′片段，利用具有各接頭共有序列的引物進行競爭RT-PCR。用ABI PRISM 3700 DNA分析儀分析該PCR產物。這一裝置可利用毛細管電泳將各種長度的片段分離，并檢測與表達水平成比例的熒光強度。
根據(jù)由對照所獲得的PCR產物的熒光強度制備校準曲線。利用校準曲線計算待測定的經切割的肝臟中的基因表達改變量。
所使用的接頭的核苷酸序列如下(接頭1，SEQ ID NO128)5′-GTACATATTGTCGTTAGAACGCG-3′3′-CATGTATAACAGCAATCTTGCGCCTAG-5′(接頭2，SEQ ID NO129)5′-GTACATATTGTCGTTAGAACGCGACT-3′3′-CATGTATAACAGCAATCTTGCGCTGACTAG-5′(接頭3，SEQ ID NO130)5′-GTACATATTGTCGTTAGAACGCGCATACT-3′3′-CATGTATAACAGCAATCTTGCGCGTATGACTAG-5′(接頭4，SEQ ID NO131)5’-GTACATATTGTCGTTAGAACGCGATCCATACT-3′
3’-CATGTATAACAGCAATCTTGCGCTAGGTATGACTAG 5′(接頭5，SEQ ID NO132)5′-GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTCAATCCATACT-3′3′-CATGTATAACAGCAATCTTGCGCAGTTAGGTATGACTAG-5′，(接頭6，SEQ ID NO133)5′-GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTACTCAATCCATACT-3′3′-CATGTATAACAGCAATCTTGCGCATGAGTTAGGTATGACTAG-5′對于用于競爭PCR中的引物對，具有下述核苷酸序列的引物通常用作所有基因的接頭側，表1和序列表中所示序列(以5′-3′的方向表示)用作基因特異的引物。
(接頭側引物)5′-GTACATATTGTCGTTAGAACGC-3′(SEQ ID NO134)對于通過使用MboI以外的限制酶的ATAC-PCR檢測表達改變的基因，所使用的限制酶的名稱如表1所示。在這些情況下，使用末端序列不同于應用MboI時的接頭序列。圖1中示出上述不同部分(黑體字)的序列。
<5>基因圖板應用于篩選加速肝再生的候選物質進行實驗以證明本發(fā)明的基因圖板對篩選加速肝再生的物質有效。
已知L-丙氨酸具有加速肝再生的作用(Maezono K等，Hepatology24(5)，1996，Effect of Alanine on D-Galactosamine-Induced AcuteLiver Failure in Rats；日本專利公開第5-229940號)。將大鼠部分肝切除，然后在進行肝切除后的第18和21小時口服L-丙氨酸，然后檢測進行肝切除后24小時的基因表達。
對5只6周齡的F344雄鼠(120g)給予飼料CRF-1(OrientalYeast)和水，進行預飼養(yǎng)6天，然后將其分成兩組(組1和組2)，每組的大鼠體重相同。在進行解剖前24小時，通過Higgins-Anderson的方法(Higgins，GM和Anderson，RM，Arch.Pathol.12，186-191，1931)進行70％部分肝切除。在進行解剖的那一天，解剖6小時前使大鼠斷食，解剖前6小時和3小時通過含0.3％羧甲基纖維素(CMC)的水溶液口服2g/10ml/kg L-丙氨酸。
麻醉狀態(tài)下將小鼠放血處死、解剖。提取肝臟，稱重，冷藏，然后通過ATAC-PCR方法進行mRNA表達測定。然后制備肝樣品，測定肝增殖細胞核抗原(PCNA)水平。
通過ATAC-PCR測定各組大鼠肝臟的基因表達。RNA的制備以及ATAC-PCR的操作如上所述。對于ATAC-PCR方法，在基因圖板的基因中，對通過利用限制酶MboI的ATAC-PCR可測定的117種基因的表達進行了測定(除了表1中所述的編號為12，49，52，55，58，59，61，69，73，77，83，90，93，101，102，108，130，134，135和136的以外)。
另外，將施用了L-丙氨酸的大鼠肝臟用抗-PCNA抗體(針對增殖細胞核抗原(PCNA)的抗體，一種促進DNA聚合酶活性的復制因子)染色，用Tanaka等的方法(Tanaka等，Byori to Rinsho，9(6)791-798，1991)，檢測PCNA標記指數(shù)(labeling index)。
PCNA標記指數(shù)的測定結果如表2所示。由于施用了L-丙氨酸，肝中的PCNA標記指數(shù)高于未施用大鼠的肝(表2)。表2中Ala+代表L-丙氨酸施用組，Ala-代表非L-丙氨酸施用組。由此可以觀察到施用L-丙氨酸引起的肝細胞增殖的加速作用。
表2

1-1到1-3組12-1，2-2組1
此外，對于基因圖板中的基因，用ATAC-PCR測定了組1和組2中基因的表達，并進行了比較。通過基于組1數(shù)值的組1的相對值(表3中的Ala+/Ala-)得到表達水平。結果發(fā)現(xiàn)有7種基因在施用L-丙氨酸的組和不施用L-丙氨酸的組間顯示3倍以上的表達差異(表3)。
表3

接下來，為比較所述基因圖板中的基因表達改變以及由于施用L-丙氨酸造成的基因表達改變，計算了組2中基因的表達與肝切除后0小時基因圖板中基因的表達之比。結果如表4所示。在表4中，1hr，6hr，24hr，48hr和7d分別代表與肝切除前肝臟中的基因表達相對，肝切除后1，6，24，48hr和7天后的殘留肝中的相對表達值。在比較第24hrAla-和24hrAla+的表達值時，在基因圖板的基因中，組1和組2內表達水平呈現(xiàn)顯著差異(3倍以上)的有7種(Nos.5，17，36，46，67，68和117)(表4)。其中有5種(Nos.17，36，46，67和68)的結果與基因圖板中的基因結果相關。也就是說，對于基因圖板中在24小時比肝切除前表達升高的基因，由于施用了L-丙氨酸，因而觀察到超出其表達的表達增加，相反，對于基因圖板中在24小時比肝切除前表達降低的基因，由于施用了L-丙氨酸，因而觀察到降低其表達的表達減少。
對于除上述基因之外的兩種(Nos.5和117)，在24小時，基因圖板中基因的表達變化未因施用L-丙氨酸而升高或降低。但對于No.5，由于在最大表達時間(6hr和1hr)施用了L-丙氨酸，因而觀察到表達升高。結果，可以解釋為在24hr維持表達高于基因圖板中基因的表達。另一方面，由于與未施用L-丙氨酸相比，施用了L-丙氨酸的No.117在24小時表現(xiàn)出降低的變化(表達降低)，說明其不適于用于篩選候選的肝再生加速物質。
表4

根據(jù)上述結果可以認為在應用本發(fā)明的基因圖板進行的篩選中，如果某物質引起約6種基因表達顯著改變(3倍以上)且所述改變與基因圖板中的基因相關(基因圖板中表達升高的基因表達進一步升高，表達降低的基因表達進一步降低)，則該物質可被選作加速肝再生的候選物質。
實施例2通過Tagman PCR(SYBR Green)對肝再生過程中L-丙氨酸代謝所涉及的基因進行的表達分析用與上述<1>和<2>相同的方式，由大鼠部分肝切除后第0，1，6，24，48和168小時的剩余肝(再生肝)中純化總RNA，利用Taqman PCR(SYBR Green)方法測定不同基因的表達水平變化。
(1)模板的制備利用SuperScript First-Strand Synthesis System for RT-PCR(GIBCO BRL)合成用于Taqman PCR(SYBR Green)的模板的cDNA。將500ng總RNA、1μl的0.5μg/μl Oligo(dT)12-18和1μl的10mMdNTP混合物溶解于DEPC-處理水中，至總體積10μl。在65℃下反應5min，在冰上使反應混合物冷卻，再向混合物中加入2μl 10x RT緩沖液、4μl的25mM MgCl2、2μl的0.1M DTT和1μl RNA酶抑制劑，在42℃下保溫2min。再向反應混合物中加入1μl(50單位)的反轉錄酶(Superscript II RT)，在42℃下反應50min，再在70℃下反應15min。
(2)候選基因的選擇及引物設計對L-丙氨酸代謝所涉及的基因，在肝再生過程中的表達分布圖進行了檢測。為徹底提取L-丙氨酸代謝所涉及的大鼠基因，用與氨基酸轉運、TCA循環(huán)、呼吸鏈和各種載體相關的關鍵詞檢索外部數(shù)據(jù)庫UniGene(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene)，檢索到59種序列已知或可以設計引物的基因。這當中有42種是通過基因芯片法在實施例1中進行了分析的基因。
用外部數(shù)據(jù)庫Primer3(http//www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3-www.cgi)設計出用于Taqman PCR(SYBRGreen)中的引物。這些基因的名稱及Unigene Nos.以及引物的核苷酸序列如表6所示。該表中僅包括Taqman PCR(SYBR Green)分析的結果認為表達發(fā)生改變的基因。
(3)Taqman PCR(SYBR Green)利用SYBR Green方法(Schmittgen TD等，Analytical Biochem.，285，194-204，2000)進行Taqman PCR(SYBR Green)。具體說來反應是如下進行的將具有表5中所示組分的反應混合物在Taqman用PCR管中混合，用ABI 7700 Prism Sequence Detector(ABI)進行PCR。進行一個如下的反應循環(huán)50℃下2min、95℃下10min，然后反應95℃下15sec、60℃1min，重復40次。
表5PCR反應混合物的組分(每管)模板cDNA(相應于2.5ng總RNA) 0.1μl5單位/μl AmpliTaq Gold 0.05μldNTP mix(各2.5mM) 0.8μl25mM MgCl21.2μl10x SYBR緩沖液 1μl引物溶液(正向) 1μl引物溶液(反向) 1μl蒸餾水總共 10μl(3)數(shù)據(jù)分析所有的Taqman PCR(SYBR Green)反應均一式兩份進行，計算循環(huán)閾值(CT)。將CT＝30時的表達水平定義為1，依照下述等式計算相對表達水平，＂CT樣品＂代表所測定基因的CT。
相對表達水平＝2(30-CT樣品)接下來，以β-肌動蛋白的相對表達水平為1000，在此基礎上獲得各基因表達水平的相對值。與正常肝中的表達相比，在再生肝中表達發(fā)生改變的基因的結果如表6所示。值得注意的是，實施例1中所述的那些在再生肝中表達發(fā)生改變的基因中，表1中所示的Nos.81(Rn.29771)和131(Rn.9913)的基因未再現(xiàn)表達的改變。
表6

實施例3在肝再生過程中施用L-丙氨酸，通過Tagman PCR(SYBRGreen)對L-丙氨酸代謝中所涉及的基因進行的表達分析對實施例2中提取的與L-丙氨酸代謝相關的59種大鼠基因，檢測在肝再生過程中施用L-丙氨酸時的表達變化。
(1)再生肝的制備對5只6周齡的F344雄鼠(120g)給予飼料CRF-1(OrientalYeast)和水，進行預飼養(yǎng)6天，然后將其分成兩組(組1和組2)，每組的大鼠體重相同。在解剖24小時前，通過Higgins-Anderson的方法(Higgins，GM and Anderson，RM，Arch.Pathol.12，186-191，19 31)進行70％部分肝切除(左葉和中間葉)。在進行解剖的那一天，解剖6小時前使大鼠斷食。部分肝切除后的18小時和21小時，用含0.3％羧甲基纖維素(CMC)的水溶液口服2g/10ml/kg BW的L-丙氨酸(組1)，以僅口服0.3％羧甲基纖維素(CMC)的大鼠作為對照(組2)。
部分肝切除后24時將大鼠解剖。麻醉下將小鼠放血處死后，提取肝臟，稱重，冷藏，然后通過Taqman PCR(SYBR Green)方法進行mRNA表達測定。
(2)總RNA的純化按照與實施例1中相同的方法，由施用L-丙氨酸組(組1)及對照組(組2)的70％部分肝切除大鼠的殘留肝臟中純化總RNA。
(3)模板的合成用于Taqman PCR(SYBR Green)的模板eDNA采用與實施例2中相同的方法合成。
(4)引物設計用外部數(shù)據(jù)庫Primer3(http//www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3-www.cgi)設計出用于Taqman PCR(SYBRGreen)中的引物。這些基因的名稱及Unigene Nos.以及引物的核苷酸序列如表7所示。該表中僅包括Taqman PCR(SYBR Green)分析的結果認為表達發(fā)生改變的基因。
(5)Taqman PCR(SYBR Green)
Taqman PCR(SYBR Green)用與實施例2中相同的方法進行。
(6)數(shù)據(jù)分析所有的Taqman PCR(SYBR Green)均一式兩份進行，計算循環(huán)閾值(CT)。將CT＝30時的表達水平定義為1，依照下述等式計算相對表達水平。
相對表達水平＝2(30-CT樣品)接下來，以β肌動蛋白的相對表達水平為1000，在此基礎上獲得各基因的表達水平的相對值。由于施用L-丙氨酸而表達水平發(fā)生變化的基因的結果如圖2-4所示。這些基因中，實施例2再生肝中表達有所改變的基因中，在4種(表6中的Nos.139，140和151，以及表7中的No.166)基因也觀察到表達改變。
工業(yè)實用性本發(fā)明提供了有關肝再生的基因的表達信息?？衫眠@些表達信息篩選加速肝再生的藥物等。
表7

序列表<110>味之素株式公社<120>肝再生相關基因的基因圖板<130>B868AYOP1331<140>
<141>2002-03-13<150>JP2001-070940<151>2001-03-13<160>192<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>1cagaatctgt caatcacctt c21<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>2caaccatcac cgcacaagaa 20<210>3<211>19
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>3ggccatattt cgagcatcc 20<210>4<211>
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>4tcctgagcgacttccac<210>5<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>5tggaatttgg cctgaa 16<210>6<211>
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>6ccatttgttcgccaac<210>7
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<221>misc_feature<222>(35)<223>互補鏈具有單鏈DNA“‘3-ctag-5’”，其由該位置按3’→5’方向延伸。
<400>132gtacatattg tcgttagaac gcgtcaatcc atact 35<210>133<211>38<212>DNA<213>人工序列
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<221>misc_feature<222>(38)<223>互補鏈具有單鏈DNA“‘3-ctag-5’”，其由該位置按3’→5’方向延伸。
<400>133gtacatattg tcgttagaac gcgtactcaa tccatact 38<210>134<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
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tgtgcgatcg ttactgcttt 20<210>180<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
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權利要求
1.一種基因圖板，其包括在肝再生過程中肝細胞內與正常狀態(tài)相比表達水平發(fā)生改變的基因的名稱，以及上述基因的表達分布圖。
2.如權利要求1所述的基因圖板，其中，基因表達水平的改變是指與正常狀態(tài)下模型動物中表達水平相比，部分肝切除后的模型動物中表達水平的改變。
3.如權利要求1或2所述的基因圖板，其中，所述表達分布圖包括肝再生全過程的表達分布圖。
4.如權利要求1-3中任意一項所述的基因圖板，其中，所述的基因圖板包括用于分析所述基因表達分布圖的一組PCR引物的序列信息。
5.如權利要求2-4中任意一項所述的基因圖板，其中，所述的模型動物是大鼠。
6.如權利要求1-5中任意一項所述的基因圖板，其中，該基因圖板包括表1、6和7中編號1-166所示的166種基因中的至少6種基因的表達分布圖。
7.如權利要求6所述的基因圖板，其中，至少6種基因選自表1和6中編號1-151所示的151種基因。
8.如權利要求6所述的基因圖板，其中，至少6種基因選自表1和6中編號1-137所示的137種基因。
9.如權利要求6-8中任意一項所述的基因圖板，其中，至少6種基因是表1中編號為5，17，36，46，67和68所示的基因。
10.一種制備基因圖板的方法，該基因圖板包括在肝再生過程中肝細胞內與正常狀態(tài)相比表達水平發(fā)生改變的基因的表達分布圖，該方法包括下述步驟(a)測定正常狀態(tài)模型動物的肝細胞中各種基因的表達水平和肝再生過程中該基因的表達水平；(b)將測得的表達水平分別進行比較；和(c)鑒定在肝再生過程中表達水平發(fā)生改變的一組基因，由所獲得的有關基因名稱和表達水平變化信息制備表達分布圖。
11.如權利要求10中所述的方法，其中，在步驟(a)中分析肝再生全過程的基因表達水平。
12.如權利要求11中所述的方法，其中，在肝再生之前、之中或之后施用加速肝再生的物質。
13.如權利要求12中所述的方法，其中，所述的加速肝再生的物質是L-丙氨酸。
14.如權利要求10-13中任意一項所述的方法，其中，基因表達水平通過選自下述的一種或多種方法進行分析，所述方法為基因芯片法、ATAC-PCR法和Taqman PCR(SYBR Green)法。
15.如權利要求14中所述的方法，其中，利用基因芯片法和ATAC-PCR方法分析基因表達水平。
16.如權利要求14中所述的方法，其中，利用Taqman PCR(SYBRGreen)方法分析基因表達水平。
17.一種篩選與肝再生有關的藥物的方法，該方法包括將某種藥物施用于模型動物、肝組織或細胞，并繪制構成權利要求1中所述基因圖板的基因的表達分布圖。
18.一種評價肝狀態(tài)的方法，該方法包括針對受試者的肝，繪制構成權利要求1中所述基因圖板的基因的表達分布圖。
19.一組引物，其可用于制備如權利要求10所述的基因圖板的方法、用于如權利要求17中所述的篩選方法或用于如權利要求18所述的評價方法，該引物包括SEQ ID NOS1-127和135-192中的全部或部分寡核苷酸。
全文摘要
一種基因圖板，包括在肝再生過程中肝細胞內與正常狀態(tài)相比表達水平發(fā)生改變的一組基因，其通過下述步驟制備(a)測定正常狀態(tài)模型動物的肝細胞中各種基因的表達水平和肝再生過程中該基因的表達水平；(b)將測得的表達水平分別進行比較；和(c)鑒定在肝再生過程中表達水平發(fā)生改變的一組基因。
文檔編號G01N33/50GK1509331SQ0280980
公開日2004年6月30日 申請日期2002年3月13日 優(yōu)先權日2001年3月13日
發(fā)明者橫屋史彥, 久, 奧津倫久, 之, 森妹子, 夫, 高原義之, 幸, 福田尚夫, 油谷浩幸, 郎, 惣中一郎 申請人:味之素株式會社