專利名稱：除草劑代謝蛋白質(zhì),其基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有代謝除草化合物能力的蛋白質(zhì)(除草劑代謝蛋白質(zhì))，其基因及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
當(dāng)使用時除草劑是以需要量的稀釋液利用。存在過量剩余的情形。還存在其中施用的除草劑在它施用片刻后殘留在土壤或植物殘體中的情形。最初，假定已經(jīng)檢查這些除草劑的安全性，這些少量的剩余溶液或殘余物對環(huán)境或此后栽培的作物產(chǎn)生小的影響。然而，如果存在將包含的除草化合物轉(zhuǎn)化為一種低除草活性的化合物的方法，那么例如可以根據(jù)需要進(jìn)行鈍化上述剩余溶液或殘余物的處理。
另外，在使用除草劑的情形中，存在難以將栽培植物與近似種的雜草區(qū)別以選擇性地僅控制雜草的情形。因而，需要開發(fā)賦予靶植物除草劑抗性的新方法。

發(fā)明內(nèi)容
在這種情形下，本發(fā)明人深入研究，結(jié)果已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過與特定的蛋白質(zhì)反應(yīng)可以將原卟啉原氧化酶(在下文中，有時稱為“PPO”)抑制型的除草化合物轉(zhuǎn)化為低除草活性的化合物，其導(dǎo)致本發(fā)明的完成。
即，本發(fā)明提供1.編碼除草劑代謝蛋白的DNA，其中所述蛋白質(zhì)選自(A1)包含在SEQ ID NO1中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A2)包含在SEQ ID NO2中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A3)包含在SEQ ID NO3中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A4)包含在SEQ ID NO108中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A5)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力， 并包含與在SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO108中任何一個表示的氨基酸序列具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列；(A6)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并包含核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述核苷酸序列與編碼在SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO108中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少80％的序列同一性；(A11)包含在SEQ ID NO159中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A12)包含在SEQ ID NO160中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A13)包含在SEQ ID NO136中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A14)包含在SEQ ID NO137中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A15)包含在SEQ ID NO138中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A16)包含在SEQ ID NO215中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A17)包含在SEQ ID NO216中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；
(A18)包含在SEQ ID NO217中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A19)包含在SEQ ID NO218中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A20)包含在SEQ ID NO219中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A21)包含在SEQ ID NO220中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A22)包含在SEQ ID NO221中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A23)包含在SEQ ID NO222中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A24)包含在SEQ ID NO223中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A25)包含在SEQ ID NO224中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A26)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并包含與在SEQ ID NO159，SEQ ID NO136，SEQ ID NO137，SEQ ID NO138，SEQ ID NO217，SEQ ID NO219，SEQ ID NO220，SEQ ID NO221或SEQ ID NO223中任何一個表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或與在SEQ ID NO160，SEQ ID NO215，SEQ ID NO216，SEQ ID NO218，SEQ ID NO222或SEQ ID NO224中任何一個表示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
(A27)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并包含核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述核苷酸序列與編碼在SEQ ID NO159，SEQ ID NO160，SEQ ID NO136，SEQ ID NO137，SEQ ID NO138，SEQ ID NO215，SEQ ID NO216，SEQ ID NO217，SEQ ID NO218，SEQ ID NO219，SEQID NO220，SEQ ID NO221，SEQ ID NO222，SEQ ID NO223或SEQ IDNO224中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少90％的序列同一性；和(A28)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并包含由可通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增的DNA所編碼的氨基酸序列，所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)使用包含在SEQ ID NO124至128中任何一個表示的核苷酸序列的引物和包含在SEQ ID NO129中表示的核苷酸序列的引物，并且模板為暗產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces phaeochromogenes)，磚紅色鏈霉菌(Streptomycestestaceus)，不產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces achromogenes)，灰褐鏈霉菌(Streptomyces griseofuscus)，熱淡天藍(lán)鏈霉菌(Streptomycesthermocoerulescens)，黑胡桃鏈霉菌(Streptomyces nogalater)，津島鏈霉菌(Streptomyces tsusimaensis)，球團(tuán)產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomycesglomerochromogenes)，橄欖產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces olivochromogenes)，裝飾鏈霉菌(Streptomyces ornatus)，灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)，羊毛鏈霉菌(Streptomyces lanatus)，三澤鏈霉菌(Streptomyces misawanensis)，蒼白色鏈霉菌(Streptomyces pallidus)，玫瑰變紅鏈霉菌(Streptomycesroseorubens)，魯?shù)劓溍咕?Streptomyces rutgersensis)，斯堡鏈霉菌(Streptomyces steffisburgensis)或塔氏糖多孢菌(Saccharopolyspora taberi)的染色體DNA；2.包含核苷酸序列的DNA，所述核苷酸序列選自(a1)在SEQ ID NO6中表示的核苷酸序列；(a2)在SEQ ID NO7中表示的核苷酸序列；(a3)在SEQ ID NO8中表示的核苷酸序列；(a4)在SEQ ID NO109中表示的核苷酸序列；(a5)在SEQ ID NO139中表示的核苷酸序列；(a6)在SEQ ID NO140中表示的核苷酸序列；(a7)在SEQ ID NO141中表示的核苷酸序列；(a8)在SEQ ID NO142中表示的核苷酸序列；(a9)在SEQ ID NO143中表示的核苷酸序列；(a10)在SEQ ID NO225中表示的核苷酸序列；(a11)在SEQ ID NO226中表示的核苷酸序列；(a12)在SEQ ID NO227中表示的核苷酸序列；(a13)在SEQ ID NO228中表示的核苷酸序列；(a14)在SEQ ID NO229中表示的核苷酸序列；(a15)在SEQ ID NO230中表示的核苷酸序列；(a16)在SEQ ID NO231中表示的核苷酸序列；(a17)在SEQ ID NO232中表示的核苷酸序列；(a18)在SEQ ID NO233中表示的核苷酸序列；
(a19)在SEQ ID NO234中表示的核苷酸序列；(a20)一種核苷酸序列，其編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列，所述蛋白質(zhì)具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，所述核苷酸序列與在SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ IDNO8或SEQ ID NO109中任何一個表示的核苷酸序列具有至少80％序列同一性；和(a21)一種核苷酸序列，其編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列，所述蛋白質(zhì)具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，所述核苷酸序列與在SEQ ID NO139，SEQ ID NO140，SEQ ID NO141，SEQ ID NO142，SEQ ID NO143，SEQ ID NO225，SEQID NO226，SEQ ID NO227，SEQ ID NO228，SEQ ID NO229，SEQ IDNO230，SEQ ID NO231，SEQ ID NO232，SEQ ID NO233或SEQ IDNO234中任何一個表示的核苷酸序列具有至少90％序列同一性；3.按照上述1的DNA，其包含編碼所述蛋白質(zhì)的氨基酸序列的核苷酸序列，其中在所述核苷酸序列中的密碼子使用是在來自引入DNA的宿主細(xì)胞物種的基因中密碼子使用±4％的范圍內(nèi)并且所述核苷酸序列的GC含量是至少40％和至多60％；4.包含在SEQ ID NO214中表示的核苷酸序列的DNA；5.包含在SEQ ID NO368中表示的核苷酸序列的DNA；6.包含在SEQ ID NO393中表示的核苷酸序列的DNA；7.一種DNA，其中具有編碼胞內(nèi)細(xì)胞器轉(zhuǎn)運信號序列的核苷酸序列的DNA連接在按照上述1的框內(nèi)DNA的上游；8.一種DNA，其中按照上述1的DNA和在宿主細(xì)胞中起作用的啟動子可操作地(operably)連接；9.包含按照上述1的DNA的載體；10.一種產(chǎn)生載體的方法，其包含將按照上述1的DNA插入可在宿主中復(fù)制的載體的步驟；11.一種轉(zhuǎn)化體，其中將按照上述1的DNA引入宿主細(xì)胞；12.按照上述11的轉(zhuǎn)化體，其中所述宿主細(xì)胞是微生物細(xì)胞或植物細(xì)胞；
13.一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)化體的方法，其包含將按照上述1的DNA引入宿主細(xì)胞的步驟；14.一種產(chǎn)生具有將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力的蛋白質(zhì)的方法，所述方法包含培養(yǎng)按照上述11的轉(zhuǎn)化體和回收產(chǎn)生的所述蛋白質(zhì)的步驟；15.按照上述1的DNA在生產(chǎn)具有將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力的蛋白質(zhì)中的應(yīng)用；16.一種給予植物除草劑抗性的方法，所述方法包含將按照上述1的DNA引入植物細(xì)胞和在其中表達(dá)的步驟；17.一種多核苷酸，其具有按照上述1的DNA的部分核苷酸序列或與所述部分核苷酸序列互補的核苷酸序列；18.一種檢測編碼具有將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力的蛋白質(zhì)的DNA的方法，所述方法包含檢測在雜交中與探針雜交的DNA的步驟，其使用按照上述1的DNA或按照上述17的多核苷酸作為探針；19.一種檢測編碼具有將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力的蛋白質(zhì)的DNA的方法，所述方法包含檢測在以按照上述17的多核苷酸作為引物的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中擴(kuò)增的DNA的步驟；20.按照上述19的方法，其中引物中至少一種選自包含在SEQ IDNO124至128中任何一個表示的核苷酸序列的多核苷酸組成的組和包含在SEQ ID NO129中顯示的核苷酸序列的多核苷酸；21.一種獲得編碼具有將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力的蛋白質(zhì)的DNA的方法，所述方法包含回收通過按照上述18或19的方法檢測的DNA的步驟；22.一種篩選含有編碼具有將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力的蛋白質(zhì)的DNA的細(xì)胞的方法，所述方法包含通過按照上述18或19的方法從試驗細(xì)胞中檢測所述DNA的步驟；23.一種除草劑代謝蛋白，其選自(A1)包含在SEQ ID NO1中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A2)包含在SEQ ID NO2中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A3)包含在SEQ ID NO3中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；
(A4)包含在SEQ ID NO108中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A5)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含與在SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO108中任何一個表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；(A6)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述核苷酸序列與編碼在SEQ ID NO1，SEQ IDNO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO108中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少80％序列同一性；(A11)包含在SEQ ID NO159中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A12)包含在SEQ ID NO160中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A13)包含在SEQ ID NO136中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A14)包含在SEQ ID NO137中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A15)包含在SEQ ID NO138中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A16)包含在SEQ ID NO215中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A17)包含在SEQ ID NO216中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A18)包含在SEQ ID NO217中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A19)包含在SEQ ID NO218中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A20)包含在SEQ ID NO219中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A21)包含在SEQ ID NO220中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A22)包含在SEQ ID NO221中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A23)包含在SEQ ID NO222中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A24)包含在SEQ ID NO223中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A25)包含在SEQ ID NO224中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A26)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含與在SEQ IDNO159，SEQ ID NO136，SEQ ID NO137，SEQ ID NO138，SEQ IDNO217，SEQ ID NO219，SEQ ID NO220，SEQ ID NO221或SEQ IDNO223中任何一個表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或與在SEQ ID NO160，SEQ ID NO215，SEQ ID NO216，SEQ IDNO218，SEQ ID NO222或SEQ ID NO224中任何一個表示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；(A27)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述核苷酸序列與編碼在SEQ ID NO159，SEQ IDNO160，SEQ ID NO136，SEQ ID NO137，SEQ ID NO138，SEQ IDNO215，SEQ ID NO216，SEQ ID NO217，SEQ ID NO218，SEQ IDNO219，SEQ ID NO220，SEQ ID NO221，SEQ ID NO222，SEQ IDNO223或SEQ ID NO224中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少90％序列同一性；和(A28)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并包含由可通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增的DNA所編碼的氨基酸序列，所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)使用包含在SEQ ID NO124至128中任何一個表示的核苷酸序列的引物和包含在SEQ ID NO129中表示的核苷酸序列的引物，并且模板為暗產(chǎn)色鏈霉菌，磚紅色鏈霉菌，不產(chǎn)色鏈霉菌，灰褐鏈霉菌，熱淡天藍(lán)鏈霉菌，黑胡桃鏈霉菌，津島鏈霉菌，球團(tuán)產(chǎn)色鏈霉菌，橄欖產(chǎn)色鏈霉菌，裝飾鏈霉菌，灰色鏈霉菌，羊毛鏈霉菌，三澤鏈霉菌，蒼白色鏈霉菌，玫瑰變紅鏈霉菌，魯?shù)劓溍咕?，斯堡鏈霉菌或塔氏糖多孢菌的染色體DNA；24.一種識別除草劑代謝蛋白的抗體，所述除草劑代謝蛋白選自由下式物質(zhì)組成的組(A1)包含在SEQ ID NO1中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A2)包含在SEQ ID NO2中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A3)包含在SEQ ID NO3中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A4)包含在SEQ ID NO108中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A5)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含與在SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO108中任何一個表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；
(A6)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述核苷酸序列與編碼在SEQ ID NO1，SEQ IDNO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO108中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少80％序列同一性；(A11)包含在SEQ ID NO159中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A12)包含在SEQ ID NO160中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A13)包含在SEQ ID NO136中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A14)包含在SEQ ID NO137中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A15)包含在SEQ ID NO138中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A16)包含在SEQ ID NO215中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A17)包含在SEQ ID NO216中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A18)包含在SEQ ID NO217中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A19)包含在SEQ ID NO218中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A20)包含在SEQ ID NO219中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A21)包含在SEQ ID NO220中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A22)包含在SEQ ID NO221中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A23)包含在SEQ ID NO222中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A24)包含在SEQ ID NO223中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A25)包含在SEQ ID NO224中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A26)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含與在SEQ IDNO159，SEQ ID NO136，SEQ ID NO137，SEQ ID NO138，SEQ IDNO217，SEQ ID NO219，SEQ ID NO220，SEQ ID NO221或SEQ IDNO223中任何一個表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或與在SEQ ID NO160，SEQ ID NO215，SEQ ID NO216，SEQ IDNO218，SEQ ID NO222或SEQ ID NO224中任何一個表示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；(A27)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述核苷酸序列與編碼在SEQ ID NO159，SEQ IDNO160，SEQ ID NO136，SEQ ID NO137，SEQ ID NO138，SEQ IDNO215，SEQ ID NO216，SEQ ID NO217，SEQ ID NO218，SEQ IDNO219，SEQ ID NO220，SEQ ID NO221，SEQ ID NO222，SEQ IDNO223或SEQ ID NO224中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少90％序列同一性；和(A28)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并包含由可通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增的DNA所編碼的氨基酸序列，所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)使用包含在SEQ ID NO124至128中任何一個表示的核苷酸序列的引物和包含在SEQ ID NO129中表示的核苷酸序列的引物，并且模板為暗產(chǎn)色鏈霉菌，磚紅色鏈霉菌，不產(chǎn)色鏈霉菌，灰褐鏈霉菌，熱淡天藍(lán)鏈霉菌，黑胡桃鏈霉菌，津島鏈霉菌，球團(tuán)產(chǎn)色鏈霉菌，橄欖產(chǎn)色鏈霉菌，裝飾鏈霉菌，灰色鏈霉菌，羊毛鏈霉菌，三澤鏈霉菌，蒼白色鏈霉菌，玫瑰變紅鏈霉菌，魯?shù)劓溍咕贡ゆ溍咕蛩咸嵌噫呔娜旧wDNA；25.一種檢測除草劑代謝蛋白的方法，所述方法包含(1)將試樣與識別所述蛋白質(zhì)的抗體接觸的步驟和(2)檢測由所述接觸產(chǎn)生的、所述蛋白質(zhì)和所述抗體的復(fù)合體的步驟，其中所述蛋白質(zhì)選自由下式物質(zhì)組成的組(A1)包含在SEQ ID NO1中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A2)包含在SEQ ID NO2中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A3)包含在SEQ ID NO3中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A4)包含在SEQ ID NO108中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A5)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含與在SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO108中任何一個表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；(A6)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述核苷酸序列與編碼在SEQ ID NO1，SEQ IDNO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO108中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少80％序列同一性；(A11)包含在SEQ ID NO159中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A12)包含在SEQ ID NO160中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A13)包含在SEQ ID NO136中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A14)包含在SEQ ID NO137中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A15)包含在SEQ ID NO138中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A16)包含在SEQ ID NO215中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A17)包含在SEQ ID NO216中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A18)包含在SEQ ID NO217中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A19)包含在SEQ ID NO218中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A20)包含在SEQ ID NO219中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A21)包含在SEQ ID NO220中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A22)包含在SEQ ID NO221中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A23)包含在SEQ ID NO222中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A24)包含在SEQ ID NO223中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A25)包含在SEQ ID NO224中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A26)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含與在SEQ IDNO159，SEQ ID NO136，SEQ ID NO137，SEQ ID NO138，SEQ IDNO217，SEQ ID NO219，SEQ ID NO220，SEQ ID NO221或SEQ IDNO223中任何一個表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或與在SEQ ID NO160，SEQ ID NO215，SEQ ID NO216，SEQ IDNO218，SEQ ID NO222或SEQ ID NO224中任何一個表示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；(A27)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述核苷酸序列與編碼在SEQ ID NO159，SEQ IDNO160，SEQ ID NO136，SEQ ID NO137，SEQ ID NO138，SEQ IDNO215，SEQ ID NO216，SEQ ID NO217，SEQ ID NO218，SEQ IDNO219，SEQ ID NO220，SEQ ID NO221，SEQ ID NO222，SEQ IDNO223或SEQ ID NO224中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少90％序列同一性；和(A28)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并包含由可通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增的DNA所編碼的氨基酸序列，所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)使用包含在SEQ ID NO124至128中任何一個表示的核苷酸序列的引物和包含在SEQ ID NO129中表示的核苷酸序列的引物，并且模板為暗產(chǎn)色鏈霉菌，磚紅色鏈霉菌，不產(chǎn)色鏈霉菌，灰褐鏈霉菌，熱淡天藍(lán)鏈霉菌，黑胡桃鏈霉菌，津島鏈霉菌，球團(tuán)產(chǎn)色鏈霉菌，橄欖產(chǎn)色鏈霉菌，裝飾鏈霉菌，灰色鏈霉菌，羊毛鏈霉菌，三澤鏈霉菌，蒼白色鏈霉菌，玫瑰變紅鏈霉菌，魯?shù)劓溍咕?，斯堡鏈霉菌或塔氏糖多孢菌的染色體DNA；26.一種分析或檢測試劑盒，其包含按照上述24的抗體；27.一種編碼鐵氧還蛋白的DNA，所述鐵氧還蛋白選自由下式物質(zhì)組成的組(B1)包含在SEQ ID NO12中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B2)包含在SEQ ID NO13中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B3)包含在SEQ ID NO14中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B4)包含在SEQ ID NO111中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B5)包含與在SEQ ID NO12，SEQ ID NO13，SEQ ID NO14或SEQID NO111中任何一個表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的鐵氧還蛋白；(B6)包含由核苷酸序列編碼的氨基酸序列的鐵氧還蛋白，其中所述核苷酸序列與編碼在SEQ ID NO12，SEQ ID NO13，SEQ ID NO14或SEQID NO111中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少90％序列同一性；(B7)包含在SEQ ID NO149中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B8)包含在SEQ ID NO150中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B9)包含在SEQ ID NO151中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B10)包含在SEQ ID NO152中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；
(B11)包含在SEQ ID NO153中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B12)一種鐵氧還蛋白，其包含與在SEQ ID NO149，SEQ IDNO151，SEQ ID NO152，SEQ ID NO153，SEQ ID NO245，SEQ IDNO247，SEQ ID NO248，SEQ ID NO249，SEQ ID NO250，SEQ IDNO251或SEQ ID NO253中任何一個表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或與在SEQ ID NO150，SEQ ID NO252或SEQ IDNO254中任何一個表示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；(B13)一種鐵氧還蛋白，其包含由核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述核苷酸序列與編碼在SEQ ID NO149，SEQ ID NO150，SEQ IDNO151，SEQ ID NO152，SEQ ID NO153，SEQ ID NO245，SEQ IDNO247，SEQ ID NO248，SEQ ID NO249，SEQ ID NO250，SEQ IDNO251，SEQ ID NO252，SEQ ID NO253或SEQ ID NO254中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少90％序列同一性；(B14)包含在SEQ ID NO245中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B15)包含在SEQ ID NO247中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B16)包含在SEQ ID NO248中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B17)包含在SEQ ID NO249中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B18)包含在SEQ ID NO250中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B19)包含在SEQ ID NO251中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B20)包含在SEQ ID NO252中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B21)包含在SEQ ID NO253中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；和(B22)包含在SEQ ID NO254中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；28.包含核苷酸序列的DNA，所述核苷酸序列選自由下述物質(zhì)組成的組(b1)在SEQ ID NO15中表示的核苷酸序列；(b2)在SEQ ID NO16中表示的核苷酸序列；(b3)在SEQ ID NO17中表示的核苷酸序列；(b4)在SEQ ID NO112中表示的核苷酸序列；(b5)在SEQ ID NO154中表示的核苷酸序列；
(b6)在SEQ ID NO155中表示的核苷酸序列；(b7)在SEQ ID NO156中表示的核苷酸序列；(b8)在SEQ ID NO157中表示的核苷酸序列；(b9)在SEQ ID NO158中表示的核苷酸序列；(b10)在SEQ ID NO255中表示的核苷酸序列；(b11)在SEQ ID NO257中表示的核苷酸序列；(b12)在SEQ ID NO258中表示的核苷酸序列；(b13)在SEQ ID NO259中表示的核苷酸序列；(b14)在SEQ ID NO260中表示的核苷酸序列；(b15)在SEQ ID NO261中表示的核苷酸序列；(b16)在SEQ ID NO262中表示的核苷酸序列；(b17)在SEQ ID NO263中表示的核苷酸序列；(b18)在SEQ ID NO264中表示的核苷酸序列；和(b19)一種核苷酸序列，其與在SEQ ID NO15，SEQ ID NO16，SEQID NO17，SEQ ID NO112，SEQ ID NO154，SEQ ID NO155，SEQ IDNO156，SEQ ID NO157，SEQ ID NO158，SEQ ID NO255，SEQ IDNO257，SEQ ID NO258，SEQ ID NO259，SEQ ID NO260，SEQ IDNO261，SEQ ID NO262，SEQ ID NO263或SEQ ID NO264中任何一個表示的核苷酸序列具有至少90％序列同一性29.一種包含按照上述28的DNA的載體；30.一種轉(zhuǎn)化體，其中將按照上述28的DNA引入宿主細(xì)胞；31.一種鐵氧還蛋白，其選自由下述物質(zhì)組成的組(B1)包含在SEQ ID NO12中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B2)包含在SEQ ID NO13中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B3)包含在SEQ ID NO14中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B4)包含在SEQ ID NO111中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B5)包含與在SEQ ID NO12，SEQ ID NO13，SEQ ID NO14或SEQID NO111中任何一個表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的鐵氧還蛋白；(B6)包含由核苷酸序列編碼的氨基酸序列的鐵氧還蛋白，其中所述核苷酸序列與編碼在SEQ ID NO12，SEQ ID NO13，SEQ ID NO14或SEQID NO111中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少90％序列同一性；(B7)包含在SEQ ID NO149中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B8)包含在SEQ ID NO150中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B9)包含在SEQ ID NO151中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B10)包含在SEQ ID NO152中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B11)包含在SEQ ID NO153中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B12)一種鐵氧還蛋白，其包含與在SEQ ID NO149，SEQ IDNO151，SEQ ID NO152，SEQ ID NO153，SEQ ID NO245，SEQ IDNO247，SEQ ID NO248，SEQ ID NO249，SEQ ID NO250，SEQ IDNO251或SEQ ID NO253中任何一個表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或與在SEQ ID NO150，SEQ ID NO252或SEQ IDNO254中任何一個表示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；(B13)一種鐵氧還蛋白，其包含由核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述核苷酸序列與編碼在SEQ ID NO149，SEQ ID NO150，SEQ IDNO151，SEQ ID NO152，SEQ ID NO153，SEQ ID NO245，SEQ IDNO247，SEQ ID NO248，SEQ ID NO249，SEQ ID NO250，SEQ IDNO251，SEQ ID NO252，SEQ ID NO253或SEQ ID NO254中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少90％序列同一性；(B14)包含在SEQ ID NO245中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B15)包含在SEQ ID NO247中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B16)包含在SEQ ID NO248中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B17)包含在SEQ ID NO249中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B18)包含在SEQ ID NO250中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B19)包含在SEQ ID NO251中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B20)包含在SEQ ID NO252中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B21)包含在SEQ ID NO253中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；和(B22)包含在SEQ ID NO254中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；
32.一種包含核苷酸序列的DNA，所述核苷酸序列選自由下述物質(zhì)組成的組(ab1)在SEQ ID NO9中表示的核苷酸序列；(ab2)在SEQ ID NO10中表示的核苷酸序列；(ab3)在SEQ ID NO11中表示的核苷酸序列；(ab4)在SEQ ID NO110中表示的核苷酸序列；(ab5)在SEQ ID NO144中表示的核苷酸序列；(ab6)在SEQ ID NO145中表示的核苷酸序列；(ab7)在SEQ ID NO146中表示的核苷酸序列；(ab8)在SEQ ID NO147中表示的核苷酸序列；(ab9)在SEQ ID NO148中表示的核苷酸序列；(ab10)在SEQ ID NO235中表示的核苷酸序列；(ab11)在SEQ ID NO236中表示的核苷酸序列；(ab12)在SEQ ID NO237中表示的核苷酸序列；(ab13)在SEQ ID NO238中表示的核苷酸序列；(ab14)在SEQ ID NO239中表示的核苷酸序列；(ab15)在SEQ ID NO240中表示的核苷酸序列；(ab16)在SEQ ID NO241中表示的核苷酸序列；(ab17)在SEQ ID NO242中表示的核苷酸序列；(ab18)在SEQ ID NO243中表示的核苷酸序列；和(ab19)在SEQ ID NO244中表示的核苷酸序列；33.包含按照上述32的DNA的載體；34.一種轉(zhuǎn)化體，其中將按照上述32的DNA引入宿主細(xì)胞；35.按照上述34的轉(zhuǎn)化體，其中所述宿主細(xì)胞是微生物細(xì)胞或植物細(xì)胞；36.一種生產(chǎn)轉(zhuǎn)化體的方法，其包含將按照上述32的DNA引入宿主細(xì)胞的步驟；37.一種生產(chǎn)具有將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力的蛋白質(zhì)的方法，所述方法包含培養(yǎng)按照上述34的轉(zhuǎn)化體和回收產(chǎn)生的所述蛋白質(zhì)的步驟；
38.一種控制雜草的方法，其包含將化合物施用于表達(dá)至少一種除草劑代謝蛋白的植物的栽培區(qū)域的步驟，所述除草劑代謝蛋白選自由下述物質(zhì)組成的組(A1)包含在SEQ ID NO1中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A2)包含在SEQ ID NO2中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A3)包含在SEQ ID NO3中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A4)包含在SEQ ID NO108中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A5)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含與在SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO108中任何一個表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；(A6)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述核苷酸序列與編碼在SEQ ID NO1，SEQ IDNO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO108中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少80％序列同一性；(A7)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含由DNA編碼的氨基酸序列，所述DNA在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與包含編碼在SEQ ID NO1，SEQ IDNO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO108中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列的DNA雜交；(A8)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并包含由可通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增的DNA所編碼的氨基酸序列，所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)使用包含在SEQ ID NO129中表示的核苷酸序列的引物和包含在SEQ ID NO124至128中任何一個表示的核苷酸序列的引物，并且模板為屬于鏈霉菌屬(Streptomyces)或糖多孢菌屬(Saccharopolyspora)微生物的染色體；(A9)包含在SEQ ID NO4中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A11)包含在SEQ ID NO159中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A12)包含在SEQ ID NO160中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；
(A13)包含在SEQ ID NO136中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A14)包含在SEQ ID NO137中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A15)包含在SEQ ID NO138中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A16)包含在SEQ ID NO215中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A17)包含在SEQ ID NO216中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A18)包含在SEQ ID NO217中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A19)包含在SEQ ID NO218中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A20)包含在SEQ ID NO219中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A21)包含在SEQ ID NO220中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A22)包含在SEQ ID NO221中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A23)包含在SEQ ID NO222中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A24)包含在SEQ ID NO223中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A25)包含在SEQ ID NO224中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A26)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含與在SEQ IDNO159，SEQ ID NO136，SEQ ID NO137，SEQ ID NO138，SEQ IDNO217，SEQ ID NO219，SEQ ID NO220，SEQ ID NO221或SEQ IDNO223中任何一個表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或與在SEQ ID NO160，SEQ ID NO215，SEQ ID NO216，SEQ IDNO218，SEQ ID NO222或SEQ ID NO224中任何一個表示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和(A27)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述核苷酸序列與編碼在SEQ ID NO159，SEQ IDNO160，SEQ ID NO136，SEQ ID NO137，SEQ ID NO138，SEQ IDNO215，SEQ ID NO216，SEQ ID NO217，SEQ ID NO218，SEQ IDNO219，SEQ ID NO220，SEQ ID NO221，SEQ ID NO222，SEQ IDNO223或SEQ ID NO224中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少90％序列同一性，其中所述化合物是式(I)的化合物
其中在式(I)中，G表示在下列G-1至G-9中任何一個表示的基團(tuán)
其中在G-1至G-9中，X表示氧原子或硫原子；Y表示氧原子或硫原子；R1表示氫原子或鹵原子；R2表示氫原子，C1-C8烷基，C1-C8鹵代烷基，鹵原子，羥基，-OR9基團(tuán)，-SH基團(tuán)，-S(O)pR9基團(tuán)，-COR9基團(tuán)，-CO2R9基團(tuán)，-C(O)SR9基團(tuán)，-C(O)NR11R12基團(tuán)，-CONH2基團(tuán)，-CHO基團(tuán)，-CR9＝NOR18基團(tuán)，-CH＝CR19CO2R9基團(tuán)，-CH2CHR19CO2R9基團(tuán)，-CO2N＝CR13R14基團(tuán)，硝基，氰基，-NHSO2R15基團(tuán)，-NHSO2NHR15基團(tuán)，-NR9R20基團(tuán)，-NH2基團(tuán)或苯基，其可以被一個或多個相同或不同的C1-C4烷基取代；p表示0，1或2；R3表示C1-C2烷基，C1-C2鹵代烷基，-OCH3基團(tuán)，-SCH3基團(tuán)，-OCHF2基團(tuán)，鹵原子，氰基，硝基或C1-C3烷氧基，其用在苯環(huán)上可以被選自鹵原子，C1-C3烷基，C1-C3鹵代烷基，OR28基團(tuán)，NR11R28基團(tuán)，SR28基團(tuán)，氰基，CO2R28基團(tuán)和硝基中的至少一個取代基取代的苯基取代；R4表示氫原子，C1-C3烷基，C1-C3鹵代烷基；R5表示氫原子，C1-C3烷基，C1-C3鹵代烷基，環(huán)丙基，乙烯基，C2炔基，氰基，-C(O)R20基團(tuán)，-CO2R20基團(tuán)，-C(O)NR20R21基團(tuán)，-CHR16R17CN基團(tuán)，-CR16R17C(O)R20基團(tuán)，-CR16R17CO2R20基團(tuán)，-CR16R17C(O)NR20R21基團(tuán)，-CHR16OH基團(tuán)，-CHR16OC(O)R20基團(tuán)或-OCHR16OC(O)NR20R21基團(tuán)，或當(dāng)G表示G-2或G-6時，R4和R5可以表示與它們結(jié)合的碳原子一起的C＝O基團(tuán)；R6表示C1-C6烷基，C1-C6鹵代烷基，C2-C6烷氧基烷基，C3-C6烯基或C3-C6炔基；R7表示氫原子，C1-C6烷基，C1-C6鹵代烷基，鹵原子，-S(O)2(C1-C6烷基)或-C(＝O)R22基團(tuán)；
R8表示氫原子，C1-C8烷基，C3-C8環(huán)烷基，C3-C8烯基，C3-C8炔基，C1-C8鹵代烷基，C2-C8烷氧基烷基，C3-C8烷氧基烷氧基烷基，C3-C8鹵代炔基，C3-C8鹵代烯基，C1-C8烷基磺酰基，C1-C8鹵代烷基磺?；?，C3-C8烷氧羰基烷基，-S(O)2NH(C1-C8烷基)基團(tuán)，-C(O)R23基團(tuán)或可在苯環(huán)上被R24取代的芐基；R9表示C1-C8烷基，C3-C8環(huán)烷基，C3-C8烯基，C3-C8炔基，C1-C8鹵代烷基，C2-C8烷氧基烷基，C2-C8烷基硫代烷基，C2-C8烷基亞磺?；榛?，C2-C8烷基磺酰基烷基，C4-C8烷氧基烷氧基烷基，C4-C8環(huán)烷基烷基，C4-C8環(huán)烷氧基烷基，C4-C8烯氧基烷基，C4-C8炔氧基烷基，C3-C8鹵代烷氧基烷基，C4-C8鹵代烯氧基烷基，C4-C8鹵代炔氧基烷基，C4-C8環(huán)烷基硫代烷基，C4-C8烯基硫代烷基，C4-C8炔基硫代烷基，用在環(huán)上可以被至少一種選自鹵原子，C1-C3烷基和C1-C3鹵代烷基的取代基取代的苯氧基取代的C1-C4烷基，用在環(huán)上可以被至少一種選自鹵原子，C1-C3烷基和C1-C3鹵代烷基的取代基取代的芐氧基取代的C1-C4烷基，C4-C8trialkylsyrylalkyl基團(tuán)，C2-C8氰烷基，C3-C8鹵代環(huán)烷基，C3-C8鹵代烯基，C5-C8烷氧基烯基，C5-C8鹵代烷氧基烯基，C5-C8烷基硫代烯基，C3-C8鹵代炔基，C5-C8烷氧基炔基，C5-C8鹵代烷氧基炔基，C5-C8烷基硫代炔基，C2-C8烷基羰基，在環(huán)上可以用至少一種選自鹵原子，C1-C3烷基，C1-C3鹵代烷基，-OR28基團(tuán)，-NR11R28基團(tuán)，-SR28基團(tuán)，氰基，-CO2R28基團(tuán)和硝基的取代基取代的芐基，-CR16R17COR10基團(tuán)，-CR16R17CO2R20基團(tuán)，-CR16R17P(O)(OR10)2基團(tuán)，-CR16R17P(S)(OR10)2基團(tuán)，-CR16R17C(O)NR11R12基團(tuán)，-CR16R17C(O)NH2基團(tuán)，-C(＝CR26R27)COR10基團(tuán)，-C(＝CR26R27)CO2R20基團(tuán)，-C(＝CR26R27)P(O)(OR10)2基團(tuán)，-C(＝CR26R27)P(S)(OR10)2基團(tuán)，-C(＝CR26R27)C(O)NR11R12基團(tuán)，-C(＝CR26R27)C(O)NH2基團(tuán)，或在Q-1至Q-7表示的環(huán)中的任何一個 其在環(huán)上可以被至少一種選自鹵原子，C1-C6烷基，C1-C6鹵代烷基，C2-C6烯基，C2-C6鹵代烯基，C2-C6炔基，C3-C6鹵代炔基，C2-C8烷氧基烷基，-OR28基團(tuán)，-SR28基團(tuán)，-NR11R28基團(tuán)，C3-C8烷氧羰基烷基，C2-C4羧基烷基，-CO2R28基團(tuán)和氰基的取代基取代；R10表示C1-C6烷基，C2-C6烯基，C3-C6炔基或四氫呋喃基團(tuán)；R11和R13獨立地表示氫原子或C1-C4烷基；R12表示C1-C6烷基，C3-C6環(huán)烷基，C3-C6烯基，C3-C6炔基，C2-C6烷氧基烷基，C1-C6鹵代烷基，C3-C6鹵代烯基，C3-C6鹵代炔基，在環(huán)上可以被至少一種取代基取代的苯基，所述取代基選自鹵原子，C1-C4烷基和C1-C4烷氧基，或-CR16R17CO2R25基團(tuán)；或，R11和R12一起可以表示-(CH2)5-，-(CH2)4-，或-CH2CH2OCH2CH2-，或者如果是那樣的話，產(chǎn)生的環(huán)可以用選自C1-C3烷基，苯基和芐基的取代基取代；R14表示C1-C4烷基或在環(huán)上可以用選自鹵原子，C1-C3烷基和C1-C3鹵代烷基取代的苯基；或，R13和R14可以與它們結(jié)合的碳原子一起表示C3-C8環(huán)烷基；R15表示C1-C4烷基，C1-C4鹵代烷基或C3-C6烯基；R16和R17獨立地表示氫原子或C1-C4烷基，C1-C4鹵代烷基，C2-C4烯基，C2-C4鹵代烯基，C2-C4炔基，C3-C4鹵代炔基；或，R16和R17可以與它們結(jié)合的碳原子一起表示C3-C6環(huán)烷基，或者如此形成的環(huán)可以用至少一種選自鹵原子，C1-C3烷基和C1-C3鹵代烷基的取代基取代；R18表示氫原子，C1-C6烷基，C3-C6烯基或C3-C6炔基；R19表示氫原子，C1-C4烷基或鹵原子；R20表示氫原子，C1-C6烷基，C3-C6環(huán)烷基，C3-C6烯基，C3-C6炔基，C2-C6烷氧基烷基，C1-C6鹵代烷基，C3-C6鹵代烯基，C3-C6鹵代炔基，在環(huán)上可以用至少一種取代基取代的苯基，所述取代基選自鹵原子，C1-C4烷基和-OR28基團(tuán)，或-CR16R17CO2R25基團(tuán)；R21表示氫原子，C1-C2烷基或-CO2(C1-C4烷基)基團(tuán)；R22表示氫原子，C1-C6烷基，C1-C6烷氧基或NH(C1-C6烷基)基團(tuán)；R23表示C1-C6烷基，C1-C6鹵代烷基，C1-C6烷氧基，NH(C1-C6烷基)基團(tuán)，芐基，C2-C8二烷基氨基或可以用R24取代的苯基；R24表示C1-C6烷基，1-2個鹵原子，C1-C6烷氧基或CF3基團(tuán)；R25表示C1-C6烷基，C1-C6鹵代烷基，C3-C6烯基，C3-C6鹵代烯基，C3-C6炔基或C3-C6鹵代炔基；R26和R27各自獨立地表示氫原子，C1-C4烷基，C1-C4鹵代烷基，C2-C4烯基，C2-C4鹵代烯基，C2-C4炔基，C3-C4鹵代炔基，-OR28基團(tuán)，-NHR28基團(tuán)，或-SR28基團(tuán)；或，R26和R27可以與它們結(jié)合的碳原子一起表示C3-C8環(huán)烷基，或每個如此形成的環(huán)可以用至少一種選自鹵原子，C1-C3烷基和C1-C3鹵代烷基的取代基取代；和R28表示氫原子，C1-C6烷基，C1-C6鹵代烷基，C3-C6烯基，C3-C6鹵代烯基，C3-C6炔基，C3-C6鹵代炔基，C2-C4羧基烷基，C3-C8烷氧羰基烷基，C3-C8鹵代烷氧羰基烷基，C5-C9烯氧基羰基烷基，C5-C9鹵代烯氧基羰基烷基，C5-C9炔氧基羰基烷基，C5-C9鹵代炔氧基羰基烷基，C5-C9環(huán)烷氧基羰基烷基或C5-C9鹵代環(huán)烷氧基羰基烷基；39.一種控制雜草的方法，其包含將化合物施用于表達(dá)至少一種蛋白質(zhì)的植物的栽培區(qū)域的步驟，所述蛋白質(zhì)選自由下述物質(zhì)組成的組(A1)包含在SEQ ID NO1中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A2)包含在SEQ ID NO2中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A3)包含在SEQ ID NO3中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A4)包含在SEQ ID NO108中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A5)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含與在SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO108中任何一個表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；(A6)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述核苷酸序列與編碼在SEQ ID NO1，SEQ IDNO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO108中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少80％序列同一性；
(A11)包含在SEQ ID NO159中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A12)包含在SEQ ID NO160中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A13)包含在SEQ ID NO136中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A14)包含在SEQ ID NO137中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A15)包含在SEQ ID NO138中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A16)包含在SEQ ID NO215中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A17)包含在SEQ ID NO216中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A18)包含在SEQ ID NO217中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A19)包含在SEQ ID NO218中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A20)包含在SEQ ID NO219中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A21)包含在SEQ ID NO220中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A22)包含在SEQ ID NO221中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A23)包含在SEQ ID NO222中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A24)包含在SEQ ID NO223中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A25)包含在SEQ ID NO224中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A26)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含與在SEQ IDNO159，SEQ ID NO136，SEQ ID NO137，SEQ ID NO138，SEQ IDNO217，SEQ ID NO219，SEQ ID NO220，SEQ ID NO221或SEQ IDNO223中任何一個表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或與在SEQ ID NO160，SEQ ID NO215，SEQ ID NO216，SEQ IDNO218，SEQ ID NO222或SEQ ID NO224中任何一個表示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；(A27)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述核苷酸序列與編碼在SEQ ID NO159，SEQ IDNO160，SEQ ID NO136，SEQ ID NO137，SEQ ID NO138，SEQ IDNO215，SEQ ID NO216，SEQ ID NO217，SEQ ID NO218，SEQ IDNO219，SEQ ID NO220，SEQ ID NO221，SEQ ID NO222，SEQ IDNO223或SEQ ID NO224中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少90％序列同一性；和(A28)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并包含由可通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增的DNA所編碼的氨基酸序列，所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)使用包含在SEQ ID NO124至128中任何一個表示的核苷酸序列的引物和包含在SEQ ID NO129中表示的核苷酸序列的引物，并且模板為暗產(chǎn)色鏈霉菌，磚紅色鏈霉菌，不產(chǎn)色鏈霉菌，灰褐鏈霉菌，熱淡天藍(lán)鏈霉菌，黑胡桃鏈霉菌，津島鏈霉菌，球團(tuán)產(chǎn)色鏈霉菌，橄欖產(chǎn)色鏈霉菌，裝飾鏈霉菌，灰色鏈霉菌，羊毛鏈霉菌，三澤鏈霉菌，蒼白色鏈霉菌，玫瑰變紅鏈霉菌，魯?shù)劓溍咕?，斯堡鏈霉菌或塔氏糖多孢菌的染色體DNA；40.一種評估細(xì)胞對式(I)化合物的抗性的方法，所述方法包含(1)將所述化合物與表達(dá)至少一種除草劑代謝蛋白的細(xì)胞接觸的步驟，所述除草劑代謝蛋白選自由下式物質(zhì)組成的組(A1)包含在SEQ ID NO1中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A2)包含在SEQ ID NO2中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A3)包含在SEQ ID NO3中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A4)包含在SEQ ID NO108中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A5)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含與在SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO108中任何一個表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；(A6)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述核苷酸序列與編碼在SEQ ID NO1，SEQ IDNO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO108中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少80％序列同一性；(A7)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含由DNA編碼的氨基酸序列，所述DNA在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與包含編碼在SEQ ID NO1，SEQ IDNO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO108中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列的DNA雜交；(A8)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并包含由可通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增的DNA所編碼的氨基酸序列，所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)使用包含在SEQ ID NO129中表示的核苷酸序列的引物和包含在SEQ ID NO124至128中任何一個表示的核苷酸序列的引物，并且模板為屬于鏈霉菌屬或糖多孢菌屬微生物的染色體DNA；(A9)包含在SEQ ID NO4中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A11)包含在SEQ ID NO159中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A12)包含在SEQ ID NO160中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A13)包含在SEQ ID NO136中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A14)包含在SEQ ID NO137中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A15)包含在SEQ ID NO138中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A16)包含在SEQ ID NO215中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A17)包含在SEQ ID NO216中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A18)包含在SEQ ID NO217中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A19)包含在SEQ ID NO218中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A20)包含在SEQ ID NO219中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A21)包含在SEQ ID NO220中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A22)包含在SEQ ID NO221中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A23)包含在SEQ ID NO222中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A24)包含在SEQ ID NO223中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A25)包含在SEQ ID NO224中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A26)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含與在SEQ IDNO159，SEQ ID NO136，SEQ ID NO137，SEQ ID NO138，SEQ IDNO217，SEQ ID NO219，SEQ ID NO220，SEQ ID NO221或SEQ IDNO223中任何一個表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或與在SEQ ID NO160，SEQ ID NO215，SEQ ID NO216，SEQ IDNO218，SEQ ID NO222或SEQ ID NO224中任何一個表示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和(A27)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述核苷酸序列與編碼在SEQ ID NO159，SEQ IDNO160，SEQ ID NO136，SEQ ID NO137，SEQ ID NO138，SEQ IDNO215，SEQ ID NO216，SEQ ID NO217，SEQ ID NO218，SEQ IDNO219，SEQ ID NO220，SEQ ID NO221，SEQ ID NO222，SEQ IDNO223或SEQ ID NO224中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少90％序列同一性；和(2)評估在上述步驟(1)中對接觸化合物的細(xì)胞的損傷程度的步驟；41.按照上述40的方法，其中所述細(xì)胞是微生物細(xì)胞或植物細(xì)胞；42.選擇抗式(I)化合物的細(xì)胞的方法，所述方法包含基于在按照上述40的方法中評估的抗性，選擇細(xì)胞的步驟；43.通過按照上述42的方法選擇的抗除草劑的細(xì)胞，或其培養(yǎng)物；44.一種評估植物對式(I)化合物的抗性的方法，所述方法包含(1)將所述化合物與表達(dá)至少一種除草劑代謝蛋白的植物接觸的步驟，所述除草劑代謝蛋白選自由下述物質(zhì)組成的組(A1)包含在SEQ ID NO1中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A2)包含在SEQ ID NO2中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A3)包含在SEQ ID NO3中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A4)包含在SEQ ID NO108中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A5)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含與在SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO108中任何一個表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；(A6)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述核苷酸序列與編碼在SEQ ID NO1，SEQ IDNO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO108中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少80％序列同一性；
(A7)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含由DNA編碼的氨基酸序列，所述DNA在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與包含編碼在SEQ ID NO1，SEQ IDNO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO108中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列的DNA雜交；(A8)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并包含由可通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增的DNA所編碼的氨基酸序列，所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)使用包含在SEQ ID NO129中表示的核苷酸序列的引物和包含在SEQ ID NO124至128中任何一個表示的核苷酸序列的引物，并且模板為屬于鏈霉菌屬或糖多孢菌屬微生物的染色體；(A9)包含在SEQ ID NO4中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A11)包含在SEQ ID NO159中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A12)包含在SEQ ID NO160中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A13)包含在SEQ ID NO136中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A14)包含在SEQ ID NO137中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A15)包含在SEQ ID NO138中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A16)包含在SEQ ID NO215中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A17)包含在SEQ ID NO216中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A18)包含在SEQ ID NO217中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A19)包含在SEQ ID NO218中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A20)包含在SEQ ID NO219中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A21)包含在SEQ ID NO220中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A22)包含在SEQ ID NO221中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A23)包含在SEQ ID NO222中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A24)包含在SEQ ID NO223中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A25)包含在SEQ ID NO224中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A26)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含與在SEQ IDNO159，SEQ ID NO136，SEQ ID NO137，SEQ ID NO138，SEQ IDNO217，SEQ ID NO219，SEQ ID NO220，SEQ ID NO221或SEQ IDNO223中任何一個表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或與在SEQ ID NO160，SEQ ID NO215，SEQ ID NO216，SEQ IDNO218，SEQ ID NO222或SEQ ID NO224中任何一個表示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和(A27)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述核苷酸序列與編碼在SEQ ID NO159，SEQ IDNO160，SEQ ID NO136，SEQ ID NO137，SEQ ID NO138，SEQ IDNO215，SEQ ID NO216，SEQ ID NO217，SEQ ID NO218，SEQ IDNO219，SEQ ID NO220，SEQ ID NO221，SEQ ID NO222，SEQ IDNO223或SEQ ID NO224中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少90％序列同一性；和(2)評估對在步驟(1)中描述的接觸化合物的植物的損傷程度的步驟；45.一種選擇抗式(I)化合物的植物的方法，所述方法包含基于在按照上述44的方法中評估的抗性，選擇植物的步驟；46.一種由按照上述45的方法選擇的抗除草劑植物，或其后代；47.一種處理式(I)化合物的方法，所述方法包含在含有電子供體的電子傳遞體系的存在下將所述化合物與至少一種除草劑代謝蛋白反應(yīng)，所述除草劑代謝蛋白選自由下述物質(zhì)組成的組(A1)包含在SEQ ID NO1中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A2)包含在SEQ ID NO2中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A3)包含在SEQ ID NO3中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A4)包含在SEQ ID NO108中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A5)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含與在SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO108中任何一個表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；(A6)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述核苷酸序列與編碼在SEQ ID NO1，SEQ IDNO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO108中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少80％序列同一性；(A7)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含由DNA編碼的氨基酸序列，所述DNA在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與包含編碼在SEQ ID NO1，SEQ IDNO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO108中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列的DNA雜交；(A8)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并包含由可通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增的DNA所編碼的氨基酸序列，所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)使用包含在SEQ ID NO129中表示的核苷酸序列的引物和包含在SEQ ID NO124至128中任何一個表示的核苷酸序列的引物，并且模板為屬于鏈霉菌屬或糖多孢菌屬微生物的染色體；(A9)包含在SEQ ID NO4中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A11)包含在SEQ ID NO159中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A12)包含在SEQ ID NO160中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A13)包含在SEQ ID NO136中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A14)包含在SEQ ID NO137中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A15)包含在SEQ ID NO138中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A16)包含在SEQ ID NO215中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A17)包含在SEQ ID NO216中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A18)包含在SEQ ID NO217中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A19)包含在SEQ ID NO218中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A20)包含在SEQ ID NO219中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A21)包含在SEQ ID NO220中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A22)包含在SEQ ID NO221中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A23)包含在SEQ ID NO222中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A24)包含在SEQ ID NO223中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；
(A25)包含在SEQ ID NO224中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A26)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含與在SEQ IDNO159，SEQ ID NO136，SEQ ID NO137，SEQ ID NO138，SEQ IDNO217，SEQ ID NO219，SEQ ID NO220，SEQ ID NO221或SEQ IDNO223中任何一個表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或與在SEQ ID NO160，SEQ ID NO215，SEQ ID NO216，SEQ IDNO218，SEQ ID NO222或SEQ ID NO224中任何一個表示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和(A27)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述核苷酸序列與編碼在SEQ ID NO159，SEQ IDNO160，SEQ ID NO136，SEQ ID NO137，SEQ ID NO138，SEQ IDNO215，SEQ ID NO216，SEQ ID NO217，SEQ ID NO218，SEQ IDNO219，SEQ ID NO220，SEQ ID NO221，SEQ ID NO222，SEQ IDNO223或SEQ ID NO224中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少90％序列同一性；48.按照上述47的方法，其中通過將所述化合物與轉(zhuǎn)化體接觸將所述化合物與所述除草劑代謝蛋白反應(yīng)，在所述轉(zhuǎn)化體中將編碼所述除草劑代謝蛋白的DNA引入宿主細(xì)胞中能使它在所述細(xì)胞中表達(dá)的位置；49.除草劑代謝蛋白在處理式(I)化合物中的應(yīng)用，所述除草劑代謝蛋白選自由下述物質(zhì)組成的組(A1)包含在SEQ ID NO1中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A2)包含在SEQ ID NO2中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A3)包含在SEQ ID NO3中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A4)包含在SEQ ID NO108中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A5)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含與在SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO108中任何一個表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；
(A6)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述核苷酸序列與編碼在SEQ ID NO1，SEQ IDNO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO108中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少80％序列同一性；(A7)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含由DNA編碼的氨基酸序列，所述DNA在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與包含編碼在SEQ ID NO1，SEQ IDNO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO108中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列的DNA雜交；(A8)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并包含由可通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增的DNA所編碼的氨基酸序列，所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)使用包含在SEQ ID NO129中表示的核苷酸序列的引物和包含在SEQ ID NO124至128中任何一個表示的核苷酸序列的引物，并且模板為屬于鏈霉菌屬或糖多孢菌屬微生物的染色體；(A9)包含在SEQ ID NO4中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A11)包含在SEQ ID NO159中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A12)包含在SEQ ID NO160中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A13)包含在SEQ ID NO136中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A14)包含在SEQ ID NO137中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A15)包含在SEQ ID NO138中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A16)包含在SEQ ID NO215中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A17)包含在SEQ ID NO216中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A18)包含在SEQ ID NO217中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A19)包含在SEQ ID NO218中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A20)包含在SEQ ID NO219中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A21)包含在SEQ ID NO220中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A22)包含在SEQ ID NO221中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A23)包含在SEQ ID NO222中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；
(A24)包含在SEQ ID NO223中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A25)包含在SEQ ID NO224中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A26)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含與在SEQ IDNO159，SEQ ID NO136，SEQ ID NO137，SEQ ID NO138，SEQ IDNO217，SEQ ID NO219，SEQ ID NO220，SEQ ID NO221或SEQ IDNO223中任何一個表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或與在SEQ ID NO160，SEQ ID NO215，SEQ ID NO216，SEQ IDNO218，SEQ ID NO222或SEQ ID NO224中任何一個表示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和(A27)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述核苷酸序列與編碼在SEQ ID NO159，SEQ IDNO160，SEQ ID NO136，SEQ ID NO137，SEQ ID NO138，SEQ IDNO215，SEQ ID NO216，SEQ ID NO217，SEQ ID NO218，SEQ IDNO219，SEQ ID NO220，SEQ ID NO221，SEQ ID NO222，SEQ IDNO223或SEQ ID NO224中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少90％序列同一性；和50.編碼除草劑代謝蛋白的多核苷酸在處理式(I)化合物中的應(yīng)用，所述除草劑代謝蛋白選自由下述物質(zhì)組成的組(A1)包含在SEQ ID NO1中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A2)包含在SEQ ID NO2中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A3)包含在SEQ ID NO3中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A4)包含在SEQ ID NO108中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A5)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含與在SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO108中任何一個表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；(A6)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述核苷酸序列與編碼在SEQ ID NO1，SEQ IDNO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO108中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少80％序列同一性；(A7)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含由DNA編碼的氨基酸序列，所述DNA在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與包含編碼在SEQ ID NO1，SEQ IDNO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO108中表示的氨基酸序列的核苷酸序列的DNA雜交；(A8)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并包含由可通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增的DNA所編碼的氨基酸序列，所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)使用包含在SEQ ID NO129中表示的核苷酸序列的引物和包含在SEQ ID NO124至128中任何一個表示的核苷酸序列的引物，并且模板為屬于鏈霉菌屬或糖多孢菌屬微生物的染色體；(A9)包含在SEQ ID NO4中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A11)包含在SEQ ID NO159中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A12)包含在SEQ ID NO160中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A13)包含在SEQ ID NO136中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A14)包含在SEQ ID NO137中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A15)包含在SEQ ID NO138中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A16)包含在SEQ ID NO215中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A17)包含在SEQ ID NO216中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A18)包含在SEQ ID NO217中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A19)包含在SEQ ID NO218中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A20)包含在SEQ ID NO219中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A21)包含在SEQ ID NO220中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A22)包含在SEQ ID NO221中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A23)包含在SEQ ID NO222中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A24)包含在SEQ ID NO223中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A25)包含在SEQ ID NO224中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；
(A26)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含與在SEQ IDNO159，SEQ ID NO136，SEQ ID NO137，SEQ ID NO138，SEQ IDNO217，SEQ ID NO219，SEQ ID NO220，SEQ ID NO221或SEQ IDNO223中任何一個表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或與在SEQ ID NO160，SEQ ID NO215，SEQ ID NO216，SEQ IDNO218，SEQ ID NO222或SEQ ID NO224中任何一個表示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和(A27)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述核苷酸序列與編碼在SEQ ID NO159，SEQ IDNO160，SEQ ID NO136，SEQ ID NO137，SEQ ID NO138，SEQ IDNO215，SEQ ID NO216，SEQ ID NO217，SEQ ID NO218，SEQ IDNO219，SEQ ID NO220，SEQ ID NO221，SEQ ID NO222，SEQ IDNO223或SEQ ID NO224中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少90％序列同一性。
附圖簡述

圖1顯示用于獲得本發(fā)明DNA(A1)和本發(fā)明DNA(B1)的PCR引物的退火位點。每個數(shù)字是指表示引物核苷酸序列的SEQ ID號。箭頭表示具有以其SEQ ID號表示的核苷酸序列的寡核苷酸引物的退火位點和從引物DNA聚合酶反應(yīng)的延伸方向。虛線表示通過使用引物的PCR擴(kuò)增的DNA。粗線表示鄰近DNA插入位點的載體區(qū)域，該載體用來生產(chǎn)染色體DNA文庫。
圖2顯示用于獲得本發(fā)明DNA(A2)和本發(fā)明DNA(B2)的PCR引物的退火位點。每個數(shù)字是指表示引物核苷酸序列的SEQ ID號。箭頭表示具有以其SEQ ID號表示的核苷酸序列的寡核苷酸引物的退火位點和從引物DNA聚合酶反應(yīng)的延伸方向。虛線表示通過使用引物的PCR擴(kuò)增的DNA。粗線表示鄰近DNA插入位點的載體區(qū)域，該載體用來生產(chǎn)染色體DNA文庫。
圖3顯示用于獲得本發(fā)明DNA(A4)和本發(fā)明DNA(B4)的PCR引物的退火位點。每個數(shù)字是指表示引物核苷酸序列的SEQ ID號。箭頭表示具有以其SEQ ID號表示的核苷酸序列的寡核苷酸引物的退火位點和從引物DNA聚合酶反應(yīng)的延伸方向。虛線表示通過使用引物的PCR擴(kuò)增的DNA。粗線表示鄰近DNA插入位點的載體區(qū)域，該載體用來生產(chǎn)染色體DNA文庫。然而，由57表示的寡核苷酸引物是與鄰近用來產(chǎn)生染色體DNA文庫的載體的DNA插入位點的區(qū)域退火的引物，未能與本發(fā)明的DNA(A4)退火。
圖4顯示質(zhì)粒pKSN2的限制性酶切圖。
圖5顯示質(zhì)粒pCRrSt12的限制性酶切圖。
圖6顯示質(zhì)粒pCR657ET的限制性酶切圖。
圖7顯示質(zhì)粒pCR657FET的限制性酶切圖。
圖8顯示質(zhì)粒pCR657Bs的限制性酶切圖。
圖9顯示質(zhì)粒pCR657FBs的限制性酶切圖。
圖10顯示質(zhì)粒pUCrSt12的限制性酶切圖。
圖11顯示質(zhì)粒pUCrSt657的限制性酶切圖。
圖12顯示質(zhì)粒pUCrSt657F的限制性酶切圖。
圖13顯示質(zhì)粒pUCCR16G6-p/t的限制性酶切圖。
圖14顯示通過將由在SEQ ID NO89中表示的核苷酸序列組成的寡核苷酸和由在SEQ ID NO90中表示的核苷酸序列組成的寡核苷酸退火產(chǎn)生的接頭NotI-EcoRI的結(jié)構(gòu)。
圖15顯示質(zhì)粒pUCCR16G6-p/tΔ的限制性酶切圖。
圖16顯示通過將由在SEQ ID NO91中表示的核苷酸序列組成的寡核苷酸和由在SEQ ID NO92中表示的核苷酸序列組成的寡核苷酸退火產(chǎn)生的接頭HindIII-NotI的結(jié)構(gòu)。
圖17顯示質(zhì)粒pNdG6-ΔT的限制性酶切圖。
圖18顯示質(zhì)粒pSUM-NdG6-rSt657的限制性酶切圖。
圖19顯示質(zhì)粒pSUM-NdG6-rSt657F的限制性酶切圖。
圖20顯示質(zhì)粒pKFrSt12的限制性酶切圖。
圖21顯示質(zhì)粒pKFrSt12-657的限制性酶切圖。
圖22顯示質(zhì)粒pKFrSt12-657F的限制性酶切圖。
圖23顯示質(zhì)粒pSUM-NdG6-rSt12-657的限制性酶切圖。
圖24顯示質(zhì)粒pSUM-NdG6-rSt12-657F的限制性酶切圖。
圖25顯示通過將由在SEQ ID NO98中表示的核苷酸序列組成的寡核苷酸和由在SEQ ID NO99中表示的核苷酸序列組成的寡核苷酸退火產(chǎn)生的接頭HindIII-NotI-EcoRI的結(jié)構(gòu)。
圖26顯示質(zhì)粒pBI121S的限制性酶切圖。
圖27顯示質(zhì)粒pBI-NdG6-rSt-657的限制性酶切圖。
圖28顯示質(zhì)粒pBI-NdG6-rSt-657F的限制性酶切圖。
圖29顯示質(zhì)粒pBI-NdG6-rSt12-657的限制性酶切圖。
圖30顯示質(zhì)粒pBI-NdG6-rSt12-657F的限制性酶切圖。
圖31顯示質(zhì)粒pCR923Sp的限制性酶切圖。
圖32顯示質(zhì)粒pNdG6-rSt12的限制性酶切圖。
圖33顯示質(zhì)粒pSUM-NdG6-rSt-923的限制性酶切圖。
圖34顯示質(zhì)粒pKFrSt12-923的限制性酶切圖。
圖35顯示質(zhì)粒pSUM-NdG6-rSt12-923的限制性酶切圖。
圖36顯示質(zhì)粒pBI-NdG6-rSt-923的限制性酶切圖。
圖37顯示質(zhì)粒pBI-NdG6-rSt12-923的限制性酶切圖。
圖38顯示質(zhì)粒pCR671ET的限制性酶切圖。
圖39顯示質(zhì)粒pCR671Bs的限制性酶切圖。
圖40顯示質(zhì)粒pUCrSt671的限制性酶切圖。
圖41顯示質(zhì)粒pSUM-NdG6-rSt-671的限制性酶切圖。
圖42顯示質(zhì)粒pKFrSt12-671的限制性酶切圖。
圖43顯示質(zhì)粒pSUM-NdG6-rSt12-671的限制性酶切圖。
圖44顯示質(zhì)粒pBI-NdG6-rSt-671的限制性酶切圖。
圖45顯示質(zhì)粒pBI-NdG6-rSt12-671的限制性酶切圖。
圖46顯示通過用瓊脂糖凝膠電泳檢測通過PCR擴(kuò)增的DNA的結(jié)果，該PCR使用具有本發(fā)明DNA(A)的部分核苷酸序列的寡核苷酸作為引物。泳道1，7，8，12，19，26，27，32，37，42和47表示DNA標(biāo)記(φ174/HaeIII消化)的電泳。其它泳道表示表20和21所示樣品的電泳。
圖47顯示通過將由在SEQ ID NO134中表示的核苷酸序列組成的寡核苷酸和由在SEQ ID NO135中表示的核苷酸序列組成的寡核苷酸退火產(chǎn)生的接頭的結(jié)構(gòu)。
圖48顯示質(zhì)粒pUCrSt657soy的限制性酶切圖。
圖49顯示質(zhì)粒pSUM-NdG6-rSt-657soy的限制性酶切圖。
圖50顯示質(zhì)粒pKFrSt12-657soy的限制性酶切圖。
圖51顯示質(zhì)粒pSUM-NdG6-rSt12-657soy的限制性酶切圖。
圖52顯示質(zhì)粒pBI-NdG6-rSt-657soy的限制性酶切圖。
圖53顯示質(zhì)粒pBI-NdG6-rSt12-657soy的限制性酶切圖。
圖54顯示質(zhì)粒pUCrSt1584soy的限制性酶切圖。
圖55顯示質(zhì)粒pSUM-NdG6-rSt-1584soy的限制性酶切圖。
圖56顯示質(zhì)粒pKFrSt12-1584soy的限制性酶切圖。
圖57顯示質(zhì)粒pSUM-NdG6-rSt12-1584soy的限制性酶切圖。
圖58顯示質(zhì)粒pBI-NdG6-rSt-1584soy的限制性酶切圖。
圖59顯示質(zhì)粒pBI-NdG6-rSt12-1584soy的限制性酶切圖。
圖60顯示質(zhì)粒pUCrSt1609soy的限制性酶切圖。
圖61顯示質(zhì)粒pSUM-NdG6-rSt-1609soy的限制性酶切圖。
圖62顯示通過將由在SEQ ID NO402中表示的核苷酸序列組成的寡核苷酸和由在SEQ ID NO403中表示的核苷酸序列組成的寡核苷酸退火產(chǎn)生的接頭EcoT22I-12aa-EcoT22I的結(jié)構(gòu)。
圖63顯示質(zhì)粒pUCrSt12-1609soy的限制性酶切圖。
圖64顯示質(zhì)粒pSUM-NdG6-rSt12-1609soy的限制性酶切圖。
圖65顯示質(zhì)粒pBI-NdG6-rSt-1609soy的限制性酶切圖。
圖66顯示質(zhì)粒pBI-NdG6-rSt12-1609soy的限制性酶切圖。
下面解釋在上圖所述的縮寫DNA A1本發(fā)明DNA(A1)DNA A2本發(fā)明DNA(A2)DNA A3本發(fā)明DNA(A3)DNA A4本發(fā)明DNA(A4)DNA B1本發(fā)明DNA(B1)
DNA B2本發(fā)明DNA(B2)DNA B4本發(fā)明DNA(B4)DNA A1S本發(fā)明DNA(A1)SDNA A23S本發(fā)明DNA(A23)SDNA A25S本發(fā)明DNA(A25)Stac ptac啟動子rrnB trrnB終止子ColEl ori質(zhì)粒ColE1的復(fù)制起點Ampr氨芐青霉素抗性基因RuBPCssCTT編碼大豆(cv.Jack)核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶的小亞基的葉綠體轉(zhuǎn)運肽的核苷酸序列12aa編碼成熟蛋白的12個氨基酸的核苷酸序列，其在大豆(cv.Jack)核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶的小亞基的葉綠體轉(zhuǎn)運肽之后Kmr卡那霉素抗性基因F1 ori質(zhì)粒F1的復(fù)制起點CR16G6pCR16G6啟動子CR16tCR16終止子CR16tΔ其中將限制酶ScaI的限制位點下游的核苷酸序列從CR16終止子中去除的DNACR16G6pΔ其中將限制酶NdeI的限制位點上游的核苷酸序列從CR16G6終止子中去除的DNANOSp胭脂堿合酶基因的啟動子NPTII卡那霉素抗性基因NOSt胭脂堿合酶基因的終止子GUSβ-葡糖醛酸糖苷酶基因RBT-DNA的右邊緣序列LBT-DNA的左邊緣序列NdeI，HindIII，BspHI，EcoRI，BamHI，EcoT221，SphI，KpnI，SacI，BglII，NotI，ScaI各種限制酶的限制酶切位點實施本發(fā)明的最好方式以下詳細(xì)解釋本發(fā)明。
選自下列蛋白質(zhì)組合(下文有時稱為本發(fā)明蛋白質(zhì)(A))的除草劑代謝蛋白具有將式(II)化合物(下文有時稱為“化合物(II)”)轉(zhuǎn)化為式(III)化合物(下文有時稱為“化合物(III)”)的能力。
<蛋白質(zhì)組合>
(A1)包含在SEQ ID NO1中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A2)包含在SEQ ID NO2中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A3)包含在SEQ ID NO3中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A4)包含在SEQ ID NO108中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A5)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含與在SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO108中任何一個表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；(A6)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述核苷酸序列與編碼在SEQ ID NO1，SEQ IDNO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO108中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少80％序列同一性；(A11)包含在SEQ ID NO159中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A12)包含在SEQ ID NO160中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A13)包含在SEQ ID NO136中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A14)包含在SEQ ID NO137中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A15)包含在SEQ ID NO138中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A16)包含在SEQ ID NO215中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A17)包含在SEQ ID NO216中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A18)包含在SEQ ID NO217中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A19)包含在SEQ ID NO218中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A20)包含在SEQ ID NO219中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A21)包含在SEQ ID NO220中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；
(A22)包含在SEQ ID NO221中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A23)包含在SEQ ID NO222中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A24)包含在SEQ ID NO223中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A25)包含在SEQ ID NO224中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A26)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含與在SEQ IDNO159，SEQ ID NO136，SEQ ID NO137，SEQ ID NO138，SEQ IDNO217，SEQ ID NO219，SEQ ID NO220，SEQ ID NO221或SEQ IDNO223中任何一個表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或與在SEQ ID NO160，SEQ ID NO215，SEQ ID NO216，SEQ IDNO218，SEQ ID NO222或SEQ ID NO224中任何一個表示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；(A27)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述核苷酸序列與編碼在SEQ ID NO159，SEQ IDNO160，SEQ ID NO136，SEQ ID NO137，SEQ ID NO138，SEQ IDNO215，SEQ ID NO216，SEQ ID NO217，SEQ ID NO218，SEQ IDNO219，SEQ ID NO220，SEQ ID NO221，SEQ ID NO222，SEQ IDNO223或SEQ ID NO224中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少90％序列同一性；和(A28)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并包含由可通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增的DNA所編碼的氨基酸序列，所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)使用包含在SEQ ID NO124至128中任何一個表示的核苷酸序列的引物和包含在SEQ ID NO129中表示的核苷酸序列的引物，并且模板為暗產(chǎn)色鏈霉菌，磚紅色鏈霉菌，不產(chǎn)色鏈霉菌，灰褐鏈霉菌，熱淡天藍(lán)鏈霉菌，黑胡桃鏈霉菌，津島鏈霉菌，球團(tuán)產(chǎn)色鏈霉菌，橄欖產(chǎn)色鏈霉菌，裝飾鏈霉菌，灰色鏈霉菌，羊毛鏈霉菌，三澤鏈霉菌，蒼白色鏈霉菌，玫瑰變紅鏈霉菌，魯?shù)劓溍咕?，斯堡鏈霉菌或塔氏糖多孢菌的染色體DNA。
作為本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)的具體實例，提及
包含在SEQ ID NO1中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)(下文有時稱為“本發(fā)明蛋白質(zhì)(A1)”)；包含在SEQ ID NO2中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)(下文有時稱為“本發(fā)明蛋白質(zhì)(A2)”)；包含在SEQ ID NO3中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)(下文有時稱為“本發(fā)明蛋白質(zhì)(A3)”)；包含在SEQ ID NO108中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)(下文有時稱為“本發(fā)明蛋白質(zhì)(A4)”)；包含在SEQ ID NO159中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)(下文有時稱為“本發(fā)明蛋白質(zhì)(A11)”)；包含在SEQ ID NO160中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)(下文有時稱為“本發(fā)明蛋白質(zhì)(A12)”)；包含在SEQ ID NO136中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)(下文有時稱為“本發(fā)明蛋白質(zhì)(A13)”)；包含在SEQ ID NO137中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)(下文有時稱為“本發(fā)明蛋白質(zhì)(A14)”)；包含在SEQ ID NO138中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)(下文有時稱為“本發(fā)明蛋白質(zhì)(A15)”)；包含在SEQ ID NO215中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)(下文有時稱為“本發(fā)明蛋白質(zhì)(A16)”)；包含在SEQ ID NO216中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)(下文有時稱為“本發(fā)明蛋白質(zhì)(A17)”)；包含在SEQ ID NO217中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)(下文有時稱為“本發(fā)明蛋白質(zhì)(A18)”)；包含在SEQ ID NO218中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)(下文有時稱為“本發(fā)明蛋白質(zhì)(A19)”)；包含在SEQ ID NO219中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)(下文有時稱為“本發(fā)明蛋白質(zhì)(A20)”)；包含在SEQ ID NO220中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)(下文有時稱為“本發(fā)明蛋白質(zhì)(A21)”)；
包含在SEQ ID NO221中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)(下文有時稱為“本發(fā)明蛋白質(zhì)(A22)”)；包含在SEQ ID NO222中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)(下文有時稱為“本發(fā)明蛋白質(zhì)(A23)”)；包含在SEQ ID NO223中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)(下文有時稱為“本發(fā)明蛋白質(zhì)(A24)”)；和包含在SEQ ID NO224中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)(下文有時稱為“本發(fā)明蛋白質(zhì)(A25)”)；例如，通過將式(I)的PPO抑制型除草化合物(下文有時稱為“化合物(I)”)與本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)反應(yīng)，能夠?qū)⒃摶衔镛D(zhuǎn)化成具有低除草活性的化合物。
另外，在將化合物(I)轉(zhuǎn)化為低除草活性的化合物的處理中，還可以利用選自下列組合的除草劑代謝蛋白(下文有時稱為“本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)”)(A1)包含在SEQ ID NO1中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A2)包含在SEQ ID NO2中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A3)包含在SEQ ID NO3中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A4)包含在SEQ ID NO108中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A5)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含與在SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO108中任何一個表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；(A6)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述核苷酸序列與編碼在SEQ ID NO1，SEQ IDNO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO108中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少80％序列同一性；(A7)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含由DNA編碼的氨基酸序列，所述DNA在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與包含編碼在SEQ ID NO1，SEQ IDNO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO108中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列的DNA雜交；(A8)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并包含由可通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增的DNA所編碼的氨基酸序列，所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)使用包含在SEQ ID NO129中表示的核苷酸序列的引物和包含在SEQ ID NO124至128中任何一個表示的核苷酸序列的引物，并且模板為屬于鏈霉菌屬或糖多孢菌屬微生物的染色體；(A9)包含在SEQ ID NO4中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A11)包含在SEQ ID NO159中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A12)包含在SEQ ID NO160中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A13)包含在SEQ ID NO136中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A14)包含在SEQ ID NO137中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A15)包含在SEQ ID NO138中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A16)包含在SEQ ID NO215中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A17)包含在SEQ ID NO216中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A18)包含在SEQ ID NO217中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A19)包含在SEQ ID NO218中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A20)包含在SEQ ID NO219中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A21)包含在SEQ ID NO220中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A22)包含在SEQ ID NO221中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A23)包含在SEQ ID NO222中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A24)包含在SEQ ID NO223中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A25)包含在SEQ ID NO224中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A26)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含與在SEQ IDNO159，SEQ ID NO136，SEQ ID NO137，SEQ ID NO138，SEQ IDNO217，SEQ ID NO219，SEQ ID NO220，SEQ ID NO221或SEQ IDNO223中任何一個表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或與在SEQ ID NO160，SEQ ID NO215，SEQ ID NO216，SEQ IDNO218，SEQ ID NO222或SEQ ID NO224中任何一個表示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和(A27)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述核苷酸序列與編碼在SEQ ID NO159，SEQ IDNO160，SEQ ID NO136，SEQ ID NO137，SEQ ID NO138，SEQ IDNO215，SEQ ID NO216，SEQ ID NO217，SEQ ID NO218，SEQ IDNO219，SEQ ID NO220，SEQ ID NO221，SEQ ID NO222，SEQ IDNO223或SEQ ID NO224中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少90％序列同一性。
作為本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)的實例，可以提及以上所述的本發(fā)明蛋白質(zhì)A。另外，作為其它實施例，可以提及包含在SEQ ID NO4中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)(下文有時稱為“本發(fā)明的蛋白質(zhì)(A9)”)和包含在SEQID NO5中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)(下文有時稱為“本發(fā)明的蛋白質(zhì)(A10)”)。
在上述蛋白質(zhì)組合中在(A5)，(A6)，(A7)，(A8)，(A26)，(A27)或(A28)中表示的蛋白質(zhì)的氨基酸序列中，從在SEQ ID NO1，2，3，108，159，160，136，137，138，215，216，217，218，219，220，221，222，223或224中表示的氨基酸序列中可以觀察到的差異是例如某些氨基酸的缺失，替換，和插入。這些差異包括例如來自包含在SEQ ID NO1，2，3，108，159，160，136，137，138，215，216，217，218，219，220，221，222，223或224中表示的氨基酸序列的上述蛋白質(zhì)在細(xì)胞中接受的加工的缺失。另外，包括自然發(fā)生的多態(tài)性變異，其是由例如獲得蛋白質(zhì)的生物的物種，個體等的差異導(dǎo)致；由通過例如定點誘變法，隨機(jī)誘變法，誘變處理等人工引入的遺傳突變引起的氨基酸缺失，替換，和插入。
經(jīng)受這些缺失，替換和插入的氨基酸的數(shù)量可以在本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)能夠發(fā)展將化合物(II)轉(zhuǎn)化成化合物(III)的能力的范圍內(nèi)。另外，作為氨基酸的替換，可以提及例如替換成在疏水性，電荷，pK，立體結(jié)構(gòu)特征等方面相似的氨基酸。作為這些替換，具體地例如提及下列各組內(nèi)的替換(1)甘氨酸和丙氨酸；(2)纈氨酸，異亮氨酸和亮氨酸；(3)天冬氨酸，谷氨酸，天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)絲氨酸和蘇氨酸；(5)賴氨酸和精氨酸；(6)苯丙氨酸和酪氨酸；等。
另外，在本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)中，優(yōu)選存在于對準(zhǔn)SEQ ID NO1所示氨基酸序列中357號氨基酸的半胱氨酸的位點的半胱氨酸是保守的(未經(jīng)受缺失或替換)該半胱氨酸的實例包括在SEQ ID NO2所示氨基酸序列中350號氨基酸所示的半胱氨酸，在SEQ ID NO3所示氨基酸序列中344號氨基酸所示的半胱氨酸，在SEQ ID NO108所示氨基酸序列中360號氨基酸所示的半胱氨酸，在SEQ ID NO4所示氨基酸序列中359號氨基酸所示的半胱氨酸，在SEQ ID NO5所示氨基酸序列中355號氨基酸所示的半胱氨酸，在SEQ ID NO159所示氨基酸序列中358號氨基酸所示的半胱氨酸，在SEQ ID NO160所示氨基酸序列中374號氨基酸所示的半胱氨酸，在SEQ ID NO136所示氨基酸序列中351號氨基酸所示的半胱氨酸，在SEQ ID NO137所示氨基酸序列中358號氨基酸所示的半胱氨酸，在SEQID NO138所示氨基酸序列中358號氨基酸所示的半胱氨酸，在SEQ IDNO222所示氨基酸序列中347號氨基酸所示的半胱氨酸，在SEQ IDNO224所示氨基酸序列中347號氨基酸所示的半胱氨酸等。
作為人工導(dǎo)致這些氨基酸缺失，插入或替換(下文有時共同稱為氨基酸修飾)的方法，例如提及包含在編碼在SEQ ID NO1，2，3，108，159，160，136，137，138，215，216，217，218，219，220，221，222，223或224中任何一個表示的氨基酸序列的DNA上進(jìn)行定點誘變，和然后通過常規(guī)方法使該DNA表達(dá)的步驟的方法。作為定點誘變方法，例如提及應(yīng)用琥珀突變(缺口雙鏈體法，Nucleic Acids Res.，12，9441-9456(1984))方法，一種通過使用引物的PCR引入突變等的方法。另外，作為人工修飾氨基酸的方法，例如提及包含在編碼在SEQ ID NO1，2，3，108，159，160，136，137，138，215，216，217，218，219，220，221，222，223或224中表示的任何一個氨基酸序列的DNA上進(jìn)行隨機(jī)誘變，然后通過常規(guī)方法使該DNA表達(dá)的步驟的方法。作為隨機(jī)誘變法，例如提及通過將編碼上述氨基酸序列中任何一個的DNA用作模板和通過應(yīng)用可以擴(kuò)增每個全長DNA的引物對，在用作底物的dATP，dTTP，dGTP和dCTP中每一個的濃度不同于通常的條件下或在其中促進(jìn)聚合酶反應(yīng)的Mg2+濃度增加到高于通常的條件下進(jìn)行PCR的方法。作為這些PCR方法，例如提及在Method in Molecular Biology，(31)，1994，97-112中描述的方法。另外，可以提及在PCT專利申請公開號WO 00/09682中描述的方法。
在本發(fā)明中，“序列同一性”是指兩個核苷酸序列或兩個氨基酸序列之間的同源性和同一性。該“序列同一性”可以通過在測試序列的全區(qū)域比較兩個序列，每個以最優(yōu)狀態(tài)對比來確定。同樣，插入或缺失(例如缺口)可以用于測試核苷酸序列或氨基酸序列的最優(yōu)對比。該序列同一性可以通過使用程序如FASTA(Pearson & Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，4，2444-2448(1988))，BLAST(Altschul等，Journal of Molecular Biology，215，403-410(1990))，CLUSTAL W(Thompson，Higgins & Gibson，Nucleic AcidResearch，22，4673-4680(1994a))等的同源性分析進(jìn)行的產(chǎn)生對比的步驟計算。這些程序例如可以典型地在日本DNA數(shù)據(jù)庫(在日本信息生物學(xué)和DNA數(shù)據(jù)庫中心運行的國際數(shù)據(jù)庫)的網(wǎng)頁(http://www.ddbj.nig.ac.jp)上利用。另外，序列同一性可以通過使用可商購的序列分析軟件來確定。具體地例如，可以使用GENETYX-WIN第5版(Software DevelopmentCompany，Ltd.)通過Lipman-Pearson法(Lipman，DJ.和Pearson，W.R.，Science，227，1435-1441，(1985))的同源性分析產(chǎn)生對比來計算它。
關(guān)于(A7)所述的“嚴(yán)謹(jǐn)條件”，可以提及例如在按照如Sambrook，J.，F(xiàn)risch，E.F.，和Maniatis，T.，Molecular Cloning第二版，Cold SpringHarbor Press所述的常規(guī)方法進(jìn)行的雜交中雜交物在45℃下在包含6xSSC(使包含1.5M NaCl和0.15M檸檬酸三鈉的溶液為10xSSC)的溶液中形成和然后在50℃下用2xSSC(Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6)洗滌雜交物的條件?？梢岳鐝?xSSC(低嚴(yán)謹(jǐn)條件)的條件至0.2xSSC的條件(高嚴(yán)謹(jǐn)條件)中選擇洗滌步驟中的鹽濃度?？梢岳鐝氖覝?低嚴(yán)謹(jǐn)條件)至65℃(高嚴(yán)謹(jǐn)條件)中選擇洗滌步驟中的溫度。備選地，鹽濃度和溫度都可以改變。
作為“在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與包含編碼在SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQID NO3或SEQ ID NO108中任何一個表示的氨基酸的核苷酸序列的DNA雜交”的DNA，具體地例如可以提及包含編碼在SEQ ID NO1，2，3，4，5，108，159，160，136，137，138，215，216，217，218，219，220，221，222，223或224中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列的DNA，包含在SEQ ID NO6，7，8，78，84，109，139，140，141，142，143，225，226，227，228，229，230，231，232，233或234中任何一個表示的核苷酸序列的DNA等。還可提及包含與在SEQ ID NO6，7，8，78，84，109，139，140，141，142，143，225，226，227，228，229，230，231，232，233或234中任何一個表示的核苷酸序列具有至少約60％同一性的核苷酸序列的DNA。
作為通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(下文稱為“SDS-PAGE”)鑒定的分子量，本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)的分子量約為30,000-60,000，典型地約40,000-50,000(比得上例如由在SEQ ID NO1，2，3，108，159，160，136，137，138，215，216，217，218，219，220，221，222，223或224中任何一個表示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì))。另外，只要將化合物(II)轉(zhuǎn)化為化合物(II)的能力未消除，本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)可以用作向其氨基末端上游或其羧基末端下游添加氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
作為本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)代謝式(I)的PPO抑制型除草化合物的能力的標(biāo)志，可以提及將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力。該能力例如可以通過在包含電子供體如輔酶NADPH的電子傳遞體系的存在下將化合物(II)與本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)反應(yīng)和通過檢測產(chǎn)生的化合物(III)來證實。
“包含電子供體的電子傳遞體系”是指其中氧化還原鏈?zhǔn)椒磻?yīng)發(fā)生和電子從電子供體轉(zhuǎn)移至本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)的系統(tǒng)。作為電子供體，例如提及輔酶NADPH，NADH等。例如，作為可構(gòu)成從NADPH至本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)的電子傳遞體系的蛋白質(zhì)，提及鐵氧還蛋白和鐵氧還蛋白-NADP+還原酶，NADPH-細(xì)胞色素P-450還原酶，等。
為了證實將化合物(II)轉(zhuǎn)化為化合物(III)的能力，例如將包含本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)，β-NADPH，鐵氧還蛋白，鐵氧還蛋白-NADP+還原酶和用放射性同位素標(biāo)記的化合物(II)的約pH7的反應(yīng)溶液在約30℃下溫育約10分鐘至1小時。隨后，在通過加入鹽酸使反應(yīng)溶液變成酸性以后，用乙酸乙酯萃取。在將回收的乙酸乙酯層進(jìn)行薄層層析(下文稱為“TLC”)后，進(jìn)行放射自顯影，通過檢測標(biāo)記的化合物(III)可以證實將化合物(II)轉(zhuǎn)化為化合物(III)的能力。
為了制備本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)，例如首先，按照常規(guī)遺傳工程方法(例如，在Sambrook，J.，F(xiàn)risch，E.F.，Maniatis，T.；Molecular Cloning第二版，Cold Spring Harbor Laboratory press中描述的方法)獲得編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)的DNA(下文有時共同稱為“本發(fā)明DNA(A)”)。
作為木發(fā)明DNA(A)的實例，可以提及編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)的DNA(以下有時稱為“本發(fā)明DNA(A)”)。作為本發(fā)明DNA(A)的具體實例，可以提及編碼包含SEQ ID NO1所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA(下文有時稱為“本發(fā)明DNA(A1)”)；編碼包含SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA(下文有時稱為“本發(fā)明DNA(A2)”)；編碼包含SEQ ID NO3所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA(下文有時稱為“本發(fā)明DNA(A3)”)；編碼包含SEQ ID NO108所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA(下文有時稱為“本發(fā)明DNA(A4)”)；編碼包含SEQ ID NO159所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA(下文有時稱為“本發(fā)明DNA(A11)”)；編碼包含SEQ ID NO160所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA(下文有時稱為“本發(fā)明DNA(A12)”)；編碼包含SEQ ID NO136所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA(下文有時稱為“本發(fā)明DNA(A13)”)；編碼包含SEQ ID NO137所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA(下文有時稱為“本發(fā)明DNA(A14)”)；編碼包含SEQ ID NO138所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA(下文有時稱為“本發(fā)明DNA(A15)”)；編碼包含SEQ ID NO215所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA(下文有時稱為“本發(fā)明DNA(A16)”)；編碼包含SEQ ID NO216所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA(下文有時稱為“本發(fā)明DNA(A17)”)；
編碼包含SEQ ID NO217所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA(下文有時稱為“本發(fā)明DNA(A18)”)；編碼包含SEQ ID NO218所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA(下文有時稱為“本發(fā)明DNA(A19)”)；編碼包含SEQ ID NO219所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA(下文有時稱為“本發(fā)明DNA(A20)”)；編碼包含SEQ ID NO220所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA(下文有時稱為“本發(fā)明DNA(A21)”)；編碼包含SEQ ID NO221所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA(下文有時稱為“本發(fā)明DNA(A22)”)；編碼包含SEQ ID NO222所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA(下文有時稱為“本發(fā)明DNA(A23)”)；編碼包含SEQ ID NO223所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA(下文有時稱為“本發(fā)明DNA(A24)”)；編碼包含SEQ ID NO224所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA(下文有時稱為“本發(fā)明DNA(A25)”)；等。
另外，作為本發(fā)明DNA(A)的更具體的實例，可以提及包含SEQ ID NO6所示核苷酸序列的DNA；包含SEQ ID NO9所示核苷酸序列的DNA；包含SEQ ID NO7所示核苷酸序列的DNA；包含SEQ ID NO10所示核苷酸序列的DNA；包含SEQ ID NO8所示核苷酸序列的DNA；包含SEQ ID NO11所示核苷酸序列的DNA；包含SEQ ID NO109所示核苷酸序列的DNA；包含SEQ ID NO110所示核苷酸序列的DNA；包含SEQ ID NO139所示核苷酸序列的DNA；包含SEQ ID NO144所示核苷酸序列的DNA；包含SEQ ID NO140所示核苷酸序列的DNA；包含SEQ ID NO145所示核苷酸序列的DNA；包含SEQ ID NO141所示核苷酸序列的DNA；
包含SEQ ID NO146所示核苷酸序列的DNA；包含SEQ ID NO142所示核苷酸序列的DNA；包含SEQ ID NO147所示核苷酸序列的DNA；包含SEQ ID NO143所示核苷酸序列的DNA；包含SEQ ID NO148所示核苷酸序列的DNA；包含SEQ ID NO225所示核苷酸序列的DNA；包含SEQ ID NO235所示核苷酸序列的DNA；包含SEQ ID NO226所示核苷酸序列的DNA；包含SEQ ID NO236所示核苷酸序列的DNA；包含SEQ ID NO227所示核苷酸序列的DNA；包含SEQ ID NO237所示核苷酸序列的DNA；包含SEQ ID NO228所示核苷酸序列的DNA；包含SEQ ID NO238所示核苷酸序列的DNA；包含SEQ ID NO229所示核苷酸序列的DNA；包含SEQ ID NO239所示核苷酸序列的DNA；包含SEQ ID NO230所示核苷酸序列的DNA；包含SEQ ID NO240所示核苷酸序列的DNA；包含SEQ ID NO231所示核苷酸序列的DNA；包含SEQ ID NO241所示核苷酸序列的DNA；包含SEQ ID NO232所示核苷酸序列的DNA；包含SEQ ID NO242所示核苷酸序列的DNA；包含SEQ ID NO233所示核苷酸序列的DNA；包含SEQ ID NO243所示核苷酸序列的DNA；包含SEQ ID NO234所示核苷酸序列的DNA；包含SEQ ID NO244所示核苷酸序列的DNA；包含SEQ ID NO214所示核苷酸序列的DNA；包含SEQ ID NO368所示核苷酸序列的DNA；包含SEQ ID NO393所示核苷酸序列的DNA；編碼具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力的蛋白質(zhì)并且與在SEQ ID NO6，7，8或109中任何一個表示的核苷酸序列具有至少80％序列同一性的DNA；編碼具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力的蛋白質(zhì)并且與在SEQ ID NO139，140，141，142，143，225，226，227，228，229，230，231，232，233或234中任何一個表示的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的DNA；等。
另外，作為本發(fā)明DNA(A)的實例，除了以上本發(fā)明DNA(A)以外，提及包含編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列的DNA，所述蛋白質(zhì)包含在SEQ ID NO4中表示的氨基酸序列(下文有時稱為“本發(fā)明DNA(A9)”)；包含SEQ ID NO78所示核苷酸序列的DNA；包含編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列的DNA，所述蛋白質(zhì)包含在SEQ ID NO5中表示的氨基酸序列(下文有時稱為“本發(fā)明DNA(A10)”)；包含SEQ ID NO84所示核苷酸序列的DNA；包含SEQ ID NO85所示核苷酸序列的DNA；等。
本發(fā)明DNA(A)例如，可以是從自然界中克隆的DNA或者可以是通過如定點誘變法，隨機(jī)誘變法已經(jīng)將核苷酸的缺失，替換或插入引入從自然界中克隆的DNA的DNA，和可以是人工合成的DNA。隨后，本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)可以通過按照常規(guī)遺傳工程方法表達(dá)獲得的本發(fā)明DNA(A)來生產(chǎn)或獲得。這樣，可以制備本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)。
例如通過以下方法制備本發(fā)明DNA(A)。首先，通過常規(guī)遺傳工程方法如在Molecular CloningA Laboratory Manual第二版(1989)，GoldSpring Harbor Laboratory Press；和Current Protocols in MolecularBiology(1987)，John Wiley & Sons公司中描述的那些，從微生物中制備染色體DNA，所述微生物屬于鏈霉菌屬，如暗產(chǎn)色鏈霉菌，磚紅色鏈霉菌，不產(chǎn)色鏈霉菌，淺灰鏈霉菌(Streptomyces griseolus)，Streptomycescarbophilus，灰褐鏈霉菌，熱淡天藍(lán)鏈霉菌，黑胡桃鏈霉菌，津島鏈霉菌，球團(tuán)產(chǎn)色鏈霉菌，橄欖產(chǎn)色鏈霉菌，裝飾鏈霉菌，灰色鏈霉菌，羊毛鏈霉菌，三澤鏈霉菌，蒼白色鏈霉菌，玫瑰變紅鏈霉菌，魯?shù)劓溍咕退贡ゆ溍咕?，更具體地，暗產(chǎn)色鏈霉菌IFO 12898，磚紅色鏈霉菌ATCC 21469，不產(chǎn)色鏈霉菌IFO 12735，淺灰鏈霉菌ATCC 11796，Streptomycescarbophilus SANK62585，灰褐鏈霉菌IFO 12870t，熱淡天藍(lán)鏈霉菌IFO14273t，黑胡桃鏈霉菌IFO 13445，津島鏈霉菌IFO 13782，球團(tuán)產(chǎn)色鏈霉菌IFO 13673t，橄欖產(chǎn)色鏈霉菌IFO 12444，裝飾鏈霉菌IFO 13069t，灰色鏈霉菌ATCC 10137，灰色鏈霉菌IFO 13849T，羊毛鏈霉菌IFO 12787T，三澤鏈霉菌IFO 13855T，蒼白色鏈霉菌IFO 13434T，玫瑰變紅鏈霉菌IFO13682T，魯?shù)劓溍咕鶬FO 15875T和斯堡鏈霉菌IFO 13446T，等；或?qū)儆谔嵌噫呔鷮俚奈⑸?，如塔氏糖多孢菌，更具體地，塔氏糖多孢菌JCM9383t等。接下來，在用限制酶如Sau3AI部分消化染色體DNA以后，回收約2kb的DNA。按照在“Molecular CloningA Laboratory Manual第二版”(1989)，Cold Spring Harbor Laboratory Press；和“Current Protocolsin Molecular Biology”(1987)，John Wiley & Sons公司中描述的常規(guī)遺傳工程方法將回收的DNA克隆到載體中。作為載體，具體地例如，可以利用pUC 119(TaKaRa Shuzo Company)，pTVA 118N(Takara Shuzo Company)，pBluescript II(Toyobo Company)，pCR2.1-TOPO(Invitrogen)，pTrc99A(Amersham Pharmacia Biotech Company)，pKK331-1A(AmershamPharmacia Biotech Company)，等。通過從獲得的克隆中提取質(zhì)粒可以獲得染色體DNA文庫。
本發(fā)明DNA(A)可以通過在下述條件下將探針與獲得的染色體DNA文庫雜交和通過檢測和回收與探針特異性結(jié)合的DNA而獲得。探針可以是由約至少20個核苷酸組成的DNA，所述核苷酸包含編碼在SEQ IDNO1，2，3或108中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列。作為可以用作探針的DNA的具體實例，提及包含在SEQ ID NO6，7，8或109中任何一個表示的核酸的DNA；包含在SEQ ID NO6，7，8或109中任何一個表示的核酸序列的部分核苷酸序列的DNA；包含與所述部分核苷酸序列互補的核苷酸序列的DNA；等。
用放射性同位素，熒光染色等標(biāo)記用作探針的DNA。為了用放射性同位素標(biāo)記DNA，例如可以使用Boehringer或Takara shuzo Company的隨機(jī)標(biāo)記試劑盒。另外，通過進(jìn)行PCR可以制備用32P標(biāo)記的DNA。將用于探針的DNA用作模板。用(α-32P)dCTP交換典型地用在PCR反應(yīng)溶液中的dCTP。另外，當(dāng)用熒光染色標(biāo)記DNA時，例如可以使用DIG-High PrimeDNA labeling和Detection Starter試劑盒II(Roche Company)。
接下來說明制備探針的具體實例。例如，通過將從如上所述的暗產(chǎn)色鏈霉菌IFO 12898制備的染色體DNA或染色體DNA文庫用作模板，通過將由SEQ ID NO93所示核苷酸序列組成的寡核苷酸和由SEQ ID NO94所示核苷酸序列組成的寡核苷酸用作引物，和通過如下述實例所述使用例如PCR DIG探針合成試劑盒(Roche Diagnostics GmbH)按照附裝的手冊進(jìn)行PCR，可以獲得包含SEQ ID NO6所示的全長核苷酸序列、用洋地黃毒苷標(biāo)記的DNA。類似地，通過將從如上所述的暗產(chǎn)色鏈霉菌IFO 12898制備的染色體DNA或染色體DNA文庫用作模板，可以獲得包含在SEQ IDNO6中表示的從核苷酸57至核苷酸730的核苷酸序列、用洋地黃毒苷標(biāo)記的DNA。作為引物，使用由SEQ ID NO130所示的核苷酸序列組成的寡核苷酸和由SEQ ID NO131所示的核苷酸序列組成的寡核苷酸進(jìn)行PCR。另外，通過將從如上所述的塔氏糖多孢菌JCM 9383t制備的染色體DNA或染色體DNA文庫用作模板，可以獲得包含SEQ ID NO7所示的全長核苷酸序列、用洋地黃毒苷標(biāo)記的DNA。作為引物，使用由SEQ IDNO61所示的核苷酸序列組成的寡核苷酸和由SEQ ID NO62所示的核苷酸序列組成的寡核苷酸進(jìn)行PCR。另外，通過將從如上所述的磚紅色鏈霉菌ATCC 21469制備的染色體DNA或染色體DNA文庫用作模板，可以獲得包含SEQ ID NO8所示的全長核苷酸序列、用洋地黃毒苷標(biāo)記的DNA。作為引物，使用由SEQ ID NO70所示的核苷酸序列組成的寡核苷酸和由SEQ ID NO71所示的核苷酸序列組成的寡核苷酸進(jìn)行PCR。另外，通過將從如上所述的磚紅色鏈霉菌ATCC 21469制備的染色體DNA或染色體DNA文庫用作模板，可以獲得包含在SEQ ID NO8中表示的從核苷酸21至核苷酸691的核苷酸序列、用洋地黃毒苷標(biāo)記的DNA。作為引物，使用由SEQ ID NO132所示的核苷酸序列組成的寡核苷酸和由SEQ IDNO133所示的核苷酸序列組成的寡核苷酸進(jìn)行PCR。
使探針與染色體DNA文庫雜交的方法可包括菌落雜交和噬菌斑雜交，可以選擇與文庫制備所用載體的類型相容的適當(dāng)方法。當(dāng)所用文庫是使用質(zhì)粒載體構(gòu)建時，進(jìn)行菌落雜交。具體地，首先，通過將文庫的DNA引入其中用于構(gòu)建文庫的載體可以復(fù)制的微生物獲得轉(zhuǎn)化體。稀釋獲得的轉(zhuǎn)化體，涂布在瓊脂平板上和培養(yǎng)直至菌落出現(xiàn)。當(dāng)將噬菌體載體用于構(gòu)建文庫，進(jìn)行噬菌斑雜交。具體地，首先，在侵染可能的條件下，將其中用于產(chǎn)生文庫的噬菌體載體可以復(fù)制的微生物與文庫的噬菌體混合。然后將混合物進(jìn)一步與軟瓊脂混合。然后將該混合物涂布在瓊脂平板上。隨后，培養(yǎng)混合物直至噬菌斑出現(xiàn)。
接下來，在任一上述雜交的情形中，將膜放置在其中進(jìn)行上述培養(yǎng)的瓊脂板表面，將轉(zhuǎn)化體的菌落或噬菌斑中的噬菌體顆粒轉(zhuǎn)移到膜上。在堿處理膜后，進(jìn)行中和處理。然后將從轉(zhuǎn)化體或噬菌體顆粒洗脫的DNA固定在膜上。更具體地，例如在噬菌斑雜交的事件中，通過將硝化纖維膜或尼龍膜，具體地例如Hybond-N+(Amersham Pharmacia Biotech Company)放置在瓊脂板上并等待1分鐘將噬菌體顆粒吸收在膜上。將膜浸泡在堿性溶液(1.5M NaCl和0.5N NaOH)中約3分鐘以溶解噬菌體顆粒和將噬菌體DNA洗脫到膜上。然后將膜浸泡在中和溶液(1.5M NaCl和0.5Mtris-HCl緩沖液pH7.5)中約5分鐘。在洗滌溶液(0.3M NaCl，30mM檸檬酸鈉，0.2M tris-HCl緩沖液pH7.5)中洗滌膜約5分鐘，例如通過在真空中在約80℃下溫育約90分鐘將噬菌體DNA固定在膜上。
通過使用如此制備的膜，使用上述DNA作為探針進(jìn)行雜交。例如可以按照“Molecular CloningA Laboratory Manual第二版(1989)”，ColdSpring Harbor Laboratory Press等中的描述進(jìn)行雜交。
盡管可提供各種溫度條件和試劑進(jìn)行雜交，將如上所述制備的膜在42℃至65℃下浸泡和保持在以50μ1-200μl/1cm2膜的比率制備的預(yù)雜交液中1小時至4小時。預(yù)雜交液例如可以包含450mM至900mM NaCl和45mM至90mM檸檬酸鈉，包含濃度為0.1％-1.0％的十二烷基硫酸鈉(下文稱為“SDS”)，和包含濃度為0μg/ml-200μg/ml的變性的非特異性DNA，并可以有時包含各自濃度為0％-0.2％的清蛋白，phycol和聚乙烯吡咯烷酮。隨后，例如將膜在42℃至65℃下浸泡和保持在以50μl-200μl/1cm2膜的比率制備的雜交液中12小時至20小時。雜交液是例如預(yù)雜交液和以上述制備方法獲得的探針(相對數(shù)量為1.0×104cpm-2.0×106cpm/1cm2膜)的混合物，該預(yù)雜交液可以包含450mM至900mM NaCl和45mM至90mM檸檬酸鈉，包含濃度為0.1％-1.0％的SDS，和包含濃度為0μg/ml-200μg/ml的變性的非特異性DNA，并可以有時包含各自濃度為0％-0.2％的清蛋白，phycol和聚乙烯吡咯烷酮。隨后，移開膜并使用包含15mM-300mM NaCl，1.5mM-30mM檸檬酸鈉和0.1％-1.0％SDS的42℃-65℃洗滌液進(jìn)行5分鐘至15分鐘的洗滌約2-4次。此外，在用2x SSC溶液(300mM NaCl和30mM檸檬酸鈉)輕輕漂洗后，將膜干燥。通過將膜進(jìn)行放射自顯影檢測探針在膜上的位置，鑒定膜上與所用探針雜交的DNA的位置。備選地，預(yù)雜交和雜交可以使用可商購的雜交試劑盒，如使用包含在DIG-HighPrime DNA Labeling & Detection Starter試劑盒II(Roche)中的雜交液進(jìn)行。在雜交后，例如，在包含0.1％ SDS的2x SSC中在室溫下洗滌膜兩次5分鐘，接著在包含0.1％ SDS的0.5x SSC中在65℃下洗滌膜兩次15分鐘。通過再用包含在試劑盒中的檢測液處理洗滌的膜和通過檢測膜上探針的位置來檢測在膜上與所用探針雜交的DNA的位置。
在原始的瓊脂培養(yǎng)基上鑒定對應(yīng)于膜上檢測的DNA的位置的克隆，其可以被挑取來分離攜帶那些DNA的克隆。
可以按照“Molecular CloningALaboratory Manual第二版”(1989)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，“Current Protocols in MolecularBiology”(1987)，John Wiley & Sons Incorporated等所述的常規(guī)遺傳工程方法將按照以上獲得的本發(fā)明DNA(A)克隆到載體中。作為載體，具體地例如，可以使用pUCA 119(Takara Shuzo Company)，pTVA118N(TakaraShuzo Company)，pBluescript II(Toyobo Company)，pCR2.1-TOPO(Invitrogen Company)，pTrc99A(Pharmacia Company)，pKK331-1A(Pharmacia Company)等。
另外，按照上述獲得的本發(fā)明DNA(A)的核苷酸序列可以通過在F.Sanger，S.Nicklen，A.R.Coulson，Proceeding of National Academy of ScienceU.S.A.(1977)745463-5467中所述的雙脫氧終止法分析。在核苷酸序列分析的樣品制備中，可以使用可商購試劑，如Perkin Elmer公司的ABI PRISM染料終止循環(huán)測序簡易反應(yīng)試劑盒。
還可以如下制備本發(fā)明DNA(A)。可以通過進(jìn)行PCR擴(kuò)增本發(fā)明DNA(A)。PCR可以使用如上所述從微生物制備的染色體DNA或染色體DNA文庫作為模板，所述微生物屬于鏈霉菌屬，如暗產(chǎn)色鏈霉菌，磚紅色鏈霉菌，不產(chǎn)色鏈霉菌，淺灰鏈霉菌，Streptomyces carbophilus，灰褐鏈霉菌，熱淡天藍(lán)鏈霉菌，黑胡桃鏈霉菌，津島鏈霉菌，球團(tuán)產(chǎn)色鏈霉菌，橄欖產(chǎn)色鏈霉菌，裝飾鏈霉菌，灰色鏈霉菌，羊毛鏈霉菌，三澤鏈霉菌，蒼白色鏈霉菌，玫瑰變紅鏈霉菌，魯?shù)劓溍咕退贡ゆ溍咕唧w地，暗產(chǎn)色鏈霉菌IFO 12898，磚紅色鏈霉菌ATCC 21469，不產(chǎn)色鏈霉菌IFO12735，淺灰鏈霉菌ATCC 11796，Streptomyces carbophilus SANK62585，灰褐鏈霉菌IFO 12870t，熱淡天藍(lán)鏈霉菌IFO 14273t，黑胡桃鏈霉菌IFO13445，津島鏈霉菌IFO 13782，球團(tuán)產(chǎn)色鏈霉菌IFO 13673t，橄欖產(chǎn)色鏈霉菌IFO 12444，裝飾鏈霉菌IFO 13069t，灰色鏈霉菌ATCC 10137，灰色鏈霉菌IFO 13849T，羊毛鏈霉菌IFO 12787T，三澤鏈霉菌IFO 13855T，蒼白色鏈霉菌IFO 13434T，玫瑰變紅鏈霉菌IFO 13682T，魯?shù)劓溍咕鶬FO15875T和斯堡鏈霉菌IFO 13446T，等；或?qū)儆谔嵌噫呔鷮俚奈⑸铮缢咸嵌噫呔?，更具體地，塔氏糖多孢菌JCM 9383t等。PCR還可使用包含編碼SEQ ID NO1，2，3，4，5，108，159，160，136，137，138，215，216，217，218，219，220，221，222，223或224中任何一個所示氨基酸序列的核苷酸序列的5’末端至少約20個核苷酸的寡核苷酸，和包含與編碼上述氨基酸序列中任何一個的核苷酸序列鄰進(jìn)3’末端或3’末端下游的至少約20個核苷酸互補的核苷酸序列的寡核苷酸。PCR可以在下述條件下進(jìn)行。在上述用于PCR的引物的5’末端側(cè)，可以增加限制酶識別序列。
更具體地例如，通過使用從暗產(chǎn)色鏈霉菌IFO 12898制備的染色體DNA或染色體DNA文庫作為模板，和通過使用包含SEQ ID NO51所示核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ ID NO52所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物進(jìn)行PCR可以制備包含編碼SEQ ID NO1所示氨基酸序列的核苷酸序列的DNA，包含SEQ ID NO6所示核苷酸序列的DNA等。備選地，通過使用包含SEQ ID NO51所示核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQID NO53所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物進(jìn)行PCR可以擴(kuò)增包含SEQ ID NO9(包含編碼SEQ ID NO1所示氨基酸序列的核苷酸序列)所示核苷酸序列的DNA。
例如，通過使用從塔氏糖多孢菌JCM 9383t制備的染色體DNA或染色體DNA文庫作為模板，和通過使用包含SEQ ID NO61所示核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ ID NO62所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物進(jìn)行PCR可以制備包含編碼SEQ ID NO2所示氨基酸序列的核苷酸序列的DNA，包含SEQ ID NO7所示核苷酸序列的DNA等。備選地，通過使用包含SEQ ID NO61所示核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ ID NO63所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物進(jìn)行PCR可以擴(kuò)增包含SEQ IDNO10(包含編碼SEQ ID NO2所示氨基酸序列的核苷酸序列)所示核苷酸序列的DNA。
例如，通過使用從不產(chǎn)色鏈霉菌IFO 12735制備的染色體DNA或染色體DNA文庫作為模板，和通過使用包含SEQ ID NO119所示核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ ID NO120所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物進(jìn)行PCR可以制備包含編碼SEQ ID NO108所示氨基酸序列的核苷酸序列的DNA，包含SEQ ID NO109所示核苷酸序列的DNA等。備選地，通過使用包含SEQ ID NO119所示核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ IDNO121所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物進(jìn)行PCR可以擴(kuò)增包含SEQID NO110(包含編碼SEQ ID NO108所示氨基酸序列的核苷酸序列)所示核苷酸序列的DNA。
例如，通過使用從黑胡桃鏈霉菌IFO 13445制備的染色體DNA或染色體DNA文庫作為模板，和通過使用包含SEQ ID NO165所示核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ ID NO166所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物進(jìn)行PCR可以制備包含SEQ ID NO144(包含編碼SEQ ID NO159所示氨基酸序列的核苷酸序列)所示核苷酸序列的DNA。
例如，通過使用從津島鏈霉菌IFO 13782制備的染色體DNA或染色體DNA文庫作為模板，和通過使用包含SEQ ID NO171所示核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ ID NO172所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物進(jìn)行PCR可以制備包含SEQ ID NO145(包含編碼SEQ ID NO160所示氨基酸序列的核苷酸序列)所示核苷酸序列的DNA。
例如，通過使用從熱淡天藍(lán)鏈霉菌IFO 14273t制備的染色體DNA或染色體DNA文庫作為模板，和通過使用包含SEQ ID NO177所示核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ ID NO178所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物進(jìn)行PCR可以制備包含SEQ ID NO146(包含編碼SEQ ID NO136所示氨基酸序列的核苷酸序列)所示核苷酸序列的DNA。
例如，通過使用從球團(tuán)產(chǎn)色鏈霉菌IFO 13673t制備的染色體DNA或染色體DNA文庫作為模板，和通過使用包含SEQ ID NO183所示核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ ID NO184所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物進(jìn)行PCR可以制備包含SEQ ID NO147(包含編碼SEQ ID NO137所示氨基酸序列的核苷酸序列)所示核苷酸序列的DNA。
例如，通過使用從橄欖產(chǎn)色鏈霉菌IFO 12444制備的染色體DNA或染色體DNA文庫作為模板，和通過使用包含SEQ ID NO184所示核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ ID NO185所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物進(jìn)行PCR可以制備包含SEQ ID NO148(包含編碼SEQ ID NO138所示氨基酸序列的核苷酸序列)所示核苷酸序列的DNA。
當(dāng)將其中將染色體DNA引入載體的DNA文庫用作模板時，例如，還可通過使用包含選自編碼SEQ ID NO1，2，3，4，5，108，159，160，136，137或138中所示任何一個氨基酸序列的核苷酸序列的核苷酸序列的寡核苷酸(例如包含編碼SEQ ID NO1所示氨基酸序列的核苷酸序列5’末端側(cè)至少約20個核苷酸的核苷酸序列的寡核苷酸)，和包含與鄰近用于構(gòu)建文庫的載體DNA插入位點的核苷酸序列互補的核苷酸序列的至少約20個核苷酸的寡核苷酸作為引物進(jìn)行PCR來擴(kuò)增本發(fā)明DNA(A)。在如上所述用于PCR的引物的5’末端側(cè)，可以加入限制酶識別序列。
關(guān)于上述這種PCR的條件，具體地例如，可以提及以下條件保持97℃ 2分鐘，然后重復(fù)10個循環(huán)，一個循環(huán)包括保持97℃ 15秒，接著65℃ 30秒，然后72℃ 2分鐘；然后進(jìn)行15個循環(huán)，一個循環(huán)包括保持97℃ 15秒，接著68℃ 30秒，和接著72℃ 2分鐘(依次每個循環(huán)增加20秒)；和然后保持在72℃ 7分鐘。PCR可以使用50μl的反應(yīng)溶液，其包含50ng染色體DNA，包含上述配對的2種引物各自300nM，包含5.0μl dNTP混合物(4種dNTP每種2.0mM的混合物)，包含5.0μl 10x ExpandHF緩沖液(包含MgCl2，Roche Molecular Biochemicals Company)和包含0.75μl Expand HiFi酶混合物(Roche Molecular Biochemicals Company)。
備選地，可以提及以下條件保持97℃ 2分鐘，然后重復(fù)30個循環(huán)，一個循環(huán)包括97℃ 15秒，接著60℃ 30秒，接著72℃ 90秒，然后保持反應(yīng)溶液在72℃ 4分鐘。PCR可以使用50μl的反應(yīng)溶液，其包含250ng染色體DNA，包含上述配對的2種引物各自200nM，包含5.0μl dNTP混合物(4種dNTP每種2.5mM的混合物)，5.0μl 10x ExTaq緩沖液(包含MgCl2，Takara Shuzo Company)和包含0.5μl ExTaq聚合酶(Takara ShuzoCompany)。
備選地，例如基于在SEQ ID NO6，7，8或109所示核苷酸序列中序列同一性特別高的區(qū)域的核苷酸序列，可以設(shè)計和制備用作引物的寡核苷酸。本發(fā)明DNA(A)還可以通過使用獲得的寡核苷酸作為引物和染色體DNA或染色體DNA文庫來進(jìn)行PCR而獲得?？梢匀缟纤鰪奈⑸镏兄苽淙旧wDNA或染色體DNA文庫，所述微生物屬于鏈霉菌屬，如暗產(chǎn)色鏈霉菌，磚紅色鏈霉菌，不產(chǎn)色鏈霉菌，淺灰鏈霉菌，Streptomycescarbophilus，灰褐鏈霉菌，熱淡天藍(lán)鏈霉菌，黑胡桃鏈霉菌，津島鏈霉菌，球團(tuán)產(chǎn)色鏈霉菌，橄欖產(chǎn)色鏈霉菌，裝飾鏈霉菌，灰色鏈霉菌，羊毛鏈霉菌，三澤鏈霉菌，蒼白色鏈霉菌，玫瑰變紅鏈霉菌，魯?shù)劓溍咕退贡ゆ溍咕唧w地，暗產(chǎn)色鏈霉菌IFO 12898，磚紅色鏈霉菌ATCC 21469，不產(chǎn)色鏈霉菌IFO 12735，淺灰鏈霉菌ATCC 11796，Streptomycescarbophilus SANK62585，灰褐鏈霉菌IFO 12870t，熱淡天藍(lán)鏈霉菌IFO14273t，黑胡桃鏈霉菌IFO 13445，津島鏈霉菌IFO 13782，球團(tuán)產(chǎn)色鏈霉菌IFO 13673t，橄欖產(chǎn)色鏈霉菌IFO 12444，裝飾鏈霉菌IFO 13069t，灰色鏈霉菌ATCC 10137，灰色鏈霉菌IFO 13849T，羊毛鏈霉菌IFO 12787T，三澤鏈霉菌IFO 13855T，蒼白色鏈霉菌IFO 13434T，玫瑰變紅鏈霉菌IFO13682T，魯?shù)劓溍咕鶬FO 15875T和斯堡鏈霉菌IFO 13446T，等；或?qū)儆谔嵌噫呔鷮俚奈⑸?，如塔氏糖多孢菌，更具體地，塔氏糖多孢菌JCM9383t等。關(guān)于“在SEQ ID NO6，7，8或109所示核苷酸序列中序列同一性特別高的區(qū)域”，例如，提及對應(yīng)于SEQ ID NO6所示核苷酸序列中核苷酸290-315，458-485，496-525或1046-1073中每一個所示區(qū)域的區(qū)域。關(guān)于基于這些核苷酸序列區(qū)域設(shè)計的引物，例如，可以提及包含SEQ IDNO124-129中任何一個所示核苷酸序列的引物。
SEQ ID NO124；基于對應(yīng)于以上核苷酸290-315所示區(qū)域的區(qū)域的核苷酸序列；
SEQ ID NO125；基于對應(yīng)于以上核苷酸458-485所示區(qū)域的區(qū)域的核苷酸序列；SEQ ID NO126；基于對應(yīng)于以上核苷酸458-485所示區(qū)域的區(qū)域的核苷酸序列；SEQ ID NO127；基于對應(yīng)于以上核苷酸496-525所示區(qū)域的區(qū)域的核苷酸序列；SEQ ID NO128；基于對應(yīng)于以上核苷酸496-525所示區(qū)域的區(qū)域的核苷酸序列；和SEQ ID NO129；基于對應(yīng)于以上核苷酸1046-1073所示區(qū)域的區(qū)域的核苷酸序列。
例如，通過使用包含SEQ ID NO124所示核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ ID NO129所示核苷酸序列的寡核苷酸的配對作為引物擴(kuò)增約800bp的DNA。通過使用包含SEQ ID NO125所示核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ ID NO129所示核苷酸序列的寡核苷酸的配對作為引物擴(kuò)增約600bp的DNA。通過使用包含SEQ ID NO126所示核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ ID NO129所示核苷酸序列的寡核苷酸的配對作為引物擴(kuò)增約600bp的DNA。通過使用包含SEQ ID NO127所示核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ ID NO129所示核苷酸序列的寡核苷酸的配對作為引物擴(kuò)增約580bp的DNA。另外，通過使用包含SEQ ID NO128所示核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ ID NO129所示核苷酸序列的寡核苷酸的配對作為引物擴(kuò)增約580bp的DNA。
關(guān)于PCR條件，具體地例如，提及以下條件保持95℃ 1分鐘；重復(fù)30個循環(huán)，一個循環(huán)包括保持94℃ 15秒，接著60℃ 30秒，然后72℃ 1分鐘；然后保持在72℃ 5分鐘?？梢允褂?5μl的反應(yīng)溶液，其包含10ng染色體DNA，包含2種引物各自200nM，包含0.5μl dNTP混合物(4種dNTP每種10mM的混合物)，包含5μl 5x GC基因組PCR反應(yīng)緩沖液，其包含5μl 5M GC-Melt和包含0.5μl Advantage-GC基因組聚合酶混合物(Clontech Company)。
通過回收如上所述擴(kuò)增的DNA，可以獲得包含本發(fā)明DNA(A)部分核苷酸序列的DNA。接下來，基于獲得的“包含本發(fā)明DNA(A)部分核苷酸序列的DNA”具有的核苷酸序列，設(shè)計和制備包含所述核苷酸序列至少約20個核苷酸的部分核苷酸序列的寡核苷酸，或包含與所述核苷酸序列至少約20個核苷酸的部分核苷酸序列互補的核苷酸序列的寡核苷酸。通過進(jìn)行PCR可以獲得包含延伸如上所述獲得的“包含本發(fā)明DNA(A)部分核苷酸序列的DNA”的3’末端下游或5’末端上游的本發(fā)明DNA(A)的部分核苷酸序列的DNA。PCR可以使用如上所述基于“包含本發(fā)明DNA(A)的部分核苷酸序列的DNA”的核苷酸序列制備的寡核苷酸和包含與用于構(gòu)建上述文庫的載體的DNA插入位點相鄰區(qū)域的核苷酸序列的至少約20個核苷酸的寡核苷酸或者包含與其核苷酸序列互補的核苷酸序列的至少約20bp的寡核苷酸的配對作為引物。PCR可以例如使用從微生物中制備的染色體DNA文庫作為模板，如上所述該微生物具有將化合物(II)轉(zhuǎn)化為化合物(III)的能力。通過連接這種包含本發(fā)明DNA(A)部分核苷酸序列的DNA，可以獲得本發(fā)明DNA(A)。在該生產(chǎn)方法中，可以使用可商購試劑盒，如Universal Genome Walker(Clontech Company)。備選地，通過基于如上所述連接本發(fā)明DNA(A)的部分核苷酸序列獲得的本發(fā)明DNA(A)的全長核苷酸序列制備引物，通過使用該引物和通過使用如上述染色體DNA文庫作為模板來進(jìn)行PCR可以獲得本發(fā)明DNA(A)。
例如，通過使用由黑胡桃鏈霉菌IFO 13445制備的染色體DNA或染色體DNA文庫作為模板和通過使用包含SEQ ID NO124所示核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ ID NO129所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物來進(jìn)行PCR，可以制備包含SEQ ID NO139的核苷酸316-1048(編碼SEQ IDNO159所示氨基酸序列的核苷酸序列的部分核苷酸序列)所示核苷酸序列的DNA?；讷@得的DNA的核苷酸序列，依照上述獲得包含延伸其3’末端下游或5’末端上游的核苷酸序列的DNA。通過連接產(chǎn)生的DNA可以獲得包含SEQ ID NO144(包含編碼SEQ ID NO159所示氨基酸序列的核苷酸序列和編碼SEQ ID NO149所示氨基酸序列的核苷酸序列)所示核苷酸序列的DNA。
例如，通過使用由津島鏈霉菌IFO 13782制備的染色體DNA或染色體DNA文庫作為模板和通過使用包含SEQ ID NO124所示核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ ID NO129所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物來進(jìn)行PCR，可以制備包含SEQ ID NO140的核苷酸364-1096(編碼SEQ IDNO160所示氨基酸序列的核苷酸序列的部分核苷酸序列)所示核苷酸序列的DNA?；讷@得的DNA的核苷酸序列，按照以上描述獲得包含延伸其3’末端下游或5’末端上游的核苷酸序列的DNA。通過連接產(chǎn)生的DNA可以獲得包含SEQ ID NO145(包含編碼SEQ ID NO150所示氨基酸序列的核苷酸序列和編碼SEQ ID NO160所示氨基酸序列的核苷酸序列)所示核苷酸序列的DNA。
例如，通過使用由熱淡天藍(lán)鏈霉菌IFO 14273t制備的染色體DNA或染色體DNA文庫作為模板和通過使用包含SEQ ID NO124所示核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ ID NO129所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物來進(jìn)行PCR，可以制備包含SEQ ID NO141的核苷酸295-1027(編碼SEQ ID NO136所示氨基酸序列的核苷酸序列的部分核苷酸序列)所示核苷酸序列的DNA?；讷@得的DNA的核苷酸序列，按照以上描述獲得包含延伸其3’末端下游或5’末端上游的核苷酸序列的DNA。通過連接產(chǎn)生的DNA可以獲得包含SEQ ID NO146(包含編碼SEQ ID NO136所示氨基酸序列的核苷酸序列和編碼SEQ ID NO151所示氨基酸序列的核苷酸序列)所示核苷酸序列的DNA。
例如，通過使用由球團(tuán)產(chǎn)色鏈霉菌IFO 13673t制備的染色體DNA或染色體DNA文庫作為模板和通過使用包含SEQ ID NO124所示核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ ID NO129所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物來進(jìn)行PCR，可以制備包含SEQ ID NO142的核苷酸316-1048(編碼SEQ ID NO137所示氨基酸序列的核苷酸序列的部分核苷酸序列)所示核苷酸序列的DNA?；讷@得的DNA的核苷酸序列，按照以上描述獲得包含延伸其3’末端下游或5’末端上游的核苷酸序列的DNA。通過連接產(chǎn)生的DNA可以獲得包含SEQ ID NO147(包含編碼SEQ ID NO137所示氨基酸序列的核苷酸序列和編碼SEQ ID NO152所示氨基酸序列的核苷酸序列)所示核苷酸序列的DNA。
例如，通過使用由橄欖產(chǎn)色鏈霉菌IFO 12444制備的染色體DNA或染色體DNA文庫作為模板和通過使用包含SEQ ID NO124所示核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ ID NO129所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物來進(jìn)行PCR，可以制備包含SEQ ID NO143的核苷酸316-1048(編碼SEQID NO138所示氨基酸序列的核苷酸序列的部分核苷酸序列)所示核苷酸序列的DNA?；讷@得的DNA的核苷酸序列，按照以上描述獲得包含延伸其3’末端下游或5’末端上游的核苷酸序列的DNA。通過連接產(chǎn)生的DNA可以獲得包含SEQ ID NO148(包含編碼SEQ ID NO138所示氨基酸序列的核苷酸序列和編碼SEQ ID NO153所示氨基酸序列的核苷酸序列)所示核苷酸序列的DNA。
例如，通過使用由玫瑰變紅鏈霉菌IFO 13682T制備的染色體DNA或染色體DNA文庫作為模板和通過使用包含SEQ ID NO124所示核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ ID NO129所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物來進(jìn)行PCR，可以制備包含SEQ ID NO232的核苷酸289-1015(編碼SEQ ID NO222所示氨基酸序列的核苷酸序列的部分核苷酸序列)所示核苷酸序列的DNA?；讷@得的DNA的核苷酸序列，按照以上描述獲得包含延伸其3’末端下游或5’末端上游的核苷酸序列的DNA。通過連接產(chǎn)生的DNA可以獲得包含SEQ ID NO242(包含編碼SEQ ID NO232所示氨基酸序列的核苷酸序列和編碼SEQ ID NO252所示氨基酸序列的核苷酸序列)所示核苷酸序列的DNA。
例如，通過使用由斯堡鏈霉菌IFO 13446T制備的染色體DNA或染色體DNA文庫作為模板和通過使用包含SEQ ID NO124所示核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ ID NO129所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物來進(jìn)行PCR，可以制備包含SEQ ID NO234的核苷酸289-1015(編碼SEQ IDNO224所示氨基酸序列的核苷酸序列的部分核苷酸序列)所示核苷酸序列的DNA?；讷@得的DNA的核苷酸序列，按照以上描述獲得包含延伸其3’末端下游或5’末端上游的核苷酸序列的DNA。通過連接產(chǎn)生的DNA可以獲得包含SEQ ID NO244(包含編碼SEQ ID NO234所示氨基酸序列的核苷酸序列和編碼SEQ ID NO254所示氨基酸序列的核苷酸序列)所示核苷酸序列的DNA。
通過按照“Molecular CloningA Laboratory Manual第二版”(1989)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，“Current Protocols in MolecularBiology”(1987)，John Wiley & Sons公司等所述的常規(guī)遺傳工程方法可以將通過使用上述PCR獲得的本發(fā)明DNA(A)克隆于載體中。具體地例如，可以通過使用質(zhì)粒載體如Strategene公司的pBluescript II或包含于Invitrogen公司的TA克隆試劑盒中的質(zhì)粒載體進(jìn)行克隆。
另外，例如如下所述可以制備本發(fā)明DNA(A)。首先，設(shè)計核苷酸序列。該核苷酸序列編碼由本發(fā)明DNA(A)編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。該核苷酸序列具有至多60％和至少40％，優(yōu)選至多55％和至少45％的GC含量。編碼上述蛋白質(zhì)氨基酸序列的核苷酸序列中密碼子使用在來自引入本發(fā)明DNA(A)的宿主細(xì)胞物種的基因中密碼子使用±4％的范圍內(nèi)。通過按照常規(guī)遺傳工程方法制備具有設(shè)計的核苷酸序列的DNA，可以獲得本發(fā)明DNA(A)。
例如，以下面所述方法可以設(shè)計編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)(A1)的氨基酸序列(SEQ ID NO1)和具有至多55％和至少45％GC含量的核苷酸序列，其中編碼上述蛋白質(zhì)的氨基酸序列的核苷酸序列中的密碼子是在大豆基因中密碼子使用±4％的范圍內(nèi)。首先，例如，比較編碼可以獲自暗產(chǎn)色鏈霉菌IFO 12898的本發(fā)明蛋白質(zhì)(A1)氨基酸序列的核苷酸序列(SEQ IDNO6)中的密碼子使用(表22和表23)和大豆密碼子使用(表24和表25)?；诒容^的結(jié)果，將核苷酸替代加入SEQ ID NO6所示核苷酸序列，以使GC含量至多55％和至少45％并且密碼子使用是在大豆密碼子使用±4％的范圍內(nèi)。作為該核苷酸替代，選擇不導(dǎo)致氨基酸替代的核苷酸替代。例如，編碼亮氨酸的CTG密碼子的使用在大豆基因中為1.22％和在SEQ IDNO6所示核苷酸序列中為7.09％。同樣，例如將從SEQ ID NO6所示核苷酸序列的核苷酸106，163，181，226，289，292，544，1111，和1210起始的CTG密碼子中的每一個替代成CTT密碼子；將從核苷酸211，547和1084起始的CTG密碼子中的每一個替代成CTA密碼子；將從核苷酸334起始的CTG密碼子替代成TTA密碼子；將從核苷酸664，718，733，772，835，1120和1141起始的CTG密碼子中的每一個替代成TTG密碼子；和將從核苷酸787起始的CTG密碼子替代成TTA密碼子。如此設(shè)計的核苷酸序列的一個序列在SEQ ID NO214中表示，其中密碼子的使用在表26和表27中顯示。在SEQ ID NO214所示的核苷酸序列中，例如，編碼亮氨酸的CTG密碼子的使用是1.71％并且在大豆密碼子使用(1.22％)±4％的范圍內(nèi)。按照如Sambrook，J.，F(xiàn)risch，E.F.，和Maniatis，T.；Molecular Cloning第二版，Cold Spring Harbor Press所述定點誘變法，可以通過將核苷酸替代引入具有SEQ ID NO6所示核苷酸序列的DNA制備包含SEQ ID NO214所示核苷酸序列的DNA。備選地，通過使用以下實施例46中所述PCR的DNA合成方法可以制備具有SEQ ID NO214所示核苷酸序列的DNA。
類似地，SEQ ID NO368所示核苷酸序列是設(shè)計編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)(A23)的氨基酸序列(SEQ ID NO222)和具有至多55％和至少45％GC含量的核苷酸序列的實例，其中編碼上述蛋白質(zhì)氨基酸序列的核苷酸序列中的密碼子使用是在大豆基因密碼子使用±4％的范圍內(nèi)。另外，SEQ ID NO393所示核苷酸序列是設(shè)計編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)(A25)的氨基酸序列(SEQID NO224)和具有至多55％和至少45％ GC含量的核苷酸序列的實例，其中編碼上述蛋白質(zhì)氨基酸序列的核苷酸序列中的密碼子使用是在大豆基因密碼子使用±4％的范圍內(nèi)。
按照如Sambrook，J.，F(xiàn)risch，E.F.，和Maniatis，T.；“Molecular Cloning第二版”(1989)，Cold Spring Harbor Press；“Current Protocols inMolecular Biology”(1987)，John Wiley & Sons公司等所述常規(guī)遺傳工程方法將如此獲得的本發(fā)明DNA(A)克隆到載體中。作為載體，具體地例如，可以利用pUC 119(TaKaRa Shuzo Company)，pTVA 118N(Takara ShuzoCompany)，pBluescript II(Toyobo Company)，pCR2.1-TOPO(Invitrogen)，pTrc99A(Pharmacia Company)，pKK331-1A(Pharmacia Company)，等。
另外，如此獲得的本發(fā)明DNA(A)的核苷酸序列可以通過F.Sanger，S.Nicklen，A.R.Coulson，Proceeding of National Academy of Science U.S.A.(1977)745463-5467所述的雙脫氧終止法分析。
以下述方法用作為標(biāo)記的將化合物(II)轉(zhuǎn)化為化合物(III)的能力可以證實由上述方法獲得的本發(fā)明DNA(A)編碼的本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)的代謝式(I)PPO抑制型除草化合物的能力。首先，如下所述，將所述DNA插入載體以使它連接在可以在宿主細(xì)胞中起作用的啟動子的下游，并導(dǎo)入宿主細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)化體。接下來，在包含電子供體如輔酶NDAPH的電子傳遞體系的存在下，將轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物或獲自破壞培養(yǎng)物的提取物與化合物(II)反應(yīng)。分析從中產(chǎn)生的反應(yīng)產(chǎn)物以檢測化合物(III)。如此，可以檢測具有代謝化合物(II)和產(chǎn)生化合物(III)的能力的轉(zhuǎn)化體，確定該轉(zhuǎn)化體具有編碼具有該能力的蛋白質(zhì)的本發(fā)明DNA(A)。更具體地例如，制備由0.1M磷酸鉀緩沖液(pH7.0)組成的30μl反應(yīng)溶液，其包含上述轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物或提取物，電子供體如終濃度約2mM的β-NADPH，終濃度約2mg/ml的來源于菠菜的鐵氧還蛋白，終濃度約0.1U/ml的鐵氧還蛋白還原酶和3ppm用放射性同位素標(biāo)記的化合物(II)。將反應(yīng)液在約30℃至40℃下溫育10分鐘至1小時。在該溫育后，加入3μl2N HCl和90μl乙酸乙酯，攪拌并在8,000g下離心以回收上清液。在真空中干燥上清液以后，將殘余物溶解在乙酸乙酯中并在TLC硅膠板上展開獲得的溶液。通過放射自顯影分析TLC板。通過鑒定對應(yīng)于用放射性同位素標(biāo)記的化合物(III)的斑點可以證實將化合物(II)轉(zhuǎn)化為化合物(III)的能力。
使用本發(fā)明DNA(A)或包含所述DNA的部分核苷酸序列或與部分核苷酸序列互補的核苷酸序列的多核苷酸，通過進(jìn)行如上所述的雜交或PCR可以進(jìn)一步搜索編碼具有將化合物(II)轉(zhuǎn)化為化合物(III)的能力的蛋白質(zhì)的DNA或具有該DNA的微生物。
具體地例如，進(jìn)行如上所述的雜交和鑒定與探針雜交的DNA。使用本發(fā)明DNA(A)或包含本發(fā)明DNA(A)的部分核苷酸序列或與部分核苷酸序列互補的核苷酸序列的多核苷酸作為探針，和來源于天然微生物的基因組DNA進(jìn)行雜交，例如，所述微生物屬于鏈霉菌屬，如暗產(chǎn)色鏈霉菌，磚紅色鏈霉菌，不產(chǎn)色鏈霉菌，淺灰鏈霉菌，Streptomyces carbophilus，灰褐鏈霉菌，熱淡天藍(lán)鏈霉菌，黑胡桃鏈霉菌，津島鏈霉菌，球團(tuán)產(chǎn)色鏈霉菌，橄欖產(chǎn)色鏈霉菌，裝飾鏈霉菌，灰色鏈霉菌，羊毛鏈霉菌，三澤鏈霉菌，蒼白色鏈霉菌，玫瑰變紅鏈霉菌，魯?shù)劓溍咕退贡ゆ溍咕?；所述微生物屬于糖多孢菌屬，如塔氏糖多孢菌；等。作為可以用作探針的DNA的具體實例，可以提及包含SEQ ID NO6，7，8，109，139，140，141，142，143，225，226，227，228，229，230，231，232，233或234任一個所示的全長核苷酸序列的DNA，包含SEQ ID NO6所示核苷酸序列的核苷酸57-730所示核苷酸序列的DNA；包含SEQ ID NO8所示核苷酸序列的核苷酸21-691所示核苷酸序列的DNA；等。
備選地，如上所述可以進(jìn)行PCR和可以檢測擴(kuò)增的DNA。PCR使用包含本發(fā)明DNA(A)的部分核苷酸序列或與部分核苷酸序列互補的核苷酸序列的多核苷酸。PCR使用來源于天然微生物的基因組DNA作為模板，例如，所述微生物屬于鏈霉菌屬，如暗產(chǎn)色鏈霉菌，磚紅色鏈霉菌，不產(chǎn)色鏈霉菌，淺灰鏈霉菌，Streptomyces carbophilus，灰褐鏈霉菌，熱淡天藍(lán)鏈霉菌，黑胡桃鏈霉菌，津島鏈霉菌，球團(tuán)產(chǎn)色鏈霉菌，橄欖產(chǎn)色鏈霉菌，裝飾鏈霉菌，灰色鏈霉菌，羊毛鏈霉菌，三澤鏈霉菌，蒼白色鏈霉菌，玫瑰變紅鏈霉菌，魯?shù)劓溍咕退贡ゆ溍咕?；所述微生物屬于糖多孢菌屬，如塔氏糖多孢菌；等。作為引物，可以提及基于如上所述“在SEQ ID NO6，7，8或109所示核苷酸序列中序列同一性特別高的區(qū)域”的核苷酸序列設(shè)計的引物。作為引物更具體的實例，提及包含SEQ ID NO124至128中任何一個所示核苷酸序列的引物和包含SEQ ID NO129所示核苷酸序列的引物的配對。
回收如此檢測的DNA。當(dāng)回收的DNA不包含本發(fā)明DNA(A)的全長核苷酸序列時，以上述方式將該DNA使用和制備成對應(yīng)于全長核苷酸序列的DNA。將獲得的DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化體。通過使用獲得的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物和以上述方法測量將化合物(II)轉(zhuǎn)化為化合物(III)的能力可以評估由導(dǎo)入轉(zhuǎn)化體的DNA編碼的蛋白質(zhì)將化合物(II)轉(zhuǎn)化為化合物(III)的能力。
為了在宿主細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明DNA(A)，將本發(fā)明DNA(A)導(dǎo)入宿主細(xì)胞中能夠使它在所述細(xì)胞中表達(dá)的位置。通過將本發(fā)明DNA(A)導(dǎo)入“能使它表達(dá)的位置”，它是指將本發(fā)明DNA(A)導(dǎo)入宿主細(xì)胞以使它處于與指導(dǎo)從其核苷酸序列轉(zhuǎn)錄和翻譯的核苷酸序列相鄰的位置(即例如，促進(jìn)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)和編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)的RNA生產(chǎn)的核苷酸序列)。
為了將本發(fā)明DNA(A)導(dǎo)入宿主細(xì)胞以使它位于能使它表達(dá)的位置，例如，將其中本發(fā)明DNA(A)和在宿主細(xì)胞中起作用的啟動子可操作連接的DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞。這里術(shù)語“可操作連接”是指其中本發(fā)明DNA(A)與啟動子連接以致當(dāng)將DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞中時它在啟動子的控制下表達(dá)的情形。
當(dāng)宿主細(xì)胞是微生物細(xì)胞時，作為起作用的啟動子，例如可以提及大腸桿菌乳糖操縱子的啟動子，大腸桿菌色氨酸操縱子的啟動子，T7噬菌體啟動子或在大腸桿菌中起作用的人造啟動子，如tac啟動子或trc啟動子等。另外，可以利用在屬于鏈霉菌屬或糖多孢菌屬的微生物的染色體中原來位于本發(fā)明DNA(A)上游的啟動子。
當(dāng)宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞時，作為起作用的啟動子，例如提及T-DNA衍生的組成型啟動子，如胭脂堿合酶基因的啟動子和章魚堿合酶基因啟動子；植物病毒衍生的啟動子如花椰菜花葉病毒衍生的19S和35S啟動子；可誘導(dǎo)的啟動子如苯丙氨酸氨裂解酶基因的啟動子，查耳酮合酶基因的啟動子和致病相關(guān)的蛋白質(zhì)基因的啟動子；日本未審查的專利公開號2000-166577所述的植物啟動子。另外，可以將在植物細(xì)胞中起作用的終止子連接到其中在植物細(xì)胞中起作用的啟動子和本發(fā)明DNA(A)被可操作連接的DNA上。在該情形中，通常優(yōu)選將終止子連接到本發(fā)明DNA(A)的下游。作為起作用的終止子，例如提及T-DNA衍生的組成型終止子如胭脂堿合酶基因(NOS)的終止子；植物病毒衍生的終止子如蔥屬病毒GVl或GV2的終止子；在日本未審查的專利公開號2000-166577中所述的植物終止子；等。
當(dāng)導(dǎo)入本發(fā)明DNA(A)以使DNA處于能使它表達(dá)的位置時，例如可以使用含有編碼轉(zhuǎn)運至胞內(nèi)細(xì)胞器的信號的核苷酸序列的DNA，其連接到本發(fā)明DNA(A)的上游以使可讀框在框內(nèi)。通過連接“以使可讀框在框內(nèi)”它是指將對胞內(nèi)細(xì)胞器的轉(zhuǎn)運信號的序列的可讀框和本發(fā)明DNA(A)的可讀框連接形成一個連續(xù)的可讀框。作為提供蛋白質(zhì)在植物細(xì)胞的胞內(nèi)細(xì)胞器中轉(zhuǎn)運和定位的轉(zhuǎn)運信號序列，例如可以提及如美國專利5,717,084所述、來源于位于植物葉綠體中的蛋白質(zhì)的胞質(zhì)前體的轉(zhuǎn)運信號，由美國專利RE36449所述的各種轉(zhuǎn)運信號序列形成的嵌合序列。更具體地，提及來源于大豆核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亞基的葉綠體轉(zhuǎn)運肽，其按照下面實施例15所述方法可以獲得。
典型地，可以將本發(fā)明DNA(A)，如上所述連接含有編碼對胞內(nèi)細(xì)胞器的轉(zhuǎn)運信號的核苷酸序列的DNA的本發(fā)明DNA(A)，或其中該DNA與在宿主細(xì)胞中起作用的啟動子可操作連接的DNA，各自可被插入在宿主細(xì)胞中可用的載體中，將這導(dǎo)入宿主細(xì)胞。當(dāng)使用已經(jīng)具有在宿主細(xì)胞中起作用的啟動子的載體時，可以將本發(fā)明DNA(A)插入存在于載體中的啟動子的下游以使所述啟動子和本發(fā)明DNA(A)可以可操作連接。
作為載體，具體地當(dāng)使用大腸桿菌作為宿主細(xì)胞時，例如，可以提及pUC 119(TaKaRa Shuzo Company)，pTVA 118N(Takara Shuzo Company)，pBluescript II(Strategene Company)，pCR2.1-TOPO(Invitrogen)，pTrc99A(Amersham Pharmacia Biotech Company)，pKK331-1A(AmerchamPharmacia Biotech Company)，pETlld(Novagen)等。通過使用包含選擇性標(biāo)記(例如賦予對抗生素的抗性的基因如卡那霉素抗性基因，新霉素抗性基因等)的載體，它是方便的，因為可以將選擇性標(biāo)記的表型用作指示物來選擇導(dǎo)入本發(fā)明DNA的轉(zhuǎn)化體。
關(guān)于將本發(fā)明DNA(A)或包含本發(fā)明DNA(A)的載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法，當(dāng)宿主細(xì)胞是微生物，例如大腸桿菌(E.coli)，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，短芽孢桿菌(Bacillus brevis)，假單胞菌屬物種(Pseudomonas sp.)，發(fā)酵單胞菌屬物種(Zymomonas sp.)，乳酸菌，乙酸菌，葡萄球菌屬物種(Staphylococcus sp.)，鏈霉菌屬物種(Streptomyces sp.)，糖多孢菌屬物種(Saccharopolyspora sp.)，或酵母如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，栗酒裂殖酵母(Schizosaccaromyces ponmbe)，真菌如曲霉屬(Aspergillus)等時，可以提及在Shin Seikagaku Zikken Kouza(Nippon-Seikagaku-Kai eds.，Tokyo Kagaku Dozin)，17卷，Biseibutu-Zikken-Hou中所述方法。備選地，例如可以使用在Sambrook，J.，F(xiàn)risch，E.F.，和Maniatis，T.；“Molecular Cloning第二版”Cold SpringHarborPress(Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)或在“Current Protocols in Molecualr Biology”(1987)，John Wiley & Sons公司中所述的氯化鈣法或在“Methods in ElectroporationGene Pulser/E.coliPulser System”，Bio-Rad Laboratories(1993)中所述的電穿孔法。
例如通過如上所述選擇包含在已經(jīng)插入本發(fā)明DNA(A)的載體中的選擇性標(biāo)記的表型作為指示物可以選擇其中已經(jīng)導(dǎo)入本發(fā)明DNA(A)或包含本發(fā)明DNA(A)的載體的轉(zhuǎn)化體。另外，通過從轉(zhuǎn)化體中制備DNA和然后用制備的DNA進(jìn)行在例如“Molecular Cloning第二版”，Cold SpringHarbor Press(Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)(如證實限制酶位點，DNA測序，DNA雜交，PCR等)所述的遺傳工程分析方法可以證實轉(zhuǎn)化體是否包含本發(fā)明DNA(A)或含本發(fā)明DNA(A)的載體。
當(dāng)宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞時，可以提及植物類型，例如，雙子葉植物如煙草，棉花，油菜籽，甜菜，擬南芥，油菜(canola)，亞麻，向日葵，馬鈴薯，苜蓿，萵苣，香蕉，大豆，豌豆，莢果，松樹，楊樹，蘋果，葡萄，橙子，檸檬，其它柑橘屬水果，杏，胡桃和其它堅果；單子葉植物如玉米，水稻，小麥，大麥，黑麥，燕麥，高梁，甘蔗和草；等。關(guān)于導(dǎo)入本發(fā)明DNA(A)的細(xì)胞可以使用植物組織，植物體，培養(yǎng)的細(xì)胞，種子等。
關(guān)于將本發(fā)明DNA(A)或包含本發(fā)明DNA(A)的載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法，提及方法如用農(nóng)桿菌感染(日本審查專利公開號2-58917和日本未審查專利公開號60-70080)，電穿孔到原生質(zhì)體中(日本未審查專利公開號60-251887和日本未審查專利公開號5-68575)或基因槍法(日本未審查專利公開號5-508316和日本未審查專利公開號63-258525)。
在這些情形中，例如，通過與包含本發(fā)明DNA(A)的載體同時將選自潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因和氯霉素轉(zhuǎn)乙酰酶基因的選擇性標(biāo)記導(dǎo)入植物細(xì)胞，可以用選擇性標(biāo)記的表型作為指示物選擇已經(jīng)導(dǎo)入本發(fā)明DNA的轉(zhuǎn)化體。可以將選擇性標(biāo)記基因和本發(fā)明DNA(A)插入相同的載體和導(dǎo)入。還可同時導(dǎo)入包含選擇性標(biāo)記基因的載體和包含本發(fā)明DNA(A)的載體。通過用包含式(I)PPO抑制型除草化合物的培養(yǎng)基培養(yǎng)和通過分離其中可增加的克隆也可以選擇已經(jīng)導(dǎo)入本發(fā)明DNA(A)的轉(zhuǎn)化體。通過從轉(zhuǎn)化體中制備DNA和然后用制備的DNA進(jìn)行例如在“Molecular Cloning第二版”，Cold Spring Harbor Press(MolecularBiology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)中描述的遺傳工程分析方法(如證實限制酶位點，DNA測序，DNA雜交，PCR等)可以證實轉(zhuǎn)化體是否包含本發(fā)明DNA(A)。通過插入到包含在胞內(nèi)細(xì)胞器如葉綠體中的DNA可以將導(dǎo)入植物細(xì)胞中的本發(fā)明DNA(A)保持在除了包含在核中的DNA以外的細(xì)胞中的位置。
從如此獲得的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，通過在Shokubutu-Idenshi-Sosa-ManualTransgenic-Shokubutu-No-Tukurikata(Uchimiya，Kodansha-Scientific，1990)，27-55頁所述的植物細(xì)胞培養(yǎng)方法再生植物體可以獲得已經(jīng)導(dǎo)入本發(fā)明DNA(A)的轉(zhuǎn)基因植物。另外，通過將靶類型的植物與已經(jīng)導(dǎo)入本發(fā)明DNA(A)的轉(zhuǎn)基因植物交配以使本發(fā)明DNA(A)導(dǎo)入靶類型植物的染色體中，可以產(chǎn)生已經(jīng)導(dǎo)入本發(fā)明DNA(A)的靶植物類型。
具體地，例如，通過Model-Shokubutu-No-Jikken-ProtocolIne，Shiroinunazuna-Hen(SupervisorsKoh SHIMAMOTO和Kiyotaka OKADA，Shujun-sha，1996)，第四章所述的方法可以獲得其中已經(jīng)導(dǎo)入本發(fā)明DNA(A)和表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)的水稻或擬南芥。另外，通過按照日本未審查的專利公開號3-291501所述方法用基因槍導(dǎo)入大豆體細(xì)胞胚可以獲得其中已經(jīng)導(dǎo)入本發(fā)明DNA(A)和表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)的大豆。同樣，通過按照Fromm，M.E.，等Bio/Technology，8；第838頁(1990)所述方法用基因槍導(dǎo)入玉米體細(xì)胞胚可以獲得其中已經(jīng)導(dǎo)入本發(fā)明DNA(A)和表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)的玉米。通過按照TAKUMI等，Journal ofBreeding Society(1995)，44Extra卷1，第57頁所述常規(guī)方法用基因槍將基因?qū)霟o菌培養(yǎng)的小麥未成熟盾蓋可以獲得其中已經(jīng)導(dǎo)入本發(fā)明DNA(A)和表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)的小麥。同樣，通過按照HAGIO，等，Journal of Breeding Society(1995)，44；Extra卷1，第67頁所述常規(guī)方法用基因槍導(dǎo)入無菌培養(yǎng)的大麥未成熟盾蓋可以獲得其中已經(jīng)導(dǎo)入本發(fā)明DNA(A)和表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)的大麥。
通過在它的細(xì)胞內(nèi)將所述除草化合物轉(zhuǎn)化成低除草活性的化合物，其中已經(jīng)導(dǎo)入本發(fā)明DNA(A)和表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)的轉(zhuǎn)化體可以減輕由化合物(I)導(dǎo)致的植物損傷。具體地例如，通過在期望植物的播種之前將表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)的微生物散布在期望栽培的植物的栽培區(qū)域，殘余在土壤中的除草化合物可以被代謝，可以減輕對期望植物的損傷。另外，通過使期望的各種植物表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)，賦予所述植物將式(I)的PPO抑制型除草化合物代謝成低活性的化合物的能力。結(jié)果，減輕植物中來自除草化合物的植物損傷，賦予對所述化合物的抗性。
例如通過培養(yǎng)包含本發(fā)明DNA(A)的細(xì)胞可以制備本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)。關(guān)于該細(xì)胞，提及表達(dá)本發(fā)明DNA(A)和具有生產(chǎn)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)的能力的微生物，如從自然界分離的包含本發(fā)明DNA(A)的微生物菌株，通過用試劑或紫外線處理等處理由天然菌株衍生的突變株。更具體地例如，提及屬于鏈霉菌屬的微生物，暗產(chǎn)色鏈霉菌IFO 12898，磚紅色鏈霉菌ATCC 21469，不產(chǎn)色鏈霉菌IFO 12735，淺灰鏈霉菌ATCC11796，Streptomyces carbophilus SANK62585，灰褐鏈霉菌IFO 12870t，熱淡天藍(lán)鏈霉菌IFO 14273t，黑胡桃鏈霉菌IFO 13445，津島鏈霉菌IFO13782，球團(tuán)產(chǎn)色鏈霉菌IFO 13673t，橄欖產(chǎn)色鏈霉菌IFO 12444，裝飾鏈霉菌IFO 13069t，灰色鏈霉菌ATCC 10137，灰色鏈霉菌IFO 13849T，羊毛鏈霉菌IFO 12787T，三澤鏈霉菌IFO 13855T，蒼白色鏈霉菌IFO 13434T，玫瑰變紅鏈霉菌IFO 13682T，魯?shù)劓溍咕鶬FO 15875T和斯堡鏈霉菌IFO13446T，等；或?qū)儆谔嵌噫呔鷮俚奈⑸?，如塔氏糖多孢菌JCM 9383t等。另外，可以提及其中已經(jīng)導(dǎo)入本發(fā)明DNA(A)或包含本發(fā)明DNA(A)的載體的轉(zhuǎn)化體。具體地例如，提及其中將與tac啟動子，trc啟動子，lac啟動子或t7噬菌體啟動子可操作連接的本發(fā)明DNA(A)導(dǎo)入大腸桿菌的轉(zhuǎn)化體。作為更多的具體實例，提及在下述實施例中描述的大腸桿菌JM109/pKSN657，大腸桿菌JM109/pKSN657F，大腸桿菌JM109/pKSN923，大腸桿菌JM109/pKSN923F，大腸桿菌JM109/pKSN11796，大腸桿菌JM109/pKSN11796F，大腸桿菌JM109/pKSN671，大腸桿菌JM109/pKSN671F，大腸桿菌JM109/pKSNCA，大腸桿菌JM109/pKSN646，大腸桿菌JM109/pKSN646F，大腸桿菌JM109/pKSN849AF，大腸桿菌JM109/pKSN1618F，大腸桿菌JM109/pKSN474F，大腸桿菌JM109/pKSN1491AF，大腸桿菌JM109/pKSN1555AF，大腸桿菌JM109/pKSN1584F，大腸桿菌JM109/pKSN1609F等。
作為培養(yǎng)上述包含本發(fā)明DNA(A)的微生物的培養(yǎng)基，可以使用通常用于培養(yǎng)微生物的那些中的任何一種，其包含碳源和氮源，如果適當(dāng)?shù)脑捰袡C(jī)和無機(jī)鹽?？梢约尤胙t素前體的化合物，如氨基乙酰丙酸。
作為碳源，例如提及糖類如葡萄糖，果糖，蔗糖和糊精；糖醇如甘油和山梨糖醇；和有機(jī)酸如延胡索酸，檸檬酸和丙酮酸；等。上面所列碳源加入培養(yǎng)基的量通常是基于培養(yǎng)基總量的約0.1％(w/v)至約10％(w/v)。
作為氮源，例如提及無機(jī)酸的銨鹽如氯化銨，硫酸銨和磷酸銨；有機(jī)酸的銨鹽如延胡索酸銨和檸檬酸銨；有機(jī)氮源如肉膏，酵母提取物，麥芽汁，大豆粉，玉米漿，棉籽粉，干酵母，酪蛋白水解物；以及氨基酸。在以上所列那些中，有機(jī)酸的銨鹽，有機(jī)氮源和氨基酸也可以通常用作碳源。加入氮源的量通常是基于培養(yǎng)基總量的約0.1％(w/v)至約10％(w/v)。
作為無機(jī)鹽，例如，提及磷酸鹽如磷酸鉀，磷酸氫二鉀，磷酸鈉，磷酸氫二鈉；氯化物如氯化鉀，氯化鈉，氯化鈷六水合物；硫酸鹽如硫酸鎂，硫酸鐵七水合物，硫酸鋅七水合物，硫酸錳三水合物；等。加入的量通常是基于培養(yǎng)基總量的約0.0001％(w/v)至約1％(w/v)。
在培養(yǎng)保持連接于T7噬菌體啟動子下游的本發(fā)明DNA(A)和其中編碼T7 RNA聚合酶(λDE3溶原菌)的核苷酸序列連接于lac UV5啟動子下游的DNA的轉(zhuǎn)化體的情形中，典型地可以加入少量例如異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(以下稱為“IPTG”)作為誘導(dǎo)物誘導(dǎo)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)的生產(chǎn)。在培養(yǎng)已經(jīng)導(dǎo)入DNA的轉(zhuǎn)化體情形中，也可以將IPTG加入培養(yǎng)基，所述DNA中本發(fā)明DNA(A)與一類由乳糖誘導(dǎo)的啟動子如tac啟動子，trc啟動子和lac啟動子可操作連接。
可以按照通常用于培養(yǎng)微生物的方法，包括液相培養(yǎng)如旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)，往復(fù)式振蕩培養(yǎng)，小型發(fā)酵(小型發(fā)酵罐培養(yǎng))和罐培養(yǎng)；或固相培養(yǎng)，培養(yǎng)包含本發(fā)明DNA(A)的微生物。當(dāng)使用小型發(fā)酵罐時，通常以每分鐘約0.1至約2倍培養(yǎng)液體積的通風(fēng)速率將無菌空氣導(dǎo)入小型發(fā)酵罐。實施培養(yǎng)的溫度可以在允許微生物生長的范圍內(nèi)變化，通常為約15℃至約40℃，培養(yǎng)基的pH為約6至約8。培養(yǎng)時間可以根據(jù)培養(yǎng)條件變化，通常約為1天至約10天。
通過包含本發(fā)明DNA(A)的微生物生產(chǎn)的本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)可以以各種形式用于處理式(I)的PPO抑制型除草化合物，如生產(chǎn)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)的微生物的培養(yǎng)物，生產(chǎn)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)的微生物細(xì)胞，通過處理該細(xì)胞得到的材料，微生物的無細(xì)胞提取物，未完全純化的蛋白質(zhì)，純化的蛋白質(zhì)等。上述通過處理細(xì)胞獲得的材料包括例如凍干細(xì)胞，丙酮干燥細(xì)胞，磨碎的細(xì)胞，細(xì)胞的自溶物，超聲處理的細(xì)胞，堿處理的細(xì)胞，有機(jī)溶劑處理的細(xì)胞等。備選地，可以按照已知方法如使用吸附在無機(jī)載體如硅膠或陶瓷材料，多糖衍生物如DEAE-纖維素，合成聚合物如Amberite IRA-935(商品名，由Rohm和Haas制備)等之上的載體結(jié)合法，和使用包含在聚合物如聚丙烯酰胺，含硫多糖凝膠(例如角叉藻聚糖凝膠)，藻酸膠，瓊脂膠等的網(wǎng)狀基質(zhì)中的包含法來固定上述各種形式中任何一種本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)，然后用于處理上述除草化合物。
作為從包含本發(fā)明DNA(A)的微生物的培養(yǎng)物中純化本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)的方法，可以使用常規(guī)用于純化蛋白質(zhì)的方法。例如可以提及下列方法。
首先，通過離心等從微生物的培養(yǎng)物中收獲細(xì)胞，然后通過超聲處理，DYNOMILL處理，F(xiàn)RENCH PRESS處理等物理破裂，或通過使用表面活性劑或細(xì)胞裂解酶如溶菌酶化學(xué)破裂細(xì)胞。從如此獲得的產(chǎn)生的裂解物中，通過離心，膜過濾等去除不溶物以制備無細(xì)胞提取物，其然后通過任何適當(dāng)?shù)姆蛛x和純化方法，如陽離子交換層析，陰離子交換層析，疏水層析，凝膠過濾層析等分級，由此純化本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)。用于該層析的支持材料包括例如樹脂載體如與羧甲基(CM)，二乙氨基乙基(DEAE)，苯基或丁基連接的纖維素，葡聚糖和瓊脂糖。也可以使用可商購的已經(jīng)填充任何載體的柱子，如Q-Sepharose FF，Phenyl-Sepharose HP，PD-10和HiLoad26/10 Q Sepharose HP(商品名，來自Amersham Pharmacia Biotech)，TSK-gel G3000SW(商品名，TOSOH CORPORATION)。
提供純化本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)的一個實例。
通過離心收獲產(chǎn)生本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)的微生物細(xì)胞，然后懸浮在緩沖液如0.1M磷酸鉀(pH7.0)中。超聲處理混懸液以破裂細(xì)胞，在約40,000g下離心如此獲得的產(chǎn)生的裂解物約30分鐘以獲得上清液，其然后在150,000g下離心約1小時以回收上清液(無細(xì)胞提取物)。將獲得的無細(xì)胞提取物進(jìn)行硫酸銨分級分離以獲得在45％-飽和硫酸銨的存在下可溶解和在55％-飽和的硫酸銨下沉淀的級分。在使用PD 10柱(AmershamPharmacia Biotech Company)用不包含硫酸銨的緩沖液如1M磷酸鉀交換級分的溶劑后，將產(chǎn)生的級分上樣到例如HiLoad 26/10 Q Sepharose HP柱(Amersham Pharmacia Biotech Company)上。用20mM雙三丙烷(bistripropane)和NaCl線性梯度洗脫柱子而獲得一系列洗脫物級分?；厥诊@示在包含電子供體如輔酶NADPH的電子傳遞體系的存在下將化合物(II)轉(zhuǎn)化為化合物(III)的活性的級分。接下來，在通過使用例如PD10柱(Amersham Pharmacia Biotech Company)交換級分中的緩沖液以后，將回收的級分上樣到Bio-Scale Ceramic，例如羥磷灰石，I型柱子CHT10-I(BioRad Company)上。在用緩沖液A(包含1.5mM CaCl2的2mM磷酸鉀緩沖液；pH7.0)洗滌柱子以后，用緩沖液A和線性梯度的緩沖液B(包含0.03mM CaCl2的100mM磷酸鉀緩沖液)洗脫柱子以獲得一系列洗脫物級分。回收顯示在包含電子供體如輔酶NADPH的電子傳遞體系的存在下將化合物(II)轉(zhuǎn)化為化合物(III)的活性的級分。在通過使用例如PD10柱(Amersham Pharmacia Biotech Company)交換級分中的緩沖液以后，通過例如超濾(microcon濾器裝置microcon-30；Millipore公司)濃縮回收的級分。將產(chǎn)生的級分例如注射到HiLoad 16/60 Superdex柱75pg柱(Amersham Pharmacia Biotech Company)中和用包含0.15M NaCl(pH7.0)的0.05M磷酸鉀緩沖液洗脫而獲得一系列洗脫物級分?；厥诊@示在包含電子供體如輔酶NADPH的電子傳遞體系的存在下將化合物(II)轉(zhuǎn)化為化合物(III)的活性的級分。根據(jù)需要通過用SDS-PAGE分離可以純化本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)。
通過以上述方法純化本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)，接著將獲得的本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)用作免疫抗原，可以產(chǎn)生識別本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)的抗體(下文有時稱為“本發(fā)明抗體(A)”)。
具體地例如，用以上述方法純化的本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)作為抗原免疫動物。例如，為了免疫動物如小鼠，倉鼠，豚鼠，小雞，大鼠，兔子，狗等，使用在例如W.H.Newsome，J.Assoc.Off.Anal.Chem.70(6)1025-1027(1987)中描述的常規(guī)免疫方法至少施用抗原一次。作為給藥計劃，例如提及在7至30天的間隔，優(yōu)選12至16天的間隔給藥2或3次。其劑量是例如每次給藥約0.05mg-2mg抗原。給藥途徑可選自皮下給藥，皮內(nèi)給藥，腹膜內(nèi)給藥，靜脈內(nèi)給藥，和肌內(nèi)給藥，靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)或皮下注射是典型的給藥方式。典型地在溶于適當(dāng)?shù)木彌_液中后使用抗原，所述緩沖液例如磷酸鈉緩沖液或生理鹽水，其包含至少一種通常使用的佐劑如完全弗氏佐劑(Aracel A，Bayol F和死結(jié)核桿菌(tubercule bacillus)的混合物)，RAS[MPL(單磷?；愔珹)+TDM(合成trehalose dicorynomycolate)+CWS(細(xì)胞壁骨架)佐劑系統(tǒng)]或氫氧化鋁。然而，取決于給藥途徑或病癥，可以不使用上述佐劑?！白魟笔墙?jīng)與抗原一起給藥后增強非特異性針對抗原的免疫反應(yīng)的物質(zhì)。在喂養(yǎng)施用抗原的動物0.5-4個月后，從例如動物的耳靜脈中采樣少量血液和測量抗體效價。當(dāng)抗體效價提高時，根據(jù)情形再施用抗原適當(dāng)?shù)拇螖?shù)。例如，可以以約100μg-1000μg的劑量再一次使用抗原。在最后一次給藥1或2個月以后，以通常方式從免疫動物中收集血液。通過常規(guī)技術(shù)如通過離心或用硫酸銨或用聚乙二醇沉淀，層析如凝膠過濾層析，離子交換層析和親和層析，等將血液分級，可以獲得作為多克隆抗血清的本發(fā)明抗體(A)。另外，可以將抗血清例如在56℃下溫育30分鐘以使補體系統(tǒng)失活。
備選地，化學(xué)合成包含本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)部分氨基酸序列的多肽并作為免疫抗原施用于動物，由此產(chǎn)生本發(fā)明抗體(A)。關(guān)于用作免疫抗原使用的多肽的氨基酸序列，從本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)的氨基酸序列中選擇與其它蛋白質(zhì)的氨基酸序列具有盡可能低同源性的氨基酸序列。通過常規(guī)方法化學(xué)合成由所選氨基酸序列組成的、10個氨基酸至15個氨基酸長度的多肽，并例如使用MBS等與載體蛋白如Limulus plyhemus血藍(lán)蛋白交聯(lián)，然后如上所述用于免疫動物如兔子。
然后將產(chǎn)生的本發(fā)明抗體(A)與試樣接觸，然后通過常規(guī)免疫學(xué)方法檢測試樣中蛋白質(zhì)與上述抗體的復(fù)合體，從而檢測試樣中的本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)或包含其部分氨基酸的多肽。具體地例如，如以下實施例45或73所述可以通過使用本發(fā)明抗體(A)的蛋白質(zhì)印跡分析評估在檢查試樣中本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)的存在或定量本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)。
另外，例如，按照常規(guī)免疫學(xué)方法，通過將本發(fā)明抗體(A)與試驗細(xì)胞或由試驗細(xì)胞制備的試樣接觸，接著檢測上述抗體和試驗細(xì)胞或由試驗細(xì)胞制備的試樣中的蛋白質(zhì)的復(fù)合體，可以檢測表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)的細(xì)胞。通過如此檢測表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)的細(xì)胞，還可以從多種細(xì)胞中選擇表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)的細(xì)胞。使用本發(fā)明抗體(A)還可以克隆或選擇包含本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)的克隆。例如，通過從表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)的細(xì)胞中提取基因組DNA，接著將基因組DNA插入表達(dá)載體可以產(chǎn)生基因組文庫。將基因組文庫導(dǎo)入細(xì)胞。從獲得的細(xì)胞組中，以上述方法使用本發(fā)明抗體(A)選擇表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)的細(xì)胞。
可以將包含本發(fā)明抗體(A)的試劑盒用來如上所述檢測本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)或分析，檢測或?qū)ふ冶磉_(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)的細(xì)胞。本發(fā)明的試劑盒可以包含除了本發(fā)明抗體(A)以外的上述分析方法所需的試劑，可以含有與本發(fā)明抗體(A)一起使用的試劑。
通過將式(I)的PPO抑制型除草化合物在包含電子供體如輔酶NADPH的電子傳遞體系的存在下與本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)反應(yīng)，將上述化合物代謝和轉(zhuǎn)化成低除草活性的化合物。具體地例如，通過在包含電子供體如輔酶NADPH的電子傳遞體系的存在下將化合物(II)與本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)反應(yīng)，化合物(II)被轉(zhuǎn)化成化合物(III)，其顯示基本上沒有除草活性。在該情形中的蛋白質(zhì)(A)的實例是本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)?？梢允褂帽景l(fā)明蛋白質(zhì)(A)的一個變體，可以一起使用多個變體。
式(I)的化合物是具有尿嘧啶結(jié)構(gòu)的化合物。作為具體的實例，可以提及化合物(II)或式(IV)至(IX)中任何一個的化合物(下文分別稱為化合物(IV)至化合物(IX))。按照在日本未審查的專利公開號2000-319264中所述方法可以合成化合物(II)和化合物(IX)，按照美國專利5183492所述方法可以合成化合物(IV)和化合物(V)，按照美國專利5674810所述方法可以合成化合物(VI)，按照日本未審查專利公開號3-204865所述方法可以合成化合物(VII)，按照日本未審查專利公開號6-321941所述方法可以合成化合物(VIII)。

另外，作為式(I)化合物的具體實例，可以提及式(X)至(XVII)中任何一項的化合物(以下分別稱為化合物(X)至化合物(XVII))。

通過使化合物存在于反應(yīng)，所述反應(yīng)中在包含電子供體如輔酶NADPH的電子傳遞體系的存在下標(biāo)記放射性同位素的化合物(II)與本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)反應(yīng)，和檢測作為標(biāo)志的標(biāo)記的化合物(II)至標(biāo)記的化合物(III)的轉(zhuǎn)化反應(yīng)被本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)的競爭性抑制，能夠選擇可以是本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)的代謝反應(yīng)底物的化合物。當(dāng)測定來自試驗化合物的競爭性抑制的存在時，典型地將試驗化合物加至1-100倍標(biāo)記化合物(II)的摩爾濃度的量。
可以例如在包含無機(jī)酸的鹽如堿金屬磷酸鹽如磷酸鈉和磷酸鉀；或有機(jī)酸的鹽如堿金屬的乙酸鹽如乙酸鈉和乙酸鉀等的含水緩沖液中進(jìn)行化合物(I)與本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)的反應(yīng)。在代謝反應(yīng)液中式(I)化合物的濃度典型地為至多約30％(w/v)和優(yōu)選約0.001％(w/v)至20％(w/v)。包含電子供體如NADPH的電子傳遞體系或者本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)的量可以例如根據(jù)反應(yīng)時間而變化。反應(yīng)溫度選自典型地約10℃-70℃的范圍，優(yōu)選約20℃-50℃。反應(yīng)液的pH選自典型地約4-12的范圍，優(yōu)選約5-10。反應(yīng)時間可以根據(jù)需要變化，典型地約1小時至10天。
另外，可以在包含本發(fā)明DNA(A)的細(xì)胞中進(jìn)行化合物(I)與本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)的反應(yīng)。作為包含本發(fā)明DNA(A)的細(xì)胞，例如提及具有表達(dá)本發(fā)明DNA(A)和生產(chǎn)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)的微生物，如從自然界中分離的包含本發(fā)明DNA(A)的那些微生物的菌株，通過用化學(xué)品或紫外線處理衍生于該微生物菌株的突變株，其中將本發(fā)明DNA(A)或包含本發(fā)明DNA(A)的載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化的微生物細(xì)胞。另外，提及導(dǎo)入本發(fā)明DNA(A)的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞或?qū)氡景l(fā)明DNA(A)的轉(zhuǎn)化植物的細(xì)胞。在該情形中，可以將式(I)化合物直接加到包含本發(fā)明DNA(A)的細(xì)胞或可以加至細(xì)胞培養(yǎng)基或與細(xì)胞接觸的土壤中以便進(jìn)入細(xì)胞。包含電子供體如NADPH的電子傳遞體系可以是原來存在于細(xì)胞中的系統(tǒng)和可以從細(xì)胞外部加入。
例如通過檢測由化合物(I)代謝產(chǎn)生的化合物可以證實由本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)導(dǎo)致的化合物(I)的代謝。具體地例如，如上所述可以用HPLC分析或TLC分析檢測由代謝化合物(II)產(chǎn)生的化合物(III)。
另外，基于在化合物(I)與本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)反應(yīng)后反應(yīng)溶液中的除草活性相比較低于化合物(I)未與本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)反應(yīng)的情形，可以證實由本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)導(dǎo)致的化合物(I)的代謝。作為檢驗除草活性的方法，例如提及其中將上述反應(yīng)溶液施用于雜草如稗(Echinochloacrus-galli)，大穗看麥娘(Alopercurus myosuroides)，Ivyleaf morningglory(Ipomoea hederacea)和苘麻(Abutilon theophrasti)和檢查除草效果的方法；或其中將雜草在施用上述反應(yīng)溶液的土壤樣品上栽培和檢查除草效果的方法；等。另外，提及其中可以將上述反應(yīng)溶液點在從植物采取的葉盤上和檢查由反應(yīng)溶液導(dǎo)致的植物損傷(變白)的存在的方法。
另外，通過檢測作為標(biāo)記的、在化合物(I)與本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)反應(yīng)后的反應(yīng)溶液中的PPO抑制活性相比較低于其中化合物(I)未與本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)反應(yīng)的反應(yīng)溶液中的活性，可以證實本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)導(dǎo)致的化合物(I)的代謝。PPO是催化原卟啉原IX向原卟啉IX(以下稱為“PPIX”)轉(zhuǎn)化的酶。例如，在將上述反應(yīng)溶液加入PPO反應(yīng)系統(tǒng)中以后，加入PPO的底物一原卟啉原IX并在黑暗中在30℃下溫育約1-2小時。隨后，使用HPLC等測量在各個溫育的溶液中PPIX的量。當(dāng)在加入化合物(I)與本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)反應(yīng)后的反應(yīng)溶液的系統(tǒng)中PPIX的量超過在加入化合物(I)未與本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)反應(yīng)后的反應(yīng)溶液的系統(tǒng)中的PPIX量時，確定化合物(I)已經(jīng)由本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)代謝。作為PPO，可以使用從植物等中純化的蛋白質(zhì)或來自植物的葉綠體級分。當(dāng)使用葉綠體級分時，可以將氨基乙酰丙酸而不是原卟啉原IX用于PPO反應(yīng)系統(tǒng)中。氨基乙酰丙酸是葉綠素-血紅素生物合成途徑中原卟啉原IX的前體。在下面實施例42中給出一個更具體的實例。
通過如此與本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)反應(yīng)，可以進(jìn)行式(I)PPO抑制型除草化合物的處理，其導(dǎo)致化合物代謝和轉(zhuǎn)化成低除草活性的化合物。通過在植物栽培區(qū)域上噴灑所述化合物的處理可以減輕來自所述化合物的植物損傷，具體地例如，噴灑在植物栽培區(qū)域上和保留在植物殘體或土壤等之中的化合物與本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)反應(yīng)。
作為可以用來使化合物(I)與本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)反應(yīng)的“包含電子供體的電子傳遞體系”，例如可以提及包含NADPH，鐵氧還蛋白和鐵氧還蛋白-NADP+還原酶的系統(tǒng)。
作為在系統(tǒng)中提供“包含電子供體的電子傳遞體系”使化合物(I)與本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)反應(yīng)的方法，例如提及將來源于植物如菠菜的NADPH，鐵氧還蛋白和來源于植物如菠菜的鐵氧還蛋白-NADP+還原酶加入上述反應(yīng)系統(tǒng)的方法。另外，可以將可以從微生物如大腸桿菌中制備、包含對于本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)反應(yīng)體系中的電子傳遞體系有作用的成分的級分加到所述反應(yīng)體系中。為了制備該級分，例如在通過離心等從微生物的培養(yǎng)物中收獲細(xì)胞以后，通過超聲處理，DYNOMILL處理，F(xiàn)RENCH PRESS處理等物理破裂或通過使用表面活性劑或細(xì)胞裂解酶如溶菌酶化學(xué)破裂細(xì)胞。從如此獲得的產(chǎn)生的裂解物中，通過離心，膜過濾等去除不溶物以制備無細(xì)胞提取物?？梢詫o細(xì)胞提取物作為包含對于本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)的反應(yīng)體系中電子傳遞體系有作用的成分的級分用于交換上述鐵氧還蛋白。另外，當(dāng)可以將電子從電子供體傳遞到本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)的系統(tǒng)存在于該細(xì)胞中時，如同其中本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)與化合物(I)的反應(yīng)是在細(xì)胞如微生物或植物細(xì)胞中進(jìn)行的情形，可以不重新加入電子傳遞體系。
作為鐵氧還蛋白，例如可以使用來源于微生物的鐵氧還蛋白(下文有時共同稱為“本發(fā)明蛋白質(zhì)(B)”)，所述微生物屬于鏈霉菌屬，如暗產(chǎn)色鏈霉菌，磚紅色鏈霉菌，不產(chǎn)色鏈霉菌，淺灰鏈霉菌，熱淡天藍(lán)鏈霉菌，黑胡桃鏈霉菌，津島鏈霉菌，球團(tuán)產(chǎn)色鏈霉菌，橄欖產(chǎn)色鏈霉菌，裝飾鏈霉菌，灰色鏈霉菌，羊毛鏈霉菌，三澤鏈霉菌，蒼白色鏈霉菌，玫瑰變紅鏈霉菌，魯?shù)劓溍咕退贡ゆ溍咕?，更具體地，暗產(chǎn)色鏈霉菌IFO 12898，磚紅色鏈霉菌ATCC 21469，不產(chǎn)色鏈霉菌IFO 12735，淺灰鏈霉菌ATCC11796，熱淡天藍(lán)鏈霉菌IFO 14273t，黑胡桃鏈霉菌IFO 13445，津島鏈霉菌IFO 13782，球團(tuán)產(chǎn)色鏈霉菌IFO 13673t，橄欖產(chǎn)色鏈霉菌IFO 12444，裝飾鏈霉菌IFO 13069t，灰色鏈霉菌ATCC 10137，灰色鏈霉菌IFO 13849T，羊毛鏈霉菌IFO 12787T，三澤鏈霉菌IFO 13855T，蒼白色鏈霉菌IFO13434T，玫瑰變紅鏈霉菌IFO 13682T，魯?shù)劓溍咕鶬FO 15875T和斯堡鏈霉菌IFO 13446T，等；或?qū)儆谔嵌噫呔鷮俚奈⑸?，如塔氏糖多孢菌，更具體地，塔氏糖多孢菌JCM 9383t等。具體地例如，可以提及選自以下組合的鐵氧還蛋白(下文有時稱為“本發(fā)明蛋白質(zhì)(B)”)。
<蛋白質(zhì)組合>
(B1)包含SEQ ID NO12所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)(下文有時稱為“本發(fā)明蛋白質(zhì)(B1)”)；(B2)包含SEQ ID NO13所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)(下文有時稱為“本發(fā)明蛋白質(zhì)(B2)”)；(B3)包含SEQ ID NO14所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)(下文有時稱為“本發(fā)明蛋白質(zhì)(B3)”)；(B4)包含SEQ ID NO111所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)(下文有時稱為“本發(fā)明蛋白質(zhì)(B4)”)；(B5)包含與SEQ ID NO12，SEQ ID NO13，SEQ ID NO14或SEQID NO111中任何一個所示氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的鐵氧還蛋白；(B6)包含與編碼SEQ ID NO12，SEQ ID NO13，SEQ ID NO14或SEQ ID NO111中任何一個所示氨基酸序列的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列的鐵氧還蛋白；(B7)包含SEQ ID NO149所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)(下文有時稱為“本發(fā)明蛋白質(zhì)(B7)”)；(B8)包含SEQ ID NO150所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)(下文有時稱為“本發(fā)明蛋白質(zhì)(B8)”)；(B9)包含SEQ ID NO151所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)(下文有時稱為“本發(fā)明蛋白質(zhì)(B9)”)；(B10)包含SEQ ID NO152所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)(下文有時稱為“本發(fā)明蛋白質(zhì)(B10)”)；(B11)包含SEQ ID NO153所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)(下文有時稱為“本發(fā)明蛋白質(zhì)(B11)”)；(B12)一種鐵氧還蛋白，其包含與在SEQ ID NO149，SEQ IDNO151，SEQ ID NO152，SEQ ID NO153，SEQ ID NO245，SEQ IDNO247，SEQ ID NO248，SEQ ID NO249，SEQ ID NO250，SEQ IDNO251，或SEQ ID NO253中任何一個表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或與在SEQ ID NO150，SEQ ID NO252或SEQID NO254中表示的氨基酸序列的任一個具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；(B13)一種鐵氧還蛋白，其包含與編碼SEQ ID NO149，SEQ IDNO150，SEQ ID NO151，SEQ ID NO152，SEQ ID NO153，SEQ IDNO245，SEQ ID NO247，SEQ ID NO248，SEQ ID NO249，SEQ IDNO250，SEQ ID NO251，SEQ ID NO252，SEQ ID NO253或SEQ IDNO254所示氨基酸序列的任何一個核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列編碼的氨基酸序列；(B14)包含SEQ ID NO245所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B15)包含SEQ ID NO247所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B16)包含SEQ ID NO248所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B17)包含SEQ ID NO249所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B18)包含SEQ ID NO250所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B19)包含SEQ ID NO251所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B20)包含SEQ ID NO252所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B21)包含SEQ ID NO253所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；和(B24)包含SEQ ID NO254所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
按照在Molecular CloningA Laboratory Manual第二版(1989)，ColdSpring Harbor Laboratory Press；Current Protocols in Molecular Biology(1987)，John Wiley & Sons公司等中描述的常規(guī)遺傳工程方法，基于編碼在SEQ ID NO12，13，14，111，149，150，151，152，153，245，247，248，249，250，251，252，253或254中表示的本發(fā)明蛋白質(zhì)(B)的氨基酸序列的核苷酸序列可以獲得編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)(B)的DNA(下文有時稱為“本發(fā)明DNA(B)”)。
作為編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)(B)的DNA(下文有時共同稱為“本發(fā)明DNA(B)”)，提及編碼包含SEQ ID NO12所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA(下文有時稱為“本發(fā)明DNA(B1)”)；編碼包含SEQ ID NO13所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA(下文有時稱為“本發(fā)明DNA(B2)”)；編碼包含SEQ ID NO14所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA(下文有時稱為“本發(fā)明DNA(B3)”)；編碼包含SEQ ID NO111所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA(下文有時稱為“本發(fā)明DNA(B4)”)；編碼包含與SEQ ID NO12，SEQ ID NO13，SEQ ID NO14或SEQ IDNO111中任何一個所示氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的鐵氧還蛋白的DNA；編碼鐵氧還蛋白的DNA，所述鐵氧還蛋白包含與編碼SEQ ID NO12，SEQ ID NO13，SEQ ID NO14或SEQ ID NO111中任何一個所示氨基酸序列的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列；編碼包含SEQ ID NO149所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA(下文有時稱為“本發(fā)明DNA(B7)”)；編碼包含SEQ ID NO150所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA(下文有時稱為“本發(fā)明DNA(B8)”)；編碼包含SEQ ID NO151所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA(下文有時稱為“本發(fā)明DNA(B9)”)；編碼包含SEQ ID NO152所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA(下文有時稱為“本發(fā)明DNA(B10)”)；編碼包含SEQ ID NO153所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA(下文有時稱為“本發(fā)明DNA(B11)”)；編碼鐵氧還蛋白的DNA，所述鐵氧還蛋白包含與在SEQ ID NO149，SEQ ID NO151，SEQ ID NO152，SEQ ID NO153，SEQ ID NO245，SEQID NO247，SEQ ID NO248，SEQ ID NO249，SEQ ID NO250，SEQ IDNO251，或SEQ ID NO253中任何一個表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或與在SEQ ID NO150，SEQ ID NO252或SEQID NO254中任何一個表示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；編碼鐵氧還蛋白的DNA，所述鐵氧還蛋白包含與編碼SEQ IDNO149，SEQ ID NO150，SEQ ID NO151，SEQ ID NO152，SEQ IDNO153，SEQ ID NO245，SEQ ID NO247，SEQ ID NO248，SEQ IDNO249，SEQ ID NO250，SEQ ID NO251，SEQ ID NO252，SEQ ID NO253或SEQ ID NO254任一個所示氨基酸序列的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列編碼的氨基酸序列；編碼包含SEQ ID NO245所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA；編碼包含SEQ ID NO247所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA；編碼包含SEQ ID NO248所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA；編碼包含SEQ ID NO249所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA；編碼包含SEQ ID NO250所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA；編碼包含SEQ ID NO251所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA；編碼包含SEQ ID NO252所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA；編碼包含SEQ ID NO253所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA；和編碼包含SEQ ID NO254所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA。
作為本發(fā)明DNA(B)的更具體的實例，可以提及包含SEQ ID NO15，16，17，112，154，155，156，157，158，255，257，258，259，260，261，262，263或264中任何一個所示核苷酸序列的DNA或包含與SEQ IDNO15，16，17，112，154，155，156，157，158，255，257，258，259，260，261，262，263或264中任何一個所示核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列的DNA。
按照在制備本發(fā)明DNA(A)的方法中所述條件，通過實施以包含其核苷酸序列的部分核苷酸序列的DNA作為引物進(jìn)行PCR的方法或其中將該DNA用作探針的雜交方法可以制備該DNA。
具體地例如，通過使用從暗產(chǎn)色鏈霉菌IFO 12898制備的染色體DNA或染色體DNA文庫作為模板，和通過使用包含SEQ ID NO105所示核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ ID NO53所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物進(jìn)行PCR可以制備包含編碼SEQ ID NO12所示氨基酸序列的核苷酸序列的DNA，或包含SEQ ID NO15所示核苷酸序列的DNA。
另外，通過使用從塔氏糖多孢菌JCM 9383t制備的染色體DNA或染色體DNA文庫作為模板，和通過使用包含SEQ ID NO106所示核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ ID NO63所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物進(jìn)行PCR可以制備包含編碼SEQ ID NO13所示氨基酸序列的核苷酸序列的DNA，或包含SEQ ID NO16所示核苷酸序列的DNA。
另外，通過使用從磚紅色鏈霉菌ATCC 21469制備的染色體DNA或染色體DNA文庫作為模板，和通過使用包含SEQ ID NO107所示核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ ID NO72所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物進(jìn)行PCR可以制備包含編碼SEQ ID NO14所示氨基酸序列的核苷酸序列的DNA，或包含SEQ ID NO17所示核苷酸序列的DNA。
另外，通過以由包含編碼SEQ ID NO12，13，14，111，149，150，151，152或153中任何一個所示氨基酸序列的核苷酸序列的約至少20個核苷酸組成的DNA作為探針，在上述條件下與染色體DNA文庫雜交，接著檢測和回收與所述探針特異性結(jié)合的DNA可以獲得本發(fā)明DNA(B)。如上所述可以從微生物中制備染色體DNA文庫，所述微生物屬于鏈霉菌屬，如暗產(chǎn)色鏈霉菌，磚紅色鏈霉菌，不產(chǎn)色鏈霉菌，熱淡天藍(lán)鏈霉菌，黑胡桃鏈霉菌，津島鏈霉菌，球團(tuán)產(chǎn)色鏈霉菌，橄欖產(chǎn)色鏈霉菌，裝飾鏈霉菌，灰色鏈霉菌，羊毛鏈霉菌，三澤鏈霉菌，蒼白色鏈霉菌，玫瑰變紅鏈霉菌，魯?shù)劓溍咕退贡ゆ溍咕?，更具體地，暗產(chǎn)色鏈霉菌IFO 12898，磚紅色鏈霉菌ATCC 21469，不產(chǎn)色鏈霉菌IFO 12735，熱淡天藍(lán)鏈霉菌IFO14273t，黑胡桃鏈霉菌IFO 13445，津島鏈霉菌IFO 13782，球團(tuán)產(chǎn)色鏈霉菌IFO 13673t，橄欖產(chǎn)色鏈霉菌IFO 12444，裝飾鏈霉菌IFO 13069t，灰色鏈霉菌ATCC 10137，灰色鏈霉菌IFO 13849T，羊毛鏈霉菌IFO 12787T，三澤鏈霉菌IFO 13855T，蒼白色鏈霉菌IFO 13434T，玫瑰變紅鏈霉菌IFO13682T，魯?shù)劓溍咕鶬FO 15875T和斯堡鏈霉菌IFO 13446T，等；或?qū)儆谔嵌噫呔鷮俚奈⑸?，如塔氏糖多孢菌，更具體地，塔氏糖多孢菌JCM9383t等。作為可以用作該探針的DNA的具體實例，提及包含SEQ ID NO15，16，17，112，154，155，156，157，158，255，257，258，259，260，261，262，263或264中任何一個所示核苷酸序列的DNA；包含這些核苷酸序列的部分核苷酸序列的DNA；或包含與所述部分核苷酸序列互補的核苷酸序列的DNA。
為了用宿主細(xì)胞表達(dá)本發(fā)明DNA(B)，例如按照在“Molecular CloningA Laboratory Manual第二版(1989)”，Cold Spring Harbor Laboratory Press；“Current Protocols in Molecular Biology(1987)”，John Wiley & Sons，公司等中所描述的常規(guī)遺傳工程方法，制備其中本發(fā)明DNA(B)和在宿主細(xì)胞中起作用的啟動子可操作連接的DNA，并導(dǎo)入宿主細(xì)胞中。通過從轉(zhuǎn)化體中制備DNA和然后用制備的DNA進(jìn)行例如在“Molecular Cloning第二版”，Cold Spring Harbor Press(Molecular Biology，John Wiley & Sons.N.Y.(1989)中所述的遺傳工程分析方法(如證實限制酶位點，DNA測序，DNA雜交，PCR等)，可以證實獲得的轉(zhuǎn)化體是否包含本發(fā)明DNA(B)。
通過將其中本發(fā)明DNA(B)和在宿主細(xì)胞中起作用的啟動子可操作連接的DNA導(dǎo)入包含本發(fā)明DNA(A)的細(xì)胞，可以在相同的細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明DNA(B)和本發(fā)明DNA(A)。
例如通過培養(yǎng)包含本發(fā)明DNA(B)的細(xì)胞可以制備本發(fā)明蛋白質(zhì)(B)。作為這種細(xì)胞，提及表達(dá)本發(fā)明DNA(B)和具有產(chǎn)生本發(fā)明蛋白質(zhì)(B)的能力的微生物，如從自然界分離的包含本發(fā)明DNA(B)的微生物菌株，通過用試劑或紫外線等處理由所述天然菌株衍生的突變株。例如，提及屬于鏈霉菌的微生物，如暗產(chǎn)色鏈霉菌，磚紅色鏈霉菌，不產(chǎn)色鏈霉菌，淺灰鏈霉菌，熱淡天藍(lán)鏈霉菌，黑胡桃鏈霉菌，津島鏈霉菌，球團(tuán)產(chǎn)色鏈霉菌，橄欖產(chǎn)色鏈霉菌，裝飾鏈霉菌，灰色鏈霉菌，羊毛鏈霉菌，三澤鏈霉菌，蒼白色鏈霉菌，玫瑰變紅鏈霉菌，魯?shù)劓溍咕退贡ゆ溍咕唧w地，暗產(chǎn)色鏈霉菌IFO 12898，磚紅色鏈霉菌ATCC 21469，不產(chǎn)色鏈霉菌IFO 12735，淺灰鏈霉菌ATCC 11796，熱淡天藍(lán)鏈霉菌IFO 14273t，黑胡桃鏈霉菌IFO 13445，津島鏈霉菌IFO 13782，球團(tuán)產(chǎn)色鏈霉菌IFO13673t，橄欖產(chǎn)色鏈霉菌IFO 12444，裝飾鏈霉菌IFO 13069t，灰色鏈霉菌ATCC 10137，灰色鏈霉菌IFO 13849T，羊毛鏈霉菌IFO 12787T，三澤鏈霉菌IFO 13855T，蒼白色鏈霉菌IFO 13434T，玫瑰變紅鏈霉菌IFO 13682T，魯?shù)劓溍咕鶬FO 15875T和斯堡鏈霉菌IFO 13446T，等；或?qū)儆谔嵌噫呔鷮?，如塔氏糖多孢菌，更具體地，塔氏糖多孢菌JCM 9383t等。另外，可以提及其中已經(jīng)導(dǎo)入本發(fā)明DNA(B)的轉(zhuǎn)化體。具體地例如，提及其中已將與tac啟動子，trc啟動子，lac啟動子或T7噬菌體啟動子可操作連接的本發(fā)明DNA(B)導(dǎo)入大腸桿菌的轉(zhuǎn)化體。作為更多的具體實例，提及在下述實施例中描述的大腸桿菌JM109/pKSN657FD，大腸桿菌JM109/pKSN923FD，大腸桿菌JM109/pKSN671FD等。
按照通常用于培養(yǎng)微生物的方法可以培養(yǎng)包含本發(fā)明DNA(B)的微生物，更具體地，按照在培養(yǎng)包含本發(fā)明DNA(A)的微生物的方法中的上述條件進(jìn)行。
例如，通過包含本發(fā)明DNA(B)的微生物生產(chǎn)的本發(fā)明蛋白質(zhì)(B)可以各種形式在本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)的反應(yīng)體系中使用，如生產(chǎn)本發(fā)明蛋白質(zhì)(B)的微生物的培養(yǎng)物，生產(chǎn)本發(fā)明蛋白質(zhì)(B)的微生物細(xì)胞，通過處理該細(xì)胞得到的材料，微生物的無細(xì)胞提取物，未完全純化的蛋白質(zhì)，純化的蛋白質(zhì)等。上述通過處理細(xì)胞獲得的材料包括例如凍干細(xì)胞，丙酮干燥細(xì)胞，磨碎的細(xì)胞，細(xì)胞的自溶物，超聲處理的細(xì)胞，堿處理的細(xì)胞，有機(jī)溶劑處理的細(xì)胞等。備選地，可以按照已知方法如使用吸附在合成聚合物等之上的載體結(jié)合法，和使用包含于聚合物網(wǎng)狀基質(zhì)中的包含法可以固定上述各種形式中任何一種的本發(fā)明蛋白質(zhì)(B)，然后用于本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)的反應(yīng)體系。
作為從包含本發(fā)明DNA(B)的微生物的培養(yǎng)物中純化本發(fā)明蛋白質(zhì)(B)的方法，可以使用常規(guī)用于純化蛋白質(zhì)的方法。例如可以提及下列方法。
首先，通過離心等從微生物的培養(yǎng)物中收獲細(xì)胞，然后通過超聲處理等物理破裂，或通過使用表面活性劑或細(xì)胞裂解酶如溶菌酶化學(xué)破裂細(xì)胞。從如此獲得的產(chǎn)生的裂解液中，通過離心，膜過濾等去除不溶物以制備無細(xì)胞提取物，其然后通過任何適當(dāng)?shù)姆蛛x和純化方法，如陽離子交換層析，陰離子交換層析，疏水層析，凝膠過濾層析等分級，由此純化本發(fā)明蛋白質(zhì)(B)。通過用SDS-PAGE分離如此獲得的級分，可以進(jìn)一步純化本發(fā)明蛋白質(zhì)(B)。
可以證實本發(fā)明蛋白質(zhì)(B)作為鐵氧還蛋白的功能是在化合物(I)與本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)反應(yīng)的反應(yīng)體系中作為從鐵氧還蛋白-NADP+還原酶到本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)的電子轉(zhuǎn)運蛋白的功能。具體地例如，通過加入本發(fā)明蛋白質(zhì)(B)和NADPH，鐵氧還蛋白-NADP+還原酶和本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)于化合物(I)與本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)反應(yīng)的反應(yīng)體系中，接著檢測化合物(II)向化合物(III)的轉(zhuǎn)化可以證實。
在本發(fā)明控制雜草的方法中，將化合物(I)施用于表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)的植物的栽培區(qū)域。該植物可以表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)的一個變體或可以表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)的多個變體。作為本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)，例如，可以提及本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)。作為已經(jīng)導(dǎo)入本發(fā)明DNA(A)的轉(zhuǎn)基因植物可以獲得表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)的植物。該導(dǎo)入包括以上述方式將本發(fā)明DNA(A)導(dǎo)入植物細(xì)胞以使DNA處于能使它表達(dá)的位置，接著從獲得的轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生植物。導(dǎo)入植物細(xì)胞的本發(fā)明DNA(A)可以在其上游連接編碼向胞內(nèi)細(xì)胞器的轉(zhuǎn)運信號的核苷酸序列，以使可讀框在框內(nèi)。
其中已經(jīng)導(dǎo)入本發(fā)明DNA(A)和表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)的植物在它的細(xì)胞內(nèi)將化合物(I)代謝成低除草活性的化合物。結(jié)果，降低植物中來自除草化合物的植物損傷和賦予對所述化合物的抗性。因此，其中已經(jīng)導(dǎo)入本發(fā)明DNA(A)和表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)的植物即使在將化合物(I)施用于其栽培區(qū)域的情形中也可以生長良好。通過栽培所述植物和施用上述除草組合物于栽培區(qū)域可以有效去除除了其中已經(jīng)導(dǎo)入本發(fā)明DNA(A)和表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)的植物以外的雜草。可以改善上述植物的產(chǎn)率，改善品質(zhì)，減小所用除草劑的量和節(jié)省勞動。
通過將表達(dá)編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)的基因的細(xì)胞與所述化合物或所述除草組合物接觸和評估對細(xì)胞的損傷程度，可以進(jìn)行表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)的細(xì)胞對式(I)化合物或包含所述化合物的除草組合物的抗性評估。
具體地，為了評估表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)的微生物細(xì)胞對化合物(I)或包含化合物(I)的除草組合物的抗性，可以制備表達(dá)植物PPO和本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)的轉(zhuǎn)化的大腸桿菌。該制備包括另外將本發(fā)明DNA(A)導(dǎo)入例如可以用來評估PPO活性抑制和已經(jīng)在日本專利申請11-102534中描述的轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，更具體地其中將美國專利號5939602等所述的植物PPO基因有效地導(dǎo)入大腸桿菌BT3菌株和表達(dá)PPO基因的轉(zhuǎn)化的大腸桿菌。如F.Yamamoto，H.Inokuti，H.Ozaki，(1988)Japanese Journal ofGenetics，63卷，第237-249頁所述，大腸桿菌BT3菌株在PPO基因中有缺陷和沒有增殖能力。通過在包含0-1.0ppm的化合物(I)或含所述化合物的除草組合物的液體培養(yǎng)基中在37℃下振蕩培養(yǎng)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化大腸桿菌約18-24小時和用600nm的光密度測量所述轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的增殖可以評估對化合物或除草組合物的抗性。作為本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)，例如可以提及本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)。
作為評估表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)的植物對式(I)化合物或包含所述化合物的除草組合物的抗性程度的方法，提及將除草組合物施用于植物和測量植物生長程度的方法。為了更定量的證實，例如首先將植物的幾片葉子浸到包含各種濃度的化合物(I)的水溶液中，或者將化合物(I)的水溶液噴灑在植物的數(shù)片葉子上，接著在室溫下在光線中放置于瓊脂培養(yǎng)基上。在數(shù)天后，按照Mackenney，G.，J.Biol.Chem.，140；第315頁(1941)所述方法從植物葉子中提取葉綠素以測定葉綠素的含量。具體地例如，采取植物的葉子并沿著主葉脈等分成2片。將除草組合物散布在葉片之一的整個表面上。另一葉片留下未處理。將這些葉片放在包含0.8％瓊脂的MS培養(yǎng)基上并在室溫在光線中放置7天。然后，用杵和研缽在5ml 80％丙酮水溶液中研磨每個葉片以提取葉綠素。用80％丙酮水溶液稀釋提取液10倍和按照Mackenney，G.，J.Biol.Chem.，140；第315頁(1941)所述方法在750nm，663nm和645nm下測量吸光度以計算總?cè)~綠素含量。通過顯示處理的葉片的總?cè)~綠素含量與未處理葉片的總?cè)~綠素含量的百分點可以比較評估對化合物(I)的抗性的程度。作為本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)，例如，可以提及本發(fā)明蛋白質(zhì)(A)。
基于評估對化合物(I)或包含化合物(I)的除草組合物的抗性程度的上述方法，可以選擇顯示對化合物(I)或包含化合物(I)的除草組合物的抗性的植物或植物細(xì)胞。例如，選擇從將化合物(I)或包含該化合物的除草組合物噴灑到植物栽培區(qū)域中未看到損傷的植物，或通過在化合物(I)的存在下培養(yǎng)仍連續(xù)生長的植物細(xì)胞。具體地例如，將土壤裝填到具有例如10cm直徑和10cm深度的塑料盆中。播種植物的種子并在溫室中培養(yǎng)。通過混合5份包含化合物(I)的除草組合物，6份蘇乳播(sorpol)3005X(Toho化學(xué)品)和89份二甲苯制備乳劑。用包含0.1％(v/v)粘著劑的水以1公頃1000L的比例稀釋特定量的乳劑并用噴槍均勻地散布在來自上面在上述盆中培養(yǎng)的植物的葉子的所有面上。在溫室中培養(yǎng)植物16天后，研究對植物的損傷?？梢赃x擇其中未觀察到損傷的植物或其中損傷減輕的植物。進(jìn)一步，通過交配這些選擇的植物可以獲得后代植物。
實施例使用以下實施例更詳細(xì)地解釋本發(fā)明，但本發(fā)明不限于這些實施例。
在以下所示條件下進(jìn)行實施例1，41和42中含量分析的HPLC和化合物的分級純化。
(HPLC分析條件1)柱SUMIPAX ODS211(Sumika Chemical Analysis Service)柱溫35℃流速1ml/分鐘檢測波長UV 254nm洗脫劑A0.01％ TFA水溶液洗脫劑B乙腈洗脫條件將樣品注射到用90％洗脫劑A和10％洗脫劑B的溶劑混合物平衡的柱中。然后流動90％洗脫劑A和10％洗脫劑B的溶劑混合物5分鐘。這接著流動洗脫劑A和洗脫劑B的溶劑混合物20分鐘，同時將洗脫劑B的比例從10％增加到90％。然后流動10％洗脫劑A和90％洗脫劑B的溶劑混合物8分鐘。
實施例1通過微生物的化合物(II)的代謝(1)化合物(II)的代謝在ISP2瓊脂培養(yǎng)基(1.0％(w/v)麥芽汁，0.4％(w/v)酵母提取物，0.4％(w/v)葡萄糖，2.0％(w/v)瓊脂，pH7.3)中培養(yǎng)表1和2所示的各種微生物。將菌環(huán)量的每種微生物加入TGY培養(yǎng)基(0.5％(w/v)胰蛋白胨，0.5％(w/v)酵母提取物，0.1％(w/v)葡萄糖，0.01％(w/v)KH2PO4，pH7.0)并在30℃下振蕩溫育2-4天。將十分之一毫升(0.1ml)獲得的培養(yǎng)物在包含100ppm化合物(II)的3ml孢子形成肉湯(0.1％(w/v)肉膏，0.2％(w/v)胰蛋白月示1％葡萄糖，pH7.1)中在30℃下振蕩溫育7-8天。將五十微升(50μl)2N HCl加入產(chǎn)生的培養(yǎng)物中并用3ml乙酸乙酯提取它。在HPLC上分析獲得的乙酸乙酯層。減小化合物(II)的濃度(23.9分鐘的柱保留時間)，在21.6分鐘和22.2分鐘的保留時間檢測到化合物的新峰(各自稱為代謝物(I)和代謝物(II))。結(jié)果在表1和2中顯示。
表1

表2


(2)代謝物(I)和代謝物(II)的結(jié)構(gòu)測定將灰色鏈霉菌ATCC 11429的冷凍原種加入3ml微生物培養(yǎng)基(0.7％(w/v)聚胨，0.5％(w/v)酵母提取物，1.0％(w/v)葡萄糖，0.5％(w/v)K2HPO4，pH7.2)并在試管中振蕩溫育過夜以獲得預(yù)培養(yǎng)物。將該預(yù)培養(yǎng)物加入包含100ppm濃度的化合物(II)的300ml微生物培養(yǎng)基中。將這以每管3ml分到100個小試管中，并在30℃下振蕩溫育6天。在通過加入HCl將250ml的該培養(yǎng)物調(diào)節(jié)至pH2以后，用250ml乙酸乙酯萃取它。從乙酸乙酯層中去除溶劑。將殘余物溶解于3ml丙酮中并點至TLC硅膠板上(TLC硅膠板60F254，20cm×20cm，0.25mm厚，Merck公司)。用甲苯，甲酸和甲酸乙酯的5∶7∶1(v/v/v)混合物展開TLC板。取Rf值為0.58左右的硅膠。用丙酮萃取TLC板的該內(nèi)容物。從萃取層中去除丙酮。將殘余物溶解于10ml乙腈中和用HPLC分級分離。回收僅包含代謝物(I)和代謝物(II)的級分以獲得3.7mg代謝物(下文稱為“代謝物A”)。
進(jìn)行代謝物A的質(zhì)譜分析。代謝物A具有比化合物(II)小14的質(zhì)量。另外，從H-NMR分析，確定代謝物(A)是具有式(III)所示結(jié)構(gòu)的化合物。
(3)化合物(III)的除草活性測試將土壤裝填到具有10cm直徑和10cm深度的圓塑料盆中。在溫室中播種和培養(yǎng)稗，大穗看麥娘，Ivyleaf morningglory10天。將五(5)份測試化合物，6份蘇乳播3005X(Toho化學(xué)品公司)和89份二甲苯充分混合以產(chǎn)生乳劑。用包含0.1％(v/v)粘著劑的水以1公頃1000L的比例稀釋特定量的乳劑并用噴槍均勻地散布在來自上面在上述盆中培養(yǎng)的植物的葉子的所有面上。在溫室中培養(yǎng)植物16天后，研究測試化合物的除草活性。結(jié)果在表3中表示。
表3

將土壤裝填到具有10cm直徑和10cm深度的圓塑料盆中。播種稗，大穗看麥娘，Ivyleaf morningglory。將五(5)份測試化合物，6份蘇乳播3005X(Toho化學(xué)品公司)和89份二甲苯充分混合以產(chǎn)生乳劑。用包含0.1％(v/v)粘著劑的水以1公頃1000L的比例稀釋特定量的乳劑并用噴槍均勻地散布在土壤的表面上。在溫室中培養(yǎng)植物19天后，研究除草活性。結(jié)果在表4中表示。
表4

在上面表3和4中，將除草活性的強度逐步表示為0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，和10。數(shù)字“0”表示其中用于測試的植物檢查時萌芽或生長與未處理施用比較并顯示完全或基本上沒有差異的情形。數(shù)字“10”表示其中植物完全枯萎或者萌芽或生長完全被抑制的情形。
實施例2本發(fā)明蛋白質(zhì)(A1)的制備(1)細(xì)胞粗提物的制備將暗產(chǎn)色鏈霉菌IFO 12898的冷凍原種加入500ml三角燒瓶中的100ml A培養(yǎng)基(0.1％(w/v)葡萄糖，0.5％(w/v)胰蛋白胨，0.5％(w/v)酵母提取物，0.1％(w/v)磷酸氫二鉀，pH7.0)并在30℃下旋轉(zhuǎn)振蕩溫育1天以獲得預(yù)培養(yǎng)物。將八毫升(8ml)預(yù)培養(yǎng)物加入200ml A培養(yǎng)基中并在30℃下在500ml帶擋板的搖瓶中旋轉(zhuǎn)振蕩溫育2天。通過將產(chǎn)生的培養(yǎng)物離心(3,000g，5分鐘)回收細(xì)胞沉淀。將這些細(xì)胞沉淀懸浮在包含100ppm化合物(II)的100ml B培養(yǎng)基(1％(w/v)葡萄糖，0.1％牛肉膏，0.2％(w/v)胰蛋白月示)中并在30℃下在500ml坂口燒瓶中往復(fù)振蕩溫育16小時。通過將10L產(chǎn)生的培養(yǎng)物離心(3,000g，5分鐘)回收細(xì)胞沉淀。用1L 0.1M磷酸鉀緩沖液(pH7.0)洗滌產(chǎn)生的細(xì)胞沉淀2次以提供162g細(xì)胞沉淀。
以1g細(xì)胞沉淀2ml將這些細(xì)胞沉淀懸浮在0.1M磷酸鉀緩沖液(pH7.0)中，向其中加入1mM PMSF，5mM苯甲脒HCl，1mM EDTA和1mM二硫垂陶耳(dithiotritol)。通過用弗氏壓碎器(1000kg/cm2)(OhtakeSeisakusho)反復(fù)破裂細(xì)胞2次獲得細(xì)胞裂解液。在將細(xì)胞裂解液離心(40,000xg，30分鐘)以后，回收上清液并在150,000xg下離心1小時以回收上清液(以下稱為“細(xì)胞粗提物”)。
(2)將化合物(II)轉(zhuǎn)化為化合物(III)的能力的測定制備0.1M磷酸鉀緩沖液(pH7.0)的30μl反應(yīng)液，其包含3ppm用14C標(biāo)記的化合物(II)，2.4mMβ-NADPH(以下稱為“組分A”)(OrientalYeast Company)，0.5mg/ml來源于菠菜的鐵氧還蛋白(以下稱為“組分B”)(Sigma Company)，1U/ml鐵氧還蛋白還原酶(以下稱為“組分C”)(Sigma Company)和18μl在實施例2(1)中回收的細(xì)胞粗提物。將反應(yīng)溶液保持在30℃下1小時。另外，類似地制備和保持未加入用于上述反應(yīng)溶液組合物中的、選自組分A，組分B和組分C的至少一種組分的反應(yīng)溶液。將三微升(3μl)2N HCl和90μl乙酸乙酯加入和混合到保持以后的每種反應(yīng)溶液中。在8,000xg下將產(chǎn)生的反應(yīng)溶液離心以回收75μl乙酸乙酯層。在減壓下干燥乙酸乙酯層以后，將殘余物溶解在6.0μl乙酸乙酯中。將其五微升(5.0μl)點到TLC板(TLC硅膠板60F25420cm×20cm，0.25mm厚，Merck公司)上。用氯仿，乙酸和乙酸乙酯的6∶1∶2的混合物展開TLC板約1小時。然后讓溶劑蒸發(fā)。將TLC板暴露于成像板(Fuji FilmCompany)過夜。接著，在Image Analyzer BAS2000(Fuji Film Company)上分析成像板。檢查對應(yīng)于用14C標(biāo)記的化合物(III)的斑點的存在(Rf值0.24和0.29)。結(jié)果在表5中顯示。
表5

(3)細(xì)胞粗提物的分級分離將硫酸銨加入在實施例2(1)中獲得的細(xì)胞粗提物至45％飽和的量。在冰冷卻的條件下攪拌后，通過在12,000xg下離心10分鐘回收上清液。在將硫酸銨加入到獲得的上清液至55％飽和的量和在冰冷卻的條件下攪拌以后，通過在12,000xg下離心10分鐘回收沉淀。用27.5ml的20mM雙三丙烷緩沖液(pH7.0)溶解沉淀。將該溶液進(jìn)行PD10柱(AmershamPharmacia Company)和用20mM雙三丙烷緩沖液(pH7.0)洗脫以回收38.5ml包含蛋白質(zhì)的級分(以下稱為“45-55％硫酸銨級分”)。
(4)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A1)的分離將在實施例2(3)中制備的45-55％硫酸銨級分注射到HiLoad 26/10 QSepharose HP柱(Amersham Pharmacia Company)中。接下來，在106ml的20mM雙三丙烷緩沖液(pH7.0)流進(jìn)柱子以后，以NaCl線性梯度(NaCl的梯度是0.001415M/分鐘，NaCl濃度的范圍是0M-0.375M，流速為3ml/分鐘)流動20mM雙三丙烷緩沖液以分級回收在0.21M-0.22M的NaCl濃度下洗脫的25ml級分。進(jìn)一步，將回收的級分進(jìn)行PD10柱(AmershamPharmacia Biotech Company)和用20mM雙三丙烷緩沖液(pH7.0)洗脫以回收包含蛋白質(zhì)的級分。
將回收的級分進(jìn)行PD10柱(Amersham Pharmacia Biotech Company)，用緩沖液A(包含1.5mM NaCl的2mM磷酸鉀緩沖液，pH7.0)洗脫，以便回收包含蛋白質(zhì)的級分。接下來，將級分注射于Bio-Scale Ceramic羥磷灰石I型柱子CHT10-I(BioRad Company)中。將三十毫升(30ml)緩沖液A流進(jìn)柱子。隨后，緩沖液A和線性梯度的緩沖液B(包含0.03mMNaCl的100mM磷酸鉀緩沖液；線性梯度從100％緩沖液A開始在100分鐘期間增加至50％緩沖液B，流速為2ml/分鐘)一起流動以分級回收在17％-20％的緩沖液B的濃度下洗脫的級分。進(jìn)一步，將回收的級分進(jìn)行PD10柱(Amersham Pharmacia Biotech Company)并用0.05M磷酸鉀緩沖液(pH7.0)洗脫以回收包含蛋白質(zhì)的級分。
使用超濾膜(Microcon YM-30，Millipore Company)將回收的級分濃縮20倍并注射到HiLoad 16/60 Superdex 75pg柱(Amersham PharmaciaBiotech Company)中。包含0.15M NaCl(pH7.0)的五十毫摩爾(50mM)磷酸鉀緩沖液流進(jìn)(流速1ml/分鐘)柱子。以每個2ml將洗脫物分級。將在56ml-66ml的洗脫體積下洗脫的級分各自分級回收。用10％-20％SDS-PAGE分析在每個級分中包含的蛋白質(zhì)。
類似于實施例2(2)，在組分A，組分B，組分C和用14C標(biāo)記的組合物(II)的存在下，加入和保持回收的級分而不是在實施例2(2)所述反應(yīng)溶液中的細(xì)胞粗提物。將保持以后的反應(yīng)溶液TLC分析以檢查對應(yīng)于用14C標(biāo)記的化合物(III)的斑點的強度。觀察到在上述SDS-PAGE中移動至47kDa位置的蛋白質(zhì)在依次加入的級分條帶的濃度方面具有平行于對應(yīng)于化合物(III)的斑點的強度波動的波動。從SDS-PAGE凝膠中回收所述蛋白質(zhì)并用蛋白質(zhì)測序儀(Applied Biosystems Company，Procise494HT，脈沖液相方法)進(jìn)行氨基酸序列分析。結(jié)果，提供在SEQ ID NO18中表示的氨基酸序列。另外，在用胰蛋白酶消化上述蛋白質(zhì)以后，在質(zhì)譜儀(ThermoQuest Company，離子阱質(zhì)譜儀LCQ，柱LC PackingsCompany PepMap C18 75μm×150mm，溶劑A0.1％ HOAc-H2O，溶劑B0.1％ HOAc-甲醇，梯度從用95％溶劑A和5％溶劑B的混合物洗脫開始在30分鐘內(nèi)增加到100％溶劑B的濃度的線性梯度，流速0.2μl/分鐘)上分析獲得的消化物。結(jié)果，提供在SEQ ID NO19中表示的氨基酸序列。
實施例3獲得本發(fā)明DNA(A1)(1)暗產(chǎn)色鏈霉菌IFO 12898的染色體DNA的制備在50ml YEME培養(yǎng)基(0.3％(w/v)酵母提取物，0.5％(w/v)細(xì)菌用蛋白胨，0.3％(w/v)麥芽汁，1.0％(w/v)葡萄糖，34％(w/v)蔗糖和0.2％(v/v)2.5MgCl2·6H2O)中將暗產(chǎn)色鏈霉菌IFO 12898在30℃下振蕩溫育1天至3天?；厥占?xì)胞。將獲得的細(xì)胞懸浮在包含1.4％(w/v)甘氨酸和60mM EDTA的YEME培養(yǎng)基中并進(jìn)一步振蕩溫育1天。從培養(yǎng)基中回收細(xì)胞。在用蒸餾水洗滌一次以后，以每200mg細(xì)胞1ml將它重懸浮在緩沖液(100mM Tris-HCl(pH8.0)，100mM EDTA，10mM NaCl)中。加入二百微克每毫升(200μg/ml)的卵清溶菌酶。將細(xì)胞混懸液在30℃下振蕩溫育1小時。另外，加入0.5％ SDS和1mg/ml蛋白酶K。將細(xì)胞混懸液在55℃下溫育3小時。用酚，氯仿和異戊醇的混合物萃取細(xì)胞混懸液2次以回收每個水層。接下來，用氯仿和異戊醇的混合物萃取一次以回收水層。通過從水層中乙醇沉淀獲得染色體DNA。
(2)暗產(chǎn)色鏈霉菌IFO 12898的染色體DNA文庫的制備用1單位限制酶Sau3AI在37℃下消化在實施例3(1)中制備的九百四十三納克(943ng)染色體DNA60分鐘。用0.7％瓊脂糖凝膠電泳分離獲得的消化液。從凝膠中回收約2.0kbp的DNA。按照所述試劑盒附帶的說明書用Prep-A-GeneRDNA純化試劑盒(Bio-Rad公司)純化DNA以獲得10μl包含目標(biāo)DNA的溶液。將一微升(1μl)DNA溶液，98ng用限制酶BamHI消化和用去磷酸化處理的質(zhì)粒載體pUC118和11μl來自連接試劑盒第二版(Takara Shuzo Company)的溶液I混合和在16℃下溫育過夜。使用5μl連接溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。將大腸桿菌在30℃下振蕩培養(yǎng)過夜。從獲得的培養(yǎng)基中，回收大腸桿菌。提取質(zhì)粒以提供染色體DNA文厙。
(3)本發(fā)明DNA(A1)的分離通過將在實施例3(1)中制備的染色體DNA用作模板進(jìn)行PCR(圖1)。作為引物，使用具有SEQ ID NO35所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO36所示核苷酸序列的寡核苷酸的配對(以下稱為“引物對1”)。基于編碼SEQ ID NO18所示氨基酸序列的核苷酸序列設(shè)計SEQ IDNO35所示核苷酸序列。另外，基于與編碼SEQ ID NO19所示氨基酸序列的核苷酸序列互補的核苷酸序列設(shè)計SEQ ID NO36所示核苷酸序列。通過加入2種每種總計200nM的引物，250ng上述染色體DNA，0.5μldNTP混合物(4種dNTP每種10mM的混合物；Clontech公司)，5μl 5xGC基因組PCR反應(yīng)緩沖液(Clontech公司)，1.1μl 25mM Mg(OAc)2，5μl 5MGC-Melt(Clontech公司)和0.5μl Advantage-GC基因組聚合酶混合物(Clontech公司)和蒸餾水，PCR反應(yīng)溶液總計25μl。PCR的反應(yīng)條件是在保持在95℃ 1分鐘后，重復(fù)30個循環(huán)，一個循環(huán)包括保持在94℃ 15秒，接著60℃ 30秒，接著72℃ 1分鐘，然后保持在72℃ 5分鐘。在保持后，將反應(yīng)溶液進(jìn)行4％瓊脂糖凝膠電泳。回收包含約150bp的DNA的凝膠區(qū)域。通過按照附帶的說明書使用QIA快速凝膠提取試劑盒(Qiagen公司)從回收的凝膠中純化DNA。按照所述載體附帶的說明書將獲得的DNA連接到TA克隆載體pCR2.1(Invitrogen公司)并導(dǎo)入大腸桿菌TOP10F’。使用QIAprep Spin Miniprep試劑盒(Qiagen公司)從獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體中制備質(zhì)粒DNA。按照所述試劑盒附帶的說明書，使用-21M13引物(Applied Biosystems日本公司)和M13Rev引物(AppliedBiosystems日本公司)作為引物，用染料終止循環(huán)測序FS簡易反應(yīng)試劑盒(Applied Biosystems日本公司)進(jìn)行測序反應(yīng)。測序反應(yīng)使用獲得的質(zhì)粒DNA作為模板。用DNA測序儀373A(Applied Biosystems日本公司)分析反應(yīng)產(chǎn)物。結(jié)果，提供在SEQ ID NO9中表示的核苷酸序列的核苷酸36至132所示的核苷酸序列。所述核苷酸序列編碼在SEQ ID NO18所示氨基酸序列的氨基酸12至23中表示的氨基酸序列。在這點上，期望所述DNA編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)(A1)的一部分。
接下來，類似上面用Advantage-GC基因組聚合酶混合物(Clontech公司)和通過將在實施例3(2)中制備的染色體DNA用作模板進(jìn)行PCR。使用具有SEQ ID NO37所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO38所示核苷酸序列的寡核苷酸的配對(以下稱為“引物對2”)或具有SEQID NO39所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO40所示核苷酸序列的寡核苷酸的配對(以下稱為“引物對3”)作為引物。
接下來，通過PCR擴(kuò)增具有其中3’末端延伸過SEQ ID NO9所示核苷酸序列的核苷酸132所示核苷酸的核苷酸序列的DNA。通過將使用引物對2獲得的反應(yīng)溶液作為模板溶液和通過使用具有SEQ ID NO41所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO38所示核苷酸序列的寡核苷酸的配對(以下稱為“引物對4”)作為引物進(jìn)行PCR。類似地，通過PCR擴(kuò)增具有其中5’末端延伸過SEQ ID NO9所示核苷酸序列的核苷酸36所示核苷酸的核苷酸序列的DNA。通過將使用引物對3獲得的反應(yīng)溶液作為模板溶液和通過使用具有SEQ ID NO42所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO40所示核苷酸序列的寡核苷酸的配對(以下稱為“引物對5”)作為引物進(jìn)行PCR。類似于上面，將使用引物對4擴(kuò)增的2kb DNA和使用引物對5擴(kuò)增的150bp DNA克隆到TA克隆載體pCR2.1中。使用QIAprep Spin Miniprep試劑盒(Qiagen公司)從獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體中制備質(zhì)粒DNA。按照所述試劑盒附帶的說明書，使用-21M13引物(AppliedBiosystems日本公司)和M13Rev引物(Applied Biosystems日本公司)和SEQ ID NO43-50所示寡核苷酸作為引物，用染料終止循環(huán)測序FS簡易反應(yīng)試劑盒(Applied Biosystems日本公司)進(jìn)行測序反應(yīng)。測序反應(yīng)使用獲得的質(zhì)粒DNA作為模板。用DNA測序儀373A(Applied Biosystems日本公司)分析反應(yīng)產(chǎn)物。作為將通過使用引物對4擴(kuò)增的2kbp DNA的核苷酸序列測序的結(jié)果，提供在SEQ ID NO9所示核苷酸序列的核苷酸133至1439中所表示的核苷酸序列。另外，作為將通過使用引物對5擴(kuò)增的150bp DNA的核苷酸序列測序的結(jié)果，提供在SEQ ID NO9所示核苷酸序列的核苷酸1至35中所表示的核苷酸序列。作為連接獲得的核苷酸序列的結(jié)果，獲得在SEQ ID NO9中表示的核苷酸序列。在所述核苷酸序列中存在兩個可讀框(ORF)。因此，包含由1227個核苷酸(包括終止密碼子)組成和編碼408個氨基酸殘基的核苷酸序列(SEQ ID NO6)以及由201個核苷酸(包括終止密碼子)組成和編碼66個氨基酸殘基的核苷酸序列(SEQ ID NO15)。由SEQ ID NO6所示核苷酸序列編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO1)組成的蛋白質(zhì)的分子量據(jù)計算為45213Da。另外，由所述核苷酸序列編碼的氨基酸序列包含從本發(fā)明蛋白質(zhì)(A1)的N末端氨基酸測序測定的氨基酸序列(SEQ ID NO18)和用質(zhì)譜分析從胰蛋白酶消化片段的氨基酸測序測定的氨基酸序列(SEQ ID NO19)。由SEQID NO15所示核苷酸序列編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO12)組成的蛋白質(zhì)的分子量據(jù)計算為6818Da。
實施例4本發(fā)明蛋白質(zhì)(A1)在大腸桿菌中的表達(dá)(1)含有本發(fā)明蛋白質(zhì)(A1)的轉(zhuǎn)化大腸桿菌的產(chǎn)生通過將在實施例3(1)中從暗產(chǎn)色鏈霉菌IFO 12898制備的染色體DNA用作模板和通過使用Expand High Fidelity PCR System(RocheMolecular Biochemicals Company)進(jìn)行PCR。作為引物，使用具有SEQ IDNO51所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO52所示核苷酸序列的寡核苷酸的配對(以下稱為“引物對19”)或具有SEQ ID NO51所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO53所示核苷酸序列的寡核苷酸的配對(以下稱為“引物對20”)。通過加入2種每種總計300nM的引物，50ng上述染色體DNA，5.0μl dNTP混合物(4種dNTP每種2.0mM的混合物)，5.0μl 10x Expand HF緩沖液(包含MgCl2)和0.75μl Expand HiFi酶混合物和蒸餾水，PCR反應(yīng)溶液總計50μl。PCR的反應(yīng)條件是在保持在97℃ 2分鐘后；重復(fù)10個循環(huán)，一個循環(huán)包括保持在97℃ 15秒，接著65℃ 30秒，接著72℃ 2分鐘；然后進(jìn)行15個循環(huán)，一個循環(huán)包括保持在97℃ 15秒，接著68℃ 30秒，接著72℃ 2分鐘(其中每個循環(huán)增加20秒保持在72℃)；然后保持在72℃ 7分鐘。在保持后，將反應(yīng)溶液進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳。從經(jīng)歷使用引物對19的反應(yīng)溶液的凝膠中回收包含約1.2kbp的DNA的凝膠區(qū)域。從經(jīng)歷使用引物對20的反應(yīng)溶液的凝膠中回收包含約1.5kbp的DNA的凝膠區(qū)域。通過按照附帶的說明書使用QIA快速凝膠提取試劑盒(Qiagen公司)從每個回收的凝膠中純化DNA。按照所述載體附帶的說明書將獲得的DNA連接到TA克隆載體pCR2.1(Invitrogen公司)并導(dǎo)入大腸桿菌TOP10F’。使用QIAprep Spin Miniprep試劑盒(Qiagen公司)從獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體中制備質(zhì)粒DNA。按照所述試劑盒附帶的說明書，使用作為引物的-21M13引物(AppliedBiosystems日本公司)和M13Rev引物(Applied Biosystems日本公司)，具有SEQ ID NO43所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO46所示核苷酸序列的寡核苷酸，用染料終止循環(huán)測序FS簡易反應(yīng)試劑盒(Applied Biosystems日本公司)進(jìn)行測序反應(yīng)。測序反應(yīng)使用獲得的質(zhì)粒DNA作為模板。用DNA測序儀373A(Applied Biosystems日本公司)分析反應(yīng)產(chǎn)物?；诮Y(jié)果，將含有SEQ ID NO6所示核苷酸序列的質(zhì)粒命名為pCR657和將含有SEQ ID NO9所示核苷酸序列的質(zhì)粒命名為pCR657F。
另外，將具有SEQ ID NO134所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQID NO135所示核苷酸序列的寡核苷酸一起退火以提供接頭(圖47)。用HindIII和XmnI消化質(zhì)粒pKSN24R2(Akiyoshi-ShibaTa M.等，Eur.J.Biochem.224P335(1994))。將接頭插入獲得的約3kb的DNA。將獲得的質(zhì)粒命名為pKSN2(圖4)。
接下來，用限制酶NdeI和HindIII消化pCR657和pCR657F中的每一個。將消化產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。從進(jìn)行pCR657消化產(chǎn)物的凝膠中切割包含約1.2kbp DNA的凝膠區(qū)域。從進(jìn)行pCR657F消化產(chǎn)物的凝膠中切割包含約1.5kbp DNA的凝膠區(qū)域。通過按照附帶的說明書使用QIA快速凝膠提取試劑盒(Qiagen公司)從每個回收的凝膠中純化DNA。按照所示試劑盒附帶的說明書用連接試劑盒版本1(Takara Shuzo Company)連接用NdeI和HindIII消化的每種獲得的DNA和質(zhì)粒pKSN2并導(dǎo)入大腸桿菌JM109。從獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體制備質(zhì)粒DNA。分析其結(jié)構(gòu)。將其中編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)(A1)的約1.2kbp DNA插入pKSN2的NdeI位點和HindIII位點之間、包含SEQ ID NO6所示核苷酸序列的質(zhì)粒命名為pKSN657。另外，將其中編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)(A1)的約1.5kbp DNA插入pKSN2的NdeI位點和HindIII位點之間、包含SEQ ID NO9所示核苷酸序列的質(zhì)粒命名為pKSN657F。將上述質(zhì)粒pKSN657和pKSN657F中的每一個導(dǎo)入大腸桿菌JM109。將獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體分別命名為JM109/pKSN657和JM109/pKSN657F。另外，將質(zhì)粒pKSN2導(dǎo)入大腸桿菌JM109。獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體命名為JM109/pKSN2。
(2)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A1)在大腸桿菌中的表達(dá)和所述蛋白質(zhì)的回收將大腸桿菌JM109/pKSN657，JM109/pKSN657F和JM109/pKSN2各自在37℃下在包含50μg/ml氨芐青霉素的10ml TB培養(yǎng)基(1.2％(w/v)胰蛋白胨，2.4％(w/v)酵母提取物，0.4％(w/v)甘油，17mM磷酸二氫鉀，72mM磷酸氫二鉀)中培養(yǎng)過夜。將一毫升(1ml)獲得的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至包含50μg/ml氨芐青霉素的100ml TB培養(yǎng)基中并在26℃下培養(yǎng)。當(dāng)OD660到達(dá)約0.5時，將5-氨基乙酰丙酸加至500μM的終濃度，繼續(xù)培養(yǎng)。三十(30)分鐘后，將IPTG加至1mM的終濃度，進(jìn)一步培養(yǎng)17小時。
從每個培養(yǎng)基中回收細(xì)胞，用0.1M tris-HCl緩沖液(pH7.5)洗滌和懸浮在10ml包含1mM PMSF的上述緩沖液中。將獲得的細(xì)胞混懸液在輸出量為3，占空因數(shù)(duty cycle)30％的條件下進(jìn)行超聲波儀(Sonifer(Branson Sonic Power Company))6次，每次3分鐘，以便獲得細(xì)胞裂解液。在將細(xì)胞裂解液離心(1,200xg，5分鐘)后回收上清液和離心(150,000xg，70分鐘)以回收上清液級分(以下，將從大腸桿菌JM109/pKSN657中獲得的上清液級分稱為“大腸桿菌pKSN657提取物”，將從大腸桿菌JM109/pKSN657F中獲得的上清液級分稱為“大腸桿菌pKSN657F提取物”，將從大腸桿菌JM109/pKSN2中獲得的上清液級分稱為“大腸桿菌pKSN2提取物”)。在15％-25％ SDS-PAGE上分析一微升(1μl)上述上清液級分并用考馬斯藍(lán)(以下稱為“CBB”)染色。結(jié)果，在大腸桿菌pKSN657提取物和大腸桿菌pKSN657F提取物中都檢測到比大腸桿菌pKSN2提取物顯著更強烈的條帶，其位于對應(yīng)于47kDa分子量的電泳位置。在大腸桿菌pKSN657F提取物中檢測到比大腸桿菌pKSN657提取物更強烈的條帶。顯示大腸桿菌JM109/pKSN657F比大腸桿菌JM109/pKSN657更高程度地表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A1)。
(3)將化合物(II)轉(zhuǎn)化為化合物(III)的能力的檢測制備30μl的反應(yīng)溶液并保持在30℃下1小時。反應(yīng)溶液由0.1M磷酸鉀緩沖液(pH7.0)組成，其包含3ppm用14C標(biāo)記的化合物(II)，2mMβ-NADPH(以下稱為“組分A”)(Oriental Yeast Company)，0.2mg/ml來源于菠菜的鐵氧還蛋白(以下稱為“組分B”)(Sigma Company)，1U/ml鐵氧還蛋白還原酶(以下稱為“組分C”)(Sigma Company)和18μl在實施例4(2)中回收的上清液級分。另外，類似地制備和保持未加入用于上述反應(yīng)溶液組合物中的、選自組分A，組分B和組分C的至少一種組分的反應(yīng)溶液。將三微升(3μl)2N HCl和90μl乙酸乙酯加入和攪拌到保持以后的每種反應(yīng)溶液中。在8,000xg下將產(chǎn)生的反應(yīng)溶液離心以回收75μl乙酸乙酯層。在減壓下干燥乙酸乙酯層以后，將殘余物溶解在6.0μl乙酸乙酯中。將其五微升(5.0μl)點到TLC板(TLC硅膠板60F25420cm×20cm，0.25厚，Merck公司)上。用氯仿，乙酸和乙酸乙酯的6∶1∶2的混合物展開TLC板約1小時。然后讓溶劑蒸發(fā)。將TLC板暴露于成像板(FujiFilm Company)過夜。接著，在Image Analyzer BAS2000(Fuji FilmCompany)上分析成像板。檢查對應(yīng)于用14C標(biāo)記的化合物(III)的斑點的存在(Rf值0.24和0.29)。結(jié)果在表6中顯示。
表6


實施例5本發(fā)明蛋白質(zhì)(A2)的制備(1)細(xì)胞粗提物的制備將塔氏糖多孢菌JCM 9383t的冷凍原種加入10ml試管中的10ml A培養(yǎng)基(0.1％(w/v)葡萄糖，0.5％(w/v)胰蛋白胨，0.5％(w/v)酵母提取物，0.1％(w/v)磷酸氫二鉀，pH7.0)并在30℃下振蕩溫育1天以獲得預(yù)培養(yǎng)物。將八毫升(8ml)預(yù)培養(yǎng)物加入200ml A培養(yǎng)基中并在30℃下在500ml帶擋板的搖瓶中旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)2天。通過將10L產(chǎn)生的培養(yǎng)物離心(3,000g，10分鐘)回收細(xì)胞沉淀。將這些細(xì)胞沉淀懸浮在包含100ppm化合物(II)的100ml B培養(yǎng)基(1％(w/v)葡萄糖，0.1％牛肉膏，0.2％(w/v)胰蛋白月示)中并在30℃下在500ml坂口燒瓶中往復(fù)振蕩溫育20小時。通過將10L產(chǎn)生的培養(yǎng)物離心(3,000xg，10分鐘)回收細(xì)胞沉淀。用1L 0.1M磷酸鉀緩沖液(pH7.0)洗滌產(chǎn)生的細(xì)胞沉淀2次以提供119g細(xì)胞沉淀。
以1g細(xì)胞沉淀2ml將這些細(xì)胞沉淀懸浮在0.1M磷酸鉀緩沖液(pH7.0)中。加入一毫摩爾(1mM)PMSF，5mM苯甲脒HCl，1mM EDTA，3μg/ml亮抑酶肽，3μg/ml抑胃酶肽和1mM二硫垂陶耳。通過用弗氏壓碎器(1000kg/cm2)(Ohtake Seisakusho)反復(fù)破裂混懸液2次獲得細(xì)胞裂解液。在將細(xì)胞裂解液離心(40,000xg，30分鐘)以后，回收上清液并在150,000xg下離心1小時以回收上清液(以下稱為“細(xì)胞粗提物”)。
(2)將化合物(II)轉(zhuǎn)化為化合物(III)的能力的測定制備0.1M磷酸鉀緩沖液(pH7.0)的30μl反應(yīng)溶液，其包含3ppm用14C標(biāo)記的化合物(II)，2.4mM β-NADPH(以下稱為“組分A”)(OrientalYeast Company)，0.5mg/ml來源于菠菜的鐵氧還蛋白(以下稱為“組分B”)(Sigma Company)，1U/ml鐵氧還蛋白還原酶(以下稱為“組分C”)(Sigma Company)和18μl在實施例5(1)中回收的細(xì)胞粗提物。將反應(yīng)體系保持在30℃下1小時。另外，類似地制備和保持未加入用于上述反應(yīng)溶液組合物中的、選自組分A，組分B和組分C的至少一種組分的反應(yīng)溶液。將三微升(3μl)2N HCl和90μl乙酸乙酯加入和混合到保持以后的每種反應(yīng)溶液中。在8,000xg下將產(chǎn)生的反應(yīng)溶液離心以回收75μl乙酸乙酯層。在減壓下干燥乙酸乙酯層以后，將殘余物溶解在6.0μl乙酸乙酯中。將其五微升(5.0μl)點到TLC板(TLC硅膠板60F25420cm×20cm，0.25厚，Merck公司)上。用氯仿，乙酸和乙酸乙酯的6∶1∶2的混合物展開TLC板約1小時。然后讓溶劑蒸發(fā)。將TLC板暴露于成像板(Fuji FilmCompany)過夜。接著，在Image Analyzer BAS2000(Fuji Film Company)上分析成像板。檢查對應(yīng)于用14C標(biāo)記的化合物(III)的斑點的存在(Rf值0.24和0.29)。結(jié)果在表7中顯示。
表7

(3)細(xì)胞粗提物的分級分離將硫酸銨加入在實施例5(1)中獲得的細(xì)胞粗提物至45％飽和的量。在冰冷卻的條件下攪拌，通過在12,000xg下離心10分鐘回收上清液。在將硫酸銨加入獲得的上清液至55％飽和的量和在冰冷卻的條件下攪拌以后，通過在12,000xg下離心10分鐘回收沉淀。用32.5ml的20mM雙三丙烷緩沖液(pH7.0)溶解沉淀。將該溶液進(jìn)行PD10柱(AmershamPharmacia Company)和用20mM雙三丙烷緩沖液(pH7.0)洗脫以回收45.5ml包含蛋白質(zhì)的級分(以下稱為“45-55％硫酸銨級分”)。
(4)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A2)的分離將在實施例5(3)中制備的45-55％硫酸銨級分注射到HiLoad 26/10QSepharose HP柱(Amersham Pharmacia Company)中。接下來，在100ml的20mM雙三丙烷緩沖液(pH7.0)流進(jìn)柱子以后，以NaCl線性梯度(NaCl的梯度是0.004M/分鐘，NaCl濃度的范圍是0M-0.5M，流速為8ml/分鐘)流動20mM雙三丙烷緩沖液以分級回收在0.25M-0.26M的NaCl濃度下洗脫的30ml級分。進(jìn)一步，將回收的級分進(jìn)行PD10柱(AmershamPharmacia Biotech Company)和用20mM雙三丙烷緩沖液(pH7.0)洗脫以回收包含蛋白質(zhì)的級分。
將回收的級分進(jìn)行PD10柱(Amersham Pharmacia Biotech Company)，用緩沖液A(包含1.5mM NaCl的2mM磷酸鉀緩沖液，pH7.0)洗脫，以便回收包含蛋白質(zhì)的級分。接下來，將級分注射于Bio-Scale Ceramic羥磷灰石I型柱子CHT10-I(BioRad Company)中。將二十毫升(20ml)緩沖液A流進(jìn)柱子。隨后，緩沖液A和線性梯度的緩沖液B(包含0.03mMNaCl的100mM磷酸鉀緩沖液；線性梯度從100％緩沖液A開始在100分鐘期間增加至50％緩沖液B，流速為2ml/分鐘)一起流動以分級回10ml收在23％-25％的緩沖液B的濃度下洗脫的級分。進(jìn)一步，將回收的級分進(jìn)行PD10柱(Amersham Pharmacia Biotech Company)并用0.05M磷酸鉀緩沖液(pH7.0)洗脫以回收包含蛋白質(zhì)的級分。
使用超濾膜(Microcon YM-30，Millipore Company)將回收的級分濃縮至約770μl并注射到HiLoad 16/60 Superdex 75pg柱(AmershamPharmacia Biotech Company)中。包含0.15M NaCl(pH7.0)的五十毫摩爾(50mM)磷酸鉀緩沖液流進(jìn)(流速1ml/分鐘)柱子。以每個2ml將洗脫液分級。將在61ml左右的洗脫體積下洗脫的級分各自分級回收。用10％-20％ SDS-PAGE分析在每個級分中包含的蛋白質(zhì)。
類似于實施例5(2)，在組分A，組分B，組分C和用14C標(biāo)記的化合物(II)的存在下，加入和保持回收的級分而不是在實施例5(2)所述反應(yīng)溶液中的細(xì)胞粗提物。將保持以后的反應(yīng)溶液TLC分析以檢查對應(yīng)于用14C標(biāo)記的化合物(III)的斑點的強度。觀察到在上述SDS-PAGE中移動至47kDa位置的蛋白質(zhì)在依次加入的級分條帶的濃度方面具有平行于對應(yīng)于化合物(III)的斑點的強度波動的波動。從SDS-PAGE凝膠中回收所述蛋白質(zhì)并用蛋白質(zhì)測序儀(Applied Biosystems Company，Procise494HT，脈沖液相方法)進(jìn)行氨基酸序列分析以測序N末端氨基酸序列。結(jié)果，提供在SEQ ID NO20中表示的氨基酸序列。另外，在用胰蛋白酶消化上述蛋白質(zhì)以后，在質(zhì)譜儀(ThermoQuest Company，離子阱質(zhì)譜儀LCQ，柱LC Packings Company PepMap C18 75μm×150mm，溶劑A0.1％ HOAc-H2O，溶劑B0.1％ HOAc-甲醇，梯度從用95％溶劑A和5％溶劑B的混合物洗脫開始在30分鐘內(nèi)增加到100％溶劑B的濃度的線性梯度，流速0.2μl/分鐘)上分析獲得的消化物。結(jié)果，提供在SEQ IDNO21中表示的氨基酸序列。
實施例6獲得本發(fā)明DNA(A2)(1)塔氏糖多孢菌JCM 9383t的染色體DNA的制備在50ml YEME培養(yǎng)基(0.3％(w/v)酵母提取物，0.5％(w/v)細(xì)菌用蛋白胨，0.3％(w/v)麥芽汁，1.0％(w/v)葡萄糖，34％(w/v)蔗糖和0.2％(v/v)2.5MgCl2·6H2O)中將塔氏糖多孢菌JCM 9383t在30℃下振蕩溫育1天至3天。回收細(xì)胞。將獲得的細(xì)胞懸浮在包含1.4％(w/v)甘氨酸和60mM EDTA的YEME培養(yǎng)基中并進(jìn)一步振蕩溫育1天。從培養(yǎng)基中回收細(xì)胞。在用蒸餾水洗滌一次以后，以每200mg細(xì)胞沉淀1ml將它重懸浮在緩沖液(100mM Tris-HCl(pH8.0)，100mM EDTA，10mMNaCl)中。加入二百微克每毫升(200μg/ml)的卵清溶菌酶。將細(xì)胞混懸液在30℃下振蕩溫育1小時。另外，加入0.5％ SDS和1mg/ml蛋白酶K。將細(xì)胞混懸液在55℃下溫育3小時。用酚·氯仿·異戊醇萃取細(xì)胞混懸液2次以回收每個水層。接下來，用氯仿·異戊醇萃取一次以回收水層。通過乙醇沉淀水層獲得染色體DNA。
(2)塔氏糖多孢菌JCM 9383t的染色體DNA文庫的制備用0.78U限制酶Sau3AI在37℃下消化在實施例5(1)中制備的十九微克(19μg)染色體DNA 60分鐘。用1％瓊脂糖凝膠電泳分離獲得的消化液。從凝膠中回收約2.0kbp的DNA。按照所述試劑盒附帶的說明書用QIA快速凝膠提取試劑盒(Qiagen公司)純化DNA并用乙醇沉淀濃縮以獲得10μl包含目標(biāo)DNA的溶液。將八微升(8μl)DNA溶液，100ng用限制酶BamHI消化和用去磷酸化處理的質(zhì)粒載體pUC118和12μl來自連接試劑盒第二版(Takara Shuzo Company)的溶液I混合和在16℃下保持3小時。用連接溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。將大腸桿菌轉(zhuǎn)化體在37℃下在包含50mg/l氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。從瓊脂培養(yǎng)基中回收獲得的菌落。提取質(zhì)粒并稱為染色體DNA文庫。
(3)本發(fā)明DNA(A2)的分離通過將在實施例6(1)中制備的染色體DNA用作模板用Expand HiFiPCR系統(tǒng)(Boehringer Manheim Company)進(jìn)行PCR(圖2)。作為引物，使用具有SEQ ID NO54所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO55所示核苷酸序列的寡核苷酸的配對(以下稱為“引物對6”)?；诰幋aSEQ ID NO20所示N末端氨基酸序列的核苷酸序列設(shè)計SEQ ID NO54所示核苷酸序列。另外，基于與編碼SEQ ID NO21所示內(nèi)部氨基酸序列的核苷酸序列互補的核苷酸序列設(shè)計SEQ ID NO55所示核苷酸序列。通過加入300ng上述染色體DNA，2種每種總計7.5pmol的引物，0.2μldNTP混合物(4種dNTP每種2mM的混合物)，2.5μl 10x緩沖液(包含MgCl2)，0.19μl Expand HiFi酶混合物和蒸餾水，PCR反應(yīng)溶液總計25μl。PCR的反應(yīng)條件是在保持在97℃ 2分鐘后，重復(fù)10個循環(huán)，一個循環(huán)包括保持在97℃ 15秒，接著65℃ 30秒，接著72℃ 1分鐘；然后進(jìn)行15個循環(huán)，一個循環(huán)包括保持在97℃ 15秒，接著65℃ 30秒，接著72℃ 1分鐘(其中每個循環(huán)增加保持在72℃下20秒)；然后保持在72℃ 7分鐘。在保持后，將反應(yīng)溶液進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳?；厥瞻s800bp的DNA的凝膠區(qū)域。通過按照附帶的說明書使用Qiagen快速凝膠提取試劑盒(Qiagen公司)從回收的凝膠中純化DNA。按照所述載體附帶的說明書將獲得的DNA連接到TA克隆載體pCRII-TOPO(Invitrogen公司)并導(dǎo)入大腸桿菌TOP10F’。使用Qiagen Tip20(Qiagen公司)從獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體中制備質(zhì)粒DNA。按照所述試劑盒附帶的說明書，使用-21M13引物(Applied Biosystems日本公司)和M13Rev引物(Applied Biosystems日本公司)作為引物，用染料終止循環(huán)測序FS簡易反應(yīng)試劑盒(AppliedBiosystems日本公司)進(jìn)行測序反應(yīng)。用DNA測序儀373A(AppliedBiosystems日本公司)分析反應(yīng)產(chǎn)物。結(jié)果，提供在SEQ ID NO10中表示的核苷酸序列的核苷酸36至819所示的核苷酸序列。SEQ ID NO10所示核苷酸序列的核苷酸37-60編碼部分SEQ ID NO20所示氨基酸序列。在這點上，期望所述DNA編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)(A2)的一部分。
接下來，通過將在實施例6(2)中制備的染色體DNA用作模板和類似上面用Expand HiFi PCR系統(tǒng)進(jìn)行PCR。使用具有SEQ ID NO56所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO57所示核苷酸序列的寡核苷酸的配對(以下稱為“引物對7”)作為引物。通過使用這些引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增具有其中5’末端延伸過SEQ ID NO10所示核苷酸序列的核苷酸36所示核苷酸的核苷酸序列的DNA。另外，使用具有SEQ ID NO58所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO59所示核苷酸序列的寡核苷酸的配對(以下稱為“引物對8”)作為引物。通過使用這些引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增具有其中3’末端延伸過SEQ ID NO10所示核苷酸序列的核苷酸819所示核苷酸的核苷酸序列的DNA。將使用引物對7擴(kuò)增的1.3kb DNA和使用引物對8擴(kuò)增的0.4kb DNA每個克隆到TA克隆載體pCRII-TOPO中。使用Qiagen Tip 20(Qiagen公司)從獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體中制備質(zhì)粒DNA。按照所述試劑盒附帶的說明書，使用-21M13引物(AppliedBiosystems日本公司)和M13Rev引物(Applied Biosystems日本公司)和SEQ ID NO60所示寡核苷酸作為引物，用染料終止循環(huán)測序FS簡易反應(yīng)試劑盒(Applied Biosystems日本公司)進(jìn)行測序反應(yīng)。用DNA測序儀373A(Applied Biosystems日本公司)分析反應(yīng)產(chǎn)物。作為將通過使用引物對7擴(kuò)增的1.3kb DNA的核苷酸序列測序的結(jié)果，提供在SEQ ID NO10所示核苷酸序列的核苷酸1至35中所表示的核苷酸序列。另外，作為將通過使用引物對8擴(kuò)增的0.4kb DNA的核苷酸序列測序的結(jié)果，提供在SEQ IDNO10所示核苷酸序列的核苷酸819至1415中所表示的核苷酸序列。作為連接獲得的核苷酸序列的結(jié)果，獲得在SEQ ID NO10中表示的核苷酸序列。在所述核苷酸序列中存在兩個可讀框(ORF)。因此，包含由1206個核苷酸(包括終止密碼子)組成和編碼401個氨基酸殘基的核苷酸序列(SEQ ID NO7)以及由198個核苷酸(包括終止密碼子)組成和編碼65個氨基酸殘基的核苷酸序列(SEQ ID NO16)。由SEQ ID NO7所示核苷酸序列編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO2)組成的蛋白質(zhì)的分子量據(jù)計算為43983Da。另外，由所述核苷酸序列編碼的氨基酸序列包含從本發(fā)明蛋白質(zhì)(A2)的N末端氨基酸測序測定的氨基酸序列(SEQ ID NO20)和用質(zhì)譜分析從胰蛋白酶消化片段的氨基酸測序測定的氨基酸序列(SEQ IDNO21)。由SEQ ID NO16所示核苷酸序列編碼的氨基酸序列(SEQ IDNO13)組成的蛋白質(zhì)的分子量據(jù)計算為6707Da。
實施例7本發(fā)明蛋白質(zhì)(A1)在大腸桿菌中的表達(dá)(1)含有本發(fā)明蛋白質(zhì)(A2)的轉(zhuǎn)化大腸桿菌的產(chǎn)生通過將在實施例6(1)中從塔氏糖多孢菌JCM 9383t制備的染色體DNA用作模板和通過使用Expand HiFi PCR System(Boehringer ManheimCompany)進(jìn)行PCR。作為引物，使用具有SEQ ID NO61所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO62所示核苷酸序列的寡核苷酸的配對(以下稱為“引物對21”)或具有SEQ ID NO61所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO63所示核苷酸序列的寡核苷酸的配對(以下稱為“引物對22”)。通過加入2種每種總計300nM的引物，50ng上述染色體DNA，5.0μl dNTP混合物(4種dNTP每種2.0mM的混合物)，5.0μl 10xExpand HF緩沖液(包含MgCl2)和0.75μl Expand HiFi酶混合物和蒸餾水，PCR反應(yīng)溶液總計50μl。PCR的反應(yīng)條件是在保持在97℃ 2分鐘后；重復(fù)10個循環(huán)，一個循環(huán)包括保持在97℃ 15秒，接著60℃ 30秒，接著72℃ 1分鐘；然后進(jìn)行15個循環(huán)，一個循環(huán)包括保持在97℃ 15秒，接著60℃ 30秒，接著72℃ 1分鐘(其中每個循環(huán)增加20秒保持在72℃)；然后保持在72℃ 7分鐘。在保持后，將反應(yīng)溶液進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳。從經(jīng)歷利用引物對21的反應(yīng)溶液的凝膠中回收包含約1.2kbp的DNA的凝膠區(qū)域。從經(jīng)歷利用引物對22的反應(yīng)溶液的凝膠中回收包含約1.4kbp的DNA的凝膠區(qū)域。通過按照附帶的說明書使用Qiagen快速凝膠提取試劑盒(Qiagen公司)從每個回收的凝膠中純化DNA。按照所述載體附帶的說明書將獲得的DNA連接到克隆載體pCRII-TOPO(Invitrogen公司)并導(dǎo)入大腸桿菌TOP10F’。使用Qiagen Tip20(Qiagen公司)從獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體中制備質(zhì)粒DNA。接著，按照所述試劑盒附帶的說明書，使用作為引物的-21M13引物(Applied Biosystems日本公司)和M13Rev引物(Applied Biosystems日本公司)，具有SEQ ID NO56所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO64所示核苷酸序列的寡核苷酸，用染料終止循環(huán)測序FS簡易反應(yīng)試劑盒(Applied Biosystems日本公司)進(jìn)行測序反應(yīng)。用DNA測序儀373A(Applied Biosystems日本公司)分析反應(yīng)產(chǎn)物?；诮Y(jié)果，將具有SEQ ID NO7所示核苷酸序列的質(zhì)粒命名為pCR923和將具有SEQ ID NO10所示核苷酸序列的質(zhì)粒命名為pCR923F。
接下來，用限制酶NdeI和HindIII消化質(zhì)粒pCR923和pCR923F中的每一個。將消化產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。從進(jìn)行pCR923消化產(chǎn)物的凝膠中切割包含約1.2kbp DNA的凝膠區(qū)域。從進(jìn)行pCR923F消化產(chǎn)物的凝膠中切割包含約1.4kbp DNA的凝膠區(qū)域。通過按照附帶的說明書使用Qiagen快速凝膠提取試劑盒(Qiagen公司)從每個回收的凝膠中純化DNA。按照所述試劑盒附帶的說明書用連接試劑盒版本1(Takara ShuzoCompany)連接用NdeI和HindIII消化的每種獲得的DNA和質(zhì)粒pKSN2并導(dǎo)入大腸桿菌JM109。從獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體制備質(zhì)粒DNA。分析其結(jié)構(gòu)。將其中編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)(A2)的約1.2kbp DNA插入pKSN2的NdeI位點和HindIII位點之間、包含SEQ ID NO7所示核苷酸序列的質(zhì)粒命名為pKSN923。另外，將其中編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)(A2)的約1.4kbpDNA插入pKSN2的NdeI位點和HindIII位點之間、包含SEQ ID NO10所示核苷酸序列的質(zhì)粒命名為pKSN923F。將上述質(zhì)粒pKSN923和pKSN923F中的每一個導(dǎo)入大腸桿菌JM109。將獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體分別命名為JM109/pKSN923和JM109/pKSN923F。另外，將質(zhì)粒pKSN2導(dǎo)入大腸桿菌JM109。獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體命名為JM109/pKSN2。
(2)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A2)在大腸桿菌中的表達(dá)和所述蛋白質(zhì)的回收將大腸桿菌JM109/pKSN657，JM109/pKSN657F和JM109/pKSN2各自在37℃下在包含50μg/ml氨芐青霉素的10ml TB培養(yǎng)基(1.2％(w/v)胰蛋白胨，2.4％(w/v)酵母提取物，0.4％(w/v)甘油，17mM磷酸二氫鉀，72mM磷酸氫二鉀)中培養(yǎng)過夜。將一毫升(1ml)獲得的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至包含50μg/ml氨芐青霉素的100ml TB培養(yǎng)基中并在26℃下培養(yǎng)。當(dāng)OD660到達(dá)約0.5時，將5-氨基乙酰丙酸加至500μM的終濃度，繼續(xù)培養(yǎng)。三十(30)分鐘后，將IPTG加至1mM的終濃度，進(jìn)一步培養(yǎng)17小時。
從每個培養(yǎng)基中回收細(xì)胞，用0.1M tris-HCl緩沖液(pH7.5)洗滌和懸浮在10ml包含1mM PMSF的所述緩沖液中。將獲得的細(xì)胞混懸液在輸出量為3，占空因數(shù)30％的條件下進(jìn)行超聲波儀(Sonifer(Branson SonicPower Company))6次，每次3分鐘，以便獲得細(xì)胞裂解液。在將細(xì)胞裂解液離心(1,200xg，5分鐘)后回收上清液和離心(150,000xg，70分鐘)以回收上清液級分(以下，將從大腸桿菌JM109/pKSN923中獲得的上清液級分稱為“大腸桿菌pKSN923提取物”，將從大腸桿菌JM109/pKSN923F中獲得的上清液級分稱為“大腸桿菌pKSN923F提取物”，將從大腸桿菌JM109/pKSN2中獲得的上清液級分稱為“大腸桿菌pKSN2提取物”)。在15％-25％ SDS-PAGE上分析一微升(1μl)上述上清液級分并用CBB染色。結(jié)果，在大腸桿菌pKSN923提取物和大腸桿菌pKSN923F提取物中都檢測到比大腸桿菌pKSN2提取物顯著更強烈的條帶，其位于對應(yīng)于47kDa分子量的電泳位置。證實大腸桿菌JM109/pKSN923和大腸桿菌JM109/pKSN923F表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A2)。
(3)將化合物(II)轉(zhuǎn)化為化合物(III)的能力的檢測制備30μl的反應(yīng)溶液并保持在30℃下10分鐘。反應(yīng)溶液由0.1M磷酸鉀緩沖液(pH7.0)組成，其包含3ppm用14C標(biāo)記的化合物(II)，2mMβ-NADPH(以下稱為“組分A”)(Oriental Yeast Company)，0.2mg/ml來源于菠菜的鐵氧還蛋白(以下稱為“組分B”)(Sigma Company)，1U/ml鐵氧還蛋白還原酶(以下稱為“組分C”)(Sigma Company)和18μl在實施例7(2)中回收的上清液級分。另外，類似地制備和保持未加入用于上述反應(yīng)溶液組合物中的、選自組分A，組分B和組分C的至少一種組分的反應(yīng)溶液。將三微升(3μl)2N HCl和90μl乙酸乙酯加入和混合到保持以后的每種反應(yīng)溶液中。在8,000xg下將產(chǎn)生的反應(yīng)溶液離心以回收75μl乙酸乙酯層。在減壓下干燥乙酸乙酯層以后，將殘余物溶解在6.0μl乙酸乙酯中。將其五微升(5.0μl)點到硅膠TLC板(TLC硅膠板60F25420cm×20cm，0.25mm厚，Merck公司)上。用氯仿，乙酸和乙酸乙酯的6∶1∶2的混合物展開TLC板約1小時。然后讓溶劑蒸發(fā)。將TLC板暴露于成像板(Fuji Film Company)過夜。接著，在Image Analyzer BAS2000(Fuji FilmCompany)上分析成像板。檢查對應(yīng)于用14C標(biāo)記的化合物(III)的斑點的存在(Rf值0.24和0.29)。結(jié)果在表8中顯示。
表8

實施例8本發(fā)明蛋白質(zhì)(A10)的制備(1)細(xì)胞粗提物的制備將淺灰鏈霉菌ATCC 11796的冷凍原種加入500ml帶擋板燒瓶中的250ml B培養(yǎng)基(1％(w/v)葡萄糖，0.1％(w/v)牛肉膏，0.2％(w/v)胰蛋白月示)并在30℃下旋轉(zhuǎn)振蕩溫育3天以獲得預(yù)培養(yǎng)物。將四十毫升(40ml)預(yù)培養(yǎng)物加入400ml B培養(yǎng)基中并在30℃下在1L三角燒瓶中旋轉(zhuǎn)振蕩溫育24小時。在停止培養(yǎng)后，讓培養(yǎng)物沉降。去除僅二百二十毫升(220ml)上清液。將類似制備的二百二十毫升(220ml)新鮮培養(yǎng)基加入剩余的220ml培養(yǎng)基以總計440ml。向其中加入化合物(II)至100ppm的量。在30℃下在1L三角燒瓶中旋轉(zhuǎn)振蕩溫育細(xì)胞40小時。通過將2.6L產(chǎn)生的培養(yǎng)物離心(3,000g，5分鐘)回收細(xì)胞沉淀。用1L 0.1MPIPES-NaOH緩沖液(pH6.8)洗滌產(chǎn)生的細(xì)胞沉淀以提供26g細(xì)胞沉淀。
以1g細(xì)胞沉淀3ml將這些細(xì)胞沉淀懸浮在0.1M PIPES-NaOH緩沖液(pH6.8)中，加入1mM PMSF，5mM苯甲脒HCl，1mM EDTA，3μg/ml亮抑酶肽，3μg/ml抑胃酶肽A和1mM二硫垂陶耳。通過用弗氏壓碎器(1000kg/cm2)(Ohtake Seisakusho)反復(fù)破裂混懸液2次獲得細(xì)胞裂解液。在將細(xì)胞裂解液離心(40,000xg，30分鐘)以后，回收上清液并在150,000xg下離心1小時以回收上清液(以下稱為“細(xì)胞粗提物”)。
(2)將化合物(II)轉(zhuǎn)化為化合物(III)的能力的測定制備0.1M磷酸鉀緩沖液(pH7.0)的30μl反應(yīng)溶液，其包含3ppm用14C標(biāo)記的化合物(II)，2.4mM β-NADPH(以下稱為“組分A”)(OrientalYeast Company)，0.5mg/ml來源于菠菜的鐵氧還蛋白(以下稱為“組分B”)(Sigma Company)，1U/ml鐵氧還蛋白還原酶(以下稱為“組分C”)(Sigma Company)和18μl在實施例8(1)中回收的細(xì)胞粗提物。將反應(yīng)溶液保持在30℃下1小時。另外，類似地制備和保持未加入用于上述反應(yīng)溶液組合物中的、選自組分A，組分B和組分C的至少一種組分的反應(yīng)溶液。將三微升(3μl)2N HCl和90μl乙酸乙酯加入和攪拌到保持以后的每種反應(yīng)溶液中。在8,000xg下將產(chǎn)生的反應(yīng)溶液離心以回收75μl乙酸乙酯層。在減壓下干燥乙酸乙酯層以后，將殘余物溶解在6.0μl乙酸乙酯中。將其五微升(5.0μl)點到硅膠TLC板(TLC硅膠板60F25420cm×20cm，0.25厚，Merck公司)上。用氯仿，乙酸和乙酸乙酯的6∶1∶2的混合物展開TLC板約1小時。然后讓溶劑蒸發(fā)。將TLC板暴露于成像板(FujiFilm Company)過夜。接著，在Image Analyzer BAS2000(Fuji FilmCompany)上分析成像板。檢查對應(yīng)于用14C標(biāo)記的化合物(III)的斑點的存在(Rf值0.24和0.29)。結(jié)果在表9中顯示。
表9

(3)細(xì)胞粗提物的分級分離將硫酸銨加入在實施例8(1)中獲得的細(xì)胞粗提物至45％飽和的量。在冰冷卻的條件下攪拌，通過在12,000xg下離心10分鐘回收上清液。在將硫酸銨加入獲得的上清液至55％飽和的量和在冰冷卻的條件下攪拌以后，通過在12,000xg下離心10分鐘回收沉淀。用20mM雙三丙烷緩沖液(pH7.0)溶解沉淀至10ml的量。將該溶液進(jìn)行PD10柱(AmershamPharmacia Company)和用20mM雙三丙烷緩沖液(pH7.0)洗脫以回收14ml包含蛋白質(zhì)的級分(以下稱為“45-55％硫酸銨級分”)。
(4)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A10)的分離將在實施例8(3)中制備的45-55％硫酸銨級分注射到MonoQHR 10/10柱(Amersham Pharmacia Company)中。接下來，在16ml的20mM雙三丙烷緩沖液(pH7.0)流進(jìn)柱子以后，與線性梯度的NaCl(NaCl的梯度是0.00625M/分鐘，NaCl濃度的范圍是0M-0.5M，流速為4ml/分鐘)一起流動20mM雙三丙烷緩沖液以分級回收在0.28M-0.31M的NaCl濃度下洗脫的15ml級分。進(jìn)一步，將回收的級分進(jìn)行PD10柱(AmershamPharmacia Biotech Company)和用20mM雙三丙烷緩沖液(pH7.0)洗脫以回收包含蛋白質(zhì)的級分。
將回收的級分進(jìn)行PD10柱(Amersham Pharmacia Biotech Company)，用緩沖液A(包含1.5mM NaCl的2mM磷酸鉀緩沖液，pH7.0)洗脫，以便回收包含蛋白質(zhì)的級分。接下來，將級分注射于Bio-Scale Ceramic羥磷灰石I型柱子CHT10-I(BioRad Company)中。將五十毫升(50ml)緩沖液A流進(jìn)柱子。隨后，緩沖液A和線性梯度的緩沖液B(包含0.03mMNaCl的100mM磷酸鉀緩沖液；線性梯度從100％緩沖液A開始在40分鐘期間增加至50％緩沖液B，流速為5ml/分鐘)一起流動以分級回收在16％-31％的緩沖液B的濃度下洗脫的級分。進(jìn)一步，將回收的級分進(jìn)行PD10柱(Amersham Pharmacia Biotech Company)并用0.05M磷酸鉀緩沖液(pH7.0)洗脫以回收包含蛋白質(zhì)的級分。在10％-20％ SDS-PAGE上分析包含在每個級分中的蛋白質(zhì)。
類似于實施例8(2)，在組分A，組分B，組分C和用14C標(biāo)記的組合物(II)的存在下，加入和保持回收的級分而不是在實施例8(2)所述反應(yīng)溶液中的細(xì)胞粗提物。將保持以后的反應(yīng)溶液TLC分析以檢查對應(yīng)于用14C標(biāo)記的化合物(III)的斑點的強度。觀察到在上述SDS-PAGE中移動至47kDa位置的蛋白質(zhì)在依次加入的級分條帶的濃度方面具有平行于對應(yīng)于化合物(III)的斑點的強度波動的波動。從SDS-PAGE凝膠中回收所述蛋白質(zhì)和用胰蛋白酶消化。在質(zhì)譜儀(ThermoQuest Company，離子阱質(zhì)譜儀LCQ，柱LC Packings Company PepMap C18 75μm×150mm，溶劑A0.1％ HOAc-H2O，溶劑B0.1％ HOAc-甲醇，梯度從用95％溶劑A和5％溶劑B的混合物洗脫開始在30分鐘內(nèi)增加到100％溶劑B的濃度的線性梯度，流速0.2μl/分鐘)上分析獲得的消化物。結(jié)果，提供在SEQ ID NO22-34的每一個和任一個中表示的氨基酸序列。
實施例9淺灰鏈霉菌ATCC 11796的染色體DNA的制備在50ml YEME培養(yǎng)基(0.3％(w/v)酵母提取物，0.5％(w/v)細(xì)菌用蛋白胨，0.3％(w/v)麥芽汁，1.0％(w/v)葡萄糖，34％(w/v)蔗糖和0.2％(v/v)2.5MgCl2·6H2O)中將淺灰鏈霉菌ATCC 11796在30℃下振蕩溫育1天至3天。回收細(xì)胞。將獲得的細(xì)胞懸浮在包含1.4％(w/v)甘氨酸和60mM EDTA的YEME培養(yǎng)基中并進(jìn)一步振蕩溫育1天。從培養(yǎng)基中回收細(xì)胞。在用蒸餾水洗滌一次以后，以每200mg細(xì)胞1ml將它重懸浮在緩沖液(100mM Tris-HCl(pH8.0)，100mM EDTA，10mM NaCl)中。加入二百微克每毫升(200μg/ml)的卵清溶菌酶。將細(xì)胞混懸液在30℃下振蕩溫育1小時。另外，加入0.5％ SDS和1mg/ml蛋白酶K。將細(xì)胞混懸液在55℃下溫育3小時。用酚·氯仿·異戊醇萃取細(xì)胞混懸液2次以回收每個水層。接下來，用氯仿·異戊醇萃取一次以回收水層。通過乙醇沉淀水層獲得染色體DNA。
實施例10獲得編碼本發(fā)明DNA(A10)的DNA和在大腸桿菌中的表達(dá)(1)產(chǎn)生具有本發(fā)明DNA的轉(zhuǎn)化的大腸桿菌通過將在實施例9中從淺灰鏈霉菌ATCC 11796制備的染色體DNA用作模板和通過使用Expand High Fidelity PCR系統(tǒng)(Roche MolecularBiochemicals Company)進(jìn)行PCR。作為引物，使用具有SEQ ID NO79所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO80所示核苷酸序列的寡核苷酸的配對(以下稱為“引物對23”)或具有SEQ ID NO79所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO81所示核苷酸序列的寡核苷酸的配對(以下稱為“引物對24”)。通過加入2種每種總計300nM的引物，50ng上述染色體DNA，5.0μl dNTP混合物(4種dNTP每種2.0mM的混合物)，5.0μl 10x Expand HF緩沖液(包含MgCl2)和0.75μl Expand HiFi酶混合物和蒸餾水，PCR反應(yīng)溶液總計25μl。PCR的反應(yīng)條件是在保持在97℃ 2分鐘后；重復(fù)10個循環(huán)，一個循環(huán)包括保持在97℃ 15秒，接著65℃ 30秒，接著72℃ 2分鐘；然后進(jìn)行15個循環(huán)，一個循環(huán)包括保持在97℃ 15秒，接著68℃ 30秒，接著72℃ 2分鐘(其中每個循環(huán)增加保持在72℃下20秒)；然后保持在72℃ 7分鐘。在保持后，將反應(yīng)溶液進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳。從使用引物對23的反應(yīng)溶液進(jìn)行的凝膠中回收包含約1.2kbp DNA的凝膠區(qū)域。從使用引物對24的反應(yīng)溶液進(jìn)行的凝膠中回收包含約1.5kbp DNA的凝膠區(qū)域。通過按照附帶的說明書使用Qiagen快速凝膠提取試劑盒(Qiagen公司)從每個回收的凝膠中純化DNA。按照所述載體附帶的說明書將獲得的DNA連接到克隆載體pCR2.1-TOPO(Invitrogen公司)并導(dǎo)入大腸桿菌TOP10F’。使用Qiaprep Spin Miniprep試劑盒(Qiagen公司)從獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體中制備質(zhì)粒DNA。接下來，按照所述試劑盒附帶的說明書，使用作為引物的-21M13引物(AppliedBiosystems日本公司)，M13Rev引物(Applied Biosystems日本公司)，具有SEQ ID NO82所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO83所示核苷酸序列的寡核苷酸，用染料終止循環(huán)測序FS簡易反應(yīng)試劑盒(AppliedBiosystems日本公司)進(jìn)行測序反應(yīng)。測序反應(yīng)使用獲得的質(zhì)粒DNA作為模板。用DNA測序儀373A(Applied Biosystems日本公司)分析反應(yīng)產(chǎn)物?；诮Y(jié)果，將含有SEQ ID NO84所示核苷酸序列的質(zhì)粒命名為pCR11796和含有SEQ ID NO85所示核苷酸序列的質(zhì)粒命名為pCR11796F。在SEQ ID NO85中表示的所述核苷酸序列中存在兩個可讀框(ORF)。因此，包含由1221個核苷酸(包括終止密碼子)組成和編碼406個氨基酸殘基(在SEQ ID NO5中表示的氨基酸序列)的核苷酸序列(SEQ ID NO84)以及由210個核苷酸(包括終止密碼子)組成和編碼69個氨基酸殘基的核苷酸序列。
接下來，用限制酶NdeI和HindIII消化pCR11796和pCR11796F中的每一個。將消化產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。從進(jìn)行pCR11796消化產(chǎn)物的凝膠中切割包含約1.2kbp DNA的凝膠區(qū)域。從進(jìn)行pCR11796F消化產(chǎn)物的凝膠中切割包含約1.5kbp DNA的凝膠區(qū)域。通過按照附帶的說明書使用Qiagen快速凝膠提取試劑盒(Qiagen公司)從每個回收的凝膠中純化DNA。按照所述試劑盒附帶的說明書用連接試劑盒版本1(Takara ShuzoCompany)連接用NdeI和HindIII消化的每種獲得的DNA和質(zhì)粒pKSN2并導(dǎo)入大腸桿菌JM109。從獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體制備質(zhì)粒DNA。分析其結(jié)構(gòu)。將其中編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)(A10)的約1.2kbp DNA插入pKSN2的NdeI位點和HindIII位點之間、包含SEQ ID NO84所示核苷酸序列的質(zhì)粒命名為pKSN11796。另外，將其中編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)(A10)的約1.5kbp DNA插入pKSN2的NdeI位點和HindIII位點之間、包含SEQ ID NO85所示核苷酸序列的質(zhì)粒命名為pKSN11796F。將上述質(zhì)粒pKSN11796和pKSN11796F中的每一個導(dǎo)入大腸桿菌JM109。將獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體分別命名為JM109/pKSN11796和JM109/pKSN11796F。另外，將質(zhì)粒pKSN2導(dǎo)入大腸桿菌JM109。獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體命名為JM109/pKSN2。
(2)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A10)在大腸桿菌中的表達(dá)和所述蛋白質(zhì)的回收將大腸桿菌JM109/pKSN11796，JM109/pKSN11796F和JM109/pKSN2各自在37℃下在包含50μg/ml氨芐青霉素的10ml TB培養(yǎng)基(1.2％(w/v)胰蛋白胨，2.4％(w/v)酵母提取物，0.4％(w/v)甘油，17mM磷酸二氫鉀，72mM磷酸氫二鉀)中培養(yǎng)過夜。將一毫升(1ml)獲得的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至包含50μg/ml氨芐青霉素的100ml TB培養(yǎng)基中并在26℃下培養(yǎng)。當(dāng)OD660到達(dá)約0.5時，將5-氨基乙酰丙酸加至500μM的終濃度，繼續(xù)培養(yǎng)。三十(30)分鐘后，將IPTG加至1mM的終濃度，進(jìn)一步培養(yǎng)17小時。
從每個培養(yǎng)基中回收細(xì)胞，用0.1M tris-HCl緩沖液(pH7.5)洗滌和懸浮在10ml包含1mM PMSF的上述緩沖液中。將獲得的細(xì)胞混懸液在輸出量3，占空因數(shù)30％的條件下進(jìn)行超聲波儀(Sonifer(Branson SonicPower Company))6次，每次3分鐘，以便獲得細(xì)胞裂解液。在將細(xì)胞裂解液離心(1,200xg，5分鐘)后回收上清液和離心(150,000xg，70分鐘)以回收上清液級分(以下，將從大腸桿菌JM109/pKSN11796中獲得的上清液級分稱為“大腸桿菌pKSN11796提取物”，將從大腸桿菌JM109/pKSN11796F中獲得的上清液級分稱為“大腸桿菌pKSN11796F提取物”，將從大腸桿菌JM109/pKSN2中獲得的上清液級分稱為“大腸桿菌pKSN2提取物”)。在15％-25％ SDS-PAGE上分析一微升(1μl)上述上清液級分并用考馬斯藍(lán)(以下稱為“CBB”)染色。結(jié)果，在大腸桿菌pKSN11796提取物和大腸桿菌pKSN11796F提取物中都檢測到比大腸桿菌pKSN2提取物顯著更強烈的條帶，其位于對應(yīng)于45kDa分子量的電泳位置。在大腸桿菌pKSN11796F提取物中鑒定比在大腸桿菌pKSN11796提取物更強烈的條帶。顯示大腸桿菌JM109/pKSN11796F比大腸桿菌JM109/pKSN11796更高程度地表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A10)。
(3)將化合物(II)轉(zhuǎn)化為化合物(III)的能力的檢測制備30μl的反應(yīng)溶液并保持在30℃下10分鐘。反應(yīng)溶液由0.1M磷酸鉀緩沖液(pH7.0)組成，其包含3ppm用14C標(biāo)記的化合物(II)，2mMβ-NADPH(以下稱為“組分A”)(Oriental Yeast Company)，2mg/ml來源于菠菜的鐵氧還蛋白(以下稱為“組分B”)(Sigma Company)，0.1U/ml鐵氧還蛋白還原酶(以下稱為“組分C”)(Sigma Company)和18μl在實施例10(2)中回收的上清液級分。另外，類似地制備和保持未加入用于上述反應(yīng)溶液組合物中的、選自組分A，組分B和組分C的至少一種組分的反應(yīng)溶液。將三微升(3μl)2N HCl和90μl乙酸乙酯加入和混合到保持以后的每種反應(yīng)溶液中。在8,000xg下將產(chǎn)生的反應(yīng)溶液離心以回收75μl乙酸乙酯層。在減壓下干燥乙酸乙酯層以后，將殘余物溶解在6.0μl乙酸乙酯中。將其五微升(5.0μl)點到硅膠TLC板(TLC硅膠板60F25420cm×20cm，0.25mm厚，Merck公司)上。用氯仿，乙酸和乙酸乙酯的6∶1∶2的混合物展開TLC板約1小時。然后讓溶劑蒸發(fā)。將TLC板暴露于成像板(Fuji Film Company)過夜。接著，在Image Analyzer BAS2000(FujiFilm Company)上分析成像板。檢查對應(yīng)于用14C標(biāo)記的化合物(III)的斑點的存在(Rf值0.24和0.29)。結(jié)果在表10中顯示。
表10


實施例11獲得本發(fā)明DNA(A3)(1)磚紅色鏈霉菌ATCC 21469的染色體DNA的制備在50ml YEME培養(yǎng)基(0.3％(w/v)酵母提取物，0.5％(w/v)細(xì)菌用蛋白胨，0.3％(w/v)麥芽汁，1.0％(w/v)葡萄糖，34％(w/v)蔗糖和0.2％(v/v)2.5MgCl2·6H2O)中將磚紅色鏈霉菌ATCC 21469在30℃下振蕩溫育1天至3天?；厥占?xì)胞。將獲得的細(xì)胞懸浮在包含1.4％(w/v)甘氨酸和60mM EDTA的YEME培養(yǎng)基中并進(jìn)一步振蕩溫育1天。從培養(yǎng)基中回收細(xì)胞。在用蒸餾水洗滌一次以后，以每200mg細(xì)胞1ml將它重懸浮在緩沖液(100mM Tris-HCl(pH8.0)，100mM EDTA，10mM NaCl)中。加入二百微克每毫升(200μg/ml)的卵清溶菌酶。將細(xì)胞混懸液在30℃下振蕩1小時。另外，加入0.5％ SDS和1mg/ml蛋白酶K。將細(xì)胞混懸液在55℃下溫育3小時。用酚·氯仿·異戊醇萃取細(xì)胞混懸液2次以回收每個水層。接下來，用氯仿·異戊醇萃取一次以回收水層。通過乙醇沉淀水層獲得染色體DNA。
(2)本發(fā)明DNA(A3)的分離通過將在實施例11(1)中制備的染色體DNA用作模板進(jìn)行PCR。作為引物，使用具有SEQ ID NO65所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQID NO66所示核苷酸序列的寡核苷酸的配對(以下稱為“引物對9”)。通過加入250ng上述染色體DNA，2種每種總計200nM的引物，4μl dNTP混合物(4種dNTP每種2.5mM的混合物)，5μl 10x ExTaq緩沖液，0.5μlExTaq聚合酶(Takara Shuzo Company)和蒸餾水，PCR反應(yīng)溶液總計50μl。PCR的反應(yīng)條件是保持在97℃ 2分鐘；重復(fù)30個循環(huán)，一個循環(huán)包括保持在97℃ 15秒，接著60℃ 30秒，接著72℃ 90秒；然后保持在72℃ 4分鐘。在保持后，將反應(yīng)溶液進(jìn)行0.8％瓊脂糖凝膠電泳。回收包含約1.4kbp的DNA的凝膠區(qū)域。通過按照附帶的說明書使用QIA快速凝膠提取試劑盒(Qiagen公司)從回收的凝膠中純化DNA。按照所述載體附帶的說明書將獲得的DNA連接到TA克隆載體pCR2.1(Invitrogen公司)并導(dǎo)入大腸桿菌TOP10F’。使用QIAprep Spin Miniprep試劑盒(Qiagen公司)從獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體中制備質(zhì)粒DNA。按照所述試劑盒附帶的說明書，使用具有SEQ ID NO67所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO68所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物，用染料終止循環(huán)測序FS簡易反應(yīng)試劑盒(Applied Biosystems日本公司)進(jìn)行測序反應(yīng)。測序反應(yīng)使用獲得的質(zhì)粒作為模板。用DNA測序儀373A(Applied Biosystems日本公司)分析反應(yīng)產(chǎn)物。結(jié)果，提供在SEQ ID NO69中表示的核苷酸序列。在所述核苷酸序列中存在兩個可讀框(ORF)。因此，包含由1188個核苷酸(包括終止密碼子)組成和編碼395個氨基酸殘基的核苷酸序列以及由195個核苷酸(包括終止密碼子)組成和編碼64個氨基酸殘基的核苷酸序列(SEQID NO17)。由SEQ ID NO17所示核苷酸序列編碼的氨基酸序列的分子量據(jù)計算為6666Da。
實施例12本發(fā)明蛋白質(zhì)(A3)在大腸桿菌中的表達(dá)(1)含有本發(fā)明DNA(A3)的轉(zhuǎn)化大腸桿菌的產(chǎn)生通過將在實施例11(1)中制備的染色體DNA用作模板和通過使用ExTaq聚合酶(Takara Shuzo Company)在如上類似的條件下進(jìn)行PCR。作為引物，使用具有SEQ ID NO70所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO71所示核苷酸序列的寡核苷酸的配對(以下稱為“引物對10”)或具有SEQ ID NO70所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO72所示核苷酸序列的寡核苷酸的配對(以下稱為“引物對11”)。按照上述方法將通過使用引物對10擴(kuò)增的1.2kb DNA和使用引物對11擴(kuò)增的1.5kbDNA克隆到TA克隆載體pCR2.1中。使用QIAprep Spin Miniprep試劑盒(Qiagen公司)從獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體中制備質(zhì)粒DNA。按照所述試劑盒附帶的說明書，使用具有SEQ ID NO67所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO68所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物，用染料終止循環(huán)測序FS簡易反應(yīng)試劑盒(Applied Biosystems日本公司)進(jìn)行測序反應(yīng)。測序反應(yīng)使用獲得的質(zhì)粒DNA作為模板。用DNA測序儀373A(Applied Biosystems日本公司)分析反應(yīng)產(chǎn)物。結(jié)果，證實用引物對10擴(kuò)增的DNA克隆的質(zhì)粒含有SEQ ID NO8所示核苷酸序列。證實用引物對11擴(kuò)增的DNA克隆的質(zhì)粒含有SEQ ID NO11所示核苷酸序列。在SEQID NO11中顯示的所述核苷酸序列中存在兩個可讀框(ORF)。因此，包含由1188個核苷酸(包括終止密碼子)組成和編碼395個氨基酸殘基的核苷酸序列(SEQ ID NO8)以及由195個核苷酸(包括終止密碼子)組成和編碼64個氨基酸殘基的核苷酸序列。由SEQ ID NO8所示核苷酸序列編碼的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的分子量據(jù)計算為43752Da。至于獲得的質(zhì)粒，將含有SEQ ID NO8所示核苷酸序列的質(zhì)粒命名為pCR671和將含有SEQ ID NO11所示核苷酸序列的質(zhì)粒命名為pCR671F。
接下來，用限制酶NdeI和HindIII消化pCR671和pCR671F中的每一個。將消化產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。從進(jìn)行pCR671消化產(chǎn)物的凝膠中切割包含約1.2kbp DNA的凝膠區(qū)域。從進(jìn)行pCR671F消化產(chǎn)物的凝膠中切割包含約1.5kbp DNA的凝膠區(qū)域。通過按照附帶的說明書使用Qiagen快速凝膠提取試劑盒(Qiagen公司)從每個回收的凝膠中純化DNA。按照所述試劑盒附帶的說明書用連接試劑盒版本1(Takara Shuzo Company)連接用NdeI和HindIII消化的每種獲得的DNA和質(zhì)粒pKSN2并導(dǎo)入大腸桿菌JM109。從獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體制備質(zhì)粒DNA。分析其結(jié)構(gòu)。將其中編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)(A3)的約1200bp DNA插入pKSN2的NdeI位點和HindIII位點之間、包含SEQ ID NO8所示核苷酸序列的質(zhì)粒命名為pKSN671。另外，將其中編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)(A3)的約1400bp DNA插入pKSN2的NdeI位點和HindIII位點之間、包含SEQ ID NO11所示核苷酸序列的質(zhì)粒命名為pKSN671F。將上述質(zhì)粒pKSN671和pKSN671F中的每一個導(dǎo)入大腸桿菌JM109。將獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體分別命名為JM109/pKSN671和JM109/pKSN671F。另外，將質(zhì)粒pKSN2導(dǎo)入大腸桿菌JM109。獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體命名為JM109/pKSN2。
(2)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A3)在大腸桿菌中的表達(dá)和所述蛋白質(zhì)的回收將大腸桿菌JM109/pKSN671，JM109/pKSN671F和JM109/pKSN2各自在37℃下在包含50μg/ml氨芐青霉素的10ml TB培養(yǎng)基(1.2％(w/v)胰蛋白胨，2.4％(w/v)酵母提取物，0.4％(w/v)甘油，17mM磷酸二氫鉀，72mM磷酸氫二鉀)中培養(yǎng)過夜。將一毫升(1ml)獲得的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至包含50μg/ml氨芐青霉素的100ml TB培養(yǎng)基中并在26℃下培養(yǎng)。當(dāng)OD660到達(dá)約0.5時，將5-氨基乙酰丙酸加至500μM的終濃度，繼續(xù)培養(yǎng)。三十(30)分鐘后，將IPTG加至1mM的終濃度，進(jìn)一步培養(yǎng)17小時。
從每個培養(yǎng)基中回收細(xì)胞，用0.1M tris-HCl緩沖液(pH7.5)洗滌和懸浮在10ml包含1mM PMSF的所述緩沖液中。將獲得的細(xì)胞混懸液在輸出量3，占空因數(shù)30％的條件下進(jìn)行超聲波儀(Sonifer(Branson SonicPower Company))6次，每次3分鐘，以便獲得細(xì)胞裂解液。在將細(xì)胞裂解液離心(1,200xg，5分鐘)后回收上清液和離心(150,000xg，70分鐘)以回收上清液級分(以下，將從大腸桿菌JM109/pKSN671中獲得的上清液級分稱為“大腸桿菌pKSN671提取物”，將從大腸桿菌JM109/pKSN671F中獲得的上清液級分稱為“大腸桿菌pKSN671F提取物”，將從大腸桿菌JM109/pKSN2中獲得的上清液級分稱為“大腸桿菌pKSN2提取物”)。
(3)將化合物(II)轉(zhuǎn)化為化合物(III)的能力的檢測制備30μl的反應(yīng)溶液并保持在30℃下1小時。反應(yīng)溶液由0.1M磷酸鉀緩沖液(pH7.0)組成，其包含3ppm用14C標(biāo)記的化合物(II)，2mMβ-NADPH(以下稱為“組分A”)(Oriental Yeast Company)，2mg/ml來源于菠菜的鐵氧還蛋白(以下稱為“組分B”)(Sigma Company)，0.1U/ml鐵氧還蛋白還原酶(以下稱為“組分C”)(Sigma Company)和18μl在實施例12(2)中回收的上清液級分組成。另外，類似地制備和保持未加入用于上述反應(yīng)溶液組合物中的、選自組分A，組分B和組分C的至少一種組分的反應(yīng)溶液。將三微升(3μl)2N HCl和90μl乙酸乙酯加入和攪拌到保持以后的每種反應(yīng)溶液中。在8,000xg下將產(chǎn)生的反應(yīng)溶液離心以回收75μl乙酸乙酯層。在減壓下干燥乙酸乙酯層以后，將殘余物溶解在6.0μl乙酸乙酯中。將其五微升(5.0μl)點到硅膠TLC板(TLC硅膠板60F25420cm×20cm，0.25mm厚，Merck公司)上。用氯仿，乙酸和乙酸乙酯的6∶1∶2的混合物展開TLC板約1小時。然后讓溶劑蒸發(fā)。將TLC板暴露于成像板(Fuji Film Company)過夜。接著，在Image Analyzer BAS2000(Fuji Film Company)上分析成像板。檢查對應(yīng)于用14C標(biāo)記的化合物(III)的斑點的存在(Rf值0.24和0.29)。結(jié)果在表11中顯示。
表11

實施例13獲得本發(fā)明DNA(A9)(1)Streptomyces carbophilus SANK 62585的染色體DNA的制備在50ml YEME培養(yǎng)基(0.3％(w/v)酵母提取物，0.5％(w/v)細(xì)菌用蛋白胨，0.3％(w/v)麥芽汁，1.0％(w/v)葡萄糖，34％(w/v)蔗糖和0.2％(v/v)2.5MgCl2·6H2O)中將Streptomyces carbophilus SANK 62585(FERM BP-1145)在30℃下振蕩溫育1天。然后回收細(xì)胞。將獲得的細(xì)胞懸浮在包含1.4％(w/v)甘氨酸和60mM EDTA的YEME培養(yǎng)基中并進(jìn)一步振蕩溫育1天。從培養(yǎng)基中回收細(xì)胞。在用蒸餾水洗滌一次以后，以每200mg細(xì)胞1ml將它重懸浮在緩沖液(100mM Tris-HCl(pH8.0)，100mM EDTA，10mM NaCl)中。加入二百微克每毫升(200μg/ml)的卵清溶菌酶。將細(xì)胞混懸液在30℃下振蕩1小時。另外，加入0.5％ SDS和1mg/ml蛋白酶K。將細(xì)胞混懸液在55℃下溫育3小時。用酚·氯仿·異戊醇萃取細(xì)胞混懸液2次以回收每個水層。接下來，用氯仿·異戊醇萃取一次以回收水層。通過乙醇沉淀水層獲得染色體DNA。
(2)本發(fā)明DNA(A9)的分離通過將在實施例13(1)中制備的染色體DNA用作模板進(jìn)行PCR。作為引物，使用具有SEQ ID NO74所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO75所示核苷酸序列的寡核苷酸的配對(以下稱為“引物對12”)或具有SEQ ID NO76所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO77所示核苷酸序列的寡核苷酸的配對(以下稱為“引物對13”)。通過加入2種每種總計200nM的引物，250ng上述染色體DNA，4μl dNTP混合物(4種dNTP每種2.5mM的混合物)，5μl 10x ExTaq緩沖液，0.5μl ExTaq聚合酶(Takara Shuzo Company)和蒸餾水，PCR反應(yīng)溶液總計50μl。PCR的反應(yīng)條件是保持在95℃ 2分鐘；重復(fù)30個循環(huán)，一個循環(huán)包括保持在97℃ 15秒，接著60℃ 30秒，接著72℃ 90秒，然后保持在72℃ 4分鐘。在保持后，將反應(yīng)溶液進(jìn)行0.8％瓊脂糖凝膠電泳。從使用引物對12的PCR反應(yīng)溶液進(jìn)行的凝膠中回收包含約500bp的DNA的凝膠區(qū)域。從使用引物對13的PCR反應(yīng)溶液進(jìn)行的凝膠中回收包含約800bp的DNA的凝膠區(qū)域。通過按照附帶的說明書使用QIA快速凝膠提取試劑盒(Qiagen公司)從每個回收的凝膠中純化DNA。按照所述載體附帶的說明書將獲得的DNA連接到TA克隆載體pCR2.1(Invitrogen公司)并導(dǎo)入大腸桿菌TOP10F’。使用QIAprep Spin Miniprep試劑盒(Qiagen公司)從獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體中制備質(zhì)粒DNA。按照所述試劑盒附帶的說明書，使用具有SEQ ID NO67所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO68所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物，用染料終止循環(huán)測序FS簡易反應(yīng)試劑盒(Applied Biosystems日本公司)進(jìn)行測序反應(yīng)。測序反應(yīng)使用獲得的質(zhì)粒DNA作為模板。用DNA測序儀373A(Applied Biosystems日本公司)分析反應(yīng)產(chǎn)物。結(jié)果，通過使用引物對12的PCR獲得的DNA提供在SEQID NO78所示核苷酸序列的核苷酸1-498中表示的核苷酸序列。通過使用引物對13的PCR獲得的DNA提供在SEQ ID NO78所示核苷酸序列的核苷酸469-1233中表示的核苷酸序列。將含有在SEQ ID NO78中表示的核苷酸1-498的核苷酸序列的質(zhì)粒命名為pCRSCA1。將含有在SEQ IDNO78中表示的核苷酸469-1233的核苷酸序列的質(zhì)粒命名為pCRSCA2。
實施例14本發(fā)明蛋白質(zhì)(A9)在大腸桿菌中的表達(dá)(1)含有本發(fā)明DNA(A9)的轉(zhuǎn)化大腸桿菌的產(chǎn)生使用在實施例13(2)中獲得的質(zhì)粒，用NdeI和NcoI消化上述質(zhì)粒pCRSCA1并用NdeI和NcoI消化pCRSCA2。將消化產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。從pCRSCA2消化產(chǎn)物進(jìn)行的凝膠中切割包含約500bp DNA的凝膠區(qū)域。從pCRSCA2消化產(chǎn)物進(jìn)行的凝膠中切割包含約800bp DNA的凝膠區(qū)域。通過按照附帶的說明書使用QIA快速凝膠提取試劑盒(Qiagen公司)從每個回收的凝膠中純化DNA。按照所述試劑盒附帶的說明書用連接試劑盒版本1(Takara Shuzo Company)連接用NdeI和HindIII消化的兩種獲得的DNA和質(zhì)粒pKSN2并導(dǎo)入大腸桿菌JM109。從獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體中制備質(zhì)粒DNA。分析其結(jié)構(gòu)。將其中編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)(A9)的DNA插入pKSN2的NdeI位點和HindIII位點之間、包含SEQ ID NO78所示核苷酸序列的質(zhì)粒命名為pKSNSCA。
(2)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A9)在大腸桿菌中的表達(dá)和所述蛋白質(zhì)的回收將大腸桿菌JM109/pKSNSCA在37℃下在包含50μg/ml氨芐青霉素的10ml TB培養(yǎng)基(1.2％(w/v)胰蛋白胨，2.4％(w/v)酵母提取物，0.4％(w/v)甘油，17mM磷酸二氫鉀，72mM磷酸氫二鉀)中培養(yǎng)過夜。將獲得的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至包含50μg/ml氨芐青霉素的100ml TB培養(yǎng)基中并在26℃下培養(yǎng)以使OD660為0.2。當(dāng)OD660到達(dá)約2.0時，將5-氨基乙酰丙酸加至500μM的終濃度，繼續(xù)培養(yǎng)。三十(30)分鐘后，將IPTG加至200μM的終濃度，進(jìn)一步培養(yǎng)5小時。
從每個培養(yǎng)基中回收細(xì)胞，用0.1M tris-HCl緩沖液(pH7.5)洗滌和懸浮在10ml包含1mM PMSF的所述緩沖液中。將獲得的細(xì)胞混懸液在輸出量3，占空因數(shù)30％的條件下進(jìn)行超聲波儀(Sonifer(Branson SonicPower Company))6次，每次3分鐘，以便獲得細(xì)胞裂解液。在將細(xì)胞裂解液離心(1,200xg，5分鐘)后回收上清液和離心(150,000xg，70分鐘)以回收上清液級分(以下，將從大腸桿菌JM109/pKSNSCA中獲得的上清液級分稱為“大腸桿菌pKSNSCA提取物”)。
(3)將化合物(II)轉(zhuǎn)化為化合物(III)的能力的檢測制備30μl的反應(yīng)溶液并保持在30℃下10分鐘。反應(yīng)溶液由0.1M磷酸鉀緩沖液(pH7.0)組成，其包含3ppm用14C標(biāo)記的化合物(II)，2mMβ-NADPH(以下稱為“組分A”)(Oriental Yeast Company)，2mg/ml來源于菠菜的鐵氧還蛋白(以下稱為“組分B”)(Sigma Company)，0.1U/ml鐵氧還蛋白還原酶(以下稱為“組分C”)(Sigma Company)和18μl在實施例14(2)中回收的上清液級分。另外，類似地制備和保持未加入用于上述反應(yīng)溶液組合物中的、選自組分A，組分B和組分C的至少一種組分的反應(yīng)溶液。將三微升(3μl)2N HCl和90μl乙酸乙酯加入和攪拌到保持以后的每種反應(yīng)溶液中。在8,000xg下將產(chǎn)生的反應(yīng)溶液離心以回收75μl乙酸乙酯層。在減壓下干燥乙酸乙酯層以后，將殘余物溶解在6.0μl乙酸乙酯中。將其五微升(5.0μl)點到硅膠TLC板(TLC硅膠板60F25420cm×20cm，0.25mm厚，Merck公司)上。用氯仿，乙酸和乙酸乙酯的6∶1∶2的混合物展開TLC板約1小時。然后讓溶劑蒸發(fā)。將TLC板暴露于成像板(Fuji Film Company)過夜。接著，在Image Analyzer BAS2000(FujiFilm Company)上分析成像板。檢查對應(yīng)于用14C標(biāo)記的化合物(III)的斑點的存在(Rf值0.24和0.29)。結(jié)果在表12中顯示。
表12

實施例15大豆RuBPC基因的分離在播種大豆(cv.Jack)后，在27℃下培養(yǎng)大豆30天和收集葉子。用液氮冷凍十分之二克(0.2g)至0.3g收集的葉子并用研缽和杵磨碎。隨后，按照附帶的手冊使用RNA提取溶劑ISOGEN(Nippon Gene Company)從磨碎的產(chǎn)物中提取總RNA。進(jìn)一步，通過按照附帶的手冊進(jìn)行程序使用用于RT-PCR的Superscript第一條鏈合成系統(tǒng)(Invitrogen Company)合成cDNA。具體地，通過使用由試劑盒提供的寡(dT)12-18引物作為引物和總大豆RNA作為模板和通過向其中加入由試劑盒提供的逆轉(zhuǎn)錄酶合成第一條鏈cDNA。接下來，通過PCR擴(kuò)增編碼后面有成熟蛋白12個氨基酸的大豆(cv.Jack)核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(以下將核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶稱為“RuBPC”)小亞基葉綠體轉(zhuǎn)運肽的DNA(以下，大豆(cv.Jack)RuBPC小亞基葉綠體轉(zhuǎn)運肽有時稱為“rSt”；編碼后面有成熟蛋白12個氨基酸的大豆(cv.Jack)RuBPC小亞基葉綠體轉(zhuǎn)運肽的DNA稱為“本發(fā)明rSt12 DNA”)。PCR使用獲得的cDNA作為模板和具有SEQ ID NO86所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO87所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物。PCR使用LA Taq聚合酶(Takara Shuzo Company)。通過保持94℃ 3分鐘1次；進(jìn)行30個循環(huán)，一個循環(huán)包括保持98℃ 25秒和然后68℃ 1分鐘；和保持72℃ 10分鐘1次來進(jìn)行PCR。通過將擴(kuò)增的DNA插入質(zhì)粒pCR2.1(Invitrogen Company)PCR產(chǎn)物克隆位點中獲得質(zhì)粒pCRrSt12(圖5)。接下來，將質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌JM109菌株的感受態(tài)細(xì)胞中和選擇抗氨芐青霉素菌株。另外，通過使用染料終止循環(huán)測序FS簡易反應(yīng)試劑盒(PE Applied Biosystems Company)和DNA測序儀373S(PE Applied Biosystems Company)測定包含在所選抗氨芐青霉素菌株中的質(zhì)粒的核苷酸序列。結(jié)果，提供在SEQ ID NO88中表示的核苷酸序列。證實質(zhì)粒pCRrSt12包含本發(fā)明rSt12 DNA。
實施例16用于直接導(dǎo)入的包含本發(fā)明DNA(A1)的葉綠體表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建(1)本發(fā)明DNA(A1)的分離通過PCR擴(kuò)增包含SEQ ID NO6所示核苷酸序列的DNA。通過使用放線菌屬暗產(chǎn)色鏈霉菌IFO 12898的基因組DNA作為模板和通過使用由SEQ ID NO93所示核苷酸序列組成的寡核苷酸和由SEQ ID NO94所示核苷酸序列組成的寡核苷酸作為引物進(jìn)行PCR。另外，通過PCR擴(kuò)增包含SEQ ID NO9所示核苷酸序列的DNA。通過使用由SEQ ID NO93所示核苷酸序列組成的寡核苷酸和SEQ ID NO95所示寡核苷酸序列作為引物進(jìn)行PCR。所述PCR使用Expand High Fidelity PCR System(BoehringerCompany)。在保持97℃ 2分鐘1次以后；進(jìn)行10個循環(huán)，一個循環(huán)包括保持97℃ 15秒，接著60℃ 30秒和接著72℃ 1分鐘；然后進(jìn)行15個循環(huán)，一個循環(huán)包括保持97℃ 15秒，接著60℃ 30秒和接著72℃ 1分鐘(其中每個循環(huán)在72℃的保持增加20秒)；然后保持72℃ 7分鐘來進(jìn)行PCR。通過將擴(kuò)增的DNA插入pCR2.1(Invitrogen Company)的PCR產(chǎn)物克隆區(qū)域產(chǎn)生質(zhì)粒pCR657ET(圖6)和pCR657FET(圖7)。此外，除了使用由SEQ ID NO96所示核苷酸序列組成的寡核苷酸和由SEQ IDNO94所示核苷酸序列組成的寡核苷酸以外，以類似于上述方法的程序獲得質(zhì)粒pCR657Bs(圖8)。再進(jìn)一步，除了使用由SEQ ID NO96所示核苷酸序列組成的寡核苷酸和由SEQ ID NO97所示核苷酸序列組成的寡核苷酸以外，以類似于上述方法的程序獲得質(zhì)粒pCR657FBs(圖9)。接下來，將質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌DH 5α感受態(tài)細(xì)胞(Takara Shuzo Company)并選擇抗氨芐青霉素的細(xì)胞。另外，通過使用BigDye終止循環(huán)測序簡易反應(yīng)試劑盒2.0版(PE Applied Biosystems Company)和DNA測序儀3100(PE Applied Biosystems Company)測定包含在抗氨芐青霉素菌株中的質(zhì)粒的核苷酸序列。結(jié)果，證實質(zhì)粒pCR657ET和pCR657Bs含有SEQ ID NO6所示核苷酸序列。證實質(zhì)粒pCR657FET和pCR657FBs含有SEQ ID NO9所示核苷酸序列。
(2)用于直接導(dǎo)入的包含本發(fā)明DNA(A1)的葉綠體表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建-部分(1)構(gòu)建包含嵌合DNA的質(zhì)粒作為用基因槍法將本發(fā)明DNA(A1)導(dǎo)入植物的質(zhì)粒，所述嵌合DNA中本發(fā)明DNA(A1)緊接在編碼大豆(cv.Jack)RuBPC小亞基葉綠體轉(zhuǎn)運肽的核苷酸序列(以下有時稱為“編碼葉綠體轉(zhuǎn)運肽的序列”)之后而沒有密碼子框的變化。
首先，用限制酶HindIII和KpnI消化pCRrSt12。分離包含本發(fā)明rSt12DNA的DNA。另外，通過用限制酶HindIII和KpnI消化從質(zhì)粒載體pUC19(Takara Shuzo Company)中去除約40bp DNA獲得約2640bp的DNA。接下來，用牛小腸堿性磷酸酶(Takara Shuzo Company)將DNA的5’末端去磷酸化。向其中插入從pCRrSt12獲得的、包含本發(fā)明rSt12DNA的DNA，獲得pUCrSt12(圖10)。接下來，通過用限制酶EcoT22I和SacI消化質(zhì)粒pCR657ET和pCR657FET中的每一個分離包含本發(fā)明DNA(A1)的DNA。將獲得的DNA中的每一個插入pUCrSt12的EcoT22I限制位點和SacI限制位點之間以獲得包含嵌合DNA的質(zhì)粒pUCrSt657(圖11)和pUCrSt657F(圖12)，所述嵌合DNA中本發(fā)明DNA(A1)緊接在編碼大豆(cv.Jack)RuBPC小亞基葉綠體轉(zhuǎn)運肽的核苷酸序列之后而沒有密碼子框的變化。
用限制酶EcoRI消化pBICR16G6PT(在日本未審查的專利2000-166577中描述)以分離約3kb的DNA。(以下，將包含在上面日本未審查專利所述的DNA中的啟動子稱為“CR16G6啟動子”。另外，將包含在上面日本未審查專利所述的DNA中的終止子稱為“CR16G6終止子”。)在用限制酶EcoRI消化質(zhì)粒載體pUC19(Takara Shuzo Compnay)以后用牛小腸堿性磷酸酶(Takara Shuzo Company)將所述DNA的5’末端去磷酸化。向其中插入獲自pBICR16G6PT的3kb DNA以獲得質(zhì)粒pUCCR16G6-p/t(圖13)。用限制酶HindIII和ScaI消化pUCCR16G6-p/t以分離包含CR16G6啟動子的DNA。另外，通過用限制酶HindIII和EcoRI消化質(zhì)粒載體pUC19(Takara Shuzo Company)，去除51bp的DNA和獲得由2635bp組成的剩余DNA。接下來，用牛小腸堿性磷酸酶(Takara ShuzoCompany)將所述DNA的5’末端去磷酸化。向其中插入包含獲自pUCCR16G6-p/t的CR16G6啟動子的上述DNA和NotI-EcoRI接頭(圖14)以獲得pUCCR12G6-p/tΔ(圖15)，所述NotI-EcoRI接頭獲自將由SEQ IDNo89所示核苷酸序列組成的寡核苷酸和由SEQ ID No90所示核苷酸序列組成的寡核苷酸退火。用限制酶NdeI和EcoRI消化pUCCR12G6-p/tΔ以分離含有CR16t終止子的部分核苷酸序列的DNA。另外，用限制酶HindIII和EcoRI消化質(zhì)粒載體pUC19(Takara Shuzo Company)以獲得2635bp的DNA。用牛小腸堿性磷酸酶(Takara Shuzo Company)將所述DNA的5’末端去磷酸化。向其中插入具有獲自pUCCR12G6-p/tΔ的CR16t終止子的部分核苷酸序列的上述DNA和HindIII-NotI接頭(圖16)以獲得pNdG6-ΔT(圖17)，所述HindIII-NotI接頭獲自將由SEQ ID No91所示核苷酸序列組成的寡核苷酸和由SEQ ID No92所示核苷酸序列組成的寡核苷酸退火。
接下來，通過用限制酶BamHI和SacI消化質(zhì)粒pUCrSt657和pUCr657F中的每一個，分離包含嵌合DNA的DNA，在嵌合DNA中本發(fā)明DNA(A1)緊接在編碼大豆(cv.Jack)RuBPC小亞基葉綠體轉(zhuǎn)運肽的核苷酸序列之后而沒有密碼子框的變化。將DNA插入質(zhì)粒pNdG6-ΔT的BglII限制酶位點和SacI限制酶位點之間以獲得質(zhì)粒pSUM-NdG6-rSt-657(圖18)和質(zhì)粒pSUM-NdG6-rSt-657F(圖19)中的每一個。
(3)用于直接導(dǎo)入的具有本發(fā)明DNA(A1)的葉綠體表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建-部分(2)構(gòu)建包含嵌合DNA的質(zhì)粒作為用基因槍法將本發(fā)明DNA(A1)導(dǎo)入植物的質(zhì)粒，所述嵌合DNA中本發(fā)明DNA(A1)緊接在編碼大豆(cv.Jack)RuBPC小亞基葉綠體轉(zhuǎn)運肽和編碼其后成熟蛋白質(zhì)的12個氨基酸的核苷酸序列之后而沒有密碼子框的變化。首先，在用限制酶BspHI消化質(zhì)粒載體pKF19(Takara Shuzo Company)以后，通過使用KOD DNA聚合酶(Toyobo Corporation)將核苷酸加入雙鏈缺口將DNA末端平端化。通過用T4 DNA連接酶將得到的DNA自身環(huán)化獲得質(zhì)粒pKF19ΔBs。用限制酶HindIII和KpnI消化在實施例1中獲得的pCRrSt12。分離包含本發(fā)明rSt12DNA的DNA。用限制酶HindIII和KpnI消化質(zhì)粒pKF19ΔBs以獲得約2160bp的DNA。用牛小腸堿性磷酸酶(Takara Shuzo Company)將所述DNA的5’末端去磷酸化。向其中插入包含獲自pCRrSt12的本發(fā)明rSt12DNA的DNA以獲得pKFrSt12(圖20)。接下來，用限制酶BspHI和SacI消化在實施例16(1)中獲得的質(zhì)粒pCR657Bs和PCR657FBs中的每一個以分離包含本發(fā)明DNA(A1)的DNA。將這些DNA中的每一個插入質(zhì)粒pKFrSt12的BspHI限制位點和SacI限制位點之間以獲得質(zhì)粒pKFrSt12-657(圖21)和質(zhì)粒pKFrSt12-657F(圖22)，其包含嵌合DNA，在所述嵌合DNA中本發(fā)明DNA(A1)緊接在編碼大豆(cv.Jack)RuBPC小亞基葉綠體轉(zhuǎn)運肽和編碼其后成熟蛋白質(zhì)的12個氨基酸的核苷酸序列之后而沒有密碼子框的變化。
接下來，用BamHI和SacI消化質(zhì)粒pKFrSt12-657和pKFrSt12-657F中的每一個以獲得包含本發(fā)明DNA(A1)的DNA。將這些DNA中的每一個插入在實施例16(2)中獲得的質(zhì)粒pNdG6-ΔT的BglII限制位點和SacI限制位點之間，以獲得質(zhì)粒pSUM-NdG6-rSt12-657(圖23)和pSUM-NdG6-rSt12-657F(圖24)，其中嵌合DNA連接在啟動子CR16G6的下游，在所述嵌合DNA中本發(fā)明DNA(A1)緊接在編碼大豆(cv.Jack)RuBPC小亞基葉綠體轉(zhuǎn)運肽和編碼其后成熟蛋白質(zhì)的12個氨基酸的核苷酸序列之后而沒有密碼子框的變化。
實施例17將本發(fā)明DNA(A1)導(dǎo)入大豆(1)增殖體細(xì)胞胚的制備在將大豆(栽培品種Fayette和Jack)莢浸于1％次氯酸鈉溶液滅菌以后，取出未成熟種子。將種皮從種子上剝離以除去具有2-5mm直徑的未成熟胚。用解剖刀切割獲得的未成熟胚的胚軸以制備未成熟子葉。將未成熟子葉分成2個子葉部分。將每個子葉部分分別放于體細(xì)胞胚發(fā)育培養(yǎng)基中。體細(xì)胞胚發(fā)育培養(yǎng)基是固體培養(yǎng)基，其中將0.2％(w/v)脫乙酰吉蘭糖膠加入設(shè)定為pH7.0和其中加入已180μM 2，4-D和30g/L蔗糖的Murashige-Skoog培養(yǎng)基(在Murashige T.和Skoog F.，Physiol.Plant(1962)15，第473頁；以下稱為“MS培養(yǎng)基”)。在放置1個月以后，將形成的球形胚移植到體細(xì)胞胚生長培養(yǎng)基中。體細(xì)胞胚生長培養(yǎng)基是固體培養(yǎng)基，其中將0.2％(w/v)脫乙酰吉蘭糖膠加入設(shè)定為pH5.8和其中加入90μM 2，4-D和30g/L蔗糖的MS培養(yǎng)基。其后以2-3周的間隔將球形胚移植到新鮮的體細(xì)胞胚生長培養(yǎng)基中5-8次。使用上述體細(xì)胞胚發(fā)育培養(yǎng)基和體細(xì)胞胚生長培養(yǎng)基的各自培養(yǎng)條件是23小時光照和1小時黑暗和全天23-25℃。
(2)將基因?qū)朐鲋丑w細(xì)胞胚在將實施例17(1)所獲球形胚移植到新鮮的體細(xì)胞胚生長培養(yǎng)基中和培養(yǎng)2-3天以后，將球形胚用于導(dǎo)入基因。將質(zhì)粒pSUM-NdG6-rSt657，pSUM-NdG6-rSt657F，pSUM-NdG6-rSt12657和pSUM-NdG6-rSt12657F包被在直徑1.0μm的金顆粒上以進(jìn)行使用基因槍法的基因?qū)搿τ?mg金顆粒的質(zhì)粒的量為1.66μg。在導(dǎo)入基因后，將胚進(jìn)一步培養(yǎng)2-3天。培養(yǎng)條件各自為23小時光照和1小時黑暗和全天23-25℃。
(3)用潮霉素選擇體細(xì)胞胚將在實施例17(2)獲得的導(dǎo)入基因以后的球形胚移植到體細(xì)胞胚選擇培養(yǎng)基。體細(xì)胞胚選擇培養(yǎng)基是固體培養(yǎng)基，其中將0.2％(w/v)脫乙酰吉蘭糖膠和15mg/L潮霉素加入設(shè)定為pH5.8和其中已加入90μM2，4-D和30g/L蔗糖的MS培養(yǎng)基。此后以2-3周的間隔將存活的球形胚移植至新鮮的體細(xì)胞選擇培養(yǎng)基5-8次。在那時，體細(xì)胞胚選擇培養(yǎng)基是固體培養(yǎng)基，其中將0.2％(w/v)脫乙酰吉蘭糖膠和30mg/L潮霉素加入設(shè)定為pH5.8和其中加入90μM 2，4-D和30g/L蔗糖的MS培養(yǎng)基。使用上述體細(xì)胞胚選擇培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件各自為23小時光照和1小時黑暗和全天23-25℃。
(4)用化合物(II)選擇體細(xì)胞胚將在實施例17(2)獲得的導(dǎo)入基因以后的球形胚移植到體細(xì)胞胚選擇培養(yǎng)基。體細(xì)胞胚選擇培養(yǎng)基是固體培養(yǎng)基，其中將0.2％(w/v)脫乙酰吉蘭糖膠和0.1mg/L化合物(II)加入設(shè)定為pH5.8和其中已加入90μM2，4-D和30g/L蔗糖的MS培養(yǎng)基。此后以2-3周的間隔將存活的球形胚移植至新鮮的體細(xì)胞選擇培養(yǎng)基5-8次。在那時，體細(xì)胞胚選擇培養(yǎng)基是固體培養(yǎng)基，其中將0.2％(w/v)脫乙酰吉蘭糖膠和0.3-1mg/L化合物(II)加入設(shè)定為pH5.8和其中已加入90μM 2，4-D和30g/L蔗糖的MS培養(yǎng)基。使用上述體細(xì)胞胚選擇培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件各自為23小時光照和1小時黑暗和全天23-25℃。
(5)從體細(xì)胞胚的植物再生將在實施例17(3)或17(4)中選擇的球形胚移植到發(fā)育培養(yǎng)基中并在23小時光照和1小時黑暗和全天23-25℃下培養(yǎng)4周。發(fā)育培養(yǎng)基是固體培養(yǎng)基，其中將0.8％(w/v)瓊脂(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.，用于植物組織培養(yǎng))加入設(shè)定為pH5.8和其中已加入60g/L麥芽糖的MS培養(yǎng)基。其后6-8周獲得白色至黃色子葉類型的胚。將這些子葉類型的胚移植至發(fā)芽培養(yǎng)基中并培養(yǎng)2周。發(fā)芽培養(yǎng)基是固體培養(yǎng)基，其中將0.2％(w/v)脫乙酰吉蘭糖膠加入設(shè)定為pH5.8和其中已加入30g/L蔗糖的MS培養(yǎng)基。結(jié)果，可以獲得已經(jīng)長出葉子和具有根的大豆。
(6)再生植物的順應(yīng)和培養(yǎng)將在實施例17(5)中獲得的大豆移植到耕土并在23小時光照和1小時黑暗和全天23-25℃的孵化室中順應(yīng)。兩(2)周以后，將生根的植物轉(zhuǎn)移至直徑為9cm的盆中并在室溫下培養(yǎng)。在室溫下的培養(yǎng)條件是全天自然光23℃-25℃。兩至四(2-4)個月以后，收集大豆種子。
(7)對除草化合物(II)的抗性評估收集再生植物的葉子并沿主葉脈等分成2片。將化合物(II)散布在葉片之一的整個表面上。另一葉片留下未處理。將這些葉片放在包含0.8％瓊脂的MS培養(yǎng)基上并在室溫下放置于光線中7天。然后，用杵和研缽在5ml 80％丙酮水溶液中研磨每個葉片以提取葉綠素。用80％丙酮水溶液稀釋提取液10倍和按照Mackenney，G，J.Biol.Chem.(1941)140；第315頁所述方法在750nm，663nm和645nm下測量吸光度以計算總?cè)~綠素含量。通過顯示處理的葉片的總?cè)~綠素含量與未處理葉片的總?cè)~綠素含量的百分位數(shù)可以比較評估對化合物(II)的抗性的程度。
接著，將土壤填塞至直徑為10cm和深度為10cm的塑料盆中。播種上述植物的種子并在溫室中培養(yǎng)。通過混合5份化合物(II)，6份蘇乳播(sorpol)3005X(Toho化學(xué)品)和89份二甲苯制備乳劑。用包含0.1％(v/v)粘著劑的水以1公頃1000L的比例稀釋特定量的乳劑并用噴槍均勻地散布在來自上面在上述盆中培養(yǎng)的植物的葉子的所有面上。在溫室中培養(yǎng)植物16天后，研究對植物的損傷，評估對化合物(II)的抗性。
實施例18用于農(nóng)桿菌屬導(dǎo)入的具有本發(fā)明DNA(A1)的葉綠體表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建構(gòu)建用農(nóng)桿菌法將本發(fā)明DNA(A1)導(dǎo)入植物的質(zhì)粒。首先，在用限制酶NotI消化二元質(zhì)粒(binary plasmid)載體pBI121(ClontechCompany)以后，通過使用DNA聚合酶I(Takara Shuzo Corporation)將核苷酸加入雙鏈缺口將DNA末端平末端化。將T4 DNA連接酶用于自身環(huán)化。在用限制酶EcoRI消化獲得的質(zhì)粒以后，通過使用DNA聚合酶I(Takara Shuzo Corporation)將核苷酸加入雙鏈缺口將DNA末端平末端化。將T4DNA連接酶用于自身環(huán)化以獲得質(zhì)粒pBI121ΔNotIEcoRI。在用HindIII消化質(zhì)粒以后，用牛小腸堿性磷酸酶(Takara Shuzo Company)將獲得的DNA的5’DNA末端去磷酸化。向其中插入通過將由SEQ ID NO98所示核苷酸序列組成的寡核苷酸和由SEQ ID NO99所示核苷酸序列組成的寡核苷酸退火而獲得的HindIII-NotI-EcoRI接頭(圖25)。通過自身環(huán)化得到二元質(zhì)粒載體pBI121S(圖26)。所述質(zhì)粒具有HindIII-NotI-EcoRI接頭以其中HindIII限制位點，NotI限制位點，和EcoRI限制位點從接近β-葡糖醛酸酶的位置依次排列的方向插入的結(jié)構(gòu)。
接下來，用限制酶HindIII和EcoRI消化質(zhì)粒pSUM-NdG6-rSt-657和pSUM-NdG6-rSt-657F中的每一個，以從其每一個獲得嵌合DNA，其中本發(fā)明DNA(A1)緊接在編碼大豆(cv.Jack)RuBPC小亞基葉綠體轉(zhuǎn)運肽的核苷酸序列之后而沒有密碼子框的變化。將這些DNA插入上述二元質(zhì)粒載體pBI121S的HindIII限制位點和EcoRI限制位點之間以獲得質(zhì)粒pBI-NdG6-rSt-657(圖27)和pBI-NdG6-rSt-657F(圖28)。另外，將上述質(zhì)粒pSUM-NdG6-rSt12-657和pSUM-NdG6-rSt12-657F中的每一個用限制酶HindIII和EcoRI消化，以從每一個中獲得嵌合DNA，其中本發(fā)明DNA(A1)緊接在編碼大豆(cv.Jack)RuBPC小亞基葉綠體轉(zhuǎn)運肽和編碼其后成熟蛋白質(zhì)的12個氨基酸的核苷酸序列之后而沒有密碼子框的變化。將這些DNA插入上述二元質(zhì)粒載體pBI121S的HindIII限制位點和EcoRI限制位點之間以獲得質(zhì)粒pBI-NdG6-rSt12-657(圖29)和pBI-NdG6-rSt12-657F(圖30)。
實施例19將本發(fā)明DNA(A1)導(dǎo)入煙草使用在實施例18中獲得的質(zhì)粒pBI-NdG6-rSt-657，質(zhì)粒pBI-NdG6-rSt-657F，質(zhì)粒pBI-NdG6-rSt12-657和質(zhì)粒pBI-NdG6-rSt12-657F，用農(nóng)桿菌法將本發(fā)明DNA(A1)導(dǎo)入煙草。
首先，分別將質(zhì)粒pBI-NdG6-rSt-657，pBI-NdG6-rSt-657F，pBI-NdG6-rSt12-657和pBI-NdG6-rSt12-657F導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404(Clontech Company)。通過將產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化體在含有300mg/L鏈霉素，100mg/L利福平和25mg/L卡那霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基(0.5％酵母提取物，1.0％細(xì)菌用胰蛋白胨，0.5％ NaCl)中培養(yǎng)和通過選擇抗性克隆，分離含有pBI-NdG6-rSt-657，pBI-NdG6-rSt-657F，pBI-NdG6-rSt12-657或pBI-NdG6-rSt12-657F的轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌菌株。
然后，按照植物基因操作手冊(Hirofumi UCHIMIYA，Kodan-shaScientific，1992)所述方法，將基因?qū)霟煵?。將含有上述質(zhì)粒的農(nóng)桿菌屬菌株各自在28℃下在含有300mg/L鏈霉素，100mg/L利福平和25mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，然后將無菌培養(yǎng)的煙草的葉片浸入液體培養(yǎng)基中。種植葉片并在室溫下光照中在包含0.1mg/L萘乙酸和1.0mg/L芐氨基嘌呤的MS瓊脂培養(yǎng)基(MS無機(jī)鹽，MS維生素，3％蔗糖和0.8％瓊脂，在Murashige T.和Skoog F.，Physiol.Plant.(1962)15，第473頁中描述)中培養(yǎng)2天。然后，用無菌水洗滌葉片并在含有0.1mg/L萘乙酸，1.0mg/L芐氨基嘌呤和500mg/L頭孢噻肟的MS瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天。接下來，移植葉片并在含有0.1mg/L萘乙酸，1.0mg/L芐氨基嘌呤，500mg/L頭孢噻肟和100mg/L卡那霉素的MS瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)連續(xù)進(jìn)行4個月，同時以4周的間隔將葉片轉(zhuǎn)移至相同組成的新鮮培養(yǎng)基。在那時，移植從葉片發(fā)育的不固定的芽并生根于包含300mg/L頭孢噻肟和50mg/L卡那霉素的MS瓊脂培養(yǎng)基中以獲得再生體。將再生體移植并培育在包含50mg/L卡那霉素的MS瓊脂培養(yǎng)基中，以分別獲得其中已經(jīng)導(dǎo)入pBI-NdG6-rSt-657，pBI-NdG6-rSt-657F，pBI-NdG6-rSt12-657或pBI-NdG6-rSt12-657F的T-DNA區(qū)域的轉(zhuǎn)基因煙草。
另外，用農(nóng)桿菌法將在實施例18中獲得的質(zhì)粒pBI121S導(dǎo)入煙草。除了使用質(zhì)粒pBI121S而不是pBI-NdG6-rSt-657，pBI-NdG6-rSt-657F，pBI-NdG6-rSt12-657和pBI-NdG6-rSt12-657F以外，類似于上面分離含有pBI121S的轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌屬菌株。接下來，利用所述轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌屬，類似于上述獲得已經(jīng)導(dǎo)入質(zhì)粒pBI121S的T-DNA區(qū)域的轉(zhuǎn)基因煙草。
從轉(zhuǎn)基因煙草取三(3)片葉子。將每片葉子分成4片，其中每片5-7mm寬。將每片葉子種植到含有0.1mg/L化合物(II)的MS瓊脂培養(yǎng)基上并在光照中在室溫下培養(yǎng)。在培養(yǎng)的第7天，觀察每個葉片的除草損傷。來自導(dǎo)入對照DNA(質(zhì)粒pBI121S的T-DNA區(qū)域)的煙草的葉片變白和枯萎。與此對比，來自導(dǎo)入本發(fā)明DNA(A1)(質(zhì)粒pBI-NdG6-rSt-657，質(zhì)粒pBI-NdG6-rSt12-657，pBI-NdG6-rSt-657F或pBI-NdG6-rSt12-657F的T-DNA區(qū)域)的煙草的葉片連續(xù)生長。
實施例20將本發(fā)明DNA導(dǎo)入植物構(gòu)建用于以基因槍法和農(nóng)桿菌法導(dǎo)入本發(fā)明DNA(A2)的質(zhì)粒。首先，通過PCR擴(kuò)增具有SEQ ID NO7所示核苷酸序列的本發(fā)明DNA(A2)。通過將放線菌屬塔氏糖多孢菌JCM 9383t的基因組DNA用作模板和通過將由SEQ ID NO100所示核苷酸序列組成的寡核苷酸和由SEQ ID NO101所示核苷酸序列組成的寡核苷酸用作引物來進(jìn)行PCR。所述PCR使用Expand High Fidelity PCR System(Boehringer Company)。在保持97℃ 2分鐘1次以后；重復(fù)10個循環(huán)，一個循環(huán)包括保持97℃ 15秒，接著60℃ 30秒和接著72℃ 60秒；然后進(jìn)行15個循環(huán)，一個循環(huán)包括保持97℃ 15秒，接著60℃ 30秒和接著72℃ 1分鐘(其中每個循環(huán)在72℃的保持增加20秒)；和然后保持72℃ 7分鐘來進(jìn)行PCR。通過將擴(kuò)增的DNA插入pCR2.1-TOPO(Invitrogen Company)的PCR產(chǎn)物克隆區(qū)域產(chǎn)生質(zhì)粒pCR923Sp(圖31)。接下來，將質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞(TakaraShuzo Company)并選擇氨芐青霉素抗性細(xì)胞。另外，通過使用BigDye終止循環(huán)測序簡易反應(yīng)試劑盒2.0版(PE Applied Biosystems Company)和DNA測序儀373S(PE Applied Biosystems Company)測定包含在抗氨芐青霉素菌株中的質(zhì)粒的核苷酸序列。結(jié)果，證實質(zhì)粒pCR923Sp具有SEQ IDNO7所示核苷酸序列。
用限制酶BamHI和SacI消化在實施例16(3)中設(shè)計的質(zhì)粒pKFrSt12以分離包含本發(fā)明rSt12DNA的DNA。將所述DNA插入在實施例16(2)中獲得的pNdG6-ΔT的BglII限制位點和SacI限制位點之間以獲得質(zhì)粒pNdG6-rSt12(圖32)。用限制酶SphI和KpnI消化質(zhì)粒pCR923Sp以獲得包含本發(fā)明DNA(A2)的DNA。用限制酶SphI和KpnI消化質(zhì)粒pNdG6-rSt12以去除編碼大豆(cv.Jack)RuBPC小亞基成熟蛋白質(zhì)的12個氨基酸的DNA。在該位置，將包含從質(zhì)粒pCR923Sp獲得的本發(fā)明DNA(A2)的上述DNA插入以獲得pSUM-NdG6-rSt-923(圖33)，其中CR16G6啟動子已經(jīng)連接到嵌合DNA的下游，在所述嵌合DNA中所述DNA緊接在編碼大豆(cv.Jack)RuBPC小亞基葉綠體轉(zhuǎn)運肽的序列之后而沒有密碼子框的變化。
接下來，用限制酶SphI消化質(zhì)粒pCR923Sp。在用KOD DNA聚合酶將獲得的DNA平末端化以后，將所述DNA用限制酶KpnI進(jìn)一步消化以分離含有本發(fā)明DNA(A2)的DNA。用限制酶BspHI消化在實施例16(3)中產(chǎn)生的質(zhì)粒pKFrSt12。在用KOD DNA聚合酶將獲得的DNA平末端化以后，將所述DNA用限制酶KpnI進(jìn)一步消化以去除約20bp的DNA。在該處，將包含從質(zhì)粒pCR923Sp獲得的含本發(fā)明DNA(A2)的上述DNA插入以獲得包含嵌合DNA的質(zhì)粒pKFrSt12-923(圖34)，在所述嵌合DNA中本發(fā)明DNA(A2)緊接在編碼大豆(cv.Jack)RuBPC小亞基葉綠體轉(zhuǎn)運肽和編碼其后成熟蛋白質(zhì)的12個氨基酸的核苷酸序列之后而沒有密碼子框的變化。用限制酶SphI和KpnI消化pKFrSt12-923以獲得嵌合DNA，其中本發(fā)明DNA(A2)和編碼大豆(cv.Jack)RuBPC小亞基成熟蛋白的開始12個氨基酸的DNA連接。用限制酶SphI和KpnI消化質(zhì)粒pNdG6-rSt12以去除編碼大豆(cv.Jack)RuBPC小亞基成熟蛋白的12個氨基酸的DNA。在該位置，將獲自質(zhì)粒pKFrSt12-923的上述嵌合DNA插入以獲得質(zhì)粒pSUM-NdG6-rSt12-923(圖35)，其中CR16G6啟動子已經(jīng)從中連接到嵌合DNA的下游，在所述嵌合DNA中包含本發(fā)明DNA(A2)的所述DNA緊接在編碼大豆(cv.Jack)RuBPC小亞基葉綠體轉(zhuǎn)運肽和編碼其后成熟蛋白質(zhì)的12個氨基酸的序列之后而沒有密碼子框的變化。
使用獲得的質(zhì)粒pSUM-NdG6-rSt-923和pSUM-NdG6-rSt12-923，以與實施例17所述方法相同的程序用基因槍法將本發(fā)明DNA(A2)導(dǎo)入大豆。
用限制酶HindIII和EcoRI消化上述質(zhì)粒pSUM-NdG6-rSt-923以分離包含嵌合DNA的DNA，在所述嵌合DNA中包含本發(fā)明DNA(A2)的所述DNA緊接在編碼大豆(cv.Jack)RuBPC小亞基葉綠體轉(zhuǎn)運肽的序列之后而沒有密碼子框的變化。如在實施例18中產(chǎn)生pBI-NdG6-rSt657，將包含獲自質(zhì)粒pSUM-NdG6-rSt-923的嵌合DNA的上述DNA插入二元載體pBI121S的HindIII限制位點和EcoRI限制位點之間以獲得pBI-NdG6-rSt-923(圖36)。另外，用HindIII和EcoRI消化上述質(zhì)粒pSUM-NdG6-rSt12-923以分離包含嵌合DNA的DNA，在所述嵌合DNA中包含本發(fā)明DNA(A2)的所述DNA緊接在編碼大豆(cv.Jack)RuBPC小亞基葉綠體轉(zhuǎn)運肽和編碼其后成熟蛋白質(zhì)的12個氨基酸的序列之后而沒有密碼子框的變化。將獲自pSUM-NdG6-rSt12-923的嵌合DNA插入二元載體pBI121S的HindIII限制位點和EcoRI限制位點之間以獲得pBI-NdG6-rSt12-923(圖37)。
將質(zhì)粒pBI-NdG6-rSt-923和pBI-NdG6-rSt12-923中的每一個導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404。將產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)在包含300μg/ml鏈霉菌，100μg/ml利福平和25μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中。選擇轉(zhuǎn)化體以分離具有pBI-NdG6-rSt1-923或pBI-NdG6-rSt12-923的農(nóng)桿菌屬菌株。
用具有pBI-NdG6-rSt-923的農(nóng)桿菌屬菌株和具有pBI-NdG6-rSt12-923的農(nóng)桿菌屬菌株中的每一個感染無菌培養(yǎng)煙草的葉片。在類似于在實施例19中描述的方法的程序下獲得已經(jīng)導(dǎo)入本發(fā)明DNA(A2)的煙草。
從獲得的轉(zhuǎn)基因煙草中取三(3)片葉子。將每片葉子分成4片，其中每片5-7mm寬。將每片葉子種植到含有0.1mg/L化合物(II)的MS瓊脂培養(yǎng)基上并在光照中在室溫下培養(yǎng)。在培養(yǎng)的第7天，觀察每個葉片的除草損傷。來自導(dǎo)入對照DNA(質(zhì)粒pBI121S的T-DNA區(qū)域)的煙草的葉片變白和枯萎。與此對比，來自導(dǎo)入本發(fā)明DNA(A2)(質(zhì)粒pBI-NdG6-rSt-923或質(zhì)粒pBI-NdG6-rSt12-923的T-DNA區(qū)域)的煙草的葉片連續(xù)生長。
實施例21將本發(fā)明DNA(A3)導(dǎo)入煙草構(gòu)建以基因槍法和農(nóng)桿菌法將本發(fā)明DNA(A3)導(dǎo)入植物的質(zhì)粒。
首先，通過PCR擴(kuò)增具有SEQ ID NO8所示核苷酸序列的本發(fā)明DNA(A3)。通過將放線菌屬磚紅色鏈霉菌ATCC 21469的基因組DNA用作模板和通過將由SEQ ID NO102所示核苷酸序列組成的寡核苷酸和由SEQ ID NO103所示核苷酸序列組成的寡核苷酸用作引物來進(jìn)行PCR。所述PCR使用Expand High Fidelity PCR System(Boehringer Company)。在保持97℃ 2分鐘1次以后；重復(fù)10個循環(huán)，一個循環(huán)包括保持97℃ 15秒，接著60℃ 30秒和接著72℃ 1分鐘；然后進(jìn)行15個循環(huán)，一個循環(huán)包括保持97℃ 15秒，接著60℃ 30秒和接著72℃ 1分鐘(其中每個循環(huán)在72℃的保持增加20秒)；和然后保持72℃ 7分鐘來進(jìn)行PCR。通過將擴(kuò)增的DNA插入pCR2.1(Invitrogen Company)的PCR產(chǎn)物克隆區(qū)域產(chǎn)生質(zhì)粒pCR671ET(圖38)。另外，除了將由SEQ ID NO104所示核苷酸序列組成的寡核苷酸和由SEQ ID NO103所示核苷酸序列組成的寡核苷酸用作引物以外，以類似于上述方法的程序獲得質(zhì)粒pCR671Bs(圖39)。接下來，將質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞(Takara Shuzo Company)并選擇氨芐青霉素抗性細(xì)胞。另外，通過使用BigDye終止循環(huán)測序簡易反應(yīng)試劑盒2.0版(PE Applied Biosystems Company)和DNA測序儀3100(PE Applied Biosystems Company)測定包含在抗氨芐青霉素菌株中的質(zhì)粒的核苷酸序列。結(jié)果，證實質(zhì)粒pCR671ET和pCR671Bs具有SEQ ID NO8所示核苷酸序列。
用限制酶EcoT22I和KpnI消化質(zhì)粒pCR671ET以分離包含本發(fā)明DNA(A3)的DNA。將所述DNA插入EcoT22I限制位點和KpnI限制位點之間以獲得包含嵌合DNA的質(zhì)粒pUCrSt671(圖40)，在所述嵌合DNA中本發(fā)明DNA(A3)緊接在編碼大豆(cv.Jack)RuBPC小亞基葉綠體轉(zhuǎn)運肽的序列之后而沒有密碼子框的變化。用限制酶NheI和KpnI消化質(zhì)粒pUCrSt671以分離包含本發(fā)明DNA(A3)的DNA。用限制酶NheI和KpnI消化在實施例16(2)中獲得的質(zhì)粒pNdG6-rSt12以去除約80bp的DNA。在該位置，將上述包含獲自質(zhì)粒pUCrSt671的本發(fā)明DNA(A3)的DNA插入以獲得pSUM-NdG6-rSt-671(圖41)，其中CR16G6啟動子已經(jīng)連接到嵌合DNA的下游，在所述嵌合DNA中本發(fā)明DNA(A3)緊接在編碼大豆(cv.Jack)RuBPC小亞基葉綠體轉(zhuǎn)運肽的序列之后而沒有密碼子框的變化。
用限制酶BspHI和KpnI消化質(zhì)粒pCR671Bs以分離包含本發(fā)明DNA(A3)的DNA。將所述DNA插入在實施例16(3)中獲得的pKFrSt12的BspHI限制位點和KpnI限制位點之間以獲得包含嵌合DNA的質(zhì)粒pKFrSt12-671(圖42)，其中本發(fā)明DNA(A3)緊接在編碼大豆(cv.Jack)RuBPC小亞基葉綠體轉(zhuǎn)運肽和編碼其后成熟蛋白質(zhì)的12個氨基酸的序列之后而沒有密碼子框的變化。用限制酶NheI和KpnI消化在實施例20中獲得的質(zhì)粒pNdG6-rSt12以去除約80bp的DNA。在該處，插入上述包含獲自質(zhì)粒pKFrSt12-671的本發(fā)明DNA(A3)的DNA以獲得pSUM-NdG6-rSt12-671(圖43)，其中CR16G6啟動子已經(jīng)連接到嵌合DNA的下游，在所述嵌合DNA中本發(fā)明DNA(A3)緊接在編碼大豆(cv.Jack)RuBPC小亞基葉綠體轉(zhuǎn)運肽和編碼其后成熟蛋白質(zhì)的12個氨基酸的序列之后而沒有密碼子框的變化。
使用獲得的質(zhì)粒pSUM-NdG6-rSt-671和pSUM-NdG6-rSt12-671，以與實施例17所述方法相同的程序用基因槍法將本發(fā)明DNA(A3)導(dǎo)入大豆。
用限制酶HindIII和EcoRI消化上述質(zhì)粒pSUM-NdG6-rSt-671以分離嵌合DNA，在所述嵌合DNA中本發(fā)明DNA(A3)緊連在編碼大豆(cv.Jack)RuBPC小亞基葉綠體轉(zhuǎn)運肽的序列之后而沒有密碼子框的變化。將包含獲自質(zhì)粒pSUM-NdG6-rSt-671的嵌合DNA的上述DNA插入實施例18中獲得的二元載體質(zhì)粒pBI121S的HindIII限制位點和EcoRI限制位點之間以獲得pBI-NdG6-rSt-671(圖44)。另外，用限制酶HindIII和EcoRI消化上述質(zhì)粒pSUM-NdG6-rSt12-671以分離包含嵌合DNA的DNA，在所述嵌合DNA中包含本發(fā)明DNA(A3)的所述DNA緊接在編碼大豆(cv.Jack)RuBPC小亞基葉綠體轉(zhuǎn)運肽和編碼其后成熟蛋白質(zhì)的12個氨基酸的序列之后而沒有密碼子框的變化。將獲自質(zhì)粒pSUM-NdG6-rSt12-671的嵌合DNA插入二元質(zhì)粒載體pBI121S的HindIII限制位點和EcoRI限制位點之間以獲得pBI-NdG6-rSt12-671(圖45)。
將質(zhì)粒pBI-NdG6-rSt-671和pBI-NdG6-rSt12-671中的每一個導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404。將產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)在包含300μg/ml鏈霉菌，100μg/ml利福平和25μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中。選擇轉(zhuǎn)化體以分離具有pBI-NdG6-rSt-671或pBI-NdG6-rSt12-671農(nóng)桿菌菌株。
用具有pBI-NdG6-rSt-671的農(nóng)桿菌菌株和具有pBI-NdG6-rSt12-671的農(nóng)桿菌菌株中的每一個感染無菌培養(yǎng)煙草的葉片。在類似于在實施例19中描述的方法的程序下獲得已經(jīng)導(dǎo)入本發(fā)明DNA(A3)的煙草。
從轉(zhuǎn)基因煙草中取三(3)片葉子。將每片葉子分成4片，其中每片5-7mm寬。將每片葉子種植到含有0.1mg/L化合物(II)的MS瓊脂培養(yǎng)基上并在光照中在室溫下培養(yǎng)。在培養(yǎng)的第7天，觀察每個葉片的除草損傷。
實施例22本發(fā)明蛋白質(zhì)(B1)在大腸桿菌中的表達(dá)(1)含有本發(fā)明DNA(B1)的轉(zhuǎn)化大腸桿菌的產(chǎn)生通過將在實施例3(1)中從暗產(chǎn)色鏈霉菌IFO 12898制備的染色體DNA用作模板進(jìn)行PCR。通過加入300ng上述染色體DNA，4μl dNTP混合物(4種dNTP每種2.5mM的混合物)，5μl 10x ExTaq緩沖液，0.5ExTaq聚合酶(Takara Shuzo Company)，蒸餾水和具有SEQ ID NO105所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO53所示核苷酸序列的寡核苷酸每種200nM，PCR反應(yīng)溶液總計50μl。PCR的反應(yīng)條件是在保持在97℃ 2分鐘后；重復(fù)25個循環(huán)，一個循環(huán)包括保持在97℃ 15秒，接著60℃ 30秒，接著72℃ 90秒；然后保持72℃ 4分鐘。按照所述載體附帶的說明書將在保持后的反應(yīng)溶液和載體pCR2.1-TOPO(Invitrogen公司)連接并導(dǎo)入大腸桿菌TOP10F’。使用QIAprep Spin Miniprep試劑盒(Qiagen公司)從獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體中制備質(zhì)粒DNA。使用由SEQ IDNO67所示核苷酸序列組成的寡核苷酸和由SEQ ID NO68所示核苷酸序列組成的寡核苷酸作為引物，按照所述試劑盒附帶的說明書，用染料終止循環(huán)測序FS簡易反應(yīng)試劑盒(Applied Biosystems日本公司)進(jìn)行測序反應(yīng)。測序反應(yīng)使用獲得的質(zhì)粒DNA作為模板。用DNA測序儀373A(Applied Biosystems日本公司)分析反應(yīng)產(chǎn)物。基于結(jié)果，將具有SEQ IDNO15所示核苷酸序列的質(zhì)粒命名為pCR657FD。
接下來，用限制酶NdeI和HindIII消化pCR657FD。將消化產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。從凝膠中切割包含約200bp DNA的凝膠區(qū)域。通過按照附帶的說明書使用QIA快速凝膠提取試劑盒(Qiagen公司)從回收的凝膠中純化DNA。按照所述試劑盒附帶的說明書用連接試劑盒版本1(Takara Shuzo Company)連接用NdeI和HindIII消化的獲得的DNA和質(zhì)粒pKSN2并導(dǎo)入大腸桿菌JM109。從獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體制備質(zhì)粒DNA。分析其結(jié)構(gòu)。將其中編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)(B1)的約200bp DNA插入pKSN2的NdeI位點和HindIII位點之間、包含SEQ ID NO15所示核苷酸序列的質(zhì)粒命名為pKSN657FD。將質(zhì)粒pKSN657FD導(dǎo)入大腸桿菌JM109。將獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體命名為JM109/pKSN657FD。另外，將質(zhì)粒pKSN2導(dǎo)入大腸桿菌JM109。獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體命名為JM109/pKSN2。
(2)本發(fā)明蛋白質(zhì)(B1)在大腸桿菌中的表達(dá)和所述蛋白質(zhì)的回收將大腸桿菌JM109/pKSN657FD和大腸桿菌JM109/pKSN2各自在37℃下在包含50μg/ml氨芐青霉素的10ml TB培養(yǎng)基(1.2％(w/v)胰蛋白胨，2.4％(w/v)酵母提取物，0.4％(w/v)甘油，17mM磷酸二氫鉀，72mM磷酸氫二鉀)中培養(yǎng)過夜。將一毫升(1ml)獲得的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至包含50μg/ml氨芐青霉素的100ml TB培養(yǎng)基中并在26℃下培養(yǎng)。OD660到達(dá)約0.5以后三十(30)分鐘，將IPTG加至1mM的終濃度，進(jìn)一步培養(yǎng)20小時。
從每個培養(yǎng)基中回收細(xì)胞，用0.1M tris-HCl緩沖液(pH7.5)洗滌和懸浮在10ml包含1mM PMSF的所述緩沖液中。將獲得的細(xì)胞混懸液在輸出量3，占空因數(shù)30％的條件下進(jìn)行超聲波儀(Sonifer(Branson SonicPower Company))6次，每次3分鐘，以便獲得細(xì)胞裂解液。在將細(xì)胞裂解液離心(1,200xg，5分鐘)后回收上清液和離心(150,000xg，70分鐘)以回收上清液級分(以下，將從大腸桿菌JM109/pKSN657FD中獲得的上清液級分稱為“大腸桿菌pKSN657FD提取物”，將從大腸桿菌JM109/pKSN2中獲得的上清液級分稱為“大腸桿菌pKSN2提取物”)。在15％-25％ SDS-PAGE上分析一微升(1μl)上述上清液級分并用CBB染色。結(jié)果，在大腸桿菌pKSN657FD提取物中檢測到比大腸桿菌pKSN2提取物顯著更強烈的條帶，其位于對應(yīng)于7kDa分子量的電泳位置。顯示大腸桿菌JM109/pKSN657FD表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)(B1)。
(3)將本發(fā)明蛋白質(zhì)(B1)應(yīng)用于將化合物(II)轉(zhuǎn)化為化合物(III)的反應(yīng)體系制備30μl的反應(yīng)溶液并保持在30℃下10分鐘。反應(yīng)溶液由0.1M磷酸鉀緩沖液(pH7.0)組成，其包含3ppm用14C標(biāo)記的化合物(II)，2mMβ-NADPH(以下稱為“組分A”)(Oriental Yeast Company)，9μl在實施例22(2)中回收的大腸桿菌pKSN657FD提取物，0.1U/ml鐵氧還蛋白還原酶(以下稱為“組分C”)(Sigma Company)和15μl在實施例4(2)中回收的大腸桿菌pKSN657F提取物(以下稱為“組分D”)組成。另外，制備其中加入2mg/ml來源于菠菜的鐵氧還蛋白(以下稱為“組分B”)(Sigma Company)替代大腸桿菌pKSN657FD提取物的反應(yīng)溶液和不加任何東西替代大腸桿菌pKSN657FD提取物的反應(yīng)溶液。類似地保持這些反應(yīng)溶液。將三微升(3μl)2N HCl和90μl乙酸乙酯加入和混合到保持以后的每種反應(yīng)溶液中。在8,000xg下將產(chǎn)生的反應(yīng)溶液離心以回收75μl乙酸乙酯層。在減壓下干燥乙酸乙酯層以后，將殘余物溶解在6.0μl乙酸乙酯中。將其五微升(5.0μl)點到硅膠TLC板(TLC硅膠板60F25420cm×20cm，0.25mm厚，Merck公司)上。用氯仿，乙酸和乙酸乙酯的6∶1∶2的混合物展開TLC板約1小時。然后讓溶劑蒸發(fā)。將TLC板暴露于成像板(Fuji Film Company)過夜。接著，在Image Analyzer BAS2000(Fuji FilmCompany)上分析成像板。檢查對應(yīng)于用14C標(biāo)記的化合物(III)的斑點的存在(Rf值0.24和0.29)。結(jié)果在表13中顯示。
表13

實施例23本發(fā)明蛋白質(zhì)(B2)在大腸桿菌中的表達(dá)(1)含有本發(fā)明DNA(B2)的轉(zhuǎn)化大腸桿菌的產(chǎn)生通過將在實施例6(1)中從塔氏糖多孢菌JCM 9383t制備的染色體DNA用作模板進(jìn)行PCR。通過加入300ng上述染色體DNA，4μl dNTP混合物(4種dNTP每種2.5mM的混合物)，5μl 10x ExTaq緩沖液，0.5ExTaq聚合酶(Takara Shuzo Company)，蒸餾水和具有SEQ ID NO106所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO63所示核苷酸序列的寡核苷酸每種200nM，PCR反應(yīng)溶液總計50μl。PCR的反應(yīng)條件是在保持在97℃ 2分鐘后；重復(fù)25個循環(huán)，一個循環(huán)包括保持在97℃ 15秒，接著60℃ 30秒，接著72℃ 90秒；然后保持72℃ 4分鐘。按照所述載體附帶的說明書將在保持后的反應(yīng)溶液和載體pCR2.1-TOPO(Invitrogen公司)連接并導(dǎo)入大腸桿菌TOP10F’。使用QIAprep Spin Miniprep試劑盒(Qiagen公司)從獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體中制備質(zhì)粒DNA。使用由SEQ IDNO67所示核苷酸序列組成的寡核苷酸和由SEQ ID NO68所示核苷酸序列組成的寡核苷酸作為引物，按照所述試劑盒附帶的說明書，用染料終止循環(huán)測序FS簡易反應(yīng)試劑盒(Applied Biosystems日本公司)進(jìn)行測序反應(yīng)。測序反應(yīng)使用獲得的質(zhì)粒DNA作為模板。用DNA測序儀373A(Applied Biosystems日本公司)分析反應(yīng)產(chǎn)物?；诮Y(jié)果，將具有SEQ IDNO16所示核苷酸序列的質(zhì)粒命名為pCR923FD。
接下來，用限制酶NdeI和HindIII消化質(zhì)粒pCR923FD。將消化產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。從凝膠中切割包含約200bp DNA的凝膠區(qū)域。通過按照附帶的說明書使用QIA快速凝膠提取試劑盒(Qiagen公司)從回收的凝膠中純化DNA。按照所述試劑盒附帶的說明書用連接試劑盒版本1(Takara Shuzo Company)連接用NdeI和HindIII消化的獲得的DNA和質(zhì)粒pKSN2并導(dǎo)入大腸桿菌JM109。從獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體制備質(zhì)粒DNA。分析其結(jié)構(gòu)。將其中編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)(B2)的約200bp DNA插入pKSN2的NdeI位點和HindIII位點之間、包含SEQ ID NO16所示核苷酸序列的質(zhì)粒命名為pKSN923FD。將質(zhì)粒pKSN923FD導(dǎo)入大腸桿菌JM109。將獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體命名為JM109/pKSN923FD。另外，將質(zhì)粒pKSN2導(dǎo)入大腸桿菌JM109。獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體命名為JM109/pKSN2。
(2)本發(fā)明蛋白質(zhì)(B2)在大腸桿菌中的表達(dá)和所述蛋白質(zhì)的回收將大腸桿菌JM109/pKSN923FD和大腸桿菌JM109/pKSN2各自在37℃下在包含50μg/ml氨芐青霉素的10ml TB培養(yǎng)基(1.2％(w/v)胰蛋白胨，2.4％(w/v)酵母提取物，0.4％(w/v)甘油，17mM磷酸二氫鉀，72mM磷酸氫二鉀)中培養(yǎng)過夜。將一毫升(1ml)獲得的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至包含50μg/ml氨芐青霉素的100ml TB培養(yǎng)基中并在26℃下培養(yǎng)。OD660到達(dá)約0.5以后三十(30)分鐘，將IPTG加至1mM的終濃度，進(jìn)一步培養(yǎng)20小時。
從每個培養(yǎng)基中回收細(xì)胞，用0.1M tris-HCl緩沖液(pH7.5)洗滌和懸浮在10ml包含1mM PMSF的所述緩沖液中。將獲得的細(xì)胞混懸液在輸出量3，占空因數(shù)30％的條件下進(jìn)行超聲波儀(Sonifer(Branson SonicPower Company))6次，每次3分鐘，以便獲得細(xì)胞裂解液。在將細(xì)胞裂解液離心(1,200xg，5分鐘)后回收上清液和離心(150,000xg，70分鐘)以回收上清液級分(以下，將從大腸桿菌JM109/pKSN923FD中獲得的上清液級分稱為“大腸桿菌pKSN923FD提取物”，將從大腸桿菌JM109/pKSN2中獲得的上清液級分稱為“大腸桿菌pKSN2提取物”)。在15％-25％ SDS-PAGE上分析一微升(1μl)上述上清液級分并用CBB染色。通過在對應(yīng)于7kDa分子量的電泳位置在大腸桿菌pKSN923FD提取物中檢測比大腸桿菌pKSN2提取物顯著更強烈的條帶，可以證實大腸桿菌表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)(B2)。
(3)將本發(fā)明蛋白質(zhì)(B2)應(yīng)用于將化合物(II)轉(zhuǎn)化為化合物(III)的反應(yīng)體系制備30μ1的反應(yīng)溶液并保持在30℃下10分鐘。反應(yīng)溶液由0.1M磷酸鉀緩沖液(pH7.0)組成，其包含3ppm用14C標(biāo)記的化合物(II)，2mMβ-NADPH(以下稱為“組分A”)(Oriental Yeast Company)，9μl在實施例23(3)中回收的大腸桿菌pKSN923FD提取物，0.1U/ml鐵氧還蛋白還原酶(以下稱為“組分C”)(Sigma Company)和15μl在實施例4(2)中回收的大腸桿菌pKSN657F提取物(以下稱為“組分D”)。另外，制備其中加入2mg/ml來源于菠菜的鐵氧還蛋白(以下稱為“組分B”)(SigmaCompany)替代大腸桿菌pKSN923FD提取物的反應(yīng)溶液和不加任何東西替代大腸桿菌pKSN923FD提取物的反應(yīng)溶液。類似地保持這些反應(yīng)溶液。將三微升(3μl)2N HCl和90μl乙酸乙酯加入和混合到保持以后的每種反應(yīng)溶液中。在8,000xg下將產(chǎn)生的反應(yīng)溶液離心以回收75μl乙酸乙酯層。在減壓下干燥乙酸乙酯層以后，將殘余物溶解在6.0μl乙酸乙酯中。將其五微升(5.0μl)點到硅膠TLC板(TLC硅膠板60F25420cm×20cm，0.25mm厚，Merck公司)上。用氯仿，乙酸和乙酸乙酯的6∶1∶2的混合物展開TLC板約1小時。然后讓溶劑蒸發(fā)。將TLC板暴露于成像板(Fuji FilmCompany)過夜。接著，在Image Analyzer BAS2000(Fuji Film Company)上分析成像板。檢查對應(yīng)于用14C標(biāo)記的化合物(III)的斑點的存在(Rf值0.24和0.29)。通過證實化合物(III)在包括組分A，大腸桿菌pKSN923FD提取物，組分C和組分D的反應(yīng)中產(chǎn)生，可以證實在將化合物(II)轉(zhuǎn)化為化合物(III)的反應(yīng)體系中可以使用本發(fā)明蛋白質(zhì)(B2)代替來源于菠菜的鐵氧還蛋白。
實施例24本發(fā)明蛋白質(zhì)(B3)在大腸桿菌中的表達(dá)(1)具有本發(fā)明DNA(B3)的轉(zhuǎn)化大腸桿菌的產(chǎn)生除了將在實施例11(1)中從磚紅色鏈霉菌ATCC 21469制備的染色體DNA用作模板和將具有SEQ ID NO107所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO72所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物以外，類似于實施例23(1)所述方法進(jìn)行PCR。類似于實施例23(1)所述方法，使用獲得的反應(yīng)溶液獲得具有SEQ ID NO17所示核苷酸序列的質(zhì)粒pCR671FD。
接下來，利用所述質(zhì)粒，類似于實施例23(1)所述方法獲得其中將本發(fā)明DNA(B3)插入pKSN2的NdeI位點和HindIII位點之間的質(zhì)粒pKSN671FD。通過將質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌JM109，可以獲得具有本發(fā)明DNA(B3)的大腸桿菌JM109/pKSN671FD。
(2)本發(fā)明蛋白質(zhì)(B3)在大腸桿菌中的表達(dá)和所述蛋白質(zhì)的回收使用大腸桿菌JM109/pKSN671FD，類似于實施例23(2)所述方法回收上清液級分(以下稱為“大腸桿菌pKSN671FD級分”)。在15％-25％SDS-PAGE上分析一微升(1μl)上述上清液級分并用CBB染色。結(jié)果，通過在對應(yīng)于7kDa分子量的電泳位置在大腸桿菌pKSN671FD提取物中檢測比大腸桿菌pKSN2提取物顯著更強烈的條帶，可以證實大腸桿菌表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)(B3)。
(3)將本發(fā)明蛋白質(zhì)(B3)應(yīng)用于將化合物(II)轉(zhuǎn)化為化合物(III)的反應(yīng)體系除了使用在實施例24(2)中回收的大腸桿菌pKSN671FD提取物以外，類似于實施例23(3)所述方法證實對應(yīng)于用14C標(biāo)記的化合物(III)的斑點(Rf值0.24和0.29)。通過證實在包括組分A，大腸桿菌pKSN671FD提取物，組分C和組分D的反應(yīng)中產(chǎn)生化合物(III)，可以證實在將化合物(II)轉(zhuǎn)化為化合物(III)的反應(yīng)體系中可以使用本發(fā)明蛋白質(zhì)(B3)代替來源于菠菜的鐵氧還蛋白。
實施例25本發(fā)明蛋白質(zhì)(A4)的制備(1)細(xì)胞粗提物的制備將不產(chǎn)色鏈霉菌IFO 12735的冷凍原種加入大試管中的10ml A培養(yǎng)基(0.1％(w/v)葡萄糖，0.5％(w/v)胰蛋白胨，0.5％(w/v)酵母提取物，0.1％(w/v)磷酸氫二鉀，pH7.0)并在30℃下振蕩溫育1天以獲得預(yù)培養(yǎng)物。將八毫升(8ml)預(yù)培養(yǎng)物加入200ml A培養(yǎng)基中并在30℃下在500ml帶擋板的搖瓶中旋轉(zhuǎn)振蕩溫育2天。通過將產(chǎn)生的培養(yǎng)物離心(3,000xg，10分鐘)回收細(xì)胞沉淀。將這些細(xì)胞沉淀懸浮在包含100ppm化合物(II)的100ml B培養(yǎng)基(1％(w/v)葡萄糖，0.1％牛肉膏，0.2％(w/v)胰蛋白月示)中并在30℃下在500ml坂口燒瓶中往復(fù)振蕩溫育20小時。通過將2L產(chǎn)生的培養(yǎng)物離心(3,000g，10分鐘)回收細(xì)胞沉淀。用1L 0.1M磷酸鉀緩沖液(pH7.0)洗滌產(chǎn)生的細(xì)胞沉淀2次以提供136g細(xì)胞沉淀。
以1g細(xì)胞沉淀1ml-2ml將這些細(xì)胞沉淀懸浮在0.1M磷酸鉀緩沖液(pH7.0)中，向細(xì)胞混懸液中加入一毫摩爾(1mM)PMSF，5mM苯甲脒HCl，1mM EDTA，3μg/ml亮抑酶肽，3μg/ml抑胃酶肽和1mM二硫垂陶耳。通過用弗氏壓碎器(1000kg/cm2)(Ohtake Seisakusho)反復(fù)破裂混懸液2次獲得細(xì)胞裂解液。在將細(xì)胞裂解液離心(40,000xg，30分鐘)以后，回收上清液并在150,000xg下離心1小時以回收上清液(以下稱為“細(xì)胞粗提物”)。
(2)將化合物(II)轉(zhuǎn)化為化合物(III)的能力的測定制備由0.1M磷酸鉀緩沖液(pH7.0)組成的30μl反應(yīng)溶液，其包含3ppm用14C標(biāo)記的化合物(II)，2.4mM β-NADPH(以下稱為“組分A”)(Oriental Yeast Company)，0.5mg/ml來源于菠菜的鐵氧還蛋白(以下稱為“組分B”)(Sigma Company)，1U/ml鐵氧還蛋白還原酶(以下稱為“組分C”)(Sigma Company)和15μl在實施例25(1)中回收的細(xì)胞粗提物。將反應(yīng)溶液保持在30℃下1小時。另外，類似地制備和保持未加入用于上述反應(yīng)溶液組合物中的、選自組分A，組分B和組分C的至少一種組分的反應(yīng)溶液。將三微升(3μl)2N HCl和90μl乙酸乙酯加入和混合到保持以后的每種反應(yīng)溶液中。在8,000xg下將產(chǎn)生的反應(yīng)溶液離心以回收75μl乙酸乙酯層。在減壓下干燥乙酸乙酯層以后，將殘余物溶解在6.0μl乙酸乙酯中。將其五微升(5.0μl)點到硅膠TLC板(TLC硅膠板60F25420cm×20cm，0.25mm厚，Merck公司)上。用氯仿，乙酸和乙酸乙酯的6∶1∶2的混合物展開TLC板約1小時。然后讓溶劑蒸發(fā)。將TLC板暴露于成像板(Fuji Film Company)過夜。接著，在Image Analyzer BAS2000(Fuji FilmCompany)上分析成像板。檢查對應(yīng)于用14C標(biāo)記的化合物(III)的斑點的存在(Rf值0.24和0.29)。結(jié)果在表14中顯示。
表14

(3)細(xì)胞粗提物的分級分離將硫酸銨加入在實施例25(1)中獲得的細(xì)胞粗提物至45％飽和的量。在冰冷卻的條件下攪拌以后，通過在12,000xg下離心30分鐘回收上清液。在將硫酸銨加入獲得的上清液至55％飽和的量和在冰冷卻的條件下攪拌以后，通過在12,000xg下離心10分鐘回收沉淀。用12.5ml的20mM雙三丙烷緩沖液(pH7.0)溶解沉淀。將該溶液進(jìn)行PD10柱(AmershamPharmacia Company)和用20mM雙三丙烷緩沖液(pH7.0)洗脫以回收17.5ml包含蛋白質(zhì)的級分(以下稱為“45-55％硫酸銨級分”)。
(4)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A4)的分離將在實施例25(3)中制備的45-55％硫酸銨級分注射到HiLoad 26/10 QSepharose HP柱(Amersham Pharmacia Company)中。接下來，在100ml的20mM雙三丙烷緩沖液(pH7.0)流進(jìn)柱子以后，以線性梯度的NaCl(NaCl的梯度是0.004M/分鐘，NaCl濃度的范圍是0M-1M，流速為4ml/分鐘)流動20mM雙三丙烷緩沖液以分級回收在0.12M-0.16M的NaCl濃度下洗脫的30ml級分。進(jìn)一步，將回收的級分進(jìn)行PD10柱(AmershamPharmacia Biotech Company)和用20mM雙三丙烷緩沖液(pH7.0)洗脫以回收包含蛋白質(zhì)的級分。
將回收的級分進(jìn)行PD10柱(Amersham Pharmacia Biotech Company)，用緩沖液A(包含1.5mM NaCl的2mM磷酸鉀緩沖液，pH7.0)洗脫，以便回收包含蛋白質(zhì)的級分。接下來，將級分注射于Bio-Scale Ceramic羥磷灰石I型柱子CHT10-I(BioRad Company)中。將二十毫升(20ml)緩沖液A流進(jìn)柱子。隨后，緩沖液A和線性梯度的緩沖液B(包含0.03mMNaCl的100mM磷酸鉀緩沖液；線性梯度從100％緩沖液A開始在100分鐘期間增加至50％緩沖液B，流速為2ml/分鐘)一起流動以分級回收在4％-6％的緩沖液B的濃度下洗脫的級分。進(jìn)一步，將回收的級分進(jìn)行PD10柱(Amersham Pharmacia Biotech Company)并用0.05M磷酸鉀緩沖液(pH7.0)洗脫以回收包含蛋白質(zhì)的級分。
將類似量的包含2.0M硫酸銨的0.05M磷酸鉀緩沖液(pH7.0)加入和混合到回收的級分中。然后將回收的級分注射到1ml RESOURSE PHE柱(Amersham Pharmacia Biotech Company)中。在流動包含1M硫酸銨的5ml 0.05M磷酸鉀緩沖液(pH7.0)以后，0.05M磷酸鉀緩沖液(pH7.0)和線性梯度的硫酸銨(硫酸銨的濃度梯度是0.1M/分鐘，NaCl濃度的范圍是1M-0M，流速是2ml/分鐘)一起流動以分級回收在約0.4M-0.5M的硫酸銨濃度下洗脫的級分。在10％-20％ SDS-PAGE上分析在每個級分中包含的蛋白質(zhì)。
類似于實施例25(2)，代替實施例25(2)所述的反應(yīng)溶液中的細(xì)胞粗提物，在組分A，組分B，組分C和用14C標(biāo)記的組分(II)的存在下，加入和保持回收的級分。將保持以后的反應(yīng)溶液TLC分析以檢查對應(yīng)于用14C標(biāo)記的化合物(III)的斑點的強度。從凝膠中回收在上述SDS-PAGE中移動至約45kDa位置的所述蛋白質(zhì)并用蛋白質(zhì)測序儀(AppliedBiosystems Company，Procise 494HT，脈沖液相方法)進(jìn)行氨基酸序列分析以將N末端氨基酸序列測序。結(jié)果，提供在SEQ ID NO113中表示的氨基酸序列。
實施例26獲得本發(fā)明DNA(A4)(1)不產(chǎn)色鏈霉菌IFO 12735的染色體DNA的制備在50ml YEME培養(yǎng)基(0.3％(w/v)酵母提取物，0.5％(w/v)細(xì)菌用蛋白胨，0.3％(w/v)麥芽汁，1.0％(w/v)葡萄糖，34％(w/v)蔗糖和0.2％(v/v)2.5MgCl2·6H2O)中將不產(chǎn)色鏈霉菌IFO 12735在30℃下振蕩培養(yǎng)1天至3天?；厥占?xì)胞。將獲得的細(xì)胞懸浮在包含1.4％(w/v)甘氨酸和60mM EDTA的YEME培養(yǎng)基中并進(jìn)一步振蕩溫育1天。從培養(yǎng)基中回收細(xì)胞。在用蒸餾水洗滌一次以后，以每200mg細(xì)胞1ml將它重懸浮在緩沖液(100mM Tris-HCl(pH8.0)，100mM EDTA，10mM NaCl)中。加入二百微克每毫升(200μg/ml)的卵清溶菌酶。將細(xì)胞混懸液在30℃下振蕩1小時。另外，加入0.5％ SDS和1mg/ml蛋白酶K。將細(xì)胞混懸液在55℃下溫育3小時。用酚·氯仿·異戊醇萃取細(xì)胞混懸液2次以回收每個水層。接下來，用氯仿·異戊醇萃取一次以回收水層。通過乙醇沉淀水層獲得染色體DNA。
(2)不產(chǎn)色鏈霉菌IFO 12735的染色體DNA文庫的制備用3.2U限制酶Sau3AI在37℃下消化在實施例26(1)中制備的三十八微克(38μg)染色體DNA 60分鐘。用1％瓊脂糖凝膠電泳分離獲得的消化液。從凝膠中回收約2.0kbp的DNA。按照所述試劑盒附帶的說明書用QIA快速凝膠提取試劑盒(Qiagen公司)純化DNA并用乙醇沉淀濃縮以獲得20μl包含目標(biāo)DNA的溶液。將八微升(8μl)DNA溶液，100ng用限制酶BamHI消化和用去磷酸化處理的質(zhì)粒載體pUC118和16μl來自連接試劑盒第二版(Takara Shuzo Company)的溶液I混合和在16℃下保持3小時。使用連接溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，并涂布在包含50mg/L氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上以在37℃下培養(yǎng)過夜。從瓊脂培養(yǎng)基中回收獲得的菌落。提取質(zhì)粒。將獲得的質(zhì)粒稱為染色體DNA文庫。
(3)本發(fā)明DNA(A4)的分離通過將在實施例26(2)中制備的染色體DNA用作模板進(jìn)行PCR。作為引物，使用具有SEQ ID NO114所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO57所示核苷酸序列的寡核苷酸的配對?；赟EQ ID NO113所示氨基酸序列設(shè)計SEQ ID NO114所示核苷酸序列。將Expand HiFiPCR系統(tǒng)(Boehringer Manheim Company)用來制備反應(yīng)溶液。通過加入2.5μl上述染色體DNA文庫，2種每種總計7.5pmol的引物，0.2μl dNTP混合物(4種dNTP每種2mM的混合物)，0.2μl的10x緩沖液(包含MgCl2)，0.38μl Expand HiFi酶混合物和蒸餾水，PCR反應(yīng)溶液總計25μl。PCR的反應(yīng)條件是在保持在97℃ 2分鐘后，重復(fù)10個循環(huán)，一個循環(huán)包括保持在97℃ 15秒，接著65℃ 30秒，接著72℃ 1分鐘；然后進(jìn)行15個循環(huán)，一個循環(huán)包括保持在97℃ 15秒，接著65℃ 30秒，接著72℃ 1分鐘(其中每個循環(huán)保持在72℃增加20秒)；然后保持在72℃ 7分鐘。在保持后，將2.5μl反應(yīng)溶液用作模板溶液以進(jìn)行第二次PCR。作為引物，使用具有SEQ ID NO115所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO57所示核苷酸序列的寡核苷酸的配對。基于SEQ ID NO113所示氨基酸序列設(shè)計SEQ ID NO115所示核苷酸序列。類似于上述方法，將ExpandHiFi PCR系統(tǒng)(Boehringer Manheim Company)用來進(jìn)行PCR。將保持后的反應(yīng)溶液進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳?；厥瞻s800bp的DNA的凝膠區(qū)域。通過按照附帶的說明書使用QIA快速凝膠提取試劑盒(Qiagen公司)從回收的凝膠中純化DNA。按照所述載體附帶的說明書將獲得的DNA連接到TA克隆載體pCRII-TOPO(Invitrogen公司)并導(dǎo)入大腸桿菌TOP10F’。使用Qiagen Tip20(Qiagen公司)從獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體中制備質(zhì)粒DNA。按照所述試劑盒附帶的說明書，使用具有SEQ ID NO67所示核苷酸序列的引物和使用具有SEQ ID NO68所示核苷酸序列的引物，用Big Dye終止循環(huán)測序FS簡易反應(yīng)試劑盒(Applied Biosystems日本公司)進(jìn)行測序反應(yīng)。測序反應(yīng)使用獲得的質(zhì)粒作為模板。用DNA測序儀3100(Applied Biosystems日本公司)分析反應(yīng)產(chǎn)物。結(jié)果，提供在SEQ ID NO110中表示的核苷酸序列的核苷酸57至832所示的核苷酸序列。在提供的核苷酸序列中，SEQ ID NO110所示核苷酸序列的核苷酸58-60編碼SEQ ID NO113所示氨基酸序列的氨基酸20。
接下來，在上述條件下，將在實施例26(2)中制備的染色體DNA文庫用作模板用Expand HiFi PCR系統(tǒng)(Boehringer Manheim Company)進(jìn)行PCR。作為引物，使用具有SEQ ID NO116所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO59所示核苷酸序列的寡核苷酸的引物配對。將約1.4kb的擴(kuò)增的DNA克隆到克隆載體pCRII-TOPO中。利用Qiagen Tip20(Qiagen Company)從獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體中制備質(zhì)粒DNA。按照所述試劑盒附帶的說明書，使用具有SEQ ID NO67所示核苷酸序列的引物和使用具有SEQ ID NO68所示核苷酸序列的引物，用Big Dye終止循環(huán)測序FS簡易反應(yīng)試劑盒(Applied Biosystems日本公司)進(jìn)行測序反應(yīng)。測序反應(yīng)使用獲得的質(zhì)粒作為模板。用DNA測序儀3100(Applied Biosystems日本公司)分析反應(yīng)產(chǎn)物。結(jié)果，提供在SEQ ID NO110中表示的核苷酸序列的核苷酸1至58所示的核苷酸序列。
進(jìn)行從SEQ ID NO110所示核苷酸序列的核苷酸832表示的核苷酸3’末端延伸下游的DNA的克隆。具體地，用200U限制酶HincII在37℃下過夜消化在實施例26(1)中制備的13μg不產(chǎn)色鏈霉菌IFO 12735染色體DNA。在酚提取后，通過乙醇沉淀純化DNA。將獲得的DNA用來產(chǎn)生20μl水溶液。將其四微升(4μl)，1.9μl的15μM基因組步行連接物(Genome Walker Adaptor)，1.6μl 10x連接緩沖液和0.5μl 6U/μl T4連接酶混合和在16℃下保持過夜。其后，保持70℃ 5分鐘和加入72μl蒸餾水以提供基因組步行(Genome Walker)文庫。通過將所述文庫用作模板進(jìn)行PCR。通過加入1μl基因組步行文庫和每個總計200nM的引物AP1(Universal Genome Walker試劑盒提供)和具有SEQ ID NO117所示核苷酸序列的寡核苷酸，加入1μl dNTP混合物(4種dNTP每種10mM的混合物)，10μl的5x GC基因組PCR緩沖液，2.2μl 25mM Mg(OAc)2，10μl5M GC-Melt和1μl Advantage-GC基因組聚合酶混合物和加入蒸餾水，提供總計50μl的PCR反應(yīng)溶液。PCR的反應(yīng)條件是在保持在95℃ 1分鐘后；進(jìn)行7個循環(huán)，一個循環(huán)包括保持在94℃ 10秒，然后72℃ 3分鐘；36個循環(huán)，一個循環(huán)包括保持94℃ 10秒和然后68℃ 3分鐘；和保持68℃ 7分鐘。用蒸餾水將保持后的反應(yīng)溶液稀釋50倍。將該PCR產(chǎn)物稱為第一PCR產(chǎn)物并用作模板來進(jìn)行另一PCR。通過加入1μl第一PCR產(chǎn)物和每個總計200nM的引物AP2(Universal Genome Walker試劑盒提供)和具有SEQ ID NO118所示核苷酸序列的寡核苷酸，加入1μl dNTP混合物(4種dNTP每種10mM的混合物)，10μl的5x GC基因組PCR緩沖液，2.2μl 25mM Mg(OAc)2，10μl 5M GC-Melt和1μl Advantage-GC基因組聚合酶混合物和加入蒸餾水，提供總計50μl的PCR反應(yīng)溶液。PCR的反應(yīng)條件是在保持在95℃ 1分鐘后；進(jìn)行5個循環(huán)，一個循環(huán)包括保持在94℃ 10秒，然后72℃ 3分鐘；20個循環(huán)，一個循環(huán)包括保持94℃ 10秒和然后68℃ 3分鐘；和保持68℃ 7分鐘。將保持以后的反應(yīng)溶液進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳?；厥瞻s1300bp的DNA的凝膠區(qū)域。通過按照附帶的說明書使用QIA快速凝膠提取試劑盒(Qiagen公司)從回收的凝膠中純化DNA。按照所述載體附帶的說明書將獲得的DNA連接到克隆載體pCRII-TOPO(Invitrogen公司)并導(dǎo)入大腸桿菌TOP10F’。使用QiagenTip20(Qiagen公司)從大腸桿菌轉(zhuǎn)化體中制備質(zhì)粒DNA。按照所述試劑盒附帶的說明書，使用SEQ ID NO67所示的寡核苷酸和SEQ ID NO68所示的寡核苷酸作為引物，用Big Dye終止循環(huán)測序FS簡易反應(yīng)試劑盒(Applied Biosystems日本公司)進(jìn)行測序反應(yīng)。測序反應(yīng)使用獲得的質(zhì)粒作為模板。用DNA測序儀3100(Applied Biosystems日本公司)分析反應(yīng)產(chǎn)物。結(jié)果，提供在SEQ ID NO110中表示的核苷酸序列的核苷酸644至1454所示的核苷酸序列。作為將所有分析的核苷酸連接的結(jié)果，提供在SEQ ID NO110中表示的核苷酸序列。在所述核苷酸序列中存在兩個可讀框(ORF)。因此，包含由1236個核苷酸(包括終止密碼子)組成和編碼411個氨基酸殘基(SEQ ID NO108)的核苷酸序列(SEQ ID NO109)以及由192個核苷酸(包括終止密碼子)組成和編碼63個氨基酸殘基(SEQID NO111)的核苷酸序列(SEQ ID NO112)。由SEQ ID NO109所不核苷酸序列編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO108)組成的蛋白質(zhì)的分子量據(jù)計算為45465Da。另外，由所述核苷酸序列編碼的氨基酸序列包含從本發(fā)明蛋白質(zhì)(A4)的N末端氨基酸測序所測定的氨基酸序列(SEQ ID NO113)。由SEQ ID NO112所示核苷酸序列編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO111)組成的蛋白質(zhì)的分子量據(jù)計算為6871Da。
實施例27本發(fā)明蛋白質(zhì)(A4)在大腸桿菌中的表達(dá)(1)具有本發(fā)明DNA(A4)的轉(zhuǎn)化大腸桿菌的產(chǎn)生通過將在實施例26(1)中從不產(chǎn)色鏈霉菌IFO 12735制備的染色體DNA用作模板和通過使用Expand HiFi PCR System(Boehringer ManheimCompany)進(jìn)行PCR。作為引物，使用具有SEQ ID NO119所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO120所示核苷酸序列的寡核苷酸的配對(以下稱為“引物對25”)或具有SEQ ID NO119所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO121所示核苷酸序列的寡核苷酸的配對(以下稱為“引物對26”)。通過加入2種每種總計300nM的引物，50ng上述染色體DNA，5.0μl dNTP混合物(4種dNTP每種2.0mM的混合物)，5.0μl 10x Expand HF緩沖液(包含MgCl2)和0.75μl Expand HiFi酶混合物和蒸餾水，PCR反應(yīng)溶液總計50μl。PCR的反應(yīng)條件是在保持在97℃2分鐘后；重復(fù)10個循環(huán)，一個循環(huán)包括保持在97℃ 15秒，接著60℃ 30秒，接著72℃ 1分鐘；然后進(jìn)行15個循環(huán)，一個循環(huán)包括保持在97℃ 15秒，接著60℃ 30秒，接著72℃ 1分鐘(其中每個循環(huán)增加20秒保持在72℃)；然后保持在72℃ 7分鐘。在保持后，將反應(yīng)溶液進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳。從經(jīng)歷使用引物對25的反應(yīng)溶液的凝膠回收包含約1.3kbp的DNA的凝膠區(qū)域。從經(jīng)歷使用引物對26的反應(yīng)溶液的凝膠中回收包含約1.6kbp的DNA的凝膠區(qū)域。通過按照附帶的說明書使用QIA快速凝膠提取試劑盒(Qiagen公司)從每個回收的凝膠中純化DNA。按照所述載體附帶的說明書將獲得的DNA連接到克隆載體pCRII-TOPO(Invitrogen公司)并導(dǎo)入大腸桿菌TOP10F’。使用Qiagen Tip20(Qiagen公司)從獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體中制備質(zhì)粒DNA。接下來，按照所述試劑盒附帶的說明書，使用SEQ ID NO67，SEQ ID NO68，SEQ ID NO122和SEQ ID NO123所示寡核苷酸作用引物，用Big Dye終止循環(huán)測序FS簡易反應(yīng)試劑盒(Applied Biosystems日本公司)進(jìn)行測序反應(yīng)。測序反應(yīng)使用獲得的質(zhì)粒DNA作為模板。用DNA測序儀3100(Applied Biosystems日本公司)分析反應(yīng)產(chǎn)物。基于結(jié)果，將具有SEQ ID NO109所示核苷酸序列的質(zhì)粒命名為pCR646和將具有SEQ ID NO110所示核苷酸序列的質(zhì)粒命名為pCR646F。
接下來，用限制酶NdeI和HindIII消化質(zhì)粒pCR646和pCR646F中的每一個。將消化產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。從進(jìn)行pCR646消化產(chǎn)物的凝膠中切割包含約1.3kbp DNA的凝膠區(qū)域。從進(jìn)行pCR646F消化產(chǎn)物的凝膠中切割包含約1.6kbp DNA的凝膠區(qū)域。通過按照附帶的說明書使用QIA快速凝膠提取試劑盒(Qiagen公司)從每個回收的凝膠中純化DNA。按照所述試劑盒附帶的說明書用連接試劑盒版本1(Takara ShuzoCompany)連接用NdeI和HindIII消化的每種獲得的DNA和質(zhì)粒pKSN2并導(dǎo)入大腸桿菌JM109。從獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體制備質(zhì)粒DNA。分析其結(jié)構(gòu)。將其中編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)(A4)的約1.3kbp DNA插入pKSN2的NdeI位點和HindIII位點之間、包含SEQ ID NO109所示核苷酸序列的質(zhì)粒命名為pKSN646。另外，將其中編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)(A4)的約1.6kbp DNA插入pKSN2的NdeI位點和HindIII位點之間、包含SEQ ID NO110所示核苷酸序列的質(zhì)粒命名為pKSN646F。將上述質(zhì)粒pKSN646和pKSN646F中的每一個導(dǎo)入大腸桿菌JM109。將獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體分別命名為JM109/pKSN646和JM109/pKSN646F。另外，將質(zhì)粒pKSN2導(dǎo)入大腸桿菌JM109。獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體命名為JM109/pKSN2。
(2)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A4)在大腸桿菌中的表達(dá)和所述蛋白質(zhì)的回收將大腸桿菌JM109/pKSN646，JM109/pKSN646F和JM109/pKSN2各自在37℃下在包含50μg/ml氨芐青霉素的10ml TB培養(yǎng)基(1.2％(w/v)胰蛋白胨，2.4％(w/v)酵母提取物，0.4％(w/v)甘油，17mM磷酸二氫鉀，72mM磷酸氫二鉀)中培養(yǎng)過夜。將一毫升(1ml)獲得的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至包含50μg/ml氨芐青霉素的100ml TB培養(yǎng)基中并在26℃下培養(yǎng)。當(dāng)OD660到達(dá)約0.5時，將5-氨基乙酰丙酸加至500μM的終濃度，繼續(xù)培養(yǎng)。三十(30)分鐘后，將IPTG加至1mM的終濃度，進(jìn)一步培養(yǎng)17小時。
從每個培養(yǎng)基中回收細(xì)胞，用0.1M tris-HCl緩沖液(pH7.5)洗滌和懸浮在10ml包含1mM PMSF的上述緩沖液中。將獲得的細(xì)胞混懸液在輸出量3，占空因數(shù)30％的條件下進(jìn)行超聲波儀(Sonifer(Branson SonicPower Company))6次，每次3分鐘，以便獲得細(xì)胞裂解液。在將細(xì)胞裂解液離心(1,200xg，5分鐘)后回收上清液和離心(150,000xg，70分鐘)以回收上清液級分(以下，將從大腸桿菌JM109/pKSN646中獲得的上清液級分稱為“大腸桿菌pKSN646提取物”，將從大腸桿菌JM109/pKSN646F中獲得的上清液級分稱為“大腸桿菌pKSN646F提取物”，將從大腸桿菌JM109/pKSN2中獲得的上清液級分稱為“大腸桿菌pKSN2提取物”)。在15％-25％ SDS-PAGE上分析一微升(1μl)上述上清液級分并用CBB染色。結(jié)果，通過在大腸桿菌pKSN646提取物和大腸桿菌pKSN646F提取物中都檢測到比大腸桿菌pKSN2提取物顯著更強烈的條帶，其位于對應(yīng)于45kDa分子量的電泳位置，可以證實本發(fā)明蛋白質(zhì)(A4)在大腸桿菌中表達(dá)。
(3)將化合物(II)轉(zhuǎn)化為化合物(III)的能力的檢測制備30μl的反應(yīng)溶液并保持在30℃下10分鐘。反應(yīng)溶液由0.1M磷酸鉀緩沖液(pH7.0)組成，其包含3ppm用14C標(biāo)記的化合物(II)，2mMβ-NADPH(以下稱為“組分A”)(Oriental Yeast Company)，2mg/ml來源于菠菜的鐵氧還蛋白(以下稱為“組分B”)(Sigma Company)，0.1U/ml鐵氧還蛋白還原酶(以下稱為“組分C”)(Sigma Company)和18μl在實施例27(2)中回收的上清液級分。另外，類似地制備和保持未加入用于上述反應(yīng)溶液組合物中的、選自組分A，組分B和組分C的至少一種組分的反應(yīng)溶液。將三微升(3μl)2N HCl和90μl乙酸乙酯加入和混合到保持以后的每種反應(yīng)溶液中。在8,000xg下將產(chǎn)生的反應(yīng)溶液離心以回收75μl乙酸乙酯層。在減壓下干燥乙酸乙酯層以后，將殘余物溶解在6.0μl乙酸乙酯中。將其五微升(5.0μl)點到硅膠TLC板(TLC硅膠板60F25420cm×20cm，0.25mm厚，Merck公司)上。用氯仿，乙酸和乙酸乙酯的6∶1∶2的混合物展開TLC板約1小時。然后讓溶劑蒸發(fā)。將TLC板暴露于成像板(Fuji Film Company)過夜。接著，在Image Analyzer BAS2000(FujiFilm Company)上分析成像板。檢查對應(yīng)于用14C標(biāo)記的化合物(III)的斑點的存在(Rf值0.24和0.29)?？梢宰C實化合物(III)在包含組分A，組分B，組分C和大腸桿菌pKSN646提取物的反應(yīng)溶液中，或在包含組分A，組分B，組分C和大腸桿菌pKSN646F的反應(yīng)溶液中的生產(chǎn)。
實施例28與本發(fā)明蛋白質(zhì)相關(guān)的序列同一性通過使用GENETYX-WIN第五版(Software Development Company)分析與本發(fā)明蛋白質(zhì)和本發(fā)明DNA相關(guān)的序列同一性。通過用Lipman-Pearson法(Lipman，D.J.和Pearson，W.R.，Science，227，1435-1441，(1985))進(jìn)行同源性分析產(chǎn)生對比。
關(guān)于本發(fā)明蛋白質(zhì)(A1)至(A4)的氨基酸序列，確定彼此之間和對最高同源性的已知蛋白質(zhì)的序列同一性。結(jié)果在表15中表示。
表15

*序列同一性在頂部顯示，提供的蛋白質(zhì)在Entrez數(shù)據(jù)庫(由生物技術(shù)信息中心提供，http//www3.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/)中的登記號在底部顯示。
關(guān)于具有SEQ ID NO6所示核苷酸序列的本發(fā)明DNA(A1)的核苷酸序列，具有SEQ ID NO7所示核苷酸序列的本發(fā)明DNA(A2)的核苷酸序列，具有SEQ ID NO8所示核苷酸序列的本發(fā)明DNA(A3)的核苷酸序列和具有SEQ ID NO109所示核苷酸序列的本發(fā)明DNA(A4)的核苷酸序列，確定彼此之間和對最高同源性的已知基因的序列同一性。結(jié)果在表16中表示。
表16


*序列同一性在頂部顯示，提供的基因在Entrez數(shù)據(jù)庫(由生物技術(shù)信息中心提供，http//www3.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/)中的登記號在底部顯示。
關(guān)于本發(fā)明蛋白質(zhì)(B1)至(B4)的氨基酸序列，確定彼此之間和對最高同源性的已知蛋白質(zhì)的序列同一性。結(jié)果在表17中表示。
表17


*序列同一性在頂部顯示，提供的蛋白質(zhì)在Entrez數(shù)據(jù)庫(由生物技術(shù)信息中心提供，http//www3.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/)中的登記號在底部顯示。
關(guān)于具有SEQ ID NO15所示核苷酸序列的本發(fā)明DNA(B1)的核苷酸序列，具有SEQ ID NO16所示核苷酸序列的本發(fā)明DNA(B2)的核苷酸序列，具有SEQ ID NO17所示核苷酸序列的本發(fā)明DNA(B3)的核苷酸序列和具有SEQ ID NO112所示核苷酸序列的本發(fā)明DNA(B4)的核苷酸序列，確定彼此之間和對最高同源性的已知基因的序列同一性。結(jié)果在表18中表示。
表18


*序列同一性在頂部顯示，提供的基因在Entrez數(shù)據(jù)庫(由生物技術(shù)信息中心提供，http//www3.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/)中的登記號在底部顯示。
實施例29使用具有本發(fā)明DNA(A)的部分核苷酸序列的寡核苷酸作為引物的PCR通過將在實施例2中制備的暗產(chǎn)色鏈霉菌IFO 12898的染色體DNA；在實施例5中制備的塔氏糖多孢菌JCM 9383t的染色體DNA；在實施例9中制備的淺灰鏈霉菌ATCC 11796的染色體DNA；在實施例11中制備的磚紅色鏈霉菌ATCC 21469的染色體DNA；在實施例26中制備的不產(chǎn)色鏈霉菌IFO 12735的染色體DNA中的每一個；和類似于實施例2所述方法制備的灰褐鏈霉菌IFO 12870t的染色體DNA，熱淡天藍(lán)鏈霉菌IFO14273t和黑胡桃鏈霉菌IFO 13445中的每一個用作模板進(jìn)行PCR。作為引物，使用表19所示5對引物。在表19中顯示通過使用基于SEQ ID NO6的核苷酸序列的每個引物對的PCR擴(kuò)增的DNA的預(yù)測大小。
表19

通過加入200nM表19所示配對2條引物中每一種，加10ng染色體DNA，0.5μl dNTP混合物(4種dNTP每種10mM的混合物)，5μl 5xGC基因組PCR緩沖液，1.1μl 25mM Mg(OAc)2，5μ1 5M GC-Melt和0.5μlAdvantage-GC基因組聚合酶混合物和加蒸餾水，PCR反應(yīng)溶液總計25μl。反應(yīng)條件是保持在95℃ 1分鐘；重復(fù)30個循環(huán)，一個循環(huán)包括保持在94℃ 15秒，接著60℃ 30秒，接著72℃ 1分鐘；和保持在72℃ 5分鐘。用3％瓊脂糖凝膠電泳分析保持后的每種反應(yīng)溶液。結(jié)果在圖46中和表20和表21中顯示。在使用引物對14，15，16，17和18中每一個或全部的情形中以及在使用從任一菌株制備的染色體DNA作為模板的情形中觀察到預(yù)測大小DNA的擴(kuò)增。
表20


*“+”表示預(yù)測大小的DNA被檢測到，“-”表示沒有檢測到。
表21


*“+”表示預(yù)測大小的DNA被檢測到，“-”表示沒有檢測到。
實施例30使用由本發(fā)明DNA(A)的部分核苷酸序列和本發(fā)明DNA(A)組成的DNA作為探針的雜交(1)探針制備作為用洋地黃毒苷標(biāo)記的探針(DIG標(biāo)記的探針)生產(chǎn)由本發(fā)明DNA(A1)的部分核苷酸序列或本發(fā)明DNA(A1)的部分核苷酸序列組成的DNA。通過將在實施例3中制備的暗產(chǎn)色鏈霉菌IFO 12898的染色體DNA用作模板和通過將由SEQ ID NO93所示核苷酸序列組成的寡核苷酸和由SEQ ID NO94所示核苷酸序列組成的寡核苷酸用作引物，按照附帶的手冊使用PCR DIG探針合成試劑盒(Roche Diagnostics GmbH Company)進(jìn)行PCR。通過加入2種引物每一種總計200nM，加50ng染色體DNA，2.5μl dNTP混合物(4種dNTP每種2.0mM的混合物)，2.5μl PCR DIG混合物(用DIG標(biāo)記的4種dNTP每種2.0mM的混合物)，5μl 10xPCR緩沖液和0.75μl Expand HiFi酶混合物和加蒸餾水，PCR反應(yīng)溶液總計50μl。反應(yīng)條件是在保持在95℃ 2分鐘以后；重復(fù)10個循環(huán)，一個循環(huán)包括保持在95℃ 10秒，接著60℃ 30秒，接著72℃ 2分鐘；然后進(jìn)行15個循環(huán)，一個循環(huán)包括保持在95℃ 10秒，接著60℃ 30秒，接著72℃ 2分鐘(其中每個循環(huán)保持在72℃增加20秒)；然后保持在72℃ 7分鐘。將保持后的反應(yīng)溶液進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果，證實約1.3kb的DNA的擴(kuò)增?；厥諗U(kuò)增的DNA以獲得用洋地黃毒苷標(biāo)記和具有SEQ ID NO6所示核苷酸序列的DNA。在類似方法下，通過將暗產(chǎn)色鏈霉菌IFO 12898的染色體DNA用作模板和通過將由SEQ ID NO130所示核苷酸序列組成的寡核苷酸和由SEQ ID NO131所示核苷酸序列組成的寡核苷酸用作引物進(jìn)行PCR。將通過所述PCR擴(kuò)增的DNA回收以獲得用洋地黃毒苷標(biāo)記和具有SEQ ID NO6所示核苷酸序列的核苷酸57-730表示的核苷酸序列的DNA。
在類似方法下，通過將在實施例6中制備的塔氏糖多孢菌JCM 9393t的染色體DNA用作模板和通過將由SEQ ID NO61所示核苷酸序列組成的寡核苷酸和由SEQ ID NO62所示核苷酸序列組成的寡核苷酸用作引物進(jìn)行PCR?；厥胀ㄟ^所述PCR擴(kuò)增的DNA以獲得用洋地黃毒苷標(biāo)記和具有SEQ ID NO7所示核苷酸序列的DNA。
另外，在類似的方法下，通過將在實施例11中制備的磚紅色鏈霉菌ATCC 21469的染色體DNA用作模板和通過將由SEQ ID NO70所示核苷酸序列組成的寡核苷酸和由SEQ ID NO71所示核苷酸序列組成的寡核苷酸用作引物進(jìn)行PCR?；厥胀ㄟ^所述PCR擴(kuò)增的DNA以獲得用洋地黃毒苷標(biāo)記和具有SEQ ID NO8所示核苷酸序列的DNA。另外，通過將上述染色體DNA用作模板和通過將由SEQ ID NO132所示核苷酸序列組成的寡核苷酸和由SEQ ID NO133所示核苷酸序列組成的寡核苷酸用作引物進(jìn)行PCR?；厥胀ㄟ^所述PCR擴(kuò)增的DNA以獲得用洋地黃毒苷標(biāo)記和具有SEQ ID NO8所示核苷酸序列的核苷酸21-691表示的核苷酸序列的DNA。
(2)斑點雜交將在實施例4中制備的pKSN657的DNA(包含本發(fā)明DNA(A1)的DNA)，在實施例7中制備的pKSN923的DNA(包含本發(fā)明DNA(A2)的DNA)，在實施例12中制備的pKSN671的DNA(包含本發(fā)明DNA(A3)的DNA)，在實施例14中制備的pKSNSCA的DNA(包含本發(fā)明DNA(A9)的DNA)和在實施例10中制備的pKSN11796的DNA(包含本發(fā)明DNA(A10)的DNA)中的每一個以100ng和10ng的量印跡到尼龍膜HybondN+(Amersham Pharmacia Company)上。用透射儀將紫外光指向獲得的膜5分鐘。
按照附帶的手冊將DIG-High Prime DNA標(biāo)記和檢測Starter試劑盒II(Roche Diagnostics GmbH Company)用于雜交和檢測。作為探針，使用用洋地黃毒苷標(biāo)記和在實施例30(1)中生產(chǎn)的DNA中的每一個，其在100℃保持5分鐘和然后快速在冰中冷卻(以下稱為“DIG標(biāo)記的探針”)。將印跡的上述膜在42℃下在所述試劑盒提供的2.0ml DIGEasyHyb中振蕩30分鐘。接下來，將2.0ml Dig Easy Hyb，5.0μl DIG標(biāo)記的探針和膜密封到塑料袋中以雜交，并保持在42℃下18小時。回收膜，在室溫下在包含0.1％ SDS的2x SSC中振蕩2次5分鐘，然后在65℃下在包含0.1％ SDS的0.5x SSC中振蕩2次15分鐘。隨后，將膜在50ml洗滌緩沖液中振蕩2分鐘，然后在室溫下在50ml封閉液中振蕩30分鐘，然后在2.0ml抗體溶液中振蕩30分鐘，然后在50ml洗滌緩沖液中振蕩2次15分鐘。另外，在50ml檢測緩沖液中振蕩5分鐘以后，將膜密封在含有2.0ml顯色底物的雜交袋中并保持在室溫下18小時。在用10ng和100ng pKSN657，pKSN923，pKSN671，pKSNSCA和pKSN11796中每一個的每種試劑進(jìn)行雜交的每種情形中檢測到信號。
實施例31獲得本發(fā)明DNA(A11)(1)黑胡桃鏈霉菌IFO 13445的染色體DNA的制備在50ml YGY培養(yǎng)基(0.5％(w/v)酵母提取物，0.5％(w/v)胰蛋白胨，0.1％(w/v)葡萄糖和0.1％(w/v)K2HPO4，pH7.0)中將黑胡桃鏈霉菌IFO 13445在30℃下振蕩培養(yǎng)3天?；厥占?xì)胞。將獲得的細(xì)胞懸浮在包含1.4％(w/v)甘氨酸和60mM EDTA的YGY培養(yǎng)基中并進(jìn)一步振蕩溫育1天。從培養(yǎng)基中回收細(xì)胞。在用蒸餾水洗滌一次以后，將它懸浮在3.5ml緩沖液B1(50mM Tris-HCl(pH8.0)，50mM EDTA，0.5％吐溫-20和0.5％ Triton X-100)中。將八十微升(80μl)100μg/ml的溶菌酶溶液和100μl Qiagen蛋白酶(600mAU/ml，Qiagen Company)加入混懸液并保持在37℃ 1小時。接下來，加入1.2ml緩沖液B2(3M鹽酸胍和20％吐溫-20)，混合和保持50℃ 30分鐘。將獲得的細(xì)胞裂解液加入平衡在緩沖液QBT(750mM NaCl，50mM MOPS(pH7.0)，15％異丙醇和0.15％ TritonX-100)中的Qiagen基因組芯片100G(Qiagen Company)。接下來，在用7.5ml緩沖液QC(50mM MOPS(pH7.0)和15％異丙醇)洗滌芯片2次以后，通過流動5ml緩沖液QF(1.25M NaCl，50mM Tris HCl(pH8.5)，15％異丙醇)洗脫DNA。將三和十分之五毫升(3.5ml)異丙醇混合到獲得的DNA溶液中以沉淀和回收染色體DNA。在用70％乙醇洗滌以后，將回收的DNA溶解在1ml TB緩沖液中。
(2)具有本發(fā)明DNA(A11)部分核苷酸序列的DNA的分離按照實施例29所述方法，通過將在實施例31(1)中制備的染色體DNA用作模板和通過使用引物對14進(jìn)行PCR。按照所述載體附帶的說明書將擴(kuò)增的DNA連接到克隆載體pCRII-TOPO(Invitrogen Company)和然后導(dǎo)入大腸桿菌TOP 10F’。使用Qiagen Tip20(Qiagen Company)從獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體中制備質(zhì)粒DNA。按照所述試劑盒附帶的說明書，使用具有SEQ ID NO57所示核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO59所示核苷酸序列的引物，用染料終止循環(huán)測序FS簡易反應(yīng)試劑盒(AppliedBiosystems日本公司)進(jìn)行測序反應(yīng)。測序反應(yīng)使用獲得的質(zhì)粒作為模板。用DNA測序儀3100(Applied Biosystems日本公司)分析反應(yīng)產(chǎn)物。結(jié)果，提供在SEQ ID NO139所示核苷酸序列的核苷酸316至1048中所表示的核苷酸序列。
另外，用限制酶PvuII消化在實施例31(1)中制備的染色體DNA。按照實施例26(3)所述方法，通過使用獲得的DNA產(chǎn)生基因組步行文庫。通過使用獲得的文庫作為模板和通過使用具有SEQ ID NO161所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP1(Universal Genome Walker試劑盒(Clontech Company))，在實施例26(3)所述條件下進(jìn)行PCR以獲得第一PCR產(chǎn)物。接下來，通過使用第一PCR產(chǎn)物作為模板和通過使用具有SEQ ID NO162所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP2(UniversalGenome Walker試劑盒(Clontech Company))，在實施例26(3)所述條件下進(jìn)行PCR。分析獲得的DNA的核苷酸序列。提供在SEQ ID NO144所示核苷酸序列的核苷酸1至330中所表示的核苷酸序列。
另外，用限制酶HincII消化在實施例31(1)中制備的染色體DNA。按照實施例26(3)所述方法，通過使用獲得的DNA產(chǎn)生基因組步行文庫。通過使用獲得的文庫作為模板和通過使用具有SEQ ID NO163所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP1(Universal Genome Walker試劑盒(Clontech Company))，在實施例26(3)所述條件下進(jìn)行PCR以獲得第一PCR產(chǎn)物。接下來，通過使用第一PCR產(chǎn)物作為模板和通過使用具有SEQ ID NO164所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP2(UniversalGenome Walker試劑盒(Clontech Company))，在實施例26(3)所述條件下進(jìn)行PCR。分析獲得的DNA的核苷酸序列。提供在SEQ ID NO144所示核苷酸序列的核苷酸983至1449中所表示的核苷酸序列。
(3)本發(fā)明DNA(A11)的序列分析通過連接由實施例31(2)所獲DNA提供的核苷酸序列獲得在SEQ IDNO144中表示的核苷酸序列。存在兩個可讀框(ORF)。因此，包含由1230個核苷酸(包括終止密碼子)組成和編碼409個氨基酸殘基(SEQ IDNO159)的核苷酸序列(SEQ ID NO139)以及由207個核苷酸(包括終止密碼子)組成和編碼68個氨基酸殘基(SEQ ID NO149)的核苷酸序列(SEQ ID NO154)。由SEQ ID NO139所示核苷酸序列編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO159)組成的蛋白質(zhì)的分子量據(jù)計算為45177Da。另外，由SEQ ID NO154所示核苷酸序列編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO149)組成的蛋白質(zhì)的分子量據(jù)計算為7147Da。
實施例32本發(fā)明蛋白質(zhì)(A11)在大腸桿菌中的表達(dá)(1)具有本發(fā)明蛋白質(zhì)(A11)的轉(zhuǎn)化大腸桿菌的產(chǎn)生通過將在實施例31(1)中從黑胡桃鏈霉菌IFO 13445制備的染色體DNA用作模板和通過使用Expand HiFi PCR System(Boehringer ManheimCompany)進(jìn)行PCR。作為引物，使用具有SEQ ID NO165所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO166所示核苷酸序列的寡核苷酸的配對。反應(yīng)溶液組成和保持類似于實施例27(1)所述情形。將保持后的反應(yīng)溶液進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳?；厥瞻s1.5kbp的DNA的凝膠區(qū)域。通過按照附帶的說明書使用QIA快速凝膠提取試劑盒(Qiagen公司)從回收的凝膠中純化DNA。按照所述載體附帶的說明書將獲得的DNA連接到克隆載體pCRII-TOPO(Invitrogen公司)并導(dǎo)入大腸桿菌TOP10F’。使用Qiagen Tip20(Qiagen公司)從獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體中制備質(zhì)粒DNA。按照所述試劑盒附帶的說明書，使用分別具有SEQ ID NO57，59，和186所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物，用染料終止循環(huán)測序FS簡易反應(yīng)試劑盒(Applied Biosystems日本公司)進(jìn)行測序反應(yīng)。測序反應(yīng)使用獲得的質(zhì)粒DNA作為模板。用DNA測序儀3100(Applied Biosystems日本公司)分析反應(yīng)產(chǎn)物?；诮Y(jié)果，將具有SEQ ID NO144所示核苷酸序列的質(zhì)粒命名為pCR849AF。
接下來，用限制酶NdeI和HindIII消化pCR849AF。將消化產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。從凝膠中切割包含約1.5kbp DNA的凝膠區(qū)域。通過按照附帶的說明書使用QIA快速凝膠提取試劑盒(Qiagen公司)從回收的凝膠中純化DNA。按照所述試劑盒附帶的說明書用連接試劑盒版本2(Takara Shuzo Company)連接用NdeI和HindIII消化的獲得的DNA和質(zhì)粒pKSN2并導(dǎo)入大腸桿菌JM109。從獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體制備質(zhì)粒DNA。分析其結(jié)構(gòu)。將其中編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)(A11)的約1.5kbp DNA插入pKSN2的NdeI位點和HindIII位點之間、包含SEQ ID NO144所示核苷酸序列的質(zhì)粒命名為pKSN849AF。將質(zhì)粒pKSN849AF導(dǎo)入大腸桿菌JM109。將獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體命名為JM109/pKSN849AF。另外，將質(zhì)粒pKSN2導(dǎo)入大腸桿菌JM109。獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體命名為JM109/pKSN2。
(2)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A11)在大腸桿菌中的表達(dá)和所述蛋白質(zhì)的回收類似于實施例4(2)，培養(yǎng)大腸桿菌JM109/pKSN849AF和JM109/pKSN2的每一個。回收細(xì)胞。制備細(xì)胞裂解液。在實施例4(2)所述方法下，從細(xì)胞裂解液中制備上清液級分(以下，將獲自大腸桿菌JM109/pKSN849AF的上清液級分稱為“大腸桿菌pKSN849AF提取物”，將獲自大腸桿菌JM109/pKSN2的上清液級分稱為“大腸桿菌pKSN2提取物”)。
(3)將化合物(II)轉(zhuǎn)化為化合物(III)的能力的檢測制備30μl的反應(yīng)溶液并保持在30℃下10分鐘。反應(yīng)溶液由0.1M磷酸鉀緩沖液(pH7.0)組成，其包含3ppm用14C標(biāo)記的化合物(II)，2mMβ-NADPH(以下稱為“組分A”)(Oriental Yeast Company)，2mg/ml來源于菠菜的鐵氧還蛋白(以下稱為“組分B”)(Sigma Company)，0.1U/ml鐵氧還蛋白還原酶(以下稱為“組分C”)(Sigma Company)和23μl在實施例32(2)中回收的上清液級分。類似于實施例4(3)，用乙酸乙酯萃取保持后的反應(yīng)溶液并將萃取層進(jìn)行TLC分析。在展開TLC板以后，檢查其上對應(yīng)于用14C標(biāo)記的化合物(III)的斑點的存在(Rf值0.24和0.29)。從包含大腸桿菌pKSN849AF提取物的反應(yīng)溶液中檢測到對應(yīng)于化合物(III)的斑點。與此對比，在包含大腸桿菌pKSN2提取物的反應(yīng)溶液中未檢測到該斑點。
實施例33獲得本發(fā)明DNA(A12)(1)津島鏈霉菌IFO 13782的染色體DNA的制備根據(jù)實施例31(1)所述方法，制備津島鏈霉菌IFO 13782的染色體DNA。
(2)具有本發(fā)明DNA(A12)部分核苷酸序列的DNA的分離按照實施例29所述方法，通過將在實施例33(1)中制備的津島鏈霉菌IFO 13782染色體DNA用作模板和通過使用引物對14進(jìn)行PCR。類似于實施例31(2)，將擴(kuò)增的DNA克隆到克隆載體pCRII-TOPO(InvitrogenCompany)。分析其核苷酸序列。結(jié)果，提供在SEQ ID NO140所示核苷酸序列的核苷酸364至1096中所表示的核苷酸序列。
另外，用限制酶SmaI消化在實施例33(1)中制備的染色體DNA。按照實施例26(3)所述方法，通過使用獲得的DNA產(chǎn)生基因組步行文庫。通過使用獲得的文庫作為模板和通過使用具有SEQ ID NO167所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP1，在實施例26(3)所述條件下進(jìn)行PCR以獲得第一PCR產(chǎn)物。接下來，通過使用第一PCR產(chǎn)物作為模板和通過使用具有SEQ ID NO168所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP2，在實施例26(3)所述條件下進(jìn)行PCR。分析獲得的DNA的核苷酸序列。提供在SEQ ID NO145所示核苷酸序列的核苷酸1至392中所表示的核苷酸序列。
另外，用限制酶PvuII消化在實施例33(1)中制備的染色體DNA。按照實施例26(3)所述方法，通過使用獲得的DNA產(chǎn)生基因組步行文庫。通過使用獲得的文庫作為模板和通過使用具有SEQ ID NO169所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP1，在實施例26(3)所述條件下進(jìn)行PCR以獲得第一PCR產(chǎn)物。接下來，通過使用第一PCR產(chǎn)物作為模板和通過使用具有SEQ ID NO170所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP2，在實施例26(3)所述條件下進(jìn)行PCR。分析獲得的DNA的核苷酸序列。提供在SEQ ID NO145所示核苷酸序列的核苷酸1048至1480中所表示的核苷酸序列。
(3)本發(fā)明DNA(A12)的序列分析通過連接由實施例33(2)所獲DNA提供的核苷酸序列獲得在SEQ IDNO145中表示的核苷酸序列。在所述核苷酸序列中存在兩個可讀框(ORF)。因此，包含由1278個核苷酸(包括終止密碼子)組成和編碼425個氨基酸殘基(SEQ ID NO160)的核苷酸序列(SEQ ID NO140)以及由198個核苷酸(包括終止密碼子)組成和編碼65個氨基酸殘基(SEQ IDNO150)的核苷酸序列(SEQ ID NO155)。由SEQ ID NO140所示核苷酸序列編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO160)組成的蛋白質(zhì)的分子量據(jù)計算為46549Da。另外，由SEQ ID NO155所示核苷酸序列編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO150)組成的蛋白質(zhì)的分子量據(jù)計算為6510Da。
實施例34本發(fā)明DNA(A12)在大腸桿菌中的表達(dá)(1)具有本發(fā)明DNA(A12)的轉(zhuǎn)化大腸桿菌的產(chǎn)生類似于實施例32(1)，除了將在實施例33(1)中從津島鏈霉菌IFO13782制備的染色體DNA用作模板和將具有SEQ ID NO171所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO172所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物以外進(jìn)行PCR。類似于實施例32(1)，從PCR反應(yīng)溶液中純化DNA并克隆到克隆載體pCRII-TOPO(Invitrogen公司)中。用分別具有SEQ IDNO57，59，171，172和187所示核苷酸序列的寡核苷酸分析獲得的質(zhì)粒DNA的核苷酸序列?；讷@得的結(jié)果，將含有SEQ ID NO145所示核苷酸序列的質(zhì)粒命名為pCR1618F。類似于實施例32(1)，用限制酶NdeI和HindIII消化pCR1618F。從消化產(chǎn)物中純化約1.5kbp的DNA。將用NdeI和HindIII消化的獲得的DNA和質(zhì)粒pKSN2連接以獲得包含SEQ IDNO145所示核苷酸序列的質(zhì)粒，其中將編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)(A12)的DNA插入pKSN2的NdeI位點和HindIII位點(以下稱為“pKSN1618F”)。將所述質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌JM109。將獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體稱為JM109/pKSN1618F。
(2)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A12)在大腸桿菌中的表達(dá)和所述蛋白質(zhì)的回收類似于實施例4(2)，培養(yǎng)大腸桿菌JM109/pKSN1618F和JM109/pKSN2中的每一個?；厥占?xì)胞。制備細(xì)胞裂解液。在實施例4(2)所述方法下，從細(xì)胞裂解液中制備上清液級分(以下，將獲自大腸桿菌JM109/pKSN1618F的上清液級分稱為“大腸桿菌pKSN1618F提取物”，將獲自大腸桿菌JM109/pKSN2的上清液級分稱為“大腸桿菌pKSN2提取物”)。
(3)將化合物(II)轉(zhuǎn)化為化合物(III)的能力的檢測制備30μl的反應(yīng)溶液并保持在30℃下10分鐘。除了使用在實施例34(2)中回收的上清液級分(大腸桿菌pKSN1618F提取物或大腸桿菌pKSN2提取物)以外，類似于實施例32(3)制備反應(yīng)溶液。用乙酸乙酯萃取保持后的反應(yīng)溶液并將萃取層TLC分析。在展開TLC板以后，檢查其上對應(yīng)于用14C標(biāo)記的化合物(III)的斑點的存在(Rf值0.24和0.29)。從包含大腸桿菌pKSN1618F提取物的反應(yīng)溶液中檢測到對應(yīng)于化合物(III)的斑點。與此對比，在包含大腸桿菌pKSN2提取物的反應(yīng)溶液中未檢測到該斑點。
實施例35獲得本發(fā)明DNA(A13)(1)熱淡天藍(lán)鏈霉菌IFO 14273t的染色體DNA的制備根據(jù)實施例31(1)所述方法，制備熱淡天藍(lán)鏈霉菌IFO 14273t的染色體DNA。
(2)具有本發(fā)明DNA(A13)部分核苷酸序列的DNA的分離按照實施例29所述方法，通過將在實施例35(1)中制備的熱淡天藍(lán)鏈霉菌IFO 14273t染色體DNA用作模板和通過使用引物對14進(jìn)行PCR。類似于實施例31(2)，將擴(kuò)增的DNA克隆到克隆載體pCRII-TOPO(Invitrogen Company)。分析其核苷酸序列。結(jié)果，提供在SEQ ID NO141所示核苷酸序列的核苷酸295至1027中所表示的核苷酸序列。
另外，用限制酶HincII消化在實施例35(1)中制備的染色體DNA。按照實施例26(3)所述方法，通過使用獲得的DNA產(chǎn)生基因組步行文庫。通過使用獲得的文庫作為模板和通過使用具有SEQ ID NO173所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP1，在實施例26(3)所述條件下進(jìn)行PCR以獲得第一PCR產(chǎn)物。接下來，通過使用第一PCR產(chǎn)物作為模板和通過使用具有SEQ ID NO174所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP2，在實施例26(3)所述條件下進(jìn)行PCR。分析獲得的DNA的核苷酸序列。提供在SEQ ID NO146所示核苷酸序列的核苷酸1至370中所表示的核苷酸序列。
另外，用限制酶SmaI消化在實施例35(1)中制備的染色體DNA。按照實施例26(3)所述方法，通過使用獲得的DNA產(chǎn)生基因組步行文庫。通過使用獲得的文庫作為模板和通過使用具有SEQ ID NO175所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP1，在實施例26(3)所述條件下進(jìn)行PCR以獲得第一PCR產(chǎn)物。接下來，通過使用第一PCR產(chǎn)物作為模板和通過使用具有SEQ ID NO176所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP2，在實施例26(3)所述條件下進(jìn)行PCR。分析獲得的DNA的核苷酸序列。提供在SEQ ID NO146所示核苷酸序列的核苷酸960至1473中所表示的核苷酸序列。
(3)本發(fā)明DNA(A13)的序列分析通過連接由實施例35(2)所獲DNA提供的核苷酸序列獲得在SEQ IDNO146中表示的核苷酸序列。在所述核苷酸序列中存在兩個可讀框(ORF)。因此，包含由1209個核苷酸(包括終止密碼子)組成和編碼402個氨基酸殘基(SEQ ID NO136)的核苷酸序列(SEQ ID NO141)以及由252個核苷酸(包括終止密碼子)組成和編碼83個氨基酸殘基(SEQ IDNO151)的核苷酸序列(SEQ ID NO156)。由SEQ ID NO141所示核苷酸序列編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO136)組成的蛋白質(zhì)的分子量據(jù)計算為44629Da。另外，由SEQ ID NO156所示核苷酸序列編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO151)組成的蛋白質(zhì)的分子量據(jù)計算為8635Da。
實施例36本發(fā)明蛋白質(zhì)(A13)在大腸桿菌中的表達(dá)(1)具有本發(fā)明蛋白質(zhì)(A13)的轉(zhuǎn)化大腸桿菌的產(chǎn)生類似于實施例32(1)，除了將在實施例35(1)中從熱淡天藍(lán)鏈霉菌IFO 14273t制備的染色體DNA用作模板和將具有SEQ ID NO177所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO178所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物以外進(jìn)行PCR。類似于實施例32(1)，從PCR反應(yīng)溶液中純化DNA并克隆到克隆載體pCRII-TOPO(Invitrogen公司)中。用分別具有SEQ ID NO57，59，173，175和188所示核苷酸序列的寡核苷酸分析獲得的質(zhì)粒DNA的核苷酸序列?；讷@得的結(jié)果，將具有SEQ ID NO146所示核苷酸序列的質(zhì)粒命名為pCR474F。類似于實施例32(1)，用限制酶NdeI和HindIII消化pCR474F。從消化產(chǎn)物中純化約1.5kbp的DNA。將用NdeI和HindIII消化的獲得的DNA和質(zhì)粒pKSN2連接以獲得包含SEQ ID NO146所示核苷酸序列的質(zhì)粒，其中將編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)(A13)的DNA插入pKSN2的NdeI位點和HindIII位點(以下稱為“pKSN474F”)。將所述質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌JM109。將獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體稱為JM109/pKSN474F。
(2)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A13)在大腸桿菌中的表達(dá)和所述蛋白質(zhì)的回收類似于實施例4(2)，培養(yǎng)大腸桿菌JM109/pKSN474F和JM109/pKSN2中的每一個?；厥占?xì)胞。制備細(xì)胞裂解液。在實施例4(2)所述方法下，從細(xì)胞裂解液中制備上清液級分(以下，將獲自大腸桿菌JM109/pKSN474F的上清液級分稱為“大腸桿菌pKSN474F提取物”，將獲自大腸桿菌JM109/pKSN2的上清液級分稱為“大腸桿菌pKSN2提取物”)。
(3)將化合物(II)轉(zhuǎn)化為化合物(III)的能力的檢測制備30μl的反應(yīng)溶液并保持在30℃下10分鐘。除了使用在實施例36(2)中回收的上清液級分(大腸桿菌pKSN474F提取物或大腸桿菌pKSN2提取物)以外，類似于實施例32(3)制備反應(yīng)溶液。用乙酸乙酯萃取保持后的反應(yīng)溶液并將萃取層TLC分析。在展開TLC板以后，檢查其上對應(yīng)于用14C標(biāo)記的化合物(III)的斑點的存在(Rf值0.24和0.29)。從包含大腸桿菌pKSN474F提取物的反應(yīng)溶液中檢測到對應(yīng)于化合物(III)的斑點。與此對比，在包含大腸桿菌pKSN2提取物的反應(yīng)溶液中未檢測到該斑點。
實施例37獲得本發(fā)明DNA(A14)(1)熱淡天藍(lán)鏈霉菌IFO 14273t的染色體DNA的制備根據(jù)實施例31(1)所述方法，制備熱淡天藍(lán)鏈霉菌IFO 14273t的染色體DNA。
(2)具有本發(fā)明DNA(A13)部分核苷酸序列的DNA的分離按照實施例29所述方法，通過將在實施例37(1)中制備的球團(tuán)產(chǎn)色鏈霉菌IFO 13673t染色體DNA用作模板和通過使用引物對14進(jìn)行PCR。類似于實施例31(2)，將擴(kuò)增的DNA克隆到克隆載體pCRII-TOPO(Invitrogen Company)。分析其核苷酸序列。結(jié)果，提供在SEQ ID NO142所示核苷酸序列的核苷酸316至1048中所表示的核苷酸序列。
另外，用限制酶SmaI消化在實施例37(1)中制備的染色體DNA。按照實施例26(3)所述方法，通過使用獲得的DNA產(chǎn)生基因組步行文庫。通過使用獲得的文庫作為模板和通過使用具有SEQ ID NO179所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP1，在實施例26(3)所述條件下進(jìn)行PCR以獲得第一PCR產(chǎn)物。接下來，通過使用第一PCR產(chǎn)物作為模板和通過使用具有SEQ ID NO180所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP2，在實施例26(3)所述條件下進(jìn)行PCR。分析獲得的DNA的核苷酸序列。提供在SEQ ID NO147所示核苷酸序列的核苷酸1至330中所表示的核苷酸序列。
另外，用限制酶HincII消化在實施例37(1)中制備的染色體DNA。按照實施例26(3)所述方法，通過使用獲得的DNA產(chǎn)生基因組步行文庫。通過使用獲得的文庫作為模板和通過使用具有SEQ ID NO181所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP1，在實施例26(3)所述條件下進(jìn)行PCR以獲得第一PCR產(chǎn)物。接下來，通過使用第一PCR產(chǎn)物作為模板和通過使用具有SEQ ID NO182所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP2，在實施例26(3)所述條件下進(jìn)行PCR。分析獲得的DNA的核苷酸序列。提供在SEQ ID NO147所示核苷酸序列的核苷酸982至1449中所表示的核苷酸序列。
(3)本發(fā)明DNA(A14)的序列分析通過連接由實施例37(2)所獲DNA提供的核苷酸序列獲得在SEQ IDNO147中表示的核苷酸序列。在所述核苷酸序列中存在兩個可讀框(ORF)。因此，包含由1230個核苷酸(包括終止密碼子)組成和編碼409個氨基酸殘基(SEQ ID NO137)的核苷酸序列(SEQ ID NO142)以及由207個核苷酸(包括終止密碼子)組成和編碼68個氨基酸殘基(SEQ IDNO152)的核苷酸序列(SEQ ID NO157)。由SEQ ID NO142所示核苷酸序列編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO137)組成的蛋白質(zhì)的分子量據(jù)計算為45089Da。另外，由SEQ ID NO157所示核苷酸序列編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO152)組成的蛋白質(zhì)的分子量據(jù)計算為7174Da。
實施例38本發(fā)明DNA(A14)在大腸桿菌中的表達(dá)(1)具有本發(fā)明DNA(A14)的轉(zhuǎn)化大腸桿菌的產(chǎn)生類似于實施例32(1)，除了將在實施例37(1)中制備的球團(tuán)產(chǎn)色鏈霉菌IFO 13673t染色體DNA用作模板和將具有SEQ ID NO183所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO184所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物以外進(jìn)行PCR。類似于實施例32(1)，從PCR反應(yīng)溶液中純化DNA并克隆到克隆載體pCRII-TOPO(Invitrogen公司)中。用分別具有SEQ IDNO57，59和189所示核苷酸序列的寡核苷酸分析獲得的質(zhì)粒DNA的核苷酸序列?；讷@得的結(jié)果，將具有SEQ ID NO147所示核苷酸序列的質(zhì)粒命名為pCR1491AF。類似于實施例32(1)，用限制酶NdeI和HindIII消化pCR1491AF。從消化產(chǎn)物中純化約1.5kbp的DNA。將用NdeI和HindIII消化的獲得的DNA和質(zhì)粒pKSN2連接以獲得包含SEQ ID NO147所示核苷酸序列的質(zhì)粒，其中將編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)(A14)的DNA插入pKSN2的NdeI位點和HindIII位點(以下稱為“pKSN1491AF”)。將所述質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌JM109。將獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體稱為JM109/pKSN1491AF。
(2)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A14)在大腸桿菌中的表達(dá)和所述蛋白質(zhì)的回收類似于實施例4(2)，培養(yǎng)大腸桿菌JM109/pKSN1491AF和JM109/pKSN2中的每一個?；厥占?xì)胞。制備細(xì)胞裂解液。在實施例4(2)所述方法下，從細(xì)胞裂解液中制備上清液級分(以下，將獲自大腸桿菌JM109/pKSN1491AF的上清液級分稱為“大腸桿菌pKSN1491AF提取物”，將獲自大腸桿菌JM109/pKSN2的上清液級分稱為“大腸桿菌pKSN2提取物”)。
(3)將化合物(II)轉(zhuǎn)化為化合物(III)的能力的檢測制備30μl的反應(yīng)溶液并保持在30℃下10分鐘。除了使用在實施例38(2)中回收的上清液級分(大腸桿菌pKSN1491AF提取物或大腸桿菌pKSN2提取物)以外，類似于實施例32(3)制備反應(yīng)溶液。用乙酸乙酯萃取保持后的反應(yīng)溶液并將萃取層TLC分析。在展開TLC板以后，檢查其上對應(yīng)于用14C標(biāo)記的化合物(III)的斑點的存在(Rf值0.24和0.29)。從包含大腸桿菌pKSN1491AF提取物的反應(yīng)溶液中檢測到對應(yīng)于化合物(III)的斑點。與此對比，在包含大腸桿菌pKSN2提取物的反應(yīng)溶液中未檢測到該斑點。
實施例39獲得本發(fā)明DNA(A15)(1)橄欖產(chǎn)色鏈霉菌IFO 12444的染色體DNA的制備根據(jù)實施例31(1)所述方法，制備橄欖產(chǎn)色鏈霉菌IFO 12444的染色體DNA。
(2)具有本發(fā)明DNA(A15)部分核苷酸序列的DNA的分離按照實施例29所述方法，通過將在實施例39(1)中制備的橄欖產(chǎn)色鏈霉菌IFO 12444染色體DNA用作模板和通過使用引物對14進(jìn)行PCR。類似于實施例31(2)，將擴(kuò)增的DNA克隆到克隆載體pCRII-TOPO(Invitrogen Company)。分析其核苷酸序列。結(jié)果，提供在SEQ ID NO143所示核苷酸序列的核苷酸316至1048中所表示的核苷酸序列。
另外，用限制酶SmaI消化在實施例37(1)中制備的染色體DNA。按照實施例26(3)所述方法，通過使用獲得的DNA產(chǎn)生基因組步行文庫。通過使用獲得的DNA作為模板和通過使用具有SEQ ID NO179所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP1，在實施例26(3)所述條件下進(jìn)行PCR以獲得第一PCR產(chǎn)物。接下來，通過使用第一PCR產(chǎn)物作為模板和通過使用具有SEQ ID NO180所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP2，在實施例26(3)所述條件下進(jìn)行PCR。分析獲得的DNA的核苷酸序列。提供在SEQ ID NO148所示核苷酸序列的核苷酸1至330中所表示的核苷酸序列。
另外，用限制酶SmaI消化在實施例39(1)中制備的染色體DNA。按照實施例26(3)所述方法，通過使用獲得的DNA產(chǎn)生基因組步行文庫。通過使用獲得的文庫作為模板和通過使用具有SEQ ID NO181所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP1，在實施例26(3)所述條件下進(jìn)行PCR以獲得第一PCR產(chǎn)物。接下來，通過使用第一PCR產(chǎn)物作為模板和通過使用具有SEQ ID NO182所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP2，在實施例26(3)所述條件下進(jìn)行PCR。分析獲得的DNA的核苷酸序列。提供在SEQ ID NO148所示核苷酸序列的核苷酸982至1449中所表示的核苷酸序列。
(3)本發(fā)明DNA(A15)的序列分析通過連接由實施例39(2)所獲DNA提供的核苷酸序列獲得在SEQ IDNO148中表示的核苷酸序列。在所述核苷酸序列中存在兩個可讀框(ORF)。因此，包含由1230個核苷酸(包括終止密碼子)組成和編碼409個氨基酸殘基(SEQ ID NO138)的核苷酸序列(SEQ ID NO143)以及由207個核苷酸(包括終止密碼子)組成和編碼68個氨基酸殘基(SEQ IDNO153)的核苷酸序列(SEQ ID NO158)。由SEQ ID NO143所示核苷酸序列編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO138)組成的蛋白質(zhì)的分子量據(jù)計算為45116Da。另外，由SEQ ID NO158所示核苷酸序列編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO153)組成的蛋白質(zhì)的分子量據(jù)計算為7179Da。
實施例40本發(fā)明DNA(A15)在大腸桿菌中的表達(dá)(1)具有本發(fā)明DNA(A15)的轉(zhuǎn)化大腸桿菌的產(chǎn)生類似于實施例32(1)，除了將在實施例39(1)中制備的橄欖產(chǎn)色鏈霉菌IFO 12444染色體DNA用作模板和將具有SEQ ID NO184所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO185所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物以外進(jìn)行PCR。類似于實施例32(1)，從PCR反應(yīng)溶液中純化DNA并克隆到克隆載體pCRII-TOPO(Invitrogen公司)中。用分別具有SEQ IDNO57，59和189所示核苷酸序列的寡核苷酸分析獲得的質(zhì)粒DNA的核苷酸序列?；讷@得的結(jié)果，將具有SEQ ID NO148所示核苷酸序列的質(zhì)粒命名為pCR1555AF。類似于實施例32(1)，用限制酶NdeI和HindIII消化pCR1555AF。從消化產(chǎn)物中純化約1.5kbp的DNA。將用NdeI和HindIII消化的獲得的DNA和質(zhì)粒pKSN2連接以獲得包含SEQ ID NO148所示核苷酸序列的質(zhì)粒，其中將編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)(A15)的DNA插入pKSN2的NdeI位點和HindIII位點(以下稱為“pKSN1555AF”)。將所述質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌JM109。將獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體稱為JM109/pKSN1555AF。
(2)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A15)在大腸桿菌中的表達(dá)和所述蛋白質(zhì)的回收類似于實施例4(2)，培養(yǎng)大腸桿菌JM109/pKSN1555AF和JM109/pKSN2中的每一個?；厥占?xì)胞。制備細(xì)胞裂解液。在實施例4(2)所述方法下，從細(xì)胞裂解液中制備上清液級分(以下，將獲自大腸桿菌JM109/pKSN1555AF的上清液級分稱為“大腸桿菌pKSN1555AF提取物”，將獲自大腸桿菌JM109/pKSN2的上清液級分稱為“大腸桿菌pKSN2提取物”)。
(3)將化合物(II)轉(zhuǎn)化為化合物(III)的能力的檢測制備30μl的反應(yīng)溶液并保持在30℃下10分鐘。除了使用在實施例40(2)中回收的上清液級分(大腸桿菌pKSN1555AF提取物或大腸桿菌pKSN2提取物)以外，類似于實施例32(3)制備反應(yīng)溶液。用乙酸乙酯萃取保持后的反應(yīng)溶液并將萃取層TLC分析。在展開TLC板以后，檢查其上對應(yīng)于用14C標(biāo)記的化合物(III)的斑點的存在(Rf值0.24和0.29)。從包含大腸桿菌pKSN1555AF提取物的反應(yīng)溶液中檢測到對應(yīng)于化合物(III)的斑點。與此對比，在包含大腸桿菌pKSN2提取物的反應(yīng)溶液中未檢測到該斑點。
實施例41通過本發(fā)明蛋白質(zhì)(A1)的化合物的代謝(1)質(zhì)體級分的制備將一百克(100g)蘿卜綠葉種子(Takii Seed)鋸到托盤中潮濕的實驗室紙抹布中，在25℃下黑暗中培養(yǎng)6天，然后在熒光燈下培養(yǎng)4小時。用Nissei AM-8勻漿器(Nihonseiki Seisakusho；18,000-20,000rpm，4℃，5秒)在破裂緩沖液(1mM氯化鎂，20mM N-三(羥甲基)甲基-2-氨乙基磺酸酯，10mM N-2-羥乙基哌啶-N’-2-乙基磺酸酯，0.5mM EDTA，5mM半胱氨酸，0.5M蔗糖；pH7.7)中磨碎三十克(30g)新變綠的子葉。將獲得的細(xì)胞裂解液通過4層尼龍gause。將獲得的溶液離心(13，170xg，1分鐘)。用60ml破裂緩沖液懸浮獲得的殘余物級分并離心(2,640xg，4℃，2分鐘)。將殘余物級分重懸浮在10ml破裂緩沖液中，在離心管中用高密度緩沖液(1mM氯化鎂，20mM N-三(羥甲基)甲基-2-氨乙基磺酸酯，30mM N-2-羥乙基哌啶-N’-2-乙基磺酸酯，O.5mM EDTA，5mM半胱氨酸，0.6M蔗糖；pH7.7)分層，并離心(675xg，4℃，15分鐘)。將殘余物懸浮在3ml懸浮緩沖液(1mM氯化鎂，20mM N-三(羥甲基)甲基-2-氨乙基磺酸酯，30mM N-2-羥乙基哌啶-N’-2-乙基磺酸酯，0.5mM EDTA；pH7.7)中并稱為質(zhì)體級分。
(2)通過本發(fā)明蛋白質(zhì)(A1)的化合物(XII)的代謝制備50mM磷酸鉀(pH7.0)的100μl反應(yīng)溶液，其包含5ppm化合物(XII)，3mMβ-NADPH(以下稱為“組分A”)(Oriental Yeast Company)，1mg/ml來源于菠菜的鐵氧還蛋白(以下稱為“組分B”)(SigmaCompany)，0.15U/ml鐵氧還蛋白還原酶(以下稱為“組分C”)(SigmaCompany)和20μl在實施例4(2)中回收的上清液級分。將反應(yīng)溶液保持在30℃下10分鐘。另外，類似地制備和保持未加入用于上述反應(yīng)溶液組合物中的、選自組分A，組分B和組分C和在實施例4(2)中制備的上清液級分的至少一種組分的50mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)的100μl反應(yīng)溶液。將十微升(10μl)2N HCl和500μl乙酸乙酯加入和混合到保持以后的每種反應(yīng)溶液中。在8,000xg下將產(chǎn)生的反應(yīng)溶液離心以回收490μl乙酸乙酯層。在減壓下干燥乙酸乙酯層以后，將殘余物溶解在100μl50mM的磷酸鉀緩沖液(pH7.0)中。在HPLC上分析四十微升(40μl)級分溶液(以下，將來自包含組分A，組分B，組分C和20μl在實施例4(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的級分溶液稱為“(XII)代謝溶液(A1)”；另外，將來自不包含組分A，不包含組分B，不包含組分C和不包含在實施例4(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的級分溶液稱為“(XII)對照溶液(A1)”)。與從(XII)對照溶液(A1)檢測的化合物(XII)的濃度相比，從(XII)代謝溶液(A1)檢測的化合物(XII)的濃度較低。另外從(XII)代謝溶液(A1)檢測到峰，其從(XII)對照溶液(A1)中未檢測到。對于在該峰中包含的化合物進(jìn)行質(zhì)譜分析。包含在該峰中的化合物的質(zhì)量比化合物(XII)的質(zhì)量小14。
混合二十微升(20μl)稀釋32倍的上述(XII)代謝溶液(A1)和60μl在實施例41(1)中制備的質(zhì)體級分。在黑暗條件下，加入20μl底物溶液(10mM腺苷三磷酸，5mM氨基乙酰丙酸，4mM谷胱甘肽還原酶和0.6mM NAD+；pH6.5；以下，該底物溶液稱為“PPO底物溶液”)并在30℃下保持1.5小時。另外，代替所述20μl稀釋32倍的(XII)代謝溶液(A1)，制備加入20μl稀釋32倍的(XII)對照溶液(A1)的反應(yīng)溶液，類似地加入和保持PPO底物溶液。將三百(300μl)二甲亞砜-甲醇混合物(二甲亞砜∶甲醇＝7∶3)加入保持以后的每個反應(yīng)溶液中并離心(8000xg，4℃，10分鐘)?；厥丈锨逡翰⒃谝韵路治鰲l件下進(jìn)行反相HPC分析以測量PPIX的量。加入(XII)代謝溶液(A1)的反應(yīng)溶液中PPIX的量多于加入(XII)對照溶液(A1)的反應(yīng)溶液中PPIX的量。
(HPLC分析條件2)
柱SUMIPAX ODS212(Sumika Chemical Analysis Service)流速2ml/分鐘檢測波長熒光Ex410nm Em630nm洗脫劑甲醇和1M乙酸銨的95∶5混合物(pH5.7)(3)通過本發(fā)明(A1)的化合物(XIII)的代謝除了使用5ppm化合物(XIII)而不是5ppm化合物(XII)以外，類似實施例41(2)所述方法制備和保持反應(yīng)溶液。類似于實施例41(2)，用乙酸乙酯萃取保持后的反應(yīng)溶液中的每一個，將獲得的殘余物溶解在100μl二甲亞砜中。在上述分析條件1下在HPLC上分析獲得的溶液(以下，將來自包含組分A，組分B，組分C和20μl在實施例4(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的溶液稱為“(XIII)代謝溶液(A1)”；另外，將來自不包含組分A，不包含組分B，不包含組分C和不包含在實施例4(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的溶液稱為“(XIII)對照溶液(A1)”)。與從(XIII)對照溶液(A1)檢測的化合物(XIII)的濃度相比，從(XIII)代謝溶液(A1)檢測的化合物(XIII)的濃度較低。另外從(XIII)代謝溶液(A1)檢測到峰，其從(XIII)對照溶液(A1)中未檢測到。對于在該峰中包含的化合物進(jìn)行質(zhì)譜分析。包含在該峰中的化合物的質(zhì)量比化合物(XIII)的質(zhì)量小14。
混合二十微升(20μl)稀釋128倍的上述(XIII)代謝溶液(A1)和60μl質(zhì)體級分。在黑暗條件下，加入20μl PPO底物溶液并在30℃下保持1.5小時。另外，代替所述20μl稀釋128倍的(XIII)代謝溶液(A1)，制備加入20μl稀釋128倍的(XIII)對照溶液(A1)的反應(yīng)溶液，類似地加入和保持PPO底物溶液。類似于實施例4(2)，制備保持后的各種反應(yīng)溶液并在上述分析條件2下進(jìn)行反相HPLC分析以測量PPIX的量。加入(XIII)代謝溶液(A1)的反應(yīng)溶液中PPIX的量多于加入(XIII)對照溶液(A1)的反應(yīng)溶液中PPIX的量。
(4)通過本發(fā)明(A1)的化合物(XVI)的代謝除了使用12.5ppm化合物(XVI)而不是5ppm化合物(XII)以外，類似實施例41(2)所述方法制備和保持反應(yīng)溶液。類似于實施例41(2)，用乙酸乙酯萃取保持后的反應(yīng)溶液中的每一個，將獲得的殘余物溶解在200μl 50mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)中。在上述分析條件1下在HPLC上分析獲得的溶液(以下，將來自包含組分A，組分B，組分C和20μl在實施例4(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的溶液稱為“(XVI)代謝溶液(A1)”；另外，將來自不包含組分A，不包含組分B，不包含組分C和不包含在實施例4(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的溶液稱為“(XVI)對照溶液(A1)”)。與從(XVI)對照溶液(A1)檢測的化合物(XVI)的濃度相比，從(XVI)代謝溶液(A1)檢測的化合物(XVI)的濃度較低。另外從(XVI)代謝溶液(A1)檢測到峰，其從(XVI)對照溶液(A1)中未檢測到。
混合二十微升(20μl)稀釋8倍的上述(XVI)代謝溶液(A1)和60μl質(zhì)體級分。在黑暗條件下，加入20μl PPO底物溶液并在30℃下保持1.5小時。另外，代替所述20μl稀釋8倍的(XVI)代謝溶液(A1)，制備加入20μl稀釋8倍的(XVI)對照溶液(A1)的反應(yīng)溶液，類似地加入和保持PPO底物溶液。類似于實施例41(2)，制備保持后的各種反應(yīng)溶液并在上述分析條件2下進(jìn)行反相HPLC分析以測量PPIX的量。加入(XVI)代謝溶液(A1)的反應(yīng)溶液中PPIX的量多于加入(XVI)對照溶液(A1)的反應(yīng)溶液中PPIX的量。
(5)通過本發(fā)明蛋白質(zhì)(A1)的化合物(XVII)的代謝除了使用12.5ppm化合物(XVII)而不是5ppm化合物(XII)以外，類似實施例41(2)所述方法制備和保持反應(yīng)溶液。類似于實施例41(2)，用乙酸乙酯萃取保持后的反應(yīng)溶液中的每一個，將獲得的殘余物溶解在200μl 50mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)中。在上述分析條件1下在HPLC上分析獲得的溶液(以下，將來自包含組分A，組分B，組分C和20μl在實施例4(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的溶液稱為“(XVII)代謝溶液(A1)”；另外，將來自不包含組分A，不包含組分B，不包含組分C和不包含在實施例4(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的溶液稱為“(XVII)對照溶液(A1)”)。與從(XVII)對照溶液(A1)檢測的化合物(XVII)的濃度相比，從(XVII)代謝溶液(A1)檢測的化合物(XVII)的濃度較低。另外從(XVII)代謝溶液(A1)檢測到峰，其從(XVII)對照溶液(A1)中未檢測到。
混合二十微升(20μl)稀釋32倍的上述(XVII)代謝溶液(A1)和60μl質(zhì)體級分。在黑暗條件下，加入20μl PPO底物溶液并在30℃下保持1.5小時。另外，代替所述20μl稀釋32倍的(XVII)代謝溶液(A1)，制備加入20μl稀釋32倍的(XVII)對照溶液(A1)的反應(yīng)溶液，類似地加入和保持PPO底物溶液。類似于實施例41(2)，制備保持后的各種反應(yīng)溶液并在上述分析條件2下進(jìn)行反相HPLC分析以測量PPIX的量。加入(XVII)代謝溶液(A1)的反應(yīng)溶液中PPIX的量多于加入(XVII)對照溶液(A1)的反應(yīng)溶液中PPIX的量。
(6)通過本發(fā)明蛋白質(zhì)(A1)的化合物(VI)的代謝將大腸桿菌JM109/pKSN657F在37℃下在3ml包含50μg/ml氨芐青霉素的TB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。將一毫升(1ml)獲得的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至100ml包含50μg/ml氨芐青霉素的TB培養(yǎng)基中并在26℃下培養(yǎng)。當(dāng)OD660達(dá)到約0.5時，將5-氨基乙酰丙酸加至500μM的終濃度，繼續(xù)培養(yǎng)。三十(30)分鐘以后，加入IPTG至1mM的終濃度，進(jìn)一步培養(yǎng)20小時。
從培養(yǎng)基中回收細(xì)胞，用0.1M tris-HCl緩沖液(pH7.5)洗滌和懸浮在10ml包含1％葡萄糖的0.1M Tris-HCl中。將化合物(VI)加入獲得的細(xì)胞混懸液至100ppm的終濃度并在30℃下振蕩溫育。分別在振蕩開始0小時和1天時，分級分離2ml細(xì)胞混懸液。每個加入五十微升(50μl)2N HCl并用2ml乙酸乙酯萃取。在反應(yīng)條件1下在HPLC上分析獲得的乙酸乙酯層。與從振蕩開始后0小時的細(xì)胞混懸液制備的乙酸乙酯層檢測的化合物(VI)的濃度相比，從振蕩開始后1天的細(xì)胞混懸液制備的乙酸乙酯層檢測的化合物(VI)的濃度較低。另外，從振蕩開始后1天的細(xì)胞混懸液制備的乙酸乙酯層檢測到峰，其在振蕩開始后0小時的細(xì)胞混懸液制備的乙酸乙酯層中未檢測到。進(jìn)行包含在所述峰中的化合物的質(zhì)譜分析。包含在所述峰中的化合物的質(zhì)量比化合物(VI)的質(zhì)量小14。
(7)通過本發(fā)明蛋白質(zhì)(A1)的化合物(VIII)的代謝除了使用化合物(VIII)而不是化合物(VI)以外，按照實施例41(6)所述方法進(jìn)行大腸桿菌JM109/pKSN657F的培養(yǎng)，細(xì)胞混懸液的制備，加入化合物(VIII)的細(xì)胞混懸液的振蕩溫育，從細(xì)胞混懸液的試劑制備和試劑的HPLC分析。與從振蕩開始后0小時的細(xì)胞混懸液制備的乙酸乙酯層檢測的化合物(VIII)的濃度相比，從振蕩開始后1天的細(xì)胞混懸液制備的乙酸乙酯層檢測的化合物(VIII)的濃度較低。另外，從振蕩開始后1天的細(xì)胞混懸液制備的乙酸乙酯層檢測到兩個峰，其在振蕩開始后0小時的細(xì)胞混懸液制備的乙酸乙酯層中未檢測到。進(jìn)行包含在所述峰中的化合物的質(zhì)譜分析。包含在所述峰中之一的化合物的質(zhì)量比化合物(VIII)的質(zhì)量小14，包含在另一個峰中的化合物的質(zhì)量比化合物(VIII)的質(zhì)量小28。
(8)通過本發(fā)明蛋白質(zhì)(A1)的化合物(X)的代謝除了使用化合物(X)而不是化合物(VI)以外，按照實施例41(6)所述方法進(jìn)行大腸桿菌JM109/pKSN657F的培養(yǎng)，細(xì)胞混懸液的制備，加入化合物(X)的細(xì)胞混懸液的振蕩培養(yǎng)，從細(xì)胞混懸液的試劑制備和試劑的HPLC分析。與從振蕩開始后0小時的細(xì)胞混懸液制備的乙酸乙酯層檢測的化合物(X)的濃度相比，從振蕩開始后1天的細(xì)胞混懸液制備的乙酸乙酯層檢測的化合物(X)的濃度較低。另外，從振蕩開始后1天的細(xì)胞混懸液制備的乙酸乙酯層檢測到兩個峰，其在振蕩開始后0小時的細(xì)胞混懸液制備的乙酸乙酯層中未檢測到。進(jìn)行包含在所述峰中的化合物的質(zhì)譜分析。包含在所述峰中之一的化合物的質(zhì)量比化合物(X)的質(zhì)量小40，包含在另一個峰中的化合物的質(zhì)量比化合物(X)的質(zhì)量小54。
(9)通過本發(fā)明蛋白質(zhì)(A1)的化合物(XI)的代謝除了使用化合物(XI)而不是化合物(VI)以外，按照實施例41(6)所述方法進(jìn)行大腸桿菌JM109/pKSN657F的培養(yǎng)，細(xì)胞混懸液的制備，加入化合物(XI)的細(xì)胞混懸液的振蕩培養(yǎng)，從細(xì)胞混懸液的試劑制備和試劑的HPLC分析。與從振蕩開始后0小時的細(xì)胞混懸液制備的乙酸乙酯層檢測的化合物(XI)的濃度相比，從振蕩開始后1天的細(xì)胞混懸液制備的乙酸乙酯層檢測的化合物(XI)的濃度較低。另外，從振蕩開始后1天的細(xì)胞混懸液制備的乙酸乙酯層檢測到兩個峰，其在振蕩開始后0小時的細(xì)胞混懸液制備的乙酸乙酯層中未檢測到。進(jìn)行包含在所述峰中的化合物的質(zhì)譜分析。包含在所述峰中之一的化合物的質(zhì)量比化合物(XI)的質(zhì)量小14，包含在另一個峰中的化合物的質(zhì)量比化合物(XI)的質(zhì)量小16。
實施例42通過本發(fā)明蛋白質(zhì)(A11)的化合物的代謝(1)通過本發(fā)明化合物(A11)的化合物(X)的代謝將大腸桿菌JM109/pKSN849AF和大腸桿菌JM109/pKSN2各自在37℃下在3ml包含50μg/ml氨芐青霉素的TB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。將一毫升(1ml)獲得的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至100ml包含50μg/ml氨芐青霉素的TB培養(yǎng)基中并在26℃下培養(yǎng)。當(dāng)OD660達(dá)到約0.5時，將5-氨基乙酰丙酸加至500μM的終濃度，繼續(xù)培養(yǎng)。三十(30)分鐘以后，加入IPTG至1mM的終濃度，進(jìn)一步培養(yǎng)18小時。
從培養(yǎng)基中回收細(xì)胞，用0.1M tris-HCl緩沖液(pH7.5)洗滌和懸浮在10ml包含1％葡萄糖的0.1M Tris-HCl中。將化合物(X)加入獲得的細(xì)胞混懸液至25ppm的終濃度并在30℃下振蕩溫育。分別在振蕩開始0小時和4天時，分級分離2ml細(xì)胞混懸液。每個加入五十微升(50μl)2N HCl并用2ml乙酸乙酯萃取。在反應(yīng)條件1下在HPLC上分析獲得的乙酸乙酯層。與從JM109/pKSN2細(xì)胞混懸液制備的乙酸乙酯層檢測的化合物(X)的濃度相比，從JM109/pKSN849AF細(xì)胞混懸液制備的乙酸乙酯層檢測的化合物(X)的濃度較低。另外，從JM109/pKSN849AF細(xì)胞混懸液制備的乙酸乙酯層檢測到3個峰，其在從JM109/pKSN2細(xì)胞混懸液制備的乙酸乙酯層中未檢測到。在3個峰中，峰1在HPLC中的洗脫時間與質(zhì)量比實施例41(8)中檢測的化合物(X)小40的化合物的峰洗脫時間相配。另外，另一個峰的HPLC洗脫時間與質(zhì)量比實施例41(8)中檢測的化合物(X)小54的化合物的峰洗脫時間相配。
在干燥后，分別地，將從上述JM109/pKSN2細(xì)胞混懸液制備的1ml乙酸乙酯層和1ml從上述JM109/pKSN849AF細(xì)胞混懸液制備的乙酸乙酯層，殘余物溶解在1ml二甲亞砜中(以下，將來自從JM109/pKSN849AF制備的乙酸乙酯層的溶液稱為“(X)代謝溶液(A11)”；另外，將來自從JM109/pKSN2細(xì)胞混懸液制備的乙酸乙酯層的溶液稱為“(X)對照溶液(A11)”)。
混合二十微升(20μl)稀釋128倍的上述(X)代謝溶液(A11)和60μl質(zhì)體級分。在黑暗條件下，加入20μl PPO底物溶液并在30℃下保持1.5小時。另外，代替所述20μl稀釋128倍的(X)代謝溶液(A11)，制備加入20μl稀釋128倍的(X)對照溶液(A11)的反應(yīng)溶液，類似地加入和保持PPO底物溶液。類似于實施例41(2)，制備保持后的各種反應(yīng)溶液并在上述分析條件2下進(jìn)行反相HPLC分析以測量PPIX的量。加入(X)代謝溶液(A11)的反應(yīng)溶液中PPIX的量多于加入(X)對照溶液(A11)的反應(yīng)溶液中PPIX的量。
(2)通過本發(fā)明蛋白質(zhì)(A11)的化合物(XII)的代謝除了使用20μl在實施例32(2)中回收的上清液級分而不是20μl在實施例4(2)中回收的上清液級分以外，按照實施例41(2)所述方法制備和保持反應(yīng)溶液。類似于實施例41(2)，用乙酸乙酯萃取保持后的各種反應(yīng)溶液，并將獲得的殘余物溶解在100μl 50mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)中。在上述分析條件1下在HPLC上分析獲得的溶液(以下，將來自包含組分A，組分B，組分C和20μl在實施例32(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的溶液稱為“(XII)代謝溶液(A11)”；另外，將來自不包含組分A，不包含組分B，不包含組分C和不包含在實施例32(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的溶液稱為“(XII)對照溶液(A11)”)。與從(XII)對照溶液(A11)檢測的化合物(XII)的濃度相比，從(XII)代謝溶液(A11)檢測的化合物(XII)的濃度較低。另外從(XII)代謝溶液(A11)檢測到峰，其從(XII)對照溶液(A11)中未檢測到。在HPLC上所述峰的洗脫時間與質(zhì)量比在實施例41(2)(XII)代謝溶液(A1)中檢測的所述化合物(XII)小14的化合物的峰洗脫時間相配。
(3)通過本發(fā)明蛋白質(zhì)(A11)的化合物(XIII)的代謝除了使用20μl在實施例32(2)中回收的上清液級分而不是20μl在實施例4(2)中回收的上清液級分以外，按照實施例41(3)所述方法制備和保持反應(yīng)溶液。類似于實施例41(2)，用乙酸乙酯萃取保持后的各種反應(yīng)溶液，并將獲得的殘余物溶解在100μl二甲亞砜中。在上述分析條件1下在HPLC上分析獲得的溶液(以下，將來自包含組分A，組分B，組分C和20μl在實施例32(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的溶液稱為“(XIII)代謝溶液(A11)”；另外，將來自不包含組分A，不包含組分B，不包含組分C和不包含在實施例32(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的溶液稱為“(XIII)對照溶液(A11)”)。與從(XIII)對照溶液(A11)檢測的化合物(XIII)的濃度相比，從(XIII)代謝溶液(A11)檢測的化合物(XIII)的濃度較低。另外從(XIII)代謝溶液(A11)檢測到峰，其從(XIII)對照溶液(A11)中未檢測到。在HPLC上所述峰的洗脫時間與質(zhì)量比在實施例41(3)(XIII)代謝溶液(A11)中檢測的所述化合物(XIII)小14的化合物的峰洗脫時間相配。
(4)通過本發(fā)明蛋白質(zhì)(A11)的化合物(XVI)的代謝除了使用20μl在實施例32(2)中回收的上清液級分而不是20μl在實施例4(2)中回收的上清液級分以外，按照實施例41(4)所述方法制備和保持反應(yīng)溶液。類似于實施例41(2)，用乙酸乙酯萃取保持后的各種反應(yīng)溶液，并將獲得的殘余物溶解在200μl 50mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)中。在上述分析條件1下在HPLC上分析獲得的溶液(以下，將來自包含組分A，組分B，組分C和20μl在實施例32(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的溶液稱為“(XVI)代謝溶液(A11)”；另外，將來自不包含組分A，不包含組分B，不包含組分C和不包含在實施例32(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的溶液稱為“(XVI)對照溶液(A11)”)。與從(XVI)對照溶液(A11)檢測的化合物(XVI)的濃度相比，從(XVI)代謝溶液(A11)檢測的化合物(XVI)的濃度較低。另外從(XVI)代謝溶液(A11)檢測到峰，其從(XVI)對照溶液(A11)中未檢測到。在HPLC上所述峰的洗脫時間與在實施例41(4)中從(XVI)代謝溶液(A11)中檢測到和在(XVI)對照溶液(A11)中未檢測到的峰的洗脫時間相配。
(5)通過本發(fā)明蛋白質(zhì)(A11)的化合物(XVII)的代謝除了使用20μl在實施例32(2)中回收的上清液級分而不是20μl在實施例4(2)中回收的上清液級分以外，按照實施例41(5)所述方法制備和保持反應(yīng)溶液。類似于實施例41(2)，用乙酸乙酯萃取保持后的各種反應(yīng)溶液，并將獲得的殘余物溶解在200μl 50mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)中。在上述分析條件1下在HPLC上分析獲得的溶液(以下，將來自包含組分A，組分B，組分C和20μl在實施例32(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的溶液稱為“(XVII)代謝溶液(A11)”；另外，將來自不包含組分A，不包含組分B，不包含組分C和不包含在實施例32(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的溶液稱為“(XVII)對照溶液(A11)”)。與從(XVII)對照溶液(A11)檢測的化合物(XVII)的濃度相比，從(XVII)代謝溶液(A11)檢測的化合物(XVII)的濃度較低。另外從(XVII)代謝溶液(A11)檢測到峰，其從(XVII)對照溶液(A11)中未檢測到。在HPLC上所述峰的洗脫時間與在實施例41(5)中從(XVII)代謝溶液(A1)中檢測到和在(XVII)對照溶液(A1)中未檢測到的峰的洗脫時間相配。
實施例43通過本發(fā)明蛋白質(zhì)(A2)，(A3)，(A12)，(A13)，(A14)或(A15)或本發(fā)明蛋白質(zhì)(A10)的化合物的代謝(1)通過本發(fā)明蛋白質(zhì)(A2)的化合物(XII)的代謝除了使用20μl在實施例7(2)中回收的上清液級分而不是20μl在實施例4(2)中回收的上清液級分以外，按照實施例41(2)所述方法制備和保持反應(yīng)溶液。類似于實施例41(2)，用乙酸乙酯萃取保持后的各種反應(yīng)溶液，并將獲得的殘余物溶解在100μl 50mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)中。在上述分析條件1下在HPLC上分析獲得的溶液(以下，將來自包含組分A，組分B，組分C和20μl在實施例7(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的溶液稱為“(XII)代謝溶液(A2)”；另外，將來自不包含組分A，不包含組分B，不包含組分C和不包含在實施例7(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的溶液稱為“(XII)對照溶液(A2)”)。與從(XII)對照溶液(A2)檢測的化合物(XII)的濃度相比，從(XII)代謝溶液(A2)檢測的化合物(XII)的濃度較低。另外從(XII)代謝溶液(A2)檢測到峰，其從(XII)對照溶液(A2)中未檢測到。在HPLC上所述峰的洗脫時間與質(zhì)量比在實施例41(2)的(XII)代謝溶液(A1)中檢測的所述化合物(XII)小14的化合物的峰洗脫時間相配。
(2)通過本發(fā)明蛋白質(zhì)(A3)的化合物(XII)的代謝除了使用20μl在實施例12(2)中回收的上清液級分而不是20μl在實施例4(2)中回收的上清液級分以外，按照實施例41(2)所述方法制備和保持反應(yīng)溶液。類似于實施例41(2)，用乙酸乙酯萃取保持后的各種反應(yīng)溶液，并將獲得的殘余物溶解在100μl 50mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)中。在上述分析條件1下在HPLC上分析獲得的溶液(以下，將來自包含組分A，組分B，組分C和20μl在實施例12(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的溶液稱為“(XII)代謝溶液(A3)”；另外，將來自不包含組分A，不包含組分B，不包含組分C和不包含在實施例7(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的溶液稱為“(XII)對照溶液(A3)”)。與從(XII)對照溶液(A3)檢測的化合物(XII)的濃度相比，從(XII)代謝溶液(A3)檢測的化合物(XII)的濃度較低。另外從(XII)代謝溶液(A3)檢測到峰，其從(XII)對照溶液(A3)中未檢測到。在HPLC上所述峰的洗脫時間與質(zhì)量比在實施例41(2)的(XII)代謝溶液(A1)中檢測的所述化合物(XII)小14的化合物的峰洗脫時間相配。
(3)通過本發(fā)明蛋白質(zhì)(A10)的化合物(XII)的代謝除了使用20μl在實施例10(2)中回收的上清液級分而不是20μl在實施例4(2)中回收的上清液級分以外，按照實施例41(2)所述方法制備和保持反應(yīng)溶液。類似于實施例41(2)，用乙酸乙酯萃取保持后的各種反應(yīng)溶液，并將獲得的殘余物溶解在100μl 50mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)中。在上述分析條件1下在HPLC上分析獲得的溶液(以下，將來自包含組分A，組分B，組分C和20μl在實施例10(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的溶液稱為“(XII)代謝溶液(A10)”；另外，將來自不包含組分A，不包含組分B，不包含組分C和不包含在實施例12(3)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的溶液稱為“(XII)對照溶液(A10)”)。與從(XII)對照溶液(A10)檢測的化合物(XII)的濃度相比，從(XII)代謝溶液(A10)檢測的化合物(XII)的濃度較低。另外從(XII)代謝溶液(A10)檢測到峰，其從(XII)對照溶液(A10)中未檢測到。在HPLC上所述峰的洗脫時間與質(zhì)量比在實施例41(2)的(XII)代謝溶液(A1)中檢測的所述化合物(XII)小14的化合物的峰洗脫時間相配。
(4)通過本發(fā)明蛋白質(zhì)(A12)的化合物(XII)的代謝除了使用20μl在實施例34(2)中回收的上清液級分而不是20μl在實施例4(2)中回收的上清液級分以外，按照實施例41(2)所述方法制備和保持反應(yīng)溶液。類似于實施例41(2)，用乙酸乙酯萃取保持后的各種反應(yīng)溶液，并將獲得的殘余物溶解在100μl 50mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)中。在上述分析條件1下在HPLC上分析獲得的溶液(以下，將來自包含組分A，組分B，組分C和20μl在實施例34(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的溶液稱為“(XII)代謝溶液(A12)”；另外，將來自不包含組分A，不包含組分B，不包含組分C和不包含在實施例34(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的溶液稱為“(XII)對照溶液(A12)”)。與從(XII)對照溶液(A12)檢測的化合物(XII)的濃度相比，從(XII)代謝溶液(A12)檢測的化合物(XII)的濃度較低。另外從(XII)代謝溶液(A12)檢測到峰，其從(XII)對照溶液(A12)中未檢測到。在HPLC上所述峰的洗脫時間與質(zhì)量比在實施例41(2)的(XII)代謝溶液(A1)中檢測的所述化合物(XII)小14的化合物的峰洗脫時間相配。
(5)通過本發(fā)明蛋白質(zhì)(A13)的化合物(XII)的代謝除了使用20μl在實施例36(2)中回收的上清液級分而不是20μl在實施例4(2)中回收的上清液級分以外，按照實施例41(2)所述方法制備和保持反應(yīng)溶液。類似于實施例41(2)，用乙酸乙酯萃取保持后的各種反應(yīng)溶液，并將獲得的殘余物溶解在100μl 50mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)中。在上述分析條件1下在HPLC上分析獲得的溶液(以下，將來自包含組分A，組分B，組分C和20μl在實施例36(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的溶液稱為“(XII)代謝溶液(A13)”；另外，將來自不包含組分A，不包含組分B，不包含組分C和不包含在實施例36(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的溶液稱為“(XII)對照溶液(A13)”)。與從(XII)對照溶液(A13)檢測的化合物(XII)的濃度相比，從(XII)代謝溶液(A13)檢測的化合物(XII)的濃度較低。另外從(XII)代謝溶液(A13)檢測到峰，其從(XII)對照溶液(A13)中未檢測到。在HPLC上所述峰的洗脫時間與質(zhì)量比在實施例41(2)的(XII)代謝溶液(A1)中檢測的所述化合物(XII)小14的化合物的峰洗脫時間相配。
(6)通過本發(fā)明蛋白質(zhì)(A14)的化合物(XII)的代謝除了使用20μl在實施例38(2)中回收的上清液級分而不是20μl在實施例4(2)中回收的上清液級分以外，按照實施例41(2)所述方法制備和保持反應(yīng)溶液。類似于實施例41(2)，用乙酸乙酯萃取保持后的各種反應(yīng)溶液，并將獲得的殘余物溶解在100μl 50mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)中。在上述分析條件1下在HPLC上分析獲得的溶液(以下，將來自包含組分A，組分B，組分C和20μl在實施例38(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的溶液稱為“(XII)代謝溶液(A14)”；另外，將來自不包含組分A，不包含組分B，不包含組分C和不包含在實施例38(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的溶液稱為“(XII)對照溶液(A14)”)。與從(XII)對照溶液(A14)檢測的化合物(XII)的濃度相比，從(XII)代謝溶液(A14)檢測的化合物(XII)的濃度較低。另外從(XII)代謝溶液(A14)檢測到峰，其從(XII)對照溶液(A14)中未檢測到。在HPLC上所述峰的洗脫時間與質(zhì)量比在實施例41(2)的(XII)代謝溶液(A1)中檢測的所述化合物(XII)小14的化合物的峰洗脫時間相配。
(7)通過本發(fā)明蛋白質(zhì)(A15)的化合物(XII)的代謝除了使用20μl在實施例40(2)中回收的上清液級分而不是20μl在實施例4(2)中回收的上清液級分以外，按照實施例41(2)所述方法制備和保持反應(yīng)溶液。類似于實施例41(2)，用乙酸乙酯萃取保持后的各種反應(yīng)溶液，并將獲得的殘余物溶解在100μl 50mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)中。在上述分析條件1下在HPLC上分析獲得的溶液(以下，將來自包含組分A，組分B，組分C和20μl在實施例40(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的溶液稱為“(XII)代謝溶液(A15)”；另外，將來自不包含組分A，不包含組分B，不包含組分C和不包含在實施例40(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的溶液稱為“(XII)對照溶液(A15)”)。與從(XII)對照溶液(A15)檢測的化合物(XII)的濃度相比，從(XII)代謝溶液(A15)檢測的化合物(XII)的濃度較低。另外從(XII)代謝溶液(A15)檢測到峰，其從(XII)對照溶液(A15)中未檢測到。在HPLC上所述峰的洗脫時間與質(zhì)量比在實施例41(2)的(XII)代謝溶液(A1)中檢測的所述化合物(XII)小14的化合物的峰洗脫時間相配。
(8)通過本發(fā)明蛋白質(zhì)(A2)的化合物(XIII)的代謝除了使用20μl在實施例7(2)中回收的上清液級分而不是20μl在實施例4(2)中回收的上清液級分以外，按照實施例41(3)所述方法制備和保持反應(yīng)溶液。類似于實施例41(2)，用乙酸乙酯萃取保持后的各種反應(yīng)溶液，并將獲得的殘余物溶解在100μl二甲亞砜中。在上述分析條件1下在HPLC上分析獲得的溶液(以下，將來自包含組分A，組分B，組分C和20μl在實施例7(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的溶液稱為“(XIII)代謝溶液(A2)”；另外，將來自不包含組分A，不包含組分B，不包含組分C和不包含在實施例7(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的溶液稱為“(XIII)對照溶液(A2)”)。與從(XIII)對照溶液(A2)檢測的化合物(XIII)的濃度相比，從(XIII)代謝溶液(A2)檢測的化合物(XIII)的濃度較低。另外從(XIII)代謝溶液(A2)檢測到峰，其從(XIII)對照溶液(A2)中未檢測到。在HPLC上所述峰的洗脫時間與質(zhì)量比在實施例41(3)的(XIII)代謝溶液(A1)中檢測的所述化合物(XIII)小14的化合物的峰洗脫時間相配。
(9)通過本發(fā)明蛋白質(zhì)(A3)的化合物(XIII)的代謝除了使用20μl在實施例12(2)中回收的上清液級分而不是20μl在實施例4(2)中回收的上清液級分以外，按照實施例41(3)所述方法制備和保持反應(yīng)溶液。類似于實施例41(2)，用乙酸乙酯萃取保持后的各種反應(yīng)溶液，并將獲得的殘余物溶解在100μl二甲亞砜中。在上述分析條件1下在HPLC上分析獲得的溶液(以下，將來自包含組分A，組分B，組分C和20μl在實施例12(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的溶液稱為“(XIII)代謝溶液(A3)”；另外，將來自不包含組分A，不包含組分B，不包含組分C和不包含在實施例12(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的溶液稱為“(XIII)對照溶液(A3)”)。與從(XIII)對照溶液(A3)檢測的化合物(XIII)的濃度相比，從(XIII)代謝溶液(A3)檢測的化合物(XIII)的濃度較低。另外從(XIII)代謝溶液(A3)檢測到峰，其從(XIII)對照溶液(A3)中未檢測到。在HPLC上所述峰的洗脫時間與質(zhì)量比在實施例41(3)的(XIII)代謝溶液(A1)中檢測的所述化合物(XIII)小14的化合物的峰洗脫時間相配。
(10)通過本發(fā)明蛋白質(zhì)(A10)的化合物(XIII)的代謝除了使用20μl在實施例10(2)中回收的上清液級分而不是20μl在實施例4(2)中回收的上清液級分以外，按照實施例41(3)所述方法制備和保持反應(yīng)溶液。類似于實施例41(2)，用乙酸乙酯萃取保持后的各種反應(yīng)溶液，并將獲得的殘余物溶解在100μl二甲亞砜中。在上述分析條件1下在HPLC上分析獲得的溶液(以下，將來自包含組分A，組分B，組分C和20μl在實施例10(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的溶液稱為“(XIII)代謝溶液(A10)”；另外，將來自不包含組分A，不包含組分B，不包含組分C和不包含在實施例10(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的溶液稱為“(XIII)對照溶液(A10)”)。與從(XIII)對照溶液(A10)檢測的化合物(XIII)的濃度相比，從(XIII)代謝溶液(A10)檢測的化合物(XIII)的濃度較低。另外從(XIII)代謝溶液(A10)檢測到峰，其從(XIII)對照溶液(A10)中未檢測到。在HPLC上所述峰的洗脫時間與質(zhì)量比在實施例41(3)的(XIII)代謝溶液(A1)中檢測的所述化合物(XIII)小14的化合物的峰洗脫時間相配。
(11)通過本發(fā)明蛋白質(zhì)(A12)的化合物(XIII)的代謝除了使用20μl在實施例34(2)中回收的上清液級分而不是20μl在實施例4(2)中回收的上清液級分以外，按照實施例41(3)所述方法制備和保持反應(yīng)溶液。類似于實施例41(2)，用乙酸乙酯萃取保持后的各種反應(yīng)溶液，并將獲得的殘余物溶解在100μl二甲亞砜中。在上述分析條件1下在HPLC上分析獲得的溶液(以下，將來自包含組分A，組分B，組分C和20μl在實施例34(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的溶液稱為“(XIII)代謝溶液(A12)”；另外，將來自不包含組分A，不包含組分B，不包含組分C和不包含在實施例34(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的溶液稱為“(XIII)對照溶液(A12)”)。與從(XIII)對照溶液(A12)檢測的化合物(XIII)的濃度相比，從(XIII)代謝溶液(A12)檢測的化合物(XIII)的濃度較低。另外從(XIII)代謝溶液(A12)檢測到峰，其從(XIII)對照溶液(A12)中未檢測到。在HPLC上所述峰的洗脫時間與質(zhì)量比在實施例41(3)的(XIII)代謝溶液(A1)中檢測的所述化合物(XIII)小14的化合物的峰洗脫時間相配。
(12)通過本發(fā)明蛋白質(zhì)(A13)的化合物(XIII)的代謝除了使用20μl在實施例36(2)中回收的上清液級分而不是20μl在實施例4(2)中回收的上清液級分以外，按照實施例41(3)所述方法制備和保持反應(yīng)溶液。類似于實施例41(2)，用乙酸乙酯萃取保持后的各種反應(yīng)溶液，并將獲得的殘余物溶解在100μl二甲亞砜中。在上述分析條件1下在HPLC上分析獲得的溶液(以下，將來自包含組分A，組分B，組分C和20μl在實施例36(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的溶液稱為“(XIII)代謝溶液(A13)”；另外，將來自不包含組分A，不包含組分B，不包含組分C和不包含在實施例36(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的溶液稱為“(XIII)對照溶液(A13)”)。與從(XIII)對照溶液(A13)檢測的化合物(XIII)的濃度相比，從(XIII)代謝溶液(A13)檢測的化合物(XIII)的濃度較低。另外從(XIII)代謝溶液(A13)檢測到峰，其從(XIII)對照溶液(A13)中未檢測到。在HPLC上所述峰的洗脫時間與質(zhì)量比在實施例41(3)的(XIII)代謝溶液(A1)中檢測的所述化合物(XIII)小14的化合物的峰洗脫時間相配。
(13)通過本發(fā)明蛋白質(zhì)(A14)的化合物(XIII)的代謝除了使用20μl在實施例38(2)中回收的上清液級分而不是20μl在實施例4(2)中回收的上清液級分以外，按照實施例41(3)所述方法制備和保持反應(yīng)溶液。類似于實施例41(2)，用乙酸乙酯萃取保持后的各種反應(yīng)溶液，并將獲得的殘余物溶解在100μl 甲亞砜中。在上述分析條件1下在HPLC上分析獲得的溶液(以下，將來自包含組分A，組分B，組分C和20μl在實施例38(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的溶液稱為“(XIII)代謝溶液(A14)”；另外，將來自不包含組分A，不包含組分B，不包含組分C和不包含在實施例38(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的溶液稱為“(XIII)對照溶液(A14)”)。與從(XIII)對照溶液(A14)檢測的化合物(XIII)的濃度相比，從(XIII)代謝溶液(A14)檢測的化合物(XIII)的濃度較低。另外從(XIII)代謝溶液(A14)檢測到峰，其從(XIII)對照溶液(A14)中未檢測到。在HPLC上所述峰的洗脫時間與質(zhì)量比在實施例41(3)的(XIII)代謝溶液(A1)中檢測的所述化合物(XIII)小14的化合物的峰洗脫時間相配。
(14)通過本發(fā)明蛋白質(zhì)(A15)的化合物(XIII)的代謝除了使用20μl在實施例40(2)中回收的上清液級分而不是20μl在實施例4(2)中回收的上清液級分以外，按照實施例41(3)所述方法制備和保持反應(yīng)溶液。類似于實施例41(2)，用乙酸乙酯萃取保持后的各種反應(yīng)溶液，并將獲得的殘余物溶解在100μl二甲亞砜中。在上述分析條件1下在HPLC上分析獲得的溶液(以下，將來自包含組分A，組分B，組分C和20μl在實施例40(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的溶液稱為“(XIII)代謝溶液(A15)”；另外，將來自不包含組分A，不包含組分B，不包含組分C和不包含在實施例40(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的溶液稱為“(XIII)對照溶液(A15)”)。與從(XIII)對照溶液(A15)檢測的化合物(XIII)的濃度相比，從(XIII)代謝溶液(A15)檢測的化合物(XIII)的濃度較低。另外從(XIII)代謝溶液(A15)檢測到峰，其從(XIII)對照溶液(A15)中未檢測到。在HPLC上所述峰的洗脫時間與質(zhì)量比在實施例41(3)的(XIII)代謝溶液(A1)中檢測的所述化合物(XIII)小14的化合物的峰洗脫時間相配。
實施例44識別本發(fā)明蛋白質(zhì)(A1)的本發(fā)明抗體(A)(以下稱為“本發(fā)明抗體(A1)”)的制備(1)表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A1)的大腸桿菌提取物的制備按照實施例4(2)所述方法，將表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A1)的大腸桿菌JM109/pKSN657F預(yù)培養(yǎng)過夜，然后在包含50μg/ml氨芐青霉素的1L TB培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在回收和破裂細(xì)胞以后，從獲得的細(xì)胞裂解液中制備上清液級分(大腸桿菌pKSN657F提取物)。
(2)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A1)的純化通過將在實施例44(1)中獲得的上清液級分(大腸桿菌pKSN657F提取物)依次進(jìn)行Hiload HiLoad26/10 Q Sepharose HP柱和然后Bio-ScaleCeramic羥磷灰石，I型柱CHT10-1柱，按照實施例2(4)所述方法純化本發(fā)明蛋白質(zhì)(A1)。在10％-20％ SDS-PAGE上分析純化的級分，以證實那些是僅為本發(fā)明蛋白質(zhì)(A1)的級分。
(3)本發(fā)明抗體(A1)的制備將在實施例44(2)中制備的本發(fā)明蛋白質(zhì)(A1)溶解在0.05M磷酸鉀緩沖液(pH7.0)中，以使?jié)舛葹?mg/ml。將已經(jīng)在42℃-43℃溫育的四十微升(40μl)RAS(MPL(單磷酰基脂A)+TDM(合成海藻糖Dicorynomycolate)+CWS(細(xì)胞壁骨架)佐劑系統(tǒng)(Sigma Company))加入并充分混合到2ml獲得的溶液中。分別將獲得的混合物以每只兔子1ml施用到新西蘭白兔(雌性，14周齡，平均2.4kg)上。因此，將100μl皮下注射到背部10個位置。在每3周和5周后施用第一次給藥量的約1/2。在該時間期間，通過從兔子的耳靜脈取血樣測量抗體效價。因為抗體效價在第三次給藥后增加，將第三次給藥后2周的免疫兔子被從頸部放血。將獲得的血液加入Separapit Tube(Sekisui Chemical Company)，在37℃下溫育2小時和然后離心(3000rpm，20分鐘，室溫)。通過回收上清液獲得抗血清(包含本發(fā)明抗體(A1))。
實施例45通過本發(fā)明抗體(A1)檢測本發(fā)明蛋白質(zhì)和檢測表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)的細(xì)胞通過使用在實施例44中獲得的本發(fā)明抗體(A1)對每個大腸桿菌提取物進(jìn)行免疫印跡。有以下提取物的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(40mA，1小時)在實施例4(2)中獲得的大腸桿菌pKSN657F提取物(包含約0.5pmol本發(fā)明蛋白質(zhì)(A1)，包含約0.78mg蛋白質(zhì))；在實施例4(2)中獲得的大腸桿菌pKSN2提取物(包含約0.78mg蛋白質(zhì))；在實施例7(2)中獲得的大腸桿菌pKSN923F提取物(包含約2pmol本發(fā)明蛋白質(zhì)(A2))；在實施例12(2)中獲得的大腸桿菌pKSN671F提取物(包含約2pmol本發(fā)明蛋白質(zhì)(A3))；在實施例27(2)中獲得的大腸桿菌pKSN646F提取物(包含約2pmol本發(fā)明蛋白質(zhì)(A4))；在實施例10(2)中獲得的大腸桿菌pKSN11796F提取物(包含約2pmol本發(fā)明蛋白質(zhì)(A10))；在實施例14(2)中獲得的大腸桿菌pKSNSCA提取物(包含約2pmol本發(fā)明蛋白質(zhì)(A9))；在實施例32(2)中獲得的大腸桿菌pKSN849AF提取物(包含約2pmol本發(fā)明蛋白質(zhì)(A11))；在實施例34(2)中獲得的大腸桿菌pKSN1618F提取物(包含約2pmol本發(fā)明蛋白質(zhì)(A12))；在實施例36(2)中獲得的大腸桿菌pKSN474F提取物(包含約2pmol本發(fā)明蛋白質(zhì)(A13))；在實施例38(2)中獲得的大腸桿菌pKSN1491AF提取物(包含約2pmol本發(fā)明蛋白質(zhì)(A14))；和在實施例40(2)中獲得的大腸桿菌pKSN1555AF提取物(包含約2pmol本發(fā)明蛋白質(zhì)(A15))。將PVDF膜放在凝膠上。通過用BioRad印跡裝置在4℃下30V處理2小時，同時在浸漬在轉(zhuǎn)移緩沖液(25mM Tris，192mM甘氨酸，10％甲醇)的條件下將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在用TBS+吐溫20溶液(50mMTris-HCl(pH7.5)，200mM NaCl，0.05％吐溫20)洗滌以后，將獲得的PVDF膜在包含3％BSA的TBS+吐溫20溶液中溫育30分鐘，然后用于與稀釋30,000倍的上述抗血清在包含3％BSA的TBS+吐溫20溶液中反應(yīng)30分鐘。在反應(yīng)后，用TBS+吐溫20溶液洗滌PVDF膜2次。然后將PVDF膜用于在包含3％BSA的TBS+吐溫20溶液中與稀釋3000倍的用堿性磷酸酶(Santa Cruz Biotechnology Company)標(biāo)記的抗兔IgG山羊抗血清反應(yīng)30分鐘。在反應(yīng)后，用TBS+吐溫20溶液洗滌PVDF膜2次和浸漬在NBT-BCIP溶液(Sigma Company)中。檢測到對應(yīng)于本發(fā)明蛋白質(zhì)(A1)，(A2)，(A3)，(A4)，(A11)，(A12)，(A13)，(A14)和(A15)以及本發(fā)明蛋白質(zhì)(A9)和(A10)中每一個的條帶的染色。用在實施例4(2)中獲得的大腸桿菌pKSN2提取物(包含約0.78mg蛋白質(zhì))的試劑未檢測到染色條帶。
實施例46其中密碼子使用已經(jīng)針對在大豆中表達(dá)調(diào)整的本發(fā)明DNA(A1)(以下稱為“本發(fā)明DNA(A1)S”)的制備和表達(dá)(1)本發(fā)明DNA(A1)S的制備通過使用具有SEQ ID NO192所示核苷酸序列的引物和具有SEQ IDNO213所示核苷酸序列的引物，按照附帶的手冊用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo Company)進(jìn)行PCR。將獲得的PCR產(chǎn)物的等分部分用作類似地使用具有SEQ ID NO191所示核苷酸序列的引物和具有SEQ IDNO212所示核苷酸序列的引物進(jìn)行的PCR的模板。另外，將PCR產(chǎn)物的等分部分用作類似地使用具有SEQ ID NO190所示核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO211所示核苷酸序列的引物進(jìn)行的PCR的模板。將獲得的反應(yīng)溶液稱為反應(yīng)溶液1。
按照附帶的手冊，通過使用具有SEQ ID NO195所示核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO210所示核苷酸序列的引物，用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo Company)進(jìn)行PCR。將獲得的PCR產(chǎn)物的等分部分用作類似地使用具有SEQ ID NO194所示核苷酸序列的引物和具有SEQ IDNO209所示核苷酸序列的引物進(jìn)行的PCR的模板。另外，將PCR產(chǎn)物的等分部分用作類似地使用具有SEQ ID NO193所示核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO208所示核苷酸序列的引物進(jìn)行的PCR的模板。將獲得的反應(yīng)溶液稱為反應(yīng)溶液2。
按照附帶的手冊，通過使用具有SEQ ID NO198所示核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO207所示核苷酸序列的引物，用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo Company)進(jìn)行PCR。將獲得的PCR產(chǎn)物的等分部分用作類似地使用具有SEQ ID NO197所示核苷酸序列的引物和具有SEQ IDNO206所示核苷酸序列的引物進(jìn)行的PCR的模板。另外，將PCR產(chǎn)物的等分部分用作類似地使用具有SEQ ID NO196所示核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO205所示核苷酸序列的引物進(jìn)行的PCR的模板。將獲得的反應(yīng)溶液稱為反應(yīng)溶液3。
按照附帶的手冊，通過使用具有SEQ ID NO201所示核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO204所示核苷酸序列的引物，用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo Company)進(jìn)行PCR。將獲得的PCR產(chǎn)物的等分部分用作類似地使用具有SEQ ID NO200所示核苷酸序列的引物和具有SEQ IDNO203所示核苷酸序列的引物進(jìn)行的PCR的模板。另外，將PCR產(chǎn)物的等分部分用作類似地使用具有SEQ ID NO199所示核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO202所示核苷酸序列的引物進(jìn)行的PCR的模板。將獲得的反應(yīng)溶液稱為反應(yīng)溶液4。
將如此獲得的反應(yīng)溶液1至4混合。按照附帶的手冊，通過將其混合物的等分部分用作模板和使用具有SEQ ID NO190所示核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO202所示核苷酸序列的引物，用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo Company)進(jìn)行PCR。證實擴(kuò)增的DNA的核苷酸序列。獲得具有其中核苷酸序列5’-cat-3’連接到SEQ ID NO214所示核苷酸序列的5’末端上游和核苷酸序列5’-aagctt-3’連接到SEQ ID NO214所示核苷酸序列的3’末端下游的序列的DNA。
在表22和表23中顯示具有SEQ ID NO6所示核苷酸序列的本發(fā)明DNA(A1)的密碼子使用(GC含量70.58％)。在表24和表25中顯示大豆的密碼子使用(GC含量46.12％，由Kazusa DNA研究院出版的密碼子使用數(shù)據(jù)庫(http//www.kazusa.or.jp/codon))。在表26和表27中顯示具有SEQ ID NO214所示核苷酸序列的本發(fā)明DNA(A1)的密碼子使用(51.59％的GC含量)。
表22

表23


表24

表25

表26


表27

(2)具有本發(fā)明蛋白質(zhì)(A1)S的轉(zhuǎn)化大腸桿菌的生產(chǎn)用限制酶NdeI和HindIII消化在實施例46(1)中獲得的具有SEQ IDNO214所示核苷酸序列的DNA。將用NdeI和HindIII消化的獲得的DNA和質(zhì)粒pKSN2連接以獲得其中具有SEQ ID NO214所示核苷酸序列的DNA插入pKSN2的NdeI位點和HindIII位點之間的質(zhì)粒(以下稱為“pKSN657soy”)。將所述質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌JM109。將獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體稱為JM109/pKSN657soy。
(3)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A1)在大腸桿菌中的表達(dá)和所述蛋白質(zhì)的回收類似于實施例4(2)，培養(yǎng)在實施例46(2)中獲得的大腸桿菌JM109/pKSN657soy和在實施例4(1)中獲得的大腸桿菌JM109/pKSN657中的每一個?；厥占?xì)胞。制備細(xì)胞裂解液。在實施例4(2)所述方法下，從細(xì)胞裂解液中制備上清液級分(以下，將從大腸桿菌JM109/pKSN657soy獲得的上清液級分稱為“大腸桿菌pKSN657soy提取物”和將從大腸桿菌JM109/pKSN657獲得的上清液級分稱為“大腸桿菌JM109/pKSN657提取物”)。在大腸桿菌pKSN657soy提取物中包含的每一蛋白質(zhì)的的量的P450的量可以比得上和高于在大腸桿菌pKSN657提取物中包含的每一蛋白質(zhì)的量的P450的量。
實施例47將本發(fā)明DNA(A1)S導(dǎo)入植物(1)用于直接導(dǎo)入的包含本發(fā)明DNA(A1)S的葉綠體表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建-部分1構(gòu)建包含嵌合DNA的質(zhì)粒作為用基因槍法將本發(fā)明DNA(A1)S導(dǎo)入植物的質(zhì)粒，所述嵌合DNA中本發(fā)明DNA(A1)S緊接在編碼大豆(cv.Jack)RuBPC小亞基葉綠體轉(zhuǎn)運肽的核苷酸序列之后而沒有密碼子框的變化。
首先，通過PCR擴(kuò)增包含SEQ ID NO214所示核苷酸序列的DNA。通過將在實施例46(2)中獲得的pKSN657soy用作模板和通過將由SEQ IDNO394所示核苷酸序列組成的寡核苷酸和由SEQ ID NO395所示核苷酸序列組成的寡核苷酸用作引物來進(jìn)行PCR。PCR使用KOD-plus(ToyoboCompany)。依照以下進(jìn)行PCR在94℃下進(jìn)行保持2分鐘；30個循環(huán)，一個循環(huán)包括保持94℃ 30秒，接著50℃ 30秒，接著68℃ 60秒；和最后保持在68℃ 30秒。通過按照附帶手冊進(jìn)行程序用MagExtractor-PCR&Gel-Clean up(Toyobo Company)回收擴(kuò)增的DNA并純化。在用限制酶EcoT22I和SacI消化純化的DNA以后，回收包含SEQID NO214所示核苷酸序列的DNA。在用限制酶EcoT22I和SacI消化在實施例16(2)中獲得的質(zhì)粒pUCrSt657以后，分離約2.9kbp的DNA，其具有來源于pUC19的核苷酸序列和編碼大豆(cv.Jack)RuBPC小亞基葉綠體轉(zhuǎn)運肽的序列。將獲得的DNA和包含SEQ ID NO214所示核苷酸序列的上述DNA連接以獲得包含嵌合DNA的pUCrSt657soy(圖48)，其中本發(fā)明DNA(A1)S緊接在編碼大豆(cv.Jack)RuBPC小亞基葉綠體轉(zhuǎn)運肽的核苷酸序列之后而沒有密碼子框的變化。
用限制酶BamHI和SacI消化獲得的質(zhì)粒pUCrSt657soy以分離包含SEQ ID NO214所示核苷酸序列的DNA。將所述DNA插入在實施例16(2)中獲得的質(zhì)粒pNdG6-AT的BglII限制酶位點和SacI限制酶位點之間以獲得質(zhì)粒pSUM-NdG6-rSt-657soy(圖49)，其中CR16G6啟動子已經(jīng)連接到嵌合DNA的下游，所述嵌合DNA中本發(fā)明DNA(A1)S緊接在編碼大豆(cv.Jack)RuBPC小亞基葉綠體轉(zhuǎn)運肽的核苷酸序列之后而沒有密碼子框的變化。
接下來，將質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞(Takara ShuzoCompany)和選擇氨芐青霉素抗性細(xì)胞。另外，通過使用BigDye終止循環(huán)測序簡易反應(yīng)試劑盒3.0版(PE Applied Biosystems Company)和DNA測序儀3100(PE Applied Biosystems Company)測定包含在所選氨芐青霉素抗性菌株中的質(zhì)粒的核苷酸序列。結(jié)果，證實質(zhì)粒pSUM-NdG6-rSt-657soy具有SEQ ID NO214所示核苷酸序列。
(2)用于直接導(dǎo)入的具有本發(fā)明DNA(A1)S的葉綠體表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建-部分(2)構(gòu)建用基因槍法將本發(fā)明DNA(A1)S導(dǎo)入植物的質(zhì)粒。該質(zhì)粒包含嵌合DNA，其中本發(fā)明DNA(A1)S緊接在編碼大豆(cv.Jack)RuBPC小亞基葉綠體轉(zhuǎn)運肽和編碼其后成熟蛋白質(zhì)的12個氨基酸的核苷酸序列之后而沒有密碼子框的變化。首先，通過PCR擴(kuò)增包含SEQ ID NO214所示核苷酸序列的DNA。通過將在實施例46(2)中獲得的pKSN657soy用作模板和通過將由SEQ ID NO395所示核苷酸序列組成的寡核苷酸和由SEQ ID NO396所示核苷酸序列組成的寡核苷酸用作引物來進(jìn)行PCR。PCR使用KOD-plus(Toyobo Company)。依照以下進(jìn)行PCR在94℃下進(jìn)行保持2分鐘；25個循環(huán)，一個循環(huán)包括保持94℃ 30秒，接著46℃ 30秒，接著68℃ 60秒；和最后保持在68℃ 3分鐘。通過按照附帶手冊進(jìn)行程序用MagExtractor-PCR&Gel-Clean up(Toyobo Company)回收擴(kuò)增的DNA并純化。在用限制酶SacI消化純化的DNA以后，回收包含SEQ ID NO214所示核苷酸序列的DNA。
用限制酶BspHI消化在實施例16(3)中獲得的質(zhì)粒pKFrSt12-657。然后通過按照附帶手冊使用TaKaRa BKL試劑盒(TaKaRa ShuzoCompany)將DNA平末端化和將5’末端去磷酸化。接下來，在用限制酶SacI消化DNA以后，分離來源于質(zhì)粒pKFrSt12的DNA。將所述DNA與用SacI消化和包含SEQ ID NO214所示核苷酸序列的DNA連接，以便獲得包含嵌合DNA的質(zhì)粒pKFrSt12-657soy(圖50)，在所述嵌合DNA中本發(fā)明DNA(A1)S緊接在編碼大豆(cv.Jack)RuBPC小亞基葉綠體轉(zhuǎn)運肽和編碼其后成熟蛋白質(zhì)的12個氨基酸的核苷酸序列之后而沒有密碼子框的變化。
用限制酶BamHI和SacI消化獲得的質(zhì)粒pKFrSt12-657soy以分離包含SEQ ID NO214所示核苷酸序列的DNA。將所述DNA插入質(zhì)粒pNdG6-AT的BglII限制酶位點和SacI限制酶位點之間以獲得質(zhì)粒pSUM-NdG6-rSt12-657soy(圖51)，其中CR16G6啟動子已經(jīng)連接到嵌合DNA的下游，所述嵌合DNA中所述DNA緊接在編碼大豆(cv.Jack)RuBPC小亞基葉綠體轉(zhuǎn)運肽的核苷酸序列之后而沒有密碼子框的變化。
接下來，將質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞(Takara ShuzoCompany)和選擇氨芐青霉素抗性細(xì)胞。另外，通過使用BigDye終止循環(huán)測序簡易反應(yīng)試劑盒3.0版(PE Applied Biosystems Company)和DNA測序儀3100(PE Applied Biosystems Company)測定包含在氨芐青霉素抗性菌株中的質(zhì)粒的核苷酸序列。結(jié)果，證實質(zhì)粒pSUM-NdG6-rSt12-657soy具有SEQ ID NO214所示核苷酸序列。
(3)將本發(fā)明DNA(A1)S導(dǎo)入大豆除了用B5培養(yǎng)基(O.L.Gamborg等，Exp.Cell Res.(1986)50 p151)的維生素來源替代MS培養(yǎng)基的維生素來源以外，按照實施例17(1)所述方法制備大豆(栽培品種Fayette和Jack)的球形胚。
將獲得的球形胚移植到新鮮體細(xì)胞胚生長培養(yǎng)基中和培養(yǎng)2-3天。按照實施例17(2)所述方法，將在實施例47(1)中構(gòu)建的質(zhì)粒pSUM-NdG6-rSt-657soy或在實施例47(2)中構(gòu)建的質(zhì)粒pSUM-NdG6-rSt12-657soy導(dǎo)入所述球形胚。
(4)用潮霉素選擇體細(xì)胞胚除了用B5培養(yǎng)基的維生素來源替代MS培養(yǎng)基的維生素來源以外，按照實施例17(3)所述方法進(jìn)行用潮霉素選擇在實施例47(3)中獲得的在基因?qū)牒蟮那蛐闻?。然而，在第二次移植后，將加?.2(w/v)％脫乙酰吉蘭糖膠的培養(yǎng)基或未加脫乙酰吉蘭糖膠的液體培養(yǎng)基用作體細(xì)胞胚選擇培養(yǎng)基。在液體培養(yǎng)基的情形中，培養(yǎng)具有每分鐘90和緩的旋轉(zhuǎn)。
(5)用化合物(II)選擇體細(xì)胞胚除了用B5培養(yǎng)基的維生素來源替代MS培養(yǎng)基的維生素來源以外，按照實施例17(4)所述方法進(jìn)行用化合物(II)選擇在實施例47(3)中獲得的導(dǎo)入基因以后的球形胚。
(6)從體細(xì)胞胚的植物再生，順應(yīng)和培養(yǎng)按照實施例17(5)所述方法，從在實施例47(4)或47(5)中選擇的球形胚進(jìn)行植物的再生。然而，將發(fā)育培養(yǎng)基中的瓊脂濃度調(diào)整至0.8(w/v)％或1.0(w/v)％。另外，用B5培養(yǎng)基的維生素來源替代發(fā)芽培養(yǎng)基的MS培養(yǎng)基的維生素來源。
相應(yīng)地用實施例17(6)所述方法將具有根和發(fā)育的葉子的植物進(jìn)行順應(yīng)和培養(yǎng)和收獲。
(7)對除草化合物(II)的抗性評估按照實施例17(4)所述方法評估在實施例47(6)中獲得的再生植物對化合物(II)的抗性程度。
(8)用于農(nóng)桿菌導(dǎo)入的具有本發(fā)明DNA(A1)S的葉綠體表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建構(gòu)建用農(nóng)桿菌法將本發(fā)明DNA(A1)S導(dǎo)入植物的質(zhì)粒。用限制酶NotI消化質(zhì)粒pSUM-NdG6-rSt-657soy以獲得嵌合DNA，其中本發(fā)明DNA(A1)S緊接在編碼大豆(cv.Jack)RuBPC小亞基葉綠體轉(zhuǎn)運肽的核苷酸序列之后而沒有密碼子框的變化。將所述DNA插入在實施例18中獲得的上述二元質(zhì)粒載體pBI121S的NotI限制位點中以獲得質(zhì)粒pBI-NdG6-rSt-657soy(圖52)。另外，用限制酶NotI消化質(zhì)粒pSUM-NdG6-rSt12-657soy以分離嵌合DNA，其中本發(fā)明DNA(A1)S緊接在編碼大(cv.Jack)RuBPC小亞基葉綠體轉(zhuǎn)運肽和編碼其后成熟蛋白質(zhì)的12個氨基酸的核苷酸序列之后而沒有密碼子框的變化。將該DNA插入上述二元質(zhì)粒載體pBI121S的NotI限制位點中以獲得質(zhì)粒pBI-NdG6-rSt12-657soy(圖53)。
(9)將本發(fā)明DNA(A1)S導(dǎo)入煙草使用在實施例47(8)中獲得的質(zhì)粒pBI-NdG6-rSt-657soy和pBI-NdG6-rSt12-657soy，用農(nóng)桿菌法將本發(fā)明DNA(A1)S導(dǎo)入煙草。
首先，按照實施例19所述方法，分別將質(zhì)粒pBI-NdG6-rSt-657soy和pBI-NdG6-rSt12-657soy導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404(Clontech Company)。分離具有pBI-NdG6-rSt-657soy或pBI-NdG6-rSt12-657soy的轉(zhuǎn)基因農(nóng)桿菌。
然后，除了在包含25mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中在30℃下過夜培養(yǎng)具有上述質(zhì)粒的轉(zhuǎn)基因農(nóng)桿菌以外，按照實施例19所述方法將所述農(nóng)桿菌用來將基因?qū)霟煵荨７謩e獲得已經(jīng)整合pBI-NdG6-rSt-657soy或pBI-NdG6-rSt12-657soy的T-DNA區(qū)域的轉(zhuǎn)基因煙草。
(10)使用本發(fā)明DNA(A1)S轉(zhuǎn)基因煙草的葉片的抗性評估從35株在實施例47(9)中獲得的轉(zhuǎn)基因煙草采集葉子。將每片葉子分成幾片，其中每片5-7mm寬。將葉片種植到含有0，0.05，0.1或0.2mg/L化合物(II)的MS瓊脂培養(yǎng)基上并在光照中在室溫下培養(yǎng)。在培養(yǎng)的第11天，觀察每個葉片的除草損傷。另外，將葉片種植到含有0，0.01，0.02，0.05或0.1mg/L化合物(XII)的MS瓊脂培養(yǎng)基上并在光照中在室溫下培養(yǎng)。在培養(yǎng)的第7天，觀察每個葉片的除草損傷。作為對照，將20個未進(jìn)行基因?qū)氲臒煵萑~片(以下，稱為“野生型煙草”)用于各個濃度。通過對連續(xù)生長的葉片記1分，對其中觀察到化學(xué)損傷的半枯萎的葉片記0.5分，和對變白和已經(jīng)枯萎的葉片記0分，測定對每組的平均分?jǐn)?shù)。對于化合物(II)和化合物(XII)中每一個，本發(fā)明DNA(A1)S(質(zhì)粒pBI-NdG6-rSt-657soy或pBI-NdG6-rSt12-657soy的T-DNA區(qū)域)已經(jīng)導(dǎo)入的煙草葉片提供比野生型煙草更高的分?jǐn)?shù)。
實施例48獲得本發(fā)明DNA(A16)(1)裝飾鏈霉菌IFO 13069t的染色體DNA的制備根據(jù)實施例31(1)所述方法，制備裝飾鏈霉菌IFO 13069t的染色體DNA。
(2)具有本發(fā)明DNA(A11)部分核苷酸序列的DNA的分離按照實施例29所述方法，通過將在實施例48(1)中從裝飾鏈霉菌IFO13069t制備的染色體DNA用作模板和通過使用引物對14進(jìn)行PCR。類似于實施例31(2)，將擴(kuò)增的DNA克隆到克隆載體pCRII-TOPO(InvitrogenCompany)。分析其序列。結(jié)果，提供在SEQ ID NO225所示核苷酸序列的核苷酸343至1069中所表示的核苷酸序列。
另外，用限制酶PvuII消化在實施例48(1)中制備的染色體DNA。按照實施例26(3)所述方法，通過使用獲得的DNA產(chǎn)生基因組步行文庫。通過使用獲得的文庫作為模板和通過使用具有SEQ ID NO265所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP1，在實施例26(3)所述條件下進(jìn)行PCR以獲得第一PCR產(chǎn)物。接下來，通過使用第一PCR產(chǎn)物作為模板和通過使用具有SEQ ID NO266所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP2，在實施例26(3)所述條件下進(jìn)行PCR。分析獲得的DNA的核苷酸序列。提供在SEQ ID NO235所示核苷酸序列的核苷酸1至501中所表示的核苷酸序列。
另外，用限制酶PvuII消化在實施例48(1)中制備的染色體DNA。按照實施例26(3)所述方法，通過使用獲得的DNA產(chǎn)生基因組步行文庫。通過使用獲得的文庫作為模板和通過使用具有SEQ ID NO267所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP1，在實施例26(3)所述條件下進(jìn)行PCR以獲得第一PCR產(chǎn)物。接下來，通過使用第一PCR產(chǎn)物作為模板和通過使用具有SEQ ID NO268所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP2，在實施例26(3)所述條件下進(jìn)行PCR。分析獲得的DNA的核苷酸序列。提供在SEQ ID NO235所示核苷酸序列的核苷酸1044至1454中所表示的核苷酸序列。
(3)本發(fā)明DNA(A16)的序列分析通過連接由實施例48(2)所獲DNA提供的核苷酸序列獲得在SEQ IDNO235中表示的核苷酸序列。在所述核苷酸序列中存在兩個可讀框(ORF)。因此，包含由1251個核苷酸(包括終止密碼子)組成和編碼416個氨基酸殘基(SEQ ID NO215)的核苷酸序列(SEQ ID NO225)以及由198個核苷酸(包括終止密碼子)組成和編碼65個氨基酸殘基(SEQ IDNO245)的核苷酸序列(SEQ ID NO255)。由SEQ ID NO225所示核苷酸序列編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO215)組成的蛋白質(zhì)的分子量據(jù)計算為46013Da。另外，由SEQ ID NO255所示核苷酸序列編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO245)組成的蛋白質(zhì)的分子量據(jù)計算為6768Da。
實施例49本發(fā)明DNA(A16)在大腸桿菌中的表達(dá)(1)具有本發(fā)明DNA(A16)的轉(zhuǎn)化大腸桿菌的產(chǎn)生通過使用GeneAmp High Fidelity PCR System(Applied BiosystemsJapan Company)和通過使用在實施例48(1)中從裝飾鏈霉菌IFO 13069t制備的染色體DNA作為模板進(jìn)行PCR。作為引物，使用具有SEQ ID NO269所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO286所示核苷酸序列的寡核苷酸的配對。通過加入2種每種總計200nM的引物，50ng上述染色體DNA，5.0μl dNTP混合物(4種dNTP每種2.0mM的混合物；Clontech公司)，5μl 10x緩沖液(包含MgCl2)和0.5μl GeneAmp HF酶混合物和通過加入蒸餾水，PCR反應(yīng)溶液總計50μl。PCR的反應(yīng)條件是在保持在97℃ 1分鐘后，重復(fù)10個循環(huán)，一個循環(huán)包括保持在97℃ 15秒，接著60℃ 30秒，接著72℃ 90秒；然后進(jìn)行15個循環(huán)，一個循環(huán)包括保持在97℃ 15秒，接著60℃ 30秒，接著72℃ 90秒(其中每個循環(huán)保持在72℃增加20秒)；和然后保持72℃ 7分鐘。類似于實施例32(1)，從PCR反應(yīng)溶液中純化DNA并克隆到克隆載體pCRII-TOPO(InvitrogenCompany)中。通過將分別具有SEQ ID NO57，59，267，286和288所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物分析獲得的質(zhì)粒DNA的核苷酸序列?；讷@得的結(jié)果，將具有SEQ ID NO235所示核苷酸序列的質(zhì)粒稱為pCR452F。類似于實施例32(1)，用限制酶NdeI和HindIII消化pCR452F。從消化產(chǎn)物中純化約1.5kbp的DNA。連接用NdeI和HindIII消化的獲得的DNA和質(zhì)粒pKSN2以獲得包含SEQ ID NO235所示核苷酸序列的質(zhì)粒，其中將編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)(A16)的DNA插入pKSN2的NdeI位點和HindIII位點之間(以下稱為“pKSN452F”)。將所述質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌JM109。將獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體稱為JM109/pKSN452F。
(2)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A16)在大腸桿菌中的表達(dá)和所述蛋白質(zhì)的回收類似于實施例4(2)，培養(yǎng)大腸桿菌JM109/pKSN452F和JM109/pKSN2中的每一個?；厥占?xì)胞。制備細(xì)胞裂解液。在實施例4(2)所述方法下，從細(xì)胞裂解液中制備上清液級分(以下，將獲自大腸桿菌JM109/pKSN452F的上清液級分稱為“大腸桿菌pKSN452F提取物”，將獲自大腸桿菌JM109/pKSN2的上清液級分稱為“大腸桿菌pKSN2提取物”)。
(3)將化合物(II)轉(zhuǎn)化為化合物(III)的能力的檢測類似實施例32(3)，制備30μ1的反應(yīng)溶液并保持在30℃下10分鐘。然而，作為上清液級分，使用在實施例49(2)中制備的上清液級分(大腸桿菌pKSN452F提取物或大腸桿菌pKSN2提取物)。用乙酸乙酯萃取保持后的反應(yīng)溶液并將萃取層TLC分析。在展開TLC板以后，檢查其上對應(yīng)于用14C標(biāo)記的化合物(III)的斑點的存在(Rf值0.24和0.29)。從包含大腸桿菌pKSN452F提取物的反應(yīng)溶液中檢測到對應(yīng)于化合物(III)的斑點。與此對比，在包含大腸桿菌pKSN2提取物的反應(yīng)溶液中未檢測到該斑點。
實施例50獲得本發(fā)明DNA(A17)(1)灰色鏈霉菌ATCC 10137的染色體DNA的制備根據(jù)實施例31(1)所述方法，制備灰色鏈霉菌ATCC 10137的染色體DNA。
(2)具有本發(fā)明DNA(A17)部分核苷酸序列的DNA的分離按照實施例29所述方法，通過將在實施例50(1)中從灰色鏈霉菌ATCC 10137制備的染色體DNA用作模板和通過使用引物對14進(jìn)行PCR。類似于實施例31(2)，將擴(kuò)增的DNA克隆到克隆載體pCRII-TOPO(Invitrogen Company)。分析其核苷酸序列。結(jié)果，提供在SEQ ID NO226所示核苷酸序列的核苷酸343至1069中所表示的核苷酸序列。
另外，用限制酶SmaI消化在實施例50(1)中制備的染色體DNA。按照實施例26(3)所述方法，通過使用獲得的DNA產(chǎn)生基因組步行文庫。通過使用獲得的文庫作為模板和通過使用具有SEQ ID NO270所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP1，在實施例26(3)所述條件下進(jìn)行PCR以獲得第一PCR產(chǎn)物。接下來，通過使用第一PCR產(chǎn)物作為模板和通過使用具有SEQ ID NO271所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP2，在實施例26(3)所述條件下進(jìn)行PCR。分析獲得的DNA的核苷酸序列。提供在SEQ ID NO236所示核苷酸序列的核苷酸1至361中所表示的核苷酸序列。
另外，用限制酶PvuII消化在實施例50(1)中制備的染色體DNA。按照實施例26(3)所述方法，通過使用獲得的DNA產(chǎn)生基因組步行文庫。通過使用獲得的文庫作為模板和通過使用具有SEQ ID NO272所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP1，在實施例26(3)所述條件下進(jìn)行PCR以獲得第一PCR產(chǎn)物。接下來，通過使用第一PCR產(chǎn)物作為模板和通過使用具有SEQ ID NO273所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP2，在實施例26(3)所述條件下進(jìn)行PCR。分析獲得的DNA的核苷酸序列。提供在SEQ ID NO236所示核苷酸序列的核苷酸1035至1454中所表示的核苷酸序列。
(3)本發(fā)明DNA(A17)的序列分析通過連接由實施例50(2)所獲DNA提供的核苷酸序列獲得在SEQ IDNO236中表示的核苷酸序列。在所述核苷酸序列中存在兩個可讀框(ORF)。因此，包含由1251個核苷酸(包括終止密碼子)組成和編碼416個氨基酸殘基(SEQ ID NO216)的核苷酸序列(SEQ ID NO226)以及由198個核苷酸(包括終止密碼子)組成和編碼65個氨基酸殘基(SEQ IDNO246)的核苷酸序列(SEQ ID NO256)。由SEQ ID NO226所示核苷酸序列編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO216)組成的蛋白質(zhì)的分子量據(jù)計算為46082Da。由SEQ ID NO256所示核苷酸序列編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO246)組成的蛋白質(zhì)的分子量據(jù)計算為6768Da。在SEQ IDNO256中所示的核苷酸序列與在SEQ ID NO255中所示核苷酸序列100％相同。在SEQ ID NO246中表示的氨基酸序列與在SEQ ID NO245中表示的氨基酸序列100％相同。
實施例51本發(fā)明DNA(A17)在大腸桿菌中的表達(dá)(1)具有本發(fā)明DNA(A17)的轉(zhuǎn)化大腸桿菌的產(chǎn)生除了使用從實施例50(1)的灰色鏈霉菌ATCC 10137中制備的染色體DNA作為模板和使用具有SEQ ID NO274所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO275所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物以外，類似于實施例32(1)進(jìn)行PCR。類似于實施例32(1)，從PCR反應(yīng)溶液中純化DNA并克隆到克隆載體pCRII-TOPO(Invitrogen Company)中。通過將分別具有SEQ ID NO57，59，274，276和277所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物測序獲得的質(zhì)粒DNA的核苷酸序列。基于獲得的結(jié)果，將具有SEQ ID NO236所示核苷酸序列的質(zhì)粒稱為pCR608F。類似于實施例32(1)，用限制酶NdeI和HindIII消化pCR608F。從消化產(chǎn)物中純化約1.5kbp的DNA。連接用NdeI和HindIII消化的獲得的DNA和質(zhì)粒pKSN2以獲得包含SEQ ID NO236所示核苷酸序列的質(zhì)粒，其中將編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)(A17)的DNA插入pKSN2的NdeI位點和HindIII位點之間(以下稱為“pKSN608F”)。將所述質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌JM109。將獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體稱為JM109/pKSN608F。
(2)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A17)在大腸桿菌中的表達(dá)和所述蛋白質(zhì)的回收類似于實施例4(2)，培養(yǎng)大腸桿菌JM109/pKSN608F和JM109/pKSN2中的每一個?；厥占?xì)胞。制備細(xì)胞裂解液。在實施例4(2)所述方法下，從細(xì)胞裂解液中制備上清液級分(以下，將獲自大腸桿菌JM109/pKSN608F的上清液級分稱為“大腸桿菌pKSN608F提取物”，將獲自大腸桿菌JM109/pKSN2的上清液級分稱為“大腸桿菌pKSN2提取物”)。
(3)將化合物(II)轉(zhuǎn)化為化合物(III)的能力的檢測類似于實施例32(3)，制備30μl的反應(yīng)溶液并保持在30℃下10分鐘。然而，作為上清液級分，使用在實施例51(2)中制備的上清液級分(大腸桿菌pKSN608F提取物或大腸桿菌pKSN2提取物)。用乙酸乙酯萃取保持后的反應(yīng)溶液并將萃取層TLC分析。在展開TLC板以后，檢查其上對應(yīng)于用14C標(biāo)記的化合物(III)的斑點的存在(Rf值0.24和0.29)。從包含大腸桿菌pKSN608F提取物的反應(yīng)溶液中檢測到對應(yīng)于化合物(III)的斑點。與此對比，在包含大腸桿菌pKSN2提取物的反應(yīng)溶液中未檢測到該斑點。
實施例52獲得本發(fā)明DNA(A18)(1)不產(chǎn)色鏈霉菌IFO 12735的染色體DNA的制備根據(jù)實施例31(1)所述方法，制備不產(chǎn)色鏈霉菌IFO 12735的染色體DNA。
(2)具有本發(fā)明DNA(A18)部分核苷酸序列的DNA的分離按照實施例29所述方法，通過將在實施例52(1)中制備的不產(chǎn)色鏈霉菌IFO 12735的染色體DNA用作模板和通過使用引物對17進(jìn)行PCR。類似于實施例31(2)，將擴(kuò)增的DNA克隆到克隆載體pCRII-TOPO(Invitrogen Company)。分析其核苷酸序列。結(jié)果，提供在SEQ ID NO227所示核苷酸序列的核苷酸526至1048中所表示的核苷酸序列。
另外，用限制酶HincII消化在實施例52(1)中制備的染色體DNA。按照實施例26(3)所述方法，通過使用獲得的DNA產(chǎn)生基因組步行文庫。通過使用獲得的文庫作為模板和通過使用具有SEQ ID NO278所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP1，在實施例26(3)所述條件下進(jìn)行PCR以獲得第一PCR產(chǎn)物。接下來，通過使用第一PCR產(chǎn)物作為模板和通過使用具有SEQ ID NO279所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP2，在實施例26(3)所述條件下進(jìn)行PCR。分析獲得的DNA的核苷酸序列。提供在SEQ ID NO237所示核苷酸序列的核苷酸1至600中所表示的核苷酸序列。
另外，用限制酶BalI消化在實施例52(1)中制備的染色體DNA。按照實施例26(3)所述方法，通過使用獲得的DNA產(chǎn)生基因組步行文庫。通過使用獲得的文庫作為模板和通過使用具有SEQ ID NO163所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP1，在實施例26(3)所述條件下進(jìn)行PCR以獲得第一PCR產(chǎn)物。接下來，通過使用第一PCR產(chǎn)物作為模板和通過使用具有SEQ ID NO164所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP2，在實施例26(3)所述條件下進(jìn)行PCR。分析獲得的DNA的核苷酸序列。提供在SEQ ID NO237所示核苷酸序列的核苷酸983至1449中所表示的核苷酸序列。
(3)本發(fā)明DNA(A18)的序列分析通過連接由實施例52(2)所獲DNA提供的核苷酸序列獲得在SEQ IDNO237中表示的核苷酸序列。在所述核苷酸序列中存在兩個可讀框(ORF)。因此，包含由1230個核苷酸(包括終止密碼子)組成和編碼409個氨基酸殘基(SEQ ID NO217)的核苷酸序列(SEQ ID NO227)以及由207個核苷酸(包括終止密碼子)組成和編碼68個氨基酸殘基(SEQ IDNO247)的核苷酸序列(SEQ ID NO257)。由SEQ ID NO227所示核苷酸序列編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO217)組成的蛋白質(zhì)的分子量據(jù)計算為45099Da。由SEQ ID NO257所示核苷酸序列編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO247)組成的蛋白質(zhì)的分子量據(jù)計算為7193Da。
實施例53本發(fā)明DNA(A18)在大腸桿菌中的表達(dá)(1)具有本發(fā)明DNA(A18)的轉(zhuǎn)化大腸桿菌的產(chǎn)生除了使用從實施例52(1)中的不產(chǎn)色鏈霉菌IFO 12735制備的染色體DNA作為模板和使用具有SEQ ID NO183所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO280所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物以外，類似于實施例49(1)進(jìn)行PCR。類似于實施例32(1)，從PCR反應(yīng)溶液中純化DNA并克隆到克隆載體pCRII-TOPO(Invitrogen Company)中。通過將分別具有SEQ ID NO67，68，163，279和281所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物分析獲得的質(zhì)粒DNA的核苷酸序列?；讷@得的結(jié)果，將具有SEQ ID NO237所示核苷酸序列的質(zhì)粒稱為pCR646BF。類似于實施例32(1)，用限制酶NdeI和HindIII消化pCR646BF。從消化產(chǎn)物中純化約1.5kbp的DNA。連接用NdeI和HindIII消化的獲得的DNA和質(zhì)粒pKSN2以獲得包含SEQ ID NO237所示核苷酸序列的質(zhì)粒，其中將編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)(A18)的DNA插入pKSN2的NdeI位點和HindIII位點之間(以下稱為“pKSN646BF”)。將所述質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌JM109。將獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體稱為JM109/pKSN646BF。
(2)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A18)在大腸桿菌中的表達(dá)和所述蛋白質(zhì)的回收類似于實施例4(2)，培養(yǎng)大腸桿菌JM109/pKSN646BF和JM109/pKSN2中的每一個?；厥占?xì)胞。制備細(xì)胞裂解液。在實施例4(2)所述方法下，從細(xì)胞裂解液中制備上清液級分(以下，將獲自大腸桿菌JM109/pKSN646BF的上清液級分稱為“大腸桿菌pKSN646BF提取物”，將獲自大腸桿菌JM109/pKSN2的上清液級分稱為“大腸桿菌pKSN2提取物”)。
(3)將化合物(II)轉(zhuǎn)化為化合物(III)的能力的檢測類似于實施例32(3)，制備30μl的反應(yīng)溶液并保持在30℃下10分鐘。然而，作為上清液級分，使用在實施例53(2)中制備的上清液級分(大腸桿菌pKSN646BF提取物或大腸桿菌pKSN2提取物)。用乙酸乙酯萃取保持后的反應(yīng)溶液并將萃取層TLC分析。在展開TLC板以后，檢查其上對應(yīng)于用14C標(biāo)記的化合物(III)的斑點的存在(Rf值0.24和0.29)。從包含大腸桿菌pKSN646BF提取物的反應(yīng)溶液中檢測到對應(yīng)于化合物(III)的斑點。與此對比，在包含大腸桿菌pKSN2提取物的反應(yīng)溶液中未檢測到該斑點。
實施例54獲得本發(fā)明DNA(A19)(1)灰色鏈霉菌IFO 13849T的染色體DNA的制備根據(jù)實施例31(1)所述方法，制備灰色鏈霉菌IFO 13849T的染色體DNA。
(2)具有本發(fā)明DNA(A19)部分核苷酸序列的DNA的分離按照實施例29所述方法，通過將在實施例54(1)中制備的灰色鏈霉菌IFO 13849T染色體DNA用作模板和通過使用引物對14進(jìn)行PCR。類似于實施例31(2)，將擴(kuò)增的DNA克隆到克隆載體pCRII-TOPO(InvitrogenCompany)。分析其核苷酸序列。結(jié)果，提供在SEQ ID NO228所示核苷酸序列的核苷酸343至1069中所表示的核苷酸序列。
另外，用限制酶SmaI消化在實施例54(1)中制備的染色體DNA。按照實施例26(3)所述方法，通過使用獲得的DNA產(chǎn)生基因組步行文庫。通過使用獲得的文庫作為模板和通過使用具有SEQ ID NO282所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP1，在實施例26(3)所述條件下進(jìn)行PCR以獲得第一PCR產(chǎn)物。接下來，通過使用第一PCR產(chǎn)物作為模板和通過使用具有SEQ ID NO283所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP2，在實施例26(3)所述條件下進(jìn)行PCR。分析獲得的DNA的核苷酸序列。提供在SEQ ID NO238所示核苷酸序列的核苷酸1至358中所表示的核苷酸序列。
另外，用限制酶HincII消化在實施例54(1)中制備的染色體DNA。按照實施例26(3)所述方法，通過使用獲得的DNA產(chǎn)生基因組步行文庫。通過使用獲得的文庫作為模板和通過使用具有SEQ ID NO284所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP1，在實施例26(3)所述條件下進(jìn)行PCR以獲得第一PCR產(chǎn)物。接下來，通過使用第一PCR產(chǎn)物作為模板和通過使用具有SEQ ID NO285所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP2，在實施例26(3)所述條件下進(jìn)行PCR。分析獲得的DNA的核苷酸序列。提供在SEQ ID NO238所示核苷酸序列的核苷酸1005至1454中所表示的核苷酸序列。
(3)本發(fā)明DNA(A19)的序列分析通過連接由實施例54(2)所獲DNA提供的核苷酸序列獲得在SEQ IDNO238中表示的核苷酸序列。在所述核苷酸序列中存在兩個可讀框(ORF)。因此，包含由1251個核苷酸(包括終止密碼子)組成和編碼416個氨基酸殘基(SEQ ID NO218)的核苷酸序列(SEQ ID NO228)以及由156個核苷酸(包括終止密碼子)組成和編碼51個氨基酸殘基(SEQ IDNO248)的核苷酸序列(SEQ ID NO258)。由SEQ ID NO228所示核苷酸序列編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO218)組成的蛋白質(zhì)的分子量據(jù)計算為45903Da。由SEQ ID NO258所示核苷酸序列編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO248)組成的蛋白質(zhì)的分子量據(jù)計算為5175Da。
實施例55本發(fā)明DNA(A19)在大腸桿菌中的表達(dá)(1)具有本發(fā)明DNA(A19)的轉(zhuǎn)化大腸桿菌的產(chǎn)生除了使用從實施例54(1)中灰色鏈霉菌IFO 13849T制備的染色體DNA作為模板和使用具有SEQ ID NO286所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO287所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物以外，類似于實施例49(1)進(jìn)行PCR。類似于實施例32(1)，從PCR反應(yīng)溶液中純化DNA并克隆到克隆載體pCRII-TOPO(Invitrogen Company)中。通過將分別具有SEQ ID NO57，59，284，286和288所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物分析獲得的質(zhì)粒DNA的核苷酸序列?；讷@得的結(jié)果，將具有SEQ ID NO238所示核苷酸序列的質(zhì)粒稱為pCR1502F。類似于實施例32(1)，用限制酶NdeI和HindIII消化pCR1502F。從消化產(chǎn)物中純化約1.5kbp的DNA。連接用NdeI和HindIII消化的獲得的DNA和質(zhì)粒pKSN2以獲得包含SEQ ID NO238所示核苷酸序列的質(zhì)粒，其中將編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)(A19)的DNA插入pKSN2的NdeI位點和HindIII位點之間(以下稱為“pKSN1502F”)。將所述質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌JM109。將獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體稱為JM109/pKSN1502F。
(2)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A19)在大腸桿菌中的表達(dá)和所述蛋白質(zhì)的回收類似于實施例4(2)，培養(yǎng)大腸桿菌JM109/pKSN1502F和JM109/pKSN2中的每一個。回收細(xì)胞。制備細(xì)胞裂解液。在實施例4(2)所述方法下，從細(xì)胞裂解液中制備上清液級分(以下，將獲自大腸桿菌JM109/pKSN1502F的上清液級分稱為“大腸桿菌pKSN1502F提取物”，將獲自大腸桿菌JM109/pKSN2的上清液級分稱為“大腸桿菌pKSN2提取物”)。
(3)將化合物(II)轉(zhuǎn)化為化合物(III)的能力的檢測類似于實施例32(3)，制備30μl的反應(yīng)溶液并保持在30℃下10分鐘。然而，作為上清液級分，使用在實施例55(2)中制備的上清液級分(大腸桿菌pKSN1502F提取物或大腸桿菌pKSN2提取物)。用乙酸乙酯萃取保持后的反應(yīng)溶液并將萃取層TLC分析。在展開TLC板以后，檢查其上對應(yīng)于用14C標(biāo)記的化合物(III)的斑點的存在(Rf值0.24和0.29)。從包含大腸桿菌pKSN1502F提取物的反應(yīng)溶液中檢測到對應(yīng)于化合物(III)的斑點。與此對比，在包含大腸桿菌pKSN2提取物的反應(yīng)溶液中未檢測到該斑點。
實施例56獲得本發(fā)明DNA(A20)(1)羊毛鏈霉菌IFO 12787T的染色體DNA的制備根據(jù)實施例31(1)所述方法，制備羊毛鏈霉菌IFO 12787T的染色體DNA。
(2)具有本發(fā)明DNA(A20)部分核苷酸序列的DNA的分離按照實施例29所述方法，通過將在實施例56(1)中制備的羊毛鏈霉菌IFO 12787T染色體DNA用作模板和通過使用引物對14進(jìn)行PCR。類似于實施例31(2)，將擴(kuò)增的DNA克隆到克隆載體pCRII-TOPO(InvitrogenCompany)。分析其核苷酸序列。結(jié)果，提供在SEQ ID NO229所示核苷酸序列的核苷酸304至1036中所表示的核苷酸序列。
另外，用限制酶PmacI消化在實施例56(1)中制備的染色體DNA。按照實施例26(3)所述方法，通過使用獲得的DNA產(chǎn)生基因組步行文庫。通過使用獲得的文庫作為模板和通過使用具有SEQ ID NO278所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP1，在實施例26(3)所述條件下進(jìn)行PCR以獲得第一PCR產(chǎn)物。接下來，通過使用第一PCR產(chǎn)物作為模板和通過使用具有SEQ ID NO289所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP2，在實施例26(3)所述條件下進(jìn)行PCR。分析獲得的DNA的核苷酸序列。提供在SEQ ID NO239所示核苷酸序列的核苷酸1至318中所表示的核苷酸序列。
另外，用限制酶StuI消化在實施例56(1)中制備的染色體DNA。按照實施例26(3)所述方法，通過使用獲得的DNA產(chǎn)生基因組步行文庫。通過使用獲得的文庫作為模板和通過使用具有SEQ ID NO290所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP1，在實施例26(3)所述條件下進(jìn)行PCR以獲得第一PCR產(chǎn)物。接下來，通過使用第一PCR產(chǎn)物作為模板和通過使用具有SEQ ID NO291所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP2，在實施例26(3)所述條件下進(jìn)行PCR。分析獲得的DNA的核苷酸序列。提供在SEQ ID NO239所示核苷酸序列的核苷酸969至1461中所表示的核苷酸序列。
(3)本發(fā)明DNA(A20)的序列分析通過連接由實施例56(2)所獲DNA提供的核苷酸序列獲得在SEQ IDNO239中表示的核苷酸序列。在所述核苷酸序列中存在兩個可讀框(ORF)。因此，包含由1218個核苷酸(包括終止密碼子)組成和編碼405個氨基酸殘基(SEQ ID NO219)的核苷酸序列(SEQ ID NO229)以及由231個核苷酸(包括終止密碼子)組成和編碼76個氨基酸殘基(SEQ IDNO249)的核苷酸序列(SEQ ID NO259)。由SEQ ID NO229所示核苷酸序列編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO219)組成的蛋白質(zhì)的分子量據(jù)計算為45071Da。由SEQ ID NO259所示核苷酸序列編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO249)組成的蛋白質(zhì)的分子量據(jù)計算為7816Da。
實施例57本發(fā)明DNA(A20)在大腸桿菌中的表達(dá)(1)具有本發(fā)明DNA(A20)的轉(zhuǎn)化大腸桿菌的產(chǎn)生除了使用從實施例56(1)羊毛鏈霉菌IFO 12787T制備的染色體DNA作為模板和使用具有SEQ ID NO292所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO293所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物以外，類似于實施例49(1)進(jìn)行PCR。類似于實施例32(1)，從PCR反應(yīng)溶液中純化DNA并克隆到克隆載體pCRII-TOPO(Invitrogen Company)中。通過將分別具有SEQ ID NO67，68，188，278和290所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物分析獲得的質(zhì)粒DNA的核苷酸序列?；讷@得的結(jié)果，將具有SEQ IDNO239所示核苷酸序列的質(zhì)粒稱為pCR1525F。類似于實施例32(1)，用限制酶NdeI和HindIII消化pCR1525F。從消化產(chǎn)物中純化約1.5kbp的DNA。連接用NdeI和HindIII消化的獲得的DNA和質(zhì)粒pKSN2以獲得包含SEQ ID NO239所示核苷酸序列的質(zhì)粒，其中將編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)(A20)的DNA插入pKSN2的NdeI位點和HindIII位點之間(以下稱為“pKSN1525F”)。將所述質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌JM109。將獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體稱為JM109/pKSN1525F。
(2)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A20)在大腸桿菌中的表達(dá)和所述蛋白質(zhì)的回收類似于實施例4(2)，培養(yǎng)大腸桿菌JM109/pKSN1525F和JM109/pKSN2中的每一個。回收細(xì)胞。制備細(xì)胞裂解液。在實施例4(2)所述方法下，從細(xì)胞裂解液中制備上清液級分(以下，將獲自大腸桿菌JM109/pKSN1525F的上清液級分稱為“大腸桿菌pKSN1525F提取物”，將獲自大腸桿菌JM109/pKSN2的上清液級分稱為“大腸桿菌pKSN2提取物”)。
(3)將化合物(II)轉(zhuǎn)化為化合物(III)的能力的檢測類似于實施例32(3)，制備30μ1的反應(yīng)溶液并保持在30℃下10分鐘。然而，作為上清液級分，使用在實施例57(2)中制備的上清液級分(大腸桿菌pKSN1525F提取物或大腸桿菌pKSN2提取物)。用乙酸乙酯萃取保持后的反應(yīng)溶液并將萃取層TLC分析。在展開TLC板以后，檢查其上對應(yīng)于用14C標(biāo)記的化合物(III)的斑點的存在(Rf值0.24和0.29)。從包含大腸桿菌pKSN1525F提取物的反應(yīng)溶液中檢測到對應(yīng)于化合物(III)的斑點。與此對比，在包含大腸桿菌pKSN2提取物的反應(yīng)溶液中未檢測到該斑點。
實施例58獲得本發(fā)明DNA(A21)(1)三澤鏈霉菌IFO 13855T的染色體DNA的制備根據(jù)實施例31(1)所述方法，制備三澤鏈霉菌IFO 13855T的染色體DNA。
(2)具有本發(fā)明DNA(A21)部分核苷酸序列的DNA的分離按照實施例29所述方法，通過將在實施例58(1)中制備的三澤鏈霉菌IFO 13855T染色體DNA用作模板和通過使用引物對14進(jìn)行PCR。類似于實施例31(2)，將擴(kuò)增的DNA克隆到克隆載體pCRII-TOPO(InvitrogenCompany)。分析其核苷酸序列。結(jié)果，提供在SEQ ID NO230所示核苷酸序列的核苷酸328至1063中所表示的核苷酸序列。
另外，用限制酶SmaI消化在實施例58(1)中制備的染色體DNA。按照實施例26(3)所述方法，通過使用獲得的DNA產(chǎn)生基因組步行文庫。通過使用獲得的文庫作為模板和通過使用具有SEQ ID NO294所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP1，在實施例26(3)所述條件下進(jìn)行PCR以獲得第一PCR產(chǎn)物。接下來，通過使用第一PCR產(chǎn)物作為模板和通過使用具有SEQ ID NO295所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP2，在實施例26(3)所述條件下進(jìn)行PCR。分析獲得的DNA的核苷酸序列。提供在SEQ ID NO240所示核苷酸序列的核苷酸1至341中所表示的核苷酸序列。
另外，用限制酶HincII消化在實施例58(1)中制備的染色體DNA。按照實施例26(3)所述方法，通過使用獲得的DNA產(chǎn)生基因組步行文庫。通過使用獲得的文庫作為模板和通過使用具有SEQ ID NO296所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP1，在實施例26(3)所述條件下進(jìn)行PCR以獲得第一PCR產(chǎn)物。接下來，通過使用第一PCR產(chǎn)物作為模板和通過使用具有SEQ ID NO297所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP2，在實施例26(3)所述條件下進(jìn)行PCR。分析獲得的DNA的核苷酸序列。提供在SEQ ID NO240所示核苷酸序列的核苷酸1017至1458中所表示的核苷酸序列。
(3)本發(fā)明DNA(A21)的序列分析通過連接由實施例58(2)所獲DNA提供的核苷酸序列獲得在SEQ IDNO240中表示的核苷酸序列。在所述核苷酸序列中存在兩個可讀框(ORF)。因此，包含由1245個核苷酸(包括終止密碼子)組成和編碼414個氨基酸殘基(SEQ ID NO220)的核苷酸序列(SEQ ID NO230)以及由201個核苷酸(包括終止密碼子)組成和編碼66個氨基酸殘基(SEQ IDNO250)的核苷酸序列(SEQ ID NO260)。由SEQ ID NO230所示核苷酸序列編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO220)組成的蛋白質(zhì)的分子量據(jù)計算為45806Da。由SEQ ID NO260所示核苷酸序列編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO250)組成的蛋白質(zhì)的分子量據(jù)計算為6712Da。
實施例59本發(fā)明DNA(A21)在大腸桿菌中的表達(dá)(1)具有本發(fā)明DNA(A21)的轉(zhuǎn)化大腸桿菌的產(chǎn)生除了使用從實施例58(1)中三澤鏈霉菌IFO 13855T制備的染色體DNA作為模板和使用具有SEQ ID NO298所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO299所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物以外，類似于實施例32(1)進(jìn)行PCR。類似于實施例32(1)，從PCR反應(yīng)溶液中純化DNA并克隆到克隆載體pCRII-TOPO(Invitrogen Company)中。通過將分別具有SEQ ID NO57，59，296和300所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物分析獲得的質(zhì)粒DNA的核苷酸序列?；讷@得的結(jié)果，將具有SEQ ID NO240所示核苷酸序列的質(zhì)粒稱為pCR1543BF。類似于實施例32(1)，用限制酶NdeI和HindIII消化pCR1543BF。從消化產(chǎn)物中純化約1.5kbp的DNA。連接用NdeI和HindIII消化的獲得的DNA和質(zhì)粒pKSN2以獲得包含SEQ ID NO240所示核苷酸序列的質(zhì)粒，其中將編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)(A21)的DNA插入pKSN2的NdeI位點和HindIII位點之間(以下稱為“pKSN1543BF”)。將所述質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌JM109。將獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體稱為JM109/pKSN1543BF。
(2)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A21)在大腸桿菌中的表達(dá)和所述蛋白質(zhì)的回收類似于實施例4(2)，培養(yǎng)大腸桿菌JM109/pKSN1543BF和JM109/pKSN2中的每一個?；厥占?xì)胞。制備細(xì)胞裂解液。在實施例4(2)所述方法下，從細(xì)胞裂解液中制備上清液級分(以下，將獲自大腸桿菌JM109/pKSN1543BF的上清液級分稱為“大腸桿菌pKSN1543BF提取物”，將獲自大腸桿菌JM109/pKSN2的上清液級分稱為“大腸桿菌pKSN2提取物”)。
(3)將化合物(II)轉(zhuǎn)化為化合物(III)的能力的檢測類似于實施例32(3)，制備30μl的反應(yīng)溶液并保持在30℃下10分鐘。然而，作為上清液級分，使用在實施例59(2)中制備的上清液級分(大腸桿菌pKSN1543BF提取物或大腸桿菌pKSN2提取物)。用乙酸乙酯萃取保持后的反應(yīng)溶液并將萃取層TLC分析。在展開TLC板以后，檢查其上對應(yīng)于用14C標(biāo)記的化合物(III)的斑點的存在(Rf值0.24和0.29)。從包含大腸桿菌pKSN1543BF提取物的反應(yīng)溶液中檢測到對應(yīng)于化合物(III)的斑點。與此對比，在包含大腸桿菌pKSN2提取物的反應(yīng)溶液中未檢測到該斑點。
實施例60獲得本發(fā)明DNA(A22)
(1)蒼白色鏈霉菌IFO 13434T的染色體DNA的制備根據(jù)實施例31(1)所述方法，制備蒼白色鏈霉菌IFO 13434T的染色體DNA。
(2)具有本發(fā)明DNA(A22)部分核苷酸序列的DNA的分離按照實施例29所述方法，通過將在實施例60(1)中制備的蒼白色鏈霉菌IFO 13434T染色體DNA用作模板和通過使用引物對15進(jìn)行PCR。類似于實施例31(2)，將擴(kuò)增的DNA克隆到克隆載體pCRII-TOPO(Invitrogen Company)。分析其核苷酸序列。結(jié)果，提供在SEQ ID NO231所示核苷酸序列的核苷酸483至1048中所表示的核苷酸序列。
另外，用限制酶SmaI消化在實施例60(1)中制備的染色體DNA。按照實施例26(3)所述方法，通過使用獲得的DNA產(chǎn)生基因組步行文庫。通過使用獲得的文庫作為模板和通過使用具有SEQ ID NO301所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP1，在實施例26(3)所述條件下進(jìn)行PCR以獲得第一PCR產(chǎn)物。接下來，通過使用第一PCR產(chǎn)物作為模板和通過使用具有SEQ ID NO302所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP2，在實施例26(3)所述條件下進(jìn)行PCR。分析獲得的DNA的核苷酸序列。提供在SEQ ID NO241所示核苷酸序列的核苷酸68至516中所表示的核苷酸序列。
另外，用限制酶HincII消化在實施例60(1)中制備的染色體DNA。按照實施例26(3)所述方法，通過使用獲得的DNA產(chǎn)生基因組步行文庫。通過使用獲得的文庫作為模板和通過使用具有SEQ ID NO302所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP1，在實施例26(3)所述條件下進(jìn)行PCR以獲得第一PCR產(chǎn)物。接下來，通過使用第一PCR產(chǎn)物作為模板和通過使用具有SEQ ID NO303所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP2，在實施例26(3)所述條件下進(jìn)行PCR。分析獲得的DNA的核苷酸序列。提供在SEQ ID NO241所示核苷酸序列的核苷酸1至270中所表示的核苷酸序列。
另外，用限制酶HincII消化在實施例60(1)中制備的染色體DNA。按照實施例26(3)所述方法，通過使用獲得的DNA產(chǎn)生基因組步行文庫。通過使用獲得的文庫作為模板和通過使用具有SEQ ID NO304所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP1，在實施例26(3)所述條件下進(jìn)行PCR以獲得第一PCR產(chǎn)物。接下來，通過使用第一PCR產(chǎn)物作為模板和通過使用具有SEQ ID NO305所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP2，在實施例26(3)所述條件下進(jìn)行PCR。分析獲得的DNA的核苷酸序列。提供在SEQ ID NO241所示核苷酸序列的核苷酸982至1448中所表示的核苷酸序列。
(3)本發(fā)明DNA(A22)的序列分析通過連接由實施例60(2)所獲DNA提供的核苷酸序列獲得在SEQ IDNO241中表示的核苷酸序列。在所述核苷酸序列中存在兩個可讀框(ORF)。因此，包含由1230個核苷酸(包括終止密碼子)組成和編碼409個氨基酸殘基(SEQ ID NO221)的核苷酸序列(SEQ ID NO231)以及由195個核苷酸(包括終止密碼子)組成和編碼64個氨基酸殘基(SEQ IDNO251)的核苷酸序列(SEQ ID NO261)。由SEQ ID NO231所示核苷酸序列編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO221)組成的蛋白質(zhì)的分子量據(jù)計算為45050Da。由SEQ ID NO261所示核苷酸序列編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO251)組成的蛋白質(zhì)的分子量據(jù)計算為6914Da。
實施例61本發(fā)明DNA(A22)在大腸桿菌中的表達(dá)(1)具有本發(fā)明DNA(A22)的轉(zhuǎn)化大腸桿菌的產(chǎn)生除了使用從實施例60(1)中蒼白色鏈霉菌IFO 13434T制備的染色體DNA作為模板和使用具有SEQ ID NO306所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO307所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物以外，類似于實施例32(1)進(jìn)行PCR。類似于實施例32(1)，從PCR反應(yīng)溶液中純化DNA并克隆到克隆載體pCRII-TOPO(Invitrogen Company)中。通過將分別具有SEQ ID NO67，68和308所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物分析獲得的質(zhì)粒DNA的核苷酸序列?；讷@得的結(jié)果，將具有SEQ IDNO241所示核苷酸序列的質(zhì)粒稱為pCR1558BF。類似于實施例32(1)，用限制酶NdeI和HindIII消化pCR1558BF。從消化產(chǎn)物中純化約1.5kbp的DNA。連接用NdeI和HindIII消化的獲得的DNA和質(zhì)粒pKSN2以獲得包含SEQ ID NO241所示核苷酸序列的質(zhì)粒，其中將編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)(A22)的DNA插入pKSN2的NdeI位點和HindIII位點之間(以下稱為“pKSN1558BF”)。將所述質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌JM109。將獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體稱為JM109/pKSN1558BF。
(2)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A22)在大腸桿菌中的表達(dá)和所述蛋白質(zhì)的回收類似于實施例4(2)，培養(yǎng)大腸桿菌JM109/pKSN1558BF和JM109/pKSN2中的每一個?；厥占?xì)胞。制備細(xì)胞裂解液。在實施例4(2)所述方法下，從細(xì)胞裂解液中制備上清液級分(以下，將獲自大腸桿菌JM109/pKSN1558BF的上清液級分稱為“大腸桿菌pKSN1558BF提取物”，將獲自大腸桿菌JM109/pKSN2的上清液級分稱為“大腸桿菌pKSN2提取物”)。
(3)將化合物(II)轉(zhuǎn)化為化合物(III)的能力的檢測類似于實施例32(3)，制備30μl的反應(yīng)溶液并保持在30℃下10分鐘。然而，作為上清液級分，使用在實施例61(2)中制備的上清液級分(大腸桿菌pKSN1558BF提取物或大腸桿菌pKSN2提取物)。用乙酸乙酯萃取保持后的反應(yīng)溶液并將萃取層TLC分析。在展開TLC板以后，檢查其上對應(yīng)于用14C標(biāo)記的化合物(III)的斑點的存在(Rf值0.24和0.29)。從包含大腸桿菌pKSN1558BF提取物的反應(yīng)溶液中檢測到對應(yīng)于化合物(III)的斑點。與此對比，在包含大腸桿菌pKSN2提取物的反應(yīng)溶液中未檢測到該斑點。
實施例62獲得本發(fā)明DNA(A23)(1)玫瑰變紅鏈霉菌IFO 13682T的染色體DNA的制備根據(jù)實施例31(1)所述方法，制備玫瑰變紅鏈霉菌IFO 13682T的染色體DNA。
(2)具有本發(fā)明DNA(A23)部分核苷酸序列的DNA的分離按照實施例29所述方法，通過將在實施例62(1)中制備的玫瑰變紅鏈霉菌IFO 13682T染色體DNA用作模板和通過使用引物對14進(jìn)行PCR。類似于實施例31(2)，將擴(kuò)增的DNA克隆到克隆載體pCRII-TOPO(Invitrogen Company)。分析其核苷酸序列。結(jié)果，提供在SEQ ID NO232所示核苷酸序列的核苷酸289至1015中所表示的核苷酸序列。
另外，用限制酶SmaI消化在實施例62(1)中制備的染色體DNA。按照實施例26(3)所述方法，通過使用獲得的DNA產(chǎn)生基因組步行文庫。通過使用獲得的文庫作為模板和通過使用具有SEQ ID NO309所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP1，在實施例26(3)所述條件下進(jìn)行PCR以獲得第一PCR產(chǎn)物。接下來，通過使用第一PCR產(chǎn)物作為模板和通過使用具有SEQ ID NO310所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP2，在實施例26(3)所述條件下進(jìn)行PCR。分析獲得的DNA的核苷酸序列。提供在SEQ ID NO242所示核苷酸序列的核苷酸1至354中所表示的核苷酸序列。
另外，用限制酶PvuII消化在實施例62(1)中制備的染色體DNA。按照實施例26(3)所述方法，通過使用獲得的DNA產(chǎn)生基因組步行文庫。通過使用獲得的文庫作為模板和通過使用具有SEQ ID NO311所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP1，在實施例26(3)所述條件下進(jìn)行PCR以獲得第一PCR產(chǎn)物。接下來，通過使用第一PCR產(chǎn)物作為模板和通過使用具有SEQ ID NO312所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP2，在實施例26(3)所述條件下進(jìn)行PCR。分析獲得的DNA的核苷酸序列。提供在SEQ ID NO242所示核苷酸序列的核苷酸966至1411中所表示的核苷酸序列。
(3)本發(fā)明DNA(A23)的序列分析通過連接由實施例62(2)所獲DNA提供的核苷酸序列獲得在SEQ IDNO242中表示的核苷酸序列。在所述核苷酸序列中存在兩個可讀框(ORF)。因此，包含由1197個核苷酸(包括終止密碼子)組成和編碼398個氨基酸殘基(SEQ ID NO222)的核苷酸序列(SEQ ID NO232)以及由201個核苷酸(包括終止密碼子)組成和編碼66個氨基酸殘基(SEQ IDNO252)的核苷酸序列(SEQ ID NO262)。由SEQ ID NO232所示核苷酸序列編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO222)組成的蛋白質(zhì)的分子量據(jù)計算為43624Da。由SEQ ID NO262所示核苷酸序列編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO252)組成的蛋白質(zhì)的分子量據(jù)計算為6797Da。
實施例63本發(fā)明DNA(A23)在大腸桿菌中的表達(dá)(1)具有本發(fā)明DNA(A23)的轉(zhuǎn)化大腸桿菌的產(chǎn)生除了使用在實施例62(1)中玫瑰變紅鏈霉菌IFO 13682T制備的染色體DNA作為模板和使用具有SEQ ID NO313所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO314所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物以外，類似于實施例49(1)進(jìn)行PCR。類似于實施例32(1)，從PCR反應(yīng)溶液中純化DNA并克隆到克隆載體pCRII-TOPO(Invitrogen Company)中。通過將分別具有SEQ ID NO67，68，309，311和315所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物分析獲得的質(zhì)粒DNA的核苷酸序列?；讷@得的結(jié)果，將具有SEQ ID NO242所示核苷酸序列的質(zhì)粒稱為pCR1584F。類似于實施例32(1)，用限制酶NdeI和HindIII消化pCR1584F。從消化產(chǎn)物中純化約1.5kbp的DNA。連接用NdeI和HindIII消化的獲得的DNA和質(zhì)粒pKSN2以獲得包含SEQ ID NO242所示核苷酸序列的質(zhì)粒，其中將編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)(A23)的DNA插入pKSN2的NdeI位點和HindIII位點之間(以下稱為“pKSN1584F”)。將所述質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌JM109。將獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體稱為JM109/pKSN1584F。
(2)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A23)在大腸桿菌中的表達(dá)和所述蛋白質(zhì)的回收類似于實施例4(2)，培養(yǎng)大腸桿菌JM109/pKSN1584F和JM109/pKSN2中的每一個?；厥占?xì)胞。制備細(xì)胞裂解液。在實施例4(2)所述方法下，從細(xì)胞裂解液中制備上清液級分(以下，將獲自大腸桿菌JM109/pKSN1584F的上清液級分稱為“大腸桿菌pKSN1584F提取物”，將獲自大腸桿菌JM109/pKSN2的上清液級分稱為“大腸桿菌pKSN2提取物”)。
(3)將化合物(II)轉(zhuǎn)化為化合物(III)的能力的檢測類似于實施例32(3)，制備30μ1的反應(yīng)溶液并保持在30℃下10分鐘。然而，作為上清液級分，使用在實施例63(2)中制備的上清液級分(大腸桿菌pKSN1584F提取物或大腸桿菌pKSN2提取物)。用乙酸乙酯萃取保持后的反應(yīng)溶液并將萃取層TLC分析。在展開TLC板以后，檢查其上對應(yīng)于用14C標(biāo)記的化合物(III)的斑點的存在(Rf值O.24和0.29)。從包含大腸桿菌pKSN1584F提取物的反應(yīng)溶液中檢測到對應(yīng)于化合物(III)的斑點。與此對比，在包含大腸桿菌pKSN2提取物的反應(yīng)溶液中未檢測到該斑點。
實施例64獲得本發(fā)明DNA(A24)(1)魯?shù)劓溍咕鶬FO 15875T的染色體DNA的制備根據(jù)實施例31(1)所述方法，制備魯?shù)劓溍咕鶬FO 15875T的染色體DNA。
(2)具有本發(fā)明DNA(A24)部分核苷酸序列的DNA的分離按照實施例29所述方法，通過將在制備的實施例64(1)中魯?shù)劓溍咕鶬FO 15875T染色體DNA用作模板和通過使用引物對14進(jìn)行PCR。類似于實施例31(2)，將擴(kuò)增的DNA克隆到克隆載體pCRII-TOPO(InvitrogenCompany)。分析其核苷酸序列。結(jié)果，提供在SEQ ID NO233所示核苷酸序列的核苷酸322至1057中所表示的核苷酸序列。
另外，用限制酶SmaI消化在實施例64(1)中制備的染色體DNA。按照實施例26(3)所述方法，通過使用獲得的DNA產(chǎn)生基因組步行文庫。通過使用獲得的文庫作為模板和通過使用具有SEQ ID NO316所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP1，在實施例26(3)所述條件下進(jìn)行PCR以獲得第一PCR產(chǎn)物。接下來，通過使用第一PCR產(chǎn)物作為模板和通過使用具有SEQ ID NO317所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP2，在實施例26(3)所述條件下進(jìn)行PCR。分析獲得的DNA的核苷酸序列。提供在SEQ ID NO243所示核苷酸序列的核苷酸1至384中所表示的核苷酸序列。
另外，用限制酶NaeI消化在實施例64(1)中制備的染色體DNA。按照實施例26(3)所述方法，通過使用獲得的DNA產(chǎn)生基因組步行文庫。通過使用獲得的文庫作為模板和通過使用具有SEQ ID NO318所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP1，在實施例26(3)所述條件下進(jìn)行PCR以獲得第一PCR產(chǎn)物。接下來，通過使用第一PCR產(chǎn)物作為模板和通過使用具有SEQ ID NO319所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP2，在實施例26(3)所述條件下進(jìn)行PCR。分析獲得的DNA的核苷酸序列。提供在SEQ ID NO243所示核苷酸序列的核苷酸992至1466中所表示的核苷酸序列。
(3)本發(fā)明DNA(A24)的序列分析通過連接由實施例64(2)所獲DNA提供的核苷酸序列獲得在SEQ IDNO243中表示的核苷酸序列。在所述核苷酸序列中存在兩個可讀框(ORF)。因此，包含由1245個核苷酸(包括終止密碼子)組成和編碼414個氨基酸殘基(SEQ ID NO223)的核苷酸序列(SEQ ID NO233)以及由198個核苷酸(包括終止密碼子)組成和編碼65個氨基酸殘基(SEQ IDNO253)的核苷酸序列(SEQ ID NO263)。由SEQ ID NO233所示核苷酸序列編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO223)組成的蛋白質(zhì)的分子量據(jù)計算為45830Da。由SEQ ID NO263所示核苷酸序列編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO253)組成的蛋白質(zhì)的分子量據(jù)計算為7034Da。
實施例65本發(fā)明DNA(A24)在大腸桿菌中的表達(dá)(1)具有本發(fā)明DNA(A24)的轉(zhuǎn)化大腸桿菌的產(chǎn)生除了使用在實施例64(1)中魯?shù)劓溍咕鶬FO 15875T制備的染色體DNA作為模板和使用具有SEQ ID NO320所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO321所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物以外，類似于實施例49(1)進(jìn)行PCR。類似于實施例32(1)，從PCR反應(yīng)溶液中純化DNA并克隆到克隆載體pCRII-TOPO(Invitrogen Company)中。通過將分別具有SEQ ID NO67，68和322所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物測序獲得的質(zhì)粒DNA的核苷酸序列。基于獲得的結(jié)果，將具有SEQ IDNO243所示核苷酸序列的質(zhì)粒稱為pCR1589BF。類似于實施例32(1)，用限制酶NdeI和HindIII消化pCR1589BF。從消化產(chǎn)物中純化約1.5kbp的DNA。連接用NdeI和HindIII消化的獲得的DNA和質(zhì)粒pKSN2以獲得包含SEQ ID NO243所示核苷酸序列的質(zhì)粒，其中將編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)(A24)的DNA插入pKSN2的NdeI位點和HindIII位點之間(以下稱為“pKSN1589BF”)。將所述質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌JM109。將獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體稱為JM109/pKSN1589BF。
(2)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A24)在大腸桿菌中的表達(dá)和所述蛋白質(zhì)的回收類似于實施例4(2)，培養(yǎng)大腸桿菌JM109/pKSN1589BF和JM109/pKSN2中的每一個。回收細(xì)胞。制備細(xì)胞裂解液。在實施例4(2)所述方法下，從細(xì)胞裂解液中制備上清液級分(以下，將獲自大腸桿菌JM109/pKSN1589BF的上清液級分稱為“大腸桿菌pKSN1589BF提取物”，將獲自大腸桿菌JM109/pKSN2的上清液級分稱為“大腸桿菌pKSN2提取物”)。
(3)將化合物(II)轉(zhuǎn)化為化合物(III)的能力的檢測類似于實施例32(3)，制備30μl的反應(yīng)溶液并保持在30℃下10分鐘。然而，作為上清液級分，使用在實施例65(2)中制備的上清液級分(大腸桿菌pKSN1589BF提取物或大腸桿菌pKSN2提取物)。用乙酸乙酯萃取保持后的反應(yīng)溶液并將萃取層TLC分析。在展開TLC板以后，檢查其上對應(yīng)于用14C標(biāo)記的化合物(III)的斑點的存在(Rf值0.24和0.29)。從包含大腸桿菌pKSN1589BF提取物的反應(yīng)溶液中檢測到對應(yīng)于化合物(III)的斑點。與此對比，在包含大腸桿菌pKSN2提取物的反應(yīng)溶液中未檢測到該斑點。
實施例66獲得本發(fā)明DNA(A25)(1)斯堡鏈霉菌IFO 13446T的染色體DNA的制備根據(jù)實施例31(1)所述方法，制備斯堡鏈霉菌IFO 13446T的染色體DNA。
(2)具有本發(fā)明DNA(A25)部分核苷酸序列的DNA的分離按照實施例29所述方法，通過將在實施例66(1)中制備的斯堡鏈霉菌IFO 13446T染色體DNA用作模板和通過使用引物對14進(jìn)行PCR。類似于實施例31(2)，將擴(kuò)增的DNA克隆到克隆載體pCRII-TOPO(InvitrogenCompany)。分析其核苷酸序列。結(jié)果，提供在SEQ ID NO234所示核苷酸序列的核苷酸289至1015中所表示的核苷酸序列。
另外，用限制酶SmaI消化在實施例66(1)中制備的染色體DNA。按照實施例26(3)所述方法，通過使用獲得的DNA產(chǎn)生基因組步行文庫。通過使用獲得的文庫作為模板和通過使用具有SEQ ID NO323所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP1，在實施例26(3)所述條件下進(jìn)行PCR以獲得第一PCR產(chǎn)物。接下來，通過使用第一PCR產(chǎn)物作為模板和通過使用具有SEQ ID NO324所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP2，在實施例26(3)所述條件下進(jìn)行PCR。分析獲得的DNA的核苷酸序列。提供在SEQ ID NO244所示核苷酸序列的核苷酸1至303中所表示的核苷酸序列。
另外，用限制酶PmacI消化在實施例66(1)中制備的染色體DNA。按照實施例26(3)所述方法，通過使用獲得的DNA產(chǎn)生基因組步行文庫。通過使用獲得的文庫作為模板和通過使用具有SEQ ID NO311所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP1，在實施例26(3)所述條件下進(jìn)行PCR以獲得第一PCR產(chǎn)物。接下來，通過使用第一PCR產(chǎn)物作為模板和通過使用具有SEQ ID NO325所示核苷酸序列的寡核苷酸和引物AP2，在實施例26(3)所述條件下進(jìn)行PCR。分析獲得的DNA的核苷酸序列。提供在SEQ ID NO244所示核苷酸序列的核苷酸966至1411中所表示的核苷酸序列。
(3)本發(fā)明DNA(A25)的序列分析通過連接由實施例66(2)所獲DNA提供的核苷酸序列獲得在SEQ IDNO244中表示的核苷酸序列。在所述核苷酸序列中存在兩個可讀框(ORF)。因此，包含由1197個核苷酸(包括終止密碼子)組成和編碼398個氨基酸殘基(SEQ ID NO224)的核苷酸序列(SEQ ID NO234)以及由201個核苷酸(包括終止密碼子)組成和編碼66個氨基酸殘基(SEQ IDNO254)的核苷酸序列(SEQ ID NO264)。由SEQ ID NO234所示核苷酸序列編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO224)組成的蛋白質(zhì)的分子量據(jù)計算為44175Da。由SEQ ID NO264所示核苷酸序列編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO254)組成的蛋白質(zhì)的分子量據(jù)計算為6685Da。
實施例67本發(fā)明DNA(A25)在大腸桿菌中的表達(dá)(1)具有本發(fā)明DNA(A25)的轉(zhuǎn)化大腸桿菌的產(chǎn)生除了使用在實施例66(1)中斯堡鏈霉菌IFO 13446T制備的染色體DNA作為模板和使用具有SEQ ID NO326所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO327所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物以外，類似于實施例49(1)進(jìn)行PCR。類似于實施例32(1)，從PCR反應(yīng)溶液中純化DNA并克隆到克隆載體pCRII-TOPO(Invitrogen Company)中。通過將分別具有SEQ ID NO67，68，311，315和323所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物測序獲得的質(zhì)粒DNA的核苷酸序列。基于獲得的結(jié)果，將具有SEQ ID NO244所示核苷酸序列的質(zhì)粒稱為pCR1609F。類似于實施例32(1)，用限制酶NdeI和HindIII消化pCR1609F。從消化產(chǎn)物中純化約1.5kbp的DNA。連接用NdeI和HindIII消化的獲得的DNA和質(zhì)粒pKSN2以獲得包含SEQ ID NO244所示核苷酸序列的質(zhì)粒，其中將編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)(A25)的DNA插入pKSN2的NdeI位點和HindIII位點之間(以下稱為“pKSN1609F”)。將所述質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌JM109。將獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體稱為JM109/pKSN1609F。
(2)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A25)在大腸桿菌中的表達(dá)和所述蛋白質(zhì)的回收類似于實施例4(2)，培養(yǎng)大腸桿菌JM109/pKSN1609F和JM109/pKSN2中的每一個。回收細(xì)胞。制備細(xì)胞裂解液。在實施例4(2)所述方法下，從細(xì)胞裂解液中制備上清液級分(以下，將獲自大腸桿菌JM109/pKSN1609F的上清液級分稱為“大腸桿菌pKSN1609F提取物”，將獲自大腸桿菌JM109/pKSN2的上清液級分稱為“大腸桿菌pKSN2提取物”)。
(3)將化合物(II)轉(zhuǎn)化為化合物(III)的能力的檢測類似于實施例32(3)，制備30μl的反應(yīng)溶液并保持在30℃下10分鐘。然而，作為上清液級分，使用在實施例67(2)中制備的上清液級分(大腸桿菌pKSN1609F提取物或大腸桿菌pKSN2提取物)。用乙酸乙酯萃取保持后的反應(yīng)溶液并將萃取層TLC分析。在展開TLC板以后，檢查其上對應(yīng)于用14C標(biāo)記的化合物(III)的斑點的存在(Rf值0.24和0.29)。從包含大腸桿菌pKSN1609F提取物的反應(yīng)溶液中檢測到對應(yīng)于化合物(III)的斑點。與此對比，在包含大腸桿菌pKSN2提取物的反應(yīng)溶液中未檢測到該斑點。
實施例68通過本發(fā)明蛋白質(zhì)(A16)，(A17)，(A18)，(A19)，(A20)，(A21)，(A22)，(A23)，(A24)或(A25)的化合物的代謝(1)通過本發(fā)明蛋白質(zhì)(A16)的化合物(XII)的代謝制備50mM磷酸鉀(pH7.0)的100μl反應(yīng)溶液，其包含12.5ppm化合物(XII)，3mM β-NADPH(以下稱為“組分A”)(Oriental YeastCompany)，1mg/ml來源于菠菜的鐵氧還蛋白(以下稱為“組分B”)(SigmaCompany)，0.15U/ml鐵氧還蛋白還原酶(以下稱為“組分C”)(SigmaCompany)和20μl在實施例49(2)中回收的上清液級分。將反應(yīng)溶液保持在30℃下10分鐘。另外，類似地制備和保持未加入用于上述反應(yīng)溶液組合物中的、選自組分A，組分B和組分C和在實施例49(2)中制備的上清液級分的至少一種組分的50mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)的100μl反應(yīng)溶液。將五微升(5μl)2N HCl和100μl乙酸乙酯加入和混合到保持以后的每種反應(yīng)溶液中。用UltraFree MC 0.22μm濾器裝置(MilliporeCompany)過濾在8,000xg下離心的上清液。在上述分析條件1下在HPLC上分析四十微升(40μl)液體濾過物(以下，將來自包含組分A，組分B，組分C和20μl在實施例49(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的液體濾過物稱為“(XII)代謝溶液(A16)”；另外，將來自不包含組分A，不包含組分B，不包含組分C和不包含在實施例49(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的液體濾過物稱為“(XII)對照溶液(A16)”)。與從(XII)對照溶液(A16)檢測的化合物(XII)的濃度相比，從(XII)代謝溶液(A16)檢測的化合物(XII)的濃度較低。另外從(XII)代謝溶液(A16)檢測到峰，其從(XII)對照溶液(A16)中未檢測到。在HPLC上所述峰的洗脫時間與質(zhì)量比在實施例41(2)的(XII)代謝溶液(A1)中檢測的所述化合物(XII)小14的化合物的峰洗脫時間相配。
(2)通過本發(fā)明蛋白質(zhì)(A17)的化合物(XII)的代謝除了使用20μl在實施例51(2)中回收的上清液級分而不是20μl在實施例49(2)中回收的上清液級分以外，按照實施例68(1)所述方法制備和保持反應(yīng)溶液。類似于實施例68(1)，制備保持后的反應(yīng)溶液。在上述分析條件1下在HPLC上分析四十微升(40μl)獲得的液體濾過物(以下，將來自包含組分A，組分B，組分C和20μl在實施例51(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的液體濾過物稱為“(XII)代謝溶液(A17)”；另外，將來自不包含組分A，不包含組分B，不包含組分C和不包含在實施例51(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的液體濾過物稱為“(XII)對照溶液(A17)”)。與從(XII)對照溶液(A17)檢測的化合物(XII)的濃度相比，從(XII)代謝溶液(A17)檢測的化合物(XII)的濃度較低。另外從(XII)代謝溶液(A17)檢測到峰，其從(XII)對照溶液(A17)中未檢測到。在HPLC上所述峰的洗脫時間與質(zhì)量比在實施例41(2)的(XII)代謝溶液(A1)中檢測的所述化合物(XII)小14的化合物的峰洗脫時間相配。
(3)通過本發(fā)明蛋白質(zhì)(A18)的化合物(XII)的代謝除了使用20μl在實施例53(2)中回收的上清液級分而不是20μl在實施例49(2)中回收的上清液級分以外，按照實施例68(1)所述方法制備和保持反應(yīng)溶液。類似于實施例68(1)，制備保持后的每種反應(yīng)溶液。在上述分析條件1下在HPLC上分析四十微升(40μl)獲得的液體濾過物(以下，將來自包含組分A，組分B，組分C和20μl在實施例53(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的液體濾過物稱為“(XII)代謝溶液(A18)”；另外，將來自不包含組分A，不包含組分B，不包含組分C和不包含在實施例53(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的液體濾過物稱為“(XII)對照溶液(A18)”)。與從(XII)對照溶液(A18)檢測的化合物(XII)的濃度相比，從(XII)代謝溶液(A18)檢測的化合物(XII)的濃度較低。另外從(XII)代謝溶液(A18)檢測到峰，其從(XII)對照溶液(A18)中未檢測到。在HPLC上所述峰的洗脫時間與質(zhì)量比在實施例41(2)的(XII)代謝溶液(A1)中檢測的所述化合物(XII)小14的化合物的峰洗脫時間相配。
(4)通過本發(fā)明蛋白質(zhì)(A19)的化合物(XII)的代謝除了使用20μl在實施例55(2)中回收的上清液級分而不是20μl在實施例49(2)中回收的上清液級分以外，按照實施例68(1)所述方法制備和保持反應(yīng)溶液。類似于實施例68(1)，制備保持后的每種反應(yīng)溶液。在上述分析條件1下在HPLC上分析四十微升(40μl)獲得的液體濾過物(以下，將來自包含組分A，組分B，組分C和20μl在實施例55(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的液體濾過物稱為“(XII)代謝溶液(A19)”；另外，將來自不包含組分A，不包含組分B，不包含組分C和不包含在實施例55(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的液體濾過物稱為“(XII)對照溶液(A19)”)。與從(XII)對照溶液(A19)檢測的化合物(XII)的濃度相比，從(XII)代謝溶液(A19)檢測的化合物(XII)的濃度較低。另外從(XII)代謝溶液(A19)檢測到峰，其從(XII)對照溶液(A19)中未檢測到。在HPLC上所述峰的洗脫時間與質(zhì)量比在實施例41(2)的(XII)代謝溶液(A1)中檢測的所述化合物(XII)小14的化合物的峰洗脫時間相配。
(5)通過本發(fā)明蛋白質(zhì)(A20)的化合物(XII)的代謝除了使用20μl在實施例57(2)中回收的上清液級分而不是20μl在實施例49(2)中回收的上清液級分以外，按照實施例68(1)所述方法制備和保持反應(yīng)溶液。類似于實施例68(1)，制備保持后的每種反應(yīng)溶液。在上述分析條件1下在HPLC上分析四十微升(40μl)獲得的液體濾過物(以下，將來自包含組分A，組分B，組分C和20μl在實施例57(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的液體濾過物稱為“(XII)代謝溶液(A20)”；另外，將來自不包含組分A，不包含組分B，不包含組分C和不包含在實施例57(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的液體濾過物稱為“(XII)對照溶液(A20)”)。與從(XII)對照溶液(A20)檢測的化合物(XII)的濃度相比，從(XII)代謝溶液(A20)檢測的化合物(XII)的濃度較低。另外從(XII)代謝溶液(A20)檢測到峰，其從(XII)對照溶液(A20)中未檢測到。在HPLC上所述峰的洗脫時間與質(zhì)量比在實施例41(2)的(XII)代謝溶液(A1)中檢測的所述化合物(XII)小14的化合物的峰洗脫時間相配。
(6)通過本發(fā)明蛋白質(zhì)(A21)的化合物(XII)的代謝除了使用20μl在實施例59(2)中回收的上清液級分而不是20μl在實施例49(2)中回收的上清液級分以外，按照實施例68(1)所述方法制備和保持反應(yīng)溶液。類似于實施例68(1)，制備保持后的每種反應(yīng)溶液。在上述分析條件1下在HPLC上分析四十微升(40μl)獲得的液體濾過物(以下，將來自包含組分A，組分B，組分C和20μl在實施例59(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的液體濾過物稱為“(XII)代謝溶液(A21)”；另外，將來自不包含組分A，不包含組分B，不包含組分C和不包含在實施例59(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的液體濾過物稱為“(XII)對照溶液(A21)”)。與從(XII)對照溶液(A21)檢測的化合物(XII)的濃度相比，從(XII)代謝溶液(A21)檢測的化合物(XII)的濃度較低。另外從(XII)代謝溶液(A21)檢測到峰，其從(XII)對照溶液(A21)中未檢測到。在HPLC上所述峰的洗脫時間與質(zhì)量比在實施例41(2)的(XII)代謝溶液(A1)中檢測的所述化合物(XII)小14的化合物的峰洗脫時間相配。
(7)通過本發(fā)明蛋白質(zhì)(A22)的化合物(XII)的代謝除了使用20μl在實施例61(2)中回收的上清液級分而不是20μl在實施例49(2)中回收的上清液級分以外，按照實施例68(1)所述方法制備和保持反應(yīng)溶液。類似于實施例68(1)，制備保持后的每種反應(yīng)溶液。在上述分析條件1下在HPLC上分析四十微升(40μl)獲得的液體濾過物(以下，將來自包含組分A，組分B，組分C和20μl在實施例61(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的液體濾過物稱為“(XII)代謝溶液(A22)”；另外，將來自不包含組分A，不包含組分B，不包含組分C和不包含在實施例61(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的液體濾過物稱為“(XII)對照溶液(A22)”)。與從(XII)對照溶液(A22)檢測的化合物(XII)的濃度相比，從(XII)代謝溶液(A22)檢測的化合物(XII)的濃度較低。另外從(XII)代謝溶液(A22)檢測到峰，其從(XII)對照溶液(A22)中未檢測到。在HPLC上所述峰的洗脫時間與質(zhì)量比在實施例41(2)的(XII)代謝溶液(A1)中檢測的所述化合物(XII)小14的化合物的峰洗脫時間相配。
(8)通過本發(fā)明蛋白質(zhì)(A23)的化合物(XII)的代謝除了使用20μl在實施例63(2)中回收的上清液級分而不是20μl在實施例49(2)中回收的上清液級分以外，按照實施例68(1)所述方法制備和保持反應(yīng)溶液。類似于實施例68(1)，制備保持后的每種反應(yīng)溶液。在上述分析條件1下在HPLC上分析四十微升(40μl)獲得的液體濾過物(以下，將來自包含組分A，組分B，組分C和20μl在實施例63(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的液體濾過物稱為“(XII)代謝溶液(A23)”；另外，將來自不包含組分A，不包含組分B，不包含組分C和不包含在實施例63(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的液體濾過物稱為“(XII)對照溶液(A23)”)。與從(XII)對照溶液(A23)檢測的化合物(XII)的濃度相比，從(XII)代謝溶液(A23)檢測的化合物(XII)的濃度較低。另外從(XII)代謝溶液(A23)檢測到峰，其從(XII)對照溶液(A23)中未檢測到。在HPLC上所述峰的洗脫時間與質(zhì)量比在實施例41(2)的(XII)代謝溶液(A1)中檢測的所述化合物(XII)小14的化合物的峰洗脫時間相配。
(9)通過本發(fā)明蛋白質(zhì)(A24)的化合物(XII)的代謝除了使用20μl在實施例65(2)中回收的上清液級分而不是20μl在實施例49(2)中回收的上清液級分以外，按照實施例68(1)所述方法制備和保持反應(yīng)溶液。類似于實施例68(1)，制備保持后的每種反應(yīng)溶液。在上述分析條件1下在HPLC上分析四十微升(40μl)獲得的液體濾過物(以下，將來自包含組分A，組分B，組分C和20μl在實施例65(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的液體濾過物稱為“(XII)代謝溶液(A24)”；另外，將來自不包含組分A，不包含組分B，不包含組分C和不包含在實施例65(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的液體濾過物稱為“(XII)對照溶液(A24)”)。與從(XII)對照溶液(A24)檢測的化合物(XII)的濃度相比，從(XII)代謝溶液(A24)檢測的化合物(XII)的濃度較低。另外從(XII)代謝溶液(A24)檢測到峰，其從(XII)對照溶液(A24)中未檢測到。在HPLC上所述峰的洗脫時間與質(zhì)量比在實施例41(2)的(XII)代謝溶液(A1)中檢測的所述化合物(XII)小14的化合物的峰洗脫時間相配。
(10)通過本發(fā)明蛋白質(zhì)(A25)的化合物(XII)的代謝除了使用20μl在實施例67(2)中回收的上清液級分而不是20μl在實施例49(2)中回收的上清液級分以外，按照實施例68(1)所述方法制備和保持反應(yīng)溶液。類似于實施例68(1)，制備保持后的每種反應(yīng)溶液。在上述分析條件1下在HPLC上分析四十微升(40μl)獲得的液體濾過物(以下，將來自包含組分A，組分B，組分C和20μl在實施例67(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的液體濾過物稱為“(XII)代謝溶液(A25)”；另外，將來自不包含組分A，不包含組分B，不包含組分C和不包含在實施例67(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的液體濾過物稱為“(XII)對照溶液(A25)”)。與從(XII)對照溶液(A25)檢測的化合物(XII)的濃度相比，從(XII)代謝溶液(A25)檢測的化合物(XII)的濃度較低。另外從(XII)代謝溶液(A25)檢測到峰，其從(XII)對照溶液(A25)中未檢測到。在HPLC上所述峰的洗脫時間與質(zhì)量比在實施例41(2)的(XII)代謝溶液(A1)中檢測的所述化合物(XII)小14的化合物的峰洗脫時間相配。
(11)通過本發(fā)明蛋白質(zhì)(A17)的化合物(XIII)的代謝除了使用12.5ppm化合物(XIII)而不是12.5ppm化合物(XII)以外，按照實施例68(2)所述方法制備和保持反應(yīng)溶液。類似于實施例68(1)，制備保持后的每種反應(yīng)溶液。在上述分析條件1下在HPLC上分析四十微升(40μl)獲得的液體濾過物(以下，將來自包含組分A，組分B，組分C和20μl在實施例51(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的液體濾過物稱為“(XIII)代謝溶液(A17)”；另外，將來自不包含組分A，不包含組分B，不包含組分C和不包含在實施例51(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的液體濾過物稱為“(XIII)對照溶液(A17)”)。與從(XIII)對照溶液(A17)檢測的化合物(XIII)的濃度相比，從(XIII)代謝溶液(A17)檢測的化合物(XIII)的濃度較低。另外從(XIII)代謝溶液(A17)檢測到峰，其從(XIII)對照溶液(A17)中未檢測到。在HPLC上所述峰的洗脫時間與質(zhì)量比在實施例41(3)的(XIII)代謝溶液(A1)中檢測的所述化合物(XIII)小14的化合物的峰洗脫時間相配。
(12)通過本發(fā)明蛋白質(zhì)(A18)的化合物(XIII)的代謝除了使用20μl在實施例53(2)中回收的上清液級分而不是20μl在實施例51(2)中回收的上清液級分以外，按照實施例68(11)所述方法制備和保持反應(yīng)溶液。類似于實施例68(1)，制備保持后的每種反應(yīng)溶液。在分析條件1下在HPLC上分析四十微升(40μl)獲得的液體濾過物(以下，將來自包含組分A，組分B，組分C和20μl在實施例53(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的液體濾過物稱為“(XIII)代謝溶液(A18)”；另外，將來自不包含組分A，不包含組分B，不包含組分C和不包含在實施例53(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的液體濾過物稱為“(XIII)對照溶液(A18)”)。與從(XIII)對照溶液(A18)檢測的化合物(XIII)的濃度相比，從(XIII)代謝溶液(A18)檢測的化合物(XIII)的濃度較低。另外從(XIII)代謝溶液(A18)檢測到峰，其從(XIII)對照溶液(A18)中未檢測到。在HPLC上所述峰的洗脫時間與質(zhì)量比在實施例41(3)的(XIII)代謝溶液(A1)中檢測的所述化合物(XIII)小14的化合物的峰洗脫時間相配。
(13)通過本發(fā)明蛋白質(zhì)(A19)的化合物(XIII)的代謝除了使用20μl在實施例55(2)中回收的上清液級分而不是20μl在實施例51(2)中回收的上清液級分以外，按照實施例68(11)所述方法制備和保持反應(yīng)溶液。類似于實施例68(1)，制備保持后的每種反應(yīng)溶液。在分析條件1下在HPLC上分析四十微升(40μl)獲得的液體濾過物(以下，將來自包含組分A，組分B，組分C和20μl在實施例55(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的液體濾過物稱為“(XIII)代謝溶液(A19)”；另外，將來自不包含組分A，不包含組分B，不包含組分C和不包含在實施例55(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的液體濾過物稱為“(XIII)對照溶液(A19)”)。與從(XIII)對照溶液(A19)檢測的化合物(XIII)的濃度相比，從(XIII)代謝溶液(A19)檢測的化合物(XIII)的濃度較低。另外從(XIII)代謝溶液(A19)檢測到峰，其從(XIII)對照溶液(A19)中未檢測到。在HPLC上所述峰的洗脫時間與質(zhì)量比在實施例41(3)的(XIII)代謝溶液(A1)中檢測的所述化合物(XIII)小14的化合物的峰洗脫時間相配。
(14)通過本發(fā)明蛋白質(zhì)(A20)的化合物(XIII)的代謝除了使用20μl在實施例57(2)中回收的上清液級分而不是20μl在實施例51(2)中回收的上清液級分以外，按照實施例68(11)所述方法制備和保持反應(yīng)溶液。類似于實施例68(1)，制備保持后的每種反應(yīng)溶液。在分析條件1下在HPLC上分析四十微升(40μl)獲得的液體濾過物(以下，將來自包含組分A，組分B，組分C和20μl在實施例57(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的液體濾過物稱為“(XIII)代謝溶液(A20)”；另外，將來自不包含組分A，不包含組分B，不包含組分C和不包含在實施例57(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的液體濾過物稱為“(XIII)對照溶液(A20)”)。與從(XIII)對照溶液(A20)檢測的化合物(XIII)的濃度相比，從(XIII)代謝溶液(A20)檢測的化合物(XIII)的濃度較低。另外從(XIII)代謝溶液(A20)檢測到峰，其從(XIII)對照溶液(A20)中未檢測到。在HPLC上所述峰的洗脫時間與質(zhì)量比在實施例41(3)的(XIII)代謝溶液(A1)中檢測的所述化合物(XIII)小14的化合物的峰洗脫時間相配。
(15)通過本發(fā)明蛋白質(zhì)(A21)的化合物(XIII)的代謝除了使用20μl在實施例59(2)中回收的上清液級分而不是20μl在實施例51(2)中回收的上清液級分以外，按照實施例68(11)所述方法制備和保持反應(yīng)溶液。類似于實施例68(1)，制備保持后的每種反應(yīng)溶液。在分析條件1下在HPLC上分析四十微升(40μl)獲得的液體濾過物(以下，將來自包含組分A，組分B，組分C和20μl在實施例59(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的液體濾過物稱為“(XIII)代謝溶液(A21)”；另外，將來自不包含組分A，不包含組分B，不包含組分C和不包含在實施例59(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的液體濾過物稱為“(XIII)對照溶液(A21)”)。與從(XIII)對照溶液(A21)檢測的化合物(XIII)的濃度相比，從(XIII)代謝溶液(A21)檢測的化合物(XIII)的濃度較低。另外從(XIII)代謝溶液(A21)檢測到峰，其從(XIII)對照溶液(A21)中未檢測到。在HPLC上所述峰的洗脫時間與質(zhì)量比在實施例41(3)的(XIII)代謝溶液(A1)中檢測的所述化合物(XIII)小14的化合物的峰洗脫時間相配。
(16)通過本發(fā)明蛋白質(zhì)(A23)的化合物(XIII)的代謝除了使用20μl在實施例63(2)中回收的上清液級分而不是20μl在實施例51(2)中回收的上清液級分以外，按照實施例68(11)所述方法制備和保持反應(yīng)溶液。類似于實施例68(1)，制備保持后的每種反應(yīng)溶液。在分析條件1下在HPLC上分析四十微升(40μl)獲得的液體濾過物(以下，將來自包含組分A，組分B，組分C和20μl在實施例63(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的液體濾過物稱為“(XIII)代謝溶液(A23)”；另外，將來自不包含組分A，不包含組分B，不包含組分C和不包含在實施例63(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的液體濾過物稱為“(XIII)對照溶液(A23)”)。與從(XIII)對照溶液(A23)檢測的化合物(XIII)的濃度相比，從(XIII)代謝溶液(A23)檢測的化合物(XIII)的濃度較低。另外從(XIII)代謝溶液(A23)檢測到峰，其從(XIII)對照溶液(A23)中未檢測到。在HPLC上所述峰的洗脫時間與質(zhì)量比在實施例41(3)的(XIII)代謝溶液(A1)中檢測的所述化合物(XIII)小14的化合物的峰洗脫時間相配。
(17)通過本發(fā)明蛋白質(zhì)(A25)的化合物(XIII)的代謝除了使用20μl在實施例67(2)中回收的上清液級分而不是20μl在實施例51(2)中回收的上清液級分以外，按照實施例68(11)所述方法制備和保持反應(yīng)溶液。類似于實施例68(1)，制備保持后的每種反應(yīng)溶液。在分析條件1下在HPLC上分析四十微升(40μl)獲得的液體濾過物(以下，將來自包含組分A，組分B，組分C和20μl在實施例67(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的液體濾過物稱為“(XIII)代謝溶液(A25)”；另外，將來自不包含組分A，不包含組分B，不包含組分C和不包含在實施例67(2)中回收的上清液級分的反應(yīng)溶液的液體濾過物稱為“(XIII)對照溶液(A25)”)。與從(XIII)對照溶液(A25)檢測的化合物(XIII)的濃度相比，從(XIII)代謝溶液(A25)檢測的化合物(XIII)的濃度較低。另外從(XIII)代謝溶液(A25)檢測到峰，其從(XIII)對照溶液(A25)中未檢測到。在HPLC上所述峰的洗脫時間與質(zhì)量比在實施例41(3)的(XIII)代謝溶液(A1)中檢測的所述化合物(XIII)小14的化合物的峰洗脫時間相配。
實施例69其中本發(fā)明DNA(A1)，(A2)，(A3)或(A4)是探針的雜交(1)探針制備按照實施例30(1)所述方法進(jìn)行PCR。然而，作為模板，使用10ng在實施例26(1)中制備的不產(chǎn)色鏈霉菌IFO 12735的染色體DNA而不是在實施例3(1)中制備的暗產(chǎn)色鏈霉菌IFO 12898的所述50ng染色體DNA。作為引物，使用具有SEQ ID NO328所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO329所示核苷酸序列的寡核苷酸。回收通過所述PCR擴(kuò)增的DNA以產(chǎn)生用洋地黃毒苷標(biāo)記的具有SEQ ID NO109所示核苷酸序列的探針(以下稱為“DIG標(biāo)記的探針(A4)”)。
(2)質(zhì)粒溶液的制備通過使用Advantage-GC基因組聚合酶混合物(Clontech Company)和將在實施例31(1)中制備的黑胡桃鏈霉菌IFO 13445的染色體DNA用作模板進(jìn)行PCR。作為引物，使用具有SEQ ID NO330所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO331所示核苷酸序列的寡核苷酸。通過加入2種每種總計200nM的引物，10ng染色體DNA，4.0μl dNTP混合物(4種dNTP每種2.5mM的混合物；Clontech公司)，10.0μl 5xGC緩沖液，2.2μl 25mM Mg(OAc)2，10.0μl 5M GC-Melt和1.0μl Advantage-GC基因組聚合酶混合物(Clontech公司)和蒸餾水，PCR反應(yīng)溶液總計50μl。PCR的反應(yīng)條件是在保持在94℃ 1分鐘后；重復(fù)7個循環(huán)，一個循環(huán)包括保持在94℃ 10秒，接著72℃ 3分鐘；重復(fù)36個循環(huán)，一個循環(huán)包括94℃ 10秒，接著67℃ 3分鐘；然后保持在67℃ 7分鐘。通過按照所述試劑盒附帶的說明書使用QIA快速PCR純化試劑盒(Qiagen公司)從PCR反應(yīng)溶液中純化DNA。按照附帶的手冊將獲得的DNA連接到TA克隆載體pCR2.1(Invitrogen公司)并導(dǎo)入大腸桿菌TOP10F’(Invitrogen公司)。使用QIAprep Spin Miniprep試劑盒(Qiagen公司)從獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體中制備質(zhì)粒DNA以獲得含有本發(fā)明DNA(A11)的質(zhì)粒溶液。
類似地，通過將在實施例33(1)中制備的津島鏈霉菌IFO 13782的染色體DNA用作模板和通過將具有SEQ ID NO332所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO333所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物進(jìn)行PCR。類似上面將通過PCR獲得的DNA連接到載體。然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌。從獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體中制備質(zhì)粒以獲得含有本發(fā)明DNA(A12)的質(zhì)粒溶液。
類似地，通過將在實施例35(1)中制備的熱淡天藍(lán)鏈霉菌IFO 14273t的染色體DNA用作模板和通過將具有SEQ ID NO331所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO334所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物進(jìn)行PCR。類似上面將通過PCR獲得的DNA連接到載體。然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌。從獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體中制備質(zhì)粒以獲得含有本發(fā)明DNA(A13)的質(zhì)粒溶液。
類似地，通過將在實施例37(1)中制備的球團(tuán)產(chǎn)色鏈霉菌IFO 13673t的染色體DNA用作模板和通過將具有SEQ ID NO330所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO331所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物進(jìn)行PCR。類似上面將通過PCR獲得的DNA連接到載體。然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌。從獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體中制備質(zhì)粒以獲得含有本發(fā)明DNA(A14)的質(zhì)粒溶液。
類似地，通過將在實施例39(1)中制備的橄欖產(chǎn)色鏈霉菌IFO 12444的染色體DNA用作模板和通過將具有SEQ ID NO330所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO331所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物進(jìn)行PCR。類似上面將通過PCR獲得的DNA連接到載體。然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌。從獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體中制備質(zhì)粒以獲得含有本發(fā)明DNA(A15)的質(zhì)粒溶液。
類似地，通過將在實施例48(1)中制備的裝飾鏈霉菌IFO 13069t的染色體DNA用作模板和通過將具有SEQ ID NO335所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO336所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物進(jìn)行PCR。類似上面將通過PCR獲得的DNA連接到載體。然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌。從獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體中制備質(zhì)粒以獲得含有本發(fā)明DNA(A16)的質(zhì)粒溶液。
類似地，通過將在實施例50(1)中制備的灰色鏈霉菌ATCC 10137的染色體DNA用作模板和通過將具有SEQ ID NO335所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO336所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物進(jìn)行PCR。類似上面將通過PCR獲得的DNA連接到載體。然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌。從獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體中制備質(zhì)粒以獲得含有本發(fā)明DNA(A17)的質(zhì)粒溶液。
類似地，通過將在實施例52(1)中制備的不產(chǎn)色鏈霉菌IFO 12735的染色體DNA用作模板和通過將具有SEQ ID NO330所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO331所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物進(jìn)行PCR。類似上面將通過PCR獲得的DNA連接到載體。然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌。從獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體中制備質(zhì)粒以獲得含有本發(fā)明DNA(A18)的質(zhì)粒溶液。
類似地，通過將在實施例54(1)中制備的灰色鏈霉菌IFO 13849T的染色體DNA用作模板和通過將具有SEQ ID NO333所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO335所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物進(jìn)行PCR。類似上面將通過PCR獲得的DNA連接到載體。然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌。從獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體中制備質(zhì)粒以獲得含有本發(fā)明DNA(A19)的質(zhì)粒溶液。
類似地，通過將在實施例56(1)中制備的羊毛鏈霉菌IFO 12787T的染色體DNA用作模板和通過將具有SEQ ID NO331所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO337所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物進(jìn)行PCR。類似上面將通過PCR獲得的DNA連接到載體。然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌。從獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體中制備質(zhì)粒以獲得含有本發(fā)明DNA(A20)的質(zhì)粒溶液。
類似地，通過將在實施例58(1)中制備的三澤鏈霉菌IFO 13855T的染色體DNA用作模板和通過將具有SEQ ID NO331所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO338所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物進(jìn)行PCR。類似上面將通過PCR獲得的DNA連接到載體。然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌。從獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體中制備質(zhì)粒以獲得含有本發(fā)明DNA(A21)的質(zhì)粒溶液。
類似地，通過將在實施例62(1)中制備的玫瑰變紅鏈霉菌IFO 13682T的染色體DNA用作模板和通過將具有SEQ ID NO331所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO339所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物進(jìn)行PCR。類似上面將通過PCR獲得的DNA連接到載體。然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌。從獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體中制備質(zhì)粒以獲得含有本發(fā)明DNA(A23)的質(zhì)粒溶液。
類似地，通過將在實施例66(1)中制備的斯堡鏈霉菌IFO 13446T的染色體DNA用作模板和通過將具有SEQ ID NO331所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO339所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物進(jìn)行PCR。類似上面將通過PCR獲得的DNA連接到載體。然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌。從獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體中制備質(zhì)粒以獲得含有本發(fā)明DNA(A25)的質(zhì)粒溶液。
另外，類似地，通過將在實施例60(1)中制備的蒼白色鏈霉菌IFO13434T的染色體DNA用作模板和通過將具有SEQ ID NO340所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO341所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物進(jìn)行PCR。類似上面將通過PCR獲得的DNA連接到載體。然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌。從獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體中制備質(zhì)粒以獲得含有本發(fā)明DNA(A22)的質(zhì)粒溶液。
類似地，通過將在實施例64(1)中制備的魯?shù)劓溍咕鶬FO 15875T的染色體DNA用作模板和通過將具有SEQ ID NO342所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO343所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物進(jìn)行PCR。類似上面將通過PCR獲得的DNA連接到載體。然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌。從獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體中制備質(zhì)粒以獲得含有本發(fā)明DNA(A24)的質(zhì)粒溶液。
(2)斑點雜交將約100ng和10ng在實施例69(2)中制備的各種質(zhì)粒印跡在HybondN+尼龍膜(Amersham Biosciences Company)上。質(zhì)粒為包含本發(fā)明DNA(A11)的質(zhì)粒DNA，包含本發(fā)明DNA(A12)的質(zhì)粒DNA，包含本發(fā)明DNA(A13)的質(zhì)粒DNA，包含本發(fā)明DNA(A14)的質(zhì)粒DNA，包含本發(fā)明DNA(A15)的質(zhì)粒DNA，包含本發(fā)明DNA(A16)的質(zhì)粒DNA，包含本發(fā)明DNA(A17)的質(zhì)粒DNA，包含本發(fā)明DNA(A18)的質(zhì)粒DNA，包含本發(fā)明DNA(A19)的質(zhì)粒DNA，包含本發(fā)明DNA(A20)的質(zhì)粒DNA，包含本發(fā)明DNA(A21)的質(zhì)粒DNA，包含本發(fā)明DNA(A23)的質(zhì)粒DNA，包含本發(fā)明DNA(A25)的質(zhì)粒DNA。用透射儀將紫外光指向獲得的膜5分鐘。
按照實施例30(2)所述方法進(jìn)行雜交和檢測。將在實施例30(1)中制備的探針在100℃保持5分鐘和然后快速在冰上冷卻。作為探針，使用用洋地黃毒苷標(biāo)記的具有SEQ ID NO6所示核苷酸序列的DNA(以下稱為“DIG標(biāo)記的探針(A1)”)，用洋地黃毒苷標(biāo)記的具有SEQ ID NO7所示核苷酸序列的DNA(以下稱為“DIG標(biāo)記的探針(A2)”)，用洋地黃毒苷標(biāo)記的具有SEQ ID NO8所示核苷酸序列的DNA(以下稱為“DIG標(biāo)記的探針(A3)”)或在實施例69(1)中產(chǎn)生的DIG標(biāo)記探針(A4)。在將DIG標(biāo)記的探針(A1)，(A2)，(A3)或(A4)中任何一個用于雜交的情形中，對于10ng和100ng上述質(zhì)粒DNA中每一個的各種試劑檢測到信號。
另外，類似地，將約10ng和100ng在實施例69(2)中制備的含有本發(fā)明DNA(A22)的質(zhì)粒DNA和含有本發(fā)明DNA(A24)的質(zhì)粒DNA各自印跡在Hybond N+尼龍膜(Amersham Biosciences Company)上。按照實施例30(2)進(jìn)行雜交和檢測。
實施例70其中密碼子使用已經(jīng)針對在大豆中表達(dá)調(diào)整的本發(fā)明DNA(A23)(以下稱為“本發(fā)明DNA(A23)S”)的制備(1)本發(fā)明DNA(A23)S的制備通過使用具有SEQ ID NO346所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO367所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物，按照附帶的手冊用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo Company)進(jìn)行PCR。將獲得的PCR產(chǎn)物的等分部分用作類似地使用具有SEQ ID NO345所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO366所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物進(jìn)行的PCR的模板。另外，將PCR產(chǎn)物的等分部分用作類似地使用具有SEQID NO344所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO365所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物進(jìn)行的PCR的模板。將獲得的反應(yīng)溶液稱為反應(yīng)溶液1。
另外，按照附帶的手冊，通過使用具有SEQ ID NO349所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO364所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物，用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo Company)進(jìn)行PCR。將獲得的PCR產(chǎn)物的等分部分用作類似地使用具有SEQ ID NO348所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO363所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物進(jìn)行的PCR的模板。另外，將PCR產(chǎn)物的等分部分用作類似地使用具有SEQ ID NO347所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO362所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物進(jìn)行的PCR的模板。將獲得的反應(yīng)溶液稱為反應(yīng)溶液2。
另外，按照附帶的手冊，通過使用具有SEQ ID NO352所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO361所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物，用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo Company)進(jìn)行PCR。將獲得的PCR產(chǎn)物的等分部分用作類似地使用具有SEQ ID NO351所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO360所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物進(jìn)行的PCR的模板。另外，將PCR產(chǎn)物的等分部分用作類似地使用具有SEQ ID NO350所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO359所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物進(jìn)行的PCR的模板。將獲得的反應(yīng)溶液稱為反應(yīng)溶液3。
另外，按照附帶的手冊，通過使用具有SEQ ID NO355所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO358所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物，用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo Company)進(jìn)行PCR。將獲得的PCR產(chǎn)物的等分部分用作類似地使用具有SEQ ID NO354所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO357所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物進(jìn)行的PCR的模板。另外，將PCR產(chǎn)物的等分部分用作類似地使用具有SEQ ID NO353所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO356所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物進(jìn)行的PCR的模板。將獲得的反應(yīng)溶液稱為反應(yīng)溶液4。
將如此獲得的反應(yīng)溶液1至4混合。按照附帶的手冊，通過將其混合物的等分部分用作模板和使用具有SEQ ID NO344所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO356所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物，用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo Company)進(jìn)行PCR。證實擴(kuò)增的DNA的核苷酸序列。獲得具有其中核苷酸序列5’-cat-3’連接到SEQ ID NO368所示核苷酸序列的5’末端上游和核苷酸序列5’-aagctt-3’連接到SEQ IDNO368所示核苷酸序列的3’末端下游的序列的DNA。
在表28和表29中顯示具有SEQ ID NO232所示核苷酸序列的本發(fā)明DNA(A23)的密碼子使用(GC含量73.10％)。在表24和表25中顯示大豆的密碼子使用(GC含量46.12％)。在表30和表31中顯示具有SEQ IDNO368所示核苷酸序列的本發(fā)明DNA(A23)S的密碼子使用(52.38％的GC含量)。
表28

表29


表30

表31

(2)具有本發(fā)明蛋白質(zhì)(A23)S的轉(zhuǎn)化大腸桿菌的生產(chǎn)用限制酶NdeI和HindIII消化在實施例70(1)中獲得的具有SEQ IDNO368所示核苷酸序列的DNA。將用NdeI和HindIII消化的獲得的DNA和質(zhì)粒pKSN2連接以獲得其中具有SEQ ID NO368所示核苷酸序列的DNA插入pKSN2的NdeI位點和HindIII位點之間的質(zhì)粒(以下稱為“pKSN1584soy”)。將所述質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌JM109。將獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體稱為JM109/pKSN1584soy。
(3)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A23)S在大腸桿菌中的表達(dá)和所述蛋白質(zhì)的回收類似于實施例4(2)，培養(yǎng)在實施例70(2)中獲得的大腸桿菌JM109/pKSN1584soy和在實施例63(1)中獲得的大腸桿菌JM109/pKSN1584F中的每一個?；厥占?xì)胞。制備細(xì)胞裂解液。在實施例4(2)所述方法下，從細(xì)胞裂解液中制備上清液級分(以下，將從大腸桿菌JM109/pKSN1584soy獲得的上清液級分稱為“大腸桿菌pKSN1584soy提取物”和將從大腸桿菌JM109/pKSN1584F獲得的上清液級分稱為“大腸桿菌pKSN1584F提取物”)。在大腸桿菌pKSN1584soy提取物中包含的每一蛋白質(zhì)的的量的P450的量可以比得上和高于在大腸桿菌pKSN1584F提取物中包含的每一蛋白質(zhì)的量的P450的量。
實施例71其中密碼子使用已經(jīng)針對在大豆中表達(dá)調(diào)整的本發(fā)明DNA(A25)(以下稱為“本發(fā)明DNA(A25)S”)的制備和表達(dá)(1)本發(fā)明DNA(A25)S的制備通過使用具有SEQ ID NO371所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO392所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物，按照附帶的手冊用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo Company)進(jìn)行PCR。將獲得的PCR產(chǎn)物的等分部分用作類似地使用具有SEQ ID NO370所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO391所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物進(jìn)行的PCR的模板。另外，將PCR產(chǎn)物的等分部分用作類似地使用具有SEQID NO369所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO390所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物進(jìn)行的PCR的模板。將獲得的反應(yīng)溶液稱為反應(yīng)溶液1。
另外，按照附帶的手冊，通過使用具有SEQ ID NO374所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO389所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物，用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo Company)進(jìn)行PCR。將獲得的PCR產(chǎn)物的等分部分用作類似地使用具有SEQ ID NO373所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO383所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物進(jìn)行的PCR的模板。另外，將PCR產(chǎn)物的等分部分用作類似地使用具有SEQ ID NO372所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO387所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物進(jìn)行的PCR的模板。將獲得的反應(yīng)溶液稱為反應(yīng)溶液2。
另外，按照附帶的手冊，通過使用具有SEQ ID NO377所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO386所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物，用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo Company)進(jìn)行PCR。將獲得的PCR產(chǎn)物的等分部分用作類似地使用具有SEQ ID NO376所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO385所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物進(jìn)行的PCR的模板。另外，將PCR產(chǎn)物的等分部分用作類似地使用具有SEQ ID NO375所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO384所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物進(jìn)行的PCR的模板。將獲得的反應(yīng)溶液稱為反應(yīng)溶液3。
另外，按照附帶的手冊，通過使用具有SEQ ID NO380所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO383所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物，用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo Company)進(jìn)行PCR。將獲得的PCR產(chǎn)物的等分部分用作類似地使用具有SEQ ID NO379所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO382所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物進(jìn)行的PCR的模板。另外，將PCR產(chǎn)物的等分部分用作類似地使用具有SEQ ID NO378所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO381所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物進(jìn)行的PCR的模板。將獲得的反應(yīng)溶液稱為反應(yīng)溶液4。
將如此獲得的反應(yīng)溶液1至4混合。按照附帶的手冊，通過將其混合物的等分部分用作模板和使用具有SEQ ID NO369所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO381所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物，用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo Company)進(jìn)行PCR。證實擴(kuò)增的DNA的核苷酸序列。獲得具有其中核苷酸序列5’-cat-3’連接到SEQ ID NO393所示核苷酸序列的5’末端上游和核苷酸序列5’-aagctt-3’連接到SEQ IDNO393所示核苷酸序列的3’末端下游的序列的DNA。
在表32和表33中顯示具有SEQ ID NO234所示核苷酸序列的本發(fā)明DNA(A25)的密碼子使用(GC含量71.93％)。在表24和表25中顯示大豆的密碼子使用(GC含量46.12％)。在表34和表35中顯示具有SEQ IDNO393所示核苷酸序列的本發(fā)明DNA(A25)S的密碼子使用(52.05％的GC含量)。
表32

表33


表34

表35

(2)具有本發(fā)明蛋白質(zhì)(A25)S的轉(zhuǎn)化大腸桿菌的生產(chǎn)用限制酶NdeI和HindIII消化在實施例71(1)中獲得的具有SEQ IDNO393所示核苷酸序列的DNA。將用NdeI和HindIII消化的獲得的DNA和質(zhì)粒pKSN2連接以獲得其中具有SEQ ID NO393所示核苷酸序列的DNA插入pKSN2的NdeI位點和HindIII位點之間的質(zhì)粒(以下稱為“pKSN1609soy”)。將所述質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌JM109。將獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體稱為JM109/pKSN1609soy。
(3)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A25)S在大腸桿菌中的表達(dá)和所述蛋白質(zhì)的回收類似于實施例4(2)，培養(yǎng)在實施例71(2)中獲得的大腸桿菌JM109/pKSN1609soy和在實施例67(1)中獲得的大腸桿菌JM109/pKSN1609F中的每一個。回收細(xì)胞。制備細(xì)胞裂解液。在實施例4(2)所述方法下，從細(xì)胞裂解液中制備上清液級分(以下，將從大腸桿菌JM109/pKSN1609soy獲得的上清液級分稱為“大腸桿菌pKSN1609soy提取物”和將從大腸桿菌JM109/pKSN1609F獲得的上清液級分稱為“大腸桿菌pKSN1609F提取物”)。在大腸桿菌pKSN1609soy提取物中包含的每一蛋白質(zhì)的的量的P450的量可以比得上和高于在大腸桿菌pKSN1609F提取物中包含的每一蛋白質(zhì)的量的P450的量。
實施例72識別本發(fā)明蛋白質(zhì)(A25)的本發(fā)明抗體(A)(以下稱為“本發(fā)明抗體(A25)”)的制備(1)表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A25)的大腸桿菌的提取物的制備按照實施例4(2)所述方法，將在實施例71(2)中生產(chǎn)的大腸桿菌JM109/pKSN1609soy預(yù)培養(yǎng)過夜。將獲得的培養(yǎng)基接種至包含50μg/ml氨芐青霉素的1L TB培養(yǎng)基中并在26℃下培養(yǎng)。然后將5-氨基乙酰丙酸加至500μM的終濃度，將IPTG加至1mM的終濃度，進(jìn)一步培養(yǎng)。從培養(yǎng)基中回收細(xì)胞，用0.05M Tris-HCl緩沖液(pH7.5)洗滌和然后懸浮在100ml包含1mM PMSF的所述緩沖液中。將獲得的細(xì)胞培養(yǎng)基在輸出量5，占空因數(shù)30％的條件下進(jìn)行超聲波儀(Sonifer(Branson Sonic PowerCompany))3次，每次10分鐘，以便獲得細(xì)胞裂解液。在將細(xì)胞裂解液離心(9,000xg，10分鐘)后回收上清液和離心(200,000xg，70分鐘)以回收上清液級分(以下，將從大腸桿菌JM109/pKSN1609soy中獲得的上清液級分稱為“大腸桿菌pKSN11609soy提取物”。
(2)本發(fā)明蛋白質(zhì)(A25)的純化將在實施例72(1)中獲得的上清液級分(大腸桿菌pKSN11609soy提取物)注射到Hiload HiLoad 16/10 Q Sepharose HP柱(AmershamBioscience Company)中。接下來，在40ml的20mM雙三丙烷緩沖液(pH7.0)流進(jìn)柱子以后，與線性梯度的NaCl(NaCl的梯度是0.00125M/分鐘，NaCl濃度的范圍是0M-0.375M，流速為3ml/分鐘)流動20mM雙三丙烷緩沖液以分級回收在0.088M-0.100M的NaCl濃度下洗脫的10ml級分。
將回收的級分進(jìn)行PD10柱(Amersham Biosciences Company)，用20mM雙三丙烷緩沖液(pH7.0)洗脫以回收包含蛋白質(zhì)的級分。接下來，將所述級分注射于MonoQ HR 10/10(Amersham Biosciences Company)中。將十六毫升(16ml)20mM雙三丙烷緩沖液流進(jìn)柱子。接下來，與線性梯度的NaCl(NaCl的梯度是0.001042M/分鐘，NaCl濃度的范圍是0M-0.25M，流速為4ml/分鐘)流動20mM雙三丙烷緩沖液以分級回收在0.060M-0.069M的NaCl濃度下洗脫的8ml級分。
用20mM雙三丙烷緩沖液(pH7.0)將回收的級分稀釋2.5倍并注射于MonoQ HR 5/5柱(Amersham Biosciences Company)中。接下來，在將2ml 20mM雙三丙烷緩沖液(pH7.0)流進(jìn)柱子以后，與線性梯度的NaCl(NaCl的梯度是0.008333M/分鐘，NaCl濃度的范圍是0M-0.25M，流速為1ml/分鐘)流動20mM雙三丙烷緩沖液以分級回收在0.073M-0.077M的NaCl濃度下洗脫的0.5ml級分。
通過使用“PAG mini Daiichi 10/20”(Daiichi Pure Chemicals有限公司)用SDS-PAGE分析如此純化的級分，以證實那些級分是主要包含本發(fā)明蛋白質(zhì)(A25)的級分。
(3)本發(fā)明抗體(A25)的制備按照實施例44(3)所述方法進(jìn)行本發(fā)明抗體的制備。然而，不是使用本發(fā)明蛋白質(zhì)(A1)，將在實施例72(2)中獲得的本發(fā)明蛋白質(zhì)(A25)用來獲得含有本發(fā)明抗體(A25)的抗血清。
實施例73通過本發(fā)明抗體(A25)檢測本發(fā)明蛋白質(zhì)通過使用在實施例72(3)中獲得的本發(fā)明抗體(A25)與每種大腸桿菌提取物進(jìn)行免疫印跡。進(jìn)行以下各項的SDS聚丙烯酰胺電泳(40mA，1小時)在實施例49(2)中獲得的大腸桿菌pKSN452F提取物(含有約2pmol本發(fā)明蛋白質(zhì)(A16))；在實施例51(2)中獲得的大腸桿菌pKSN608F提取物(含有約2pmol本發(fā)明蛋白質(zhì)(A17))；在實施例53(2)中獲得的大腸桿菌pKSN646BF提取物(含有約2pmol本發(fā)明蛋白質(zhì)(A18))；在實施例55(2)中獲得的大腸桿菌pKSN1502F提取物(含有約2pmol本發(fā)明蛋白質(zhì)(A19))；在實施例57(2)中獲得的大腸桿菌pKSN1525F提取物(含有約2pmol本發(fā)明蛋白質(zhì)(A20))；在實施例59(2)中獲得的大腸桿菌pKSN1543BF提取物(含有約2pmol本發(fā)明蛋白質(zhì)(A21))；在實施例61(2)中獲得的大腸桿菌pKSN1558BF提取物(含有約2pmol本發(fā)明蛋白質(zhì)(A22))；在實施例63(2)中獲得的大腸桿菌pKSN1584F提取物(含有約2pmol本發(fā)明蛋白質(zhì)(A23))；在實施例65(2)中獲得的大腸桿菌pKSN1589BF提取物(含有約2pmol本發(fā)明蛋白質(zhì)(A24))；在實施例67(2)中獲得的大腸桿菌pKSN1609F提取物(含有約0.5pmol本發(fā)明蛋白質(zhì)(A25))；在實施例70(3)中獲得的大腸桿菌pKSN1584soy提取物(含有約2pmol本發(fā)明蛋白質(zhì)(A23))；在實施例71(3)中獲得的大腸桿菌pKSN1609soy提取物(含有約0.5pmol本發(fā)明蛋白質(zhì)(A25))；和在實施例67(2)中獲得的大腸桿菌pKSN2提取物(含有約0.8mg蛋白質(zhì))。按照實施例45所述方法將所述凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PDVF膜上。按照實施例45所述方法，將在實施例45中獲得的PDVF膜(以下稱為“PDVF膜(A)”)和從上述方法中獲得的PDVF膜(以下稱為“PDVF膜(B)”)與在實施例72(3)中獲得的抗血清反應(yīng)。隨后，按照實施例45所述方法進(jìn)行與第二抗體的反應(yīng)，洗滌和染色。在PDVF膜(A)上檢測到對應(yīng)于本發(fā)明蛋白質(zhì)(A1)，(A2)，(A3)，(A4)，(A11)，(A12)，(A13)，(A14)和(A15)以及本發(fā)明蛋白質(zhì)(A9)和(A10)的條帶的染色。在PDVF膜(B)上檢測到對應(yīng)于本發(fā)明蛋白質(zhì)(A16)，(A17)，(A18)，(A19)，(A20)，(A21)，(A22)，(A23)，(A24)和(A25)的條帶的染色。對于PVDF膜(A)的在實施例4(2)中獲得的大腸桿菌pKSN2提取物(含有0.78mg蛋白質(zhì))試劑和對于PVDF膜(B)的在實施例67(2)中獲得的大腸桿菌pKSN2提取物(含有0.8mg蛋白質(zhì))試劑未檢測到染色的條帶。
實施例74將本發(fā)明DNA(A23)S導(dǎo)入植物(1)用于直接導(dǎo)入的包含本發(fā)明DNA(A23)S的葉綠體表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建-部分1
構(gòu)建包含嵌合DNA的質(zhì)粒作為用基因槍法將本發(fā)明DNA(A23)S導(dǎo)入植物的質(zhì)粒，所述嵌合DNA中本發(fā)明DNA(A23)S緊接在編碼大豆(cv.Jack)RuBPC小亞基葉綠體轉(zhuǎn)運肽的核苷酸序列之后而沒有密碼子框的變化。
首先，通過PCR擴(kuò)增包含SEQ ID NO398所示核苷酸序列的DNA。通過將在實施例70(2)中獲得的pKSN1584soy用作模板和通過將由SEQID NO397所示核苷酸序列組成的寡核苷酸和由SEQ ID NO398所示核苷酸序列組成的寡核苷酸用作引物來進(jìn)行PCR。PCR使用KOD-plus(Toyobo Company)。依照以下進(jìn)行PCR在94℃下進(jìn)行保持2分鐘一次；20個循環(huán)，一個循環(huán)包括保持94℃ 30秒，接著53℃ 30秒，接著68℃ 90秒；和最后保持在68℃ 3分鐘。通過按照附帶手冊進(jìn)行程序用MagExtractor-PCR&Gel-Clean up(Toyobo Company)回收和純化擴(kuò)增的DNA。通過按照附帶的手冊用TaKaRa BKL試劑盒(Takara ShuzoCompany)處理獲得的DNA，將DNA平末端化和5’末端磷酸化?；厥瞻琒EQ ID NO368所示核苷酸序列的DNA。在用SmaI消化質(zhì)粒pUC19(Takara Shuzo Company)以后，用牛小腸堿性磷酸酶(Takara ShuzoCompany)將5’末端去磷酸化。通過連接產(chǎn)生的去磷酸化的DNA和含有SEQ ID NO368所示核苷酸序列的DNA產(chǎn)生質(zhì)粒。在用限制酶EcoT22I和SacI消化獲得的質(zhì)粒以后，回收包含SEQ ID NO368所示核苷酸序列的DNA。在用限制酶EcoT22I和SacI消化在實施例16(2)中獲得的質(zhì)粒pUCrSt657以后，分離約2.9kbp的DNA，其具有來源于pUC19的核苷酸序列和編碼大豆(cv.Jack)RuBPC小亞基葉綠體轉(zhuǎn)運肽的序列。將獲得的DNA和包含SEQ ID NO368所示核苷酸序列的上述DNA連接以獲得包含嵌合DNA的pUCrSt1584soy(圖54)，其中本發(fā)明DNA(A23)S緊接在編碼大豆(cv.Jack)RuBPC小亞基葉綠體轉(zhuǎn)運肽的核苷酸序列之后而沒有密碼子框的變化。
用限制酶BamHI和SacI消化獲得的質(zhì)粒pUCrSt1584soy以分離包含SEQ ID NO368所示核苷酸序列的DNA。將所述DNA插入在實施例16(2)中獲得的質(zhì)粒pNdG6-ΔT的BglII限制酶位點和SacI限制酶位點之間以獲得質(zhì)粒pSUM-NdG6-rSt-1584soy(圖55)，其中CR16G6啟動子已經(jīng)連接到嵌合DNA的下游，在嵌合DNA中所述DNA緊接在編碼大豆(cv.Jack)RuBPC小亞基葉綠體轉(zhuǎn)運肽的核苷酸序列之后而沒有密碼子框的變化。
接下來，將質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞(Takara ShuzoCompany)和選擇氨芐青霉素抗性細(xì)胞。另外，通過使用BigDye終止循環(huán)測序簡易反應(yīng)試劑盒3.0版(PE Applied Biosystems Company)和DNA測序儀3100(PE Applied Biosystems Company)測定包含在氨芐青霉素抗性菌株中的質(zhì)粒的核苷酸序列。結(jié)果，證實質(zhì)粒pSUM-NdG6-rSt-1584soy具有SEQ ID NO368所示核苷酸序列。
(2)用于直接導(dǎo)入的具有本發(fā)明DNA(A23)S的葉綠體表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建-部分(2)構(gòu)建用基因槍法將本發(fā)明DNA(A23)S導(dǎo)入植物的質(zhì)粒。該質(zhì)粒包含嵌合DNA，其中本發(fā)明DNA(A23)S緊接在編碼大豆(cv.Jack)RuBPC小亞基葉綠體轉(zhuǎn)運肽和編碼其后成熟蛋白質(zhì)的12個氨基酸的核苷酸序列之后而沒有密碼子框的變化。首先，通過PCR擴(kuò)增包含SEQ ID NO368所示核苷酸序列的DNA。通過將在實施例70中獲得的pKSN1584soy用作模板和通過將由SEQ ID NO399所示核苷酸序列組成的寡核苷酸和由SEQ ID NO398所示核苷酸序列組成的寡核苷酸用作引物來進(jìn)行PCR。PCR使用KOD-plus(Toyobo Company)。依照以下進(jìn)行PCR在94℃下進(jìn)行保持2分鐘一次；25個循環(huán)，一個循環(huán)包括保持94℃ 30秒，接著46℃ 30秒，接著68℃ 90秒；和最后保持在68℃ 3分鐘。通過按照附帶手冊進(jìn)行程序用MagExtractor-PCR&Gel-Clean up(Toyobo Company)回收并純化擴(kuò)增的DNA。通過按照附帶手冊用TaKaRa BKL試劑盒(TaKaRaShuzo Company)處理獲得的DNA，將DNA平末端化和將5’末端磷酸化?；厥蘸蠸EQ ID NO368所示核苷酸序列的DNA。在用SmaI消化在實施例15(3)中獲得的質(zhì)粒pKF19ΔBs以后，用牛小腸堿性磷酸酶(TakaraShuzo Company)將5’末端去磷酸化。通過連接產(chǎn)生的去磷酸化的DNA和含有SEQ ID NO368所示核苷酸序列的DNA產(chǎn)生質(zhì)粒。在用限制酶BspHI和SacI消化獲得的質(zhì)粒以后，回收含有SEQ ID NO368所示核苷酸序列的DNA。接著用限制酶BspHI和SacI消化在實施例16(3)中獲得的質(zhì)粒pKFrSt12-657以分離來自質(zhì)粒pKFrSt12的DNA。將所述DNA與用限制酶SacI和BspHI消化和包含SEQ ID NO368所示核苷酸序列的DNA連接，以便獲得包含嵌合DNA的質(zhì)粒pKFrSt12-1584soy(圖56)，在所述嵌合DNA中本發(fā)明DNA(A23)S緊接在編碼大豆(cv.Jack)RuBPC小亞基葉綠體轉(zhuǎn)運肽和編碼其后成熟蛋白質(zhì)的12個氨基酸的核苷酸序列之后而沒有密碼子框的變化。
用限制酶BamHI和SacI消化獲得的質(zhì)粒pKFrSt12-1584soy以分離包含SEQ ID NO368所示核苷酸序列的DNA。將所述DNA插入質(zhì)粒pNdG6-ΔT的BglII限制酶位點和SacI限制酶位點之間以獲得質(zhì)粒pSUM-NdG6-rSt12-1584soy(圖57)，其中CR16G6啟動子已經(jīng)連接到嵌合DNA的下游，所述嵌合DNA中所述DNA緊接在編碼大豆(cv.Jack)RuBPC小亞基葉綠體轉(zhuǎn)運肽的核苷酸序列之后而沒有密碼子框的變化。
接下來，將質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞(Takara ShuzoCompany)和選擇氨芐青霉素抗性細(xì)胞。另外，通過使用BigDye終止循環(huán)測序簡易反應(yīng)試劑盒3.0版(PE Applied Biosystems Company)和DNA測序儀3100(PE Applied Biosystems Company)測定包含在氨芐青霉素抗性菌株中的質(zhì)粒的核苷酸序列。結(jié)果，證實質(zhì)粒pSUM-NdG6-rSt12-1584soy具有SEQ ID NO368所示核苷酸序列。
(3)將本發(fā)明DNA(A23)S導(dǎo)入大豆按照實施例47(3)所述方法制備大豆(栽培品種Fayette和Jack)的球形胚。
將獲得的球形胚移植到新鮮體細(xì)胞胚生長培養(yǎng)基中并培養(yǎng)2-3天。按照實施例17(2)所述方法，將在實施例74(1)中生產(chǎn)的質(zhì)粒pSUM-NdG6-rSt-1584soy或在實施例74(2)中生產(chǎn)的質(zhì)粒pSUM-NdG6-rSt12-1584soy導(dǎo)入那些球形胚。
(4)用潮霉素選擇體細(xì)胞胚按照實施例47(4)所述方法進(jìn)行用潮霉素選擇在實施例74(3)中獲得的在基因?qū)牒蟮那蛐闻摺?br> (5)用化合物(II)選擇體細(xì)胞胚按照實施例47(5)所述方法進(jìn)行用化合物(II)選擇在實施例74(3)中獲得的導(dǎo)入基因以后的球形胚。
(6)從體細(xì)胞胚的植物再生，順應(yīng)和培養(yǎng)按照實施例47(6)所述方法，從在實施例74(4)或74(5)中選擇的球形胚進(jìn)行植物的再生。
相應(yīng)地用實施例17(6)所述方法將具有根和發(fā)育的葉子的植物進(jìn)行順應(yīng)和培養(yǎng)并收獲。
(7)對除草化合物(II)的抗性評估按照實施例17(4)所述方法評估在實施例74(6)中獲得的再生植物對化合物(II)的抗性程度。
(8)用于農(nóng)桿菌導(dǎo)入的具有本發(fā)明DNA(A23)S的葉綠體表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建構(gòu)建用農(nóng)桿菌法將本發(fā)明DNA(A23)S導(dǎo)入植物的質(zhì)粒。用限制酶HindIII和EcoRI消化質(zhì)粒pSUM-NdG6-rSt-1584soy以分離嵌合DNA，其中本發(fā)明DNA(A23)S緊接在編碼大豆(cv.Jack)RuBPC小亞基葉綠體轉(zhuǎn)運肽的核苷酸序列之后而沒有密碼子框的變化。將所述DNA插入在實施例18中獲得的上述二元質(zhì)粒載體pBI121S的HindIII限制位點和EcoRI限制位點之間以獲得質(zhì)粒pBI-NdG6-rSt-1584soy(圖58)。另外，用限制酶NotI消化質(zhì)粒pSUM-NdG6-rSt12-1584soy以分離嵌合DNA，其中本發(fā)明DNA(A23)S緊接在編碼大豆(cv.Jack)RuBPC小亞基葉綠體轉(zhuǎn)運肽和編碼其后成熟蛋白質(zhì)的12個氨基酸的核苷酸序列之后而沒有密碼子框的變化。將該DNA插入上述二元質(zhì)粒載體pBI121S的HindIII限制位點和EcoRI限制位點之間以獲得質(zhì)粒pBI-NdG6-rSt12-1584soy(圖59)。
(9)將本發(fā)明DNA(A23)S導(dǎo)入煙草使用在實施例74(8)中獲得的質(zhì)粒pBI-NdG6-rSt-1584soy和pBI-NdG6-rSt12-1584soy，用農(nóng)桿菌法將本發(fā)明DNA(A23)S導(dǎo)入煙草。
首先，按照實施例19所述方法，分別將質(zhì)粒pBI-NdG6-rSt-1584soy和pBI-NdG6-rSt12-1584soy導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404(ClontechCompany)。分離各自具有pBI-NdG6-rSt-1584soy或pBI-NdG6-rSt12-1584soy的轉(zhuǎn)基因農(nóng)桿菌。
然后，按照實施例47(9)所述方法將具有質(zhì)粒的所述農(nóng)桿菌用來將基因?qū)霟煵?，分別獲得已經(jīng)整合pBI-NdG6-rSt-1584soy或pBI-NdG6-rSt12-1584soy的T-DNA區(qū)域的轉(zhuǎn)基因煙草。
(10)使用本發(fā)明DNA(A23)S轉(zhuǎn)基因煙草的葉片的抗性評估從35株在實施例74(9)中獲得的轉(zhuǎn)基因煙草采集葉子。將每片葉子分成幾片，其中每片5-7mm寬。將葉片種植到包含化合物(II)或化合物(XII)的MS瓊脂培養(yǎng)基上并在光照中在室溫下培養(yǎng)。在培養(yǎng)幾天后，觀察每個葉片的除草損傷。作為對照，使用野生型煙草的葉片。通過對連續(xù)生長的葉片，具有化學(xué)損傷的葉片，和變白和已經(jīng)枯萎的葉片記分評估轉(zhuǎn)基因煙草的抗性。
實施例75將本發(fā)明DNA(A25)S導(dǎo)入植物(1)用于直接導(dǎo)入的包含本發(fā)明DNA(A25)S的葉綠體表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建-部分1構(gòu)建包含嵌合DNA的質(zhì)粒作為用基因槍法將本發(fā)明DNA(A25)S導(dǎo)入植物的質(zhì)粒，所述嵌合DNA中本發(fā)明DNA(A25)S緊接在編碼大豆(cv.Jack)RuBPC小亞基葉綠體轉(zhuǎn)運肽的核苷酸序列之后而沒有密碼子框的變化。
首先，通過PCR擴(kuò)增包含SEQ ID NO393所示核苷酸序列的DNA。通過將在實施例71(2)中獲得的pKSN1609soy用作模板和通過將由SEQID NO400所示核苷酸序列組成的寡核苷酸和由SEQ ID NO401所示核苷酸序列組成的寡核苷酸用作引物來進(jìn)行PCR。PCR使用KOD-plus(Toyobo Company)。依照以下進(jìn)行PCR在94℃下進(jìn)行保持2分鐘一次；20個循環(huán)，一個循環(huán)包括保持94℃ 30秒，接著53℃ 30秒，接著68℃ 90秒；和最后保持在68℃ 3分鐘。通過按照附帶手冊進(jìn)行程序用MagExtractor-PCR&Gel-Clean up(Toyobo Company)回收和純化擴(kuò)增的DNA。通過按照附帶的手冊用TaKaRa BKL試劑盒(Takara ShuzoCompany)處理獲得的DNA，將DNA平末端化和5’末端磷酸化?；厥瞻琒EQ ID NO393所示核苷酸序列的DNA。在用SmaI消化質(zhì)粒pUC19(Takara Shuzo Company)以后，用牛小腸堿性磷酸酶(Takara ShuzoCompany)將5’末端去磷酸化。通過連接產(chǎn)生的去磷酸化的DNA和含有SEQ ID NO393所示核苷酸序列的DNA產(chǎn)生質(zhì)粒。在用限制酶EcoT22I和SacI消化獲得的質(zhì)粒以后，回收包含SEQ ID NO393所示核苷酸序列的DNA。在用限制酶EcoT22I和SacI消化在實施例16(2)中獲得的質(zhì)粒pUCrSt657以后，分離約2.9kbp的DNA，其具有來源于pUC 19的核苷酸序列和編碼大豆(cv.Jack)RuBPC小亞基葉綠體轉(zhuǎn)運肽的序列。將獲得的DNA和包含SEQ ID NO393所示核苷酸序列的上述DNA連接以獲得包含嵌合DNA的pUCrSt1609soy(圖60)，其中本發(fā)明DNA(A25)S緊接在編碼大豆(cv.Jack)RuBPC小亞基葉綠體轉(zhuǎn)運肽的核苷酸序列之后而沒有密碼子框的變化。
用限制酶BamHI和SacI消化獲得的質(zhì)粒pUCrSt1609soy以分離包含SEQ ID NO393所示核苷酸序列的DNA。將所述DNA插入質(zhì)粒pNdG6-ΔT的BglII限制酶位點和SacI限制酶位點之間以獲得質(zhì)粒pSUM-NdG6-rSt-1609soy(圖61)，其中CR16G6啟動子已經(jīng)連接到嵌合DNA的下游，在嵌合DNA中所述DNA緊接在編碼大豆(cv.Jack)RuBPC小亞基葉綠體轉(zhuǎn)運肽的核苷酸序列之后而沒有密碼子框的變化。
接下來，將質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞(Takara ShuzoCompany)和選擇氨芐青霉素抗性細(xì)胞。另外，通過使用BigDye終止循環(huán)測序簡易反應(yīng)試劑盒3.0版(PE Applied Biosystems Company)和DNA測序儀3100(PE Applied Biosystems Company)測定包含在氨芐青霉素抗性菌株中的質(zhì)粒的核苷酸序列。結(jié)果，證實質(zhì)粒pSUM-NdG6-rSt-1609soy具有SEQ ID NO393所示核苷酸序列。
(2)用于直接導(dǎo)入的具有本發(fā)明DNA(A25)S的葉綠體表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建-部分(2)構(gòu)建用基因槍法將本發(fā)明DNA(A25)S導(dǎo)入植物的質(zhì)粒。該質(zhì)粒包含嵌合DNA，其中本發(fā)明DNA(A25)S緊接在編碼大豆(cv.Jack)RuBPC小亞基葉綠體轉(zhuǎn)運肽和編碼其后成熟蛋白質(zhì)的12個氨基酸的核苷酸序列之后而沒有密碼子框的變化。首先，在實施例75(1)中獲得的質(zhì)粒pUCrSt1609soy在它的EcoT22I限制位點插入接頭EcoT22I-12aa-EcoT22I(圖62)，該接頭是通過將由SEQ ID NO402所示核苷酸序列組成的寡核苷酸和由SEQ ID NO403所示核苷酸序列組成的寡核苷酸退火獲得。獲得包含嵌合DNA的質(zhì)粒pUCrSt12-1609soy(圖63)，在所述嵌合DNA中本發(fā)明DNA(A25)S緊接在編碼大豆(cv.Jack)RuBPC小亞基葉綠體轉(zhuǎn)運肽和編碼其后成熟蛋白質(zhì)的12個氨基酸的核苷酸序列之后而沒有密碼子框的變化。
用限制酶BamHI和SacI消化獲得的質(zhì)粒pUCrSt12-1609soy以分離包含SEQ ID NO393所示核苷酸序列的DNA。將所述DNA插入實施例16(2)中獲得的質(zhì)粒pNdG6-ΔT的BglII限制酶位點和SacI限制酶位點之間以獲得質(zhì)粒pSUM-NdG6-rSt12-1609soy(圖64)，其中CR16G6啟動子已經(jīng)連接到嵌合DNA的下游，所述嵌合DNA中所述DNA緊接在編碼大豆(cv.Jack)RuBPC小亞基葉綠體轉(zhuǎn)運肽的核苷酸序列之后而沒有密碼子框的變化。
接下來，將質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞(Takara ShuzoCompany)和選擇氨芐青霉素抗性細(xì)胞。另外，通過使用BigDye終止循環(huán)測序簡易反應(yīng)試劑盒3.0版(PE Applied Biosystems Company)和DNA測序儀3100(PE Applied Biosystems Company)測定包含在氨芐青霉素抗性菌株中的質(zhì)粒的核苷酸序列。結(jié)果，證實質(zhì)粒pSUM-NdG6-rSt12-1609soy具有SEQ ID NO393所示核苷酸序列。
(3)將本發(fā)明DNA(A23)S導(dǎo)入大豆按照實施例47(3)所述方法制備大豆(栽培品種Fayette和Jack)的球形胚。
將獲得的球形胚移植到新鮮體細(xì)胞胚生長培養(yǎng)基中并培養(yǎng)2-3天。按照實施例17(2)所述方法，將在實施例75(1)中生產(chǎn)的質(zhì)粒pSUM-NdG6-rSt-1609soy或在實施例75(2)中生產(chǎn)的質(zhì)粒pSUM-NdG6-rSt12-1609soy導(dǎo)入那些球形胚。
(4)用潮霉素選擇體細(xì)胞胚按照實施例47(4)所述方法進(jìn)行用潮霉素選擇在實施例75(3)中獲得的在基因?qū)牒蟮那蛐闻摺?br> (5)用化合物(II)選擇體細(xì)胞胚按照實施例47(5)所述方法進(jìn)行用化合物(II)選擇在實施例75(3)中獲得的導(dǎo)入基因以后的球形胚。
(6)從體細(xì)胞胚的植物再生，順應(yīng)和培養(yǎng)按照實施例47(6)所述方法，從在實施例74(4)或74(5)中選擇的球形胚進(jìn)行植物的再生。
相應(yīng)地用實施例17(6)所述方法將具有根和發(fā)育的葉子的植物進(jìn)行順應(yīng)和培養(yǎng)并收獲。
(7)對除草化合物(II)的抗性評估按照實施例17(4)所述方法評估在實施例75(6)中獲得的再生植物對化合物(II)的抗性程度。
(8)用于農(nóng)桿菌屬導(dǎo)入的具有本發(fā)明DNA(A25)S的葉綠體表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建構(gòu)建用農(nóng)桿菌法將本發(fā)明DNA(A25)S導(dǎo)入植物的質(zhì)粒。用限制酶HindIII和EcoRI消化質(zhì)粒pSUM-NdG6-rSt-1609soy以獲得嵌合DNA，其中本發(fā)明DNA(A25)S緊接在編碼大豆(cv.Jack)RuBPC小亞基葉綠體轉(zhuǎn)運肽的核苷酸序列之后而沒有密碼子框的變化。將所述DNA插入在實施例18中獲得的二元質(zhì)粒載體pBI121S的HindIII限制位點和EcoRI限制位點之間以獲得質(zhì)粒pBI-NdG6-rSt-1609soy(圖65)。另外，用限制酶NotI消化質(zhì)粒pSUM-NdG6-rSt12-1609soy以分離嵌合DNA，其中本發(fā)明DNA(A25)S緊接在編碼大(cv.Jack)RuBPC小亞基葉綠體轉(zhuǎn)運肽和編碼其后成熟蛋白質(zhì)的12個氨基酸的核苷酸序列之后而沒有密碼子框的變化。將該DNA插入上述二元質(zhì)粒載體pBI121S的HindIII限制位點和EcoRI限制位點之間以獲得質(zhì)粒pBI-NdG6-rSt12-1609soy(圖66)。
(9)將本發(fā)明DNA(A23)S導(dǎo)入煙草使用在實施例75(8)中獲得的質(zhì)粒pBI-NdG6-rSt-1609soy和pBI-NdG6-rSt12-1609soy，用農(nóng)桿菌法將本發(fā)明DNA(A25)S導(dǎo)入煙草。
首先，按照實施例19所述方法，分別將質(zhì)粒pBI-NdG6-rSt-1609soy和pBI-NdG6-rSt12-1609soy導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404(ClontechCompany)。分離各自具有pBI-NdG6-rSt-1609soy或pBI-NdG6-rSt12-1609soy的轉(zhuǎn)基因農(nóng)桿菌。
然后，按照實施例47(9)所述方法將具有質(zhì)粒的所述農(nóng)桿菌用來將基因?qū)霟煵?，分別獲得已經(jīng)整合pBI-NdG6-rSt-1609soy或pBI-NdG6-rSt12-1609soy的T-DNA區(qū)域的轉(zhuǎn)基因煙草。
(10)使用本發(fā)明DNA(A25)S轉(zhuǎn)基因煙草的葉片的抗性評估從在實施例75(9)中獲得的轉(zhuǎn)基因煙草采集葉子。按照實施例74(10)所述方法，將該葉子用于評估轉(zhuǎn)基因煙草對化合物(II)或化合物(XII)的抗性。
工業(yè)適用性根據(jù)本發(fā)明，可以提供具有代謝PPO抑制除草化合物和將該化合物轉(zhuǎn)化成低除草活性的化合物的能力的蛋白質(zhì)；編碼該蛋白質(zhì)的DNA；和表達(dá)該蛋白質(zhì)的抗除草化合物的植物。
序列獨立文本
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Arg Arg Ile Pro Asp Leu Arg Leu Ala Val Gly Phe Asp Asp Ile Arg370 375 380ttc aag gag gag tcg gcg atc tac gga atc cac gaa ctg atg gtc act 1200Phe Lys Glu Glu Ser Ala Ile Tyr Gly Ile His Glu Leu Met Val Thr385 390 395 400tgg tga 1206Trp<210>8<211>1188<212>DNA<213>磚紅色鏈霉菌(Streptmyces testaceus)ATCC 21469<220>
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ctg ctc gcc gat tcc cgc ctg tcg tcc gac cgc ctg cgc ccc ggc ttc240Leu Leu Ala Asp Ser Arg Leu Ser Ser Asp Arg Leu Arg Pro Gly Phe65 70 75 80ccg gcc acc tcg ccg cgc atc gtg gcg ttc cgc gac cgc cgg gcc gcc288Pro Ala Thr Ser Pro Arg Ile Val Ala Phe Arg Asp Arg Arg Ala Ala85 90 95ctg ctg aac gtc gac gac ccc gag cac cac acc cag cgg cgg atg ctg336Leu Leu Asn Val Asp Asp Pro Glu His His Thr Gln Arg Arg Met Leu100 105 110gtc ccg agc ttc acc ctc aag cgc gcc gcc gcg ttg cgg ccg gcc atc384Val Pro Ser Phe Thr Leu Lys Arg Ala Ala Ala Leu Arg Pro Ala Ile115 120 125cag cgg atc gtc gac gaa tgc atc gac gcg atg ctc gcg aag ggc ccg432Gln Arg Ile Val Asp Glu Cys Ile Asp Ala Met Leu Ala Lys Gly Pro130 135 140ccc gcc gag ttg gtg aac gcc ttc gcg ctc ccc gtt ccc tcg atg gtg480Pro Ala Glu Leu Val Asn Ala Phe Ala Leu Pro Val Pro Ser Met Val145 150 155 160atc tgc gaa ctg ctc ggt gtc ccg tac gcc gat cac gag ttc ttc gag528Ile Cys Glu Leu Leu Gly Val Pro Tyr Ala Asp His Glu Phe Phe Glu165 170 175gag cag tcc cgt cgg ctg ctg cgc ggc cgg gac gtg gac gag gtg cgg576Glu Gln Ser Arg Arg Leu Leu Arg Gly Arg Asp Val Asp Glu Val Arg180 185 190gac gcg cgg gac cag ctc gac tgc tac ctc ggg gcg ctg atc gac cgc624Asp Ala Arg Asp Gln Leu Asp Cys Tyr Leu Gly Ala Leu Ile Asp Arg195 200 205aag tcc gag tcg tcc gtc ggt gac ggt gtc ctc gac gcc ctg gtc cac672Lys Ser Glu Ser Ser Val Gly Asp Gly Val Leu Asp Ala Leu Val His210 215 220gag cag ttg cgc gag ggc gcg gtg gac cgg cag gag gcc atc tcg ctg720Glu Gln Leu Arg Glu Gly Ala Val Asp Arg Gln Glu Ala Ile Ser Leu225 230 235 240gcc acg atc ctg ctg gtc gcc ggc cac gag acc acc gcc aac atg atc768Ala Thr Ile Leu Leu Val Ala Gly His Glu Thr Thr Ala Asn Met Ile245 250 255tcg ctg ggc act tac acc ctg ctc caa cac ccc gag cga ctg gcg gag816Ser Leu Gly Thr Tyr Thr Leu Leu Gln His Pro Glu Arg Leu Ala Glu260 265 270ttg cgg gac gac ccg tcg ctg tgg ccc gcc gcc gtc gac gag ttg atg864Leu Arg Asp Asp Pro Ser Leu Trp Pro Ala Ala Val Asp Glu Leu Met275 280 285cgg atg ctg tcc atc gcg gac ggg ctg atg cgg cag gcc acg gag gac912Arg Met Leu Ser Ile Ala Asp Gly Leu Met Arg Gln Ala Thr Glu Asp290 295 300atc gag gtg gcc ggg acg acg atc cgc gcc ggt gag ggc gtg gtc ttc960Ile Glu Val Ala Gly Thr Thr Ile Arg Ala Gly Glu Gly Val Val Phe305 310 315 320gcg acc tcg gtc atc aac cgc gac ggg gag gtc tac gcc gaa ccc gac 1008Ala Thr Ser Val Ile Asn Arg Asp Gly Glu Val Tyr Ala Glu Pro Asp325 330 335gcc ctc gac tgg cac cgg ccc acc cgc cat cac gtg gcg ttc ggc ttc 1056Ala Leu Asp Trp His Arg Pro Thr Arg His His Val Ala Phe Gly Phe340 345 350ggc atc cac cag tgt ctc ggc cag aac ctg gcc cgt gcc gag atg gag 1104Gly Ile His Gln Cys Leu Gly Gln Asn Leu Ala Arg Ala Glu Met Glu355 360 365
atc gcc ctg cgt tcc ctg ttc gag cgg gtg ccc ggg ctg cgc ctc gac1152Ile Ala Leu Arg Ser Leu Phe Glu Arg Val Pro Gly Leu Arg Leu Asp370 375 380att gcg ccg gac gcg gtc cgc ttc aaa ccg ggc gac acg atc cag gga1200Ile Ala Pro Asp Ala Val Arg Phe Lys Pro Gly Asp Thr Ile Gln Gly385 390 395 400atg ctg gat ctg ccc gtg gcc tgg tag ggggtccact c atg cac atc gac 1250Met Leu Asp Leu Pro Val Ala Trp Met His Ile Asp4051atc gac acg gac gtg tgc atc ggc gcc ggc cag tgc gcg ctg tcc gcc1298Ile Asp Thr Asp Val Cys Ile Gly Ala Gly Gln Cys Ala Leu Ser Ala5 10 15 20ccg gcc gtc ttc acg cag gac gac gac ggc ttc agc acc ctc ctg ccc1346Pro Ala Val Phe Thr Gln Asp Asp Asp Gly Phe Ser Thr Leu Leu Pro25 30 35gga cag gag gac agc ggc gac ccg atg gtc cgg gag gcg gcc cga gcc1394Gly Gln Glu Asp Ser Gly Asp Pro Met Val Arg Glu Ala Ala Arg Ala40 45 50tgc ccg gtc ggt gcc atc aag gtc tcg gaa acc gcg cga ccg tga1439Cys Pro Val Gly Ala Ile Lys Val Ser Glu Thr Ala Arg Pro55 60 65<210>10<211>1415<212>DNA<213>塔氏糖多孢菌(Saccharopolyspora taberi)JCM 9383t<220>
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<221>CDS<222>(1)..(1188)<220>
<221>CDS<222>(1224)..(1418)<400>11atg acc gaa gcc atc gcg tat ttc cag gac cgc acc tgc ccc tac cac 48Met Thr Glu Ala Ile Ala Tyr Phe Gln Asp Arg Thr Cys Pro Tyr His1 5 10 15ccg ccg gcc ggc tat cag ccg ctg cgt gac gca ggc ccg ctg gcc cat 96Pro Pro Ala Gly Tyr Gln Pro Leu Arg Asp Ala Gly Pro Leu Ala His20 25 30gtc acc ctc tac gac ggc cgc aag gtg tgg gcg gtg acc ggc cac acc144Val Thr Leu Tyr Asp Gly Arg Lys Val Trp Ala Val Thr Gly His Thr35 40 45gag gcg cgg gcg ctg ctg agc gac ccg cgg ctg tcc tcc gac cgg cag192Glu Ala Arg Ala Leu Leu Ser Asp Pro Arg Leu Ser Ser Asp Arg Gln50 55 60aac ccg gcc ttc ccg gcg ccg ttc gcc cgc ttc gcg gcg ctg cgc cag240Asn Pro Ala Phe Pro Ala Pro Phe Ala Arg Phe Ala Ala Leu Arg Gln65 70 75 80gtc agg tcg ccg ctg atc ggc gtg gac gac ccc gag cac aac acc cag288Val Arg Ser Pro Leu Ile Gly Val Asp Asp Pro Glu His Asn Thr Gln85 90 95cgc cgg atg ctg atc ccc agc ttc agc gtc aag cgg acc gcg gcg ctg336Arg Arg Met Leu Ile Pro Ser Phe Ser Val Lys Arg Thr Ala Ala Leu100 105 110cgg ccg cag atc cag cag atc gtc gac ggg ctg ctg gac cgg atg ctg384Arg Pro Gln Ile Gln Gln Ile Val Asp Gly Leu Leu Asp Arg Met Leu115 120 125gcg cag ggg ccg ccc gcc gag ctg gtc tcc gcg ttc gcg ctg ccg gtg432Ala Gln Gly Pro Pro Ala Glu Leu Val Ser Ala Phe Ala Leu Pro Val130 135 140ccc tcg atg gtg atc tgc tcg ctg ctc ggc gtc ccc tac tcc gac cac480Pro Ser Met Val Ile Cys Ser Leu Leu Gly Val Pro Tyr Ser Asp His145 150 155 160gag ttc ttc gag gag gcc tcc cgc cgg ctc ctg cgc agc cgg acg gcc528Glu Phe Phe Glu Glu Ala Ser Arg Arg Leu Leu Arg Ser Arg Thr Ala165 170 175gag gag gcg gag gag gcc cgc ctc cgg ctg gag gac tac ttc gac gag576Glu Glu Ala Glu Glu Ala Arg Leu Arg Leu Glu Asp Tyr Phe Asp Glu180 185 190
ctg atc gcc cac aag gag aag acc ccg cgc gag ggc ctg ctc gac gag624Leu Ile Ala His Lys Glu Lys Thr Pro Arg Glu Gly Leu Leu Asp Glu195 200 205ctg gtc cac gac gag ctg cgc acc ggc gcc ctg gag cgc gag gat ctg672Leu Val His Asp Glu Leu Arg Thr Gly Ala Leu Glu Arg Glu Asp Leu210 215 220gtc cgg ctc gcg atg atc ctg ctg gtg gcc ggc cac gag acc acc gcc720Val Arg Leu Ala Met Ile Leu Leu Val Ala Gly His Glu Thr Thr Ala225 230 235 240aac atg atc tcg ctc ggc acc ttc acc ctg ctg gag cac ccc gga cag768Asn Met Ile Ser Leu Gly Thr Phe Thr Leu Leu Glu His Pro Gly Gln245 250 255ctg gcc cgg ctg aag gcc gag gag ggg ctg ctg ccg gcc gcc gtc gag816Leu Ala Arg Leu Lys Ala Glu Glu Gly Leu Leu Pro Ala Ala Val Glu260 265 270gag ctg ttg cgg ttc ctg tcc atc gcg gac ggc ctg ctg cgg gtg gcc864Glu Leu Leu Arg Phe Leu Ser Ile Ala Asp Gly Leu Leu Arg Val Ala275 280 285atg gcg gac atc gag atc ggc ggg cag gtc atc cgt gcc gac gac ggc912Met Ala Asp Ile Glu Ile Gly Gly Gln Val Ile Arg Ala Asp Asp Gly290 295 300gtg ctg ttc ccc acc tcg ctg atc aac cgg gac gac ggc gcc tat ccg960Val Leu Phe Pro Thr Ser Leu Ile Asn Arg Asp Asp Gly Ala Tyr Pro305 310 315 320aca ccg gac gag ctg gac gtc ggc cgg tcc gcc cgc cat cac gtg gcg 1008Thr Pro Asp Glu Leu Asp Val Gly Arg Ser Ala Arg His His Val Ala325 330 335ttc ggg ttc ggc atc cac cag tgc ctg ggg cag aac ctc gcc cgg gcg 1056Phe Gly Phe Gly Ile His Gln Cys Leu Gly Gln Asn Leu Ala Arg Ala340 345 350gag atg gag atc gcg ctg cgc tcg ctg ttc gac cgg atc ccg gat ctg 1104Glu Met Glu Ile Ala Leu Arg Ser Leu Phe Asp Arg Ile Pro Asp Leu355 360 365cga ctc gcc gtg ccg gct gcc gag atc ccc ttc aag ccg ggg gac act 1152Arg Leu Ala Val Pro Ala Ala Glu Ile Pro Phe Lys Pro Gly Asp Thr370 375 380ctg caa gga atg atc gaa ctg ccg ctg gcc tgg tag ccgcggtgca cccggc 1204Leu Gln Gly Met Ile Glu Leu Pro Leu Ala Trp385 390 395cgaacgaagg ggttttgga atg cgg atc acc atc gac acc gac gtc tgc atc 1256Met Arg Ile Thr Ile Asp Thr Asp Val Cys Ile1 5 10ggc gcc ggc cag tgc gcg ctg acc gcg ccc ggg gtg ttc acc cag gac 1304Gly Ala Gly Gln Cys Ala Leu Thr Ala Pro Gly Val Phe Thr Gln Asp15 20 25gac gac ggc ttc agc gag ctg ctg ccc ggc cgc gag gac ggc gcg ggc 1352Asp Asp Gly Phe Ser Glu Leu Leu Pro Gly Arg Glu Asp Gly Ala Gly30 35 40gac ccg atg ctg cgg gag gcc gtg cgt gcc tgc ccc gtg cag gcc atc 1400Asp Pro Met Leu Arg Glu Ala Val Arg Ala Cys Pro Val Gln Ala Ile45 50 55acc gtc gcg gac gac tga 1418Thr Val Ala Asp Asp60 64<210>12<211>66<212>PRT
<213>暗產(chǎn)色鏈霉菌(Streptmyces phaeochromogenes)IFO 12898<400>12Met His Ile Asp Ile Asp Thr Asp Val Cys Ile Gly Ala Gly Gln Cys1 5 10 15Ala Leu Ser Ala Pro Ala Val Phe Thr Gln Asp Asp Asp Gly Phe Ser20 25 30Thr Leu Leu Pro Gly Gln Glu Asp Ser Gly Asp Pro Met Val Arg Glu35 40 45Ala Ala Arg Ala Cys Pro Val Gly Ala Ile Lys Val Ser Glu Thr Ala50 55 60Arg Pro65<210>13<211>65<212>PRT<213>塔氏糖多孢菌(Saccharopolyspora taberi)JCM 9383t<400>13Met Arg Ile Gln Ala Asp Val Glu Arg Cys Val Gly Ala Gly Gln Cys1 5 10 15Val Leu Ala Ala Asp Ala Leu Phe Asp Gln Arg Asp Asp Asp Gly Thr20 25 30Val Val Val Leu Ala Thr Glu Val Gly Asp Gly Asp Ala Asp Ala Val35 40 45Arg Asp Ala Val Thr Leu Cys Pro Ser Gly Ala Leu Ser Leu Val Glu50 55 60Asp65<210>14<211>64<212>PRT<213>磚紅色鏈霉菌(Streptmyces testaceus)ATCC 21469<400>14Met Arg Ile Thr Ile Asp Thr Asp Val Cys Ile Gly Ala Gly Gln Cys1 5 10 15Ala Leu Thr Ala Pro Gly Val Phe Thr Gln Asp Asp Asp Gly Phe Ser20 25 30Glu Leu Leu Pro Gly Arg Glu Asp Gly Ala Gly Asp Pro Met Leu Arg35 40 45Glu Ala Val Arg Ala Cys Pro Val Gln Ala Ile Thr Val Ala Asp Asp50 55 60<210>15<211>201<212>DNA<213>暗產(chǎn)色鏈霉菌(Streptmyces phaeochromogenes)IFO 12898<220>
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<210>16<211>198<212>DNA<213>塔氏糖多孢菌(Saccharopolyspora taberi)JCM 9383t<220>
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Glu Ser Pro Gln Ala Phe Ile Gly Leu Asp Pro Pro Glu His Gly Thr1 5 10 15Arg<210>28<211>9<212>PRT<213>淺灰鏈霉菌(Streptomyces griseolus)ATCC11796<400>28Met Thr Ile Ser Glu Phe Thr Val Lys1 5<210>29<211>14<212>PRT<213>淺灰鏈霉菌(Streptomyces griseolus)ATCC11796<400>29Leu Val Gln Ser Thr Asp Ala Gln Ser Ala Leu Thr Ala Arg1 5 10<210>30<211>12<212>PRT<213>淺灰鏈霉菌(Streptomyces griseolus)ATCC11796<400>30Ser Leu Val Pro Gly Ala Val Glu Glu Leu Leu Arg1 5 10<210>31<211>11<212>PRT<213>淺灰鏈霉菌(Streptomyces griseolus)ATCC11796<400>31Tyr Leu Ala Ile Ala Asp Ile Ala Gly Gly Arg1 5 10<210>32<211>14<212>PRT<213>淺灰鏈霉菌(Streptomyces griseolus)ATCC11796<400>32Ala Gly Glu Gly Val Ile Val Val Asn Ser Ile Ala Asn Arg1 5 10<210>33<211>15<212>PRT<213>淺灰鏈霉菌(Streptomyces griseolus)ATCC11796<400>33Asp Gly Thr Val Tyr Glu Asp Pro Asp Ala Leu Asp Ile His Arg1 5 10 15<210>34<211>13<212>PRT<213>淺灰鏈霉菌(Streptomyces griseolus)ATCC11796<400>34Leu Glu Leu Glu Val Ile Leu Asn Ala Leu Met Asp Arg1 5 10<210>35<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物
<400>35acsgayatga csgayacsgc sgaygtnaag cc 32<210>36<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>36vcgsccgtcg tagagcgtca c 21<210>37<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>37atatgaccga taccgcggat gtgaagccgc tct33<210>38<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>38aacaatttca cacaggaaac agctatgacc 30<210>39<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>39ctggaagggg caggtgcggt cctgggggaa 30<210>40<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>40cagtcacgac gttgtaaaac gacggccagt 30<210>41<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>41cttcccccag gaccgcacct gccccttcca 30<210>42<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>42tgcggtcctg ggggaaggcg acgggtgccg aga 33<210>43<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>43acgaatgcat cgacgcgatg ct 22<210>44<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>44agttggtgaa cgccttcgcg ct 22<210>45<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>45cctcgatggt gatctgcgaa ct 22<210>46<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>46acttacaccc tgctccaaca20<210>47<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>47acgagttgat gcggatgctg tccat 25<210>48<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
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<220>
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<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>51ctcatatgac agacatgacg gatacggca 29<210>52<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>52gaagcttcta ccaggccacg ggcagatcca 30<210>53<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>53aaagctttca cggtcgcgcg gtttccga 28<210>54<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
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<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>58tcgacctggt gcggatgctc tcg23<210>59<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
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<220>
<221>CDS<222>(1224)..(1418)<400>69gtg acc gaa gcc atc gcg tat ttc cag gac cgc acc tgc ccc tac cac 48Val Thr Glu Ala Ile Ala Tyr Phe Gln Asp Arg Thr Cys Pro Tyr His1 5 10 15ccg ccg gcc ggc tat cag ccg ctg cgt gac gca ggc ccg ctg gcc cat 96Pro Pro Ala Gly Tyr Gln Pro Leu Arg Asp Ala Gly Pro Leu Ala His20 25 30gtc acc ctc tac gac ggc cgc aag gtg tgg gcg gtg acc ggc cac acc144Val Thr Leu Tyr Asp Gly Arg Lys Val Trp Ala Val Thr Gly His Thr35 40 45gag gcg cgg gcg ctg ctg agc gac ccg cgg ctg tcc tcc gac cgg cag192Glu Ala Arg Ala Leu Leu Ser Asp Pro Arg Leu Ser Ser Asp Arg Gln50 55 60aac ccg gcc ttc ccg gcg ccg ttc gcc cgc ttc gcg gcg ctg cgc cag240Asn Pro Ala Phe Pro Ala Pro Phe Ala Arg Phe Ala Ala Leu Arg Gln65 70 75 80gtc agg tcg ccg ctg atc ggc gtg gac gac ccc gag cac aac acc cag288Val Arg Ser Pro Leu Ile Gly Val Asp Asp Pro Glu His Asn Thr Gln85 90 95cgc cgg atg ctg atc ccc agc ttc agc gtc aag cgg acc gcg gcg ctg336Arg Arg Met Leu Ile Pro Ser Phe Ser Val Lys Arg Thr Ala Ala Leu100 105 110cgg ccg cag atc cag cag atc gtc gac ggg ctg ctg gac cgg atg ctg384Arg Pro Gln Ile Gln Gln Ile Val Asp Gly Leu Leu Asp Arg Met Leu115 120 125gcg cag ggg ccg ccc gcc gag ctg gtc tcc gcg ttc gcg ctg ccg gtg432Ala Gln Gly Pro Pro Ala Glu Leu Val Ser Ala Phe Ala Leu Pro Val130 135 140ccc tcg atg gtg atc tgc tcg ctg ctc ggc gtc ccc tac tcc gac cac480Pro Ser Met Val Ile Cys Ser Leu Leu Gly Val Pro Tyr Ser Asp His145 150 155 160gag ttc ttc gag gag gcc tcc cgc cgg ctc ctg cgc agc cgg acg gcc528Glu Phe Phe Glu Glu Ala Ser Arg Arg Leu Leu Arg Ser Arg Thr Ala165 170 175gag gag gcg gag gag gcc cgc ctc cgg ctg gag gac tac ttc gac gag576Glu Glu Ala Glu Glu Ala Arg Leu Arg Leu Glu Asp Tyr Phe Asp Glu180 185 190ctg atc gcc cac aag gag aag acc ccg cgc gag ggc ctg ctc gac gag624Leu Ile Ala His Lys Glu Lys Thr Pro Arg Glu Gly Leu Leu Asp Glu195 200 205ctg gtc cac gac gag ctg cgc acc ggc gcc ctg gag cgc gag gat ctg672Leu Val His Asp Glu Leu Arg Thr Gly Ala Leu Glu Arg Glu Asp Leu210 215 220gtc cgg ctc gcg atg atc ctg ctg gtg gcc ggc cac gag acc acc gcc720Val Arg Leu Ala Met Ile Leu Leu Val Ala Gly His Glu Thr Thr Ala225 230 235 240aac atg atc tcg ctc ggc acc ttc acc ctg ctg gag cac ccc gga cag768Asn Met Ile Ser Leu Gly Thr Phe Thr Leu Leu Glu His Pro Gly Gln245 250 255ctg gcc cgg ctg aag gcc gag gag ggg ctg ctg ccg gcc gcc gtc gag816Leu Ala Arg Leu Lys Ala Glu Glu Gly Leu Leu Pro Ala Ala Val Glu260 265 270gag ctg ttg cgg ttc ctg tcc atc gcg gac ggc ctg ctg cgg gtg gcc864Glu Leu Leu Arg Phe Leu Ser Ile Ala Asp Gly Leu Leu Arg Val Ala
275 280 285atg gcg gac atc gag atc ggc ggg cag gtc atc cgt gcc gac gac ggc 912Met Ala Asp Ile Glu Ile Gly Gly Gln Val Ile Arg Ala Asp Asp Gly290 295 300gtg ctg ttc ccc acc tcg ctg atc aac cgg gac gac ggc gcc tat ccg 960Val Leu Phe Pro Thr Ser Leu Ile Asn Arg Asp Asp Gly Ala Tyr Pro305 310 315 320aca ccg gac gag ctg gac gtc ggc cgg tcc gcc cgc cat cac gtg gcg1008Thr Pro Asp Glu Leu Asp Val Gly Arg Ser Ala Arg His His Val Ala325 330 335ttc ggg ttc ggc atc cac cag tgc ctg ggg cag aac ctc gcc cgg gcg1056Phe Gly Phe Gly Ile His Gln Cys Leu Gly Gln Asn Leu Ala Arg Ala340 345 350gag atg gag atc gcg ctg cgc tcg ctg ttc gac cgg atc ccg gat ctg1104Glu Met Glu Ile Ala Leu Arg Ser Leu Phe Asp Arg Ile Pro Asp Leu355 360 365cga ctc gcc gtg ccg gct gcc gag atc ccc ttc aag ccg ggg gac act1152Arg Leu Ala Val Pro Ala Ala Glu Ile Pro Phe Lys Pro Gly Asp Thr370 375 380ctg caa gga atg atc gaa ctg ccg ctg gcc tgg tag ccgcggtgca cccggc 1204Leu Gln Gly Met Ile Glu Leu Pro Leu Ala Trp385 390 395cgaacgaagg ggttttgga atg cgg atc acc atc gac acc gac gtc tgc atc 1256Met Arg Ile Thr Ile Asp Thr Asp Val Cys Ile1 5 10ggc gcc ggc cag tgc gcg ctg acc gcg ccc ggg gtg ttc acc cag gac1304Gly Ala Gly Gln Cys Ala Leu Thr Ala Pro Gly Val Phe Thr Gln Asp15 20 25gac gac ggc ttc agc gag ctg ctg ccc ggc cgc gag gac ggc gcg ggc1352Asp Asp Gly Phe Ser Glu Leu Leu Pro Gly Arg Glu Asp Gly Ala Gly30 35 40gac ccg atg ctg cgg gag gcc gtg cgt gcc tgc ccc gtg cag gcc atc1400Asp Pro Met Leu Arg Glu Ala Val Arg Ala Cys Pro Val Gln Ala Ile45 50 55acc gtc gcg gac gac tga1418Thr Val Ala Asp Asp60 64<210>70<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>70cgggaggaac atatgaccga agccatcgcg 30<210>71<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>71gcaaagcttc taccaggcca gcggcagttc gat 33<210>72<211>33<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>72gaggaagctt gctcagtcgt ccgcgacggt gat 33<210>73<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>73gtgccctcga tggtgatctg ctcgctgctc 30<210>74<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>74tcgagggttc atatgaccga gatgacagag 30<210>75<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>75gatgtggcag atcaccatgg acgggacggg 30<210>76<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>76cccgtcccgt ccatggtgat ctgccacatg 30<210>77<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>77ggcaagcttt caccaggtga ccgggagttc gtt 33<210>78<211>1233<212>DNA<213>Streptmyces carbophilus SANK 62585<220>
<221>CDS<222>(1)..(1233)<400>78atg acc gag atg aca gag aaa gcc acc aca ttc ctc acg tcg cag gag 48Met Thr Glu Met Thr Glu Lys Ala Thr Thr Phe Leu Thr Ser Gln Glu
1 5 10 15gca ccg gcc ttc ccg gcg gac cgc aca tgt ccc tac caa cta ccc acg 96Ala Pro Ala Phe Pro Ala Asp Arg Thr Cys Pro Tyr Gln Leu Pro Thr20 25 30gcc tac agt cgg ttg agg gac gag ccg gat gcg ctg cgc ccg gtg acg144Ala Tyr Ser Arg Leu Arg Asp Glu Pro Asp Ala Leu Arg Pro Val Thr35 40 45ctc tac gac ggc cgc cgc gcc tgg gtg gtg acc aag cac gag gcg gcg192Leu Tyr Asp Gly Arg Arg Ala Trp Val Val Thr Lys His Glu Ala Ala50 55 60cgg cgg tta ctc gcg gac ccc cgg ctg tcc tcc gac cgc ctg cac gcc240Arg Arg Leu Leu Ala Asp Pro Arg Leu Ser Ser Asp Arg Leu His Ala65 70 75 80gac ttc ccc gcc acc tcg cca cgc ttc aag gcg ttc cgg cag ggc agc288Asp Phe Pro Ala Thr Ser Pro Arg Phe Lys Ala Phe Arg Gln Gly Ser85 90 95ccc gcg ttc atc ggg atg gat ccc ccc gag cac ggg acg cgt cgc cgc336Pro Ala Phe Ile Gly Met Asp Pro Pro Glu His Gly Thr Arg Arg Arg100 105 110atg acg atc agc gag ttc acc gtg aag cgc atc aag ggc atg cgc ccg384Met Thr Ile Ser Glu Phe Thr Val Lys Arg Ile Lys Gly Met Arg Pro115 120 125gac gtc gaa cgc atc gtg cac ggc ttc atc gac gac atg ctc gcc gcg432Asp Val Glu Arg Ile Val His Gly Phe Ile Asp Asp Met Leu Ala Ala130 135 140gga ccc acc gcc gat ctg gtc agc cag ttc gcc ctg ccc gtc ccg tcc480Gly Pro Thr Ala Asp Leu Val Ser Gln Phe Ala Leu Pro Val Pro Ser145 150 155 160atg gtg atc tgc cac atg ctc ggc gtc ccc tac gcc gac cac gag ttc528Met Val Ile Cys His Met Leu Gly Val Pro Tyr Ala Asp His Glu Phe165 170 175ttc cag gac gcg agc aag cgc ctg gtg cag gcg gtg gac gcc gac agt576Phe Gln Asp Ala Ser Lys Arg Leu Val Gln Ala Val Asp Ala Asp Ser180 185 190gcc gtc gcc gcc cgg gac gac ttc gag cgc tac ctg gac ggg ctg atc624Ala Val Ala Ala Arg Asp Asp Phe Glu Arg Tyr Leu Asp Gly Leu Ile195 200 205acc aag ctg gag tcc gaa ccc ggg acc ggg ctc ctc ggc aaa ctg gtc672Thr Lys Leu Glu Ser Glu Pro Gly Thr Gly Leu Leu Gly Lys Leu Val210 215 220acc cac cag ctg gcg gac ggc gag atc gac cgc gcg gag ctg atc tcc720Thr His Gln Leu Ala Asp Gly Glu Ile Asp Arg Ala Glu Leu Ile Ser225 230 235 240acc gcc ctg ctg ctg ctc gtc gcc ggt cat gag acc acg gcc tcg atg768Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ala Gly His Glu Thr Thr Ala Ser Met245 250 255acc tcg ctc agc gtc atc acc ctg ctc gaa cac ccc gac cag cac gcc816Thr Ser Leu Ser Val Ile Thr Leu Leu Glu His Pro Asp Gln His Ala260 265 270gcc ctg cgc gcc gac ccg tcc ctc gtg ccc gga gcg gtc gag gaa ctg864Ala Leu Arg Ala Asp Pro Ser Leu Val Pro Gly Ala Val Glu Glu Leu275 280 285ctg cgc gtc ctg gcc atc gcg gac atc gcg ggc ggc cgc atc gcc acc912Leu Arg Val Leu Ala Ile Ala Asp Ile Ala Gly Gly Arg Ile Ala Thr290 295 300gcc gac atc gag atc gac gga cag ctc atc cgg gcc ggt gaa gga gtg960
Ala Asp Ile Glu Ile Asp Gly Gln Leu Ile Arg Ala Gly Glu Gly Val305 310 315 320atc gtc acc aac tcc atc gcc aac cgc gac agt tcg gtg ttc gag aac1008Ile Val Thr Asn Ser Ile Ala Asn Arg Asp Ser Ser Val Phe Glu Asn325 330 335ccg gac cgc ctc gat gtg cac cgc tcg gca cgc cac cac ctc tcc ttc1056Pro Asp Arg Leu Asp Val His Arg Ser Ala Arg His His Leu Ser Phe340 345 350ggg tac ggg gtg cac cag tgc ctg ggc cag aac ctg gcc cgc ctc gaa1104Gly Tyr Gly Val His Gln Cys Leu Gly Gln Asn Leu Ala Arg Leu Glu355 360 365ctc gaa gtc atc ctc acc gtg ttg ttc gac cgc att ccg acc ctg cgc1152Leu Glu Val Ile Leu Thr Val Leu Phe Asp Arg Ile Pro Thr Leu Arg370 375 380ctg gcc gtc ccc gtg gag cag ctg acg ctg cgt ccg ggc acg acg atc1200Leu Ala Val Pro Val Glu Gln Leu Thr Leu Arg Pro Gly Thr Thr Ile385 390 395 400cag ggc gtc aac gaa ctc ccg gtc acc tgg tga1233Gln Gly Val Asn Glu Leu Pro Val Thr Trp405 410<210>79<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>79gccatatgac cgataccgcc acgacgcc 28<210>80<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>80gcaagctttc accaggtgac cgggagttc 29<210>81<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>81gcaagcttct attccgtgtc ctcgacga 28<210>82<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>82cacggcttcc tcgacgagat20<210>83<211>20<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>83gtggaggaac tgctccgcta 20<210>84<211>1221<212>DNA<213>淺灰鏈霉菌(Streptmyces griseolus)ATCC 11796<220>
<221>CDS<222>(1)..(1221)<400>84atg acc gat acc gcc acg acg ccc cag acc acg gac gca ccc gcc ttc 48Met Thr Asp Thr Ala Thr Thr Pro Gln Thr Thr Asp Ala Pro Ala Phe1 5 10 15ccg agc aac cgg agc tgt ccc tac cag tta ccg gac ggc tac gcc cag 96Pro Ser Asn Arg Ser Cys Pro Tyr Gln Leu Pro Asp Gly Tyr Ala Gln20 25 30ctc cgg gac acc ccc ggc ccc ctg cac cgg gtg acg ctc tac gac ggc144Leu Arg Asp Thr Pro Gly Pro Leu His Arg Val Thr Leu Tyr Asp Gly35 40 45cgt cag gcg tgg gtg gtg acc aag cac gag gcc gcg cgc aaa ctg ctc192Arg Gln Ala Trp Val Val Thr Lys His Glu Ala Ala Arg Lys Leu Leu50 55 60ggc gac ccc cgg ctg tcc tcc aac cgg acg gac gac aac ttc ccc gcc240Gly Asp Pro Arg Leu Ser Ser Asn Arg Thr Asp Asp Asn Phe Pro Ala65 70 75 80acg tca ccg cgc ttc gag gcc gtc cgg gag agc ccg cag gcg ttc atc288Thr Ser Pro Arg Phe Glu Ala Val Arg Glu Ser Pro Gln Ala Phe Ile85 90 95ggc ctg gac ccg ccc gag cac ggc acc cgg cgg cgg atg acg atc agc336Gly Leu Asp Pro Pro Glu His Gly Thr Arg Arg Arg Met Thr Ile Ser100 105 110gag ttc acc gtc aag cgg atc aag ggc atg cgc ccc gag gtc gag gag384Glu Phe Thr Val Lys Arg Ile Lys Gly Met Arg Pro Glu Val Glu Glu115 120 125gtg gtg cac ggc ttc ctc gac gag atg ctg gcc gcc ggc ccg acc gcc432Val Val His Gly Phe Leu Asp Glu Met Leu Ala Ala Gly Pro Thr Ala130 135 140gac ctg gtc agt cag ttc gcg ctg ccg gtg ccc tcc atg gtg atc tgc480Asp Leu Val Ser Gln Phe Ala Leu Pro Val Pro Ser Met Val Ile Cys145 150 155 160cga ctc ctc ggc gtg ccc tac gcc gac cac gag ttc ttc cag gac gcg528Arg Leu Leu Gly Val Pro Tyr Ala Asp His Glu Phe Phe Gln Asp Ala165 170 175agc aag cgg ctg gtg cag tcc acg gac gcg cag agc gcg ctc acc gcg576Ser Lys Arg Leu Val Gln Ser Thr Asp Ala Gln Ser Ala Leu Thr Ala180 185 190cgg aac gac ctc gcg ggt tac ctg gac ggc ctc atc acc cag ttc cag624Arg Asn Asp Leu Ala Gly Tyr Leu Asp Gly Leu Ile Thr Gln Phe Gln195 200 205acc gaa ccg ggc gcg ggc ctg gtg ggc gct ctg gtc gcc gac cag ctg672Thr Glu Pro Gly Ala Gly Leu Val Gly Ala Leu Val Ala Asp Gln Leu210 215 220gcc aac ggc gag atc gac cgt gag gaa ctg atc tcc acc gcg atg ctg720Ala Asn Gly Glu Ile Asp Arg Glu Glu Leu Ile Ser Thr Ala Met Leu
225 230 235 240ctc ctc atc gcc ggc cac gag acc acg gcc tcg atg acc tcc ctc agc 768Leu Leu Ile Ala Gly His Glu Thr Thr Ala Ser Met Thr Ser Leu Ser245 250 255gtg atc acc ctg ctg gac cac ccc gag cag tac gcc gcc ctg cgc gcc 816Val Ile Thr Leu Leu Asp His Pro Glu Gln Tyr Ala Ala Leu Arg Ala260 265 270gac cgc agc ctc gtg ccc ggc gcg gtg gag gaa ctg ctc cgc tac ctc 864Asp Arg Ser Leu Val Pro Gly Ala Val Glu Glu Leu Leu Arg Tyr Leu275 280 285gcc atc gcc gac atc gcg ggc ggc cgc gtc gcc acg gcg gac atc gag 912Ala Ile Ala Asp Ile Ala Gly Gly Arg Val Ala Thr Ala Asp Ile Glu290 295 300gtc gag ggg cag ctc atc cgg gcc ggc gag ggc gtg atc gtc gtc aac 960Val Glu Gly Gln Leu Ile Arg Ala Gly Glu Gly Val Ile Val Val Asn305 310 315 320tcg ata gcc aac cgg gac ggc acg gtg tac gag gac ccg gac gcc ctc1008Ser Ile Ala Asn Arg Asp Gly Thr Val Tyr Glu Asp Pro Asp Ala Leu325 330 335gac atc cac cgc tcc gcg cgc cac cac ctc gcc ttc ggc ttc ggc gtg1056Asp Ile His Arg Ser Ala Arg His His Leu Ala Phe Gly Phe Gly Val340 345 350cac cag tgc ctg ggc cag aac ctc gcc cgg ctg gag ctg gag gtc atc1104His Gln Cys Leu Gly Gln Asn Leu Ala Arg Leu Glu Leu Glu Val Ile355 360 365ctc aac gcc ctc atg gac cgc gtc ccg acg ctg cga ctg gcc gtc ccc1152Leu Asn Ala Leu Met Asp Arg Val Pro Thr Leu Arg Leu Ala Val Pro370 375 380gtc gag cag ttg gtg ctg cgg ccg ggt acg acg atc cag ggc gtc aac1200Val Glu Gln Leu Val Leu Arg Pro Gly Thr Thr Ile Gln Gly Val Asn385 390 395 400gaa ctc ccg gtc acc tgg tga1221Glu Leu Pro Val Thr Trp405<210>85<211>1451<212>DNA<213>淺灰鏈霉菌(Streptmyces griseolus)ATCC 11796<220>
<221>CDS<222>(1)..(1221)<220>
<221>CDS<222>(1242)..(1451)<400>85atg acc gat acc gcc acg acg ccc cag acc acg gac gca ccc gcc ttc 48Met Thr Asp Thr Ala Thr Thr Pro Gln Thr Thr Asp Ala Pro Ala Phe1 5 10 15ccg agc aac cgg agc tgt ccc tac cag tta ccg gac ggc tac gcc cag 96Pro Ser Asn Arg Ser Cys Pro Tyr Gln Leu Pro Asp Gly Tyr Ala Gln20 25 30ctc cgg gac acc ccc ggc ccc ctg cac cgg gtg acg ctc tac gac ggc 144Leu Arg Asp Thr Pro Gly Pro Leu His Arg Val Thr Leu Tyr Asp Gly35 40 45cgt cag gcg tgg gtg gtg acc aag cac gag gcc gcg cgc aaa ctg ctc 192Arg Gln Ala Trp Val Val Thr Lys His Glu Ala Ala Arg Lys Leu Leu50 55 60
ggc gac ccc cgg ctg tcc tcc aac cgg acg gac gac aac ttc ccc gcc240Gly Asp Pro Arg Leu Ser Ser Asn Arg Thr Asp Asp Asn Phe Pro Ala65 70 75 80acg tca ccg cgc ttc gag gcc gtc cgg gag agc ccg cag gcg ttc atc288Thr Ser Pro Arg Phe Glu Ala Val Arg Glu Ser Pro Gln Ala Phe Ile85 90 95ggc ctg gac ccg ccc gag cac ggc acc cgg cgg cgg atg acg atc agc336Gly Leu Asp Pro Pro Glu His Gly Thr Arg Arg Arg Met Thr Ile Ser100 105 110gag ttc acc gtc aag cgg atc aag ggc atg cgc ccc gag gtc gag gag384Glu Phe Thr Val Lys Arg Ile Lys Gly Met Arg Pro Glu Val Glu Glu115 120 125gtg gtg cac ggc ttc ctc gac gag atg ctg gcc gcc ggc ccg acc gcc432Val Val His Gly Phe Leu Asp Glu Met Leu Ala Ala Gly Pro Thr Ala130 135 140gac ctg gtc agt cag ttc gcg ctg ccg gtg ccc tcc atg gtg atc tgc480Asp Leu Val Ser Gln Phe Ala Leu Pro Val Pro Ser Met Val Ile Cys145 150 155 160cga ctc ctc ggc gtg ccc tac gcc gac cac gag ttc ttc cag gac gcg528Arg Leu Leu Gly Val Pro Tyr Ala Asp His Glu Phe Phe Gln Asp Ala165 170 175agc aag cgg ctg gtg cag tcc acg gac gcg cag agc gcg ctc acc gcg576Ser Lys Arg Leu Val Gln Ser Thr Asp Ala Gln Ser Ala Leu Thr Ala180 185 190cgg aac gac ctc gcg ggt tac ctg gac ggc ctc atc acc cag ttc cag624Arg Asn Asp Leu Ala Gly Tyr Leu Asp Gly Leu Ile Thr Gln Phe Gln195 200 205acc gaa ccg ggc gcg ggc ctg gtg ggc gct ctg gtc gcc gac cag ctg672Thr Glu Pro Gly Ala Gly Leu Val Gly Ala Leu Val Ala Asp Gln Leu210 215 220gcc aac ggc gag atc gac cgt gag gaa ctg atc tcc acc gcg atg ctg720Ala Asn Gly Glu Ile Asp Arg Glu Glu Leu Ile Ser Thr Ala Met Leu225 230 235 240ctc ctc atc gcc ggc cac gag acc acg gcc tcg atg acc tcc ctc agc768Leu Leu Ile Ala Gly His Glu Thr Thr Ala Ser Met Thr Ser Leu Ser245 250 255gtg atc acc ctg ctg gac cac ccc gag cag tac gcc gcc ctg cgc gcc816Val Ile Thr Leu Leu Asp His Pro Glu Gln Tyr Ala Ala Leu Arg Ala260 265 270gac cgc agc ctc gtg ccc ggc gcg gtg gag gaa ctg ctc cgc tac ctc864Asp Arg Ser Leu Val Pro Gly Ala Val Glu Glu Leu Leu Arg Tyr Leu275 280 285gcc atc gcc gac atc gcg ggc ggc cgc gtc gcc acg gcg gac atc gag912Ala Ile Ala Asp lle Ala Gly Gly Arg Val Ala Thr Ala Asp Ile Glu290 295 300gtc gag ggg cag ctc atc cgg gcc ggc gag ggc gtg atc gtc gtc aac960Val Glu Gly Gln Leu Ile Arg Ala Gly Glu Gly Val Ile Val Val Asn305 310 315 320tcg ata gcc aac cgg gac ggc acg gtg tac gag gac ccg gac gcc ctc 1008Ser Ile Ala Asn Arg Asp Gly Thr Val Tyr Glu Asp Pro Asp Ala Leu325 330 335gac atc cac cgc tcc gcg cgc cac cac ctc gcc ttc ggc ttc ggc gtg 1056Asp Ile His Arg Ser Ala Arg His His Leu Ala Phe Gly Phe Gly Val340 345 350cac cag tgc ctg ggc cag aac ctc gcc cgg ctg gag ctg gag gtc atc 1104His Gln Cys Leu Gly Gln Asn Leu Ala Arg Leu Glu Leu Glu Val Ile
355 360 365ctc aac gcc ctc atg gac cgc gtc ccg acg ctg cga ctg gcc gtc ccc1152Leu Asn Ala Leu Met Asp Arg Val Pro Thr Leu Arg Leu Ala Val Pro370 375 380gtc gag cag ttg gtg ctg cgg ccg ggt acg acg atc cag ggc gtc aac1200Val Glu Gln Leu Val Leu Arg Pro Gly Thr Thr Ile Gln Gly Val Asn385 390 395 400gaa ctc ccg gtc acc tgg tga cgggggagag gggcaaggac atg acc atg cgg 1253Glu Leu Pro Val Thr Trp Met Thr Met Arg405 1gtg agt gcg gat cgg acg gtc tgc gtc ggt gcc ggg ctg tgt gcg ctg1301Val Ser Ala Asp Arg Thr Val Cys Val Gly Ala Gly Leu Cys Ala Leu5 10 15 20acg gcg ccg ggc gtc ctc gac cag gac gac gac ggg atc gtc acg gtg1349Thr Ala Pro Gly Val Leu Asp Gln Asp Asp Asp Gly Ile Val Thr Val25 30 35ctg acg gcc gaa ccc gcc gcc gac gac gac cgg cgc acc gcg cgc gag1397Leu Thr Ala Glu Pro Ala Ala Asp Asp Asp Arg Arg Thr Ala Arg Glu40 45 50gcc ggc cat ctc tgt ccg tcc ggt gcg gtc cgc gtc gtc gag gac acg1445Ala Gly His Leu Cys Pro Ser Gly Ala Val Arg Val Val Glu Asp Thr55 60 65gaa tag1451Glu69<210>86<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>86gaaagcttag aggatccaaa tggcttcctc aatgatc 37<210>87<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>87cgaggtaccg caagtaggaa agagtcatga acttcttc38<210>88<211>248<212>DNA<213>Glycine max(L.)Merrill<220>
<221>CDS<222>(20)..(220)<400>88gaaagcttag aggatccaa atg gct tcc tca atg atc tcc tcc cca gct gtt 52Met Ala Ser Ser Met Ile Ser Ser Pro Ala Val1 5 10acc acc gtc aac cgt gcc ggt gcc ggc atg gtt gct cca ttc acc ggc 100Thr Thr Val Asn Arg Ala Gly Ala Gly Met Val Ala Pro Phe Thr Gly15 20 25ctc aaa tcc atg gct ggc ttc ccc acg agg aag acc aac aat gac att 148
Leu Lys Ser Met Ala Gly Phe Pro Thr Arg Lys Thr Asn Asn Asp Ile30 35 40acc tcc att gct agc aac ggt gga aga gta caa tgc atg cag gtg tgg196Thr Ser Ile Ala Ser Asn Gly Gly Arg Val Gln Cys Met Gln Val Trp45 50 55cca cca att ggc aag aag aag ttc atgactcttt cctacttgcg gtacctcg 248Pro Pro Ile Gly Lys Lys Lys Phe60 65<210>89<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為表達(dá)載體構(gòu)建設(shè)計的寡核苷酸接頭<400>89gcggccgcg9<210>90<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為表達(dá)載體構(gòu)建設(shè)計的寡核苷酸接頭<400>90aattcgcggc cgc 13<210>91<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為表達(dá)載體構(gòu)建設(shè)計的寡核苷酸接頭<400>91agcttgcggc cgc 13<210>92<211>11<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為表達(dá)載體構(gòu)建設(shè)計的寡核苷酸接頭<400>92tagcggccgc a11<210>93<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>93tcatgcatga cagacatgac ggatacggca30<210>94<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>94
ggagctccta ccaggccacg ggcagatcca 30<210>95<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>95ggagctctca cggtcgcgcg gtttccgag a30<210>96<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>96tctttcatga cagacatgac ggatacggca 30<210>97<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>97ggagctctca cggtcgcgcg gtttccgag a30<210>98<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為表達(dá)載體構(gòu)建設(shè)計的寡核苷酸接頭<400>98agcttgcggc cgcgaattc 19<210>99<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為表達(dá)載體構(gòu)建設(shè)計的寡核苷酸接頭<400>99agctgaattc gcggccgca 19<210>100<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>100ccaagcttgc atgccggcat cttctgaagc tctga 35<210>101<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物
<400>101gaagcttggt acctcaccaa gtgaccatca gttcg 35<210>102<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>102aatgcatgac cgaagccatc gcgtatttc 29<210>103<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>103ggggtaccgc ggctaccagg ccag 24<210>104<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>104aactcatgac cgaagccatc gcgtatttc 29<210>105<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>105ggtccacata tgcacatcga catcgacacg 30<210>106<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>106agagtccata tgaggatcca ggcggacgtg 30<210>107<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>107ggttttcata tgcggatcac catcgacacc 30<210>108<211>411<212>PRT<213>不產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces achromogenes)IFO 12735
<400>108Met Thr Gln Ser Ala Asp Ala Val Pro Glu Ala Glu Ala Pro Pro Val1 5 10 15Gln Phe Pro Leu Arg Arg Thr Cys Pro Phe Ala Glu Pro Pro Glu Tyr20 25 30Ala Gly Leu Arg Ala Asp Thr Pro Val Ala Arg Ala Ala Leu Lys Val35 40 45Asn Gly Lys Pro Ala Trp Leu Val Thr Arg His Glu His Val Arg Gln50 55 60Val Leu Gly Asp Ser Arg Val Ser Ser Asn Leu Lys Leu Pro Gly Tyr65 70 75 80Pro His Gln Phe His Ile Pro Glu Glu Leu Leu Ala Gln Val Arg Leu85 90 95Met Met Leu Asn Met Asp Pro Pro Glu His Thr Ala His Arg Arg Met100 105 110Leu Ile Pro Glu Phe Thr Ala Arg Arg Val Arg Glu Leu Arg Pro Arg115 120 125Ile Gln Gln Ile Val Asp Glu His Val Asp Ala Met Leu Ala Ala Gly130 135 140Gly Pro Val Asp Leu Val Thr Ala Leu Ala Leu Pro Val Pro Ser Leu145 150 155 160Val Ile Cys Glu Leu Leu Gly Val Pro Tyr Glu Asp His Ala Arg Phe165 170 175Glu Glu Trp Ser Ala Ala Leu Met Asn His Asp Leu Ser Pro Gln Glu180 185 190Tyr Gly Ala Ala Val Gln Ala Leu Asp Thr Tyr Leu Asp Gln Leu Val195 200 205Thr Leu Lys Glu Asn Glu Pro Gly Asp Asp Leu Ile Ser Arg Phe Leu210 215 220Glu Lys Asn Arg Thr Glu Arg Val Ala Asp His Thr Asp Val Val Thr225 230 235 240Met Ala Arg Leu Met Leu Val Gly Gly His Glu Thr Thr Ala Asn Met245 250 255Ile Ala Leu Gly Val Leu Ala Leu Leu Arg His Pro Glu Gln Met Ala260 265 270Glu Leu Arg Ala Asp Pro Ala Leu Leu Pro Asn Ala Val Glu Glu Leu275 280 285Leu Arg Val Phe Ser Ile Ser Asp Ser Gly Thr Ala Arg Val Ala Val290 295 300Ala Asp Ile Glu Val Gly Asp Val Thr Ile Arg Ala Gly Glu Gly Ile305 310 315 320Leu Ala Leu Asn Asn Ala Ala Asp His Asp Glu Ser Val Phe Pro Asp325 330 335Pro Asp Thr Leu Asp Ile His Arg Lys Glu Ala Arg Ser His Leu Ala340 345 350Phe Gly Tyr Gly Val His Gln Cys Ile Gly Ala Asn Leu Ala Arg Ala355 360 365Glu Leu Glu Ala Val Tyr Gly Thr Leu Leu Arg Arg Val Pro Gly Leu370 375 380Arg Leu Ala Ala Glu Pro Glu Asp Leu Arg Phe Lys Asp Asp Ala Met385 390 395 400Val Tyr Gly Val Tyr Glu Leu Pro Val Thr Trp405 410<210>109<211>1236<212>DNA<213>不產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces achromogenes)IFO 12735<220>
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aac ggc aag ccg gcc tgg ctg gtc acc cgg cac gag cac gtc cgg cag192Asn Gly Lys Pro Ala Trp Leu Val Thr Arg His Glu His Val Arg Gln50 55 60gtg ctg ggc gac agc cgg gtc agc tcc aac ctc aaa ctg ccg ggc tat240Val Leu Gly Asp Ser Arg Val Ser Ser Asn Leu Lys Leu Pro Gly Tyr65 70 75 80ccc cac cag ttc cac atc ccc gag gaa ctg ctg gcg cag gtc cgg ctg288Pro His Gln Phe His Ile Pro Glu Glu Leu Leu Ala Gln Val Arg Leu85 90 95atg atg ctg aac atg gac ccg ccg gaa cac acc gcc cac cgg cgc atg336Met Met Leu Asn Met Asp Pro Pro Glu His Thr Ala His Arg Arg Met100 105 110ctg ata ccg gag ttc acg gcc cgc cgg gtg cgg gag ttg cgc ccg cgg384Leu Ile Pro Glu Phe Thr Ala Arg Arg Val Arg Glu Leu Arg Pro Arg115 120 125atc cag cag atc gtg gac gag cac gtg gac gcg atg ctg gcc gcg ggc432Ile Gln Gln Ile Val Asp Glu His Val Asp Ala Met Leu Ala Ala Gly130 135 140ggc ccg gtg gac ctg gtc acc gcc ctc gcg ctg ccg gtg ccc tcg ctg480Gly Pro Val Asp Leu Val Thr Ala Leu Ala Leu Pro Val Pro Ser Leu145 150 155 160gtg atc tgc gaa ctg ctc ggc gtg ccc tac gag gac cac gcg cgg ttc528Val Ile Cys Glu Leu Leu Gly Val Pro Tyr Glu Asp His Ala Arg Phe165 170 175gag gag tgg tcg gcg gcg ctg atg aac cac gat ctg agc ccg cag gag576Glu Glu Trp Ser Ala Ala Leu Met Asn His Asp Leu Ser Pro Gln Glu180 185 190tac ggg gcg gcc gtg cag gcc ctg gac acg tac ctc gac cag ctc gtc624Tyr Gly Ala Ala Val Gln Ala Leu Asp Thr Tyr Leu Asp Gln Leu Val195 200 205acc ctg aag gag aac gag ccg ggc gac gac ctc atc agc cgc ttc ctg672Thr Leu Lys Glu Asn Glu Pro Gly Asp Asp Leu Ile Ser Arg Phe Leu210 215 220gag aag aac cgc acc gag cgg gtc gcc gac cac acc gat gtg gtg acg720Glu Lys Asn Arg Thr Glu Arg Val Ala Asp His Thr Asp Val Val Thr225 230 235 240atg gcc cgg ctg atg ctg gtc ggc ggc cac gag acc acc gcc aac atg768Met Ala Arg Leu Met Leu Val Gly Gly His Glu Thr Thr Ala Asn Met245 250 255atc gcc ctc ggg gtg ctg gcc ctg ctg cgg cac ccg gag cag atg gcc816Ile Ala Leu Gly Val Leu Ala Leu Leu Arg His Pro Glu Gln Met Ala260 265 270gag ttg cgg gcc gat ccg gcc ctg ctg ccg aac gcc gtg gag gag ttg864Glu Leu Arg Ala Asp Pro Ala Leu Leu Pro Asn Ala Val Glu Glu Leu275 280 285ctg cgc gtc ttc tcc atc tcc gac tcc ggc acc gcc cgg gtc gcg gtg912Leu Arg Val Phe Ser Ile Ser Asp Ser Gly Thr Ala Arg Val Ala Val290 295 300gcg gac atc gag gtc ggt gac gtc acc atc cgc gcg ggt gag ggc atc960Ala Asp Ile Glu Val Gly Asp Val Thr Ile Arg Ala Gly Glu Gly Ile305 310 315 320ctc gcc ctg aac aac gcg gcc gac cac gac gag tcg gtc ttc ccg gac 1008Leu Ala Leu Asn Asn Ala Ala Asp His Asp Glu Ser Val Phe Pro Asp325 330 335ccg gac acc ctc gac atc cac cgc aag gag gcc cgc tcc cac ctg gcc 1056Pro Asp Thr Leu Asp Ile His Arg Lys Glu Ala Arg Ser His Leu Ala
340 345 350ttc ggc tac ggc gtc cac cag tgc atc ggc gcc aac ctc gcc cgg gcg 1104Phe Gly Tyr Gly Val His Gln Cys Ile Gly Ala Asn Leu Ala Arg Ala355 360 365gag ctg gag gcg gtc tac ggc acg ctg ctg cgc cgc gtc ccc ggc ctg 1152Glu Leu Glu Ala Val Tyr Gly Thr Leu Leu Arg Arg Val Pro Gly Leu370 375 380cgg ctg gcc gcc gag ccg gag gac ctg cgg ttc aag gac gac gcc atg 1200Arg Leu Ala Ala Glu Pro Glu Asp Leu Arg Phe Lys Asp Asp Ala Met385 390 395 400gtc tac ggc gtc tac gaa ctc ccc gtc acc tgg tga 1236Val Tyr Gly Val Tyr Glu Leu Pro Val Thr Trp405 410<210>110<211>1454<212>DNA<213>不產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces achromogenes)IFO 12735<220>
<221>CDS<222>(1)..(1236)<220>
<221>CDS<222>(1263)..(1454)<400>110atg acc cag tcc gcc gac gcc gta ccc gag gcg gaa gca ccg ccg gtg 48Met Thr Gln Ser Ala Asp Ala Val Pro Glu Ala Glu Ala Pro Pro Val1 5 10 15cag ttc ccc ctg cgg cgc acc tgt ccg ttc gcc gag ccg ccc gag tac 96Gln Phe Pro Leu Arg Arg Thr Cys Pro Phe Ala Glu Pro Pro Glu Tyr20 25 30gcc ggg ctg cgc gcc gac aca ccc gtc gcc cgc gcc gcc ctg aaa gtg144Ala Gly Leu Arg Ala Asp Thr Pro Val Ala Arg Ala Ala Leu Lys Val35 40 45aac ggc aag ccg gcc tgg ctg gtc acc cgg cac gag cac gtc cgg cag192Asn Gly Lys Pro Ala Trp Leu Val Thr Arg His Glu His Val Arg Gln50 55 60gtg ctg ggc gac agc cgg gtc agc tcc aac ctc aaa ctg ccg ggc tat240Val Leu Gly Asp Ser Arg Val Ser Ser Asn Leu Lys Leu Pro Gly Tyr65 70 75 80ccc cac cag ttc cac atc ccc gag gaa ctg ctg gcg cag gtc cgg ctg288Pro His Gln Phe His Ile Pro Glu Glu Leu Leu Ala Gln Val Arg Leu85 90 95atg atg ctg aac atg gac ccg ccg gaa cac acc gcc cac cgg cgc atg336Met Met Leu Asn Met Asp Pro Pro Glu His Thr Ala His Arg Arg Met100 105 110ctg ata ccg gag ttc acg gcc cgc cgg gtg cgg gag ttg cgc ccg cgg384Leu Ile Pro Glu Phe Thr Ala Arg Arg Val Arg Glu Leu Arg Pro Arg115 120 125atc cag cag atc gtg gac gag cac gtg gac gcg atg ctg gcc gcg ggc432Ile Gln Gln Ile Val Asp Glu His Val Asp Ala Met Leu Ala Ala Gly130 135 140ggc ccg gtg gac ctg gtc acc gcc ctc gcg ctg ccg gtg ccc tcg ctg480Gly Pro Val Asp Leu Val Thr Ala Leu Ala Leu Pro Val Pro Ser Leu145 150 155 160gtg atc tgc gaa ctg ctc ggc gtg ccc tac gag gac cac gcg cgg ttc528Val Ile Cys Glu Leu Leu Gly Val Pro Tyr Glu Asp His Ala Arg Phe165 170 175
gag gag tgg tcg gcg gcg ctg atg aac cac gat ctg agc ccg cag gag 576Glu Glu Trp Ser Ala Ala Leu Met Asn His Asp Leu Ser Pro Gln Glu180 185 190tac ggg gcg gcc gtg cag gcc ctg gac acg tac ctc gac cag ctc gtc 624Tyr Gly Ala Ala Val Gln Ala Leu Asp Thr Tyr Leu Asp Gln Leu Val195 200 205acc ctg aag gag aac gag ccg ggc gac gac ctc atc agc cgc ttc ctg 672Thr Leu Lys Glu Asn Glu Pro Gly Asp Asp Leu Ile Ser Arg Phe Leu210 215 220gag aag aac cgc acc gag cgg gtc gcc gac cac acc gat gtg gtg acg 720Glu Lys Asn Arg Thr Glu Arg Val Ala Asp His Thr Asp Val Val Thr225 230 235 240atg gcc cgg ctg atg ctg gtc ggc ggc cac gag acc acc gcc aac atg 768Met Ala Arg Leu Met Leu Val Gly Gly His Glu Thr Thr Ala Asn Met245 250 255atc gcc ctc ggg gtg ctg gcc ctg ctg cgg cac ccg gag cag atg gcc 816Ile Ala Leu Gly Val Leu Ala Leu Leu Arg His Pro Glu Gln Met Ala260 265 270gag ttg cgg gcc gat ccg gcc ctg ctg ccg aac gcc gtg gag gag ttg 864Glu Leu Arg Ala Asp Pro Ala Leu Leu Pro Asn Ala Val Glu Glu Leu275 280 285ctg cgc gtc ttc tcc atc tcc gac tcc ggc acc gcc cgg gtc gcg gtg 912Leu Arg Val Phe Ser Ile Ser Asp Ser Gly Thr Ala Arg Val Ala Val290 295 300gcg gac atc gag gtc ggt gac gtc acc atc cgc gcg ggt gag ggc atc 960Ala Asp Ile Glu Val Gly Asp Val Thr Ile Arg Ala Gly Glu Gly Ile305 310 315 320ctc gcc ctg aac aac gcg gcc gac cac gac gag tcg gtc ttc ccg gac1008Leu Ala Leu Asn Asn Ala Ala Asp His Asp Glu Ser Val Phe Pro Asp325 330 335ccg gac acc ctc gac atc cac cgc aag gag gcc cgc tcc cac ctg gcc1056Pro Asp Thr Leu Asp Ile His Arg Lys Glu Ala Arg Ser His Leu Ala340 345 350ttc ggc tac ggc gtc cac cag tgc atc ggc gcc aac ctc gcc cgg gcg1104Phe Gly Tyr Gly Val His Gln Cys Ile Gly Ala Asn Leu Ala Arg Ala355 360 365gag ctg gag gcg gtc tac ggc acg ctg ctg cgc cgc gtc ccc ggc ctg1152Glu Leu Glu Ala Val Tyr Gly Thr Leu Leu Arg Arg Val Pro Gly Leu370 375 380cgg ctg gcc gcc gag ccg gag gac ctg cgg ttc aag gac gac gcc atg1200Arg Leu Ala Ala Glu Pro Glu Asp Leu Arg Phe Lys Asp Asp Ala Met385 390 395 400gtc tac ggc gtc tac gaa ctc ccc gtc acc tgg tga cggccgacgc gaacgg 1252Val Tyr Gly Val Tyr Glu Leu Pro Val Thr Trp405 410actgcccctg atg cgt gtc tcc gcc gaa cgc gac cgg tgc gtg ggc tcc 1301Met Arg Val Ser Ala Glu Arg Asp Arg Cys Val Gly Ser1 5 10ggc cag tgc gcg ctg ctg agc ccc gag gtg ttc gac cag gac gcc gac1349Gly Gln Cys Ala Leu Leu Ser Pro Glu Val Phe Asp Gln Asp Ala Asp15 20 25ggc ctg gtc acc ctg ctg agc gag gag ccg gcc gag gag ctg cgc gag1397Gly Leu Val Thr Leu Leu Ser Glu Glu Pro Ala Glu Glu Leu Arg Glu30 35 40 45cag gtc gct cag gcc gcg gac ctg tgc ccg tcc cgc tcg atc cgc gtg1445Gln Val Ala Gln Ala Ala Asp Leu Cys Pro Ser Arg Ser Ile Arg Val
50 55 60cac gac tga 1454His Asp<210>111<211>63<212>PRT<213>不產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces achromogenes)IFO 12735<400>111Met Arg Val Ser Ala Glu Arg Asp Arg Cys Val Gly Ser Gly Gln Cys1 5 10 15Ala Leu Leu Ser Pro Glu Val Phe Asp Gln Asp Ala Asp Gly Leu Val20 25 30Thr Leu Leu Ser Glu Glu Pro Ala Glu Glu Leu Arg Glu Gln Val Ala35 40 45Gln Ala Ala Asp Leu Cys Pro Ser Arg Ser Ile Arg Val His Asp50 55 60<210>112<211>192<212>DNA<213>不產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces achromogenes)IFO 12735<220>
<221>CDS<222>(1)..(192)<400>112atg cgt gtc tcc gcc gaa cgc gac cgg tgc gtg ggc tcc ggc cag tgc 48Met Arg Val Ser Ala Glu Arg Asp Arg Cys Val Gly Ser Gly Gln Cys1 5 10 15gcg ctg ctg agc ccc gag gtg ttc gac cag gac gcc gac ggc ctg gtc 96Ala Leu Leu Ser Pro Glu Val Phe Asp Gln Asp Ala Asp Gly Leu Val20 25 30acc ctg ctg agc gag gag ccg gcc gag gag ctg cgc gag cag gtc gct144Thr Leu Leu Ser Glu Glu Pro Ala Glu Glu Leu Arg Glu Gln Val Ala35 40 45cag gcc gcg gac ctg tgc ccg tcc cgc tcg atc cgc gtg cac gac tga192Gln Ala Ala Asp Leu Cys Pro Ser Arg Ser Ile Arg Val His Asp50 55 60<210>113<211>20<212>PRT<213>不產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces achromogenes)IFO 12735<400>113Met Thr Gln Ser Ala Asp Ala Val Pro Glu Ala Glu Ala Pro Pro Val1 5 10 15Gln Phe Pro Leu20<210>114<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>114gacgcsgtsc csgaggcsga agc23<210>115<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物
<400>115gaggcsccsc csgtscagtt ccc23<210>116<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>116tcggcgaacg gacaggtgcg ccgca 25<210>117<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>117ccctcgctgg tgat ctgcga actgctc 27<210>118<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>118agctcgtcac cctgaaggag aacgagc27<210>119<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>119accatatgac ccagtccgcc gacgccgt 28<210>120<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>120gtaagctttc accaggtgac ggggagtt 28<210>121<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>121cgaagctttc agtcgtgcac gcggatcg 28<210>122<211>27<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>122ttcctggaga agaaccgcac cgagcgg27<210>123<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>123cacccggagc agatggccga gttgcg 26<210>124<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>124tgmtcggcvt sgacgacccc gagcac 26<210>125<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>125cgctgccsgt gccstcsatg gtgatctg 28<210>126<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>126cgctgccggt gccgtcsctg gtgatctg 28<210>127<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>127ggcgtsccct acgccgacca cgagttcttc 30<210>128<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>128ggcgtsccct acgaggacca cgssttcttc 30<210>129<211>28<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>129aggcactggt gsacsccgaa sccgaagg 28<210>130<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>130cttcccccag gaccgcacct gccccttcca 30<210>131<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>131ggatcgtggc cagcgagatg gcctcctgcc 30<210>132<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>132tttccaggac cgcacctgcc cctaccaccc 30<210>133<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>133ggatcatcgc gagccggacc agatcctcgc 30<210>134<211>72<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為表達(dá)載體構(gòu)建設(shè)計的寡核苷酸接頭<400>134agctattttt taataaaatc aggaggaaaa aacatatgag caagcttggc tgttttggcg60gatgagagaa ga72<210>135<211>68<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為表達(dá)載體構(gòu)建設(shè)計的寡核苷酸接頭<400>135tcttctctca tccgccaaaa cagccaagct tgctcatatg ttttttcctc ctgattttat60taaaaaat 68
<210>136<211>402<212>PRT<213>熱淡天藍(lán)鏈霉菌(Streptmyces thermocoerulescens)IFO 14273t<400>136Met Thr Asp Met Thr Glu Thr Pro Thr Val Ala Phe Pro Gln Ser Arg1 5 10 15Thr Cys Pro Tyr His Pro Pro Ala Ala Tyr Ala Pro Leu Arg Asp Thr20 25 30Arg Pro Leu Ala Arg Ala Arg Leu Tyr Asp Gly Arg Leu Val Trp Thr35 40 45Val Thr Gly His Gly Leu Ala Arg Thr Leu Leu Ala Asp Pro Arg Leu50 55 60Ser Thr Asp Pro Thr Arg Pro Glu Phe Pro Ala Thr Thr Glu Arg Ile65 70 75 80Ala Arg Ile Arg Arg Arg Arg Thr Ala Leu Leu Gly Val Asp Asp Pro85 90 95Glu His Arg Val Gln Arg Arg Met Met Val Pro Ser Phe Thr Leu Gln100 105 110Arg Ala Thr Ala Leu Arg Pro Arg Ile Gln Arg Val Val Asp Glu Arg115 120 125Leu Asp Ala Met Ile Ala Gly Gly Pro Pro Ala Asp Leu Val Thr Ala130 135 140Phe Ala Leu Pro Val Pro Ser Met Val Ile Cys Ala Leu Leu Gly Val145 150 155 160Pro Tyr Glu Asp His Asp Phe Phe Glu Glu Gln Ser Arg Arg Leu Leu165 170 175Arg Gly Pro Thr Ala Glu Asp Ser Met Asp Ala Arg Ala Arg Met Glu180 185 190Ala Tyr Phe Asp Glu Leu Ile Asp Arg Lys Gln Arg Gln Asp Ala Pro195 200 205Gly Asp Gly Val Leu Asp Glu Leu Val His Gln Arg Leu Ala Ala Gly210 215 220Glu Leu Asp Arg Glu Gly Leu Ile Ala Met Ala Ile Ile Leu Leu Val225 230 235 240Ala Gly His Glu Thr Thr Ala Asn Met Ile Ser Leu Gly Thr Phe Thr245 250 255Leu Leu Gly His Pro Glu Arg Leu Ala Glu Leu Arg Ala Asp Pro Asp260 265 270Leu Val Pro Ala Ala Val Glu Glu Leu Leu Arg Met Leu Ser Ile Ala275 280 285Asp Gly Leu Leu Arg Val Ala Val Glu Asp Ile Glu Val Ala Gly Glu290 295 300Thr Ile Arg Ala Gly Asp Gly Val Ile Phe Ser Thr Ser Val Ile Asn305 310 315 320Arg Asp Glu Ala Val Tyr Pro Glu Pro Asp Thr Leu Asp Leu His Arg325 330 335Pro Ala Arg His His Val Ala Phe Gly Phe Gly Ile His Gln Cys Leu340 345 350Gly Gln Asn Leu Ala Arg Ala Glu Met Glu Ile Ala Leu Arg Thr Leu355 360 365Phe Gly Arg Leu Pro Gly Leu Arg Leu Ala Val Pro Pro Glu Glu Ile370 375 380Pro Phe Lys Pro Gly Asp Thr Ile Gln Gly Met Leu Glu Leu Pro Val385 390 395 400Thr Trp<210>137<211>409<212>PRT<213>球團(tuán)產(chǎn)色鏈霉菌(Streptmyces glomerochromogenes)IFO 13673T<400>137Met Thr Glu Leu Thr Asp Ile Thr Gly Pro Ala Gly Gln Ala Gln Pro1 5 10 15Val Ala Phe Pro Gln Asp Arg Thr Cys Pro Tyr His Pro Pro Thr Gly20 25 30Tyr Asp Pro Leu Arg Asp Gly Arg Pro Leu Ser Arg Val Thr Leu Tyr35 40 45Asp Gly Arg Glu Val Trp Leu Val Thr Ala Gln Ala Thr Ala Arg Ala50 55 60Leu Leu Ala Asp Pro Arg Leu Ser Thr Asp Arg Arg Arg Asp Gly Phe65 70 75 80
Pro Val Pro Ser Pro Arg Phe Glu Ala Gly Arg Asp Arg Lys Leu Ala85 90 95Leu Leu Gly Leu Asp Asp Pro Glu His His Gln Gln Arg Arg Met Leu100 105 110Ile Pro Ser Phe Thr Val Lys Arg Ala Thr Ala Leu Arg Pro Trp Ile115 120 125Gln Arg Ile Val Asp Glu Leu Leu Asp Asp Met Ile Ala Arg Gly Pro130 135 140Val Ala Asp Leu Val Ser Ala Phe Ala Leu Pro Val Pro Ser Met Val145 150 155 160Ile Cys Glu Leu Leu Gly Val Pro Tyr Ala Asp His Glu Phe Phe Glu165 170 175Glu Gln Ser Arg Arg Leu Leu Arg Gly Pro Gly Gly Ala Asp Thr Leu180 185 190Asp Ala Arg Asp Arg Leu Glu Ala Tyr Leu Gly Glu Leu Ile Asp Ala195 200 205Lys Ala Lys Glu Ala Glu Pro Gly Asp Gly Val Leu Asp Asp Leu Val210 215 220His Asn Arg Leu Arg Ala Gly Glu Leu Asp Arg Thr Asp Leu Val Ser225 230 235 240Leu Ala Leu Ile Leu Leu Val Ala Gly His Glu Thr Thr Ala Asn Met245 250 255Ile Ser Leu Gly Thr Tyr Thr Leu Leu Gln His Pro Glu Arg Leu Ala260 265 270Glu Leu Arg Ala Asp Pro Thr Val Leu Pro Ala Val Val Glu Glu Leu275 280 285Leu Arg Met Leu Ser Ile Ala Glu Gly Leu Gln Arg Leu Ala Leu Glu290 295 300Asp Ile Glu Ile Asp Gly Thr Thr Ile Arg Ala Gly Asp Gly Val Leu305 310 315 320Phe Ser Thr Ser Val Ile Asn Arg Asp Thr Ala Val Tyr Asp Asp Pro325 330 335Asp Asp Leu Asp Phe His Arg Ala Asp Arg His His Val Ala Phe Gly340 345 350Phe Gly Ile His Gln Cys Leu Gly Gln Asn Leu Ala Arg Ala Glu Leu355 360 365Glu Ile Ala Leu Gly Ser Leu Phe Thr Arg Leu Pro Gly Leu Arg Leu370 375 380Ala Ala Pro Ala Glu Glu Ile Pro Phe Lys Pro Gly Asp Thr Ile Gln385 390 395 400Gly Met Leu Glu Leu Pro Val Thr Trp405<210>138<211>409<212>PRT<213>橄欖產(chǎn)色鏈霉菌(Streptmyces olivochromogenes)IFO 12444<400>138Met Thr Glu Leu Thr Asp Ile Thr Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro1 5 10 15Val Ala Phe Pro Gln Asp Arg Thr Cys Pro Tyr His Pro Pro Thr Gly20 25 30Tyr Asp Pro Leu Arg Asp Gly Arg Pro Leu Ser Arg Val Thr Leu Tyr35 40 45Asp Gly Arg Glu Val Trp Leu Val Thr Ala Gln Ala Thr Ala Arg Ala50 55 60Leu Leu Ala Asp Pro Arg Leu Ser Thr Asp Arg Arg Arg Asp Gly Phe65 70 75 80Pro Val Pro Ser Pro Arg Phe Glu Ala Gly Arg Asp Arg Lys Leu Ala85 90 95Leu Leu Gly Leu Asp Asp Pro Glu His His Gln Gln Arg Arg Met Leu100 105 110Ile Pro Ser Phe Thr Val Lys Arg Ala Thr Ala Leu Arg Pro Trp Ile115 120 125Gln Arg Ile Val Asp Glu Leu Leu Asp Asp Met Ile Ala Arg Gly Pro130 135 140Val Ala Asp Leu Val Ser Ala Phe Ala Leu Pro Val Pro Ser Met Val145 150 155 160Ile Cys Glu Leu Leu Gly Val Pro Tyr Ala Asp His Glu Phe Phe Glu165 170 175Glu Gln Ser Arg Arg Leu Leu Arg Gly Pro Gly Gly Ala Asp Thr Leu180 185 190Asp Ala Arg Asp Arg Leu Glu Ala Tyr Leu Gly Glu Leu Ile Asp Ala195 200 205
Lys Ala Lys Glu Ala Glu Pro Gly Asp Gly Ile Leu Asp Asp Leu Val210 215 220His Asn Arg Leu Arg Ala Gly Glu Leu Asp Arg Thr Asp Leu Val Ser225 230 235 240Leu Ala Leu Ile Leu Leu Val Ala Gly His Glu Thr Thr Ala Asn Met245 250 255Ile Ser Leu Gly Thr Tyr Thr Leu Leu Gln His Pro Glu Arg Leu Ala260 265 270Glu Leu Arg Ala Asp Pro Thr Val Leu Pro Ala Val Val Glu Glu Leu275 280 285Leu Arg Met Leu Ser Ile Ala Glu Gly Leu Gln Arg Val Ala Leu Glu290 295 300Asp Ile Glu Ile Asp Gly Thr Thr Ile Arg Ala Gly Asp Gly Val Leu305 310 315 320Phe Ser Thr Ser Val Ile Asn Arg Asp Thr Ala Val Tyr Asp Asp Pro325 330 335Asp Gly Leu Asp Phe His Arg Ala Asp Arg His His Val Ala Phe Gly340 345 350Phe Gly Ile His Gln Cys Leu Gly Gln Asn Leu Ala Arg Ala Glu Leu355 360 365Glu Ile Ala Leu Gly Ser Leu Phe Thr Arg Leu Pro Gly Leu Arg Leu370 375 380Ala Ala Pro Ala Glu Glu Ile Pro Phe Lys Pro Gly Asp Thr Ile Gln385 390 395 400Gly Met Leu Glu Leu Pro Val Thr Trp405<210>139<211>1230<212>DNA<213>黑胡桃鏈霉菌(Streptmyces nogalater)IFO 13445<220>
<221>CDS<222>(1)..(1230)<400>139atg acg gaa ctg acg gac acc acc ggc ccg gcc gac gcg gcc gaa ccc 48Met Thr Glu Leu Thr Asp Thr Thr Gly Pro Ala Asp Ala Ala Glu Pro1 5 10 15gtc gca ttc ccc cag gac cgc acc tgc ccc tac cac ccc ccg acc ggc 96Val Ala Phe Pro Gln Asp Arg Thr Cys Pro Tyr His Pro Pro Thr Gly20 25 30tac gac ccg ctg cgc gac ggg cgg ccc ctg tcc cgg gtc acc ctc tac144Tyr Asp Pro Leu Arg Asp Gly Arg Pro Leu Ser Arg Val Thr Leu Tyr35 40 45gac ggc cgt gag gtc tgg ctg gtc acc gcg cag gcc acc gcc cgc acc192Asp Gly Arg Glu Val Trp Leu Val Thr Ala Gln Ala Thr Ala Arg Thr50 55 60ctg ctc gcc gac ccc cgg ctg tcc acc gac cgc cgc cgc gac ggc ttc240Leu Leu Ala Asp Pro Arg Leu Ser Thr Asp Arg Arg Arg Asp Gly Phe65 70 75 80ccc gtg ccc acc ccc cgc ttc gag ggc gga cgc gac cgc aag ctg gcc288Pro Val Pro Thr Pro Arg Phe Glu Gly Gly Arg Asp Arg Lys Leu Ala85 90 95ctg ctc gga ctg gac gac ccc gag cac cag cag cag cgc cgg atg ctg336Leu Leu Gly Leu Asp Asp Pro Glu His Gln Gln Gln Arg Arg Met Leu100 105 110atc ccg tcg ttc acc gtg aaa cgc gcc acc gcg cta cgc ccc tgg atc384Ile Pro Ser Phe Thr Val Lys Arg Ala Thr Ala Leu Arg Pro Trp Ile115 120 125cag cgg atc gtc gac gga ctg ctg gac gcc atg atc acc cgg ggg ccg432Gln Arg Ile Val Asp Gly Leu Leu Asp Ala Met Ile Thr Arg Gly Pro130 135 140gtc gcc gac ctc gtg tcc gcc ttc gcg ctg ccc gtg ccg tcc atg gtc480Val Ala Asp Leu Val Ser Ala Phe Ala Leu Pro Val Pro Ser Met Val
145 150 155 160atc tgc gaa ctg ctc ggc gtg ccc tac gcc gac cac gag ttc ttc gag528Ile Cys Glu Leu Leu Gly Val Pro Tyr Ala Asp His Glu Phe Phe Glu165 170 175gag cag tcc cgc cga ctg ctg agc gcc tcg acc agc gcc gac acc ctg576Glu Gln Ser Arg Arg Leu Leu Ser Ala Ser Thr Ser Ala Asp Thr Leu180 185 190gac gcc cgg gac cgg ctg gag acg tac ctc ggc gac ctg atc gac gcc624Asp Ala Arg Asp Arg Leu Glu Thr Tyr Leu Gly Asp Leu Ile Asp Ala195 200 205aag gcc aag gag gcc gag ccc ggc gac ggc atc ctg gac gag ctc gtc672Lys Ala Lys Glu Ala Glu Pro Gly Asp Gly Ile Leu Asp Glu Leu Val210 215 220cac aac cgg ctc cgc aag ggc gag ctg gac cgg acc gac ctg gtg tcg720His Asn Arg Leu Arg Lys Gly Glu Leu Asp Arg Thr Asp Leu Val Ser225 230 235 240ctc gcc gtc atc ctg ctg gtc gcc ggg cac gag acg acc gcc aac atg768Leu Ala Val Ile Leu Leu Val Ala Gly His Glu Thr Thr Ala Asn Met245 250 255atc tcc ctg ggc acc tac acg ctg ctc cag cac ccc gag cgc ctg gcc816Ile Ser Leu Gly Thr Tyr Thr Leu Leu Gln His Pro Glu Arg Leu Ala260 265 270gag ctg cgc gcc gac ccc gcg ctg ctg ccc gcc gtc gtc gag gaa ctg864Glu Leu Arg Ala Asp Pro Ala Leu Leu Pro Ala Val Val Glu Glu Leu275 280 285ctg cgg atg ctg tcc atc gcc gag ggg ctg caa cgg gtg gcg ctg gag912Leu Arg Met Leu Ser Ile Ala Glu Gly Leu Gln Arg Val Ala Leu Glu290 295 300gac atc gag atc gac ggc acc acc atc cgg gcc ggc gac ggc gtc ctc960Asp Ile Glu Ile Asp Gly Thr Thr Ile Arg Ala Gly Asp Gly Val Leu305 310 315 320ttc tcc acc tcg gtc atc aac cgg gac acg gcc gtc tac gac gac ccg 1008Phe Ser Thr Ser Val Ile Asn Arg Asp Thr Ala Val Tyr Asp Asp Pro325 330 335gac gac ctg gac ttc cac cgc gcc gac cgg cac cac gtg gcg ttc ggc 1056Asp Asp Leu Asp Phe His Arg Ala Asp Arg His His Val Ala Phe Gly340 345 350ttc ggc atc cac cag tgc ctg ggc cag aac ctg gcc cgc gcg gaa ctg 1104Phe Gly Ile His Gln Cys Leu Gly Gln Asn Leu Ala Arg Ala Glu Leu355 360 365gag atc gct ctc ggc agc ctg ttc acc cgc ttg ccc ggg ctc cgt ctg 1152Glu Ile Ala Leu Gly Ser Leu Phe Thr Arg Leu Pro Gly Leu Arg Leu370 375 380gcc gta ccg gcg aag gac att ccc ttc aaa ccg ggc gac acg atc cag 1200Ala Val Pro Ala Lys Asp Ile Pro Phe Lys Pro Gly Asp Thr Ile Gln385 390 395 400ggg atg ctg gaa ctc ccc gtg acc tgg taa 1230Gly Met Leu Glu Leu Pro Val Thr Trp405 410<210>140<211>1278<212>DNA<213>津島鏈霉菌(Streptmyces tsusimaensis)IFO 13782T<220>
<221>CDS<222>(1)..(1278)
<400>140atg acg gaa tcc acg aca gat ccg acg acc cgc cag gcc ctc ggc tcc 48Met Thr Glu Ser Thr Thr Asp Pro Thr Thr Arg Gln Ala Leu Gly Ser1 5 10 15acc acc ccc gcc gct gcc acc gcg acc gcc atc gac ccg acc ctc gcg 96Thr Thr Pro Ala Ala Ala Thr Ala Thr Ala Ile Asp Pro Thr Leu Ala20 25 30aca ccc ttc ccg cag gac cgg ggg tgc ccg tac cac ccg ccc gcc ggg144Thr Pro Phe Pro Gln Asp Arg Gly Cys Pro Tyr His Pro Pro Ala Gly35 40 45tac gcg ccg ctg cgt gag ggc cga ccg ctc agc agg gtc gcc ctc ttc192Tyr Ala Pro Leu Arg Glu Gly Arg Pro Leu Ser Arg Val Ala Leu Phe50 55 60gac ggg cgc ccg gtc tgg gcg gtc acc gga cac gcc ctg gcc cgc cgg240Asp Gly Arg Pro Val Trp Ala Val Thr Gly His Ala Leu Ala Arg Arg65 70 75 80ttg ctg gcc gat cca cgg ctc tcc acc gac cgt acc cac ccg gac ttc288Leu Leu Ala Asp Pro Arg Leu Ser Thr Asp Arg Thr His Pro Asp Phe85 90 95ccc gcc ccg gcc ccg cgc ttc gcc aac gcg aac cgg cgc cgc gtg gcc336Pro Ala Pro Ala Pro Arg Phe Ala Asn Ala Asn Arg Arg Arg Val Ala100 105 110ctg ctc ggc gtc gac gac ccc gag cac aac acc cag cgc aga atg ctc384Leu Leu Gly Val Asp Asp Pro Glu His Asn Thr Gln Arg Arg Met Leu115 120 125atc ccg gcc ttc tcc gtg aag cgg atc aac gct ctc cgc ccc cgc atc432Ile Pro Ala Phe Ser Val Lys Arg Ile Asn Ala Leu Arg Pro Arg Ile130 135 140cag gag acc gtg gac cgg ttg ctc gac gcg atg gag cgc cag ggg cca480Gln Glu Thr Val Asp Arg Leu Leu Asp Ala Met Glu Arg Gln Gly Pro145 150 155 160ccg gcc gag ctg gtg agc gcg ttc gcc ctg ccg gtg ccg tcg atg gtg528Pro Ala Glu Leu Val Ser Ala Phe Ala Leu Pro Val Pro Ser Met Val165 170 175atc tgc tcc ctg ctc gga gtg ccg tac gcc gac cac gag ttc ttc gag576Ile Cys Ser Leu Leu Gly Val Pro Tyr Ala Asp His Glu Phe Phe Glu180 185 190gag cgc tcg cgg cgg ctc ctg cgc ggc ccc ggc gcg gcc gac gtg gac624Glu Arg Ser Arg Arg Leu Leu Arg Gly Pro Gly Ala Ala Asp Val Asp195 200 205agg gcc ctc gac gaa ctc gag gag tac ctc ggc gcg ctg atc gac cgc672Arg Ala Leu Asp Glu Leu Glu Glu Tyr Leu Gly Ala Leu Ile Asp Arg210 215 220aag cgt acg gaa ccg ggc gac ggc ctc ctc gac gag ctg atc cac cgc720Lys Arg Thr Glu Pro Gly Asp Gly Leu Leu Asp Glu Leu Ile His Arg225 230 235 240gac cac ccc ggc gga ccg gtc gac cgc gag gag ctg gtc tcg ttc gcc768Asp His Pro Gly Gly Pro Val Asp Arg Glu Glu Leu Val Ser Phe Ala245 250 255gtg atc ctg ctc atc gcg ggg cac gag acg acg gcg aac atg atc tcg816Val Ile Leu Leu Ile Ala Gly His Glu Thr Thr Ala Asn Met Ile Ser260 265 270ctc ggc acc ttc acc ctg ctg cgc cac ccc gaa cag ctc gcg gcg ctg864Leu Gly Thr Phe Thr Leu Leu Arg His Pro Glu Gln Leu Ala Ala Leu275 280 285cgg gcc ggc ggg acg acc acg gcc gtg gcg gtc gag gaa ctg ttg cgg912Arg Ala Gly Gly Thr Thr Thr Ala Val Ala Val Glu Glu Leu Leu Arg
290 295 300ttc ctc tcc atc gcc gac ggc ctg cag cgg ctg gcg acc gag gac atc 960Phe Leu Ser Ile Ala Asp Gly Leu Gln Arg Leu Ala Thr Glu Asp Ile305 310 315 320gag gtg ccg gac gcc ggg gtg acg atc cgc aag ggc gaa ggt gtg gtc1008Glu Val Pro Asp Ala Gly Val Thr Ile Arg Lys Gly Glu Gly Val Val325 330 335ttc tcg acc tcg ctc atc aac cgc gac gac ggc gtg ttc ccg cag ccc1056Phe Ser Thr Ser Leu Ile Asn Arg Asp Asp Gly Val Phe Pro Gln Pro340 345 350gaa acg ctc gac tgg gac cgc ccg gcc cgt cac cat ctc gcc ttc ggc1104Glu Thr Leu Asp Trp Asp Arg Pro Ala Arg His His Leu Ala Phe Gly355 360 365ttc ggc gta cac cag tgc ctg ggg cag aac ctg gcc cgc gcg gaa ctc1152Phe Gly Val His Gln Cys Leu Gly Gln Asn Leu Ala Arg Ala Glu Leu370 375 380gac atc gcg atg cgc acg ctc ttc gag cgg ctg ccg ggc ctc cgg ctc1200Asp Ile Ala Met Arg Thr Leu Phe Glu Arg Leu Pro Gly Leu Arg Leu385 390 395 400gcc gta ccc gcg cag gag atc ccc cat aaa ccg ggg gac acg atc cag1248Ala Val Pro Ala Gln Glu Ile Pro His Lys Pro Gly Asp Thr Ile Gln405 410 415ggc atg ctc gaa ctg ccc gtg gcc tgg tga1278Gly Met Leu Glu Leu Pro Val Ala Trp420 425<210>141<211>1209<212>DNA<213>熱淡天藍(lán)鏈霉菌(Streptmyces thermocoerulescens)IFO 14273t<220>
<221>CDS<222>(1)..(1209)<400>141atg acg gac atg acg gaa acc ccc acc gtc gcc ttt ccc cag agc cgg 48Met Thr Asp Met Thr Glu Thr Pro Thr Val Ala Phe Pro Gln Ser Arg1 5 10 15acc tgt ccg tac cac ccg ccc gcc gcc tac gcc ccg ctg cgc gac acc 96Thr Cys Pro Tyr His Pro Pro Ala Ala Tyr Ala Pro Leu Arg Asp Thr20 25 30cgc ccg ctg gcc cgc gcc cgt ctc tac gac ggc cgc ctc gtc tgg acg 144Arg Pro Leu Ala Arg Ala Arg Leu Tyr Asp Gly Arg Leu Val Trp Thr35 40 45gtc acc ggt cac ggc ctc gcc cgc acc ctg ctc gcc gac ccc cgc ctg 192Val Thr Gly His Gly Leu Ala Arg Thr Leu Leu Ala Asp Pro Arg Leu50 55 60tcc acc gac ccc acc cgg ccg gag ttc ccc gcc acc acg gaa cgc atc 240Ser Thr Asp Pro Thr Arg Pro Glu Phe Pro Ala Thr Thr Glu Arg Ile65 70 75 80gcc cgg atc cgg cgc cgc cgg acc gcc ctg ctg ggc gtc gac gac ccc 288Ala Arg Ile Arg Arg Arg Arg Thr Ala Leu Leu Gly Val Asp Asp Pro85 90 95gaa cac cgc gtc cag cgg cgc atg atg gtc ccc agc ttc acc ctc cag 336Glu His Arg Val Gln Arg Arg Met Met Val Pro Ser Phe Thr Leu Gln100 105 110cgc gcc acc gcg ctg cgc ccc cgg atc cag cgg gtc gtc gac gaa cgc 384Arg Ala Thr Ala Leu Arg Pro Arg Ile Gln Arg Val Val Asp Glu Arg115 120 125
ctc gac gcg atg atc gcc ggc ggc ccg ccc gcc gat ctc gtc acc gcg432Leu Asp Ala Met Ile Ala Gly Gly Pro Pro Ala Asp Leu Val Thr Ala130 135 140ttc gcg ctg ccg gtg ccg tcc atg gtg atc tgc gcc ctg ctc ggc gtg480Phe Ala Leu Pro Val Pro Ser Met Val Ile Cys Ala Leu Leu Gly Val145 150 155 160ccc tac gag gac cac gac ttc ttc gag gag cag tca cgc cgg ctg ctg528Pro Tyr Glu Asp His Asp Phe Phe Glu Glu Gln Ser Arg Arg Leu Leu165 170 175cgc ggc ccg acg gcc gag gac tcc atg gac gcc cgc gcc cga atg gag576Arg Gly Pro Thr Ala Glu Asp Ser Met Asp Ala Arg Ala Arg Met Glu180 185 190gcc tac ttc gac gag ctg atc gac cgc aag cag cgg cag gac gcg ccc624Ala Tyr Phe Asp Glu Leu Ile Asp Arg Lys Gln Arg Gln Asp Ala Pro195 200 205ggt gac ggc gtc ctg gac gaa ctc gtc cac cag cgg ctg gcc gcg ggc672Gly Asp Gly Val Leu Asp Glu Leu Val His Gln Arg Leu Ala Ala Gly210 215 220gag ctg gac cgc gag ggg ctc atc gcc atg gcg atc atc ctg ctc gtc720Glu Leu Asp Arg Glu Gly Leu Ile Ala Met Ala Ile Ile Leu Leu Val225 230 235 240gcc ggt cac gag acg acc gcc aac atg atc tcg ctc ggc acc ttc acg768Ala Gly His Glu Thr Thr Ala Asn Met Ile Ser Leu Gly Thr Phe Thr245 250 255ctg ctc ggg cac ccc gag cgg ctg gcc gag ctg cgc gcc gac ccg gac816Leu Leu Gly His Pro Glu Arg Leu Ala Glu Leu Arg Ala Asp Pro Asp260 265 270ctg gtg ccc gcg gcc gtc gag gag ctg ctg cgc atg ctg tcc atc gcg864Leu Val Pro Ala Ala Val Glu Glu Leu Leu Arg Met Leu Ser Ile Ala275 280 285gac ggc ctg ctg cgc gtc gcc gtc gag gac atc gag gtg gcc ggg gag912Asp Gly Leu Leu Arg Val Ala Val Glu Asp Ile Glu Val Ala Gly Glu290 295 300acg atc cgc gcg ggc gac ggc gtc atc ttc tcg acg tcg gtc atc aac960Thr Ile Arg Ala Gly Asp Gly Val Ile Phe Ser Thr Ser Val Ile Asn305 310 315 320cgg gac gag gcc gtc tac ccc gaa ccc gac acc ctg gac ctg cac cgc 1008Arg Asp Glu Ala Val Tyr Pro Glu Pro Asp Thr Leu Asp Leu His Arg325 330 335ccg gcc cgg cac cac gtc gcc ttc ggg ttc ggc atc cac cag tgc ctc 1056Pro Ala Arg His His Val Ala Phe Gly Phe Gly Ile His Gln Cys Leu340 345 350ggg cag aac ctg gcc cgc gcc gag atg gag atc gcc ctg cgc acc ctg 1104Gly Gln Asn Leu Ala Arg Ala Glu Met Glu Ile Ala Leu Arg Thr Leu355 360 365ttc ggc cgc ctg ccc gga ctg cgt ctg gcg gtc ccc ccg gag gaa atc 1152Phe Gly Arg Leu Pro Gly Leu Arg Leu Ala Val Pro Pro Glu Glu Ile370 375 380ccg ttc aaa ccc ggc gac acg atc cag ggg atg ctg gaa ctc ccc gtg 1200Pro Phe Lys Pro Gly Asp Thr Ile Gln Gly Met Leu Glu Leu Pro Val385 390 395 400acc tgg taa 1209Thr Trp<210>142<211>1230
<213>球團(tuán)產(chǎn)色鏈霉菌(Streptmyces glomerochromogenes)IFO 13673T<220>
<221>CDS<222>(1)..(1230)<400>142atg acg gaa ctg acg gac atc acc ggc ccg gct ggc cag gcc caa ccc 48Met Thr Glu Leu Thr Asp Ile Thr Gly Pro Ala Gly Gln Ala Gln Pro1 5 10 15gtc gca ttc ccc cag gac cgc acc tgt ccc tac cac ccc ccc acc gga 96Val Ala Phe Pro Gln Asp Arg Thr Cys Pro Tyr His Pro Pro Thr Gly20 25 30tac gac ccg ctg cgc gac ggg cga ccc ctg tcc cgc gtc acc ctc tac144Tyr Asp Pro Leu Arg Asp Gly Arg Pro Leu Ser Arg Val Thr Leu Tyr35 40 45gac ggc cgc gag gtc tgg ctg gtc acc gcc cag gcc acc gcc cgc gcc192Asp Gly Arg Glu Val Trp Leu Val Thr Ala Gln Ala Thr Ala Arg Ala50 55 60ctg ctc gcc gac ccc cgg ctg tcc acc gac cgc cgc cgc gac ggc ttt240Leu Leu Ala Asp Pro Arg Leu Ser Thr Asp Arg Arg Arg Asp Gly Phe65 70 75 80ccc gtg ccc agc ccc cgc ttc gag gcc ggc cgc gac cgc aaa ctg gcc288Pro Val Pro Ser Pro Arg Phe Glu Ala Gly Arg Asp Arg Lys Leu Ala85 90 95ctg ctc ggg ctg gac gac ccc gag cac cac cag cag cgc cgg atg ctg336Leu Leu Gly Leu Asp Asp Pro Glu His His Gln Gln Arg Arg Met Leu100 105 110atc ccg tcg ttc acc gtc aaa cgc gcc acc gcg cta cgc ccc tgg atc384Ile Pro Ser Phe Thr Val Lys Arg Ala Thr Ala Leu Arg Pro Trp Ile115 120 125cag cgg atc gtc gac gaa ctg ctg gac gac atg atc gcc cgg ggg ccg432Gln Arg Ile Val Asp Glu Leu Leu Asp Asp Met Ile Ala Arg Gly Pro130 135 140gtc gcc gac ctc gtg tcc gcg ttc gcg ctg ccc gtg ccg tcc atg gtc480Val Ala Asp Leu Val Ser Ala Phe Ala Leu Pro Val Pro Ser Met Val145 150 155 160atc tgc gaa ctg ctc ggc gtg ccc tac gcc gac cac gag ttc ttc gag528Ile Cys Glu Leu Leu Gly Val Pro Tyr Ala Asp His Glu Phe Phe Glu165 170 175gaa cag tcc cgc cgg ctg ctg cgc ggc ccg ggc ggc gcc gac acc ctg576Glu Gln Ser Arg Arg Leu Leu Arg Gly Pro Gly Gly Ala Asp Thr Leu180 185 190gac gcc cgg gac cgg ctg gag gcg tac ctc ggc gag ctg atc gac gcc624Asp Ala Arg Asp Arg Leu Glu Ala Tyr Leu Gly Glu Leu Ile Asp Ala195 200 205aag gcc aag gag gcc gag ccc ggc gac ggc gtt ctg gac gac ctg gtc672Lys Ala Lys Glu Ala Glu Pro Gly Asp Gly Val Leu Asp Asp Leu Val210 215 220cac aac cgg ctc cgc gcg ggc gag ctg gac cgg acc gac ctg gtg tcg720His Asn Arg Leu Arg Ala Gly Glu Leu Asp Arg Thr Asp Leu Val Ser225 230 235 240ctc gcc ctc atc ctg ctg gtc gcc ggg cac gag acg acc gcc aac atg768Leu Ala Leu Ile Leu Leu Val Ala Gly His Glu Thr Thr Ala Asn Met245 250 255atc tcc ctg ggc acc tac acc ctg ctc cag cac ccc gaa cgg ctg gcc816Ile Ser Leu Gly Thr Tyr Thr Leu Leu Gln His Pro Glu Arg Leu Ala260 265 270
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<221>CDS<222>(1)..(1230)<400>143atg acg gaa ctg acg gac atc acc ggc ccg gct ggc cag gcc gaa ccc 48Met Thr Glu Leu Thr Asp Ile Thr Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro1 5 10 15gtc gca ttc ccc cag gac cgc acc tgt ccc tac cac ccc ccc acc gga 96Val Ala Phe Pro Gln Asp Arg Thr Cys Pro Tyr His Pro Pro Thr Gly20 25 30tac gac ccg ctg cgc gac ggg cga ccc ctg tcc cgc gtc acc ctc tac 144Tyr Asp Pro Leu Arg Asp Gly Arg Pro Leu Ser Arg Val Thr Leu Tyr35 40 45gac ggc cgc gag gtc tgg ctg gtc acc gcc cag gcc acc gcc cgc gcc 192Asp Gly Arg Glu Val Trp Leu Val Thr Ala Gln Ala Thr Ala Arg Ala50 55 60ctg ctc gcc gac ccc cgg ctg tcc acc gac cgc cgc cgc gac ggt ttt 240Leu Leu Ala Asp Pro Arg Leu Ser Thr Asp Arg Arg Arg Asp Gly Phe65 70 75 80ccc gtg ccc agc ccc cgc ttc gag gcc ggc cgc gac cgc aaa ctg gcc 288Pro Val Pro Ser Pro Arg Phe Glu Ala Gly Arg Asp Arg Lys Leu Ala85 90 95ctg ctc ggg ctg gac gac ccc gag cac cac cag cag cgc cgg atg ctg 336Leu Leu Gly Leu Asp Asp Pro Glu His His Gln Gln Arg Arg Met Leu100 105 110
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<210>144<211>1449<212>DNA<213>黑胡桃鏈霉菌(Streptmyces nogalater)IFO 13445<220>
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<221>CDS<222>(1243)..(1449)<400>144atg acg gaa ctg acg gac acc acc ggc ccg gcc gac gcg gcc gaa ccc 48Met Thr Glu Leu Thr Asp Thr Thr Gly Pro Ala Asp Ala Ala Glu Pro1 5 10 15gtc gca ttc ccc cag gac cgc acc tgc ccc tac cac ccc ccg acc ggc 96Val Ala Phe Pro Gln Asp Arg Thr Cys Pro Tyr His Pro Pro Thr Gly20 25 30tac gac ccg ctg cgc gac ggg cgg ccc ctg tcc cgg gtc acc ctc tac144Tyr Asp Pro Leu Arg Asp Gly Arg Pro Leu Ser Arg Val Thr Leu Tyr35 40 45gac ggc cgt gag gtc tgg ctg gtc acc gcg cag gcc acc gcc cgc acc192Asp Gly Arg Glu Val Trp Leu Val Thr Ala Gln Ala Thr Ala Arg Thr50 55 60ctg ctc gcc gac ccc cgg ctg tcc acc gac cgc cgc cgc gac ggc ttc240Leu Leu Ala Asp Pro Arg Leu Ser Thr Asp Arg Arg Arg Asp Gly Phe65 70 75 80ccc gtg ccc acc ccc cgc ttc gag ggc gga cgc gac cgc aag ctg gcc288Pro Val Pro Thr Pro Arg Phe Glu Gly Gly Arg Asp Arg Lys Leu Ala85 90 95ctg ctc gga ctg gac gac ccc gag cac cag cag cag cgc cgg atg ctg336Leu Leu Gly Leu Asp Asp Pro Glu His Gln Gln Gln Arg Arg Met Leu100 105 110atc ccg tcg ttc acc gtg aaa cgc gcc acc gcg cta cgc ccc tgg atc384Ile Pro Ser Phe Thr Val Lys Arg Ala Thr Ala Leu Arg Pro Trp Ile115 120 125cag cgg atc gtc gac gga ctg ctg gac gcc atg atc acc cgg ggg ccg432Gln Arg Ile Val Asp Gly Leu Leu Asp Ala Met Ile Thr Arg Gly Pro130 135 140gtc gcc gac ctc gtg tcc gcc ttc gcg ctg ccc gtg ccg tcc atg gtc480Val Ala Asp Leu Val Ser Ala Phe Ala Leu Pro Val Pro Ser Met Val145 150 155 160atc tgc gaa ctg ctc ggc gtg ccc tac gcc gac cac gag ttc ttc gag528Ile Cys Glu Leu Leu Gly Val Pro Tyr Ala Asp His Glu Phe Phe Glu165 170 175gag cag tcc cgc cga ctg ctg agc gcc tcg acc agc gcc gac acc ctg576Glu Gln Ser Arg Arg Leu Leu Ser Ala Ser Thr Ser Ala Asp Thr Leu180 185 190gac gcc cgg gac cgg ctg gag acg tac ctc ggc gac ctg atc gac gcc624Asp Ala Arg Asp Arg Leu Glu Thr Tyr Leu Gly Asp Leu Ile Asp Ala195 200 205aag gcc aag gag gcc gag ccc ggc gac ggc atc ctg gac gag ctc gtc672Lys Ala Lys Glu Ala Glu Pro Gly Asp Gly Ile Leu Asp Glu Leu Val210 215 220cac aac cgg ctc cgc aag ggc gag ctg gac cgg acc gac ctg gtg tcg720His Asn Arg Leu Arg Lys Gly Glu Leu Asp Arg Thr Asp Leu Val Ser225 230 235 240
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<221>CDS
<222>(1284)..(1480)<400>145atg acg gaa tcc acg aca gat ccg acg acc cgc cag gcc ctc ggc tcc 48Met Thr Glu Ser Thr Thr Asp Pro Thr Thr Arg Gln Ala Leu Gly Ser1 5 10 15acc acc ccc gcc gct gcc acc gcg acc gcc atc gac ccg acc ctc gcg 96Thr Thr Pro Ala Ala Ala Thr Ala Thr Ala Ile Asp Pro Thr Leu Ala20 25 30aca ccc ttc ccg cag gac cgg ggg tgc ccg tac cac ccg ccc gcc ggg144Thr Pro Phe Pro Gln Asp Arg Gly Cys Pro Tyr His Pro Pro Ala Gly35 40 45tac gcg ccg ctg cgt gag ggc cga ccg ctc agc agg gtc gcc ctc ttc192Tyr Ala Pro Leu Arg Glu Gly Arg Pro Leu Ser Arg Val Ala Leu Phe50 55 60gac ggg cgc ccg gtc tgg gcg gtc acc gga cac gcc ctg gcc cgc cgg240Asp Gly Arg Pro Val Trp Ala Val Thr Gly His Ala Leu Ala Arg Arg65 70 75 80ttg ctg gcc gat cca cgg ctc tcc acc gac cgt acc cac ccg gac ttc288Leu Leu Ala Asp Pro Arg Leu Ser Thr Asp Arg Thr His Pro Asp Phe85 90 95ccc gcc ccg gcc ccg cgc ttc gcc aac gcg aac cgg cgc cgc gtg gcc336Pro Ala Pro Ala Pro Arg Phe Ala Asn Ala Asn Arg Arg Arg Val Ala100 105 110ctg ctc ggc gtc gac gac ccc gag cac aac acc cag cgc aga atg ctc384Leu Leu Gly Val Asp Asp Pro Glu His Asn Thr Gln Arg Arg Met Leu115 120 125atc ccg gcc ttc tcc gtg aag cgg atc aac gct ctc cgc ccc cgc atc432Ile Pro Ala Phe Ser Val Lys Arg Ile Asn Ala Leu Arg Pro Arg Ile130 135 140cag gag acc gtg gac cgg ttg ctc gac gcg atg gag cgc cag ggg cca480Gln Glu Thr Val Asp Arg Leu Leu Asp Ala Met Glu Arg Gln Gly Pro145 150 155 160ccg gcc gag ctg gtg agc gcg ttc gcc ctg ccg gtg ccg tcg atg gtg528Pro Ala Glu Leu Val Ser Ala Phe Ala Leu Pro Val Pro Ser Met Val165 170 175atc tgc tcc ctg ctc gga gtg ccg tac gcc gac cac gag ttc ttc gag576Ile Cys Ser Leu Leu Gly Val Pro Tyr Ala Asp His Glu Phe Phe Glu180 185 190gag cgc tcg cgg cgg ctc ctg cgc ggc ccc ggc gcg gcc gac gtg gac624Glu Arg Ser Arg Arg Leu Leu Arg Gly Pro Gly Ala Ala Asp Val Asp195 200 205agg gcc ctc gac gaa ctc gag gag tac ctc ggc gcg ctg atc gac cgc672Arg Ala Leu Asp Glu Leu Glu Glu Tyr Leu Gly Ala Leu Ile Asp Arg210 215 220aag cgt acg gaa ccg ggc gac ggc ctc ctc gac gag ctg atc cac cgc720Lys Arg Thr Glu Pro Gly Asp Gly Leu Leu Asp Glu Leu Ile His Arg225 230 235 240gac cac ccc ggc gga ccg gtc gac cgc gag gag ctg gtc tcg ttc gcc768Asp His Pro Gly Gly Pro Val Asp Arg Glu Glu Leu Val Ser Phe Ala245 250 255gtg atc ctg ctc atc gcg ggg cac gag acg acg gcg aac atg atc tcg816Val Ile Leu Leu Ile Ala Gly His Glu Thr Thr Ala Asn Met Ile Ser260 265 270ctc ggc acc ttc acc ctg ctg cgc cac ccc gaa cag ctc gcg gcg ctg864Leu Gly Thr Phe Thr Leu Leu Arg His Pro Glu Gln Leu Ala Ala Leu275 280 285
cgg gcc ggc ggg acg acc acg gcc gtg gcg gtc gag gaa ctg ttg cgg 912Arg Ala Gly Gly Thr Thr Thr Ala Val Ala Val Glu Glu Leu Leu Arg290 295 300ttc ctc tcc atc gcc gac ggc ctg cag cgg ctg gcg acc gag gac atc 960Phe Leu Ser Ile Ala Asp Gly Leu Gln Arg Leu Ala Thr Glu Asp Ile305 310 315 320gag gtg ccg gac gcc ggg gtg acg atc cgc aag ggc gaa ggt gtg gtc1008Glu Val Pro Asp Ala Gly Val Thr Ile Arg Lys Gly Glu Gly Val Val325 330 335ttc tcg acc tcg ctc atc aac cgc gac gac ggc gtg ttc ccg cag ccc1056Phe Ser Thr Ser Leu Ile Asn Arg Asp Asp Gly Val Phe Pro Gln Pro340 345 350gaa acg ctc gac tgg gac cgc ccg gcc cgt cac cat ctc gcc ttc ggc1104Glu Thr Leu Asp Trp Asp Arg Pro Ala Arg His His Leu Ala Phe Gly355 360 365ttc ggc gta cac cag tgc ctg ggg cag aac ctg gcc cgc gcg gaa ctc1152Phe Gly Val His Gln Cys Leu Gly Gln Asn Leu Ala Arg Ala Glu Leu370 375 380gac atc gcg atg cgc acg ctc ttc gag cgg ctg ccg ggc ctc cgg ctc1200Asp Ile Ala Met Arg Thr Leu Phe Glu Arg Leu Pro Gly Leu Arg Leu385 390 395 400gcc gta ccc gcg cag gag atc ccc cat aaa ccg ggg gac acg atc cag1248Ala Val Pro Ala Gln Glu Ile Pro His Lys Pro Gly Asp Thr Ile Gln405 410 415ggc atg ctc gaa ctg ccc gtg gcc tgg tga gcggc atg ggc gtc cag gtc 1298Gly Met Leu Glu Leu Pro Val Ala Trp Met Gly Val Gln Val420 425 430gac agg gaa cgc tgc gtg ggg gcg ggc atg tgc gcg ctg acc gcg ccg1346Asp Arg Glu Arg Cys Val Gly Ala Gly Met Cys Ala Leu Thr Ala Pro435 440 445gac gtg ttc acg cag gac gac gac ggc ctc agc gag gtg ctc ccg ggc1394Asp Val Phe Thr Gln Asp Asp Asp Gly Leu Ser Glu Val Leu Pro Gly450 455 460cgc gcg gag acc gct gga gga cat ccc ttg gtg ggg gag gct gta cgg1442Arg Ala Glu Thr Ala Gly Gly His Pro Leu Val Gly Glu Ala Val Arg465 470 475gcc tgc ccg gtg ggg gcg gtg gcc ctg tcc gcc gac tg 1480Ala Cys Pro Val Gly Ala Val Ala Leu Ser Ala Asp480 485 490<210>146<211>1473<212>DNA<213>熱淡天藍(lán)鏈霉菌(Streptomyces thermocoerulescens)IFO 14273t<220>
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<221>CDS<222>(1)..(207)<400>157atg cac atg gac atc gac atc gac cag gac gtc tgt atc ggc gcc ggg 48Met His Met Asp Ile Asp Ile Asp Gln Asp Val Cys Ile Gly Ala Gly1 5 10 15cag tgc gcg ctg gcg gca ccg ggc gtc ttc acc cag gac gac gac ggc 96Gln Cys Ala Leu Ala Ala Pro Gly Val Phe Thr Gln Asp Asp Asp Gly20 25 30tac agc acc ctg ctg ccc ggc cag gag aac ggc gtc acc gac ccg atg144Tyr Ser Thr Leu Leu Pro Gly Gln Glu Asn Gly Val Thr Asp Pro Met35 40 45gtc cgg gag gcc gcc cgc gcc tgc ccg gtc agc gcc atc acc gta cgg192Val Arg Glu Ala Ala Arg Ala Cys Pro Val Ser Ala Ile Thr Val Arg50 55 60gag cgc acc gcc tga207Glu Arg Thr Ala
65<210>158<211>207<212>DNA<213>橄欖產(chǎn)色鏈霉菌(Streptmyces olivochromogenes)IFO 12444<220>
<221>CDS<222>(1)..(207)<400>158atg cac atg gac atc gac atc gac cag gac atc tgt atc ggc gcc ggg 48Met His Met Asp Ile Asp Ile Asp Gln Asp Ile Cys Ile Gly Ala Gly1 5 10 15cag tgc gcg ctg gcg gca ccg ggc gtc ttc acc cag gac gac gac ggc 96Gln Cys Ala Leu Ala Ala Pro Gly Val Phe Thr Gln Asp Asp Asp Gly20 25 30tac agc acc ctg ctg ccc ggc cag gag aac ggc gtc acc gac ccg atg144Tyr Ser Thr Leu Leu Pro Gly Gln Glu Asn Gly Val Thr Asp Pro Met35 40 45gtc cgg gag gcc gcc cgc gcc tgc ccg gtc agc gcc atc acc gta cgg192Val Arg Glu Ala Ala Arg Ala Cys Pro Val Ser Ala Ile Thr Val Arg50 55 60gag cgc acc gcc tga207Glu Arg Thr Ala65<210>159<211>409<212>PRT<213>黑胡桃鏈霉菌(Streptmyces nogalater)IFO 13445<400>159Met Thr Glu Leu Thr Asp Thr Thr Gly Pro Ala Asp Ala Ala Glu Pro1 5 10 15Val Ala Phe Pro Gln Asp Arg Thr Cys Pro Tyr His Pro Pro Thr Gly20 25 30Tyr Asp Pro Leu Arg Asp Gly Arg Pro Leu Ser Arg Val Thr Leu Tyr35 40 45Asp Gly Arg Glu Val Trp Leu Val Thr Ala Gln Ala Thr Ala Arg Thr50 55 60Leu Leu Ala Asp Pro Arg Leu Ser Thr Asp Arg Arg Arg Asp Gly Phe65 70 75 80Pro Val Pro Thr Pro Arg Phe Glu Gly Gly Arg Asp Arg Lys Leu Ala85 90 95Leu Leu Gly Leu Asp Asp Pro Glu His Gln Gln Gln Arg Arg Met Leu100 105 110Ile Pro Ser Phe Thr Val Lys Arg Ala Thr Ala Leu Arg Pro Trp Ile115 120 125Gln Arg Ile Val Asp Gly Leu Leu Asp Ala Met Ile Thr Arg Gly Pro130 135 140Val Ala Asp Leu Val Ser Ala Phe Ala Leu Pro Val Pro Ser Met Val145 150 155 160Ile Cys Glu Leu Leu Gly Val Pro Tyr Ala Asp His Glu Phe Phe Glu165 170 175Glu Gln Ser Arg Arg Leu Leu Ser Ala Ser Thr Ser Ala Asp Thr Leu180 185 190Asp Ala Arg Asp Arg Leu Glu Thr Tyr Leu Gly Asp Leu Ile Asp Ala195 200 205Lys Ala Lys Glu Ala Glu Pro Gly Asp Gly Ile Leu Asp Glu Leu Val210 215 220His Asn Arg Leu Arg Lys Gly Glu Leu Asp Arg Thr Asp Leu Val Ser225 230 235 240Leu Ala Val Ile Leu Leu Val Ala Gly His Glu Thr Thr Ala Asn Met245 250 255Ile Ser Leu Gly Thr Tyr Thr Leu Leu Gln His Pro Glu Arg Leu Ala260 265 270Glu Leu Arg Ala Asp Pro Ala Leu Leu Pro Ala Val Val Glu Glu Leu275 280 285Leu Arg Met Leu Ser Ile Ala Glu Gly Leu Gln Arg Val Ala Leu Glu
290 295 300Asp Ile Glu Ile Asp Gly Thr Thr Ile Arg Ala Gly Asp Gly Val Leu305 310 315 320Phe Ser Thr Ser Val Ile Asn Arg Asp Thr Ala Val Tyr Asp Asp Pro325 330 335Asp Asp Leu Asp Phe His Arg Ala Asp Arg His His Val Ala Phe Gly340 345 350Phe Gly Ile His Gln Cys Leu Gly Gln Asn Leu Ala Arg Ala Glu Leu355 360 365Glu Ile Ala Leu Gly Ser Leu Phe Thr Arg Leu Pro Gly Leu Arg Leu370 375 380Ala Val Pro Ala Lys Asp Ile Pro Phe Lys Pro Gly Asp Thr Ile Gln385 390 395 400Gly Met Leu Glu Leu Pro Val Thr Trp405<210>160<211>425<212>PRT<213>津島鏈霉菌(Streptmyces tsusimaensis)IFO 13782T<400>160Met Thr Glu Ser Thr Thr Asp Pro Thr Thr Arg Gln Ala Leu Gly Ser1 5 10 15Thr Thr Pro Ala Ala Ala Thr Ala Thr Ala Ile Asp Pro Thr Leu Ala20 25 30Thr Pro Phe Pro Gln Asp Arg Gly Cys Pro Tyr His Pro Pro Ala Gly35 40 45Tyr Ala Pro Leu Arg Glu Gly Arg Pro Leu Ser Arg Val Ala Leu Phe50 55 60Asp Gly Arg Pro Val Trp Ala Val Thr Gly His Ala Leu Ala Arg Arg65 70 75 80Leu Leu Ala Asp Pro Arg Leu Ser Thr Asp Arg Thr His Pro Asp Phe85 90 95Pro Ala Pro Ala Pro Arg Phe Ala Asn Ala Asn Arg Arg Arg Val Ala100 105 110Leu Leu Gly Val Asp Asp Pro Glu His Asn Thr Gln Arg Arg Met Leu115 120 125Ile Pro Ala Phe Ser Val Lys Arg Ile Asn Ala Leu Arg Pro Arg Ile130 135 140Gln Glu Thr Val Asp Arg Leu Leu Asp Ala Met Glu Arg Gln Gly Pro145 150 155 160Pro Ala Glu Leu Val Ser Ala Phe Ala Leu Pro Val Pro Ser Met Val165 170 175Ile Cys Ser Leu Leu Gly Val Pro Tyr Ala Asp His Glu Phe Phe Glu180 185 190Glu Arg Ser Arg Arg Leu Leu Arg Gly Pro Gly Ala Ala Asp Val Asp195 200 205Arg Ala Leu Asp Glu Leu Glu Glu Tyr Leu Gly Ala Leu Ile Asp Arg210 215 220Lys Arg Thr Glu Pro Gly Asp Gly Leu Leu Asp Glu Leu Ile His Arg225 230 235 240Asp His Pro Gly Gly Pro Val Asp Arg Glu Glu Leu Val Ser Phe Ala245 250 255Val Ile Leu Leu Ile Ala Gly His Glu Thr Thr Ala Asn Met Ile Ser260 265 270Leu Gly Thr Phe Thr Leu Leu Arg His Pro Glu Gln Leu Ala Ala Leu275 280 285Arg Ala Gly Gly Thr Thr Thr Ala Val Ala Val Glu Glu Leu Leu Arg290 295 300Phe Leu Ser Ile Ala Asp Gly Leu Gln Arg Leu Ala Thr Glu Asp Ile305 310 315 320Glu Val Pro Asp Ala Gly Val Thr Ile Arg Lys Gly Glu Gly Val Val325 330 335Phe Ser Thr Ser Leu Ile Asn Arg Asp Asp Gly Val Phe Pro Gln Pro340 345 350Glu Thr Leu Asp Trp Asp Arg Pro Ala Arg His His Leu Ala Phe Gly355 360 365Phe Gly Val His Gln Cys Leu Gly Gln Asn Leu Ala Arg Ala Glu Leu370 375 380Asp Ile Ala Met Arg Thr Leu Phe Glu Arg Leu Pro Gly Leu Arg Leu385 390 395 400Ala Val Pro Ala Gln Glu Ile Pro His Lys Pro Gly Asp Thr Ile Gln405 410 415Gly Met Leu Glu Leu Pro Val Ala Trp
420 425<210>161<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>161agcagttcgc agatgaccat ggacggca 28<210>162<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>162tttcacggtg aacgacggga tcagcat27<210>163<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>163acgagacgac cgccaacatg atctccct 28<210>164<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>164tcctcttctc cacctcggtc atcaacc27<210>165<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>165ttcatatgac ggaactgacg gacacca27<210>166<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>166cgaagctttc aggcggtgcg ctcccgca 28<210>167<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物
<400>167agcaaccggt ccacggtctc ctggatg27<210>168<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>168gagagcgttg atccgcttca cggagaag 28<210>169<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>169caagggcgaa ggtgtggtct tctcgac27<210>170<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>170ctcatcaacc gcgacgacgg cgtgttc27<210>171<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>171accatatgac ggaatccacg acagatc27<210>172<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>172cgaagctttc agtcggcgga cagggccac 29<210>173<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>173ctcctcgaag aagtcgtggt cctcgta27<210>174<211>28<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>174atcatcgcgt cgaggcgttc gtcgacga 28<210>175<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>175ccaacatgat ctcgctcggc accttca27<210>176<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>176cgtcatcttc tcgacgtcgg tcatcaa27<210>177<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>177ctcatatgac ggacatgacg gaaaccccca 30<210>178<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>178cgaagctttc agacggcggc ctccgtca 28<210>179<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>179cagttcgtcg acgatccgct ggatcca27<210>180<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>180tttgacggtg aacgacggga tcagcat27<210>181<211>27<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>181gacatcgaga tcgacggcac caccatc27<210>182<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>182gtcctcttct ccacctcggt catcaac27<210>183<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>183cgaggtcttc atatgacgga actgacggac atc 33<210>184<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>184ccgccgaagc tttcaggcgg tgcgctcccg tac 33<210>185<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>185cgaggtcata tgacggaact gacggacatc 30<210>186<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為DNA測序設(shè)計的寡核苷酸引物<400>186atgctgatcc cgtcgttcac cgtgaaa27<210>187<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為DNA測序設(shè)計的寡核苷酸引物<400>187cttctccgtg aagcggatca acgctctc 28<210>188
<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為DNA測序設(shè)計的寡核苷酸引物<400>188tcgtcgacga acgcctcgac gcgatgat 28<210>189<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為DNA測序設(shè)計的寡核苷酸引物<400>189atggtcatct gcgaactgct cggcgtg27<210>190<211>78<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>190cgggatccca tatgacagat atgacagata ctgcagacgt taaaccacta tctgcaccag60ttgcatttcc tcaagata 78<210>191<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>191agttgcattt cctcaagata gaacctgtcc attccagcct cctactgggt atgatccact60tcgtgaagct 70<210>192<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>192atgatccact tcgtgaagct aggcctcttg ctagagttac actttacgat ggaagggcta60tctggcttgt 70<210>193<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>193gttgatgacc ctgaacatca cactcaaagg cggatgttag ttcctagctt tacactcaag60cgcgctgctg 70<210>194<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>194tacactcaag cgcgctgctg cgttgaggcc agccattcag aggattgtcg atgagtgcat60agatgctatg 70<210>195<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>195atgagtgcat agatgctatg ttagctaagg gaccacctgc agagttggtt aacgccttcg60cacttcccgt 70<210>196<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>196tgctacttag gagcactgat tgaccgcaag tccgaatcat ccgttggtga tggtgtcctc60gacgccttgg 70<210>197<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>197tggtgtcctc gacgccttgg ttcacgagca attgagagaa ggagctgtgg ataggcagga60ggctatcagc 70<210>198<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>198ataggcagga ggctatcagc ttggccacga ttctgttggt cgctggtcat gaaaccactg60ctaatatgat 70<210>199<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>199caagccacag aggacatcga ggtggcaggt actactatta gagccggtga aggcgtggtc60tttgcgacct 70<210>200<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>200aggcgtggtc tttgcgacct ctgtaatcaa cagagatggg gaggtttacg cagaacccga60cgccctcgat 70<210>201<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>201cagaacccga cgccctcgat tggcataggc ccaccagaca tcacgtggca ttcggctttg60gcattcatca 70<210>202<211>79<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>202accagatgct gtccgcttta aaccaggtga cacgattcag ggaatgctgg atcttcccgt60ggcctggtag aagcttggg 79<210>203<211>80<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>203gatggagata gcacttcgta gtttgttcga gagagtgcct gggttgagac tcgacattgc60accagatgct gtccgcttta80<210>204<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>204ttcggctttg gcattcatca atgtctcgga cagaatctag cacgtgccga gatggagata60gcacttcgta 70<210>205<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>205ctgttgatga gttgatgagg atgctttcta tagcggacgg gctgatgaga caagccacag60aggacatcga 70<210>206<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>206
ccccgagcga ctggcggaat tgagggatga cccgagtttg tggcctgctg ctgttgatga60gttgatgagg 70<210>207<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>207gaaaccactg ctaatatgat ctcattgggc acttatacat tactccaaca ccccgagcga60ctggcggaat 70<210>208<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>208tacgcggacg ggatgtggac gaggtgcgtg atgcaaggga ccagctcgat tgctacttag60gagcactgat 70<210>209<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>209tgtaccgtat gccgatcatg aattctttga ggaacaaagt cgtaggcttc tacgcggacg60ggatgtggac 70<210>210<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>210aacgccttcg cacttcccgt tccatcaatg gtgatatgtg aactgctcgg tgtaccgtat60gccgatcatg 70<210>211<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>211cctctccacg cattgtagca ttcagagacc gcagggctgc ccttcttaat gttgatgacc60ctgaacatca 70<210>212<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>212cgcagattca cgactatcgt ccgatagact tcgacctggc tttccagcta cctctccacg60cattgtagca 70
<210>213<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>213ggaagggcta tctggcttgt taccggacgt gaccttgcta gaagcctgct cgcagattca60cgactatcgt 70<210>214<211>1227<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(1227)<223>設(shè)計的編碼SEQ ID No.1的氨基酸序列的多核苷酸<400>214atg aca gat atg aca gat act gca gac gtt aaa cca cta tct gca cca 48Met Thr Asp Met Thr Asp Thr Ala Asp Val Lys Pro Leu Ser Ala Pro1 5 10 15gtt gca ttt cct caa gat aga acc tgt cca ttc cag cct cct act ggg 96Val Ala Phe Pro Gln Asp Arg Thr Cys Pro Phe Gln Pro Pro Thr Gly20 25 30tat gat cca ctt cgt gaa gct agg cct ctt gct aga gtt aca ctt tac 144Tyr Asp Pro Leu Arg Glu Ala Arg Pro Leu Ala Arg Val Thr Leu Tyr35 40 45gat gga agg gct atc tgg ctt gtt acc gga cgt gac ctt gct aga agc 192Asp Gly Arg Ala Ile Trp Leu Val Thr Gly Arg Asp Leu Ala Arg Ser50 55 60ctg ctc gca gat tca cga cta tcg tcc gat aga ctt cga cct ggc ttt 240Leu Leu Ala Asp Ser Arg Leu Ser Ser Asp Arg Leu Arg Pro Gly Phe65 70 75 80cca gct acc tct cca cgc att gta gca ttc aga gac cgc agg gct gcc 288Pro Ala Thr Ser Pro Arg Ile Val Ala Phe Arg Asp Arg Arg Ala Ala85 90 95ctt ctt aat gtt gat gac cct gaa cat cac act caa agg cgg atg tta 336Leu Leu Asn Val Asp Asp Pro Glu His His Thr Gln Arg Arg Met Leu100 105 110gtt cct agc ttt aca ctc aag cgc gct gct gcg ttg agg cca gcc att 384Val Pro Ser Phe Thr Leu Lys Arg Ala Ala Ala Leu Arg Pro Ala Ile115 120 125cag agg att gtc gat gag tgc ata gat gct atg tta gct aag gga cca 432Gln Arg Ile Val Asp Glu Cys Ile Asp Ala Met Leu Ala Lys Gly Pro130 135 140cct gca gag ttg gtt aac gcc ttc gca ctt ccc gtt cca tca atg gtg 480Pro Ala Glu Leu Val Asn Ala Phe Ala Leu Pro Val Pro Ser Met Val145 150 155 160ata tgt gaa ctg ctc ggt gta ccg tat gcc gat cat gaa ttc ttt gag 528Ile Cys Glu Leu Leu Gly Val Pro Tyr Ala Asp His Glu Phe Phe Glu165 170 175gaa caa agt cgt agg ctt cta cgc gga cgg gat gtg gac gag gtg cgt 576Glu Gln Ser Arg Arg Leu Leu Arg Gly Arg Asp Val Asp Glu Val Arg180 185 190gat gca agg gac cag ctc gat tgc tac tta gga gca ctg att gac cgc 624Asp Ala Arg Asp Gln Leu Asp Cys Tyr Leu Gly Ala Leu Ile Asp Arg195 200 205
aag tcc gaa tca tcc gtt ggt gat ggt gtc ctc gac gcc ttg gtt cac672Lys Ser Glu Ser Ser Val Gly Asp Gly Val Leu Asp Ala Leu Val His210 215 220gag caa ttg aga gaa gga gct gtg gat agg cag gag gct atc agc ttg720Glu Gln Leu Arg Glu Gly Ala Val Asp Arg Gln Glu Ala Ile Ser Leu225 230 235 240gcc acg att ctg ttg gtc gct ggt cat gaa acc act gct aat atg atc768Ala Thr Ile Leu Leu Val Ala Gly His Glu Thr Thr Ala Asn Met Ile245 250 255tca ttg ggc act tat aca tta ctc caa cac ccc gag cga ctg gcg gaa816Ser Leu Gly Thr Tyr Thr Leu Leu Gln His Pro Glu Arg Leu Ala Glu260 265 270ttg agg gat gac ccg agt ttg tgg cct gct gct gtt gat gag ttg atg864Leu Arg Asp Asp Pro Ser Leu Trp Pro Ala Ala Val Asp Glu Leu Met275 280 285agg atg ctt tct ata gcg gac ggg ctg atg aga caa gcc aca gag gac912Arg Met Leu Ser Ile Ala Asp Gly Leu Met Arg Gln Ala Thr Glu Asp290 295 300atc gag gtg gca ggt act act att aga gcc ggt gaa ggc gtg gtc ttt960Ile Glu Val Ala Gly Thr Thr Ile Arg Ala Gly Glu Gly Val Val Phe305 310 315 320gcg acc tct gta atc aac aga gat ggg gag gtt tac gca gaa ccc gac 1008Ala Thr Ser Val Ile Asn Arg Asp Gly Glu Val Tyr Ala Glu Pro Asp325 330 335gcc ctc gat tgg cat agg ccc acc aga cat cac gtg gca ttc ggc ttt 1056Ala Leu Asp Trp His Arg Pro Thr Arg His His Val Ala Phe Gly Phe340 345 350ggc att cat caa tgt ctc gga cag aat cta gca cgt gcc gag atg gag 1104Gly Ile His Gln Cys Leu Gly Gln Asn Leu Ala Arg Ala Glu Met Glu355 360 365ata gca ctt cgt agt ttg ttc gag aga gtg cct ggg ttg aga ctc gac 1152Ile Ala Leu Arg Ser Leu Phe Glu Arg Val Pro Gly Leu Arg Leu Asp370 375 380att gca cca gat gct gtc cgc ttt aaa cca ggt gac acg att cag gga 1200Ile Ala Pro Asp Ala Val Arg Phe Lys Pro Gly Asp Thr Ile Gln Gly385 390 395 400atg ctg gat ctt ccc gtg gcc tgg tag 1227Met Leu Asp Leu Pro Val Ala Trp405<210>215<211>416<212>PRT<213>裝飾鏈霉菌(Streptomyces ornatus)IFO 13069t<400>215Met Thr Glu Ser Thr Thr Glu Pro Ala Arg Gln Asp Pro Ala Pro Thr1 5 10 15Ala Pro Pro Thr Gln Pro Thr Ser Thr Thr Pro Phe Pro Gln Asn Arg20 25 30Asp Cys Pro Tyr His Pro Pro Thr Gly Tyr Gln Pro Leu Arg Ala Asp35 40 45Arg Pro Leu Ser Arg Val Thr Leu Phe Asp Gly Arg Pro Val Trp Ala50 55 60Val Thr Gly His Ala Leu Ala Arg Arg Leu Leu Ala Asp Pro Arg Leu65 70 75 80Ser Thr Asp Arg Thr His Pro Asp Phe Pro Val Pro Ala Glu Arg Phe85 90 95Ala Asn Val Glu Arg Arg Arg Val Ala Leu Leu Gly Val Asp Asp Pro100 105 110Glu His Asn Ala Gln Arg Arg Met Leu Ile Pro Ser Phe Ser Val Lys115 120 125Arg Ile Ala Ala Leu Arg Pro Arg Ile Gln Glu Thr Val Asp Gly Leu
130 135 140Leu Asp Ala Met Glu Arg Gln Gly Pro Pro Ser Glu Leu Val Ala Asp145 150 155 160Phe Ala Leu Pro Val Pro Ser Met Val Ile Cys Ala Leu Leu Gly Val165 170 175Pro Tyr Ala Asp His Glu Phe Phe Glu Gly Cys Ser Arg Arg Leu Leu180 185 190Gln Gly Pro Gly Ala Ala Asp Val Asn Glu Ala Arg Ile Glu Leu Glu195 200 205Gly Tyr Leu Gly Ala Leu Ile Asp Arg Lys Arg Val Glu Pro Gly Glu210 215 220Gly Leu Leu Asp Glu Leu Ile His Arg Asp His Pro Gly Gly Pro Val225 230 235 240Asp Arg Glu Asp Leu Val Ser Phe Ala Val Ile Leu Leu Val Ala Gly245 250 255His Glu Thr Thr Ala Asn Met Ile Ser Leu Gly Thr Phe Thr Leu Leu260 265 270Asn His Pro Glu Gln Leu Glu Ala Leu Arg Ser Gly Ser Thr Thr Thr275 280 285Ala Ala Val Val Glu Glu Leu Leu Arg Phe Leu Ser Ile Ala Glu Gly290 295 300Leu Gln Arg Leu Ala Thr Glu Asp Ile Glu Val Ala Gly Thr Thr Ile305 310 315 320Arg Glu Gly Glu Gly Val Phe Phe Ser Thr Ser Leu Ile Asn Arg Asp325 330 335Thr Glu Val Tyr Glu Asn Pro Glu Thr Leu Asp Trp Asp Arg Pro Ser340 345 350Arg His His Leu Ala Phe Gly Phe Gly Val His Gln Cys Leu Gly Gln355 360 365Asn Leu Ala Arg Thr Glu Leu Asp Ile Ala Leu Arg Thr Leu Phe Glu370 375 380Arg Leu Pro Gly Leu Arg Leu Ala Val Pro Ala His Glu Ile Arg His385 390 395 400Lys Pro Gly Asp Thr Ile Gln Gly Leu Leu His Leu Pro Val Ala Trp405 410 415<210>216<211>416<212>PRT<213>灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)ATCC 10137<400>216Met Thr Glu Ser Thr Thr Glu Pro Ala Arg Gln Asp Pro Ala Pro Thr1 5 10 15Ala Pro Pro Thr Gln Pro Thr Ser Thr Thr Pro Phe Pro Gln Asn Arg20 25 30Asp Cys Pro Tyr His Pro Pro Thr Gly Tyr Gln Pro Leu Arg Ala Asp35 40 45Arg Pro Leu Ser Arg Val Thr Leu Phe Asp Gly Arg Pro Val Trp Ala50 55 60Val Thr Gly His Ala Leu Ala Arg Arg Leu Leu Ala Asp Pro Arg Leu65 70 75 80Ser Thr Asp Arg Thr His Pro Asp Phe Pro Val Pro Ala Glu Arg Phe85 90 95Ala Asn Val Glu Arg Arg Arg Val Ala Leu Leu Gly Val Asp Asp Pro100 105 110Glu His Asn Ala Gln Arg Arg Met Leu Ile Pro Ser Phe Ser Val Lys115 120 125Arg Ile Ala Ala Leu Arg Pro Arg Ile Gln Glu Thr Val Asp Gly Leu130 135 140Leu Asp Ala Met Glu Arg Gln Gly Pro Pro Ser Glu Leu Val Ala Asp145 150 155 160Phe Ala Leu Pro Val Pro Ser Met Val Ile Cys Ala Leu Leu Gly Val165 170 175Pro Tyr Ala Asp His Glu Phe Phe Glu Gly Cys Ser Arg Arg Leu Leu180 185 190Gln Gly Pro Gly Ala Ala Asp Val Asn Glu Ala Arg Ile Glu Leu Glu195 200 205Gly Tyr Leu Gly Ala Leu Ile Asp Arg Lys Arg Val Glu Pro Gly Glu210 215 220Gly Leu Leu Asp Glu Leu Ile His Arg Asp His Pro Gly Gly Pro Val225 230 235 240Asp Arg Glu Asp Leu Val Ser Phe Ala Val Ile Leu Leu Val Ala Gly245 250 255His Glu Thr Thr Ala Asn Met Ile Ser Leu Gly Thr Phe Thr Leu Leu
260 265 270Asn His Pro Glu Gln Leu Glu Ala Leu Arg Ser Gly Arg Thr Thr Thr275 280 285Ala Ala Val Val Glu Glu Leu Leu Arg Phe Leu Ser Ile Ala Glu Gly290 295 300Leu Gln Arg Leu Ala Thr Glu Asp Ile Glu Val Ala Gly Thr Thr Ile305 310 315 320Arg Glu Gly Glu Gly Val Phe Phe Ser Thr Ser Leu Ile Asn Arg Asp325 330 335Thr Glu Val Tyr Glu Asn Pro Glu Thr Leu Asp Trp Asp Arg Pro Ser340 345 350Arg His His Leu Ala Phe Gly Phe Gly Val His Gln Cys Leu Gly Gln355 360 365Asn Leu Ala Arg Thr Glu Leu Asp Ile Ala Leu Arg Thr Leu Phe Glu370 375 380Arg Leu Pro Gly Leu Arg Leu Ala Val Pro Ala His Glu Ile Arg His385 390 395 400Lys Pro Gly Asp Thr Ile Gln Gly Leu Leu His Leu Pro Val Ala Trp405 410 415<210>217<211>409<212>PRT<213>不產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces achromogenes)IFO 12735<400>217Met Thr Glu Leu Thr Asp Ile Thr Gly Pro Ala Ala Glu Ala Glu Pro1 5 10 15Val Ala Phe Pro Gln Asp Arg Thr Cys Pro Tyr His Pro Pro Thr Gly20 25 30Tyr Asp Pro Leu Arg Asp Gly Arg Pro Leu Ser Arg Val Thr Leu Tyr35 40 45Asp Gly Arg Glu Ala Trp Leu Val Thr Gly Gln Ala Thr Ala Arg Ala50 55 60Leu Leu Ala Asp Pro Arg Leu Ser Thr Asp Arg Arg Arg Asp Gly Phe65 70 75 80Pro Val Pro Thr Pro Arg Phe Glu Ala Gly Arg Asp Arg Lys Val Ala85 90 95Leu Leu Gly Val Asp Asp Pro Glu His His Gln Gln Arg Arg Met Leu100 105 110Ile Pro Ser Phe Thr Leu Lys Arg Ala Thr Ala Leu Arg Pro Trp Ile115 120 125Gln Arg Ile Val Asp Glu Leu Leu Asp Ala Met Ile Glu Arg Gly Pro130 135 140Gly Ala Glu Leu Val Ser Ala Phe Ala Leu Pro Val Pro Ser Met Val145 150 155 160Ile Cys Gly Leu Leu Gly Val Pro Tyr Ala Asp His Glu Phe Phe Glu165 170 175Glu Gln Ser Arg Arg Leu Leu Arg Gly Pro Thr Ser Ala Asp Thr Leu180 185 190Asp Ala Arg Asp Arg Leu Glu Arg Phe Leu Gly Asp Leu Ile Asp Ala195 200 205Lys Ala Lys Glu Ala Glu Pro Gly Asp Gly Ile Leu Asp Asp Leu Val210 215 220His His Arg Leu Arg Glu Gly Glu Leu Asp Arg Gly Asp Leu Val Ser225 230 235 240Leu Ala Val Ile Leu Leu Val Ala Gly His Glu Thr Thr Ala Asn Met245 250 255Ile Ser Leu Gly Thr Tyr Thr Leu Leu Gln His Pro Asp Arg Leu Ala260 265 270Glu Leu Arg Ala Asp Pro Ala Leu Leu Pro Ala Val Val Glu Glu Leu275 280 285Met Arg Met Leu Ser Ile Ala Glu Gly Leu Gln Arg Val Ala Leu Glu290 295 300Asp Val Glu Ile Ala Gly Thr Thr Ile Arg Ala Gly Asp Gly Val Leu305 310 315 320Phe Ser Thr Ser Val Ile Asn Arg Asp Thr Ala Val Tyr Asp Asp Pro325 330 335Asp Ala Leu Asp Phe His Arg Ala Asp Arg His His Val Ala Phe Gly340 345 350Phe Gly Ile His Gln Cys Leu Gly Gln Asn Leu Ala Arg Ala Glu Leu355 360 365Glu Ile Ala Leu Gly Ser Leu Phe Thr Arg Leu Pro Gly Leu Arg Leu370 375 380Ala Ala Pro Ala Glu Glu Ile Pro Phe Lys Pro Gly Asp Thr Ile Gln
385 390 395 400Gly Met Leu Glu Leu Pro Val Thr Trp405<210>218<211>416<212>PRT<213>灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)IFO 13849T<400>218Met Thr Glu Ser Thr Thr Glu Pro Ala Arg Gln Asp Ala Ala Leu Thr1 5 10 15Gly Ala Thr Thr Glu Pro Thr Ser Ala Pro Pro Phe Pro Gln Asp Arg20 25 30Glu Cys Pro Tyr His Pro Pro Thr Gly Tyr Glu Pro Leu Arg Ala Asp35 40 45Arg Pro Leu Ser Arg Val Thr Leu Tyr Asp Gly Arg Pro Val Trp Ala50 55 60Val Thr Gly His Ala Leu Ala Arg Arg Leu Leu Ala Asp Pro Arg Leu65 70 75 80Ser Thr Asp Arg Thr His Pro Ala Phe Pro Val Pro Ala Glu Arg Phe85 90 95Ala Gln Thr Arg Gln Arg Arg Val Ala Leu Leu Gly Val Asp Asp Pro100 105 110Glu His Asn Thr Gln Arg Arg Met Leu Ile Pro Ser Phe Ser Val Lys115 120 125Arg Ile Ala Ala Leu Arg Pro Arg Ile Gln Glu Thr Val Asp Arg Leu130 135 140Leu Asp Ala Met Glu Arg Gln Gly Pro Pro Ser Glu Leu Val Ala Asp145 150 155 160Phe Ala Leu Pro Val Pro Ser Met Val Ile Cys Ala Leu Leu Gly Val165 170 175Pro Tyr Ala Asp His Ala Leu Phe Glu Gly Cys Ser Arg Arg Leu Leu180 185 190Arg Gly Pro Gly Ala Asp Asp Val Asp Ala Ala Arg Val Glu Leu Glu195 200 205Glu Tyr Leu Gly Ala Leu Ile Asp Arg Lys Arg Ala Asp Pro Gly Glu210 215 220Gly Leu Leu Asp Glu Leu Ile His Arg Asp Arg Pro Asp Gly Pro Val225 230 235 240Ser Arg Glu Asp Leu Val Ser Phe Ala Leu Ile Leu Leu Val Ala Gly245 250 255His Glu Thr Thr Ala Asn Met Ile Ser Leu Gly Thr Phe Thr Leu Leu260 265 270Arg His Pro Gly Gln Leu Ala Ala Leu Arg Ser Gly Glu Thr Thr Thr275 280 285Ala Val Val Val Glu Glu Leu Leu Arg Phe Leu Ser Ile Ala Glu Gly290 295 300Leu Gln Arg Leu Ala Ile Glu Asp Ile Glu Val Asp Gly Thr Thr Ile305 310 315 320Arg Glu Gly Glu Gly Val Phe Phe Ser Thr Ser Leu Val Asn Arg Asp325 330 335Ala Asp Val Phe Ala Asp Pro Glu Thr Leu Asp Trp Glu Arg Ser Ala340 345 350Arg His His Leu Ala Phe Gly Phe Gly Val His Gln Cys Leu Gly Gln355 360 365Asn Leu Ala Arg Ala Glu Leu Asp Ile Ala Leu Arg Thr Leu Phe Glu370 375 380Arg Leu Pro Ala Leu Arg Leu Ala Val Pro Ala Asp Glu Val Arg His385 390 395 400Lys Pro Gly Asp Thr Ile Gln Gly Leu Leu Glu Leu Pro Val Ala Trp405 410 415<210>219<211>405<212>PRT<213>羊毛鏈霉菌(Streptomyces lanatus)IFO 12787T<400>219Met Thr Asp Met Thr Asp Met Thr Arg Pro Pro Thr Val Ala Phe Pro1 5 10 15Gln Asn Arg Thr Cys Pro Tyr His Pro Pro Thr Ala Tyr Asp Pro Leu20 25 30Arg Asp Thr Arg Pro Leu Ala Arg Ilc Thr Leu Tyr Asp Gly Arg Pro35 40 45
Val Trp Leu Val Thr Gly His Ala Leu Ala Arg Thr Leu Leu Ala Asp50 55 60Pro Arg Leu Ser Ser Asp Arg Gly Arg Pro Gly Phe Pro Ala Pro Asn65 70 75 80Glu Arg Phe Ala Ala Val Arg Asp Arg Lys Ser Ala Leu Leu Gly Val85 90 95Asp Asp Pro Glu His Arg Val Gln Arg Arg Met Met Val Pro Ser Phe100 105 110Thr Leu Arg Arg Ala Ala Glu Leu Arg Pro Gln Ile Gln Arg Ile Val115 120 125Asp Glu Arg Leu Asp Ala Met Ile Asp Gln Gly Ala Pro Ala Glu Leu130 135 140Val Asn Ala Phe Ala Leu Pro Val Pro Ser Met Val Ile Cys Ala Leu145 150 155 160Leu Gly Val Pro Tyr Ala Asp His Asp Phe Phe Glu Gly Glu Ser Arg165 170 175Arg Leu Leu Arg Gly Ala Thr Ala Ala Glu Ala Met Asp Ala Arg Asp180 185 190Arg Leu Glu Asn Tyr Phe Ile Glu Leu Ile Asp Arg Lys Gln Lys Asp195 200 205Pro Glu Pro Gly Asp Gly Val Leu Asp Glu Leu Val His Arg Gln Leu210 215 220Arg Asp Gly Asp Leu Asp Arg Glu Glu Val Val Ala Leu Ser Thr Ile225 230 235 240Leu Leu Val Ala Gly His Glu Thr Thr Ala Asn Met Ile Ser Leu Gly245 250 255Thr Phe Thr Leu Leu Gln His Pro Glu Gln Leu Ala Glu Leu Arg Ala260 265 270Asp Ala Gly Leu Leu Pro Ala Ala Val Glu Glu Leu Met Arg Met Leu275 280 285Ser Ile Ala Asp Gly Leu Leu Arg Val Ala Ser Glu Asp Ile Glu Ala290 295 300Gly Gly Glu Thr Ile Arg Ala Gly Asp Gly Val Val Phe Ser Thr Ser305 310 315 320Val Ile Asn Arg Asp Glu Ser Val Tyr Pro Asp Pro Asp Ala Ile Asp325 330 335Trp His Arg Pro Thr Arg His His Ile Ala Phe Gly Phe Gly Ile His340 345 350Gln Cys Leu Gly Gln Asn Leu Ala Arg Ala Glu Met Glu Ile Ala Leu355 360 365Arg Thr Leu Phe Glu Arg Leu Pro Thr Leu Arg Leu Ala Val Pro Ala370 375 380Gly Glu Ile Pro Phe Lys Pro Gly Asp Thr Ile Gln Gly Met Leu Glu385 390 395 400Leu Pro Val Thr Trp405<210>220<211>414<212>PRT<213>三澤鏈霉菌(Streptomyces misawanensis)IFO 13855T<400>220Met Lys Glu Leu Thr Asp Leu Thr Glu Pro Ile Ser Pro Ala Gly Gln1 5 10 15Ala Asp Pro Val Ala Trp Pro Gln Asp Arg Thr Cys Pro Tyr His Pro20 25 30Pro Thr Gly Tyr Asp Pro Leu Arg Asp Gly Thr Pro Leu Ser Arg Val35 40 45Thr Leu Tyr Asp Gly Arg Thr Val Trp Ala Val Thr Gly His Gly Thr50 55 60Ala Arg Ala Leu Leu Ser Asp Pro Arg Leu Ser Ser Asp Arg Arg Arg65 70 75 80Asp Asp Phe Pro Met Pro Asn Ala Arg Phe Ala Ala Ala Arg Glu Arg85 90 95Arg Gln Leu Ala Leu Leu Gly Leu Asp Asp Pro Glu His Gln Ile Gln100 105 110Arg Arg Met Leu Ile Pro Asp Phe Thr Leu Lys Arg Ala Thr Val Met115 120 125Arg Pro Ala Ile Gln Arg Ile Val Asp Asp Leu Leu Asp Arg Met Ile130 135 140Ala Ala Gly Pro Pro Ala Asp Leu Val Ser Ser Phe Ala Leu Pro Val145 150 155 160Pro Ser Met Val Ile Cys Asp Leu Leu Gly Val Pro Tyr Ala Asp His165 170 175
Glu Phe Phe Glu Ala Gln Ser Arg Arg Leu Leu Arg Gly Pro Ala Pro180 185 190Ala Asp Ser Leu Asp Ala Arg Asp Gln Leu Glu Ala Tyr Leu Gly Asp195 200 205Leu Ala Asp Arg Lys Ser Arg Asp Ala Val Pro Gly Asp Gly Val Leu210 215 220Asp Asp Leu Val His Gln Arg Leu Arg Asp Gly Ala Leu Asp Arg Ala225 230 235 240Glu Val Val Ala Leu Ala Leu Ile Leu Leu Val Ala Gly His Glu Thr245 250 255Thr Ala Asn Met Ile Ser Leu Gly Thr Phe Thr Leu Leu Gln Gln Pro260 265 270Glu Arg Leu Ala Glu Leu Arg Ala Asp Pro Ala Leu Val Pro Ala Ala275 280 285Val Glu Glu Leu Met Arg Met Leu Ser Ile Ala Asp Gly Leu Leu Arg290 295 300Val Ala Leu Glu Asp Ile Glu Thr Asp Gly Gly Thr Thr Ile Arg Lys305 310 315 320Gly Glu Gly Val Leu Phe Ala Thr Ser Val Ile Asn Arg Asp Glu Ser325 330 335Val Tyr Asp Asp Pro Asp Ala Leu Asp Trp His Arg Pro Ala Arg His340 345 350His Val Ala Phe Gly Phe Gly Ile His Gln Cys Leu Gly Gln Asn Leu355 360 365Ala Arg Thr Glu Leu Glu Ile Ala Leu Arg Thr Leu Trp Glu Arg Leu370 375 380Pro Asp Leu Arg Leu Ala Ala Pro Pro Glu Glu IIe Pro Phe Lys Pro385 390 395 400Gly Asp Thr Ile Gln Gly Met Leu Glu Leu Pro Val Thr Trp405 410<210>221<211>409<212>PRT<213>蒼白色鏈霉菌(Streptomyces pallidus)IFO 13434T<400>221Met Ala Asp Thr Leu Ala Gly Ala Thr Pro Asp Ala Ala Ala Thr Val1 5 10 15Pro Ala Tyr Pro Met Ala Arg Ala Ala Gly Cys Pro Phe Asp Pro Pro20 25 30Pro Asp Leu Thr Ala Arg Gln Asp Glu Gly Arg Leu Val Arg Val Arg35 40 45Leu Trp Asp Gly Ser Thr Pro Trp Leu Val Thr Arg Tyr Glu Asp Gln50 55 60Arg Ala Leu Leu Leu Asp Pro Arg Val Ser Ala Asp Ile Thr Arg Pro65 70 75 80Gly Tyr Pro Leu Gln Ala Ala Gly Ala Gly Glu Asn Asn Ala Ser Phe85 90 95Ile Leu Met Asp Asp Pro Glu His Ala Arg Leu Arg Arg Met Val Thr100 105 110Ala Pro Phe Ala Ile Lys Arg Val Glu Ala Met Arg Pro Gly Val Gln115 120 125Gln Leu Val Asp Asp Leu Ile Asp Gly Met Leu Ala Gly Pro Lys Pro130 135 140Val Asp Leu Val Glu Ala Phe Ala Leu Pro Val Pro Ser Leu Val Ile145 150 155 160Cys Arg Met Leu Gly Val Pro Tyr Glu Asp His Asp Phe Phe Gln Glu165 170 175Asn Ser Arg Ile Leu Ile Lys Arg Asp Ala Ala Met Glu Asp Arg Met180 185 190Ala Ala His Gly Arg Leu Ile Ala Tyr Leu Asp Glu Leu Met Gly Glu195 200 205Lys Thr Ala Arg Pro Ala Asp Asp Leu Leu Ser Gly Leu Val Glu Arg210 215 220Val Arg Thr Gly Glu Leu Thr Arg Arg Glu Ser Ala Arg Met Gly Val225 230 235 240Leu Leu Leu Ile Ala Gly His Glu Thr Thr Ala Asn Met Ile Ala Leu245 250 255Gly Thr Leu Ala Leu Leu Glu His Pro Asp Gln Leu Ala Leu Leu Arg260 265 270Asp Thr Asp Asp Pro Lys Leu Val Ala Gly Ala Ala Glu Glu Leu Leu275 280 285Arg Tyr Leu Thr Ile Val His Asn Gly Arg Arg Arg Ala Ala Leu Ala290 295 300
Asp Ile Glu Ile Gly Gly Gln Val Ile Arg Ala Gly Glu Gly Met Ile305 310 315 320Met Pro Asn Asp Leu Ala Asn Arg Asp Pro Gly Ala Phe Thr Asp Pro325 330 335Asp Arg Leu Asp Leu Arg Arg Asp Ala Arg Arg His Ile Ala Phe Gly340 345 350Phe Gly Val His Gln Cys Leu Gly Gln Pro Leu Ala Arg Met Glu Leu355 360 365Gln Val Val Tyr Gly Thr Leu Tyr Arg Arg Ile Pro Thr Leu Arg Leu370 375 380Ala Ala Pro Val Glu Ser Leu Ser Phe Lys His Asp Gly Ser Val Tyr385 390 395 400Gly Val Tyr Glu Leu Pro Val Thr Trp405<210>222<211>398<212>PRT<213>玫瑰變紅鏈霉菌(Streptomyces roseorubens)IFO 13682T<400>222Met Thr Asp Thr Thr Ala Pro Val Ala Phe Pro Gln Ser Arg Thr Cys1 5 10 15Pro Tyr His Pro Pro Ala Ala Tyr Glu Pro Leu Arg Ala Glu Arg Pro20 25 30Leu Thr Arg Ile Thr Leu Phe Asp Gly Arg Glu Ala Trp Leu Val Ser35 40 45Gly His Ala Thr Ala Arg Ala Leu Leu Ala Asp Pro Arg Leu Ser Ser50 55 60Asp Arg Asp Arg Pro Gly Phe Pro Thr Pro Thr Ala Arg Phe Ala Gly65 70 75 80Ile Arg Asn Arg Arg Thr Ala Leu Leu Gly Val Asp Asp Pro Glu His85 90 95Arg Ala Gln Arg Arg Met Val Val Gly Asp Phe Thr Leu Lys Arg Ala100 105 110Ala Ala Leu Arg Pro Arg Ile Gln Arg Ile Val Asp Glu Arg Leu Asp115 120 125Ala Met Ile Ala Gln Gly Pro Pro Ala Asp Leu Val Ser Ala Phe Ala130 135 140Leu Pro Val Pro Ser Met Val Ile Cys Ala Leu Leu Gly Val Pro Tyr145 150 155 160Ala Asp His Asp Phe Phe Glu Ala Gln Ser Arg Arg Leu Leu Arg Gly165 170 175Pro Gly Thr Ala Asp Val Gln Asp Ala Arg Ser Arg Leu Glu Glu Tyr180 185 190Phe Gly Glu Leu Ile Asp Arg Lys Arg Glu Asp Pro Gly Thr Gly Leu195 200 205Leu Asp Asp Leu Val Gln Arg Gln Pro Gly Asp Gly Gly Pro Asp Arg210 215 220Glu Gly Leu Ile Ala Met Ala Leu Ile Leu Leu Val Ala Gly His Glu225 230 235 240Thr Thr Ala Asn Met Ile Ser Leu Gly Thr Phe Thr Leu Leu Gln His245 250 255Pro Glu Arg Leu Ala Glu Leu Arg Ala Asp Ser Glu Val Met Pro Ala260 265 270Ala Val Glu Glu Leu Met Arg Leu Leu Ser Ile Ala Asp Gly Leu Leu275 280 285Arg Ile Ala Val Glu Asp Val Glu Val Ala Gly Thr Thr Ile Arg Ala290 295 300Gly Glu Gly Val Val Phe Ala Thr Ser Val Ile Asn Arg Asp Glu Thr305 310 315 320Val Phe Ala Glu Pro Asp Thr Leu Asp Trp Ser Arg Pro Ala Arg His325 330 335His Val Ala Phe Gly Phe Gly Ile His Gln Cys Leu Gly Gln Asn Leu340 345 350Ala Arg Ala Glu Leu Glu Ile Ala Leu Gly Thr Leu Phe Gly Arg Leu355 360 365Pro Thr Leu Arg Leu Ala Ala Pro Pro Asp Glu Ile Pro Phe Lys Pro370 375 380Gly Asp Thr Ile Gln Gly Met Leu Glu Leu Pro Val Thr Trp385 390 395<210>223<211>414<212>PRT
<213>魯?shù)劓溍咕?Streptomyces rutgersensis)IFO 15875T<400>223Met Thr Glu Thr Leu Ala Glu Thr Thr Thr Glu Ala Glu Glu Pro Leu1 5 10 15Pro Glu Phe Pro Met Pro Arg Ala Asn Gly Cys Pro Phe Ala Pro Pro20 25 30Pro Thr Ala Arg Ala Leu His Thr Glu Arg Pro Val Thr Arg Val Arg35 40 45Leu Trp Asp Gly Ser Ala Pro Trp Leu Val Thr Arg Tyr Ala Asp Gln50 55 60Arg Ala Leu Leu Gly Asp Pro Arg Val Ser Ser Glu Ala Thr Arg Pro65 70 75 80Gly Phe Pro His Ala Ser Ala Gly Phe Arg Glu Asn Ala Arg Arg Arg85 90 95Arg Ser Phe Ile Thr Met Asp Asp Pro Glu His Ala Arg Ile Arg Arg100 105 110Met Val Thr Ala Pro Phe Ala Ile Lys Arg Val Glu Ala Met Arg Pro115 120 125Asp Ile Gln Lys Ile Thr Asp Asp Leu Ile Asp Ser Met Leu Ala Gly130 135 140Pro Thr Pro Val Asp Leu Val Arg Ala Leu Ala Leu Pro Leu Pro Ser145 150 155 160Leu Val Ile Cys Arg Leu Leu Gly Val Pro Tyr Glu Asp His Asp Phe165 170 175Phe Gln Arg Asn Ser Ser Leu Leu Ile Asn Arg Asn Ser Thr Thr Glu180 185 190Glu Val Val Gly Ala Asn Glu Ala Leu Thr Asp Tyr Leu Asp Glu Leu195 200 205Val Ser Ala Lys Leu Ala Asn Pro Ala Asp Asp Met Leu Ser Glu Leu210 215 220Ala Ala Arg Val Thr Ala Gly Glu Leu Thr Gln Arg Glu Ala Ala Asn225 230 235 240Met Gly Val Leu Leu Leu Ile Ala Gly His Glu Thr Thr Ala Asn Met245 250 255Ile Ala Leu Gly Thr Val Ala Leu Leu Glu Asn Pro Asp Gln Leu Ala260 265 270Val Leu Arg Glu Thr Asp Asp Pro Lys Ala Val Ala Lys Ala Val Glu275 280 285Glu Leu Leu Arg Tyr Leu Thr Ile Val His Thr Gly Arg Arg Arg Val290 295 300Ala Arg Glu Asp Ile Glu Ile Gly Gly Glu Thr Ile Arg Ala Gly Asp305 310 315 320Gly Ile Ile Ile Tyr Thr Gly Thr Gly Asn Trp Asp Ala Glu Val Phe325 330 335Pro Glu Pro Glu Arg Leu Asp Ile Gly Arg Asp Ala Arg Arg His Met340 345 350Ala Phe Gly Phe Gly Val His Gln Cys Leu Gly Gln Pro Leu Ala Arg355 360 365Val Glu Leu Gln Val Val Tyr Gly Thr Leu Tyr Arg Arg Ile Pro Thr370 375 380Leu Arg Leu Ala Thr Gly Val Asp Gln Leu Pro Phe Lys Asp Asp Gly385 390 395 400Leu Val Tyr Gly Val Tyr Glu Leu Pro Val Thr Trp Thr Ser405 410<210>224<211>398<212>PRT<213>斯堡鏈霉菌(Streptomyces steffisburgensis)IFO 13446T<400>224Met Ser Asp Thr Thr Ala Pro Val Ala Phe Pro Gln Ser Arg Thr Cys1 5 10 15Pro Tyr His Pro Pro Ala Ala Tyr Glu Pro Leu Arg Ala Glu Arg Pro20 25 30Leu Thr Arg Ile Thr Leu Phe Asp Gly Arg Glu Ala Trp Leu Val Ser35 40 45Gly His Ala Thr Ala Arg Ala Leu Leu Ala Asp Pro Arg Leu Ser Ser50 55 60Asp Arg Asp Arg Pro Gly Phe Pro Ala Pro Thr Ala Arg Phe Ala Gly65 70 75 80Ile Arg Asn Arg Arg Thr Ala Leu Leu Gly Val Asp Asp Pro Glu His85 90 95Arg Val Gln Arg Arg Met Val Ala Gly Asp Phe Thr Leu Lys Arg Ala
100 105 110Ala Gly Leu Arg Pro Arg Ile Gln Arg Ile Val Asp Arg Arg Leu Asp115 120 125Ala Met Ile Ala Gln Gly Pro Pro Ala Asp Leu Val Ser Ser Phe Ala130 135 140Leu Pro Val Pro Ser Met Val Ile Cys Ala Leu Leu Gly Val Pro Tyr145 150 155 160Ala Asp His Asp Phe Phe Glu Thr Gln Ser Arg Arg Leu Leu Arg Gly165 170 175Pro Gln Thr Ala Asp Val Met Asp Ala Arg Ala Arg Leu Asp Glu Tyr180 185 190Phe Gly Glu Leu Ile Asp Arg Lys Arg Lys Glu Pro Gly Ala Gly Leu195 200 205Leu Asp Asp Leu Val Gln Arg Gln Leu Arg Asp Gly Ala Leu Asp Arg210 215 220Glu Gly Leu Ile Ala Leu Ala Leu Ile Leu Leu Val Ala Gly His Glu225 230 235 240Thr Thr Ala Asn Met Ile Ser Leu Gly Thr Phe Thr Leu Leu Gln His245 250 255Pro Glu Arg Leu Ala Glu Leu Arg Ala Asp Pro Arg Leu Leu Pro Ala260 265 270Ala Val Glu Glu Leu Met Arg Met Leu Ser Ile Ala Asp Gly Leu Leu275 280 285Arg Leu Ala Val Glu Asp Ile Glu Val Ala Gly Thr Thr Ile Arg Lys290 295 300Gly Asp Gly Val Val Phe Leu Thr Ser Val Ile Asn Arg Asp Glu Thr305 310 315 320Val Tyr Pro Glu Pro Asp Thr Leu Asp Trp His Arg Ser Ala Arg His325 330 335His Val Ala Phe Gly Phe Gly Ile His Gln Cys Leu Gly Gln Asn Leu340 345 350Ala Arg Ala Glu Leu Glu Ile Ala Leu Trp Thr Leu Phe Asp Arg Leu355 360 365Pro Thr Leu Arg Leu Ala Ala Pro Ala Glu Glu Ile Ala Phe Lys Pro370 375 380Gly Asp Thr Ile Gln Gly Met Leu Glu Leu Pro Val Thr Trp385 390 395<210>225<211>1251<212>DNA<213>裝飾鏈霉菌(Streptomyces ornatus)IFO 13069t<220>
<221>CDS<222>(1)..(1251)<400>225atg acg gaa tcc acg acg gaa ccg gcc cgc cag gac ccc gct ccc acc 48Met Thr Glu Ser Thr Thr Glu Pro Ala Arg Gln Asp Pro Ala Pro Thr1 5 10 15gcc cct ccg acg caa ccg acc tcc acg aca ccc ttc ccc cag aac cgc 96Ala Pro Pro Thr Gln Pro Thr Ser Thr Thr Pro Phe Pro Gln Asn Arg20 25 30gac tgc ccc tac cac ccg ccc acc ggg tac caa ccg ctc cgc gcg gac144Asp Cys Pro Tyr His Pro Pro Thr Gly Tyr Gln Pro Leu Arg Ala Asp35 40 45cgg ccg ctc agc cgg gtc acc ctc ttc gac ggg cgt ccg gtc tgg gcc192Arg Pro Leu Ser Arg Val Thr Leu Phe Asp Gly Arg Pro Val Trp Ala50 55 60gtc acc ggc cac gcc ctg gcc cgc cgg cta ctg gcg gat ccg cgc ctg240Val Thr Gly His Ala Leu Ala Arg Arg Leu Leu Ala Asp Pro Arg Leu65 70 75 80tcc acc gat cgc acc cac ccc gac ttc ccc gtt ccg gcc gag cgg ttc288Ser Thr Asp Arg Thr His Pro Asp Phe Pro Val Pro Ala Glu Arg Phe85 90 95gcg aac gtc gag cgg cgg cgc gtg gcc ctg ctc ggc gtc gac gac ccc336Ala Asn Val Glu Arg Arg Arg Val Ala Leu Leu Gly Val Asp Asp Pro100 105 110
gag cac aac gcc cag cgc agg atg ctc atc ccg agc ttc tcc gtg aag384Glu His Asn Ala Gln Arg Arg Met Leu Ile Pro Ser Phe Ser Val Lys115 120 125cgg ata gcc gcg ctg cgc ccc cgc atc cag gag acg gtg gac gga ctg432Arg Ile Ala Ala Leu Arg Pro Arg Ile Gln Glu Thr Val Asp Gly Leu130 135 140ctg gac gcg atg gag cgg cag ggc ccg ccg tcc gaa ctg gtc gcc gac480Leu Asp Ala Met Glu Arg Gln Gly Pro Pro Ser Glu Leu Val Ala Asp145 150 155 160ttc gcg ctg ccg gtg ccg tcg atg gtg atc tgc gcg ctc ctc ggt gtg528Phe Ala Leu Pro Val Pro Ser Met Val Ile Cys Ala Leu Leu Gly Val165 170 175ccg tac gcc gac cac gag ttc ttc gag ggc tgc tcc cgg cgg ctc ctg576Pro Tyr Ala Asp His Glu Phe Phe Glu Gly Cys Ser Arg Arg Leu Leu180 185 190cag ggc ccg ggc gcg gcc gat gtg aac gag gcc cgg atc gag ctg gag624Gln Gly Pro Gly Ala Ala Asp Val Asn Glu Ala Arg Ile Glu Leu Glu195 200 205ggc tat ctg ggc gcc ctg atc gac cgc aag cgg gtg gag ccg ggg gag672Gly Tyr Leu Gly Ala Leu Ile Asp Arg Lys Arg Val Glu Pro Gly Glu210 215 220ggg ctc ctg gac gaa ctg atc cac cgg gac cac ccc ggc gga ccc gtc720Gly Leu Leu Asp Glu Leu Ile His Arg Asp His Pro Gly Gly Pro Val225 230 235 240gac cgc gag gac ctc gtc tcg ttc gcg gtg atc ctc ctc gtc gcg ggg768Asp Arg Glu Asp Leu Val Ser Phe Ala Val Ile Leu Leu Val Ala Gly245 250 255cac gag acg acg gcg aac atg atc tcg ctc ggc acg ttc acg ctg ctg816His Glu Thr Thr Ala Asn Met Ile Ser Leu Gly Thr Phe Thr Leu Leu260 265 270aac cac ccg gaa cag ctg gag gcg ctg cgg tcc ggg agc acg acg acg864Asn His Pro Glu Gln Leu Glu Ala Leu Arg Ser Gly Ser Thr Thr Thr275 280 285gcc gcg gtg gtc gag gaa ctg ctg cgg ttc ctc tcc atc gcc gag gga912Ala Ala Val Val Glu Glu Leu Leu Arg Phe Leu Ser Ile Ala Glu Gly290 295 300ctg caa cgg ctg gcc acc gag gac atc gag gtg gcc ggg acg acg atc960Leu Gln Arg Leu Ala Thr Glu Asp Ile Glu Val Ala Gly Thr Thr Ile305 310 315 320cgc gag gga gag ggc gtg ttc ttc tcg acc tcg ctc atc aac cgc gac 1008Arg Glu Gly Glu Gly Val Phe Phe Ser Thr Ser Leu Ile Asn Arg Asp325 330 335acc gag gtc tac gag aat ccg gag acg ctc gac tgg gac cgg cct tcc 1056Thr Glu Val Tyr Glu Asn Pro Glu Thr Leu Asp Trp Asp Arg Pro Ser340 345 350cgg cac cac ctc gcc ttc ggc ttc ggc gtc cat cag tgc ctg ggc cag 1104Arg His His Leu Ala Phe Gly Phe Gly Val His Gln Cys Leu Gly Gln355 360 365aat ctg gcc cgc acc gag ctc gac atc gcc ctg cgc act ctc ttc gag 1152Asn Leu Ala Arg Thr Glu Leu Asp Ile Ala Leu Arg Thr Leu Phe Glu370 375 380cgg ctg ccg gga ctc agg ctc gcc gtg ccc gcg cac gag atc cgg cac 1200Arg Leu Pro Gly Leu Arg Leu Ala Val Pro Ala His Glu Ile Arg His385 390 395 400aaa ccc ggg gac acg atc cag ggc ctt ctg cac ctg ccc gtg gcc tgg 1248Lys Pro Gly Asp Thr Ile Gln Gly Leu Leu His Leu Pro Val Ala Trp
405 410 415tga 1251<210>226<211>1251<212>DNA<213>灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)ATCC 10137<220>
<221>CDS<222>(1)..(1251)<400>226atg acg gaa tcc acg acg gaa ccg gcc cgc cag gac ccc gct ccc acc 48Met Thr Glu Ser Thr Thr Glu Pro Ala Arg Gln Asp Pro Ala Pro Thr1 5 10 15gcc cct ccg acg caa ccg acc tcc acg aca ccc ttc ccc cag aac cgc 96Ala Pro Pro Thr Gln Pro Thr Ser Thr Thr Pro Phe Pro Gln Asn Arg20 25 30gac tgc ccc tac cac ccg ccc acc ggg tac caa ccg ctc cgc gcg gac144Asp Cys Pro Tyr His Pro Pro Thr Gly Tyr Gln Pro Leu Arg Ala Asp35 40 45cgg ccg ctc agc cgg gtc acc ctc ttc gac ggg cgt ccg gtc tgg gcc192Arg Pro Leu Ser Arg Val Thr Leu Phe Asp Gly Arg Pro Val Trp Ala50 55 60gtc acc ggc cac gcc ctg gcc cgc cgg cta ctg gcg gat ccg cgc ctg240Val Thr Gly His Ala Leu Ala Arg Arg Leu Leu Ala Asp Pro Arg Leu65 70 75 80tcc acc gat cgc acc cac ccc gac ttc ccc gtt ccg gcc gag cgg ttc288Ser Thr Asp Arg Thr His Pro Asp Phe Pro Val Pro Ala Glu Arg Phe85 90 95gcg aac gtc gag cgg agg cga gtg gcc ctg ctc ggc gtc gac gac ccc336Ala Asn Val Glu Arg Arg Arg Val Ala Leu Leu Gly Val Asp Asp Pro100 105 110gag cac aac gcc cag cgc agg atg ctc atc ccg agc ttc tcc gtg aag384Glu His Asn Ala Gln Arg Arg Met Leu Ile Pro Ser Phe Ser Val Lys115 120 125cgg ata gcc gcg ctg cgc ccc cgc atc cag gag acg gtg gac gga ctg432Arg Ile Ala Ala Leu Arg Pro Arg Ile Gln Glu Thr Val Asp Gly Leu130 135 140ctg gac gcg atg gag cgg cag ggc ccg ccg tcc gaa ctg gtc gcc gac480Leu Asp Ala Met Glu Arg Gln Gly Pro Pro Ser Glu Leu Val Ala Asp145 150 155 160ttc gcg ctg ccg gtg ccg tcg atg gtg atc tgc gcg ctc ctc ggt gtg528Phe Ala Leu Pro Val Pro Ser Met Val Ile Cys Ala Leu Leu Gly Val165 170 175ccg tac gcc gac cac gag ttc ttc gag ggc tgc tcc cgg cgg ctc ctg576Pro Tyr Ala Asp His Glu Phe Phe Glu Gly Cys Ser Arg Arg Leu Leu180 185 190cag ggc ccg ggc gcg gcc gat gtg aac gag gcc cgg atc gag ctg gag624Gln Gly Pro Gly Ala Ala Asp Val Asn Glu Ala Arg Ile Glu Leu Glu195 200 205ggc tat ctg ggc gcc ctg atc gac cgc aag cgg gtg gag ccg ggg gag672Gly Tyr Leu Gly Ala Leu Ile Asp Arg Lys Arg Val Glu Pro Gly Glu210 215 220ggg ctc ctg gac gaa ctg atc cac cgg gac cac ccc ggc gga ccc gtc720Gly Leu Leu Asp Glu Leu Ile His Arg Asp His Pro Gly Gly Pro Val225 230 235 240gac cgc gag gac ctc gtc tcg ttc gcg gtg atc ctc ctc gtc gcg ggg768
Asp Arg Glu Asp Leu Val Ser Phe Ala Val Ile Leu Leu Val Ala Gly245 250 255cac gag acg acg gcg aac atg atc tcg ctc ggc acg ttc acg ctg ctg 816His Glu Thr Thr Ala Asn Met Ile Ser Leu Gly Thr Phe Thr Leu Leu260 265 270aac cac ccg gaa cag ctg gag gcg ctg cgc tcc ggg agg acg acg acg 864Asn His Pro Glu Gln Leu Glu Ala Leu Arg Ser Gly Arg Thr Thr Thr275 280 285gcc gcg gtg gtc gag gaa ctg ctg cgg ttc ctc tcc atc gcc gag gga 912Ala Ala Val Val Glu Glu Leu Leu Arg Phe Leu Ser Ile Ala Glu Gly290 295 300ctg caa cgg ctg gcc acc gag gac atc gag gtg gcc ggg acg acg atc 960Leu Gln Arg Leu Ala Thr Glu Asp Ile Glu Val Ala Gly Thr Thr Ile305 310 315 320cgc gag gga gag ggc gtg ttc ttc tcg acc tcg ctc atc aac cgc gac1008Arg Glu Gly Glu Gly Val Phe Phe Ser Thr Ser Leu Ile Asn Arg Asp325 330 335acc gag gtc tac gag aat ccg gag acg ctc gac tgg gac cgg cct tcc1056Thr Glu Val Tyr Glu Asn Pro Glu Thr Leu Asp Trp Asp Arg Pro Ser340 345 350cgg cac cac ctc gcc ttc ggc ttc ggc gtc cac cag tgc ctg ggc cag1104Arg His His Leu Ala Phe Gly Phe Gly Val His Gln Cys Leu Gly Gln355 360 365aat ctg gcc cgc acc gag ctc gac atc gcc ctg cgc act ctc ttc gag1152Asn Leu Ala Arg Thr Glu Leu Asp Ile Ala Leu Arg Thr Leu Phe Glu370 375 380cgg ctg ccg gga ctc agg ctc gcc gtg ccc gcg cac gag atc cgg cac1200Arg Leu Pro Gly Leu Arg Leu Ala Val Pro Ala His Glu Ile Arg His385 390 395 400aaa ccc ggg gac acg atc cag ggc ctt ctg cac ctg ccc gtg gcc tgg1248Lys Pro Gly Asp Thr Ile Gln Gly Leu Leu His Leu Pro Val Ala Trp405 410 415tga1251<210>227<211>1230<212>DNA<213>不產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces achromogenes)IFO 12735<220>
<221>CDS<222>(1)..(1230)<400>227atg acg gaa ctg acg gac atc acc ggc ccg gct gcc gag gcc gaa ccc 48Met Thr Glu Leu Thr Asp Ile Thr Gly Pro Ala Ala Glu Ala Glu Pro1 5 10 15gtc gcc ttc ccc cag gac cgc acc tgt ccc tac cac ccc ccc acc gga 96Val Ala Phe Pro Gln Asp Arg Thr Cys Pro Tyr His Pro Pro Thr Gly20 25 30tac gac ccg ctg cgc gac ggg cga ccc ctg tcc cgc gtc acc ctc tac 144Tyr Asp Pro Leu Arg Asp Gly Arg Pro Leu Ser Arg Val Thr Leu Tyr35 40 45gac ggc cgc gag gcc tgg ctg gtc acc ggc cag gcc acc gcc cgc gcc 192Asp Gly Arg Glu Ala Trp Leu Val Thr Gly Gln Ala Thr Ala Arg Ala50 55 60ctg ctc gcc gac ccg cgg ctg tcc acc gac cgc cgc cgc gac ggc ttc 240Leu Leu Ala Asp Pro Arg Leu Ser Thr Asp Arg Arg Arg Asp Gly Phe65 70 75 80
ccc gtg ccc acc ccc cgc ttc gag gcc ggc cgc gac cgc aag gtg gcc288Pro Val Pro Thr Pro Arg Phe Glu Ala Gly Arg Asp Arg Lys Val Ala85 90 95ctg ctc ggg gtg gac gat ccc gag cac cac cag cag cgc cgg atg ctg336Leu Leu Gly Val Asp Asp Pro Glu His His Gln Gln Arg Arg Met Leu100 105 110atc ccg tcg ttc acc ctc aaa cgc gcc acc gcg ctg cgc ccc tgg atc384Ile Pro Ser Phe Thr Leu Lys Arg Ala Thr Ala Leu Arg Pro Trp Ile115 120 125cag cgg atc gtg gac gaa ctg ctg gac gcg atg atc gag cgg ggg ccg432Gln Arg Ile Val Asp Glu Leu Leu Asp Ala Met Ile Glu Arg Gly Pro130 135 140ggg gcc gaa ctg gtc tcc gcc ttc gcg ctg ccc gtg ccg tcc atg gtc480Gly Ala Glu Leu Val Ser Ala Phe Ala Leu Pro Val Pro Ser Met Val145 150 155 160atc tgc ggc ctg ctc ggc gtg ccc tac gcc gac cac gag ttc ttc gag528Ile Cys Gly Leu Leu Gly Val Pro Tyr Ala Asp His Glu Phe Phe Glu165 170 175gag cag tcc cgc cgg ctg ctg cgc ggg ccg acc agc gcc gac acc ctg576Glu Gln Ser Arg Arg Leu Leu Arg Gly Pro Thr Ser Ala Asp Thr Leu180 185 190gac gcc cgg gac cgg ctg gag cgg ttc ctc ggc gac ctg atc gac gcc624Asp Ala Arg Asp Arg Leu Glu Arg Phe Leu Gly Asp Leu Ile Asp Ala195 200 205aag gcc aag gag gcc gag ccc ggc gac ggc att ctg gac gac ctc gtc672Lys Ala Lys Glu Ala Glu Pro Gly Asp Gly Ile Leu Asp Asp Leu Val210 215 220cac cac cgg ctc cgc gag ggc gaa ctg gac cgg ggt gac ctg gtg tcg720His His Arg Leu Arg Glu Gly Glu Leu Asp Arg Gly Asp Leu Val Ser225 230 235 240ctc gcc gtg atc ctg ttg gtc gcc ggg cac gag acg acc gcc aac atg768Leu Ala Val Ile Leu Leu Val Ala Gly His Glu Thr Thr Ala Asn Met245 250 255atc tcc ctg ggc acc tac acc ctg ctc cag cac ccc gac cgg ctg gcc816Ile Ser Leu Gly Thr Tyr Thr Leu Leu Gln His Pro Asp Arg Leu Ala260 265 270gag ctg cgg gcc gac ccc gcg ctg ctg ccc gcc gtc gtc gag gaa ctg864Glu Leu Arg Ala Asp Pro Ala Leu Leu Pro Ala Val Val Glu Glu Leu275 280 285atg cgg atg ctg tcc atc gcc gag ggg ctg caa cgg gtg gcg ctg gag912Met Arg Met Leu Ser Ile Ala Glu Gly Leu Gln Arg Val Ala Leu Glu290 295 300gac gtc gag atc gcc ggc acc acc atc cgg gcc ggc gac ggc gtc ctg960Asp Val Glu Ile Ala Gly Thr Thr Ile Arg Ala Gly Asp Gly Val Leu305 310 315 320ttc tcc acc tcg gtc atc aac cgg gac acg gcc gtc tac gac gac ccc 1008Phe Ser Thr Ser Val Ile Asn Arg Asp Thr Ala Val Tyr Asp Asp Pro325 330 335gac gcg ctg gac ttc cac cgc gcc gac cgg cac cac gtg gcg ttc ggc 1056Asp Ala Leu Asp Phe His Arg Ala Asp Arg His His Val Ala Phe Gly340 345 350ttc ggc atc cac cag tgc ctg ggc cag aac ctg gcg cgc gcg gag ctg 1104Phe Gly Ile His Gln Cys Leu Gly Gln Asn Leu Ala Arg Ala Glu Leu355 360 365gag atc gcc ctc ggc agc ctg ttc acc cgg ttg ccc ggg ctg cgg ctc 1152Gln Ile Ala Leu Gly Ser Leu Phe Thr Arg Leu Pro Gly Leu Arg Leu370 375 380
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Leu Trp Asp Gly Ser Ala Pro Trp Leu Val Thr Arg Tyr Ala Asp Gln50 55 60cgc gcc ctg ctc ggc gac ccg cgg gtc agc tcc gag gcc acc cgg ccc240Arg Ala Leu Leu Gly Asp Pro Arg Val Ser Ser Glu Ala Thr Arg Pro65 70 75 80ggc ttt ccg cat gcg agc gcc ggc ttc cgc gag aat gcc agg cgg cgg288Gly Phe Pro His Ala Ser Ala Gly Phe Arg Glu Asn Ala Arg Arg Arg85 90 95cgc tcc ttc atc acc atg gac gac ccc gag cac gcc cgg atc cgc cgg336Arg Ser Phe Ile Thr Met Asp Asp Pro Glu His Ala Arg Ile Arg Arg100 105 110atg gtc acc gcg ccg ttc gcc atc aag cgg gtc gag gcg atg cgg ccc384Met Val Thr Ala Pro Phe Ala Ile Lys Arg Val Glu Ala Met Arg Pro115 120 125gac atc cag aag atc acc gac gat ctg atc gac tcc atg ctg gcc ggg432Asp Ile Gln Lys Ile Thr Asp Asp Leu Ile Asp Ser Met Leu Ala Gly130 135 140ccg acc ccg gtc gac ctg gtg cgc gcg ttg gcg ctg ccg ctg ccg tcg480Pro Thr Pro Val Asp Leu Val Arg Ala Leu Ala Leu Pro Leu Pro Ser145 150 155 160ctg gtg atc tgc cgg ctg ctc gga gtg ccg tac gag gac cac gac ttc528Leu Val Ile Cys Arg Leu Leu Gly Val Pro Tyr Glu Asp His Asp Phe165 170 175ttc cag cgc aac agc tcg ctc ctg atc aac cgt aac tcc acg acc gaa576Phe Gln Arg Asn Ser Ser Leu Leu Ile Asn Arg Asn Ser Thr Thr Glu180 185 190gag gtg gtc ggc gcc aac gag gcg ctg acc gac tat ctg gac gag ctg624Glu Val Val Gly Ala Asn Glu Ala Leu Thr Asp Tyr Leu Asp Glu Leu195 200 205gtc agc gcc aaa ctc gcc aac ccc gcc gac gac atg ctc tcc gag ctg672Val Ser Ala Lys Leu Ala Asn Pro Ala Asp Asp Met Leu Ser Glu Leu210 215 220gcc gcc cgg gtc acg gcc gga gag ctg acc cag cgc gag gcc gcc aat720Ala Ala Arg Val Thr Ala Gly Glu Leu Thr Gln Arg Glu Ala Ala Asn225 230 235 240atg ggc gtg ctg ctg ctg atc gcc ggc cat gag acc acc gcc aac atg768Met Gly Val Leu Leu Leu Ile Ala Gly His Glu Thr Thr Ala Asn Met245 250 255atc gcc ctc ggc acc gtc gcc ctg ctg gag aac ccc gac cag ctc gcc816Ile Ala Leu Gly Thr Val Ala Leu Leu Glu Asn Pro Asp Gln Leu Ala260 265 270gtc ctg cgg gag acc gac gac ccg aag gcg gtc gcc aag gcc gtc gag864Val Leu Arg Glu Thr Asp Asp Pro Lys Ala Val Ala Lys Ala Val Glu275 280 285gaa ctg ctg cgc tat ctg acc atc gtg cac acc ggc cgg cgc cgg gtc912Glu Leu Leu Arg Tyr Leu Thr Ile Val His Thr Gly Arg Arg Arg Val290 295 300gcg cgg gag gac atc gag atc ggc ggc gag acc atc cgt gcc ggg gac960Ala Arg Glu Asp Ile Glu Ile Gly Gly Glu Thr Ile Arg Ala Gly Asp305 310 315 320ggg atc atc atc tac acc ggc acc ggc aac tgg gac gcg gag gtc ttc 1008Gly Ile Ile Ile Tyr Thr Gly Thr Gly Asn Trp Asp Ala Glu Val Phe325 330 335ccc gag ccc gag cgg ctg gac atc ggc cgc gac gcc cgc cgc cac atg 1056Pro Glu Pro Glu Arg Leu Asp Ile Gly Arg Asp Ala Arg Arg His Met340 345 350
gcg ttc ggt ttc ggc gtc cac cag tgc ctg ggc cag ccg ctg gcc cgg 1104Ala Phe Gly Phe Gly Val His Gln Cys Leu Gly Gln Pro Leu Ala Arg355 360 365gtg gag ctg cag gtg gtc tac ggc acg ctc tac cgc cgt atc ccc acg 1152Val Glu Leu Gln Val Val Tyr Gly Thr Leu Tyr Arg Arg Ile Pro Thr370 375 380ctg cgg ctg gcg acc ggg gtc gac caa cta ccg ttc aag gac gac ggt 1200Leu Arg Leu Ala Thr Gly Val Asp Gln Leu Pro Phe Lys Asp Asp Gly385 390 395 400ttg gtc tac ggc gtc tat gaa ctg ccc gtc acc tgg acg tct tga 1245Leu Val Tyr Gly Val Tyr Glu Leu Pro Val Thr Trp Thr Ser405 410<210>234<211>1197<212>DNA<213>斯堡鏈霉菌(Streptomyces steffisburgensis)IFO 13446T<220>
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Phe Gly Glu Leu Ile Asp Arg Lys Arg Lys Glu Pro Gly Ala Gly Leu195 200 205ctg gac gac ctg gtc cag cga cag ctg cgc gac ggc gca ctc gac cgc672Leu Asp Asp Leu Val Gln Arg Gln Leu Arg Asp Gly Ala Leu Asp Arg210 215 220gag ggc ctg atc gcc ctg gcg ctc atc ctg ctg gtc gcg ggc cac gag720Glu Gly Leu Ile Ala Leu Ala Leu Ile Leu Leu Val Ala Gly His Glu225 230 235 240acg acc gcc aac atg atc tcg ctc ggc acc ttc acc ctg ctg cag cac768Thr Thr Ala Asn Met Ile Ser Leu Gly Thr Phe Thr Leu Leu Gln His245 250 255ccc gaa cgg ctc gcc gag ctg cgc gcc gac ccg cgg ctg ctg cct gcg816Pro Glu Arg Leu Ala Glu Leu Arg Ala Asp Pro Arg Leu Leu Pro Ala260 265 270gcg gtc gag gag ctg atg cgc atg ctg tcc atc gcg gac ggt ctg ctc864Ala Val Glu Glu Leu Met Arg Met Leu Ser Ile Ala Asp Gly Leu Leu275 280 285cgc ctc gcc gtc gag gac ata gag gtg gcc ggg acc acg atc cgc aag912Arg Leu Ala Val Glu Asp Ile Glu Val Ala Gly Thr Thr Ile Arg Lys290 295 300ggg gac ggc gtg gtg ttc ctg acg tcc gtc atc aac cgc gac gag acg960Gly Asp Gly Val Val Phe Leu Thr Ser Val Ile Asn Arg Asp Glu Thr305 310 315 320gtc tac ccc gag ccg gac acc ctc gac tgg cac cgc tcg gcc cgg cat 1008Val Tyr Pro Glu Pro Asp Thr Leu Asp Trp His Arg Ser Ala Arg His325 330 335cac gtc gcg ttc ggc ttc ggc atc cac cag tgc ctc ggc cag aac ctc 1056His Val Ala Phe Gly Phe Gly Ile His Gln Cys Leu Gly Gln Asn Leu340 345 350gcg cgc gcc gag ctg gag atc gcc ctg tgg acc ctc ttc gac cgt ctg 1104Ala Arg Ala Glu Leu Glu Ile Ala Leu Trp Thr Leu Phe Asp Arg Leu355 360 365ccc acc ctg cgc ctg gcc gcg ccg gcc gag gag atc gcc ttc aag ccg 1152Pro Thr Leu Arg Leu Ala Ala Pro Ala Glu Glu Ile Ala Phe Lys Pro370 375 380ggc gac acg atc cag ggg atg ctg gaa ctc ccc gtg act tgg taa 1197Gly Asp Thr Ile Gln Gly Met Leu Glu Leu Pro Val Thr Trp385 390 395<210>235<211>1454<212>DNA<213>裝飾鏈霉菌(Streptomyces ornatus)IFO 13069t<220>
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85 90 95gcg aac gtc gag cgg agg cga gtg gcc ctg ctc ggc gtc gac gac ccc336Ala Asn Val Glu Arg Arg Arg Val Ala Leu Leu Gly Val Asp Asp Pro100 105 110gag cac aac gcc cag cgc agg atg ctc atc ccg agc ttc tcc gtg aag384Glu His Asn Ala Gln Arg Arg Met Leu Ile Pro Ser Phe Ser Val Lys115 120 125cgg ata gcc gcg ctg cgc ccc cgc atc cag gag acg gtg gac gga ctg432Arg Ile Ala Ala Leu Arg Pro Arg Ile Gln Glu Thr Val Asp Gly Leu130 135 140ctg gac gcg atg gag cgg cag ggc ccg ccg tcc gaa ctg gtc gcc gac480Leu Asp Ala Met Glu Arg Gln Gly Pro Pro Ser Glu Leu Val Ala Asp145 150 155 160ttc gcg ctg ccg gtg ccg tcg atg gtg atc tgc gcg ctc ctc ggt gtg528Phe Ala Leu Pro Val Pro Ser Met Val Ile Cys Ala Leu Leu Gly Val165 170 175ccg tac gcc gac cac gag ttc ttc gag ggc tgc tcc cgg cgg ctc ctg576Pro Tyr Ala Asp His Glu Phe Phe Glu Gly Cys Ser Arg Arg Leu Leu180 185 190cag ggc ccg ggc gcg gcc gat gtg aac gag gcc cgg atc gag ctg gag624Gln Gly Pro Gly Ala Ala Asp Val Asn Glu Ala Arg Ile Glu Leu Glu195 200 205ggc tat ctg ggc gcc ctg atc gac cgc aag cgg gtg gag ccg ggg gag672Gly Tyr Leu Gly Ala Leu Ile Asp Arg Lys Arg Val Glu Pro Gly Glu210 215 220ggg ctc ctg gac gaa ctg atc cac cgg gac cac ccc ggc gga ccc gtc720Gly Leu Leu Asp Glu Leu Ile His Arg Asp His Pro Gly Gly Pro Val225 230 235 240gac cgc gag gac ctc gtc tcg ttc gcg gtg atc ctc ctc gtc gcg ggg768Asp Arg Glu Asp Leu Val Ser Phe Ala Val Ile Leu Leu Val Ala Gly245 250 255cac gag acg acg gcg aac atg atc tcg ctc ggc acg ttc acg ctg ctg816His Glu Thr Thr Ala Asn Met Ile Ser Leu Gly Thr Phe Thr Leu Leu260 265 270aac cac ccg gaa cag ctg gag gcg ctg cgc tcc ggg agg acg acg acg864Asn His Pro Glu Gln Leu Glu Ala Leu Arg Ser Gly Arg Thr Thr Thr275 280 285gcc gcg gtg gtc gag gaa ctg ctg cgg ttc ctc tcc atc gcc gag gga912Ala Ala Val Val Glu Glu Leu Leu Arg Phe Leu Ser Ile Ala Glu Gly290 295 300ctg caa cgg ctg gcc acc gag gac atc gag gtg gcc ggg acg acg atc960Leu Gln Arg Leu Ala Thr Glu Asp Ile Glu Val Ala Gly Thr Thr Ile305 310 315 320cgc gag gga gag ggc gtg ttc ttc tcg acc tcg ctc atc aac cgc gac 1008Arg Glu Gly Glu Gly Val Phe Phe Ser Thr Ser Leu Ile Asn Arg Asp325 330 335acc gag gtc tac gag aat ccg gag acg ctc gac tgg gac cgg cct tcc 1056Thr Glu Val Tyr Glu Asn Pro Glu Thr Leu Asp Trp Asp Arg Pro Ser340 345 350cgg cac cac ctc gcc ttc ggc ttc ggc gtc cac cag tgc ctg ggc cag 1104Arg His His Leu Ala Phe Gly Phe Gly Val His Gln Cys Leu Gly Gln355 360 365aat ctg gcc cgc acc gag ctc gac atc gcc ctg cgc act ctc ttc gag 1152Asn Leu Ala Arg Thr Glu Leu Asp Ile Ala Leu Arg Thr Leu Phe Glu370 375 380cgg ctg ccg gga ctc agg ctc gcc gtg ccc gcg cac gag atc cgg cac 1200
Arg Leu Pro Gly Leu Arg Leu Ala Val Pro Ala His Glu Ile Arg His385 390 395 400aaa ccc ggg gac acg atc cag ggc ctt ctg cac ctg ccc gtg gcc tgg1248Lys Pro Gly Asp Thr Ile Gln Gly Leu Leu His Leu Pro Val Ala Trp405 410 415tga gcggc atg ggc gtg cgg gtc gac agg gaa cgg tgc gtg ggg gcc ggc 1298Met Gly Val Arg Val Asp Arg Glu Arg Cys Val Gly Ala Gly420 425 430atg tgc gcg ctg acc gcg ccc gac gtg ttc acg cag gac gac gac ggg1346Met Cys Ala Leu Thr Ala Pro Asp Val Phe Thr Gln Asp Asp Asp Gly435 440 445ttc agc gag atg ctt ccc ggg agc acg gcg ggg acg ggg gac cac cca1394Phe Ser Glu Met Leu Pro Gly Ser Thr Ala Gly Thr Gly Asp His Pro450 455 460cgg gtg cgg gag gcc gtt cgg gcc tgc ccg gtc ggg gcg gtg tcc ctg1442Arg Val Arg Glu Ala Val Arg Ala Cys Pro Val Gly Ala Val Ser Leu465 470 475acc gac gac tga1454Thr Asp Asp480<210>237<211>1449<212>DNA<213>不產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces achromogenes)IFO 12735<220>
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130 135 140ggg gcc gaa ctg gtc tcc gcc ttc gcg ctg ccc gtg ccg tcc atg gtc 480Gly Ala Glu Leu Val Ser Ala Phe Ala Leu Pro Val Pro Ser Met Val145 150 155 160atc tgc ggc ctg ctc ggc gtg ccc tac gcc gac cac gag ttc ttc gag 528Ile Cys Gly Leu Leu Gly Val Pro Tyr Ala Asp His Glu Phe Phe Glu165 170 175gag cag tcc cgc cgg ctg ctg cgc ggg ccg acc agc gcc gac acc ctg 576Glu Gln Ser Arg Arg Leu Leu Arg Gly Pro Thr Ser Ala Asp Thr Leu180 185 190gac gcc cgg gac cgg ctg gag cgg ttc ctc ggc gac ctg atc gac gcc 624Asp Ala Arg Asp Arg Leu Glu Arg Phe Leu Gly Asp Leu Ile Asp Ala195 200 205aag gcc aag gag gcc gag ccc ggc gac ggc att ctg gac gac ctc gtc 672Lys Ala Lys Glu Ala Glu Pro Gly Asp Gly Ile Leu Asp Asp Leu Val210 215 220cac cac cgg ctc cgc gag ggc gaa ctg gac cgg ggt gac ctg gtg tcg 720His His Arg Leu Arg Glu Gly Glu Leu Asp Arg Gly Asp Leu Val Ser225 230 235 240ctc gcc gtg atc ctg ttg gtc gcc ggg cac gag acg acc gcc aac atg 768Leu Ala Val Ile Leu Leu Val Ala Gly His Glu Thr Thr Ala Asn Met245 250 255atc tcc ctg ggc acc tac acc ctg ctc cag cac ccc gac cgg ctg gcc 816Ile Ser Leu Gly Thr Tyr Thr Leu Leu Gln His Pro Asp Arg Leu Ala260 265 270gag ctg cgg gcc gac ccc gcg ctg ctg ccc gcc gtc gtc gag gaa ctg 864Glu Leu Arg Ala Asp Pro Ala Leu Leu Pro Ala Val Val Glu Glu Leu275 280 285atg cgg atg ctg tcc atc gcc gag ggg ctg caa cgg gtg gcg ctg gag 912Met Arg Met Leu Ser Ile Ala Glu Gly Leu Gln Arg Val Ala Leu Glu290 295 300gac gtc gag atc gcc ggc acc acc atc cgg gcc ggc gac ggc gtc ctg 960Asp Val Glu Ile Ala Gly Thr Thr Ile Arg Ala Gly Asp Gly Val Leu305 310 315 320ttc tcc acc tcg gtc atc aac cgg gac acg gcc gtc tac gac gac ccc1008Phe Ser Thr Ser Val Ile Asn Arg Asp Thr Ala Val Tyr Asp Asp Pro325 330 335gac gcg ctg gac ttc cac cgc gcc gac cgg cac cac gtg gcg ttc ggc1056Asp Ala Leu Asp Phe His Arg Ala Asp Arg His His Val Ala Phe Gly340 345 350ttc ggc atc cac cag tgc ctg ggc cag aac ctg gcg cgc gcg gag ctg1104Phe Gly Ile His Gln Cys Leu Gly Gln Asn Leu Ala Arg Ala Glu Leu355 360 365gag atc gcc ctc ggc agc ctg ttc acc cgg ttg ccc ggg ctg cgg ctc1152Glu Ile Ala Leu Gly Ser Leu Phe Thr Arg Leu Pro Gly Leu Arg Leu370 375 380gcc gct ccg gcc gag gag atc ccc ttc aaa ccg ggc gac acg atc cag1200Ala Ala Pro Ala Glu Glu Ile Pro Phe Lys Pro Gly Asp Thr Ile Gln385 390 395 400ggg atg ctg gaa ctc ccc gtg acc tgg taa gaggcttcgc tc atg cac atg 1251Gly Met Leu Glu Leu Pro Val Thr Trp Met His Met405 410gac atc gac atc gac cag gac gtc tgt atc ggc gcc ggg cag tgc gcg1299Asp Ile Asp Ile Asp Gln Asp Val Cys Ile Gly Ala Gly Gln Cys Ala415 420 425ctg gcg gca ccg ggc gtc ttc acc cag gac gac gac ggc tac agc acc1347
Leu Ala Ala Pro Gly Val Phe Thr Gln Asp Asp Asp Gly Tyr Ser Thr430 435 440 445ctg ctg ccc ggc cgg gag aac ggc gtc acc gac ccg atg gtc cgg gag 1395Leu Leu Pro Gly Arg Glu Asn Gly Val Thr Asp Pro Met Val Arg Glu450 455 460gcc gcc cgc gcc tgc ccg gtc agc gcc atc acc gta cga gag cgc acc 1443Ala Ala Arg Ala Cys Pro Val Ser Ala Ile Thr Val Arg Glu Arg Thr465 470 475gcc tga 1449Ala<210>238<211>1454<212>DNA<213>灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)IFO 13849T<220>
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<221>CDS<222>(1299)..(1454)<400>238atg acg gaa tcc acg acg gaa ccg gcc cgc cag gac gcc gcc ctc acc 48Met Thr Glu Ser Thr Thr Glu Pro Ala Arg Gln Asp Ala Ala Leu Thr1 5 10 15ggc gcc acc acc gaa ccg acc tcc gcc cca ccg ttc ccg cag gac cgc 96Gly Ala Thr Thr Glu Pro Thr Ser Ala Pro Pro Phe Pro Gln Asp Arg20 25 30gag tgc ccc tac cac ccg ccc acc ggg tac gaa ccg ctg cgc gcg gac144Glu Cys Pro Tyr His Pro Pro Thr Gly Tyr Glu Pro Leu Arg Ala Asp35 40 45cgg ccg ttg agc cgg gtc acg ctc tac gac gga cgc ccg gtc tgg gcc192Arg Pro Leu Ser Arg Val Thr Leu Tyr Asp Gly Arg Pro Val Trp Ala50 55 60gtc acc gga cac gcc ctg gcc cgc cgc ctc ctg gcc gac ccc cga ctc240Val Thr Gly His Ala Leu Ala Arg Arg Leu Leu Ala Asp Pro Arg Leu65 70 75 80tcc acc gac cgc acc cac ccc gcc ttc ccc gtc ccg gcc gag cgg ttc288Ser Thr Asp Arg Thr His Pro Ala Phe Pro Val Pro Ala Glu Arg Phe85 90 95gcg cag acc cgg cag cgg cgc gtg gcc ctg ctc ggc gtc gac gac ccc336Ala Gln Thr Arg Gln Arg Arg Val Ala Leu Leu Gly Val Asp Asp Pro100 105 110gag cac aac acc cag cgc agg atg ctc atc ccg agc ttc tcc gtg aaa384Glu His Asn Thr Gln Arg Arg Met Leu Ile Pro Ser Phe Ser Val Lys115 120 125cgg atc gcc gcg ctg cgc ccc cgt atc cag gag acg gtg gac cgg ctg432Arg Ile Ala Ala Leu Arg Pro Arg Ile Gln Glu Thr Val Asp Arg Leu130 135 140ctg gac gcc atg gag cgg cag ggg ccg ccg tcc gaa ctg gtc gcc gac480Leu Asp Ala Met Glu Arg Gln Gly Pro Pro Ser Glu Leu Val Ala Asp145 150 155 160ttc gcg ctg ccg gtg ccg tcc atg gtg atc tgc gcc ctc ctc ggc gtg528Phe Ala Leu Pro Val Pro Ser Met Val Ile Cys Ala Leu Leu Gly Val165 170 175ccc tac gcc gac cac gcg ctc ttc gag ggc tgt tcg cgc cgg ctc ctg576Pro Tyr Ala Asp His Ala Leu Phe Glu Gly Cys Ser Arg Arg Leu Leu180 185 190
cgc ggt ccg ggc gcg gac gac gtg gac gcg gcc cgc gtc gaa ctg gag 624Arg Gly Pro Gly Ala Asp Asp Val Asp Ala Ala Arg Val Glu Leu Glu195 200 205gag tac ctc ggc gcg ttg atc gac cgc aaa cgc gcc gat ccg ggg gag 672Glu Tyr Leu Gly Ala Leu Ile Asp Arg Lys Arg Ala Asp Pro Gly Glu210 215 220ggg ctg ctg gac gag ctg atc cac cgg gac cgt ccg gac gga ccc gtg 720Gly Leu Leu Asp Glu Leu Ile His Arg Asp Arg Pro Asp Gly Pro Val225 230 235 240agc cgg gag gac ctc gtc tcc ttc gcc ctg atc ctg ctc gtc gcc gga 768Ser Arg Glu Asp Leu Val Ser Phe Ala Leu Ile Leu Leu Val Ala Gly245 250 255cac gag acg acc gcg aac atg atc tcg ctc ggc acg ttc acc ctg ctg 816His Glu Thr Thr Ala Asn Met Ile Ser Leu Gly Thr Phe Thr Leu Leu260 265 270cgc cac ccc ggt caa ctg gcg gcg ctg cgc tcg ggg gag acc acg acg 864Arg His Pro Gly Gln Leu Ala Ala Leu Arg Ser Gly Glu Thr Thr Thr275 280 285gcc gtc gtg gtc gag gag ttg ctg cgc ttc ctc tcc atc gcc gag ggg 912Ala Val Val Val Glu Glu Leu Leu Arg Phe Leu Ser Ile Ala Glu Gly290 295 300ctg caa cgc ctc gcg atc gag gac atc gag gtg gac ggg acg acg atc 960Leu Gln Arg Leu Ala Ile Glu Asp Ile Glu Val Asp Gly Thr Thr Ile305 310 315 320cgc gag ggg gag ggc gtc ttc ttc tcc acc tcg ctc gtc aac cgc gac1008Arg Glu Gly Glu Gly Val Phe Phe Ser Thr Ser Leu Val Asn Arg Asp325 330 335gcc gac gtg ttc gcg gac ccg gag acc ctg gac tgg gag cgg tcc gcc1056Ala Asp Val Phe Ala Asp Pro Glu Thr Leu Asp Trp Glu Arg Ser Ala340 345 350cgg cac cac ctc gcg ttc ggc ttc ggc gtc cac cag tgc ctg gga cag1104Arg His His Leu Ala Phe Gly Phe Gly Val His Gln Cys Leu Gly Gln355 360 365aac ctg gcc cgc gcc gaa ctc gac atc gcg ctc cgc acg ctc ttc gaa1152Asn Leu Ala Arg Ala Glu Leu Asp Ile Ala Leu Arg Thr Leu Phe Glu370 375 380cgg ctg ccc gcg ctc agg ctc gcc gta ccg gcg gac gag gtg agg cac1200Arg Leu Pro Ala Leu Arg Leu Ala Val Pro Ala Asp Glu Val Arg His385 390 395 400aag ccc ggc gac acc atc cag ggc ctg ctc gaa ctg ccc gtg gcc tgg1248Lys Pro Gly Asp Thr Ile Gln Gly Leu Leu Glu Leu Pro Val Ala Trp405 410 415tga gcggcgtgga cgtccaggta aacagggaac gctgcgtggg agccggc atg tgc1304Met Cysgcg ctg acc gcg ccg gag gtg ttc aca cag gac gac gac ggt ttc agc1352Ala Leu Thr Ala Pro Glu Val Phe Thr Gln Asp Asp Asp Gly Phe Ser420 425 430 435gag gtg cgt ccc ggt ggc acg gcc gcc act gct ggc cac ccg ctg gta1400Glu Val Arg Pro Gly Gly Thr Ala Ala Thr Ala Gly His Pro Leu Val440 445 450cgc gat gcc gca cgg gcc tgc ccg gtc ggg gcg gtg acc ctg acc gac1448Arg Asp Ala Ala Arg Ala Cys Pro Val Gly Ala Val Thr Leu Thr Asp455 460 465gac tga1454Asp
<210>239<211>1461<212>DNA<213>羊毛鏈霉菌(Streptomyces lanatus)IFO 12787T<220>
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Leu Leu Val Ala Gly His Glu Thr Thr Ala Asn Met Ile Ser Leu Gly245 250 255acc ttc aca ctg ctc caa cac ccg gag cag ctg gcc gag ttg cgc gcc 816Thr Phe Thr Leu Leu Gln His Pro Glu Gln Leu Ala Glu Leu Arg Ala260 265 270gac gcc ggg ttg ctg ccc gcc gcg gtc gag gag ctc atg cgg atg ctg 864Asp Ala Gly Leu Leu Pro Ala Ala Val Glu Glu Leu Met Arg Met Leu275 280 285tcg atc gcg gac ggg ctg ctg cgc gtc gcc tcc gag gac atc gag gcg 912Ser Ile Ala Asp Gly Leu Leu Arg Val Ala Ser Glu Asp Ile Glu Ala290 295 300ggc ggc gag acg atc cgg gcg ggc gac ggc gtg gtc ttc tcg acc tcg 960Gly Gly Glu Thr Ile Arg Ala Gly Asp Gly Val Val Phe Ser Thr Ser305 310 315 320gtc atc aac cgc gac gag tcc gtc tac ccc gac ccc gat gcc atc gac1008Val Ile Asn Arg Asp Glu Ser Val Tyr Pro Asp Pro Asp Ala Ile Asp325 330 335tgg cac cgc ccc acc cgc cac cac atc gcc ttc ggg ttc ggc atc cac1056Trp His Arg Pro Thr Arg His His Ile Ala Phe Gly Phe Gly Ile His340 345 350cag tgc ctc ggc cag aac ctg gcc cgc gcc gag atg gag atc gcc ctg1104Gln Cys Leu Gly Gln Asn Leu Ala Arg Ala Glu Met Glu Ile Ala Leu355 360 365cgc acc ctc ttc gag cgc ctg ccc acc ctg cgc ctt gcc gtc ccg gcg1152Arg Thr Leu Phe Glu Arg Leu Pro Thr Leu Arg Leu Ala Val Pro Ala370 375 380ggg gaa atc ccc ttc aaa ccc ggc gac acg atc cag ggg atg ctg gaa1200Gly Glu Ile Pro Phe Lys Pro Gly Asp Thr Ile Gln Gly Met Leu Glu385 390 395 400ctc ccc gtg acc tgg taa gaggctccgg tc atg cac aac gaa acg cac gaa 1251Leu Pro Val Thr Trp Met His Asn Glu Thr His Glu405 410tca ggc cat atc cac atc gac atc gac cat gac gtc tgc gtc ggc gcc1299Ser Gly His Ile His Ile Asp Ile Asp His Asp Val Cys Val Gly Ala415 420 425ggg cag tgc gcc ctc gcc gcc ccc tcc gtg ttc acc cag gac gac gac1347Gly Gln Cys Ala Leu Ala Ala Pro Ser Val Phe Thr Gln Asp Asp Asp430 435 440 445ggc ttc agc acc ctg ctt ccc ggc cgc gag gac ggc ggc ggc gac ccc1395Gly Phe Ser Thr Leu Leu Pro Gly Arg Glu Asp Gly Gly Gly Asp Pro450 455 460atg gtg cgg gag gcg gcc cgg gcg tgc ccg gtc agc gcc atc acc gtg1443Met Val Arg Glu Ala Ala Arg Ala Cys Pro Val Ser Ala Ile Thr Val465 470 475tcc gaa ggg ggg agt tga1461Ser Glu Gly Gly Ser480<210>240<211>1458<212>DNA<213>三澤鏈霉菌(Streptomyces misawanensis)IFO 13855T<220>
<221>CDS<222>(1)..(1245)<220>
<221>CDS<222>(1258)..(1458)
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Val Glu Glu Leu Met Arg Met Leu Ser Ile Ala Asp Gly Leu Leu Arg290 295 300gtc gca ctg gag gac atc gag acg gac ggc ggc acc acc atc cgc aag 960Val Ala Leu Glu Asp Ile Glu Thr Asp Gly Gly Thr Thr Ile Arg Lys305 310 315 320ggc gag ggc gtg ctc ttc gcg acc tcg gtc atc aac cgt gac gag tcc1008Gly Glu Gly Val Leu Phe Ala Thr Ser Val Ile Asn Arg Asp Glu Ser325 330 335gtg tac gac gac ccc gac gcc ctc gac tgg cac cgc ccg gcc cgc cac1056Val Tyr Asp Asp Pro Asp Ala Leu Asp Trp His Arg Pro Ala Arg His340 345 350cac gtg gcc ttc ggc ttc ggc atc cac cag tgc ctg ggc cag aac ctg1104His Val Ala Phe Gly Phe Gly Ile His Gln Cys Leu Gly Gln Asn Leu355 360 365gcc cgc acc gag ctg gag atc gcc ctg cgc acc ctg tgg gag cgg ctc1152Ala Arg Thr Glu Leu Glu Ile Ala Leu Arg Thr Leu Trp Glu Arg Leu370 375 380ccg gac ctg cgg ctc gcc gca ccg ccg gag gag att ccc ttc aaa ccc1200Pro Asp Leu Arg Leu Ala Ala Pro Pro Glu Glu Ile Pro Phe Lys Pro385 390 395 400ggc gac acg atc cag ggg atg ctg gaa ctc ccc gtg acc tgg taa gaggc 1250Gly Asp Thr Ile Gln Gly Met Leu Glu Leu Pro Val Thr Trp405 410 415tcctgcc atg cac atc gag atc gac agt gac gtc tgc atc ggc gcg ggg1299Met His Ile Glu Ile Asp Ser Asp Val Cys Ile Gly Ala Gly420 425cag tgt gcc ctg acc gcc ccc aac gtc ttc acc cag gac gac gac ggt1347Gln Cys Ala Leu Thr Ala Pro Asn Val Phe Thr Gln Asp Asp Asp Gly430 435 440 445ttc agc acc ctg ctc ccc ggg atg gcg gac ggc ggc ggc gac ccg ctg1395Phe Ser Thr Leu Leu Pro Gly Met Ala Asp Gly Gly Gly Asp Pro Leu450 455 460gtc aag gag gcg gcc cgg gcc tgc ccg gtg cac gcc atc acg gtc gag1443Val Lys Glu Ala Ala Arg Ala Cys Pro Val His Ala Ile Thr Val Glu465 470 475gaa ccg tcg ggt tag1458Glu Pro Ser Gly480<210>241<211>1448<212>DNA<213>蒼白色鏈霉菌(Streptomyces pallidus)IFO 13434T<220>
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Glu Glu Asp Gly Ile Val Ile Leu Leu Asp Glu Gln Pro Ala Ser Glu445 450 455ctc cac gcc gat gtg cgt gag tcc gcg gtg gtc tgc ccg gcg gcg gcg 1445Leu His Ala Asp Val Arg Glu Ser Ala Val Val Cys Pro Ala Ala Ala460 465 470ata cgg gtg gtc gag aat tga 1466Ile Arg Val Val Glu Asn475 480<210>244<211>1411<212>DNA<213>斯堡鏈霉菌(Streptomyces steffisburgensis)IFO 13446T<220>
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<221>CDS<222>(1211)..(1411)<400>244atg tcg gac acg acc gca ccc gtg gcc ttc ccc cag agc cgg acc tgc 48Met Ser Asp Thr Thr Ala Pro Val Ala Phe Pro Gln Ser Arg Thr Cys1 5 10 15ccc tac cac ccg ccc gcc gcc tac gag ccg ctg cgc gcc gag cgc ccc 96Pro Tyr His Pro Pro Ala Ala Tyr Glu Pro Leu Arg Ala Glu Arg Pro20 25 30ctg acc cgt atc acc ctc ttc gac ggc cgt gag gcc tgg ctg gtc agc144Leu Thr Arg Ile Thr Leu Phe Asp Gly Arg Glu Ala Trp Leu Val Ser35 40 45ggc cac gcc acc gcc cgc gcg ctg ctc gcc gac ccg cgc ctg tcc tcc192Gly His Ala Thr Ala Arg Ala Leu Leu Ala Asp Pro Arg Leu Ser Ser50 55 60gac cgc gac cgc ccc ggc ttc ccc gcc ccc acc gcg cgc ttc gcc ggg240Asp Arg Asp Arg Pro Gly Phe Pro Ala Pro Thr Ala Arg Phe Ala Gly65 70 75 80atc cgc aac cgc aga acg gcc ctg ctg ggc gtc gac gac ccc gag cac288Ile Arg Asn Arg Arg Thr Ala Leu Leu Gly Val Asp Asp Pro Glu His85 90 95cga gtc cag cgg cgg atg gtg gcc ggg gac ttc acc ctc aaa cgg gcc336Arg Val Gln Arg Arg Met Val Ala Gly Asp Phe Thr Leu Lys Arg Ala100 105 110gcc gga ctg cga ccc cgc atc cag cgg atc gtg gac cga cga ctc gac384Ala Gly Leu Arg Pro Arg Ile Gln Arg Ile Val Asp Arg Arg Leu Asp115 120 125gcg atg atc gcc cag ggc cca ccg gcc gac ctg gtg agc agc ttc gcg432Ala Met Ile Ala Gln Gly Pro Pro Ala Asp Leu Val Ser Ser Phe Ala130 135 140ctg ccc gtc ccg tcc atg gtg atc tgt gcc ctg ctc ggc gtc ccg tac480Leu Pro Val Pro Ser Met Val Ile Cys Ala Leu Leu Gly Val Pro Tyr145 150 155 160gcc gac cac gac ttc ttc gag acc cag tca cgg cgg ctg ctg cgc ggc528Ala Asp His Asp Phe Phe Glu Thr Gln Ser Arg Arg Leu Leu Arg Gly165 170 175ccg cag acc gcc gac gtg atg gac gcc cgg gcc cgg ctg gac gag tac576Pro Gln Thr Ala Asp Val Met Asp Ala Arg Ala Arg Leu Asp Glu Tyr180 185 190ttc ggc gaa ctg atc gac cgc aag cgg aag gaa ccc ggc gcc ggc ctg624Phe Gly Glu Leu Ile Asp Arg Lys Arg Lys Glu Pro Gly Ala Gly Leu
195 200 205ctg gac gac ctg gtc cag cga cag ctg cgc gac ggc gca ctc gac cgc 672Leu Asp Asp Leu Val Gln Arg Gln Leu Arg Asp Gly Ala Leu Asp Arg210 215 220gag ggc ctg atc gcc ctg gcg ctc atc ctg ctg gtc gcg ggc cac gag 720Glu Gly Leu Ile Ala Leu Ala Leu Ile Leu Leu Val Ala Gly His Glu225 230 235 240acg acc gcc aac atg atc tcg ctc ggc acc ttc acc ctg ctg cag cac 768Thr Thr Ala Asn Met Ile Ser Leu Gly Thr Phe Thr Leu Leu Gln His245 250 255ccc gaa cgg ctc gcc gag ctg cgc gcc gac ccg cgg ctg ctg cct gcg 816Pro Glu Arg Leu Ala Glu Leu Arg Ala Asp Pro Arg Leu Leu Pro Ala260 265 270gcg gtc gag gag ctg atg cgc atg ctg tcc atc gcg gac ggt ctg ctc 864Ala Val Glu Glu Leu Met Arg Met Leu Ser Ile Ala Asp Gly Leu Leu275 280 285cgc ctc gcc gtc gag gac ata gag gtg gcc ggg acc acg atc cgc aag 912Arg Leu Ala Val Glu Asp Ile Glu Val Ala Gly Thr Thr Ile Arg Lys290 295 300ggg gac ggc gtg gtg ttc ctg acg tcc gtc atc aac cgc gac gag acg 960Gly Asp Gly Val Val Phe Leu Thr Ser Val Ile Asn Arg Asp Glu Thr305 310 315 320gtc tac ccc gag ccg gac acc ctc gac tgg cac cgc tcg gcc cgg cat1008Val Tyr Pro Glu Pro Asp Thr Leu Asp Trp His Arg Ser Ala Arg His325 330 335cac gtc gcg ttc ggc ttc ggc atc cac cag tgc ctc ggc cag aac ctc1056His Val Ala Phe Gly Phe Gly Ile His Gln Cys Leu Gly Gln Asn Leu340 345 350gcg cgc gcc gag ctg gag atc gcc ctg tgg acc ctc ttc gac cgt ctg1104Ala Arg Ala Glu Leu Glu Ile Ala Leu Trp Thr Leu Phe Asp Arg Leu355 360 365ccc acc ctg cgc ctg gcc gcg ccg gcc gag gag atc gcc ttc aag ccg1152Pro Thr Leu Arg Leu Ala Ala Pro Ala Glu Glu Ile Ala Phe Lys Pro370 375 380ggc gac acg atc cag ggg atg ctg gaa ctc ccc gtg act tgg taa gaggc 1202Gly Asp Thr Ile Gln Gly Met Leu Glu Leu Pro Val Thr Trp385 390 395ttcccccc atg cac atc gac atc gac aag gac gtc tgc atc ggc gcg ggc 1252Met His Ile Asp Ile Asp Lys Asp Val Cys Ile Gly Ala Gly400 405 410cag tgc gcc ctg acc gcc ccg gac gtg ttc acc cag gac gac gac ggc1300Gln Cys Ala Leu Thr Ala Pro Asp Val Phe Thr Gln Asp Asp Asp Gly415 420 425atc agc gcc ctg ctg ccg gga cag gag gac ggc ggc ggc agc ccg ctg1348Ile Ser Ala Leu Leu Pro Gly Gln Glu Asp Gly Gly Gly Ser Pro Leu430 435 440 445gtg cgg gag gcg gcc cgt gcc tgc ccg gtg agc gcc atc acc gtg tcg1396Val Arg Glu Ala Ala Arg Ala Cys Pro Val Ser Ala Ile Thr Val Ser450 455 460gag acg gtg agc tga1411Glu Thr Val Ser465<210>245<211>65<212>PRT<213>裝飾鏈霉菌(Streptomyces ornatus)IFO 13069t
<400>245Met Gly Val Arg Val Asp Arg Glu Arg Cys Val Gly Ala Gly Met Cys1 5 10 15Ala Leu Thr Ala Pro Asp Val Phe Thr Gln Asp Asp Asp Gly Phe Ser20 25 30Glu Met Leu Pro Gly Ser Thr Ala Gly Thr Gly Asp His Pro Arg Val35 40 45Arg Glu Ala Val Arg Ala Cys Pro Val Gly Ala Val Ser Leu Thr Asp50 55 60Asp65<210>246<211>65<212>PRT<213>灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)ATCC 10137<400>246Met Gly Val Arg Val Asp Arg Glu Arg Cys Val Gly Ala Gly Met Cys1 5 10 15Ala Leu Thr Ala Pro Asp Val Phe Thr Gln Asp Asp Asp Gly Phe Ser20 25 30Glu Met Leu Pro Gly Ser Thr Ala Gly Thr Gly Asp His Pro Arg Val35 40 45Ara Glu Ala Val Arg Ala Cys Pro Val Gly Ala Val Ser Leu Thr Asp50 55 60Asp65<210>247<211>68<212>PRT<213>不產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces achromogenes)IFO 12735<400>247Met His Met Asp Ile Asp Ile Asp Gln Asp Val Cys Ile Gly Ala Gly1 5 10 15Gln Cys Ala Leu Ala Ala Pro Gly Val Phe Thr Gln Asp Asp Asp Gly20 25 30Tyr Ser Thr Leu Leu Pro Gly Arg Glu Asn Gly Val Thr Asp Pro Met35 40 45Val Arg Glu Ala Ala Arg Ala Cys Pro Val Ser Ala Ile Thr Val Arg50 55 60Glu Arg Thr Ala65<210>248<211>51<212>PRT<213>灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)IFO 13849T<400>248Met Cys Ala Leu Thr Ala Pro Glu Val Phe Thr Gln Asp Asp Asp Gly1 5 10 15Phe Ser Glu Val Arg Pro Gly Gly Thr Ala Ala Thr Ala Gly His Pro20 25 30Leu Val Arg Asp Ala Ala Arg Ala Cys Pro Val Gly Ala Val Thr Leu35 40 45Thr Asp Asp50<210>249<211>76<212>PRT<213>羊毛鏈霉菌(Streptomyces lanatus)IFO 12787T<400>249Met His Asn Glu Thr His Glu Ser Gly His Ile His Ile Asp Ile Asp1 5 10 15His Asp Val Cys Val Gly Ala Gly Gln Cys Ala Leu Ala Ala Pro Ser20 25 30Val Phe Thr Gln Asp Asp Asp Gly Phe Ser Thr Leu Leu Pro Gly Arg35 40 45Glu Asp Gly Gly Gly Asp Pro Met Val Arg Glu Ala Ala Arg Ala Cys50 55 60
Pro Val Ser Ala Ile Thr Val Ser Glu Gly Gly Ser65 70 75<210>250<211>66<212>PRT<213>三澤鏈霉菌(Streptomyces misawanensis)IFO 13855T<400>250Met His Ile Glu Ile Asp Ser Asp Val Cys Ile Gly Ala Gly Gln Cys1 5 10 15Ala Leu Thr Ala Pro Asn Val Phe Thr Gln Asp Asp Asp Gly Phe Ser20 25 30Thr Leu Leu Pro Gly Met Ala Asp Gly Gly Gly Asp Pro Leu Val Lys35 40 45Glu Ala Ala Arg Ala Cys Pro Val His Ala Ile Thr Val Glu Glu Pro50 55 60Ser Gly65<210>251<211>64<212>PRT<213>蒼白色鏈霉菌(Streptomyces pallidus)IFO 13434T<400>251Met Arg Val Glu Leu Asp Glu Pro Lys Cys Val Ala Ser Gly Gln Cys1 5 10 15Val Met Ala Ala Pro Glu Val Phe Asp Gln Arg Glu Glu Asp Gly Ile20 25 30Ala Phe Val Leu Asp Glu Arg Pro Ala Ala Asp Val Leu Ala Glu Val35 40 45Arg Glu Ala Val Ala Ile Cys Pro Ala Ala Ala Ile Arg Leu Val Glu50 55 60<210>252<211>66<212>PRT<213>玫瑰變紅鏈霉菌(Streptomyces roseorubens)IFO 13682T<400>252Met Arg Ile Asp Ile Asp Lys Asp Val Cys Ile Gly Ala Gly Gln Cys1 5 10 15Ala Leu Thr Ala Pro Asp Val Phe Thr Gln Asp Asp Asp Gly Tyr Ser20 25 30Thr Leu Leu Pro Gly Arg Glu Asp Gly Gly Gly Ser Pro Leu Leu Arg35 40 45Glu Ala Ala Arg Ala Cys Pro Val Ser Ala Ile Thr Val Ser Glu Thr50 55 60Val Gly65<210>253<211>65<212>PRT<213>魯?shù)劓溍咕?Streptomyces rutgersensis)IFO 15875T<400>253Met Arg Val Glu Val Asp Val Pro Lys Cys Val Ala Ser Gly Gln Cys1 5 10 15Val Met Ile Ala Pro Asp Val Phe Asp Gln Arg Glu Glu Asp Gly Ile20 25 30Val Ile Leu Leu Asp Glu Gln Pro Ala Ser Glu Leu His Ala Asp Val35 40 45Arg Glu Ser Ala Val Val Cys Pro Ala Ala Ala Ile Arg Val Val Glu50 55 60Asn65<210>254<211>66<212>PRT<213>斯堡鏈霉菌(Streptomyces steffisburgensis)IFO 13446T<400>254
Met His Ile Asp Ile Asp Lys Asp Val Cys Ile Gly Ala Gly Gln Cys1 5 10 15Ala Leu Thr Ala Pro Asp Val Phe Thr Gln Asp Asp Asp Gly Ile Ser20 25 30Ala Leu Leu Pro Gly Gln Glu Asp Gly Gly Gly Ser Pro Leu Val Arg35 40 45Glu Ala Ala Arg Ala Cys Pro Val Ser Ala Ile Thr Val Ser Glu Thr50 55 60Val Ser65<210>255<211>198<212>DNA<213>裝飾鏈霉菌(Streptomyces ornatus)IFO 13069t<220>
<221>CDS<222>(1)..(198)<400>255atg ggc gtg cgg gtc gac agg gaa cgg tgc gtg ggg gcc ggc atg tgc 48Met Gly Val Arg Val Asp Arg Glu Arg Cys Val Gly Ala Gly Met Cys1 5 10 15gcg ctg acc gcg ccc gac gtg ttc acg cag gac gac gac ggg ttc agc 96Ala Leu Thr Ala Pro Asp Val Phe Thr Gln Asp Asp Asp Gly Phe Ser20 25 30gag atg ctt ccc ggg agc acg gcg ggg acg ggg gac cac cca cgg gtg144Glu Met Leu Pro Gly Ser Thr Ala Gly Thr Gly Asp His Pro Arg Val35 40 45cgg gag gcc gtt cgg gcc tgc ccg gtc ggg gcg gtg tcc ctg acc gac192Arg Glu Ala Val Arg Ala Cys Pro Val Gly Ala Val Ser Leu Thr Asp50 55 60gac tga198Asp65<210>256<211>198<212>DNA<213>灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)ATCC 10137<220>
<221>CDS<222>(1)..(198)<400>256atg ggc gtg cgg gtc gac agg gaa cgg tgc gtg ggg gcc ggc atg tgc 48Met Gly Val Arg Val Asp Arg Glu Arg Cys Val Gly Ala Gly Met Cys1 5 10 15gcg ctg acc gcg ccc gac gtg ttc acg cag gac gac gac ggg ttc agc 96Ala Leu Thr Ala Pro Asp Val Phe Thr Gln Asp Asp Asp Gly Phe Ser20 25 30gag atg ctt ccc ggg agc acg gcg ggg acg ggg gac cac cca cgg gtg144Glu Met Leu Pro Gly Ser Thr Ala Gly Thr Gly Asp His Pro Arg Val35 40 45cgg gag gcc gtt cgg gcc tgc ccg gtc ggg gcg gtg tcc ctg acc gac192Arg Glu Ala Val Arg Ala Cys Pro Val Gly Ala Val Ser Leu Thr Asp50 55 60gac tga198Asp65<210>257<211>207<212>DNA<213>不產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces achromogenes)IFO 12735
<220>
<221>CDS<222>(1)..(207)<400>257atg cac atg gac atc gac atc gac cag gac gtc tgt atc ggc gcc ggg 48Met His Met Asp Ile Asp Ile Asp Gln Asp Val Cys Ile Gly Ala Gly1 5 10 15cag tgc gcg ctg gcg gca ccg ggc gtc ttc acc cag gac gac gac ggc 96Gln Cys Ala Leu Ala Ala Pro Gly Val Phe Thr Gln Asp Asp Asp Gly20 25 30tac agc acc ctg ctg ccc ggc cgg gag aac ggc gtc acc gac ccg atg144Tyr Ser Thr Leu Leu Pro Gly Arg Glu Asn Gly Val Thr Asp Pro Met35 40 45gtc cgg gag gcc gcc cgc gcc tgc ccg gtc agc gcc atc acc gta cga192Val Arg Glu Ala Ala Arg Ala Cys Pro Val Ser Ala Ile Thr Val Arg50 55 60gag cgc acc gcc tga207Glu Arg Thr Ala65<210>258<211>156<212>DNA<213>灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)IFO 13849T<220>
<221>CDS<222>(1)..(156)<400>258atg tgc gcg ctg acc gcg ccg gag gtg ttc aca cag gac gac gac ggt 48Met Cys Ala Leu Thr Ala Pro Glu Val Phe Thr Gln Asp Asp Asp Gly1 5 10 15ttc agc gag gtg cgt ccc ggt ggc acg gcc gcc act gct ggc cac ccg 96Phe Ser Glu Val Arg Pro Gly Gly Thr Ala Ala Thr Ala Gly His Pro20 25 30ctg gta cgc gat gcc gca cgg gcc tgc ccg gtc ggg gcg gtg acc ctg144Leu Val Arg Asp Ala Ala Arg Ala Cys Pro Val Gly Ala Val Thr Leu35 40 45acc gac gac tga156Thr Asp Asp50<210>259<211>231<212>DNA<213>羊毛鏈霉菌(Streptomyces lanatus)IFO 12787T<220>
<221>CDS<222>(1)..(231)<400>259atg cac aac gaa acg cac gaa tca ggc cat atc cac atc gac atc gac 48Met His Asn Glu Thr His Glu Ser Gly His Ile His Ile Asp Ile Asp1 5 10 15cat gac gtc tgc gtc ggc gcc ggg cag tgc gcc ctc gcc gcc ccc tcc 96His Asp Val Cys Val Gly Ala Gly Gln Cys Ala Leu Ala Ala Pro Ser20 25 30gtg ttc acc cag gac gac gac ggc ttc agc acc ctg ctt ccc ggc cgc144Val Phe Thr Gln Asp Asp Asp Gly Phe Ser Thr Leu Leu Pro Gly Arg35 40 45gag gac ggc ggc ggc gac ccc atg gtg cgg gag gcg gcc cgg gcg tgc192
Glu Asp Gly Gly Gly Asp Pro Met Val Arg Glu Ala Ala Arg Ala Cys50 55 60ccg gtc agc gcc atc acc gtg tcc gaa ggg ggg agt tga231Pro Val Ser Ala Ile Thr Val Ser Glu Gly Gly Ser65 70 75<210>260<211>201<212>DNA<213>三澤鏈霉菌(Streptomyces misawanensis)IFO 13855T<220>
<221>CDS<222>(1)..(201)<400>260atg cac atc gag atc gac agt gac gtc tgc atc ggc gcg ggg cag tgt 48Met His Ile Glu Ile Asp Ser Asp Val Cys Ile Gly Ala Gly Gln Cys1 5 10 15gcc ctg acc gcc ccc aac gtc ttc acc cag gac gac gac ggt ttc agc 96Ala Leu Thr Ala Pro Asn Val Phe Thr Gln Asp Asp Asp Gly Phe Ser20 25 30acc ctg ctc ccc ggg atg gcg gac ggc ggc ggc gac ccg ctg gtc aag144Thr Leu Leu Pro Gly Met Ala Asp Gly Gly Gly Asp Pro Leu Val Lys35 40 45gag gcg gcc cgg gcc tgc ccg gtg cac gcc atc acg gtc gag gaa ccg192Glu Ala Ala Arg Ala Cys Pro Val His Ala Ile Thr Val Glu Glu Pro50 55 60tcg ggt tag201Ser Gly65<210>261<211>195<212>DNA<213>蒼白色鏈霉菌(Streptomyces pallidus)IFO 13434T<220>
<221>CDS<222>(1)..(195)<400>261atg cga gtg gaa ctg gac gag ccg aag tgc gtc gcg tcg ggg cag tgc 48Met Arg Val Glu Leu Asp Glu Pro Lys Cys Val Ala Ser Gly Gln Cys1 5 10 15gtg atg gcc gcc ccc gag gtc ttc gac cag cgc gag gag gac ggc atc 96Val Met Ala Ala Pro Glu Val Phe Asp Gln Arg Glu Glu Asp Gly Ile20 25 30gcc ttc gtg ctg gac gag cgg ccg gcg gcg gac gtc ctg gcg gag gtg144Ala Phe Val Leu Asp Glu Arg Pro Ala Ala Asp Val Leu Ala Glu Val35 40 45cgc gag gcc gtg gcg atc tgc ccc gcc gcc gcg atc cgg ctg gtg gag192Arg Glu Ala Val Ala Ile Cys Pro Ala Ala Ala Ile Arg Leu Val Glu50 55 60tga195<210>262<211>201<212>DNA<213>玫瑰變紅鏈霉菌(Streptomyces roseorubens)IFO 13682T<220>
<221>CDS<222>(1)..(201)<400>262
atg cgc atc gac atc gac aag gac gtc tgc atc ggc gcg ggc cag tgc 48Met Arg Ile Asp Ile Asp Lys Asp Val Cys Ile Gly Ala Gly Gln Cys1 5 10 15gcc ctg acc gcc ccg gac gtg ttc gcc cag gac gac gac ggc tac agc 96Ala Leu Thr Ala Pro Asp Val Phe Thr Gln Asp Asp Asp Gly Tyr Ser20 25 30acc ctg ctg ccc ggc cgg gag gac ggc ggc ggc agc ccg ctg ctg cgg144Thr Leu Leu Pro Gly Arg Glu Asp Gly Gly Gly Ser Pro Leu Leu Arg35 40 45gag gcg gcc cgg gcc tgc ccg gtg agc gcc atc acc gtc tcg gag acc192Glu Ala Ala Arg Ala Cys Pro Val Ser Ala Ile Thr Val Ser Glu Thr50 55 60gtc ggc tga201Val Gly65<210>263<211>198<212>DNA<213>魯?shù)劓溍咕?Streptomyces rutgersensis)IFO 15875T<220>
<221>CDS<222>(1)..(198)<400>263atg cgt gtg gaa gtc gat gtt ccc aag tgt gtg gca tcg ggt cag tgc 48Met Arg Val Glu Val Asp Val Pro Lys Cys Val Ala Ser Gly Gln Cys1 5 10 15gtg atg atc gca ccc gat gtg ttc gac cag cgg gag gag gac ggc atc 96Val Met Ile Ala Pro Asp Val Phe Asp Gln Arg Glu Glu Asp Gly Ile20 25 30gtg atc ctg ctg gac gag cag ccc gcg tcc gaa ctc cac gcc gat gtg144Val Ile Leu Leu Asp Glu Gln Pro Ala Ser Glu Leu His Ala Asp Val35 40 45cgt gag tcc gcg gtg gtc tgc ccg gcg gcg gcg ata cgg gtg gtc gag192Arg Glu Ser Ala Val Val Cys Pro Ala Ala Ala Ile Arg Val Val Glu50 55 60aat tga198Asn65<210>264<211>201<212>DNA<213>斯堡鏈霉菌(Streptomyces steffisburgensis)IFO 13446T<220>
<221>CDS<222>(1)..(201)<400>264atg cac atc gac atc gac aag gac gtc tgc atc ggc gcg ggc cag tgc 48Met His Ile Asp Ile Asp Lys Asp Val Cys Ile Gly Ala Gly Gln Cys1 5 10 15gcc ctg acc gcc ccg gac gtg ttc acc cag gac gac gac ggc atc agc 96Ala Leu Thr Ala Pro Asp Val Phe Thr Gln Asp Asp Asp Gly Ile Ser20 25 30gcc ctg ctg ccg gga cag gag gac ggc ggc ggc agc ccg ctg gtg cgg144Ala Leu Leu Pro Gly Gln Glu Asp Gly Gly Gly Ser Pro Leu Val Arg35 40 45gag gcg gcc cgt gcc tgc ccg gtg agc gcc atc acc gtg tcg gag acg192Glu Ala Ala Arg Ala Cys Pro Val Ser Ala Ile Thr Val Ser Glu Thr50 55 60
gtg agc tga 201Val Ser65<210>265<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>265ctcgaagaac tcgtggtcgg cgtacgg27<210>266<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>266cacaccgagg agcgcgcaga tcaccat27<210>267<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>267cgtgttcttc tcgacctcgc tcatcaacc 29<210>268<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>268ctacgagaat ccggagacgc tcgactg27<210>269<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>269ccaagctttc agtcgtcggt cagggacac 29<210>270<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>270agcagtccgt ccaccgtctc ctggatg27<210>271<211>30<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>271ctatccgctt cacggagaag ctcgggatga 30<210>272<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>272ggcgtgttct tctcgacctc gctcatc27<210>273<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>273caccgaggtc tacgagaatc cggagac27<210>274<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>274gccatatgac ggaatccacg acggaac27<210>275<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>275ccaagctttc agtcgtcggt cagggacac 29<210>276<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為DNA測序設(shè)計的寡核苷酸引物<400>276gagcttctcc gtgaagcgga tag23<210>277<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為DNA測序設(shè)計的寡核苷酸引物<400>277caaagctttc accaggccac gggcaggtgc 30<210>278<211>27
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>278ccagggagat catgttggcg gtcgtct27<210>279<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>279cttggcgtcg atcaggtcgc cgaggaa27<210>280<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>280accgccgaag ctttcaggcg gtgcgct27<210>281<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為DNA測序設(shè)計的寡核苷酸引物<400>281ggacgaactg ctggacgcga tgatcga27<210>282<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>282agcagccggt ccaccgtctc ctggatac 28<210>283<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>283cgtttcacgg agaagctcgg gatgagca 28<210>284<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>284gatcgaggac atcgaggtgg acgggac27
<210>285<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>285tcttcttctc cacctcgctc gtcaaccg 28<210>286<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>286atcatatgac ggaatccacg acggaacc 28<210>287<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>287cgaagctttc agtcgtcggt cagggtcac 29<210>288<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為DNA測序設(shè)計的寡核苷酸引物<400>288gtatccagga gacggtggac20<210>289<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>289gcggagagtg aagctgggga ccatcat27<210>290<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>290cgaggagctc atgcggatgc tgtcgat27<210>291<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>291
cgtggtcttc tcgacctcgg tcatcaa27<210>292<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>292cgaggtccat atgacggaca tgaccgatat 30<210>293<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>293gatgccaagc tttcaactcc ccccttcgga 30<210>294<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>294cgagcagatc gtcgacgatc cgctggat 28<210>295<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>295ttgagggtga agtccgggat cagcatc27<210>296<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>296gaggaactga tgcggatgct gtccatc27<210>297<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>297catcaaccgt gacgagtccg tgtacga27<210>298<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物
<400>298ctcatatgaa agaactgacg gacctga27<210>299<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>299gcaagcttct aacccgacgg ttcctcgac 29<210>300<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為DNA測序設(shè)計的寡核苷酸引物<400>300gatgctgatc ccggacttca cc 22<210>301<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>301cttctcgccc atcagctcgt cgaggta27<210>302<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>302gaggatccgg ctgttctcct ggaagaa27<210>303<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>303catgaggatg aagctggcgt tgttctc27<210>304<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>304gacatcgaga tcggcggaca ggtcatc27<210>305<211>27<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>305atgatcatgc ccaacgacct cgccaac27<210>306<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>306cgaccgagga gacatatggc cgacaccctc gcc 33<210>307<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>307aaatcgaagc tttcactcca ccagccggat cgc 33<210>308<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為DNA測序設(shè)計的寡核苷酸引物<400>308ggagtgccgt acgaggacca cgacttcttc 30<210>309<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>309agcctcgaag aagtcgtggt cggcgta27<210>310<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>310gagtcgttcg tcgacgatcc gctggat27<210>311<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>311ccaacatgat ctccctcggc accttca27<210>312<211>27<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>312ggtcatcaac cgcgacgaga cggtctt27<210>313<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>313gtctgcgagg tccatatgac ggacacgacc gca 33<210>314<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>314tgacaagctt tcagccgacg gtctccgaga 30<210>315<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為DNA測序設(shè)計的寡核苷酸引物<400>315cgtcgacgaa cgactcgacg cgatgat27<210>316<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>316cgtggagtta cggttgatca ggagcga27<210>317<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>317cagatcgtcg gtgatcttct ggatgtc27<210>318<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>318gaactgctgc gctatctgac catcgtg27<210>319
<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>319atcatcgtct acaccggcac cggcaact 28<210>320<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>320ccgaggagac atatgaccga aacgctggca 30<210>321<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>321ccaccacaag cttcttcaat tctcgaccac 30<210>322<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為DNA測序設(shè)計的寡核苷酸引物<400>322atggtgatct gccggctgct cggagtg27<210>323<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>323ggtctcgaag aagtcgtggt cggcgta27<210>324<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>324tttgagggtg aagtccccgg ccaccat27<210>325<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>325cgtcatcaac cgcgacgaga cggtcta27
<210>326<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>326gaggtccata tgtcggacac gaccgca27<210>327<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>327tacaagcttt cagctcaccg tctccg 26<210>328<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>328atgacccagt ccgccgacgc cgtaccc27<210>329<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>329tcaccaggtg acggggagtt cgtagac27<210>330<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>330atgacggaac tgacggacat caccggc27<210>331<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>331ttaccaggtc acggggagtt ccagcat27<210>332<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物
<400>332atgacggaat ccacgacaga tccgacg27<210>333<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>333tcaccaggcc acgggcagtt cgagca 26<210>334<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>334atgacggaca tgacggaaac ccccacc27<210>335<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>335atgacggaat ccacgacgga accggcc27<210>336<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>336tcaccaggcc acgggcaggt gcagaag27<210>337<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>337atgacggaca tgacggaaac ccccacc27<210>338<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>338atgaaagaac tgacggacct gacggaa27<210>339<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>339atgtcggaca cgaccgaccc cgtggcc27<210>340<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>340atggccgaca ccctcgccgg cgccacg27<210>341<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>341tcaccacgtg acgggcagtt cgtagac27<210>342<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>342atgaccgaaa cgctggcaga gaccacg27<210>343<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>343tcaagacgtc caggtgacgg gcagttc27<210>344<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>344catatgacag atactactgc acctgttgca tttcctcaga gtaggacctg tccatatcat60ccacctgctg 70<210>345<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>345tccatatcat ccacctgctg catacgaacc acttcgtgct gaacgtcctc tgactaggat60tactctcttt 70<210>346<211>70
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>346tgactaggat tactctcttt gatggacgtg aagcatggtt ggttagtggt catgccaccg60cacgtgctct 70<210>347<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>347aggaggatgg tcgttgggga cttcactctc aaacgggcag ctgcattgag gccccgcatt60cagaggattg 70<210>348<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>348gccccgcatt cagaggattg ttgatgaacg actcgatgcg atgattgctc aaggaccacc60tgcagatttg 70<210>349<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>349aaggaccacc tgcagatttg gtgagcgcat ttgcattgcc agtgccttca atggtgatat60gcgctttgct 70<210>350<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>350aagagagaag atcctggtac tggattactt gatgaccttg ttcaacggca gccaggagat60ggtggacccg 70<210>351<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>351gccaggagat ggtggacccg atagagaagg actgatagcc atggccctca tcctgcttgt60agcaggccat 70<210>352<211>70<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>352tcctgcttgt agcaggccat gagacgaccg ccaacatgat atcactaggc acctttacac60tcttgcaaca 70<210>353<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>353acaacaatcc gagctggaga aggcgtagtg ttcgcgacat cggtcatcaa tagagatgag60acagtctttg 70<210>354<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>354tagagatgag acagtctttg ctgagccgga cactctcgac tggtctagac cagccagaca60tcacgtagcg 70<210>355<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>355cagccagaca tcacgtagcg ttcggctttg ggattcacca gtgcttaggt caaaacttag60caagagccga 70<210>356<211>56<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>356aagcttttac caggtcacgg ggagttccaa catcccttgg atcgtgtcgc ctggct56<210>357<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>357ttggatcgtg tcgcctggct tgaagggaat ctcatctgga ggagcggcca atctaagtgt60gggcaaccta 70<210>358<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>358
atctaagtgt gggcaaccta ccgaagaggg tgcctaaggc gatctcaagt tcggctcttg60ctaagttttg 70<210>359<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>359tctccagctc ggattgttgt cccggccact tcaacatcct caacagcaat gcgcaacaga60ccatctgcaa 70<210>360<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>360gcgcaacaga ccatctgcaa tggacagcaa cctcataagt tcctcaactg cggccggcat60gacctcggag 70<210>361<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>361cggccggcat gacctcggag tcagctcgaa gttcagctag cctctcaggg tgttgcaaga60gtgtaaaggt 70<210>362<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>362gtaccaggat cttctctctt gcggtcaata agctcaccga agtactcctc aagcctgctc60ctagcatcct 70<210>363<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>363aagcctgctc ctagcatcct gcacatcagc agtccctggt cctctcagaa gtctccttga60ttgagcttca 70<210>364<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>364gtctccttga ttgagcttca aagaagtcat ggtcagcata gggaacacct agcaaagcgc60atatcaccat 70
<210>365<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>365tccccaacga ccatcctcct ttgggcacgg tgctcaggat cgtccacacc gagaagagct60gtacgtctat 70<210>366<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>366gagaagagct gtacgtctat tgcgtatccc agcaaatctc gcagtagggg ttgggaatcc60aggtctgtcg 70<210>367<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>367ttgggaatcc aggtctgtcg cgatcagaag acaatcttgg atctgctaga agagcacgtg60cggtggcatg 70<210>368<211>1197<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(1197)<223>設(shè)計的編碼SEQ ID No.222的氨基酸序列的多核苷酸<400>368atg aca gat act act gca cct gtt gca ttt cct cag agt agg acc tgt 48Met Thr Asp Thr Thr Ala Pro Val Ala Phe Pro Gln Ser Arg Thr Cys1 5 10 15cca tat cat cca cct gct gca tac gaa cca ctt cgt gct gaa cgt cct 96Pro Tyr His Pro Pro Ala Ala Tyr Glu Pro Leu Arg Ala Glu Arg Pro20 25 30ctg act agg att act ctc ttt gat gga cgt gaa gca tgg ttg gtt agt 144Leu Thr Arg Ile Thr Leu Phe Asp Gly Arg Glu Ala Trp Leu Val Ser35 40 45ggt cat gcc acc gca cgt gct ctt cta gca gat cca aga ttg tct tct 192Gly His Ala Thr Ala Arg Ala Leu Leu Ala Asp Pro Arg Leu Ser Ser50 55 60gat cgc gac aga cct gga ttc cca acc cct act gcg aga ttt gct ggg 240Asp Arg Asp Arg Pro Gly Phe Pro Thr Pro Thr Ala Arg Phe Ala Gly65 70 75 80ata cgc aat aga cgt aca gct ctt ctc ggt gtg gac gat cct gag cac 288Ile Arg Asn Arg Arg Thr Ala Leu Leu Gly Val Asp Asp Pro Glu His85 90 95cgt gcc caa agg agg atg gtc gtt ggg gac ttc act ctc aaa cgg gca 336Arg Ala Gln Arg Arg Met Val Val Gly Asp Phe Thr Leu Lys Arg Ala100 105 110
gct gca ttg agg ccc cgc att cag agg att gtt gat gaa cga ctc gat384Ala Ala Leu Arg Pro Arg Ile Gln Arg Ile Val Asp Glu Arg Leu Asp115 120 125gcg atg att gct caa gga cca cct gca gat ttg gtg agc gca ttt gca432Ala Met Ile Ala Gln Gly Pro Pro Ala Asp Leu Val Ser Ala Phe Ala130 135 140ttg cca gtg cct tca atg gtg ata tgc gct ttg cta ggt gtt ccc tat480Leu Pro Val Pro Ser Met Val Ile Cys Ala Leu Leu Gly Val Pro Tyr145 150 155 160gct gac cat gac ttc ttt gaa gct caa tca agg aga ctt ctg aga gga528Ala Asp His Asp Phe Phe Glu Ala Gln Ser Arg Arg Leu Leu Arg Gly165 170 175cca ggg act gct gat gtg cag gat gct agg agc agg ctt gag gag tac576Pro Gly Thr Ala Asp Val Gln Asp Ala Arg Ser Arg Leu Glu Glu Tyr180 185 190ttc ggt gag ctt att gac cgc aag aga gaa gat cct ggt act gga tta624Phe Gly Glu Leu Ile Asp Arg Lys Arg Glu Asp Pro Gly Thr Gly Leu195 200 205ctt gat gac ctt gtt caa cgg cag cca gga gat ggt gga ccc gat aga672Leu Asp Asp Leu Val Gln Arg Gln Pro Gly Asp Gly Gly Pro Asp Arg210 215 220gaa gga ctg ata gcc atg gcc ctc atc ctg ctt gta gca ggc cat gag720Glu Gly Leu Ile Ala Met Ala Leu Ile Leu Leu Val Ala Gly His Glu225 230 235 240acg acc gcc aac atg ata tca cta ggc acc ttt aca ctc ttg caa cac768Thr Thr Ala Asn Met Ile Ser Leu Gly Thr Phe Thr Leu Leu Gln His245 250 255cct gag agg cta gct gaa ctt cga gct gac tcc gag gtc atg ccg gcc816Pro Glu Arg Leu Ala Glu Leu Arg Ala Asp Ser Glu Val Met Pro Ala260 265 270gca gtt gag gaa ctt atg agg ttg ctg tcc att gca gat ggt ctg ttg864Ala Val Glu Glu Leu Met Arg Leu Leu Ser Ile Ala Asp Gly Leu Leu275 280 285cgc att gct gtt gag gat gtt gaa gtg gcc ggg aca aca atc cga gct912Arg Ile Ala Val Glu Asp Val Glu Val Ala Gly Thr Thr Ile Arg Ala290 295 300gga gaa ggc gta gtg ttc gcg aca tcg gtc atc aat aga gat gag aca960Gly Glu Gly Val Val Phe Ala Thr Ser Val Ile Asn Arg Asp Glu Thr305 310 315 320gtc ttt gct gag ccg gac act ctc gac tgg tct aga cca gcc aga cat 1008Val Phe Ala Glu Pro Asp Thr Leu Asp Trp Ser Arg Pro Ala Arg His325 330 335cac gta gcg ttc ggc ttt ggg att cac cag tgc tta ggt caa aac tta 1056His Val Ala Phe Gly Phe Gly Ile His Gln Cys Leu Gly Gln Asn Leu340 345 350gca aga gcc gaa ctt gag atc gcc tta ggc acc ctc ttc ggt agg ttg 1104Ala Arg Ala Glu Leu Glu Ile Ala Leu Gly Thr Leu Phe Gly Arg Leu355 360 365ccc aca ctt aga ttg gcc gct cct cca gat gag att ccc ttc aag cca 1152Pro Thr Leu Arg Leu Ala Ala Pro Pro Asp Glu Ile Pro Phe Lys Pro370 375 380ggc gac acg atc caa ggg atg ttg gaa ctc ccc gtg acc tgg taa 1197Gly Asp Thr Ile Gln Gly Met Leu Glu Leu Pro Val Thr Trp Stop385 390 395<210>369<211>70<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>369catatgtctg atactacagc acctgttgct tttccacaat ctcgtacctg cccctatcat60cctcctgctg 70<210>370<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>370cccctatcat cctcctgctg cctatgaacc gttacgtgct gagagaccct tgactagaat60cacactcttt 70<210>371<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>371tgactagaat cacactcttt gatggtagag aagcctggtt ggtcagtgga catgccacag60ctagggcatt 70<210>372<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>372cgtaggatgg ttgcagggga ctttacactc aaaagagctg caggattgag gccacgcatt60caacggattg 70<210>373<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>373gccacgcatt caacggattg tggacaggcg actcgatgcg atgatagctc agggtccacc60tgcagacctt 70<210>374<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>374agggtccacc tgcagacctt gtgagcagct tcgcgttacc agttccgtcc atggtgatct60gtgccttgct 70<210>375<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>375aaacggaagg aaccaggagc tggactgctt gatgacttgg ttcaacgaca gcttagagat60ggagcattag 70<210>376<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>376gcttagagat ggagcattag acagggaagg tctgattgcc cttgcactca tcttgcttgt60tgctggtcac 70<210>377<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>377tcttgcttgt tgctggtcac gagacgacag ccaacatgat ctctcttggc accttcaccc60tattgcaaca 70<210>378<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>378accacaattc gcaaggggga tggagtggtg tttctgacta gtgtcatcaa ccgcgatgag60acagtctacc 70<210>379<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>379ccgcgatgag acagtctacc ctgaaccaga caccctcgat tggcaccgtt ctgctagaca60tcacgtagcg 70<210>380<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>380ctgctagaca tcacgtagcg ttcggcttcg gcattcacca gtgcctcggc cagaatcttg60cacgcgctga 70<210>381<211>56<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>381
aagcttttac caagtcacag gaagttccaa catcccttga atcgtgtcac ctggct56<210>382<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>382ttgaatcgtg tcacctggct tgaaggcaat ctcctcggct ggagctgcta agcgtagagt60gggcaaacga 70<210>383<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>383agcgtagagt gggcaaacga tcgaagaggg tccaaagtgc aatctcaagc tcagcgcgtg60caagattctg 70<210>384<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>384tcccccttgc gaattgtggt cccagcaact tctatgtcct caacggcgag tctaagcaaa60ccatccgcta 70<210>385<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>385tctaagcaaa ccatccgcta tggacagcat gcgcatcagt tcctcgactg cagcaggcaa60tagacgagga 70<210>386<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>386cagcaggcaa tagacgagga tctgctctca actcagcaag cctttcggga tgttgcaata60gggtgaaggt 70<210>387<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>387gctcctggtt ccttccgttt cctgtcaatc agttctccaa agtactcatc caaccgtgct60ctagcatcca 70<210>388
<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>388caaccgtgct ctagcatcca tcacatcggc agtctgagga cctctaagta gtctccttga60ctgggtctca 70<210>389<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>389gtctccttga ctgggtctca aagaaatcgt gatcggcgta tggaactccg agcaaggcac60agatcaccat 70<210>390<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>390tcccctgcaa ccatcctacg ttgtactcga tgttcaggat cgtcaacacc cagtagtgca60gttctcctat 70<210>391<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>391cagtagtgca gttctcctat tccttatccc agcaaacctt gcagtgggag ctgggaagcc60aggtctgtca 70<210>392<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>392ctgggaagcc aggtctgtca cgatcagatg aaagccttgg atcagcgagt aatgccctag60ctgtggcatg 70<210>393<211>1197<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(1197)<223>設(shè)計的編碼SEQ ID No.224的氨基酸序列的多核苷酸<400>393atg tct gat act aca gca cct gtt gct ttt cca caa tct cgt acc tgc 48Met Ser Asp Thr Thr Ala Pro Val Ala Phe Pro Gln Ser Arg Thr Cys1 5 10 15ccc tat cat cct cct gct gcc tat gaa ccg tta cgt gct gag aga ccc 96
Pro Tyr His Pro Pro Ala Ala Tyr Glu Pro Leu Arg Ala Glu Arg Pro20 25 30ttg act aga atc aca ctc ttt gat ggt aga gaa gcc tgg ttg gtc agt144Leu Thr Arg Ile Thr Leu Phe Asp Gly Arg Glu Ala Trp Leu Val Ser35 40 45gga cat gcc aca gct agg gca tta ctc gct gat cca agg ctt tca tct192Gly His Ala Thr Ala Arg Ala Leu Leu Ala Asp Pro Arg Leu Ser Ser50 55 60gat cgt gac aga cct ggc ttc cca gct ccc act gca agg ttt gct ggg240Asp Arg Asp Arg Pro Gly Phe Pro Ala Pro Thr Ala Arg Phe Ala Gly65 70 75 80ata agg aat agg aga act gca cta ctg ggt gtt gac gat cct gaa cat288Ile Arg Asn Arg Arg Thr Ala Leu Leu Gly Val Asp Asp Pro Glu His85 90 95cga gta caa cgt agg atg gtt gca ggg gac ttt aca ctc aaa aga gct336Arg Val Gln Arg Arg Met Val Ala Gly Asp Phe Thr Leu Lys Arg Ala100 105 110gca gga ttg agg cca cgc att caa cgg att gtg gac agg cga ctc gat384Ala Gly Leu Arg Pro Arg Ile Gln Arg Ile Val Asp Arg Arg Leu Asp115 120 125gcg atg ata gct cag ggt cca cct gca gac ctt gtg agc agc ttc gcg432Ala Met Ile Ala Gln Gly Pro Pro Ala Asp Leu Val Ser Ser Phe Ala130 135 140tta cca gtt ccg tcc atg gtg atc tgt gcc ttg ctc gga gtt cca tac480Leu Pro Val Pro Ser Met Val Ile Cys Ala Leu Leu Gly Val Pro Tyr145 150 155 160gcc gat cac gat ttc ttt gag acc cag tca agg aga cta ctt aga ggt528Ala Asp His Asp Phe Phe Glu Thr Gln Ser Arg Arg Leu Leu Arg Gly165 170 175cct cag act gcc gat gtg atg gat gct aga gca cgg ttg gat gag tac576Pro Gln Thr Ala Asp Val Met Asp Ala Arg Ala Arg Leu Asp Glu Tyr180 185 190ttt gga gaa ctg att gac agg aaa cgg aag gaa cca gga gct gga ctg624Phe Gly Glu Leu Ile Asp Arg Lys Arg Lys Glu Pro Gly Ala Gly Leu195 200 205ctt gat gac ttg gtt caa cga cag ctt aga gat gga gca tta gac agg672Leu Asp Asp Leu Val Gln Arg Gln Leu Arg Asp Gly Ala Leu Asp Arg210 215 220gaa ggt ctg att gcc ctt gca ctc atc ttg ctt gtt gct ggt cac gag720Glu Gly Leu Ile Ala Leu Ala Leu Ile Leu Leu Val Ala Gly His Glu225 230 235 240acg aca gcc aac atg atc tct ctt ggc acc ttc acc cta ttg caa cat768Thr Thr Ala Asn Met Ile Ser Leu Gly Thr Phe Thr Leu Leu Gln His245 250 255ccc gaa agg ctt gct gag ttg aga gca gat cct cgt cta ttg cct gct816Pro Glu Arg Leu Ala Glu Leu Arg Ala Asp Pro Arg Leu Leu Pro Ala260 265 270gca gtc gag gaa ctg atg cgc atg ctg tcc ata gcg gat ggt ttg ctt864Ala Val Glu Glu Leu Met Arg Met Leu Ser Ile Ala Asp Gly Leu Leu275 280 285aga ctc gcc gtt gag gac ata gaa gtt gct ggg acc aca att cgc aag912Arg Leu Ala Val Glu Asp Ile Glu Val Ala Gly Thr Thr Ile Arg Lys290 295 300ggg gat gga gtg gtg ttt ctg act agt gtc atc aac cgc gat gag aca960Gly Asp Gly Val Val Phe Leu Thr Ser Val Ile Asn Arg Asp Glu Thr305 310 315 320
gtc tac cct gaa cca gac acc ctc gat tgg cac cgt tct gct aga cat1008Val Tyr Pro Glu Pro Asp Thr Leu Asp Trp His Arg Ser Ala Arg His325 330 335cac gta gcg ttc ggc ttc ggc att cac cag tgc ctc ggc cag aat ctt1056His Val Ala Phe Gly Phe Gly Ile His Gln Cys Leu Gly Gln Asn Leu340 345 350gca cgc gct gag ctt gag att gca ctt tgg acc ctc ttc gat cgt ttg1104Ala Arg Ala Glu Leu Glu Ile Ala Leu Trp Thr Leu Phe Asp Arg Leu355 360 365ccc act cta cgc tta gca gct cca gcc gag gag att gcc ttc aag cca1152Pro Thr Leu Arg Leu Ala Ala Pro Ala Glu Glu Ile Ala Phe Lys Pro370 375 380ggt gac acg att caa ggg atg ttg gaa ctt cct gtg act tgg taa1197Gly Asp Thr Ile Gln Gly Met Leu Glu Leu Pro Val Thr Trp Stop385 390 395<210>394<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>394ggggatgcat gacagatatg acagatact 29<210>395<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>395ggggagctcc taccaggcca cgggaagatc 30<210>396<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>396acagatatga cagatact 18<210>397<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>397ggatgcatga cagatactac tgcacct27<210>398<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>398gagctcttac caggtcacgg ggagttc27
<210>399<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>399ggggtcatga cagatactac tgcacct 27<210>400<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>400ggatgcatgt ctgatactac agcacct 27<210>401<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為PCR設(shè)計的寡核苷酸引物<400>401gagctcttac caagtcacag gaagttc 27<210>402<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為表達(dá)載體構(gòu)建設(shè)計的寡核苷酸接頭<400>402tgcaggtgtg gccaccaatt ggcaagaaga aatgca36<210>403<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>為表達(dá)載體構(gòu)建設(shè)計的寡核苷酸接頭<400>403tttcttcttg ccaattggtg gccacacctg catgca3權(quán)利要求
1.編碼除草劑代謝蛋白質(zhì)的DNA，其中所述蛋白質(zhì)選自下述物質(zhì)組成的組(A1)包含在SEQ ID NO1中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A2)包含在SEQ ID NO2中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A3)包含在SEQ ID NO3中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A4)包含在SEQ ID NO108中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A5)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力， 并包含與在SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO108中任何一個表示的氨基酸序列具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列；(A6)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并包含由核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述核苷酸序列與編碼在SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO108中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少80％的序列同一性；(A11)包含在SEQ ID NO159中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A12)包含在SEQ ID NO160中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A13)包含在SEQ ID NO136中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A14)包含在SEQ ID NO137中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A15)包含在SEQ ID NO138中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A16)包含在SEQ ID NO215中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A17)包含在SEQ ID NO216中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A18)包含在SEQ ID NO217中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A19)包含在SEQ ID NO218中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A20)包含在SEQ ID NO219中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A21)包含在SEQ ID NO220中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A22)包含在SEQ ID NO221中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A23)包含在SEQ ID NO222中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A24)包含在SEQ ID NO223中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A25)包含在SEQ ID NO224中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A26)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并包含與在SEQ ID NO159，SEQ ID NO136，SEQ ID NO137，SEQ ID NO138，SEQ ID NO217，SEQ ID NO219，SEQ ID NO220，SEQ ID NO221或SEQ ID NO223中任何一個表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或與在SEQ ID NO160，SEQ ID NO215，SEQ ID NO216，SEQ ID NO218，SEQ ID NO222或SEQ ID NO224中任何一個表示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。(A27)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并包含由核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述核苷酸序列與編碼在SEQ ID NO159，SEQ IDNO160，SEQ ID NO136，SEQ ID NO137，SEQ ID NO138，SEQ IDNO215，SEQ ID NO216，SEQ ID NO217，SEQ ID NO218，SEQ IDNO219，SEQ ID NO220，SEQ ID NO221，SEQ ID NO222，SEQ IDNO223或SEQ ID NO224中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少90％的序列同一性；和(A28)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并包含由可通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增的DNA所編碼的氨基酸序列，所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)使用包含在SEQ ID NO124至128中任何一個表示的核苷酸序列的引物和包含在SEQ ID NO129中表示的核苷酸序列的引物，并且模板為暗產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces phaeochromogenes)，磚紅色鏈霉菌(Streptomyces testaceus)，不產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces achromogenes)，灰褐鏈霉菌(Streptomycesgriseofuscus)，熱淡天藍(lán)鏈霉菌(Streptomyces thermocoerulescens)，黑胡桃鏈霉菌(Streptomyces nogalater)，津島鏈霉菌(Streptomyces tsusimaensis)，球團(tuán)產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces glomerochromogenes)，橄欖產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces olivochromogenes)，裝飾鏈霉菌(Streptomyces ornatus)，灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)，羊毛鏈霉菌(Streptomyces lanatus)，三澤鏈霉菌(Streptomyces misawanensis)，蒼白色鏈霉菌(Streptomyces pallidus)，玫瑰變紅鏈霉菌(Streptomyces roseorubens)，魯?shù)劓溍咕?Streptomycesrutgersensis)，斯堡鏈霉菌(Streptomyces steffisburgensis)或塔氏糖多孢菌(Saccharopolyspora taberi)的染色體DNA。
2.包含核苷酸序列的DNA，所述核苷酸序列選自下述物質(zhì)組成的組(a1)在SEQ ID NO6中表示的核苷酸序列；(a2)在SEQ ID NO7中表示的核苷酸序列；(a3)在SEQ ID NO8中表示的核苷酸序列；(a4)在SEQ ID NO109中表示的核苷酸序列；(a5)在SEQ ID NO139中表示的核苷酸序列；(a6)在SEQ ID NO140中表示的核苷酸序列；(a7)在SEQ ID NO141中表示的核苷酸序列；(a8)在SEQ ID NO142中表示的核苷酸序列；(a9)在SEQ ID NO143中表示的核苷酸序列；(a10)在SEQ ID NO225中表示的核苷酸序列；(a11)在SEQ ID NO226中表示的核苷酸序列；(a12)在SEQ ID NO227中表示的核苷酸序列；(a13)在SEQ ID NO228中表示的核苷酸序列；(a14)在SEQ ID NO229中表示的核苷酸序列；(a15)在SEQ ID NO230中表示的核苷酸序列；(a16)在SEQ ID NO231中表示的核苷酸序列；(a17)在SEQ ID NO232中表示的核苷酸序列；(a18)在SEQ ID NO233中表示的核苷酸序列；(a19)在SEQ ID NO234中表示的核苷酸序列；(a20)一種核苷酸序列，其編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列，所述蛋白質(zhì)具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，所述核苷酸序列與在SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ IDNO8或SEQ ID NO109中任何一個表示的核苷酸序列具有至少80％序列同一性；和(a21)一種核苷酸序列，其編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列，所述蛋白質(zhì)具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，所述核苷酸序列與在SEQ ID NO139，SEQ ID NO140，SEQ ID NO141，SEQ ID NO142，SEQ ID NO143，SEQ ID NO225，SEQID NO226，SEQ ID NO227，SEQ ID NO228，SEQ ID NO229，SEQ IDNO230，SEQ ID NO231，SEQ ID NO232，SEQ ID NO233或SEQ IDNO234中任何一個表示的核苷酸序列具有至少90％序列同一性。
3.按照權(quán)利要求1的DNA，其包含編碼所述蛋白質(zhì)的氨基酸序列的核苷酸序列，其中在所述核苷酸序列中的密碼子使用是在來自引入所述DNA的宿主細(xì)胞物種的基因中密碼子使用±4％的范圍內(nèi)并且所述核苷酸序列的GC含量是至少40％和至多60％。
4.包含在SEQ ID NO214中表示的核苷酸序列的DNA。
5.包含在SEQ ID NO368中表示的核苷酸序列的DNA。
6.包含在SEQ ID NO393中表示的核苷酸序列的DNA。
7.一種DNA，其中具有編碼胞內(nèi)細(xì)胞器轉(zhuǎn)運信號序列的核苷酸序列的DNA在框內(nèi)連接在按照權(quán)利要求1的DNA的上游。
8.一種DNA，其中按照權(quán)利要求1的DNA和在宿主細(xì)胞中起作用的啟動子可操作地連接。
9.包含按照權(quán)利要求1的DNA的載體。
10.一種生產(chǎn)載體的方法，其包含將按照權(quán)利要求1的DNA插入可在宿主細(xì)胞中復(fù)制的載體的步驟。
11.一種轉(zhuǎn)化體，其中將按照權(quán)利要求1的DNA引入宿主細(xì)胞。
12.按照權(quán)利要求11的轉(zhuǎn)化體，其中所述宿主細(xì)胞是微生物細(xì)胞或植物細(xì)胞。
13.一種生產(chǎn)轉(zhuǎn)化體的方法，其包含將按照權(quán)利要求1的DNA引入宿主細(xì)胞的步驟。
14.一種生產(chǎn)具有將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力的蛋白質(zhì)的方法，所述方法包含培養(yǎng)按照權(quán)利要求11的轉(zhuǎn)化體和回收產(chǎn)生的所述蛋白質(zhì)的步驟。
15.按照權(quán)利要求1的DNA在生產(chǎn)具有將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力的蛋白質(zhì)中的應(yīng)用。
16.一種給予植物除草劑抗性的方法，所述方法包含將按照權(quán)利要求1的DNA引入植物細(xì)胞和在其中表達(dá)的步驟。
17.一種多核苷酸，其具有按照權(quán)利要求1的DNA的部分核苷酸序列或與所述部分核苷酸序列互補的核苷酸序列。
18.一種檢測編碼具有將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力的蛋白質(zhì)的DNA的方法，所述方法包含檢測在雜交中與探針雜交的DNA的步驟，所述雜交使用按照權(quán)利要求1的DNA或按照權(quán)利要求17的多核苷酸作為探針。
19.一種檢測編碼具有將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力的蛋白質(zhì)的DNA的方法，所述方法包含檢測在以按照權(quán)利要求17的多核苷酸作為引物的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中擴(kuò)增的DNA的步驟。
20.按照權(quán)利要求19的方法，其中引物中至少一種選自包含在SEQ IDNO124至128中任何一個表示的核苷酸序列的多核苷酸和包含在SEQ IDNO129中顯示的核苷酸序列的多核苷酸組成的組。
21.一種獲得編碼具有將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力的蛋白質(zhì)的DNA的方法，所述方法包含回收通過按照權(quán)利要求18或19的方法檢測的DNA的步驟。
22.一種篩選具有編碼一種蛋白質(zhì)的DNA的細(xì)胞的方法，所述蛋白質(zhì)具有將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，所述方法包含通過按照權(quán)利要求18或19的方法從試驗細(xì)胞中檢測所述DNA的步驟。
23.一種除草劑代謝蛋白質(zhì)，其選自由下述物質(zhì)組成的組(A1)包含在SEQ ID NO1中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A2)包含在SEQ ID NO2中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A3)包含在SEQ ID NO3中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A4)包含在SEQ ID NO108中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A5)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含與在SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO108中任何一個表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；(A6)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述核苷酸序列與編碼在SEQ ID NO1，SEQ IDNO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO108中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少80％序列同一性；(A11)包含在SEQ ID NO159中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A12)包含在SEQ ID NO160中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A13)包含在SEQ ID NO136中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A14)包含在SEQ ID NO137中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A15)包含在SEQ ID NO138中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A16)包含在SEQ ID NO215中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A17)包含在SEQ ID NO216中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A18)包含在SEQ ID NO217中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A19)包含在SEQ ID NO218中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A20)包含在SEQ ID NO219中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A21)包含在SEQ ID NO220中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A22)包含在SEQ ID NO221中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A23)包含在SEQ ID NO222中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A24)包含在SEQ ID NO223中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A25)包含在SEQ ID NO224中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A26)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含與在SEQ IDNO159，SEQ ID NO136，SEQ ID NO137，SEQ ID NO138，SEQ IDNO217，SEQ ID NO219，SEQ ID NO220，SEQ ID NO221或SEQ IDNO223中任何一個表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或與在SEQ ID NO160，SEQ ID NO215，SEQ ID NO216，SEQ IDNO218，SEQ ID NO222或SEQ ID NO224中任何一個表示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；(A27)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述核苷酸序列與編碼在SEQ ID NO159，SEQ IDNO160，SEQ ID NO136，SEQ ID NO137，SEQ ID NO138，SEQ IDNO215，SEQ ID NO216，SEQ ID NO217，SEQ ID NO218，SEQ IDNO219，SEQ ID NO220，SEQ ID NO221，SEQ ID NO222，SEQ IDNO223或SEQ ID NO224中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少90％序列同一性；和(A28)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并包含由可通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增的DNA所編碼的氨基酸序列，所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)使用包含在SEQ ID NO124至128中任何一個表示的核苷酸序列的引物和包含在SEQ ID NO129中表示的核苷酸序列的引物，并且模板為暗產(chǎn)色鏈霉菌，磚紅色鏈霉菌，不產(chǎn)色鏈霉菌，灰褐鏈霉菌，熱淡天藍(lán)鏈霉菌，黑胡桃鏈霉菌，津島鏈霉菌，球團(tuán)產(chǎn)色鏈霉菌，橄欖產(chǎn)色鏈霉菌，裝飾鏈霉菌，灰色鏈霉菌，羊毛鏈霉菌，三澤鏈霉菌，蒼白色鏈霉菌，玫瑰變紅鏈霉菌，魯?shù)劓溍咕?，斯堡鏈霉菌或塔氏糖多孢菌的染色體DNA。
24.一種識別除草劑代謝蛋白質(zhì)的抗體，所述除草劑代謝蛋白質(zhì)選自由下述物質(zhì)組成的組(A1)包含在SEQ ID NO1中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A2)包含在SEQ ID NO2中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A3)包含在SEQ ID NO3中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A4)包含在SEQ ID NO108中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A5)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含與在SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO108中任何一個表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；(A6)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述核苷酸序列與編碼在SEQ ID NO1，SEQ IDNO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO108中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少80％序列同一性；(A11)包含在SEQ ID NO159中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A12)包含在SEQ ID NO160中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A13)包含在SEQ ID NO136中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A14)包含在SEQ ID NO137中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A15)包含在SEQ ID NO138中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A16)包含在SEQ ID NO215中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A17)包含在SEQ ID NO216中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A18)包含在SEQ ID NO217中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A19)包含在SEQ ID NO218中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A20)包含在SEQ ID NO219中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A21)包含在SEQ ID NO220中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A22)包含在SEQ ID NO221中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A23)包含在SEQ ID NO222中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A24)包含在SEQ ID NO223中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A25)包含在SEQ ID NO224中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A26)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含與在SEQ IDNO159，SEQ ID NO136，SEQ ID NO137，SEQ ID NO138，SEQ IDNO217，SEQ ID NO219，SEQ ID NO220，SEQ ID NO221或SEQ IDNO223中任何一個表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或與在SEQ ID NO160，SEQ ID NO215，SEQ ID NO216，SEQ IDNO218，SEQ ID NO222或SEQ ID NO224中任何一個表示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；(A27)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述核苷酸序列與編碼在SEQ ID NO159，SEQ IDNO160，SEQ ID NO136，SEQ ID NO137，SEQ ID NO138，SEQ IDNO215，SEQ ID NO216，SEQ ID NO217，SEQ ID NO218，SEQ IDNO219，SEQ ID NO220，SEQ ID NO221，SEQ ID NO222，SEQ IDNO223或SEQ ID NO224中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少90％序列同一性；和(A28)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并包含由可通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增的DNA所編碼的氨基酸序列，所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)使用包含在SEQ ID NO124至128中任何一個表示的核苷酸序列的引物和包含在SEQ ID NO129中表示的核苷酸序列的引物，并且模板為暗產(chǎn)色鏈霉菌，磚紅色鏈霉菌，不產(chǎn)色鏈霉菌，灰褐鏈霉菌，熱淡天藍(lán)鏈霉菌，黑胡桃鏈霉菌，津島鏈霉菌，球團(tuán)產(chǎn)色鏈霉菌，橄欖產(chǎn)色鏈霉菌，裝飾鏈霉菌，灰色鏈霉菌，羊毛鏈霉菌，三澤鏈霉菌，蒼白色鏈霉菌，玫瑰變紅鏈霉菌，魯?shù)劓溍咕?，斯堡鏈霉菌或塔氏糖多孢菌的染色體DNA。
25.一種檢測除草劑代謝蛋白質(zhì)的方法，所述方法包含(1)將試樣物質(zhì)與識別所述蛋白質(zhì)的抗體接觸的步驟和(2)檢測由所述接觸產(chǎn)生的、所述蛋白質(zhì)和所述抗體的復(fù)合體的步驟，其中所述蛋白質(zhì)選自由下述物質(zhì)組成的組(A1)包含在SEQ ID NO1中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A2)包含在SEQ ID NO2中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A3)包含在SEQ ID NO3中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A4)包含在SEQ ID NO108中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A5)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含與在SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO108中任何一個表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；(A6)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述核苷酸序列與編碼在SEQ ID NO1，SEQ IDNO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO108中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少80％序列同一性；(A11)包含在SEQ ID NO159中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A12)包含在SEQ ID NO160中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A13)包含在SEQ ID NO136中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A14)包含在SEQ ID NO137中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A15)包含在SEQ ID NO138中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A16)包含在SEQ ID NO215中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A17)包含在SEQ ID NO216中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A18)包含在SEQ ID NO217中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A19)包含在SEQ ID NO218中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A20)包含在SEQ ID NO219中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A21)包含在SEQ ID NO220中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A22)包含在SEQ ID NO221中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A23)包含在SEQ ID NO222中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A24)包含在SEQ ID NO223中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A25)包含在SEQ ID NO224中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A26)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含與在SEQ IDNO159，SEQ ID NO136，SEQ ID NO137，SEQ ID NO138，SEQ IDNO217，SEQ ID NO219，SEQ ID NO220，SEQ ID NO221或SEQ IDNO223中任何一個表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或與在SEQ ID NO160，SEQ ID NO215，SEQ ID NO216，SEQ IDNO218，SEQ ID NO222或SEQ ID NO224中任何一個表示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；(A27)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述核苷酸序列與編碼在SEQ ID NO159，SEQ IDNO160，SEQ ID NO136，SEQ ID NO137，SEQ ID NO138，SEQ IDNO215，SEQ ID NO216，SEQ ID NO217，SEQ ID NO218，SEQ IDNO219，SEQ ID NO220，SEQ ID NO221，SEQ ID NO222，SEQ IDNO223或SEQ ID NO224中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少90％序列同一性；和(A28)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并包含由可通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增的DNA所編碼的氨基酸序列，所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)使用包含在SEQ ID NO124至128中任何一個表示的核苷酸序列的引物和包含在SEQ ID NO129中表示的核苷酸序列的引物，并且模板為暗產(chǎn)色鏈霉菌，磚紅色鏈霉菌，不產(chǎn)色鏈霉菌，灰褐鏈霉菌，熱淡天藍(lán)鏈霉菌，黑胡桃鏈霉菌，津島鏈霉菌，球團(tuán)產(chǎn)色鏈霉菌，橄欖產(chǎn)色鏈霉菌，裝飾鏈霉菌，灰色鏈霉菌，羊毛鏈霉菌，三澤鏈霉菌，蒼白色鏈霉菌，玫瑰變紅鏈霉菌，魯?shù)劓溍咕?，斯堡鏈霉菌或塔氏糖多孢菌的染色體DNA。
26.一種分析或檢測試劑盒，其包含按照權(quán)利要求24的抗體。
27.一種編碼鐵氧還蛋白的DNA，所述鐵氧還蛋白選自由下述物質(zhì)組成的組(B1)包含在SEQ ID NO12中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B2)包含在SEQ ID NO13中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B3)包含在SEQ ID NO14中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B4)包含在SEQ ID NO111中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B5)包含與在SEQ ID NO12，SEQ ID NO13，SEQ ID NO14或SEQID NO111中任何一個表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸的鐵氧還蛋白；(B6)包含由核苷酸序列編碼的氨基酸序列的鐵氧還蛋白，所述核苷酸序列與編碼在SEQ ID NO12，SEQ ID NO13，SEQ ID NO14或SEQ IDNO111中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少90％序列同一性；(B7)包含在SEQ ID NO149中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B8)包含在SEQ ID NO150中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B9)包含在SEQ ID NO151中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B 10)包含在SEQ ID NO152中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B11)包含在SEQ ID NO153中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B12)一種鐵氧還蛋白，其包含與在SEQ ID NO149，SEQ IDNO151，SEQ ID NO152，SEQ ID NO153，SEQ ID NO245，SEQ IDNO247，SEQ ID NO248，SEQ ID NO249，SEQ ID NO250，SEQ IDNO251或SEQ ID NO253中任何一個表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或與在SEQ ID NO150，SEQ ID NO252或SEQ IDNO254中任何一個表示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；(B13)一種鐵氧還蛋白，其包含由核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述核苷酸序列與編碼在SEQ ID NO149，SEQ ID NO150，SEQ IDNO151，SEQ ID NO152，SEQ ID NO153，SEQ ID NO245，SEQ IDNO247，SEQ ID NO248，SEQ ID NO249，SEQ ID NO250，SEQ IDNO251，SEQ ID NO252，SEQ ID NO253或SEQ ID NO254中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少90％序列同一性；(B14)包含在SEQ ID NO245中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B15)包含在SEQ ID NO247中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B16)包含在SEQ ID NO248中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B17)包含在SEQ ID NO249中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B18)包含在SEQ ID NO250中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B19)包含在SEQ ID NO251中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B20)包含在SEQ ID NO252中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B21)包含在SEQ ID NO253中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；和(B22)包含在SEQ ID NO254中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
28.包含核苷酸序列的DNA，所述核苷酸序列選自由下述物質(zhì)組成的組(b1)在SEQ ID NO15中表示的核苷酸序列；(b2)在SEQ ID NO16中表示的核苷酸序列；(b3)在SEQ ID NO17中表示的核苷酸序列；(b4)在SEQ ID NO112中表示的核苷酸序列；(b5)在SEQ ID NO154中表示的核苷酸序列；(b6)在SEQ ID NO155中表示的核苷酸序列；(b7)在SEQ ID NO156中表示的核苷酸序列；(b8)在SEQ ID NO157中表示的核苷酸序列；(b9)在SEQ ID NO158中表示的核苷酸序列；(b10)在SEQ ID NO255中表示的核苷酸序列；(b11)在SEQ ID NO257中表示的核苷酸序列；(b12)在SEQ ID NO258中表示的核苷酸序列；(b13)在SEQ ID NO259中表示的核苷酸序列；(b14)在SEQ ID NO260中表示的核苷酸序列；(b15)在SEQ ID NO261中表示的核苷酸序列；(b16)在SEQ ID NO262中表示的核苷酸序列；(b17)在SEQ ID NO263中表示的核苷酸序列；(b18)在SEQ ID NO264中表示的核苷酸序列；和(b19)一種核苷酸序列，其與在SEQ ID NO15，SEQ ID NO16，SEQID NO17，SEQ ID NO112，SEQ ID NO154，SEQ ID NO155，SEQ IDNO156，SEQ ID NO157，SEQ ID NO158，SEQ ID NO255，SEQ IDNO257，SEQ ID NO258，SEQ ID NO259，SEQ ID NO260，SEQ IDNO261，SEQ ID NO262，SEQ ID NO263或SEQ ID NO264中任何一個表示的核苷酸序列具有至少90％序列同一性。
29.一種包含按照權(quán)利要求28的DNA的載體。
30.一種轉(zhuǎn)化體，其中將按照權(quán)利要求28的DNA引入宿主細(xì)胞；
31.一種鐵氧還蛋白，其選自由下述物質(zhì)組成的組(B1)包含在SEQ ID NO12中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B2)包含在SEQ ID NO13中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B3)包含在SEQ ID NO14中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B4)包含在SEQ ID NO111中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B5)包含與在SEQ ID NO12，SEQ ID NO13，SEQ ID NO14或SEQID NO111中任何一個表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸的鐵氧還蛋白；(B6)包含由核苷酸序列編碼的氨基酸序列的鐵氧還蛋白，所述核苷酸序列與編碼在SEQ ID NO12，SEQ ID NO13，SEQ ID NO14或SEQ IDNO111中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少90％序列同一性；(B7)包含在SEQ ID NO149中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B8)包含在SEQ ID NO150中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B9)包含在SEQ ID NO151中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B10)包含在SEQ ID NO152中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B11)包含在SEQ ID NO153中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B12)一種鐵氧還蛋白，其包含與在SEQ ID NO149，SEQ IDNO151，SEQ ID NO152，SEQ ID NO153，SEQ ID NO245，SEQ IDNO247，SEQ ID NO248，SEQ ID NO249，SEQ ID NO250，SEQ IDNO251或SEQ ID NO253中任何一個表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或與在SEQ ID NO150，SEQ ID NO252或SEQ IDNO254中任何一個表示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；(B13)一種鐵氧還蛋白，其包含由核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述核苷酸序列與編碼在SEQ ID NO149，SEQ ID NO150，SEQ IDNO151，SEQ ID NO152，SEQ ID NO153，SEQ ID NO245，SEQ IDNO247，SEQ ID NO248，SEQ ID NO249，SEQ ID NO250，SEQ IDNO251，SEQ ID NO252，SEQ ID NO253或SEQ ID NO254中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少90％序列同一性；(B14)包含在SEQ ID NO245中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B15)包含在SEQ ID NO247中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B16)包含在SEQ ID NO248中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B17)包含在SEQ ID NO249中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B18)包含在SEQ ID NO250中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B19)包含在SEQ ID NO251中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B20)包含在SEQ ID NO252中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B21)包含在SEQ ID NO253中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；和(B22)包含在SEQ ID NO254中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
32.一種包含核苷酸序列的DNA，所述核苷酸選自由下述物質(zhì)組成的組(ab1)在SEQ ID NO9中表示的核苷酸序列；(ab2)在SEQ ID NO10中表示的核苷酸序列；(ab3)在SEQ ID NO11中表示的核苷酸序列；(ab4)在SEQ ID NO110中表示的核苷酸序列；(ab5)在SEQ ID NO144中表示的核苷酸序列；(ab6)在SEQ ID NO145中表示的核苷酸序列；(ab7)在SEQ ID NO146中表示的核苷酸序列；(ab8)在SEQ ID NO147中表示的核苷酸序列；(ab9)在SEQ ID NO148中表示的核苷酸序列；(ab10)在SEQ ID NO235中表示的核苷酸序列；(ab11)在SEQ ID NO236中表示的核苷酸序列；(ab12)在SEQ ID NO237中表示的核苷酸序列；(ab13)在SEQ ID NO238中表示的核苷酸序列；(ab14)在SEQ ID NO239中表示的核苷酸序列；(ab15)在SEQ ID NO240中表示的核苷酸序列；(ab16)在SEQ ID NO241中表示的核苷酸序列；(ab17)在SEQ ID NO242中表示的核苷酸序列；(ab18)在SEQ ID NO243中表示的核苷酸序列；和(ab19)在SEQ ID NO244中表示的核苷酸序列。
33.包含按照權(quán)利要求32的DNA的載體。
34.一種轉(zhuǎn)化體，其中將按照權(quán)利要求32的DNA引入宿主細(xì)胞。
35.按照權(quán)利要求34的轉(zhuǎn)化體，其中所述宿主細(xì)胞是微生物細(xì)胞或植物細(xì)胞。
36.一種生產(chǎn)轉(zhuǎn)化體的方法，其包含將按照權(quán)利要求32的DNA引入宿主細(xì)胞的步驟。
37.一種生產(chǎn)具有將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力的蛋白質(zhì)的方法，所述方法包含培養(yǎng)按照權(quán)利要求34的轉(zhuǎn)化體和回收產(chǎn)生的所述蛋白質(zhì)的步驟。
38.一種控制雜草的方法，其包含將化合物施用于表達(dá)至少一種除草劑代謝蛋白質(zhì)的植物的栽培區(qū)域的步驟，所述除草劑代謝蛋白質(zhì)選自由下述物質(zhì)組成的組(A1)包含在SEQ ID NO1中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A2)包含在SEQ ID NO2中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A3)包含在SEQ ID NO3中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A4)包含在SEQ ID NO108中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A5)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含與在SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO108中任何一個表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；(A6)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述核苷酸序列與編碼在SEQ ID NO1，SEQ IDNO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO108中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少80％序列同一性；(A7)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含由DNA編碼的氨基酸序列，所述DNA在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與包含編碼在SEQ ID NO1，SEQ IDNO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO108中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列的DNA雜交；(A8)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并包含由可通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增的DNA所編碼的氨基酸序列，所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)使用包含在SEQ ID NO129中表示的核苷酸序列的引物和包含在SEQ ID NO124至128中任何一個表示的核苷酸序列的引物，并且模板為屬于鏈霉菌屬或糖多孢菌屬微生物的染色體；(A9)包含在SEQ ID NO4中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A11)包含在SEQ ID NO159中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A12)包含在SEQ ID NO160中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A13)包含在SEQ ID NO136中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A14)包含在SEQ ID NO137中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A15)包含在SEQ ID NO138中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A16)包含在SEQ ID NO215中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A17)包含在SEQ ID NO216中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A18)包含在SEQ ID NO217中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A19)包含在SEQ ID NO218中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A20)包含在SEQ ID NO219中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A21)包含在SEQ ID NO220中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A22)包含在SEQ ID NO221中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A23)包含在SEQ ID NO222中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A24)包含在SEQ ID NO223中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A25)包含在SEQ ID NO224中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A26)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含與在SEQ IDNO159，SEQ ID NO136，SEQ ID NO137，SEQ ID NO138，SEQ IDNO217，SEQ ID NO219，SEQ ID NO220，SEQ ID NO221或SEQ IDNO223中任何一個表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或與在SEQ ID NO160，SEQ ID NO215，SEQ ID NO216，SEQ IDNO218，SEQ ID NO222或SEQ ID NO224中任何一個表示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；(A27)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述核苷酸序列與編碼在SEQ ID NO159，SEQ IDNO160，SEQ ID NO136，SEQ ID NO137，SEQ ID NO138，SEQ IDNO215，SEQ ID NO216，SEQ ID NO217，SEQ ID NO218，SEQ IDNO219，SEQ ID NO220，SEQ ID NO221，SEQ ID NO222，SEQ IDNO223或SEQ ID NO224中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少90％序列同一性；其中所述化合物是式(I)的化合物 其中在式(I)中，G表示在下列G-1至G-9中任何一個表示的基團(tuán) 其中在G-1至G-9中，X表示氧原子或硫原子；Y表示氧原子或硫原子；R1表示氫原子或鹵原子；R2表示氫原子，C1-C8烷基，C1-C8鹵代烷基，鹵原子，羥基，-OR9基團(tuán)，-SH基團(tuán)，-S(O)pR9基團(tuán)，-COR9基團(tuán)，-CO2R9基團(tuán)，-C(O)SR9基團(tuán)，-C(O)NR11R12基團(tuán)，-CONH2基團(tuán)，-CHO基團(tuán)，-CR9＝NOR18基團(tuán)，-CH＝CR19CO2R9基團(tuán)，-CH2CHR19CO2R9基團(tuán)，-CO2N＝CR13R14基團(tuán)，硝基，氰基，-NHSO2R15基團(tuán)，-NHSO2NHR15基團(tuán)，-NR9R20基團(tuán)，-NH2基團(tuán)或苯基，其可以被一個或多個可以相同或不同的C1-C4烷基取代；p表示0，1或2；R3表示C1-C2烷基，C1-C2鹵代烷基，-OCH3基團(tuán)，-SCH3基團(tuán)，-OCHF2基團(tuán)，鹵原子，氰基，硝基或C1-C3烷氧基，其用在苯環(huán)上可以被至少一個取代基取代的苯基取代，所述取代基選自鹵原子，C1-C3烷基，C1-C3鹵代烷基，OR28基團(tuán)，NR11R28基團(tuán)，SR28基團(tuán)，氰基，CO2R28基團(tuán)和硝基；R4表示氫原子，C1-C3烷基或C1-C3鹵代烷基；R5表示氫原子，C1-C3烷基，C1-C3鹵代烷基，環(huán)丙基，乙烯基，C2炔基，氰基，-C(O)R20基團(tuán)，-CO2R20基團(tuán)，-C(O)NR20R21基團(tuán)，-CHR16R17CN基團(tuán)，-CR16R17C(O)R20基團(tuán)，-CR16R17CO2R20基團(tuán)，-CR16R17C(O)NR20R21基團(tuán)，-CHR16OH基團(tuán)，-CHR16OC(O)R20基團(tuán)或-OCHR16OC(O)NR20R21基團(tuán)，或當(dāng)G表示G-2或G-6時，R4和R5可以表示與它們結(jié)合的碳原子一起的C＝O基團(tuán)；R6表示C1-C6烷基，C1-C6鹵代烷基，C2-C6烷氧基烷基，C3-C6烯基或C3-C6炔基；R7表示氫原子，C1-C6烷基，C1-C6鹵代烷基，鹵原子，-S(O)2(C1-C6烷基)或-C(＝O)R22基團(tuán)；R8表示氫原子，C1-C8烷基，C3-C8環(huán)烷基，C3-C8烯基，C3-C8炔基，C1-C8鹵代烷基，C2-C8烷氧基烷基，C3-C8烷氧基烷氧基烷基，C3-C8鹵代炔基，C3-C5鹵代烯基，C1-C8烷基磺?；珻1-C8鹵代烷基磺?；?，C3-C8烷氧基羰基烷基，-S(O)2NH(C1-C8烷基)基團(tuán)，-C(O)R23基團(tuán)或可在苯環(huán)上被R24取代的芐基；R9表示C1-C8烷基，C3-C8環(huán)烷基，C3-C8烯基，C3-C8炔基，C1-C8鹵代烷基，C2-C8烷氧基烷基，C2-C8烷基硫代烷基，C2-C8烷基亞磺?；榛珻2-C8烷基磺?；榛珻4-C8烷氧基烷氧基烷基，C4-C8環(huán)烷基烷基，C4-C8環(huán)烷氧基烷基，C4-C8烯基氧基烷基，C4-C8炔基氧基烷基，C3-C8鹵代烷氧基烷基，C4-C8鹵代烯基氧基烷基，C4-C8鹵代炔基氧基烷基，C4-C8環(huán)烷基硫代烷基，C4-C8烯基硫代烷基，C4-C8炔基硫代烷基，苯氧基取代的C1-C4烷基，所述苯氧基可在環(huán)上被至少一種取代基取代，所述取代基選自鹵原子，C1-C3烷基和C1-C3鹵代烷基，芐氧基取代的C1-C4烷基，所述芐氧基可在環(huán)上被至少一種取代基取代，所述取代基選自鹵原子，C1-C3烷基和C1-C3鹵代烷基，C4-C8trialkylsyrylalkyl基團(tuán)，C2-C8氰烷基，C3-C8鹵代環(huán)烷基，C3-C8鹵代烯基，C5-C8烷氧基烯基，C5-C8鹵代烷氧基烯基，C5-C8烷基硫代烯基，C3-C8鹵代炔基，C5-C8烷氧基炔基，C5-C8鹵代烷氧基炔基，C5-C8烷基硫代炔基，C2-C8烷基羰基，在環(huán)上可以用至少一種選自鹵原子，C1-C3烷基，C1-C3鹵代烷基，-OR28基團(tuán)，-NR11R28基團(tuán)，-SR28基團(tuán)，氰基，-CO2R28基團(tuán)和硝基的取代基取代的芐基，-CR16R17COR10基團(tuán)，-CR16R17CO2R20基團(tuán)，-CR16R17P(O)(OR10)2基團(tuán)，-CR16R17P(S)(OR10)2基團(tuán)，-CR16R17C(O)NR11R12基團(tuán)，-CR16R17C(O)NH2基團(tuán)，-C(＝CR26R27)COR10基團(tuán)，-C(＝CR26R27)CO2R20基團(tuán)，-C(＝CR26R27)P(O)(OR10)2基團(tuán)，-C(＝CR26R27)P(S)(OR10)2基團(tuán)，-C(＝CR26R27)C(O)NR11R12基團(tuán)，-C(＝CR26R27)C(O)NH2基團(tuán)，或在Q-1至Q-7表示的環(huán)中的任何一個 其在環(huán)上可以被至少一種取代基取代，所述取代基選自鹵原子，C1-C6烷基，C1-C6鹵代烷基，C2-C6烯基，C2-C6鹵代烯基，C2-C6炔基，C3-C6鹵代炔基，C2-C8烷氧基烷基，-OR28基團(tuán)，-SR28基團(tuán)，-NR11R28基團(tuán)，C3-C8烷氧羰基烷基，C2-C4羧基烷基，-CO2R28基團(tuán)和氰基；R10表示C1-C6烷基，C2-C6烯基，C3-C6炔基或四氫呋喃基團(tuán)；R11和R13獨立地表示氫原子或C1-C4烷基；R12表示C1-C6烷基，C3-C6環(huán)烷基，C3-C6烯基，C3-C6炔基，C2-C6烷氧基烷基，C1-C6鹵代烷基，C3-C6鹵代烯基，C3-C6鹵代炔基，在環(huán)上可以被至少一種取代基取代的苯基，所述取代基選自鹵原子，C1-C4烷基和C1-C4烷氧基，或-CR16R17CO2R25基團(tuán)；或，R11和R12一起可以表示-(CH2)5-，-(CH2)4-，或-CH2CH2OCH2CH2-，或者如果是那樣的話，產(chǎn)生的環(huán)可以用選自C1-C3烷基，苯基和芐基的取代基取代；R14表示C1-C4烷基或在環(huán)上可以用選自鹵原子，C1-C3烷基和C1-C3鹵代烷基的取代基所取代的苯基；或，R13和R14可以與它們結(jié)合的碳原子一起表示C3-C8環(huán)烷基；R15表示C1-C4烷基，C1-C4鹵代烷基或C3-C6烯基；R16和R17獨立地表示氫原子或C1-C4烷基，C1-C4鹵代烷基，C2-C4烯基，C2-C4鹵代烯基，C2-C4炔基，C3-C4鹵代炔基；或，R16和R17可以與它們結(jié)合的碳原子一起表示C3-C6環(huán)烷基，或者如此形成的環(huán)可以用至少一種選自鹵原子，C1-C3烷基和C1-C3鹵代烷基的取代基所取代；R18表示氫原子，C1-C6烷基，C3-C6烯基或C3-C6炔基；R19表示氫原子，C1-C4烷基或鹵原子；R20表示氫原子，C1-C6烷基，C3-C6環(huán)烷基，C3-C6烯基，C3-C6炔基，C2-C6烷氧基烷基，C1-C6鹵代烷基，C3-C6鹵代烯基，C3-C6鹵代炔基，在環(huán)上可以用至少一種取代基取代的苯基，所述取代基選自鹵原子，C1-C4烷基和-OR28基團(tuán)，或-CR16R17CO2R25基團(tuán)；R21表示氫原子，C1-C2烷基或-CO2(C1-C4烷基)基團(tuán)；R22表示氫原子，C1-C6烷基，C1-C6烷氧基或NH(C1-C6烷基)基團(tuán)；R23表示C1-C6烷基，C1-C6鹵代烷基，C1-C6烷氧基，NH(C1-C6烷基)基團(tuán)，芐基，C2-C8二烷基氨基或可以用R24取代的苯基；R24表示C1-C6烷基，1-2個鹵原子，C1-C6烷氧基或CF3基團(tuán)；R25表示C1-C6烷基，C1-C6鹵代烷基，C3-C6烯基，C3-C6鹵代烯基，C3-C6炔基或C3-C6鹵代炔基；R26和R27各自獨立地表示氫原子，C1-C4烷基，C1-C4鹵代烷基，C2-C4烯基，C2-C4鹵代烯基，C2-C4炔基，C3-C4鹵代炔基，-OR28基團(tuán)，-NHR28基團(tuán)，或-SR28基團(tuán)；或，R26和R27可以與它們結(jié)合的碳原子一起表示C3-C8環(huán)烷基，或每個如此形成的環(huán)可以用至少一種選自鹵原子，C1-C3烷基和C1-C3鹵代烷基的取代基所取代；并且R28表示氫原子，C1-C6烷基，C1-C6鹵代烷基，C3-C6烯基，C3-C6鹵代烯基，C3-C6炔基，C3-C6鹵代炔基，C2-C4羧基烷基，C3-C8烷氧基羰基烷基，C3-C8鹵代烷氧基羰基烷基，C5-C9烯基氧基羰基烷基，C5-C9鹵代烯基氧基羰基烷基，C5-C9炔基氧基羰基烷基，C5-C9鹵代炔基氧基羰基烷基，C5-C9環(huán)烷氧基羰基烷基或C5-C9鹵代環(huán)烷氧基羰基烷基。
39.一種控制雜草的方法，其包含將化合物施用于表達(dá)至少一種蛋白質(zhì)的植物的栽培區(qū)域的步驟，所述蛋白質(zhì)選自由下述物質(zhì)組成的組(A1)包含在SEQ ID NO1中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A2)包含在SEQ ID NO2中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A3)包含在SEQ ID NO3中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A4)包含在SEQ ID NO108中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A5)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含與在SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO108中任何一個表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；(A6)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述核苷酸序列與編碼在SEQ ID NO1，SEQ IDNO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO108中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少80％序列同一性；(A11)包含在SEQ ID NO159中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A12)包含在SEQ ID NO160中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A13)包含在SEQ ID NO136中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A14)包含在SEQ ID NO137中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A15)包含在SEQ ID NO138中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A16)包含在SEQ ID NO215中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A17)包含在SEQ ID NO216中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A18)包含在SEQ ID NO217中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A19)包含在SEQ ID NO218中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A20)包含在SEQ ID NO219中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A21)包含在SEQ ID NO220中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A22)包含在SEQ ID NO221中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A23)包含在SEQ ID NO222中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A24)包含在SEQ ID NO223中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A25)包含在SEQ ID NO224中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A26)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含與在SEQ IDNO159，SEQ ID NO136，SEQ ID NO137，SEQ ID NO138，SEQ IDNO217，SEQ ID NO219，SEQ ID NO220，SEQ ID NO221或SEQ IDNO223中任何一個表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或與在SEQ ID NO160，SEQ ID NO215，SEQ ID NO216，SEQ IDNO218，SEQ ID NO222或SEQ ID NO224中任何一個表示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；(A27)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述核苷酸序列與編碼在SEQ ID NO159，SEQ IDNO160，SEQ ID NO136，SEQ ID NO137，SEQ ID NO138，SEQ IDNO215，SEQ ID NO216，SEQ ID NO217，SEQ ID NO218，SEQ IDNO219，SEQ ID NO220，SEQ ID NO221，SEQ ID NO222，SEQ IDNO223或SEQ ID NO224中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少90％序列同一性；和(A28)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并包含由可通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增的DNA所編碼的氨基酸序列，所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)使用包含在SEQ ID NO124至128中任何一個表示的核苷酸序列的引物和包含在SEQ ID NO129中表示的核苷酸序列的引物，并且模板為暗產(chǎn)色鏈霉菌，磚紅色鏈霉菌，不產(chǎn)色鏈霉菌，灰褐鏈霉菌，熱淡天藍(lán)鏈霉菌，黑胡桃鏈霉菌，津島鏈霉菌，球團(tuán)產(chǎn)色鏈霉菌，橄欖產(chǎn)色鏈霉菌，裝飾鏈霉菌，灰色鏈霉菌，羊毛鏈霉菌，三澤鏈霉菌，蒼白色鏈霉菌，玫瑰變紅鏈霉菌，魯?shù)劓溍咕?，斯堡鏈霉菌或塔氏糖多孢菌的染色體DNA。
40.一種評估細(xì)胞對式(I)化合物的抗性的方法，所述方法包含(3)將所述化合物與表達(dá)至少一種除草劑代謝蛋白質(zhì)的細(xì)胞接觸的步驟，所述除草劑代謝蛋白質(zhì)選自由下述物質(zhì)組成的組(A1)包含在SEQ ID NO1中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A2)包含在SEQ ID NO2中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A3)包含在SEQ ID NO3中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A4)包含在SEQ ID NO108中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A5)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含與在SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO108中任何一個表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；(A6)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述核苷酸序列與編碼在SEQ ID NO1，SEQ IDNO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO108中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少80％序列同一性；(A7)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含由DNA編碼的氨基酸序列，所述DNA在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與包含編碼在SEQ ID NO1，SEQ IDNO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO108中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列的DNA雜交；(A8)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并包含由可通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增的DNA所編碼的氨基酸序列，所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)使用包含在SEQ ID NO129中表示的核苷酸序列的引物和包含在SEQ ID NO124至128中任何一個表示的核苷酸序列的引物，并且模板為屬于鏈霉菌屬或糖多孢菌屬的微生物的染色體；(A9)包含在SEQ ID NO4中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A11)包含在SEQ ID NO159中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A12)包含在SEQ ID NO160中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A13)包含在SEQ ID NO136中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A14)包含在SEQ ID NO137中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A15)包含在SEQ ID NO138中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A16)包含在SEQ ID NO215中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A17)包含在SEQ ID NO216中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A18)包含在SEQ ID NO217中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A19)包含在SEQ ID NO218中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A20)包含在SEQ ID NO219中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A21)包含在SEQ ID NO220中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A22)包含在SEQ ID NO221中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A23)包含在SEQ ID NO222中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A24)包含在SEQ ID NO223中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A25)包含在SEQ ID NO224中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A26)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含與在SEQ IDNO159，SEQ ID NO136，SEQ ID NO137，SEQ ID NO138，SEQ IDNO217，SEQ ID NO219，SEQ ID NO220，SEQ ID NO221或SEQ IDNO223中任何一個表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或與在SEQ ID NO160，SEQ ID NO215，SEQ ID NO216，SEQ IDNO218，SEQ ID NO222或SEQ ID NO224中任何一個表示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和(A27)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述核苷酸序列與編碼在SEQ ID NO159，SEQ IDNO160，SEQ ID NO136，SEQ ID NO137，SEQ ID NO138，SEQ IDNO215，SEQ ID NO216，SEQ ID NO217，SEQ ID NO218，SEQ IDNO219，SEQ ID NO220，SEQ ID NO221，SEQ ID NO222，SEQ IDNO223或SEQ ID NO224中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少90％序列同一性；和(4)評估在上述步驟(1)中對接觸所述化合物的細(xì)胞的損傷程度的步驟。
41.按照權(quán)利要求40的方法，其中所述細(xì)胞是微生物細(xì)胞或植物細(xì)胞；
42.選擇抗式(I)化合物的細(xì)胞的方法，所述方法包含基于在按照權(quán)利要求40的方法中評估的抗性來選擇細(xì)胞的步驟。
43.通過按照權(quán)利要求42的方法選擇的抗除草劑的細(xì)胞，或其培養(yǎng)物。
44.一種評估植物對式(I)化合物的抗性的方法，所述方法包含(3)將所述化合物與表達(dá)至少一種除草劑代謝蛋白質(zhì)的植物接觸的步驟，所述除草劑代謝蛋白質(zhì)選自由下述物質(zhì)組成的組(A1)包含在SEQ ID NO1中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A2)包含在SEQ ID NO2中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A3)包含在SEQ ID NO3中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A4)包含在SEQ ID NO108中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A5)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含與在SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO108中任何一個表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；(A6)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述核苷酸序列與編碼在SEQ ID NO1，SEQ IDNO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO108中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少80％序列同一性；(A7)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含由DNA編碼的氨基酸序列，所述DNA在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與包含編碼在SEQ ID NO1，SEQ IDNO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO108中表示的氨基酸序列的核苷酸序列的DNA雜交；(A8)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并包含由可通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增的DNA所編碼的氨基酸序列，所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)使用包含在SEQ ID NO129中表示的核苷酸序列的引物和包含在SEQ ID NO124至128中任何一個表示的核苷酸序列的引物，并且模板為屬于鏈霉菌屬或糖多孢菌屬的微生物的染色體；(A9)包含在SEQ ID NO4中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A11)包含在SEQ ID NO159中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A12)包含在SEQ ID NO160中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A13)包含在SEQ ID NO136中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A14)包含在SEQ ID NO137中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A15)包含在SEQ ID NO138中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A16)包含在SEQ ID NO215中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A17)包含在SEQ ID NO216中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A18)包含在SEQ ID NO217中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A19)包含在SEQ ID NO218中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A20)包含在SEQ ID NO219中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A21)包含在SEQ ID NO220中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A22)包含在SEQ ID NO221中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A23)包含在SEQ ID NO222中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A24)包含在SEQ ID NO223中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A25)包含在SEQ ID NO224中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A26)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含與在SEQ IDNO159，SEQ ID NO136，SEQ ID NO137，SEQ ID NO138，SEQ IDNO217，SEQ ID NO219，SEQ ID NO220，SEQ ID NO221或SEQ IDNO223中任何一個表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或與在SEQ ID NO160，SEQ ID NO215，SEQ ID NO216，SEQ IDNO218，SEQ ID NO222或SEQ ID NO224中任何一個表示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和(A27)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述核苷酸序列與編碼在SEQ ID NO159，SEQ IDNO160，SEQ ID NO136，SEQ ID NO137，SEQ ID NO138，SEQ IDNO215，SEQ ID NO216，SEQ ID NO217，SEQ ID NO218，SEQ IDNO219，SEQ ID NO220，SEQ ID NO221，SEQ ID NO222，SEQ IDNO223或SEQ ID NO224中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少90％序列同一性；和(4)評估在上述步驟(1)中對接觸所述化合物的植物的損傷程度的步驟。
45.一種選擇抗式(I)化合物的植物的方法，所述方法包含基于在按照權(quán)利要求44的方法中評估的抗性來選擇植物的步驟。
46.一種由按照權(quán)利要求45的方法選擇的抗除草劑植物，或其后代。
47.一種處理式(I)化合物的方法，所述方法包含在含有電子供體的電子傳遞體系的存在下將所述化合物與至少一種除草劑代謝蛋白質(zhì)反應(yīng)，所述除草劑代謝蛋白質(zhì)選自由下述物質(zhì)組成的組(A1)包含在SEQ ID NO1中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A2)包含在SEQ ID NO2中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A3)包含在SEQ ID NO3中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A4)包含在SEQ ID NO108中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A5)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含與在SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO108中任何一個表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；(A6)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述核苷酸序列與編碼在SEQ ID NO1，SEQ IDNO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO108中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少80％序列同一性；(A7)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含由DNA編碼的氨基酸序列，所述DNA在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與包含編碼在SEQ ID NO1，SEQ IDNO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO108中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列的DNA雜交；(A8)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并包含由可通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增的DNA所編碼的氨基酸序列，所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)使用包含在SEQ ID NO129中表示的核苷酸序列的引物和包含在SEQ ID NO124至128中任何一個表示的核苷酸序列的引物，并且模板為屬于鏈霉菌屬或糖多孢菌屬的微生物的染色體；(A9)包含在SEQ ID NO4中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A11)包含在SEQ ID NO159中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A12)包含在SEQ ID NO160中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A13)包含在SEQ ID NO136中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A14)包含在SEQ ID NO137中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A15)包含在SEQ ID NO138中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A16)包含在SEQ ID NO215中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A17)包含在SEQ ID NO216中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A18)包含在SEQ ID NO217中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A19)包含在SEQ ID NO218中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A20)包含在SEQ ID NO219中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A21)包含在SEQ ID NO220中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A22)包含在SEQ ID NO221中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A23)包含在SEQ ID NO222中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A24)包含在SEQ ID NO223中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A25)包含在SEQ ID NO224中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A26)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含與在SEQ IDNO159，SEQ ID NO136，SEQ ID NO137，SEQ ID NO138，SEQ IDNO217，SEQ ID NO219，SEQ ID NO220，SEQ ID NO221或SEQ IDNO223中任何一個表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或與在SEQ ID NO160，SEQ ID NO215，SEQ ID NO216，SEQ IDNO218，SEQ ID NO222或SEQ ID NO224中任何一個表示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和(A27)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述核苷酸序列與編碼在SEQ ID NO159，SEQ IDNO160，SEQ ID NO136，SEQ ID NO137，SEQ ID NO138，SEQ IDNO215，SEQ ID NO216，SEQ ID NO217，SEQ ID NO218，SEQ IDNO219，SEQ ID NO220，SEQ ID NO221，SEQ ID NO222，SEQ IDNO223或SEQ ID NO224中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少90％序列同一性。
48.按照權(quán)利要求47的方法，其中通過將所述化合物與轉(zhuǎn)化體接觸將所述化合物與所述除草劑代謝蛋白質(zhì)反應(yīng)，在所述轉(zhuǎn)化體中將編碼所述除草劑代謝蛋白質(zhì)的DNA引入能使它在所述細(xì)胞中表達(dá)的位置的宿主細(xì)胞中。
49.除草劑代謝蛋白質(zhì)在處理式(I)化合物中的應(yīng)用，所述除草劑代謝蛋白質(zhì)選自由下述物質(zhì)組成的組(A1)包含在SEQ ID NO1中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A2)包含在SEQ ID NO2中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A3)包含在SEQ ID NO3中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A4)包含在SEQ ID NO108中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A5)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含與在SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO108中任何一個表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；(A6)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述核苷酸序列與編碼在SEQ ID NO1，SEQ IDNO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO108中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少80％序列同一性；(A7)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含由DNA編碼的氨基酸序列，所述DNA在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與包含編碼在SEQ ID NO1，SEQ IDNO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO108中表示的氨基酸序列的核苷酸序列的DNA雜交；(A8)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并包含由可通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增的DNA所編碼的氨基酸序列，所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)使用包含在SEQ ID NO129中表示的核苷酸序列的引物和包含在SEQ ID NO124至128中任何一個表示的核苷酸序列的引物，并且模板為屬于鏈霉菌屬或糖多孢菌屬的微生物的染色體；(A9)包含在SEQ ID NO4中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A11)包含在SEQ ID NO159中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A12)包含在SEQ ID NO160中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A13)包含在SEQ ID NO136中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A14)包含在SEQ ID NO137中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A15)包含在SEQ ID NO138中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A16)包含在SEQ ID NO215中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A17)包含在SEQ ID NO216中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A18)包含在SEQ ID NO217中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A19)包含在SEQ ID NO218中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A20)包含在SEQ ID NO219中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A21)包含在SEQ ID NO220中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A22)包含在SEQ ID NO221中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A23)包含在SEQ ID NO222中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A24)包含在SEQ ID NO223中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A25)包含在SEQ ID NO224中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A26)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含與在SEQ IDNO159，SEQ ID NO136，SEQ ID NO137，SEQ ID NO138，SEQ IDNO217，SEQ ID NO219，SEQ ID NO220，SEQ ID NO221或SEQ IDNO223中任何一個表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或與在SEQ ID NO160，SEQ ID NO215，SEQ ID NO216，SEQ IDNO218，SEQ ID NO222或SEQ ID NO224中任何一個表示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和(A27)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述核苷酸序列與編碼在SEQ ID NO159，SEQ IDNO160，SEQ ID NO136，SEQ ID NO137，SEQ ID NO138，SEQ IDNO215，SEQ ID NO216，SEQ ID NO217，SEQ ID NO218，SEQ IDNO219，SEQ ID NO220，SEQ ID NO221，SEQ ID NO222，SEQ IDNO223或SEQ ID NO224中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少90％序列同一性。
50.編碼除草劑代謝蛋白質(zhì)的多核苷酸在處理式(I)化合物中的應(yīng)用，所述除草劑代謝蛋白質(zhì)選自由下述物質(zhì)組成的組(A1)包含在SEQ ID NO1中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A2)包含在SEQ ID NO2中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A3)包含在SEQ ID NO3中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A4)包含在SEQ ID NO108中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A5)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含與在SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO108中任何一個表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；(A6)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述核苷酸序列與編碼在SEQ ID NO1，SEQ IDNO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO108中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少80％序列同一性；(A7)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含由DNA編碼的氨基酸序列，所述DNA在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與包含編碼在SEQ ID NO1，SEQ IDNO2，SEQ ID NO3或SEQ ID NO108中表示的氨基酸序列的核苷酸序列的DNA雜交；(A8)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并包含由可通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增的DNA所編碼的氨基酸序列，所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)使用包含在SEQ ID NO129中表示的核苷酸序列的引物和包含在SEQ ID NO124至128中任何一個表示的核苷酸序列的引物，并且模板為屬于鏈霉菌屬或糖多孢菌屬的微生物的染色體；(A9)包含在SEQ ID NO4中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A11)包含在SEQ ID NO159中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A12)包含在SEQ ID NO160中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A13)包含在SEQ ID NO136中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A14)包含在SEQ ID NO137中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A15)包含在SEQ ID NO138中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A16)包含在SEQ ID NO215中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A17)包含在SEQ ID NO216中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A18)包含在SEQ ID NO217中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A19)包含在SEQ ID NO218中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A20)包含在SEQ ID NO219中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A21)包含在SEQ ID NO220中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A22)包含在SEQ ID NO221中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A23)包含在SEQ ID NO222中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A24)包含在SEQ ID NO223中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A25)包含在SEQ ID NO224中表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(A26)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含與在SEQ IDNO159，SEQ ID NO136，SEQ ID NO137，SEQ ID NO138，SEQ IDNO217，SEQ ID NO219，SEQ ID NO220，SEQ ID NO221或SEQ IDNO223中任何一個表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或與在SEQ ID NO160，SEQ ID NO215，SEQ ID NO216，SEQ IDNO218，SEQ ID NO222或SEQ ID NO224中任何一個表示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和(A27)一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并且包含由核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述核苷酸序列與編碼在SEQ ID NO159，SEQ IDNO160，SEQ ID NO136，SEQ ID NO137，SEQ ID NO138，SEQ IDNO215，SEQ ID NO216，SEQ ID NO217，SEQ ID NO218，SEQ IDNO219，SEQ ID NO220，SEQ ID NO221，SEQ ID NO222，SEQ IDNO223或SEQ ID NO224中任何一個表示的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少90％序列同一性。
全文摘要
本發(fā)明提供例如，編碼選自以下蛋白質(zhì)組的除草劑代謝蛋白質(zhì)的DNA。該DNA可以例如用于生產(chǎn)抗除草劑植物。<蛋白質(zhì)組>一種蛋白質(zhì)，其包含在SEQ ID NO1，2，3，108，159，160，136，137，138，215，216，217，218，219，220，221，222，223或224中表示的氨基酸序列，一種蛋白質(zhì)，其具有在包含電子供體的電子傳遞體系的存在下將式(II)化合物轉(zhuǎn)化為式(III)化合物的能力，并包含與在SEQ ID NO1，2，3，108，159，136，137，138，215，216，217，218，219，220，221，222，223或224中任何一個表示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或與在SEQ ID NO160，215，216，218，222或224中任何一個表示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
文檔編號G01N33/15GK1894408SQ0282564
公開日2007年1月10日 申請日期2002年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月19日
發(fā)明者中島寬樹, 椋本藤夫, 高石昌直 申請人:住友化學(xué)工業(yè)株式會社