專(zhuān)利名稱(chēng)：利用vsv－g假型化猴免疫缺陷病毒載體將基因?qū)腱`長(zhǎng)類(lèi)胚胎干細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于將基因?qū)腱`長(zhǎng)類(lèi)胚胎干細(xì)胞的猴免疫缺陷病毒載體。
背景技術(shù)：
胚胎干細(xì)胞(以下稱(chēng)為ES細(xì)胞)是具有自主復(fù)制能力的多能性未分化細(xì)胞。已知在受傷后ES細(xì)胞具有組織修復(fù)能力，因此，ES細(xì)胞可以用于篩選各種疾病的治療物質(zhì)和再生醫(yī)療領(lǐng)域，目前被廣泛研究。與小鼠ES細(xì)胞相比，猴ES細(xì)胞更接近于人的ES細(xì)胞，因此有望適用于人的疾病模型。
ES細(xì)胞的遺傳工程對(duì)其將來(lái)應(yīng)用于各種疾病和損傷的治療極其重要。為了改變ES細(xì)胞的增殖能力或分化能力等特性，或藥物敏感性，往往需要對(duì)ES細(xì)胞的基因組進(jìn)行穩(wěn)定的基因?qū)?。為了?shí)現(xiàn)穩(wěn)定的基因?qū)?，一般采用整合到宿主基因組的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，這是因?yàn)楫?dāng)以ES細(xì)胞等反復(fù)進(jìn)行增殖和分化的細(xì)胞為靶時(shí)，如果導(dǎo)入基因不整合到基因組中，則載體會(huì)隨每個(gè)細(xì)胞的分裂而被稀釋。來(lái)自Moloney鼠白血病病毒(MoMLV)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體以往被廣泛用于基因?qū)?，但是，在?duì)小鼠ES細(xì)胞的基因?qū)胫行实拖?約為百分之幾)，并且基因表達(dá)隨時(shí)間而減弱。最近，用來(lái)自小鼠干細(xì)胞病毒(MSCV)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體對(duì)小鼠ES細(xì)胞進(jìn)行基因?qū)?，其?dǎo)入效率得到改善(50％以上)，但基因表達(dá)隨時(shí)間而減弱的問(wèn)題仍未得到解決(Cherry，S.R.等，Mol.Cell Biol.207419，2000)。最近有報(bào)告表明，采用整合到基因組中的另一個(gè)載體——慢病毒載體可以更高效地(80％以上)將基因?qū)胄∈驟S細(xì)胞(Hamaguchi，I.等，J.Virol.7410778，2000)，但在該報(bào)告中，對(duì)導(dǎo)入基因的表達(dá)只進(jìn)行了數(shù)天～約兩周的短時(shí)間觀察，也沒(méi)有任何有關(guān)導(dǎo)入基因長(zhǎng)期表達(dá)的記載。
上述對(duì)ES細(xì)胞進(jìn)行基因?qū)氲膱?bào)告中，都采用了小鼠ES細(xì)胞。至今尚無(wú)關(guān)于將基因?qū)腱`長(zhǎng)類(lèi)ES細(xì)胞的報(bào)告文獻(xiàn)，只有學(xué)術(shù)會(huì)議上的報(bào)告指出靈長(zhǎng)類(lèi)ES細(xì)胞的基因?qū)氡刃∈驟S細(xì)胞的基因?qū)敫щy。例如，用MoMLV載體時(shí)靈長(zhǎng)類(lèi)ES細(xì)胞的基因?qū)胄蕿?％左右，用MSCV載體時(shí)為5～10％左右(IMSUT Symposium for Stem Cell Biology，Tokyo，Japan2000；Key Stone Sympoia，Pluripotent Stem CellsBiology and Applications，Durango，Colorado，USA，2001)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供用于靈長(zhǎng)類(lèi)ES細(xì)胞基因?qū)氲暮锩庖呷毕莶《据d體。本發(fā)明載體介導(dǎo)的靈長(zhǎng)類(lèi)ES細(xì)胞基因?qū)肟梢杂糜谌说褥`長(zhǎng)類(lèi)的胚胎學(xué)研究、疾病研究、臨床應(yīng)用和實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷取Ａ硗?，該方法還可以用于分析或篩選用于進(jìn)行組織或細(xì)胞特異性分化的基因或試劑，所述特異性分化對(duì)從ES細(xì)胞獲得所需的分化細(xì)胞或分化組織有用。
本發(fā)明人研究開(kāi)發(fā)了一種可以將基因?qū)腱`長(zhǎng)類(lèi)ES細(xì)胞的載體。為了建立一種通過(guò)該載體高效地將外源基因?qū)腱`長(zhǎng)類(lèi)ES細(xì)胞的方法，對(duì)猴免疫缺陷病毒(SIV)載體進(jìn)行了悉心研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用VSV-G蛋白假型化的SIV載體具有明顯高效地將基因?qū)腱`長(zhǎng)類(lèi)ES細(xì)胞的能力，其中VSV-G蛋白是水泡性口炎病毒(VSV)的表面糖蛋白。VSV-G假型化SIV載體對(duì)猴ES細(xì)胞的基因?qū)胄时刃∈驟S細(xì)胞高數(shù)倍～10倍以上(圖8)。SIV載體介導(dǎo)的ES細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率隨感染復(fù)數(shù)(MOI)增加，當(dāng)MOI很高時(shí)，基因被導(dǎo)入到幾乎所有的ES細(xì)胞(圖5)。將一種包含連接在CMV啟動(dòng)子下游的報(bào)告基因的SIV載體導(dǎo)入Cynomolgus猴的ES細(xì)胞，在較長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi)，所導(dǎo)入的基因穩(wěn)定表達(dá)，即使是兩個(gè)月后表達(dá)水平也基本沒(méi)有下降(圖6)。
因此，本發(fā)明人研究開(kāi)發(fā)了可以將基因?qū)腱`長(zhǎng)類(lèi)ES細(xì)胞的假型化SIV載體，并且成功建立了一種用該載體將基因?qū)腱`長(zhǎng)類(lèi)ES細(xì)胞的方法。本發(fā)明涉及用于靈長(zhǎng)類(lèi)ES細(xì)胞基因?qū)氲暮锩庖呷毕莶《据d體，更具體地，本發(fā)明涉及(1)用于將基因?qū)腱`長(zhǎng)類(lèi)胚胎干細(xì)胞的重組猴免疫缺陷病毒載體，該載體被VSV-G假型化；(2)如(1)所述的載體，其中重組猴免疫缺陷病毒載體來(lái)自agm株；(3)如(1)或(2)所述的載體，其中重組猴免疫缺陷病毒載體為自我失活型；
(4)如(1)～(3)中任意一項(xiàng)所述的載體，其中靈長(zhǎng)類(lèi)為舊世界靈長(zhǎng)類(lèi)獼猴科獼猴屬；(5)如(1)～(4)中任意一項(xiàng)所述的載體，其帶有可以表達(dá)的外源基因；(6)如(5)所述的載體，其中外源基因?yàn)榫幋a選自綠色熒光蛋白、β-半乳糖苷酶和螢光素酶的蛋白質(zhì)的基因；(7)將基因?qū)腱`長(zhǎng)類(lèi)胚胎干細(xì)胞的方法，其包括使(1)～(6)中任意一項(xiàng)所述的重組猴免疫缺陷病毒載體與靈長(zhǎng)類(lèi)胚胎干細(xì)胞接觸的步驟；(8)導(dǎo)入了(1)～(6)中任意一項(xiàng)所述的重組猴免疫缺陷病毒載體的靈長(zhǎng)類(lèi)胚胎干細(xì)胞；(9)由(8)所述的靈長(zhǎng)類(lèi)胚胎干細(xì)胞增殖和/或分化生成的細(xì)胞；(10)一種檢測(cè)基因?qū)雽?duì)ES細(xì)胞增殖和/或分化的效果的方法，該方法包括(a)將(1)～(6)中任意一項(xiàng)所述的重組猴免疫缺陷病毒載體導(dǎo)入靈長(zhǎng)類(lèi)胚胎干細(xì)胞的步驟；(b)檢測(cè)該胚胎干細(xì)胞的增殖或分化的步驟。
本發(fā)明中“病毒載體”是指能夠?qū)⒑怂岱肿訉?dǎo)入宿主的病毒粒子。“猴免疫缺陷病毒(SIV)載體”是指具有SIV骨架的載體?！熬哂蠸IV骨架”是指構(gòu)成該載體的病毒粒子中包含的核酸分子以SIV基因組為基礎(chǔ)。例如，當(dāng)病毒粒子中的核酸分子包含來(lái)自SIV基因組的包裝信號(hào)序列時(shí)，這樣的載體包括在本發(fā)明的SIV病毒載體之內(nèi)。本發(fā)明中，猴免疫缺陷病毒(SIV)包括所有的SIV株及其亞型。SIV分離株包括但不限于SIVagm、SIVcpz、SIVmac、SIVmnd、SIVsm、SIVsnm和SIVsyk?！爸亟M”病毒載體是指利用基因重組技術(shù)構(gòu)建的病毒載體。用編碼病毒基因組的DNA和包裝細(xì)胞構(gòu)建的病毒載體包括在重組病毒載體之內(nèi)。
“VSV-G假型化載體”是指包含VSV-G蛋白的載體，VSV-G蛋白是水泡性口炎病毒(VSV)的表面糖蛋白。VSV-G蛋白可以是來(lái)自任何VSV株的蛋白，例如可以用來(lái)自Indiana血清型株(J.Virology 39519-528(1981))的VSV-G蛋白，但不限于此。另外，VSV-G蛋白也可以是天然蛋白質(zhì)通過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、缺失和/或添加等得到的修飾物。VSV-G假型化載體可以通過(guò)在病毒產(chǎn)生時(shí)使VSV-G蛋白與之共存來(lái)制備。例如，通過(guò)VSV-G表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染，或通過(guò)誘導(dǎo)整合到宿主染色體DNA中的VSV-G基因的表達(dá)，使包裝細(xì)胞內(nèi)的VSV-G表達(dá)，由此使包裝細(xì)胞產(chǎn)生的病毒粒子用VSV-G假型化。VSV-G蛋白以穩(wěn)定的糖蛋白同型三聚體的形式存在于膜上，因此，在純化過(guò)程中載體粒子不容易被破壞，可以通過(guò)離心濃縮成高濃度(Yang，Y.等，Hum Gene TherSep，6(9)，1203-13.1995)。
本發(fā)明的假型化逆轉(zhuǎn)錄病毒載體還可以包括來(lái)自其它病毒的包膜蛋白。例如，來(lái)自感染人細(xì)胞的病毒的包膜蛋白適于用作這種蛋白。這樣的蛋白質(zhì)包括但不限于兼嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜蛋白。作為兼嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜蛋白，可以用例如來(lái)自小鼠白血病病毒(MuLV)4070A株的包膜蛋白，也可以用來(lái)自MuMLV 10A1的包膜蛋白(例如pCL-10A1(Imgenex)(Naviaux，R.K.等，J.Virol.705701-5705(1996))。另外，還包括來(lái)自皰疹病毒科的蛋白，例如單純皰疹病毒的gB、gD、gH和gp85蛋白和EB病毒的gp350和gp220蛋白等；嗜肝DNA病毒科的蛋白，包括例如乙型肝炎病毒的S蛋白等。
猴免疫缺陷病毒作為猴的HIV樣病毒被發(fā)現(xiàn)，與HIV一起構(gòu)成靈長(zhǎng)類(lèi)慢病毒組(E.Ido和M.Hayamizu，“Gene，Infection and Pathogenicity of SimianImmunodeficiency Virus”，Protein，Nucleic acid and Enzyme，Vol.39，No.8，1994)。該組進(jìn)一步被大致分為4個(gè)亞組(1)HIV-1組，包括HIV-1和從黑猩猩分離的SIVcpz，其中HIV-1是人獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)的原因；(2)HIV-2組，包括從白領(lǐng)白眉猴(Sooty Mangabeys，Cercocebus atys)分離的SIVsmm和從獼猴(Macaca mulatta)分離的SIVmac，以及對(duì)人致病性較低的HIV-2(Jaffar，S.等，J.Acquir.Immune Defic.Syndr.Hum.Retrovirol.，16(5)，327-32，1997)；(3)SIVagm組，以從非洲綠猴(Cercopithecus aethiops)分離的SIVagm為代表；和(4)SIVmnd組，以從山魈(Papio sphinx)分離的SIVmnd為代表。
迄今無(wú)人報(bào)道SIVagm和SIVmnd在自然宿主中的致病性(Ohta，Y.等，Int.J.Cancer，15，41(1)，115-22，1988；Miura，T.等，J.Med.Primatol.，18(3-4)，255-9，1989；M.Hayamizu，Nippon Rinsho，47，1，1989)。更具體地，有關(guān)感染實(shí)驗(yàn)的報(bào)道提示，SIVagm病毒的TYO-1株(本發(fā)明實(shí)施例中也用到它)除了對(duì)其天然宿主不具有致病性以外，對(duì)食蟹猴(Macaca facicularis)和獼猴(Macaca mulatta)也不表現(xiàn)致病性(Ali，M.等，Gene Therapy，1(6)，367-84，1994；Honjo，S等J.Med.Primatol.，19(1)，9-20，1990)。尚沒(méi)有任何有關(guān)SIVagm對(duì)人感染和致病的報(bào)告，因此不清楚其致病性，但一般說(shuō)來(lái)，靈長(zhǎng)類(lèi)慢病毒的種特異性高，從自然宿主跨種感染或致病的例子很少，有發(fā)病率低、疾病進(jìn)展慢的傾向(Novembre，F(xiàn).J.等，J.Virol.，71(5)，4086-91，1997)。因此，認(rèn)為以SIVagm、特別是SIVagm TYO-1株為基礎(chǔ)制備的病毒載體比以HIV-1或其它慢病毒為基礎(chǔ)制備的載體安全性高，優(yōu)選用于本發(fā)明。
本發(fā)明的猴免疫缺陷病毒載體可以包含來(lái)自其它慢病毒的部分基因組RNA序列。例如，本發(fā)明的猴免疫缺陷病毒載體還包括含有嵌合序列的載體，所述嵌合序列是用人免疫缺陷病毒(HIV)、貓免疫缺陷病毒(FIV)(Poeschla，E.M.等，Nature Medicine，4(3)，354-7，1998)或山羊關(guān)節(jié)炎腦炎病毒(CAEV)(Mselli-Lakhal，L.等，Arch.Virol.，143(4)，681-95，1998)等其它慢病毒的部分基因組序列取代猴免疫缺陷病毒的部分基因組而形成的。
本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)也可以被修飾。LTR是逆轉(zhuǎn)錄病毒的特征序列，存在于病毒基因組的兩端。5’LTR起啟動(dòng)子的作用，促進(jìn)原病毒mRNA的轉(zhuǎn)錄。因此，如果將基因轉(zhuǎn)移載體中具有5’LTR啟動(dòng)子活性的部分用其它活性更強(qiáng)的啟動(dòng)子取代，則有可能增大基因轉(zhuǎn)移載體的mRNA轉(zhuǎn)錄量，提高包裝效率和載體滴度，其中所述基因轉(zhuǎn)移載體編碼包裝在病毒粒子內(nèi)的病毒RNA基因組。進(jìn)一步地，例如當(dāng)為慢病毒時(shí)，已知病毒蛋白tat增強(qiáng)5’LTR的轉(zhuǎn)錄活性，因此，用不依賴(lài)于tat蛋白的啟動(dòng)子取代5’LTR可以從包裝載體刪除tat。感染細(xì)胞或侵入到細(xì)胞內(nèi)的病毒RNA在逆轉(zhuǎn)錄后，將兩端的LTR連接成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，連接部位與病毒整合酶結(jié)合，然后整合到細(xì)胞染色體內(nèi)。被轉(zhuǎn)錄的原病毒mRNA是從5’LTR轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)到下游的3’LTR polyA序列，5’LTR啟動(dòng)子部分沒(méi)有包裝到病毒內(nèi)。因此，即使啟動(dòng)子被其它序列取代，整合到靶細(xì)胞染色體中的部分不會(huì)發(fā)生變化?；谝陨鲜聦?shí)，認(rèn)為5’LTR啟動(dòng)子的取代與制備安全性高的高滴度載體有關(guān)。因此，基因轉(zhuǎn)移載體5’末端啟動(dòng)子的取代可以提高被包裝載體的滴度。
另外，通過(guò)部分刪除3’LTR序列制備自我失活型載體(SIN載體)，可以防止全長(zhǎng)載體mRNA在靶細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄，從而提高安全性。侵入到靶細(xì)胞染色體的慢病毒原病毒將其5’末端結(jié)合到3’LTR的U3部分。因此，在逆轉(zhuǎn)錄后，基因轉(zhuǎn)移載體的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物整合到靶細(xì)胞的染色體中，使U3部分處于5’末端。從此點(diǎn)開(kāi)始RNA的轉(zhuǎn)錄，該RNA的結(jié)構(gòu)與基因轉(zhuǎn)移載體的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物相似。如果靶細(xì)胞內(nèi)存在慢病毒或相關(guān)蛋白，被轉(zhuǎn)錄的RNA可能被重新包裝并感染其它細(xì)胞。另外，還有一種可能就是3’LTR啟動(dòng)子可能表達(dá)位于病毒基因組3’末端的宿主基因(Rosenberg，N.，Jolicoeur，P.，RetroviralPathogenesis.Retroviruses.Cold Spring Harbor Laboratory Press，475-585，1997)。這種現(xiàn)象已被視為逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的一個(gè)問(wèn)題，目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)出SIN載體以避免此類(lèi)問(wèn)題(Yu，S.F.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83(10)，3194-8，1986)。當(dāng)基因轉(zhuǎn)移載體上3’LTR的U3部分缺失時(shí)，靶細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有5’LTR和3’LTR的啟動(dòng)子，因此全長(zhǎng)RNA和宿主基因不進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。并且，由于只從內(nèi)部啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄目的基因，有望獲得安全性高并且能夠高表達(dá)的載體。這樣的載體在本發(fā)明中是優(yōu)選的。SIN載體可以通過(guò)公知的方法或?qū)嵤├?～4的方法構(gòu)建。
利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體等在基因組中包含LTR序列的病毒載體進(jìn)行基因治療的問(wèn)題之一是導(dǎo)入基因的表達(dá)逐漸降低，其中一個(gè)原因是這些載體整合到宿主基因組后，宿主機(jī)制使LTR發(fā)生甲基化，抑制導(dǎo)入基因的表達(dá)(Challita，P.M.and Kohn，D.B.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 912567，1994)。自我失活型(SIN型)載體在整合到宿主基因組后失去大部分的LTR序列，因此有難于出現(xiàn)因LTR甲基化而導(dǎo)致基因表達(dá)減弱的優(yōu)點(diǎn)。根據(jù)實(shí)施例可知，將基因轉(zhuǎn)移載體中的3’LTRU3區(qū)域用其它啟動(dòng)子序列取代而制備的自我失活型載體在導(dǎo)入靈長(zhǎng)類(lèi)ES細(xì)胞后能持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)兩個(gè)月以上。因此，通過(guò)修飾LTR U3區(qū)域而設(shè)計(jì)成自我失活型的SIN載體特別適用于本發(fā)明。具體地，通過(guò)取代、缺失和/或添加3’LTR U3區(qū)域的一個(gè)或多個(gè)核苷酸而被修飾的載體包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)?？梢詥渭兊厝笔3區(qū)域，或者在該區(qū)域插入其它的啟動(dòng)子。該啟動(dòng)子包括例如CMV啟動(dòng)子、EF1啟動(dòng)子和CAG啟動(dòng)子等。
另外，本發(fā)明載體編碼的外源基因優(yōu)選設(shè)計(jì)成可以通過(guò)LTR以外的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄。例如，如上所述，將LTR U3區(qū)域用非LTR啟動(dòng)子取代時(shí)，優(yōu)選該修飾的LTR驅(qū)動(dòng)外源基因的表達(dá)?；蛘撸鐚?shí)施例中所述，通過(guò)在LTR區(qū)域以外的位置設(shè)置非LTR啟動(dòng)子，并在該位置的下游連接外源基因，可以不依賴(lài)于LTR而誘導(dǎo)外源基因的表達(dá)。本發(fā)明中，構(gòu)建成通過(guò)非LIR啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)外源基因表達(dá)的SIV載體在ES細(xì)胞中長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定地表達(dá)該外源基因。因此，在外源基因上游連接非LTR啟動(dòng)子、使該外源基因通過(guò)該啟動(dòng)子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，這樣的載體特別適用于本發(fā)明。非LTR啟動(dòng)子包括例如CMV啟動(dòng)子、EF1啟動(dòng)子和CAG啟動(dòng)子，特別優(yōu)選CMV啟動(dòng)子。這樣的載體特別是當(dāng)以上述自我失活(SIN)型載體為基礎(chǔ)構(gòu)建時(shí)其效率很高。
有人指出，HIV載體為代表的慢病毒載體的危險(xiǎn)性在于，如果宿主基因組已經(jīng)帶有HIV原病毒，外來(lái)載體與內(nèi)源性原病毒之間會(huì)發(fā)生重組，從而產(chǎn)生可復(fù)制的病毒。這可能是將來(lái)在實(shí)際中將HIV載體用于HIV患者時(shí)的一大問(wèn)題。本發(fā)明使用的SIV載體基本上沒(méi)有與HIV同源的序列，并且其中80.6％的病毒序列已被去除，因此是不能復(fù)制的病毒，上述危險(xiǎn)性小，與其它慢病毒載體相比安全性高。本發(fā)明的SIV載體為優(yōu)選去除40％以上、更優(yōu)選50％以上、進(jìn)一步優(yōu)選60％以上、再進(jìn)一步優(yōu)選70％以上、最優(yōu)選80％以上原SIV基因組序列的不能復(fù)制的病毒。
逆轉(zhuǎn)錄病毒可以如下產(chǎn)生在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄具有包裝信號(hào)的基因轉(zhuǎn)移載體DNA，在gag、pol蛋白和包膜蛋白的存在下形成病毒粒子。基因轉(zhuǎn)移載體DNA編碼的包裝信號(hào)序列優(yōu)選具有足夠的長(zhǎng)度以保持由該序列形成的結(jié)構(gòu)。另一方面，為了抑制野生型病毒的出現(xiàn)頻率，必須將這些載體之間的重疊序列保持在最小限度，所述野生型表達(dá)由該載體DNA上的包裝信號(hào)與提供gag和pol蛋白的包裝載體之間的重組引起。因此，在構(gòu)建基因轉(zhuǎn)移載體DNA時(shí)，為了同時(shí)確保包裝效率和安全性，優(yōu)選使用盡可能短而又包含包裝所必需的序列的序列。
例如，實(shí)施例中所用的來(lái)自SIVagm的包裝載體，由于HIV載體沒(méi)有被包裝，因此所用信號(hào)的來(lái)源不限于SIV。但是，當(dāng)采用來(lái)自HIV的包裝載體時(shí)，來(lái)自SIV的基因轉(zhuǎn)移載體也被包裝，因此，為了降低重組病毒的出現(xiàn)頻率，可以將來(lái)自不同慢病毒的基因轉(zhuǎn)移載體和包裝載體重組形成載體粒子。這樣制備的SIV載體也包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)。在這種情況下，優(yōu)選用靈長(zhǎng)類(lèi)慢病毒之間的重組(例如HIV和SIV)。
在基因轉(zhuǎn)移載體DNA中，優(yōu)選修飾gag蛋白使其不能表達(dá)。病毒gag蛋白可能被機(jī)體視為異物而表現(xiàn)出抗原性，還可能影響細(xì)胞的機(jī)能。為了使gag蛋白不表達(dá)，可以進(jìn)行如下修飾在gag起始密碼子的下游添加或缺失堿基，由此導(dǎo)致移碼。優(yōu)選缺失gag蛋白的部分編碼區(qū)。一般來(lái)說(shuō)，gag蛋白5’端的編碼區(qū)對(duì)病毒包裝是必需的。因此，在基因轉(zhuǎn)移載體中優(yōu)選缺失gag蛋白C末端的編碼區(qū)。在不給包裝效率造成很大影響的范圍內(nèi)，優(yōu)選缺失盡可能大的gag編碼區(qū)。另外，還優(yōu)選將gag蛋白的起始密碼子(ATG)用ATG以外的密碼子進(jìn)行取代。取代密碼子可以適當(dāng)選擇對(duì)包裝效率影響小的密碼子。將按照上述方法構(gòu)建的帶有包裝信號(hào)的基因轉(zhuǎn)移載體DNA導(dǎo)入適當(dāng)?shù)陌b細(xì)胞中，由此可以產(chǎn)生病毒載體。產(chǎn)生的病毒載體可以從例如包裝細(xì)胞的培養(yǎng)上清中回收。
對(duì)用作包裝細(xì)胞的細(xì)胞沒(méi)有特殊限制，只要是通常用于產(chǎn)生病毒的細(xì)胞株即可。從用于人基因治療的方面考慮，認(rèn)為來(lái)自人和猴的細(xì)胞合適?？梢杂米靼b細(xì)胞的人細(xì)胞株包括例如293細(xì)胞、293T細(xì)胞、293EBNA細(xì)胞、SW480細(xì)胞、u87MG細(xì)胞、HOS細(xì)胞、C8166細(xì)胞、MT-4細(xì)胞、Molt-4細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、HT1080細(xì)胞和TE671細(xì)胞等；猴細(xì)胞株包括例如COS1細(xì)胞、COS7細(xì)胞、CV-1細(xì)胞和BMT10細(xì)胞等。
對(duì)插入載體中的外源基因的種類(lèi)沒(méi)有特別限制，可以是編碼蛋白質(zhì)的核酸，也可以是反義核酸和核酶等不編碼蛋白質(zhì)的核酸。該基因可以是天然或人工設(shè)計(jì)的序列。人工蛋白質(zhì)包括例如與其它蛋白質(zhì)的融合蛋白、顯性陰性蛋白(包括可溶性受體分子和膜結(jié)合型顯性陰性受體)、缺失型細(xì)胞粘附分子和可溶性細(xì)胞表面分子等。另外，外源基因也可以是用于評(píng)價(jià)基因?qū)胄屎捅磉_(dá)穩(wěn)定性等的標(biāo)記基因。標(biāo)記基因包括例如編碼綠色熒光蛋白(以下稱(chēng)為“GFP”)、β-半乳糖苷酶和螢光素酶等的基因，特別優(yōu)選編碼GFP的基因。
本發(fā)明的假型化病毒載體可以被基本上純化。純化可以通過(guò)過(guò)濾器過(guò)濾、離心分離和柱提純等公知的純化、分離方法進(jìn)行。例如，將載體溶液用0.45μm的過(guò)濾器過(guò)濾后，在42500×g、4℃的條件下離心90分鐘，由此沉淀、濃縮載體。
本發(fā)明的假型化逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以根據(jù)需要適當(dāng)與所需的可藥用載體或介質(zhì)組合制成組合物?！翱伤幱幂d體”是指可以與載體一起施用并且不明顯阻礙載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的材料。具體地，可以適當(dāng)與例如滅菌水、生理鹽水、培養(yǎng)液、血清和磷酸緩沖生理鹽水(PBS)等組合，還可以與穩(wěn)定劑、殺菌劑等組合。含有本發(fā)明假型化逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的組合物可以用作試劑或藥物，例如可以將本發(fā)明的組合物用作ES基因?qū)朐噭┗蚧蛑委熕幬铩?br> 使本發(fā)明的載體與靈長(zhǎng)類(lèi)(包括人)的ES細(xì)胞接觸，由此可以將包含該載體的核酸導(dǎo)入所述ES細(xì)胞中。本發(fā)明涉及將基因?qū)腱`長(zhǎng)類(lèi)ES細(xì)胞的方法，該方法包括使本發(fā)明載體與所述ES細(xì)胞接觸的步驟。另外，本發(fā)明涉及經(jīng)VSV-G假型化的重組猴免疫缺陷病毒載體在靈長(zhǎng)類(lèi)ES細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移中的用途。對(duì)作為導(dǎo)入對(duì)象的靈長(zhǎng)類(lèi)ES細(xì)胞沒(méi)有特別限制，可以采用例如所需的猴ES細(xì)胞。已知世界上大約有200種猴，高等靈長(zhǎng)類(lèi)大致分為以下兩類(lèi)(1)新世界靈長(zhǎng)類(lèi)(New World primates)狨猴(Callithrix jacchus)是公知的實(shí)驗(yàn)用靈長(zhǎng)類(lèi)之一。新世界靈長(zhǎng)類(lèi)的胚胎和胎盤(pán)結(jié)構(gòu)與舊世界靈長(zhǎng)類(lèi)不同，但兩者的發(fā)育基本上類(lèi)似。
(2)舊世界靈長(zhǎng)類(lèi)(Old World Primates)舊世界靈長(zhǎng)類(lèi)是與人極其近緣的靈長(zhǎng)類(lèi)，已知有獼猴(Macaca mulatta)和cynomolgus猴(食蟹猴Macaca fascicularis)。日本猴(Macaca fuscata)與cynomolgus猴同屬(獼猴屬)。舊世界靈長(zhǎng)類(lèi)的發(fā)育與人極其相似。
本發(fā)明中的“猴”是指靈長(zhǎng)類(lèi)，具體指新世界靈長(zhǎng)類(lèi)和舊世界靈長(zhǎng)類(lèi)。對(duì)用本發(fā)明載體進(jìn)行基因?qū)氲膶?dǎo)入對(duì)象——猴ES細(xì)胞沒(méi)有特別限制，包括狨猴ES細(xì)胞(Thomson，J.A.等，Biol.Reprod.55，254-259，(1996))、獼猴ES細(xì)胞(Thomson，J.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92，7844-7848，(1995))和cynomolgus猴ES細(xì)胞(參見(jiàn)實(shí)施例)等。舊世界靈長(zhǎng)類(lèi)是與人極其近緣的靈長(zhǎng)類(lèi)，并且其發(fā)育與人類(lèi)似，因此有望用作與人接近的疾病模型或多種疾病治療劑的篩選系統(tǒng)。因此，作為本發(fā)明載體的導(dǎo)入對(duì)象，優(yōu)選來(lái)自舊世界靈長(zhǎng)類(lèi)，特別優(yōu)選來(lái)自日本猴、獼猴和cynomolgus猴等獼猴屬猴的ES細(xì)胞。
靈長(zhǎng)類(lèi)ES細(xì)胞的制備可以按照公知的方法或?qū)嵤├械姆椒ㄟM(jìn)行。例如，可以從發(fā)育的胚泡獲取ES細(xì)胞(參照例如WO 96/22362)。具體地，例如可將從胚泡獲得的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(inner cell mass)在飼養(yǎng)細(xì)胞上培養(yǎng)或用白血病抑制因子(LIF，也稱(chēng)作分化抑制因子(DIF))進(jìn)行培養(yǎng)，由此建立ES細(xì)胞。
飼養(yǎng)細(xì)胞包括來(lái)自妊娠12～16天的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)細(xì)胞、將小鼠胚胎成纖維細(xì)胞株例如STO細(xì)胞等通過(guò)絲裂霉素C或X射線處理所得的細(xì)胞等。來(lái)自小鼠的飼養(yǎng)細(xì)胞可以大量地制備，這有利于實(shí)驗(yàn)。飼養(yǎng)細(xì)胞可以通過(guò)例如后述實(shí)施例中記載的方法等制備。用MEM培養(yǎng)基(Minimum Essential Medium Eagle)將飼養(yǎng)細(xì)胞接種到被明膠覆蓋的培養(yǎng)容器上?？梢允癸曫B(yǎng)細(xì)胞在培養(yǎng)容器充分長(zhǎng)滿。將接種了飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)容器中的MEM培養(yǎng)基更換為ES細(xì)胞培養(yǎng)用的培養(yǎng)基(參照實(shí)施例6表3)，并將上述內(nèi)細(xì)胞團(tuán)接種到該飼養(yǎng)細(xì)胞上。
利用本發(fā)明的載體將基因?qū)腱`長(zhǎng)類(lèi)ES細(xì)胞，可通過(guò)包括使該載體與靈長(zhǎng)類(lèi)ES細(xì)胞接觸的步驟的方法進(jìn)行。具體例如，將要導(dǎo)入基因的ES細(xì)胞接種到被飼養(yǎng)細(xì)胞覆蓋的培養(yǎng)皿上，然后加入SIV載體。此時(shí)，可以通過(guò)同時(shí)添加例如大約8μg/ml Polybrene提高導(dǎo)入效率。以導(dǎo)入時(shí)的MOI(感染復(fù)數(shù)，感染病毒粒子數(shù)/細(xì)胞)為例如0.1～100、優(yōu)選1～100、更優(yōu)選2～50(例如5～10)進(jìn)行導(dǎo)入。通常，不用多次添加載體，添加一次就能把基因?qū)霂缀跞康腅S細(xì)胞。本發(fā)明的載體有即使不用RetroNectinTM也能獲得高基因?qū)胄实膬?yōu)點(diǎn)。
另外，本發(fā)明還涉及導(dǎo)入了本發(fā)明VSV-G假型化病毒載體的靈長(zhǎng)類(lèi)ES細(xì)胞，和，由該細(xì)胞增殖和/或分化產(chǎn)生的細(xì)胞?？梢匀缦抡T導(dǎo)ES細(xì)胞的分化例如加入細(xì)胞因子等公知的分化/增殖因子或胞外基質(zhì)等基質(zhì)、與其它細(xì)胞共培養(yǎng)、移植到個(gè)體內(nèi)等(Hitoshi Niwa“ES cell differentiation fatedecision mechanism”P(pán)rotein，Nucleic acid and Enzyme 452047-2055，2000；Rathjen，P.D.等，Reprod.Fertil.Dev.1031-47，1998)。
例如，誘導(dǎo)來(lái)自胚外組織的細(xì)胞分化的方法列舉如下胚外內(nèi)胚層 胚狀體形成滋養(yǎng)外胚層 抑制Oct-3/4表達(dá)誘導(dǎo)來(lái)自未分化細(xì)胞的細(xì)胞分化的方法可以列舉如下原始外胚層 胚狀體形成HepG2培養(yǎng)上清誘導(dǎo)來(lái)自外胚層的細(xì)胞分化的方法可以列舉如下神經(jīng)細(xì)胞胚狀體形成+視黃酸處理胚狀體形成+bFGF胚狀體形成+視黃酸處理+Sox2陽(yáng)性細(xì)胞的選擇神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞胚狀體形成+視黃酸處理胚狀體形成+bFGF上皮細(xì)胞胚狀體形成誘導(dǎo)來(lái)自神經(jīng)嵴細(xì)胞的細(xì)胞分化的方法可以列舉如下色素細(xì)胞胚狀體形成OP9+ST2+地塞米松+SOL產(chǎn)生類(lèi)固醇的細(xì)胞SF1過(guò)度表達(dá)誘導(dǎo)來(lái)自中胚層的細(xì)胞分化的方法可以列舉如下血細(xì)胞(造血干細(xì)胞)胚狀體形成+IL-3+IL-6+飼養(yǎng)細(xì)胞OP9+飼養(yǎng)細(xì)胞flk1-陽(yáng)性細(xì)胞的選擇血管內(nèi)皮細(xì)胞flk1-陽(yáng)性細(xì)胞的選擇破骨細(xì)胞胚狀體形成+視黃酸處理心肌細(xì)胞胚狀體形成胚狀體形成+αMHC陽(yáng)性細(xì)胞的選擇骨骼肌細(xì)胞 胚狀體形成平滑肌細(xì)胞 胚狀體形成胚狀體形成+DMSO脂肪細(xì)胞胚狀體形成+視黃酸處理+胰島素+T3誘導(dǎo)來(lái)自內(nèi)胚層的細(xì)胞分化的方法可以列舉如下產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞 胚狀體形成通過(guò)本發(fā)明的假型化病毒載體導(dǎo)入了基因的ES細(xì)胞以及由該ES細(xì)胞分化的細(xì)胞、組織和器官等可以用于各種藥物的分析和篩選。例如，可以通過(guò)靈長(zhǎng)類(lèi)ES細(xì)胞的基因?qū)雭?lái)評(píng)價(jià)或篩選使組織或細(xì)胞，特別優(yōu)選來(lái)自靈長(zhǎng)類(lèi)的組織或細(xì)胞進(jìn)行特異性分化的基因或藥物等的效果。本發(fā)明提供使組織或細(xì)胞進(jìn)行特異性分化的基因或藥物的篩選方法。本發(fā)明提供一種檢測(cè)基因?qū)雽?duì)ES細(xì)胞增殖或分化的效果的方法，其包括下述步驟(a)將本發(fā)明的載體導(dǎo)入靈長(zhǎng)類(lèi)ES細(xì)胞的步驟；和(b)檢測(cè)該ES細(xì)胞的增殖或分化的步驟?？梢酝ㄟ^(guò)使本發(fā)明的重組猴免疫缺陷病毒載體與目的靈長(zhǎng)類(lèi)ES細(xì)胞接觸，而將載體導(dǎo)入ES細(xì)胞。ES細(xì)胞的增殖可以通過(guò)線粒體活性測(cè)定(例如細(xì)胞計(jì)數(shù)和MTT分析)等公知的方法進(jìn)行檢測(cè)。ES細(xì)胞的分化可以通過(guò)檢測(cè)公知分化基因的表達(dá)，或者通過(guò)細(xì)胞或組織等的形態(tài)學(xué)或生化學(xué)分析進(jìn)行檢測(cè)(Satoshi Niwa“ES cell differentiation fate decisionmechanism”P(pán)rotein，Nucleic acid and Enzyme 452047-205 5，2000；Rathien，P.D.等，Reprod.Fertil.Dev.1031-47，1998)。導(dǎo)入載體可以攜帶效果待測(cè)的所需外源基因。另外，在檢測(cè)載體本身導(dǎo)入到ES細(xì)胞中的效率時(shí)，可以用不含外源基因的載體，例如作為陰性對(duì)照的情況?？梢杂蒙鲜鰴z測(cè)方法評(píng)價(jià)或篩選能影響靈長(zhǎng)類(lèi)ES細(xì)胞增殖或分化的基因。篩選可以通過(guò)下述方法進(jìn)行該方法繼上述檢測(cè)方法中的步驟(a)和(b)之后，還包括步驟(c)選擇具有調(diào)節(jié)該ES細(xì)胞增殖和分化的活性的導(dǎo)入基因。這樣的篩選方法也包括在上述本發(fā)明的基因?qū)胄Ч麢z測(cè)方法中。
利用上述方法進(jìn)行篩選的一個(gè)例子是篩選使靈長(zhǎng)類(lèi)ES細(xì)胞分化成功能細(xì)胞的基因。
例如，使靈長(zhǎng)類(lèi)ES細(xì)胞分化成胰腺β細(xì)胞時(shí)，基因A、B、C、D和E中的哪種是必需的？哪種組合最有效？還有，按照什么順序?qū)牖蜃詈线m？為了研究這些問(wèn)題，高效并且簡(jiǎn)單地將基因?qū)腱`長(zhǎng)類(lèi)ES細(xì)胞的技術(shù)是有用的。本發(fā)明的載體滿足這樣的要求。例如，構(gòu)建用于表達(dá)基因A、B、C、D和E的本發(fā)明載體，然后將這些基因以各種組合或順序?qū)腱`長(zhǎng)類(lèi)ES細(xì)胞或從它們分化得到的細(xì)胞中。通過(guò)檢測(cè)導(dǎo)入了這些基因的細(xì)胞的分化情況，可以知道基因?qū)氲男Ч?br> 另外，本發(fā)明的載體也可以用于預(yù)測(cè)體內(nèi)施用某種基因進(jìn)行基因治療的副作用。
基因X對(duì)每種器官和組織的毒性或副作用在某種程度上可以通過(guò)對(duì)小鼠或猴施用該基因的實(shí)驗(yàn)掌握。但是，現(xiàn)有的方法不能檢測(cè)出基因X對(duì)每種組織的干細(xì)胞可能造成的所有影響。該基因X可能抑制某些特定組織的干細(xì)胞分化成功能細(xì)胞。例如，抑制肝臟干細(xì)胞的分化時(shí)，其抑制作用首先會(huì)在患有肝炎或接受肝臟切除手術(shù)時(shí)表現(xiàn)出來(lái)。因此，基因X抑制肝臟干細(xì)胞的分化，導(dǎo)致不能進(jìn)行必要的肝臟再生的嚴(yán)重事故。這樣的問(wèn)題在一般的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中未必能預(yù)見(jiàn)到。利用本發(fā)明的載體可以高效地將基因X導(dǎo)入靈長(zhǎng)類(lèi)ES細(xì)胞中，使這種導(dǎo)入了基因的ES細(xì)胞分化成各種組織干細(xì)胞或進(jìn)一步分化成功能細(xì)胞，這樣可以在各個(gè)分化階段檢測(cè)基因X的安全性。
利用本發(fā)明載體進(jìn)行的分析或篩選可以用于靈長(zhǎng)類(lèi)，特別是人或猴的胚胎學(xué)研究、疾病研究、臨床應(yīng)用和實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷?，并且能夠篩選用于獲得所需的分化細(xì)胞或分化組織的基因或試劑。
在上述篩選方法中，ES細(xì)胞特異性分化為所需組織或細(xì)胞的過(guò)程可以，例如以所需組織或細(xì)胞的特異性標(biāo)記的表達(dá)作為指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，例如用組織或細(xì)胞特異性抗原作為上述特異性標(biāo)記。例如，神經(jīng)前體細(xì)胞的標(biāo)記為干蛋白(nestin)等，所述干蛋白是中間纖維。這種特異性標(biāo)記可以用該標(biāo)記的抗體通過(guò)通常使用的ELISA和免疫染色等檢測(cè)，也可以用編碼該標(biāo)記的核酸通過(guò)常規(guī)的RT-PCR和DNA陣列雜交進(jìn)行檢測(cè)。所述“核酸”是指基因組DNA、RNA、mRNA或cDNA等。本發(fā)明范圍內(nèi)包括通過(guò)本篩選法獲得的基因或試劑。
另外，本發(fā)明范圍內(nèi)也包括導(dǎo)入了本發(fā)明假型化逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的ES細(xì)胞以及由該ES細(xì)胞分化產(chǎn)生的分化細(xì)胞或分化組織。所述分化細(xì)胞和分化組織可以通過(guò)觀察上述組織或細(xì)胞的特異性標(biāo)記的表達(dá)和形態(tài)學(xué)特征來(lái)鑒定。
本發(fā)明的病毒載體還可以用于靈長(zhǎng)類(lèi)中任何遺傳性疾病的基因治療。對(duì)治療目標(biāo)的疾病沒(méi)有特殊限制。例如，目標(biāo)疾病及其單一致病基因包括Gaucher病中的β-腦苷脂酶(cerebrosidase)(第20染色體)、血友病中的凝血因子VIII(X染色體)和凝血因子IX(X染色體)、腺苷脫氨酶缺乏癥中的腺苷脫氨酶、苯丙酮酸尿癥中的苯丙氨酸羥化酶(第12染色體)、Duchenne氏肌營(yíng)養(yǎng)不良中的肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白(X染色體)、家族性高膽固醇血癥中的LDL受體(第19染色體)和囊性纖維癥中的CFTR基因的染色體易位等。被認(rèn)為與上述基因之外的多種基因有關(guān)的目標(biāo)疾病包括阿耳茨海默氏病、帕金森氏病等神經(jīng)變性疾病、缺血性腦病、癡呆或艾滋病等難治性感染病等。
另外，由導(dǎo)入了基因的ES細(xì)胞分化的細(xì)胞、組織和器官可以用于疾病治療。例如，基因缺損或不足導(dǎo)致的疾病可以如下進(jìn)行治療將該基因?qū)腱`長(zhǎng)類(lèi)ES細(xì)胞的染色體中，然后移植到體內(nèi)，由此彌補(bǔ)缺損的基因，彌補(bǔ)(體)循環(huán)中酶、生長(zhǎng)因子等的不足。另外，與器官移植相結(jié)合的基因治療可以通過(guò)將非人動(dòng)物供體的組織相容性抗原變?yōu)槿诵徒M織相容性抗原來(lái)進(jìn)行，由此可以提高異種移植的成功率。
當(dāng)利用本發(fā)明載體進(jìn)行基因?qū)氲腅S細(xì)胞來(lái)自猴時(shí)，通過(guò)將該ES細(xì)胞移植到疾病模型猴的體內(nèi)，可以提供對(duì)人疾病治療有用的模型。作為人的疾病模型，已知有多種疾病模型猴，例如，可以人工制作人帕金森氏病的模型猴，飼養(yǎng)大量天生患有糖尿病的猴作為人糖尿病的忠實(shí)模型，猴SIV感染癥公知作為人HIV感染癥的忠實(shí)模型。對(duì)于這樣的疾病，在將人ES細(xì)胞用于臨床前，作為臨床前實(shí)驗(yàn)，將猴ES細(xì)胞移植到疾病模型猴，這樣的系統(tǒng)是非常有用的。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是一種慢病毒載體系統(tǒng)的示意圖，該系統(tǒng)采用了猴免疫缺陷病毒克隆SIVagmTYO1。
圖2表示SIVagm基因轉(zhuǎn)移載體的結(jié)構(gòu)，其中5’LTR的啟動(dòng)子序列——U3區(qū)域被其它的啟動(dòng)子序列取代。
圖3表示3’LTR U3區(qū)域被其它啟動(dòng)子序列取代的SIVagm基因轉(zhuǎn)移載體的結(jié)構(gòu)，和，預(yù)計(jì)作為該載體在靶細(xì)胞中逆轉(zhuǎn)錄的結(jié)果而產(chǎn)生的5’LTR U3啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)構(gòu)。
圖4表示包含EGFP作為報(bào)告基因的SIN載體(pGCL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVEGFP/3’LTRΔU3)(也簡(jiǎn)稱(chēng)為“SIN-GFP/SIV”或“SIN CMVEGFP”)的結(jié)構(gòu)。通過(guò)除去3’U3，獲得自我失活載體(SIV載體)。
圖5表示在用SIV載體導(dǎo)入了EGFP基因的ES細(xì)胞(CMK-1株)中，EGFP表達(dá)的時(shí)間過(guò)程。橫軸表示基因?qū)氘?dāng)天(第0天)后的天數(shù)，縱軸表示CMK-1中EGFP表達(dá)細(xì)胞的比率(％)。CMK-1的基因?qū)胄视脤?shí)施例中記載的“CMK-1基因?qū)胄市Ｕ健庇枰孕Ｕ?，以除去飼養(yǎng)細(xì)胞混入部分的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基因?qū)?天后，基因?qū)胄蕵O高并且依賴(lài)于MOI，MOI＝100時(shí)導(dǎo)入效率為90％以上，MOI＝10時(shí)約為80％，MOI＝1時(shí)約為60％。這種高基因?qū)胄食掷m(xù)2個(gè)月以上。
圖6表示在用SIV載體導(dǎo)入了EGFP基因的ES細(xì)胞(CMK-1株)中，EGFP平均熒光強(qiáng)度的時(shí)間過(guò)程。橫軸表示基因?qū)氘?dāng)天(第0)天后的天數(shù)，縱軸表示通過(guò)FACS分析得到的EGFP平均熒光強(qiáng)度。在持續(xù)約2個(gè)月以上的時(shí)間內(nèi)，EGFP表達(dá)細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度幾乎沒(méi)有下降。
圖7是在用SIV載體導(dǎo)入了基因的ES細(xì)胞(CMK-1株)中，EGFP表達(dá)的熒光顯微照片。
上圖基因?qū)牒?1天(第21天)的ES細(xì)胞的熒光顯微鏡觀察結(jié)果。發(fā)出EGFP熒光的CMK-1細(xì)胞呈島狀突出。
下圖基因?qū)牒?2天(第21天)的ES細(xì)胞的熒光顯微鏡觀察結(jié)果。發(fā)出EGFP熒光的CMK-1細(xì)胞仍然呈島狀突出。
圖8表示SIV載體介導(dǎo)的小鼠和猴ES細(xì)胞(CMK-1株)的基因?qū)胄省？v軸表示除去了飼養(yǎng)細(xì)胞混入部分的影響的ES細(xì)胞基因?qū)胄?％)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，猴ES細(xì)胞的基因?qū)胄时刃∈驟S細(xì)胞高。一般認(rèn)為，當(dāng)采用以SIV為基礎(chǔ)的載體時(shí)，作為SIV自然宿主的猴等靈長(zhǎng)類(lèi)的細(xì)胞比小鼠等異種的細(xì)胞的基因?qū)胄矢摺?br> 發(fā)明的最佳實(shí)施方案下面通過(guò)實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。本說(shuō)明書(shū)中引用的文獻(xiàn)在此引入作為參考。
SIV載體的構(gòu)建用非致病性非洲綠猴(African green monkey)免疫缺陷病毒克隆——SIVagmTYO1構(gòu)建載體系統(tǒng)。圖1表示載體系統(tǒng)的概要。所有核苷酸的序號(hào)以下均用病毒RNA的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)+1表示。用插入了SIVagmTYO1的pSA212作為質(zhì)粒(J.Viol.，vol.64，pp307-312，1990)。并且所有連接反應(yīng)都按照Ligation High(Toyobo)所附的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
a.包裝載體的構(gòu)建首先，用引物1F(SEQ ID NO1)和1R(SEQ ID NO2)，以pSA212為模板，通過(guò)PCR獲得與含有tat/rev第一外顯子和vif的區(qū)域(5337-5770)對(duì)應(yīng)的DNA片段。在PCR引物上添加EcoRI限制酶位點(diǎn)，由此制備在3’末端帶有EcoRI位點(diǎn)的DNA片段。用BglII和EcoRI將PCR片段進(jìn)行消化后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和Wizard PCR Preps DNA Purification System(Promega)純化。將按照上述方法得到的DNA片段，和，編碼gag/pol區(qū)域的DNA片段(包括XhoI位點(diǎn)(356)～BglII位點(diǎn)(5338))在pBluescript KS+(Stratagene)的XhoI-EcoRI位點(diǎn)連接。然后，通過(guò)PCR擴(kuò)增與包含tat/rev第2外顯子和Rev responsive element(RRE)(6964-7993)的區(qū)域?qū)?yīng)的DNA片段。用類(lèi)似于針對(duì)上述PCR片段的方式，用引物2F(SEQ ID NO3)和2R(SEQ ID NO4)，以pSA212為模板進(jìn)行PCR，由此在3’末端添加NotI位點(diǎn)。用EcoRI和NotI消化后將DNA片段純化，然后插入pBluescript KS+的EcoRI-NotI位點(diǎn)，所述pBluescript KS+中已插有g(shù)ag-tat/rev。
然后，合成包含剪接供體(SD)部位的DNA片段(序列3F(SEQ ID NO5)和3R(SEQ ID NO6))。合成時(shí)在DNA片段的5’和3’末端分別添加X(jué)hoI位點(diǎn)和SalI位點(diǎn)，然后插入上述pBluescript KS+的XhoI位點(diǎn)，所述pBluescriptKS+已插有g(shù)ag-RRE-tat/rev。所得的質(zhì)粒用XhoI和NotI進(jìn)行消化，純化包含SD～tat/rev的片段，然后將該片段插入質(zhì)粒的XhoI-NotI位點(diǎn)，所述質(zhì)粒在pCAGGS(Gene，vol.108，pp193-200，1991)的EcoRI位點(diǎn)插有XhoI/NotI接頭(序列4F(SEQ ID NO7)和4R(SEQ ID NO8))。將按照上述方法得到的質(zhì)粒作為包裝載體(pCAGGS/SIVagm gag-tat/rev)。
b.基因轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建以pSA212為模板，通過(guò)PCR，用引物5-1F(SEQ ID NO9)和5-1R(SEQID NO10)擴(kuò)增來(lái)自SIVagmTYO1的5’LTR區(qū)域(8547-9053+1-982，在5’末端添加KpnI位點(diǎn)，在3’末端添加EcoRI位點(diǎn))，用引物5-2F(SEQ ID NO11)和5-2R(SEQ ID NO12)擴(kuò)增RRE(7380-7993，在5’末端添加EcoRI，在3’末端添加SacII位點(diǎn))，用引物5-3F(SEQ ID NO13)和5-3R(SEQ ID NO14)擴(kuò)增3’LTR(8521-9170，在5’末端添加NotI和BamHI位點(diǎn)，在3’末端添加SacI位點(diǎn))。以pEGFPC2為模板，通過(guò)PCR，用引物6F(SEQ ID NO15)和6R(SEQ ID NO16)擴(kuò)增來(lái)自pEGFPC2(Clontech)的CMV啟動(dòng)子區(qū)域和編碼增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(以下稱(chēng)為EGFP)的區(qū)域(1-1330，在5’末端添加SacII位點(diǎn)，在3’末端添加NotI位點(diǎn)和BamHI位點(diǎn)以及翻譯終止密碼子)。將4種PCR片段分別用限制酶KpnI和EcoRI、EcoRI和SacII、BamHI和SacI、SacII和BamHI消化后，純化，然后以5’LTR-＞3’LTR-＞RRE和CMV啟動(dòng)子EGFP的順序連接并插入到pBluescript KS+的KpnI-SacI位點(diǎn)之間(pBS/5’LTR.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/WT3’LTR)。為了插入作為報(bào)告基因的β-半乳糖苷酶基因，將上述通過(guò)PCR制備的包含5’LTR區(qū)域和3’LTR區(qū)域的DNA片段分別用限制酶KpnI和EcoRI、NotI和SacI消化，純化，然后分別插入質(zhì)粒pBluescript KS+的KpnI-EcoRI位點(diǎn)和NotI-SacI位點(diǎn)(pBS/5’LTR.U3G2/WT3’LTR)。在該質(zhì)粒的NotI位點(diǎn)插入包含編碼pCMV-beta β-半乳糖苷酶(Clontech)的區(qū)域的NotI片段(820-4294)(pBS/5’LTR.U3G2/β-gal/WT3’LTR)。然后在質(zhì)粒pBS/5’LTR.U3G2/β-gal/WT3’LTR的EcoRI-NotI位點(diǎn)插入RRE序列(pBS/5’LTR.U3G2/RRE6/tr/β-gal/WT3’LTR)，所述RRE序列(6964-8177，在5’末端添加EcoRI位點(diǎn)，在3’末端添加NotI位點(diǎn))已用引物7-1F(SEQ ID NO17)和7-1R(SEQ ID NO18)，以pSA212為模板通過(guò)PCR進(jìn)行擴(kuò)增。然后，用EcoRI和NheI切除RRE序列，插入RRE序列(7380-7993，在5’末端添加EcoRI位點(diǎn)，在3’末端添加NheI位點(diǎn))，該RRE序列已以pSA212為模板，用引物7-2F(SEQ IDNO19)和7-2R(SEQ ID NO20)通過(guò)PCR進(jìn)行擴(kuò)增。將以上方法得到質(zhì)粒(pBS/5’LTR.U3G2/RREc/s/β-gal/WT3’LTR)用NheI和SmaI消化使其平端化，然后插入來(lái)自pEGFPN2(Clontech)的CMV啟動(dòng)子區(qū)域(8-592，平端化AseI-NheI片段)(pBS/5’LTR.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/WT3’LTR)。所有平端化反應(yīng)都用Blunting High(Toyobo)根據(jù)所附的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將質(zhì)粒pBS/5’LTR.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/WT3’LTR和pBS/5’LTR.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/WT3’LTR分別用KpnI-SacI消化，制備包含5’LTR-3’LTR的DNA片段，然后將該片段插入pGL3 Control(Promega)載體的KpnI-SacI位點(diǎn)，作為基因轉(zhuǎn)移載體(pGL3C/5’LTR.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/WT3’LTR和pGL3C/5′LTR.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/WT3′LTR)來(lái)使用。
5’LTR的修飾慢病毒的5’LTR轉(zhuǎn)錄活性一般依賴(lài)于Tat蛋白的存在，該Tat蛋白是一種來(lái)自病毒的因子。因此，為了消除對(duì)Tat的依賴(lài)性，并通過(guò)用轉(zhuǎn)錄活性強(qiáng)的啟動(dòng)子序列進(jìn)行取代來(lái)提高載體滴度，制備SIVagm基因轉(zhuǎn)移載體，該載體中5’LTR啟動(dòng)子序列——U3區(qū)域被其它的啟動(dòng)子序列取代(圖2)。
通過(guò)下述方法用嵌合啟動(dòng)子取代5’LTR用引物9-1F～3F(SEQ ID NO21-23)和引物9R(SEQ ID NO24)，以pSA212為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增包含5’LTR的TATA盒下游區(qū)域直至gag區(qū)域(9039-9170+1-982)的片段。然后，將包含CMVL啟動(dòng)子(來(lái)自pCI(Promega)，1-721)的片段用引物10-1F(SEQID NO25)和10-1R(SEQ ID NO26)以pCI為模板通過(guò)PCR擴(kuò)增；將包含CMV啟動(dòng)子(來(lái)自pEGFPN2(Clontech)，1-568)的片段用引物10-2F(SEQ IDNO27)和10-2R(SEQ ID NO28)以pEGFPN2為模板通過(guò)PCR擴(kuò)增；將包含EF1α啟動(dòng)子(pEF-BOS(Nucleic Acids Research，vol.18，p5322，1990)的核苷酸2240-2740)的片段用引物10-3F(SEQ ID NO29)和10-3R(SEQ ID NO30)以pEF-BOS為模板通過(guò)PCR擴(kuò)增；將包含CA啟動(dòng)子(pCAGGS的核苷酸5-650)的片段用引物10-4F(SEQ ID NO31)和10-4R(SEQ ID NO32)以pCAGGS為模板通過(guò)PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增后，將包含5’LTR的片段和包含上述各啟動(dòng)子的片段混合，添加與各啟動(dòng)子5’末端對(duì)應(yīng)的引物(10-1F(SEQ ID NO25)、10-2F(SEQ ID NO27)、10-3F(SEQ ID NO29)或10-4F(SEQ ID NO31)以及與5’LTR的3’末端對(duì)應(yīng)的引物(9R)，然后進(jìn)行10個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)，得到含有4種啟動(dòng)子分別與5’LTR組成的嵌合啟動(dòng)子的DNA片段。將所得的DNA片段插入基因轉(zhuǎn)移載體(pGL3C/5’LTR.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/WT3’LTR)的KpnI-EcoRI位點(diǎn)(pGL3 C/CMVL.U3 G2/RREc/s/CMVFβ-gal/WT3’LTR、pGL3C/CMV.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/WT3’LTR、pGL3C/EFlα.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/WT3’LTR、pGL3C/CAGU3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/WT3’LTR)。
3’LTR的修飾切除3’LTR的部分序列，以防止全長(zhǎng)載體mRNA在靶細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄，由此構(gòu)建安全性提高的自我失活型(SIV)載體。在慢病毒載體中，已經(jīng)證明3’LTR區(qū)域包含的啟動(dòng)子序列——U3區(qū)域在靶細(xì)胞中逆轉(zhuǎn)錄時(shí)可以整合到5’LTR的U3啟動(dòng)子區(qū)域，因此，在靶細(xì)胞的基因組內(nèi)，基因轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒3’LTR區(qū)域中包含的U3區(qū)域可以作為與基因表達(dá)相關(guān)的5’LTR U3啟動(dòng)子區(qū)域(圖3)。因此，制備將SIVagm基因轉(zhuǎn)移載體的3’LTR U3區(qū)域用其它啟動(dòng)子序列取代的載體(圖3)。另外，為了研究靶細(xì)胞中5’LTR是否可以缺失啟動(dòng)子序列，也制備缺失SIVagm基因轉(zhuǎn)移載體中3’LTR U3區(qū)域的載體。
3’LTR U3啟動(dòng)子序列的修飾和缺失通過(guò)下述方法進(jìn)行用引物11F(SEQ ID NO33)和11R(SEQ ID NO34)，以pSA212為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增不含3’LTR U3的DNA片段。另外，將U3區(qū)域已被其它啟動(dòng)子取代的一種3’LTR用引物12-1F～3F(SEQ ID NOs35-37)和引物12R(SEQ ID NO38)通過(guò)PCR擴(kuò)增，其中分別以按照實(shí)施例2記載的方法得到的插有嵌合啟動(dòng)子的載體質(zhì)粒pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/WT3’LTR、pGL3C/EF1α.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/WT3’LTR和pGL3C/CAGU3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/WT3’LTR為模板。將通過(guò)PCR所得的DNA片段用SalI和SacI消化，純化，然后插入pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/WT3’LTR的SalI-SacI位點(diǎn)(pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/3’LTRΔU3、pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/CMVL.R、pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/EF1α.R和pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/CAGR)。
另外，從經(jīng)過(guò)EcoR1-BamHI處理的pGCL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/3’LTRΔU3構(gòu)建包含EGFP作為報(bào)告基因的SIN載體(pGCL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVEGFP/3’LTRΔU3)(圖4)，用PCR產(chǎn)物——EcoRI-BamHI片段取代包含β-gal的片段，所述PCR以pEGFP-C2(Clontech)為模板，用EGFPFG2Eco(ATCGGAATTCGGCCGCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCT/SEQ ID NO39)和EGFPRstoNB(CGGGATCCGCGGCCGCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC/SEQ ID NO40)作為引物。然后將以pSA212為模板，用引物5-2F(SEQ ID NO11)和5-2R(SEQ ID NO12)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物——EcoRI-SacII片段插入EcoRI-SacII位點(diǎn)。
大量制備SIV轉(zhuǎn)染將來(lái)自人胚腎細(xì)胞的細(xì)胞系293T細(xì)胞(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.90，pp8392-8396，1993)接種到50個(gè)15cm的皿中，使達(dá)到2.5×106細(xì)胞/皿，在包含10％非活性胎牛血清(FCS)的DMEM(GibcoBRL)中培養(yǎng)48小時(shí)，每個(gè)15cm皿中培養(yǎng)基的量為20ml。培養(yǎng)兩天后，將300μg基因轉(zhuǎn)移載體pGCL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVEGFP/3′LTRΔU3、150μg包裝載體pCAGGS/SIVagm gag-tat/rev和50μg VSV-G表達(dá)載體(pVSV-G)溶于75mlOPTI-MEM(Invitrogen)，加入2ml PLUS試劑(Invitrogen)，攪拌后在室溫靜置15分鐘。另外將3ml LIPOFECTAMINE(Invitrogen)單獨(dú)與75mlOPTI-MEM混合，然后將其與上述DNA混合物混合，在室溫靜置15分鐘。
將每皿中的3ml溶液滴加到293T細(xì)胞，其中培養(yǎng)基已經(jīng)用10mlOPTI-MEM替換，在37℃、10％CO2中培養(yǎng)3小時(shí)。每皿中加入10ml包含20％FCS的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)21小時(shí)。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，每皿中的培養(yǎng)基替換成20ml包含10％FCS的DMEM，再繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。
載體的回收和濃縮回收培養(yǎng)上清，用0.45μm的過(guò)濾器過(guò)濾，然后在42500G和4℃離心90分鐘。將所得沉淀溶于10ml TBS中，在37℃反應(yīng)2小時(shí)，然后在42500G和4℃離心2小時(shí)，所述TBS包含10mM MgCl2、3mM精胺、0.3mM亞精胺和100μM dNTP。將所得顆粒懸浮于1ml PBS中，然后在-80℃冷凍保存，所述PBS包含5％FCS和2μg/ml Polybrene。
猴胚泡的制備為了獲得適于建立ES細(xì)胞的胚泡，進(jìn)行體外受精和顯微受精，然后用體外培養(yǎng)法使受精卵發(fā)育成胚泡。
(1)卵巢刺激法皮下給予雌性cynomolgus猴(4～15周齡)1.8mg促性腺激素釋放素(GnRH)(商品名Leuplin，武田藥品工業(yè)(株)社；或商品名Sprecur，HoechstMarion RousseI)。給予GnRH兩周后，每天定時(shí)(本實(shí)施例中為晚上)肌內(nèi)給予下述激素，每天一次，持續(xù)9天，所述激素為妊娠馬血清促性腺激素(PMSG)(商品名Serotropin，帝國(guó)臟器制藥(株)社)，25IU/kg；人絕經(jīng)期尿性促性腺激素(hMG)(Pergonal，帝國(guó)臟器制藥(株)社)，10IU/kg；卵泡刺激激素(FSH)(Fertinorm，Serono Laboratories)，3IU/kg。給藥5天后，用腹腔鏡(外徑＝3mm)觀察卵巢，確認(rèn)卵泡是否發(fā)育。
確認(rèn)施用了PMSG、hMG或FSH的猴的卵泡充分發(fā)育后，肌內(nèi)給予一次人絨毛膜促性腺激素(hCG)(商品名Puberogen，Sankyo CO.，Ltd.)，劑量為400IU/kg。給予hCG的40小時(shí)后進(jìn)行采卵。
采卵通過(guò)下述方法進(jìn)行用腹腔鏡(外徑＝10mm)觀察卵巢，用配備了60mm 19G或20G Cathelin針的2.5ml注射筒穿刺卵泡并吸取卵泡液和卵子，所述注射器中裝有約0.5ml包含10％SSS(Serum Substitute Supplement；Irvine Scientific Sales Inc.)的α-MEM(α-Modification of Eagle’s Medium；ICDBiomedical Inc.)溶液。
回收后迅速在立體顯微鏡下分離卵丘細(xì)胞中包含的成熟卵子，然后轉(zhuǎn)移到含有0.3％BSA的TALP(以下簡(jiǎn)稱(chēng)為BSA/TALP)中，37℃在5％CO2、5％O2和90％N2的CO2培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)3～4小時(shí)。
(2)精子的采集(i)從附睪上采集的方法采取雄性cynomolgus猴(10～15周齡)的附睪，然后迅速將帶有23G針的1ml注射筒插入精管內(nèi)，緩慢注入含有0.3％BSA的BWW(以下簡(jiǎn)稱(chēng)為BSA/BWW)，切斷附睪尾部，收集從中留出的精液。
(ii)利用電刺激進(jìn)行的采集法(a)直腸法將雄性cynomolgus猴(10～15周齡)用鹽酸氯胺酮和鹽酸甲苯噻嗪(分別為5mg/kg和1mg/kg)進(jìn)行麻醉，并使其處于仰臥位。在與電刺激器相連的棒狀直腸電極上涂布角蛋白乳膏，然后將該電極輕輕插入上述猴的直腸中。用滅菌生理鹽水洗凈陰莖，用紙巾等擦干，然后將陰莖尖端插入試管(50ml)中。隨后，給電刺激器通以5V交流電，通電3～5秒后，停止5秒，此操作最多重復(fù)3次。觀察到射精時(shí)停止操作。如果沒(méi)觀察到射精，將電壓改為10V后進(jìn)行同樣的操作，如果還未發(fā)現(xiàn)射精，則在15V或20V下進(jìn)行操作。
(b)陰莖法不進(jìn)行麻醉，將雄性cynomolgus猴(10～15周齡)的四肢固定在籠子的前面，使其陰莖方便觸及。帶上手術(shù)用橡膠手套，用無(wú)菌生理鹽水洗滌陰莖，然后用紙巾等擦干。準(zhǔn)備電刺激器，用夾子將電極連接到陰莖上。首先以1秒的間隔反復(fù)通以5V的直流電壓，然后逐漸縮短其間隔。如果未觀察到射精，在10V、15V或20V的電壓下進(jìn)行同樣的操作。如果還沒(méi)有出現(xiàn)射精，則在交流電壓反復(fù)進(jìn)行同樣的操作。
(3)精液采集后的處理和冷凍保存法(Torii，R.，Hosoi，Y.，Iritani，A.，Masuda，Y.and Nigi，H.(1998).Establishment of Routine Cryopreservation ofSpermatozoa in the Japanese Monkey(Macaca fuscata)，Jpn.J.Fertil.，43(2)，125-131)將通過(guò)直腸法或陰莖法采集的精液在37℃的CO2培養(yǎng)箱中靜置約30分鐘，收集液體成分，加入包含0.3％BSA的BWW(Biggers，Whitten andWittinghams)(BSA/BWW)培養(yǎng)液1～2ml配制精子溶液，將該溶液輕輕覆蓋到2.5ml 80％Percoll(American Pharmacia Biotech Inc.)和2.5ml 60％Percoll的液體上。所得的樣品在室溫以1,400rpm的速度離心分離20分鐘，抽取并棄去上層，剩下試管底部的約0.5ml。然后加入BSA/BWW約10ml，輕輕混合，得到的混合物在室溫以1,400rpm的速度離心分離3分鐘，抽取并棄去上層，剩下底部的約0.5ml。
往所得的精子中加入適量的BSA/BWW制備精子溶液，使精子數(shù)達(dá)到約5×107～1.0×108細(xì)胞/ml，在4℃靜置約60～90分鐘。然后，在冰水中往精子溶液中緩慢滴加TTE-G溶液(含有終濃度為12％的甘油的TTE培養(yǎng)基(100ml培養(yǎng)基的組成Tes 1.2g、Tris-HCl 0.2g、葡萄糖2g、乳糖2g、棉子糖0.2g、蛋黃20ml、青霉素-G 10,000IU、硫酸鏈霉素5mg))，所述TTE-G溶液的量為精子溶液的1/5，將所得混合物靜置5分鐘。上述滴加TTE-G溶液和靜置的操作重復(fù)5次。
將所得的混合物在冰水中放置60～90分鐘后，將得到的精子溶液加到0.25或0.5ml麥桿(ストロ-)中。將該麥桿在液氮容器的上部保持約5分鐘，進(jìn)一步在液氮表面保持5分鐘，然后將該麥桿保存在液氮中。
(4)用于體外受精的精子的制備從液氮中取出的麥桿在室溫保持30秒，然后在37℃水浴中保持30秒，使保存的精子溶液解凍。接著往上述麥桿中加入包含1mM咖啡因(Sigma)和1mM dbC-AMP(Sigma)的BSA/BWW 10ml，所得混合物在37℃的CO2培養(yǎng)箱(5％CO2)中溫育30分鐘，進(jìn)行受精獲能。
將上述精子溶液以1,000rpm(200×g)的速度離心分離2分鐘，棄去上清液，然后加入約0.5～1ml包含1mM咖啡因和1mM dbC-AMP的BSA/BWW。將所得的精子溶液在37℃的CO2培養(yǎng)箱中(5％CO2)靜置60分鐘，收集游到頂部的精子，檢查精子的運(yùn)動(dòng)性和精子數(shù)，由此獲得體外受精用的精子。
(5)受精方法(A)體外受精法往在塑料皿中被礦物油覆蓋的50μl BSA/BWW液滴中加入卵丘細(xì)胞中包含的卵子1～5個(gè)，然后將精子懸浮液轉(zhuǎn)移到液滴中，達(dá)到5.0×105～1.0×106個(gè)(精子)/ml。用礦物油覆蓋該液滴，然后進(jìn)行授精。
將受精后的卵子在37℃、5％CO2、5％O2和90％N2的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。授精5小時(shí)后，用TALP溶液替換BWW溶液，受精效率經(jīng)測(cè)定約為45％，因此以較高受精率得到受精卵。將已確認(rèn)受精的卵子培養(yǎng)約20小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移到CMRL-1066溶液中繼續(xù)培養(yǎng)。
所述CMRL-1066溶液按照下述方法配制將0.014615g L-谷氨酰胺(1mM)溶于10ml的A溶液中[青霉素G(1000單位)、0.5ml硫酸慶大霉素(10mg/ml)、10ml CMRL-1066(10×)(不含NaHCO3和L-谷氨酰胺)、0.218gNaHCO3、6.7ml乳酸鈉(290毫滲量stock)，用水調(diào)至100ml]。將所得溶液過(guò)濾除菌，往除菌后的溶液1ml中添加9ml溶液A，得到10ml溶液B。將0.0055g丙酮酸鈉(最終濃度為5mM)溶于溶液B，得到溶液C。將8ml溶液C和2ml BCS(胎牛血清)混合，將所得的混合物過(guò)濾除菌，得到CMRL-1066溶液。
(B)顯微授精法
(i)卵子的制備將回收的卵母細(xì)胞收集到用礦物油(Sigma)覆蓋的50μl包含0.3％BSA的TALP(BSA/TALP)溶液液滴中，在37℃、5％CO2、5％O2和90％N2的條件下預(yù)培養(yǎng)2～4小時(shí)。
為了確認(rèn)卵子的成熟，將卵母細(xì)胞培養(yǎng)物在包含0.1％透明質(zhì)酸酶(Sigma)的TALP-HEPES溶液中進(jìn)一步培養(yǎng)1分鐘，用移液管除去卵丘細(xì)胞。回收的卵子在倒置顯微鏡下分成以下4類(lèi)第1類(lèi)帶有極體的成熟卵子(PB)；第2類(lèi)沒(méi)有觀察到PB和生發(fā)泡(GV)的成熟中期的卵子；第3類(lèi)沒(méi)有觀察到GV的未成熟卵子；第4類(lèi)明顯變形或伴有胞質(zhì)退化包括退化型變化的卵子。
對(duì)于第1類(lèi)卵子，確認(rèn)后迅速用于顯微授精。對(duì)于第2類(lèi)和第3類(lèi)卵子，將其收集到用礦物油覆蓋的50μl BSA/TALP溶液液滴中，在37℃、5％CO2、5％O2和90％N2的條件下繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)后24小時(shí)檢查卵子的成熟狀態(tài)，成熟卵子用于顯微授精，剩下的未成熟的卵子和第4類(lèi)卵子不用于受精。
(ii)精子的制備按照體外受精的制備方法進(jìn)行。
(iii)顯微授精法顯微授精在裝有微調(diào)的倒置顯微鏡下(Olympus IX70，Narishige)進(jìn)行。在15cm的皿中，依次放置點(diǎn)1(15μl稀釋精子)、點(diǎn)2(10％聚乙烯吡咯烷酮/PBS培養(yǎng)液(PVP，平均分子量約為360,000，Nacalai Tesque)5μl×3個(gè)和點(diǎn)3(用于卵子操作的TALP-HEPES溶液(BSA最終濃度為3mg/ml)5μl×3個(gè))，用礦物油覆蓋其表面以防止干燥，將該皿用于顯微授精。另外，本實(shí)施例中忽略操作溫度變化，因此未使用加熱裝置，但也可以使用加熱裝置。
采用人體顯微授精所用的傾斜角度為30度的針(外徑7～8μm，內(nèi)徑5～7μm，Medi-Con International Co.，Ltd)作為注入用針，將該針連接到高精度的Alcatel注射器上。
采用人顯微授精所用的傾斜角度為30度的針，或用磁力拔出器(商品名PN-30，Narishige)制作的針(外徑約為100μm，前端內(nèi)徑約為15μm)作為用于支撐卵子的針。將上述針連接到Narishige注射器上，該注射器帶有2000μl的氣密注射筒。
在點(diǎn)1按照人顯微授精的基準(zhǔn)選擇具有運(yùn)動(dòng)性的精子并吸取，將所得的精子轉(zhuǎn)移到點(diǎn)2釋放。在點(diǎn)2中，PVP的粘性導(dǎo)致精子的運(yùn)動(dòng)性降低。用注射針摩擦上述精子的尾部，破壞部分精子膜，由此使精子停止運(yùn)動(dòng)。吸取該精子以及粘度高的溶液并轉(zhuǎn)移到點(diǎn)3。
將成熟卵子加入到點(diǎn)3中，用支撐針在6點(diǎn)或12點(diǎn)的位置固定，使極體以下的染色體不被注射用針破壞，然后將精子置于注入用針的尖端并插入卵子中。確認(rèn)針已經(jīng)通過(guò)透明帶后，吸取卵細(xì)胞膜。確認(rèn)發(fā)生膜斷裂后，將注入用針內(nèi)的內(nèi)容物(精子和卵子的細(xì)胞質(zhì))注入卵子中。重復(fù)注入精子和卵子細(xì)胞質(zhì)的一系列操作，單次操作中有2～3個(gè)卵子進(jìn)行顯微授精。如果精子或卵子細(xì)胞質(zhì)污染了針尖端的內(nèi)側(cè)，用點(diǎn)2中的溶液洗凈。
將顯微受精的卵子迅速放回培養(yǎng)箱中，在37℃、5％O2、5％CO2和90％N2的條件下開(kāi)始培養(yǎng)。顯微受精后迅速在6cm的裸露培養(yǎng)皿中制作50ulCMRL-1066溶液的點(diǎn)(spot)，并用石蠟油覆蓋。點(diǎn)與氣體的平衡原則上進(jìn)行3小時(shí)以上。顯微授精后24小時(shí)，將卵子從TALP溶液轉(zhuǎn)移到上述CMRL-1066溶液的點(diǎn)中，在37℃、5％O2、5％CO2和90％N2的條件下，在CO2培養(yǎng)箱中密封培養(yǎng)8天，結(jié)果以高受精率(約為75～85％)得到受精卵。
(6)培養(yǎng)方法體外受精和顯微授精后，將確認(rèn)已受精的卵子用微小懸滴培養(yǎng)法進(jìn)行培養(yǎng)，該方法中，為了避免溫度和二氧化碳?xì)怏w濃度的急劇變化，用礦物油覆蓋培養(yǎng)基，這種方法在小鼠和兔子等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中廣泛使用，但通常不用于人。觀察培養(yǎng)過(guò)程，為了避免溫度或pH變化導(dǎo)致的不必要的壓力，在預(yù)測(cè)到胚泡的出現(xiàn)之前不開(kāi)啟或關(guān)閉培養(yǎng)箱的門(mén)，進(jìn)行密閉培養(yǎng)，即，在體外受精中為培養(yǎng)開(kāi)始后7天，在顯微授精中為培養(yǎng)開(kāi)始后8天。
此次培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)氣體如下培養(yǎng)基TALP & CMRL-1066所用培養(yǎng)基為通常用于小鼠的BWW、用于人的Pl(Nakamedical Inc.)、Blast培養(yǎng)基(Nakamedical Inc.)和新開(kāi)發(fā)的HFF(human foilcular fluid，F(xiàn)usoPharmaceutical Industries，Ltd.)。結(jié)果表明，受精和分裂順利進(jìn)行，但在桑葚體階段停止發(fā)育。確認(rèn)受精后，組合使用TALP和CMRL-1066培養(yǎng)液，受精胚發(fā)育成胚泡，并且發(fā)育率極高，為受精胚的40～46％。培養(yǎng)箱外的操作中用HEPES緩沖液系統(tǒng)TALP而不用磷酸緩沖液系統(tǒng)PBS，由此可以減少對(duì)卵子的不良影響。
培養(yǎng)溫度38℃小鼠和人的胚胎通常在37℃進(jìn)行，但在該溫度下發(fā)育慢，并且完全沒(méi)有桑葚體以后的發(fā)育。因此，與38.5℃的牛胚胎培養(yǎng)等類(lèi)似，在38℃或稍高的溫度進(jìn)行培養(yǎng)，體外受精后7天獲得胚泡，顯微授精后8天獲得胚泡。
培養(yǎng)氣體5％CO2、5％O2和90％N2在通常所用的5％CO2和95％空氣的條件下，受精卵的發(fā)育停止在桑葚體階段，但在5％CO2、5％O2和90％N2中培養(yǎng)時(shí)，發(fā)育到胚泡的發(fā)育率很高。
TALP溶液和TALP-HEPES溶液如下配制表1

原液通過(guò)高壓滅菌法滅菌保存。
配制TALP溶液前，配制下列試劑并用過(guò)濾器過(guò)濾除菌丙酮酸鈉 0.5mM 0.0055g(每100ml)硫酸慶大霉素(10mg/ml) 50μg/ml50μl
BSA 3mg/ml 0.3g配制TALP-HEPES溶液前，配制下列試劑并用過(guò)濾器過(guò)濾除菌丙酮酸鈉0.1mM 0.0011g(每100ml)BSA 3mg/ml 0.3g另外，配制TALP-HEPES溶液時(shí)，首先將50ml NaCl和Na-HEPES(N-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙烷磺酸)、酚紅和青霉素G溶解。往所得的溶液中分別加入規(guī)定量的原液，最后用NaCl原液調(diào)至100ml。然后，用1M NaOH將所得溶液調(diào)至pH＝7.4。乳酸鈉溶液通過(guò)將原液(60％的糖漿劑)與水以1∶35的比例混合來(lái)制備。往所得混合物中加入1mg/ml的酚紅后，用1M NaOH將所得溶液調(diào)至pH＝7.6，然后過(guò)濾除菌。所得的試劑可以在4℃保存一周。將28mg NaHPO4·H2O溶于10ml葡萄糖溶液中，過(guò)濾除菌，所得的溶液可以在4℃保存一周。
BWW(Biggers，Whitten and Whittingham)溶液的組成如表2所示。
表2

*/500ml[實(shí)施例6]建立猴ES細(xì)胞的方法(1)飼養(yǎng)細(xì)胞的制備將從12.5日齡的小鼠胚胎獲得的原代胚胎成纖維細(xì)胞(以下稱(chēng)為MEF細(xì)胞)在包含10％胎牛血清(FBS)的MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)1-3代，直至細(xì)胞鋪滿。然后在含有最終濃度為10μg/ml的絲裂霉素C(MMC)的MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)MEF 2～3小時(shí)，使細(xì)胞分裂失活。隨后，除去包含MMC的培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞3次。通過(guò)胰蛋白酶處理(0.05％胰蛋白酶和1mM EDTA)將洗凈后的細(xì)胞從培養(yǎng)皿剝離，計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)。
在被明膠覆蓋的24孔培養(yǎng)皿的各個(gè)孔中接種2×104個(gè)/孔的經(jīng)MMC處理過(guò)的MEF。
將所得的細(xì)胞接種到皿上，在確認(rèn)細(xì)胞數(shù)足夠以后，培養(yǎng)小鼠ES細(xì)胞并檢查其性質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所得的細(xì)胞增殖能力良好，保持未分化的狀態(tài)，適合用作飼養(yǎng)細(xì)胞。另外，3代以下(1-3代)的細(xì)胞適合用作飼養(yǎng)細(xì)胞。
(2)從猴胚泡分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)為了除去透明體，將猴胚泡轉(zhuǎn)移到包含最終濃度為0.5％的鏈霉蛋白酶或Tyrode的M2培養(yǎng)基(參見(jiàn)例如D.M.Glover等，Eds.，DNA Cloning 4Mammalian Systems A Practical Approach第二版(1995)等)中，在37℃溫育10分鐘。另外將殘留有透明體的胚泡進(jìn)一步在37℃用鏈霉蛋白酶處理5分鐘。確認(rèn)除去透明體后，將得到的胚泡用PBS洗滌兩次。
然后，將胚泡轉(zhuǎn)移到用M16培養(yǎng)基(參見(jiàn)上述“DNA Cloning 4Mammalian Systems A Practical Approach”等)稀釋20倍的兔抗cynomolgus猴淋巴細(xì)胞血清溶液中，在37℃溫育30分鐘，然后將所得的胚泡用PBS洗滌三次。將胚泡轉(zhuǎn)移到用M16培養(yǎng)液稀釋50倍的補(bǔ)體溶液中，在37℃溫育30分鐘，然后將所得的胚泡用PBS洗滌三次。當(dāng)胚泡的營(yíng)養(yǎng)外胚層未完全除去時(shí)，用剝離針在顯微鏡下物理性地除去營(yíng)養(yǎng)外胚層，由此分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)。
(3)猴的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的培養(yǎng)從接種了(1)中所得的飼養(yǎng)細(xì)胞的24孔培養(yǎng)皿中除去MEM培養(yǎng)基，每孔加入ES細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基(ES細(xì)胞培養(yǎng)基，表3)800μl。
用微量移液管將(2)中所得的ICM移到各個(gè)孔中，濃度為1個(gè)細(xì)胞/孔，在37℃、5％CO2的條件下培養(yǎng)7天。為了不妨礙ICM的著床，培養(yǎng)開(kāi)始后3天不改變培養(yǎng)基，每天用顯微鏡觀察著床狀況。
表3ES細(xì)胞培養(yǎng)基的組成產(chǎn)品名用量DMEM/F12(SIGMA) 500mlFBS(JRH BIOSCIENCES) 75ml谷氨酰胺(SIGMA；200mM)5ml青霉素(SIGMA；10.000IU/ml)和鏈霉素(SIGMA；100mg/ml)混合物 5ml丙酮酸鈉(SIGMA；100mM)5mlNaHCO3(SIGMA；7.5％) 8ml2-巰基乙醇(SIGMA；最終濃度10-4M)4μlLIF(ESGRO；最終濃度1000U/ml) 0.5ml(106U/ml)在培養(yǎng)第7天，將ICM分散，除去孔中的ES細(xì)胞培養(yǎng)基，用PBS將孔洗滌一次，往孔中加入300μl 0.25％胰蛋白酶/0.02％EDTA，然后迅速除去。隨后，將24孔培養(yǎng)皿在37℃溫育1分鐘。用顯微鏡確認(rèn)細(xì)胞分散后，往孔中加入500μl ES細(xì)胞培養(yǎng)基，用移液管很好地分散。
將上述細(xì)胞全部轉(zhuǎn)移到預(yù)先接種了飼養(yǎng)細(xì)胞的新鮮24孔培養(yǎng)皿的孔中，加入300μl ES細(xì)胞培養(yǎng)基，使培養(yǎng)基總量為800μl，然后充分混合以使細(xì)胞接種均勻。每?jī)商旄鼡Q一次ES細(xì)胞培養(yǎng)基。細(xì)胞分散后7天內(nèi)被視為ES細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)增殖，以集落出現(xiàn)，每天進(jìn)行觀察。
ES細(xì)胞集落出現(xiàn)后，在24孔培養(yǎng)皿中將細(xì)胞用胰蛋白酶處理，進(jìn)一步傳代。在此期間，每天或每?jī)商旄鼡Q一次ES細(xì)胞培養(yǎng)基，結(jié)果得到由cynomolgus猴胚泡產(chǎn)生的大量ES細(xì)胞株。
(4)猴ES細(xì)胞的評(píng)價(jià)核型檢查染色體數(shù)是否正常(與起源猴的染色體數(shù)相同2n＝42)，結(jié)果表明，所建立的ES細(xì)胞保持正常的核型。
多能性將1×106個(gè)cynomolgus猴ES細(xì)胞皮下注射到8周齡的SCID小鼠的腹股溝區(qū)域，注射后5～12周發(fā)現(xiàn)形成腫瘤。用Bouin液或多聚甲醛溶液將該腫瘤固定后，切成薄片，進(jìn)行蘇木精伊紅染色(HE染色)或免疫染色，然后進(jìn)行組織學(xué)檢查。在免疫染色中，可以利用的猴組織特異性抗體極少，因此使用人神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)、S-100蛋白和結(jié)蛋白的抗體。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該腫瘤是由來(lái)自外胚層(神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì))、中胚層(肌肉、軟骨、骨)和內(nèi)胚層(纖毛上皮和腸道上皮)的細(xì)胞群構(gòu)成的畸胎瘤。在免疫組織學(xué)檢查中，用NSE抗體檢查神經(jīng)元，用NSE和GFAP的抗體檢查神經(jīng)膠質(zhì)，用NSE抗體檢查末梢神經(jīng)，用S-100蛋白抗體檢查軟骨，用結(jié)蛋白抗體檢查肌肉。以上結(jié)果表明，cynomolgus猴的ES細(xì)胞具有多能性(三胚層分化能力)。
形態(tài)學(xué)特征1.核/細(xì)胞質(zhì)之比高，核仁顯著，形成集落；2.與小鼠ES細(xì)胞相比，集落形態(tài)扁平。
細(xì)胞表面標(biāo)記的表達(dá)為了確認(rèn)有無(wú)階段特異性胚抗原(SSEA，該抗原是用于賦予ES細(xì)胞特征的細(xì)胞表面標(biāo)記)，用SSEA-1(陰性對(duì)照)、SSEA-3和SSEA-4的細(xì)胞表面標(biāo)記抗體進(jìn)行免疫染色。這些抗體得自The Developmental Studies HybridomaBank of the National Institute of Child Health and Human Development。通過(guò)下述操作評(píng)價(jià)每一種SSEA細(xì)胞表面標(biāo)記使用4％多聚甲醛固定的細(xì)胞與第一抗體反應(yīng)，然后，與標(biāo)記的聚合物(Simple Stain PO，Nichirei)反應(yīng)，該聚合物包含與過(guò)氧化物酶和第二抗體偶聯(lián)的氨基酸聚合物。加入Simple StainDAB溶液(Nichirei)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果未檢出SSEA-1，但檢出了SSEA-3和SSEA-4。
堿性磷酸酯酶活性以Fast-Red TR SaH為底物，用HNPP(Roche)測(cè)定堿性磷酸酯酶活性，結(jié)果檢測(cè)出堿性磷酸酯酶。
猴ES細(xì)胞的培養(yǎng)(I)飼養(yǎng)細(xì)胞的制備與實(shí)施例6類(lèi)似，將從12.5日齡的小鼠胚胎獲得的MEF在包含10％胎牛血清(FBS)的MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)1-3代，直至細(xì)胞鋪滿。然后在含有最終濃度為10μg/ml的MMC的MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)MEF 2～3小時(shí)，使細(xì)胞分裂失活。隨后，除去包含MMC的培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞3次。通過(guò)胰蛋白酶處理(0.05％胰蛋白酶和1mM EDTA)回收細(xì)胞，計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)。
在被明膠覆蓋的24孔培養(yǎng)皿的各個(gè)孔中接種2×104個(gè)/孔的經(jīng)MMC處理過(guò)的MEF。
(II)猴ES細(xì)胞(CMK-1株)的培養(yǎng)按照實(shí)施例6的方法配制ES細(xì)胞培養(yǎng)基。將ES細(xì)胞的CMK-1株(以下也稱(chēng)為“CMK-1”)接種到上述(I)中制備的飼養(yǎng)細(xì)胞上。此時(shí)，ES細(xì)胞不分散成單個(gè)細(xì)胞，而是以5～10個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行接種。每天或每?jī)商旄鼡Q一次培養(yǎng)基，細(xì)胞每4～6天傳代一次。
在傳代中，用PBS將細(xì)胞洗滌一次，加入0.25％胰蛋白酶/PBS或0.1％膠原酶/DMEM，在37℃溫育2～10分鐘。將細(xì)胞懸浮于ES細(xì)胞培養(yǎng)基中，以1000rpm的速度離心5分鐘。將該細(xì)胞以1∶2～1∶4的比例接種到新鮮制備的飼養(yǎng)細(xì)胞上。用10～20％DMSO/DMEM或市售的細(xì)胞冷凍保存液保存細(xì)胞。
利用猴ES細(xì)胞(CMK-1株)進(jìn)行的基因?qū)雽?shí)驗(yàn)<將基因?qū)牒顴S細(xì)胞(CMK-1株)>
通過(guò)上述制備的表達(dá)EGFP的VSV-G假型化SIV載體(自我失活型(SIN)載體)(圖4)將基因?qū)牒顴S細(xì)胞中，使用有效滴度為1.9×109/ml的載體溶液。
在基因?qū)氲那耙惶?，?.5×104細(xì)胞/ml的濃度將CMK-1接種到飼養(yǎng)細(xì)胞上(2.5×105細(xì)胞/ml)。在基因?qū)氲漠?dāng)天(第0天)，以上述制備的細(xì)胞為基準(zhǔn)，用ES細(xì)胞培養(yǎng)基(實(shí)施例6)稀釋上述SIV載體，使MOI為1、10和100。加入Polybrene 8μg/ml進(jìn)行一次轉(zhuǎn)導(dǎo)，10小時(shí)后更換培養(yǎng)基。次日(第1天)開(kāi)始，每5～6天細(xì)胞以1∶3～1∶4的比例傳代到飼養(yǎng)細(xì)胞上。
ES細(xì)胞(CMK-1株)的基因?qū)胄视孟率龇椒ㄍㄟ^(guò)EGFP表達(dá)率計(jì)算，所述EGFP表達(dá)率通過(guò)FACScan求出。由于CMK-1細(xì)胞是在飼養(yǎng)細(xì)胞上培養(yǎng)的，因此用胰蛋白酶回收的樣品中混有CMK-1細(xì)胞和飼養(yǎng)細(xì)胞。另外，除了CMK-1細(xì)胞之外，SIV載體還可以將基因?qū)胗媒z裂霉素C處理過(guò)的飼養(yǎng)細(xì)胞中，因此，EGFP表達(dá)細(xì)胞中包含CMK-1細(xì)胞和飼養(yǎng)細(xì)胞。用下述“(1)飼養(yǎng)細(xì)胞中EGFP表達(dá)率的測(cè)定”和“(2)CMK-1細(xì)胞和飼養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞比測(cè)定”根據(jù)下面的校正式計(jì)算CMK-1細(xì)胞中的EGFP表達(dá)率。
<CMK-1基因?qū)胄实男Ｕ?amp;gt;
在各FACS樣本中，CMK-1的EGFP表達(dá)率表示為Ec，飼養(yǎng)細(xì)胞的EGFP表達(dá)率表示為Ef，CMK-1和飼養(yǎng)細(xì)胞的總體EGFP表達(dá)率表示為Eb。將CMK-1細(xì)胞數(shù)表示為c，飼養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)表示為f時(shí)f×Ef+c×Ec＝(f+c)Eb將上式變形為Ec＝{(f+c)Eb-f×Ef}/c設(shè)c/(f+c)＝k，則有1/k＝1+f/c將其代入上述方程，得Ec＝Eb/k-(1/k-1)/Ef＝(Eb-Ef)/k+Ef由此得到校正式平均Ec＝{(Eb-Ef)/n×∑1/ki}+Ef標(biāo)準(zhǔn)誤差SEM(平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差)＝1/n×(∑(Eci-均值)2)1/2＝(Eb-Ef)×(∑(1/ki-1/n∑1/ki)2)1/2(1)飼養(yǎng)細(xì)胞中EGFP表達(dá)率的測(cè)定將SIV載體僅導(dǎo)入飼養(yǎng)細(xì)胞中，使MOI＝1，10和100，在上述的相同條件下進(jìn)行FACS分析和傳代。
(2)CMK-1細(xì)胞和飼養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞比測(cè)定用下述方法識(shí)別CMK-1細(xì)胞和飼養(yǎng)細(xì)胞。人的抗HLA-ABC抗體(小鼠抗人HLA-ABCRPE，Serotec Ltd.)不與來(lái)自小鼠的飼養(yǎng)細(xì)胞反應(yīng)，但與來(lái)自cynomolgus猴的CMK-1細(xì)胞反應(yīng)。使該抗體與CMK-1細(xì)胞和飼養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞混懸液反應(yīng)，用FACS測(cè)定CMK-1細(xì)胞和飼養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞比。
測(cè)定SIV載體介導(dǎo)的猴ES細(xì)胞的基因?qū)胄?圖5)。CMK-1細(xì)胞的基因?qū)胄手?，通過(guò)上述“CMK-1基因?qū)胄实男Ｕ健毕嘶烊氲娘曫B(yǎng)細(xì)胞的影響。基因?qū)雰商旌?，發(fā)現(xiàn)基因?qū)胄屎芨卟⑶乙蕾?lài)于MOI，MOI＝100時(shí)，導(dǎo)入效率為90％以上，MOI＝10約為80％，MOI＝1時(shí)約為60％。這種高基因?qū)胄食掷m(xù)兩個(gè)月以上。另外，檢查導(dǎo)入了EGFP基因的CMK-1細(xì)胞中平均熒光強(qiáng)度的時(shí)間過(guò)程，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EGFP表達(dá)細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度持續(xù)兩個(gè)月以上幾乎不下降(圖6)。通過(guò)SIV載體導(dǎo)入了EGFP基因的CMK-1細(xì)胞(“綠色”ES細(xì)胞)的顯微照片如圖所示。
SIV載體介導(dǎo)的猴ES細(xì)胞和小鼠ES細(xì)胞的基因?qū)胄蕿榱搜芯縎IV載體介導(dǎo)的基因?qū)氲男适欠耠SES細(xì)胞的種類(lèi)而變，按照實(shí)施例8的方法將基因?qū)胄∈驟S細(xì)胞(D3株)。
具體地，在基因?qū)氲那耙惶?，?.5×104細(xì)胞/ml的濃度將CMK-1細(xì)胞接種到飼養(yǎng)細(xì)胞上(2.5×105細(xì)胞/ml)。在基因?qū)氲漠?dāng)天(第0天)，以上述制備的細(xì)胞為基準(zhǔn)，用ES細(xì)胞培養(yǎng)基(實(shí)施例6)稀釋表達(dá)上述EGFP的VSG-G假型化SIV載體(自我失活型(SIN)載體)(圖4)，使MOI為1、10和100。加入Polybrene 8μg/ml進(jìn)行一次基因?qū)耄?0小時(shí)后更換培養(yǎng)基。次日(第1天)開(kāi)始，每5～6天細(xì)胞以1∶3～1∶4的比例傳代到飼養(yǎng)細(xì)胞上。將小鼠ES細(xì)胞(D3株)在基因?qū)氲那耙惶煲?×105細(xì)胞/ml的濃度接種到大約相同數(shù)量的飼養(yǎng)細(xì)胞上，對(duì)于CMK-1細(xì)胞也使用相同類(lèi)型的飼養(yǎng)細(xì)胞。接種次日往上述SIV載體中添加培養(yǎng)基，使MOI＝10，加入Polybrene 8μg/ml進(jìn)行一次基因?qū)耄稳?第1天)開(kāi)始，每一天細(xì)胞以1∶8～1∶10的比例傳代到飼養(yǎng)細(xì)胞上。
以MOI＝10進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)的各ES細(xì)胞的基因?qū)胄嗜鐖D8所示，結(jié)果發(fā)現(xiàn)猴ES細(xì)胞的基因?qū)胄时刃∈驟S細(xì)胞高(圖8)。當(dāng)使用以SIV為基礎(chǔ)的載體時(shí)，作為SIV自然宿主的猴等靈長(zhǎng)類(lèi)的細(xì)胞比猴等的異種細(xì)胞的基因?qū)胄矢摺?br> 工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明用于來(lái)自靈長(zhǎng)類(lèi)的ES細(xì)胞基因?qū)胗玫腣SV-G假型化猴免疫缺陷病毒載體可以用于靈長(zhǎng)類(lèi)(包括人)的胚胎學(xué)研究、疾病研究、臨床應(yīng)用和實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。本發(fā)明的載體可以篩選能控制ES細(xì)胞特異性分化為組織或細(xì)胞的基因或試劑，該篩選方法在下述基因或試劑等的篩選中發(fā)揮優(yōu)良的效果，所述基因或試劑使組織或細(xì)胞進(jìn)行特異性分化，以獲得所需的分化細(xì)胞或分化組織。
序列表<110>花團(tuán)豐(HANAZONO Yutaka)上田泰次(UEDA Yasuji)近藤靖(KONDO Yasushi)鈴木豐(SUZUKI Yutaka)<120>利用VSG-V假型化猴免疫缺陷病毒載體將基因?qū)腱`長(zhǎng)類(lèi)胚胎干細(xì)胞<130>D3-A0103P<140>JP 02/05225<141>2002-05-29<150>JP 2001-174696<151>2001-06-08<160>40<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>1gcagatctca accaggaggc gaggctgcat tttggg 36<210>2<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>2gcgaattcta ct tactggtg ctgtaaagga gccaaa36
<210>3<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>3atcggaattc ttttattgta agatggattg gtttttaaat 40<210>4<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>4cgggatccgc ggccgcggat atggatctgt ggagatagag gaacatat 48<210>5<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>5tcgagactag tgacttggtg agtaggctt 29<210>6<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列
<400>6tcgaaagcct actcaccaag tcactactc 29<210>7<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成寡核苷酸序列<400>7aatttctcga gcggccgca 19<210>8<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成寡核苷酸序列<400>8aatttgcggc cgctcgaga 19<210>9<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>9gcggtacctg gatgggattt attactccga tagga35<210>10<211>40<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>10gcgaattcga tagggcttga aacatgggta ctatttctgc 40<210>11<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>11gcgaattccc gtttgtgcta gggttcttag gcttct 36<210>12<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>12tccccgcgga tatggatctg tggagataga ggaacatatc 40<210>13<211>44<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>13gcgcggccgc ggatccgtcg acgcactttt taaaagaaaa ggga 44
<210>14<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>14gcgagctcta atgcaggcaa gtttattagc tttcta 36<210>15<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>15ggaattcccg cggtagttat taatagtaat caattacggg 40<210>16<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>16cgggatccgc ggccgcttac ttgtacagct cgtccatgcc 40<210>17<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列
<400>17atcggaattc ttttattgta agatggattg gtttttaaat 40<210>18<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>18ataagaatgc ggccgctagc taagctgaat gaggagggtc aggcaactgt50<210>19<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>19gcgaattccc gtttgtgcta gggttcttag gcttct 36<210>20<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>20agctagctag gctagcggat atggatctgt ggagatagag gaacatat 48<210>21<211>39<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>21tatataagca gagctcgctg gcttgtaact cagtctctt39<210>22<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>22tatataagtg cagtacgctg gcttgtaact cagtctctta 40<210>23<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>23tataaaaagc gaagccgctg gcttgtaact cagtctctta 40<210>24<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>24
gcgaattcga tagggcttga aacatgggta ctatttctgc 40<210>25<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>25cggggtacct caatattggc cattagccat attattcatt 40<210>26<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>26agttacaagc cagcgagctc tgcttatata gacctcccac 40<210>27<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>27gcggtaccta gttattaata gtaatcaatt acggg35<210>28<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>28agttacaagc cagcgagctc tgcttatata gacctcccac 40<210>29<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>29gcggtaccag gctccccagc aggcagaagt atgca35<210>30<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>30agttacaagc cagcgtactg cacttatata cggttctccc 40<210>31<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>31ggggtaccat tgattattga ctagttatta atagtaatca 40<210>32<211>40
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>32agttacaagc cagcggcttc gctttttata gggccgccgc 40<210>33<211>99<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>33atgcgagctc gtcgacgcac tttttaaaag aaaagggagg actggatggg atttattact 60ccgataggac gctggcttgt aactcagtct cttactagg99<210>34<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>34gcgagctcta atgcaggcaa gtttattagc tttcta 36<210>35<211>99<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列
<400>35atgcgagctc gtcgacgcac tttttaaaag aaaagggagg actggatggg atttattact 60ccgataggat caatattggc cattagccat attattcat99<210>36<211>99<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>36atgcgagctc gtcgacgcac tttttaaaag aaaagggagg actggatggg atttattact 60ccgataggaa ggctccccag caggcagaag tatgcaaag99<210>37<211>99<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>37atgcgagctc gtcgacgcac tttttaaaag aaaagggagg actggatggg atttattact 60ccgataggac attgattatt gactagttat taatagtaa99<210>38<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>38gcgagctcta atgcaggcaa gtttattagc tttcta 36<210>39<211>40
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>39atcggaattc ggccgccatg gtgagcaagg gcgaggagct 40<210>40<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>40cgggatccgc ggccgcttac ttgtacagct cgtccatgcc 40
權(quán)利要求
1.一種重組猴免疫缺陷病毒載體，用于將基因?qū)腱`長(zhǎng)類(lèi)胚胎干細(xì)胞，該載體被VSV-G假型化。
2.權(quán)利要求1所述的載體，其中重組猴免疫缺陷病毒載體來(lái)自agm株。
3.權(quán)利要求1或2所述的載體，其中重組猴免疫缺陷病毒載體為自我失活型。
4.權(quán)利要求1～3中任意一項(xiàng)所述的載體，其中靈長(zhǎng)類(lèi)屬于舊世界靈長(zhǎng)類(lèi)獼猴科獼猴屬。
5.權(quán)利要求1～4中任意一項(xiàng)所述的載體，其攜帶可以表達(dá)的外源基因。
6.權(quán)利要求5所述的載體，其中外源基因?yàn)榫幋a選自綠色熒光蛋白、β-半乳糖苷酶和螢光素酶的蛋白質(zhì)的基因。
7.將基因?qū)腱`長(zhǎng)類(lèi)胚胎干細(xì)胞的方法，其包括使權(quán)利要求1～6中任意一項(xiàng)所述的重組猴免疫缺陷病毒載體與靈長(zhǎng)類(lèi)胚胎干細(xì)胞接觸的步驟。
8.靈長(zhǎng)類(lèi)胚胎干細(xì)胞，所述細(xì)胞中導(dǎo)入了權(quán)利要求1～6任一項(xiàng)所述的重組猴免疫缺陷病毒載體。
9.由權(quán)利要求8所述的靈長(zhǎng)類(lèi)胚胎干細(xì)胞增殖和/或分化生成的細(xì)胞。
10.一種檢測(cè)基因?qū)雽?duì)ES細(xì)胞增殖或分化的效果的方法，該方法包括以下步驟(a)將權(quán)利要求1～6中任意一項(xiàng)所述的載體導(dǎo)入靈長(zhǎng)類(lèi)胚胎干細(xì)胞；(b)檢測(cè)該胚胎干細(xì)胞的增殖或分化。
全文摘要
本發(fā)明利用被VSV－G蛋白假型化的猴免疫缺陷病毒載體(SIV)，成功地將基因高效導(dǎo)入靈長(zhǎng)類(lèi)胚胎干細(xì)胞，其中所述VSV－G蛋白為水泡性口炎病毒(VSV)的表面糖蛋白。本發(fā)明提供用于將基因?qū)腱`長(zhǎng)類(lèi)胚胎干細(xì)胞的猴免疫缺陷病毒載體。用上述載體介導(dǎo)的靈長(zhǎng)類(lèi)胚胎干細(xì)胞基因?qū)肟梢杂糜陟`長(zhǎng)類(lèi)的胚胎學(xué)研究、疾病研究、臨床應(yīng)用和實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷龋硗?，可用于從胚胎干?xì)胞獲得所需的分化細(xì)胞或分化組織，也可以用于分析和篩選使組織或細(xì)胞特異性分化的基因或試劑。
文檔編號(hào)G01N33/50GK1571844SQ0281555
公開(kāi)日2005年1月26日 申請(qǐng)日期2002年5月29日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月8日
發(fā)明者花園豐, 上田泰次, 近藤靖, 鈴木豐 申請(qǐng)人:株式會(huì)社載體研究所, 田邊制藥株式會(huì)社