專利名稱：對照組合物及其用于凝結(jié)實(shí)驗(yàn)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于校準(zhǔn)凝結(jié)實(shí)驗(yàn)的對照組合物、方法、設(shè)備和試劑盒。
背景技術(shù)：
已經(jīng)開發(fā)了各種血液和血漿凝結(jié)實(shí)驗(yàn)來診斷凝結(jié)病癥、監(jiān)控患者的抗凝結(jié)治療、篩選患者在手術(shù)前的凝結(jié)能力以及其它用途。這種實(shí)驗(yàn)包括例如凝血酶原時間(PT)、部分組織促凝血酶原激酶時間(PTT)、活化部分組織促凝血酶原激酶時間(APTT)、凝血酶凝血時間(TCT)、活化凝血時間(ACT)、血纖維蛋白原分析以及其它實(shí)驗(yàn)。
凝血酶原時間或PT實(shí)驗(yàn)是最常用的凝結(jié)實(shí)驗(yàn)，通常用于監(jiān)控正在接受使用藥物例如Warfarin或Coumadin進(jìn)行的口服抗凝結(jié)治療的患者。當(dāng)與組織促凝血酶原激酶混合時，PT通過檢測患者的再次鈣化的血漿或毛細(xì)管血液的凝固能力來評價外源凝血途徑因子。對患者的精確監(jiān)控要求使藥物劑量有規(guī)律并避免大量流血或再次出現(xiàn)凝血。凝血酶原時間分析通常包括將患者的血樣暴露于組織促凝血酶原激酶，然后監(jiān)控血液或血漿凝膠或凝固所需的時間。組織促凝血酶原激酶可以存在于能與血液混合的液體試劑中，或可以是在已涂有血液的試條上的化學(xué)預(yù)干燥的形式，或以其它實(shí)驗(yàn)形式排列。凝固的發(fā)展是組織促凝血酶原激酶反應(yīng)的開始，開始的時間可以通過光學(xué)、電子、粘度變化或其它技術(shù)來檢測。
PT實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不均一性導(dǎo)致對患者的劑量控制問題。長期以來已經(jīng)認(rèn)識到PT的變化是一個嚴(yán)重的問題，世界健康組織(WHO)已經(jīng)發(fā)展了建立PT實(shí)驗(yàn)的均一性的標(biāo)準(zhǔn)。國際敏感指數(shù)(ISI)是對于不同組織促凝血酶原激酶對口服抗凝結(jié)劑的響應(yīng)的校準(zhǔn)因子(L.Poller，“The Prothrombin Time”，WHO 1998)。ISI值取決于單個PT實(shí)驗(yàn)對參比制劑例如WHO國際參比制劑(IRP)的校正。對于每組商業(yè)PT實(shí)驗(yàn)必須測定ISI以提供對實(shí)驗(yàn)體系不均一性的補(bǔ)償。
用不同凝結(jié)實(shí)驗(yàn)得到的凝血酶原時間可以通過計(jì)算比較，稱為國際標(biāo)準(zhǔn)化比率(INR)。INR提供對于PT檢測中體系與體系之間的變化的補(bǔ)償，通過用PT時間除以限定正常主體人群的平均正常凝血酶原時間(MNPT)來計(jì)算，得到ISI。對于相同的樣品，不同類型的PT實(shí)驗(yàn)可以產(chǎn)生不同的PT結(jié)果，但是對于不同實(shí)驗(yàn)的INR值應(yīng)該是可比的。ISI是INR計(jì)算的一部分，以校正PT實(shí)驗(yàn)體系的靈敏性方面的差異。ISI得自參考PT值對由20個正常(非抗凝結(jié)的)主體與60個穩(wěn)定的正在進(jìn)行長期口服給予抗凝結(jié)治療的患者得到的檢測的PT值的log校準(zhǔn)曲線的斜率。MNPT值通常通過計(jì)算在ISI檢測中所用的20個正常主體得到的PT檢測值的幾何平均值而獲得。
通過WHO建議的方式對凝結(jié)實(shí)驗(yàn)的校正是比較復(fù)雜且昂貴的程序。每組商業(yè)PT實(shí)驗(yàn)的校準(zhǔn)需要從一組至少80個供體用寬范圍的INR得到毛細(xì)管血液樣品。因?yàn)殛惻f的血液樣品不能在PT實(shí)驗(yàn)中使用，所以新鮮血液樣品必須從每組新的商業(yè)PT實(shí)驗(yàn)的供體得到。以此方式獲得血液樣品是昂貴的，需要獲得很多患者同意抽血來評價每組商業(yè)PT實(shí)驗(yàn)。
曾經(jīng)有人嘗試克服上述困難，使用可從商業(yè)得到的“校準(zhǔn)”血漿，其得自正常的和抗凝結(jié)血液供體庫，可以冰凍儲存。通常需要5-7個不同水平或種類的校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)，這取決于待校準(zhǔn)的特定實(shí)驗(yàn)。但是，許多凝結(jié)實(shí)驗(yàn)是基于在試條中血液凝結(jié)的光學(xué)檢測，這允許使用“刺手指”血液樣品在非臨床裝置中對各患者進(jìn)行快速和容易的PT實(shí)驗(yàn)。這種凝結(jié)實(shí)驗(yàn)不能有效地檢測單獨(dú)在血漿中的凝結(jié)，所以對作為凝結(jié)實(shí)驗(yàn)的控制標(biāo)準(zhǔn)的校準(zhǔn)血漿的有效性受到限制。
因此需要校準(zhǔn)和對照組合物和用于凝結(jié)實(shí)驗(yàn)的簡單價廉的方法，該方法不需要大的血液或血漿供體庫，并可以使用光學(xué)檢測系統(tǒng)。本發(fā)明滿足這些和其它要求，并通?？朔吮尘凹夹g(shù)中的不足。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了用于校準(zhǔn)凝結(jié)實(shí)驗(yàn)的對照組合物、方法、設(shè)備和試劑盒。本發(fā)明的對照組合物一般包括能在血漿中聚集的顆粒和鈣離子。該組合物可以另外含有血漿。血漿可以含有來自已知的抗凝結(jié)人血供體庫的檸檬酸鹽化校準(zhǔn)血漿、來自稀釋或消耗庫存正常血漿的檸檬酸鹽化對照血漿或其它血漿。所述顆?？梢院芯酆衔镏榱＃谄浔砻嫔暇哂卸鄠€帶電荷的基團(tuán)，它們與血漿中存在的蛋白質(zhì)進(jìn)行非特定的結(jié)合。鈣離子可以是Ca++離子溶液的形式，例如鹵化鈣溶液或其它可溶性鈣鹽的溶液。在特定的實(shí)施方案中，所述組合物可以含有能在檸檬酸鹽化血漿中聚集的顆粒的溶液或懸浮液，能與所述顆粒懸浮液組合的鈣離子溶液，和能與所述組合的鈣離子溶液和顆粒懸浮液混合的檸檬酸鹽化血漿。
本發(fā)明的組合物可以進(jìn)一步含有一種或多種光學(xué)對比增強(qiáng)劑以促進(jìn)血漿凝結(jié)的光學(xué)檢測。光學(xué)對比增強(qiáng)劑可以含有一種或多種粒狀顏料和/或一種或多種可溶性染料。光學(xué)對比增強(qiáng)劑可以溶解和/或懸浮于鈣離子的溶液中。所述顆?；蚓酆衔镏榱＿€可以含有用于增強(qiáng)對比的染料或顏料。本發(fā)明的組合物可以進(jìn)一步含有血紅蛋白以促進(jìn)在血漿中顆粒的聚集。所述對照組合物的各種組分可以在使用之前分開儲存以使其儲存期最大化。所述組合物可以另外含有防凍劑以利于所述組合物或其組分的低溫儲存。
本發(fā)明的方法一般包括提供鈣離子和能在血漿中聚集的顆粒，使鈣離子和顆粒與血漿組合以形成一種對照組合物，將所述對照組合物施用或引入到至少一個凝結(jié)實(shí)驗(yàn)中。所述方法可以進(jìn)一步包括監(jiān)控所述對照組合物的凝結(jié)。所述方法可以另外包括測定所述對照組合物的凝結(jié)時間與至少一種與對照組合物中所用血漿相關(guān)的全血樣的凝結(jié)時間之間的關(guān)系。該方法可以進(jìn)一步包括測定由凝結(jié)實(shí)驗(yàn)獲得的對照組合物的凝結(jié)時間與使用參比實(shí)驗(yàn)得到的凝結(jié)時間之間的關(guān)系。該方法還可以進(jìn)一步包括測定校準(zhǔn)曲線或者確定對凝結(jié)實(shí)驗(yàn)的校準(zhǔn)。在特定的實(shí)施方案中，該方法包括提供含鈣離子的第一對照組分，提供含能在血漿中聚集的顆粒的第二對照組分，將第一和第二對照組分組合在一起，將血漿加入組合的對照組分中以形成對照組合物，將所述對照組合物施用或引入到至少一個凝結(jié)實(shí)驗(yàn)樣品中，并監(jiān)控所述對照組合物的凝結(jié)。
本發(fā)明還提供用于儲存本發(fā)明對照組合物的各組分的設(shè)備或裝置。所述設(shè)備一般包括具有至少兩個室的容器，其中一個室裝有能在血漿中聚集的顆粒，另一個室裝有鈣離子的溶液。所述室的結(jié)構(gòu)使得在這兩個室中的內(nèi)容物不能在進(jìn)行校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)之前混合。所述室可以通過一個或多個可移動的或易碎的隔斷(barrier)來限定，所述隔斷可以移動或破裂以使室的內(nèi)容物在使用之前混合。所述顆粒可以含有在其表面上具有帶電荷基團(tuán)的聚合物珠粒的溶液。鈣離子溶液可以包括氯化鈣溶液，并可以包含光學(xué)對比增強(qiáng)劑例如一種或多種染料和血紅蛋白作為珠粒聚集增強(qiáng)劑。所述容器可以含有額外的室，其裝有能與其它兩室的內(nèi)容物混合的血漿。
本發(fā)明的試劑盒可以含有一種對照組合物，其包括鈣離子的容器、能在血漿中聚集的顆粒的容器、和校準(zhǔn)血漿的容器。所述試劑盒可以進(jìn)一步包括一種或多種凝結(jié)實(shí)驗(yàn)設(shè)備例如PT試條。所述試劑盒可以另外包括用于檢測凝結(jié)實(shí)驗(yàn)設(shè)備的凝結(jié)時間的讀數(shù)計(jì)。所述試劑盒還可以包括印刷的說明書，關(guān)于將對照組合物與校準(zhǔn)血漿混合，將對照組合物和血漿施用到凝結(jié)實(shí)驗(yàn)設(shè)備上，和檢測凝結(jié)時間。鈣離子、血液血漿和/或能在血漿中聚集的顆粒的容器可以在單個容器中的各室中實(shí)現(xiàn)。
附圖簡述將通過參考以下附圖而更全面地理解本發(fā)明，這些附圖僅僅用于說明目的。


圖1是根據(jù)本發(fā)明的一個對照組合物設(shè)備的實(shí)施方案的示意圖。
圖2是根據(jù)本發(fā)明的對照組合物設(shè)備的另一個實(shí)施方案的示意圖。
發(fā)明詳述在進(jìn)一步描述本發(fā)明之前，應(yīng)該理解的是本發(fā)明不限于下述的本發(fā)明的特定實(shí)施方案，因?yàn)樵谒綑?quán)利要求的范圍內(nèi)可以改變特定實(shí)施方案。還應(yīng)該理解的是所用的術(shù)語是用于描述特定的實(shí)施方案，而不是要限制本發(fā)明。而本發(fā)明的范圍將由所附的權(quán)利要求確定。
這里描述了用于校準(zhǔn)凝結(jié)實(shí)驗(yàn)的組合物、方法、設(shè)備和試劑盒。本發(fā)明使用能在血漿中聚集的顆粒的懸浮液和鈣離子的溶液以形成一種基質(zhì)(matrix)，當(dāng)該基質(zhì)與血漿組合時，提供一種對照組合物，它在被施用或引入到凝結(jié)實(shí)驗(yàn)體系例如試條中時能模擬全血的作用。所述對照組合物的組合顆粒、鈣離子溶液和血漿當(dāng)用于凝結(jié)實(shí)驗(yàn)中時模擬相應(yīng)的全血的凝結(jié)行為，其中從該全血得到對照組合物的血漿。所述對照組合物因此提供對凝結(jié)實(shí)驗(yàn)的快速且容易的校準(zhǔn)，并可以對凝結(jié)實(shí)驗(yàn)的商業(yè)組進(jìn)行質(zhì)量控制。
本發(fā)明主要使用PT實(shí)驗(yàn)描述，特別是光學(xué)可讀數(shù)的PT試條體系。但是，本發(fā)明可以用于對任何類型的血液或血漿凝結(jié)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行校準(zhǔn)和質(zhì)量控制，包括例如但不限于部分促凝血酶原激酶時間(PTT)、活化部分促凝血酶原激酶時間(APTT)、凝血酶凝血時間(TCT)實(shí)驗(yàn)、活化凝血時間(ACT)實(shí)驗(yàn)、血纖維蛋白原分析和其它與血液和血漿有關(guān)的凝結(jié)實(shí)驗(yàn)，可以通過光學(xué)、電子、粘度或其它檢測機(jī)理檢測凝結(jié)。
為了清楚，這里提供定義，但不應(yīng)該理解為起限制作用。這里所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語意欲具有與本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。
本文所用的術(shù)語“平均偏差”及其語法同義詞指試驗(yàn)、實(shí)驗(yàn)、方法或技術(shù)的準(zhǔn)確度?！捌骄睢笔且唤M實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均結(jié)果與另一組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均結(jié)果之間的差異。
本文所用的術(shù)語“變量系數(shù)”或“CV”及其語法同義詞指對檢測精確度定量的統(tǒng)計(jì)值。術(shù)語“％CV”等于(標(biāo)準(zhǔn)偏差/平均值)×100。
本文所用的術(shù)語“凝血酶原時間”或“PT”及其語法同義詞指在對有過量血液凝固(血栓癥)危險的個體的監(jiān)控治療中可以使用的血液凝結(jié)時間的實(shí)驗(yàn)。因?yàn)楫?dāng)用不同的PT檢測系統(tǒng)檢測時，對給定樣品的“PT”將不同，所以“PT”值通過用國際標(biāo)準(zhǔn)化比率(INR)單位表示實(shí)驗(yàn)結(jié)果來標(biāo)準(zhǔn)化。
本文所用的術(shù)語“國際標(biāo)準(zhǔn)化比率”或“INR”及其語法同義詞指從根據(jù)下面的公式從凝血酶原時間PT得到的檢測單位INR＝(PT/MNPT)ISI其中MNPT是平均正常凝血酶原時間，ISI是國際靈敏指數(shù)。INR補(bǔ)償體系與體系之間的變化和在PT檢測中組織促凝血酶原激酶試劑的靈敏度。雖然預(yù)期不同的試劑和儀器系統(tǒng)對于相同樣品會產(chǎn)生不同的PT，但是預(yù)期不同體系的INR值是可比較的。正常的INR范圍是約0.8-約1.2INR單位，治療水平可以在約2.0-約4.5INR單位之間變化，這取決于對患者的血栓危險和所涉及的不同治療方法。
本文所用的術(shù)語“國際靈敏指數(shù)”或“ISI”及其語法同義詞指用于將PT轉(zhuǎn)化為INR單位的因子。ISI對于每個用于PT檢測的體系是唯一的，必須通過相對于參比體系的校準(zhǔn)體系來測定。ISI通過用校準(zhǔn)曲線斜率(正交回歸，其中x＝待校準(zhǔn)的體系的LogPT，y＝參比體系的LogPT)乘以參比體系的ISI來計(jì)算。
本文所用的術(shù)語“平均正常凝血酶原時間”或“MNPT”及其語法同義詞指用于將PT轉(zhuǎn)化為凝血酶原時間比率(PTR)或用ISI因子轉(zhuǎn)化為INR單位的因子。MNPT是幾個(通常大于20個)在PT實(shí)驗(yàn)體系上檢測的正常血漿的凝血時間的幾何平均值。MNPT對于每個凝結(jié)時間實(shí)驗(yàn)體系是唯一的。
本文所用的術(shù)語“校準(zhǔn)編碼”及其語法同義詞指在不同的分析體系中使用的唯一的一個數(shù)或一組數(shù)，以確定對于一組給定的PT實(shí)驗(yàn)試劑例如試條的ISI和MNPT的組合。
本文所用的術(shù)語“血漿”及其語法同義詞指血液的血漿，即在其中懸浮血液細(xì)胞的非細(xì)胞流體。
本文所用的術(shù)語“宿主”、“患者”、“個體”和“主體”及其語法同義詞指任何一個或一組哺乳或非哺乳物種，其可以是可以用于本發(fā)明的血漿的血漿供體，或可以需要抗凝結(jié)治療，或需要凝結(jié)監(jiān)控。
本文所用的術(shù)語“凝結(jié)”及其語法同義詞指將液體或溶膠轉(zhuǎn)化成軟的半固體或固體物質(zhì)。當(dāng)創(chuàng)傷或病理狀況引起血管損傷時，血液自然地凝結(jié)形成隔斷。有兩種公認(rèn)的凝結(jié)途徑外源性或組織促凝血酶原激酶控制的凝結(jié)途徑以及內(nèi)源性或凝血酶原/血纖維蛋白原控制的凝結(jié)途徑。
應(yīng)該注意的是，如在本說明書中和所附權(quán)利要求中所用的單數(shù)形式“一”、“一種”和“這種”包括復(fù)數(shù)，除非另有說明。因此，例如“一種控制混合物”包括一種或多種這種控制混合物，和“凝結(jié)實(shí)驗(yàn)”包括一個或多個凝結(jié)實(shí)驗(yàn)等。
組合物本發(fā)明的對照組合物包括能在血漿中聚集的顆粒和鈣離子，當(dāng)其與血漿組合時，在被施用或引入到凝結(jié)實(shí)驗(yàn)體系例如試條中時能模擬全血的作用。特別是，顆粒和蛋白質(zhì)的聚集以及外源性凝結(jié)途徑的活化以與全血相似的方式進(jìn)行，從而能進(jìn)行凝結(jié)實(shí)驗(yàn)體系的校準(zhǔn)。所述顆粒可以是懸浮液的形式，它們和在溶液中的鈣離子可以在與血漿組合之前分別儲存，并可以在降低的溫度下儲存以便延長儲存期。在本文中，術(shù)語“懸浮液”和“溶液”可以互換使用，因?yàn)樵谠S多情況下，本發(fā)明的組合物可以具有同時存在的溶解和懸浮的組分。
能在血漿中聚集的顆粒包括在顆粒表面上存在的分子或官能團(tuán)，其能促進(jìn)血漿中的蛋白質(zhì)與顆粒的非特定結(jié)合，或在顆粒表面上附著特定的官能團(tuán)，從而能檢測校準(zhǔn)和控制凝結(jié)實(shí)驗(yàn)體系中的顆粒聚集。顆粒尺寸可以例如為直徑約0.01-約1000微米。更特別的是，顆粒的直徑可以為約0.05-約100微米，在一些情況下其直徑將為約0.1-約10微米。在一些情況下，顆?？梢院胁煌叽绲念w粒的混合物。
在用于下述校準(zhǔn)之前，顆?？梢耘c鈣離子溶液分開儲存，其中顆粒以在水中的懸浮液、含水緩沖液或其它液體的形式儲存。當(dāng)顆粒作為懸浮液儲存時，顆?？梢哉紤腋∫旱募s1-約99重量％。在特定的實(shí)施方案中，顆粒在懸浮液中的重量百分率可以占懸浮液的約10-約50重量％。顆粒以懸浮形式的使用允許用微移液管對懸浮液進(jìn)行準(zhǔn)確的取樣。
本發(fā)明的組合物可以含有防凍組分，在其中懸浮顆粒，以便防止顆粒在冷儲存過程中發(fā)生變化。防凍材料可以包括甘油、乙二醇、丙二醇或它們的溶液、混合物或摻混物。在選擇的實(shí)施方案中，上述顆?？梢灾苯討腋≡诜纼鼋M分例如甘油中。
所述顆粒可以含有聚合物珠粒例如聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯酸類或其它已經(jīng)過表面改性而在珠粒表面上引入官能團(tuán)的聚合物材料。不同聚合物材料的各種所述表面官能化聚合物珠粒、珠粒尺寸和官能度是可以從商業(yè)得到的。表面官能化聚合物珠粒的尺寸可以根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案而變化。聚合物珠粒可以例如具有直徑為約0.01-約1000微米，或約0.05-約100微米，和在一些情況下如上所述為約0.1-約10微米。
當(dāng)珠粒暴露于血漿蛋白時，在聚合物珠粒表面上存在的官能團(tuán)誘導(dǎo)或促進(jìn)了珠粒的非特定聚集。官能團(tuán)可以包括帶電荷的官能團(tuán)，其可以包括任何陰離子和/或陽離子性的官能團(tuán)。陰離子官能團(tuán)包括例如羧酸根、磺酸根、酚鹽基團(tuán)和磷酸根。陽離子官能團(tuán)包括例如銨、烷基銨和芳基銨基團(tuán)。陰離子或陽離子官能團(tuán)可以通過表面官能化化學(xué)反應(yīng)被引入到聚合物珠粒上。在聚合物珠粒表面上引入帶電荷官能團(tuán)的過程中涉及的技術(shù)可以與在用于離子交換色譜的陰離子和陽離子珠粒的制備中所用的公知技術(shù)相同或相似，在本發(fā)明組合物中可以使用的各種表面官能化聚合物珠?？梢詮纳虡I(yè)獲得。在下述具體實(shí)施例中，在對照組合物中使用羧酸鹽官能化的聚苯乙烯珠粒。
在顆粒表面上的官能團(tuán)的相對濃度可以變化。在帶電荷官能團(tuán)的情況下，顆?？梢跃哂斜砻娴味ǎ晕?dāng)量/克計(jì)，為約10-約1000，更通常為約50-約500，在特定的實(shí)施方案中為約100-250。在顆粒表面上的帶電荷基團(tuán)的“占據(jù)面積”可以例如為約5-約100、約10-約50，和在特定實(shí)施方案中為約20-約30。
珠粒的聚合物材料可以是離聚性的，使得帶電荷官能團(tuán)是珠粒本身的聚合物材料所固有的。離聚物的例子包括能提供銨官能團(tuán)的聚賴氨酸(polylysine)和能提供羧酸根官能團(tuán)的聚丙烯酸。所以，聚合物珠粒可以含有交聯(lián)的離聚物。
在一些情況下，顆?？梢院蟹蔷酆衔镱w粒，其已經(jīng)進(jìn)行表面改性以引入官能團(tuán)。所以，合適的碳、二氧化硅、粘土或其它材料的官能化顆?？梢杂糜诒景l(fā)明的組合物中?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域公知的表面官能化化學(xué)技術(shù)或通過用離聚物例如多熔素或聚丙烯酸涂覆顆粒而將帶電荷的官能團(tuán)引入這種非聚合物顆粒中。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的顆粒被能促進(jìn)顆粒在血漿中聚集的材料或分子涂覆。在這方面，所述顆?？梢院泄潭ㄔ陬w粒表面上的蛋白質(zhì)，其在血漿的存在下誘導(dǎo)顆粒的聚集。
鈣離子溶液可以包括任何水或含水的可溶性Ca++鹽，包括例如硫酸鈣，鹵化鈣例如氯化鈣、溴化鈣或碘化鈣。Ca++離子在溶液中的濃度可以根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案和所用的具體鈣鹽的溶解度而變化。Ca++離子的濃度可以例如是約0.01-約5.0摩爾，更特別地是約0.05-約2.0摩爾。在具體的實(shí)施方案中，Ca++離子的濃度可以是約0.1-約1.0摩爾。鈣離子溶液通常與所述顆粒分開儲存，在如下所述進(jìn)行本發(fā)明方法之前與其混合。
含有在珠粒表面上具有帶電荷官能團(tuán)的聚合物珠粒的對照組合物與可溶性鈣鹽的溶液一起當(dāng)與檸檬酸鹽化血漿混合時，能提供對常規(guī)全血的凝結(jié)的有效模擬，這可以用于如下所述的校準(zhǔn)凝結(jié)實(shí)驗(yàn)。一些凝結(jié)實(shí)驗(yàn)不能容易地檢測在未著色的對照組合物中的凝結(jié)。因此，在本發(fā)明的用于基于光學(xué)監(jiān)控凝結(jié)來校準(zhǔn)凝結(jié)實(shí)驗(yàn)的實(shí)施方案中，可以加入一種或多種光學(xué)對比增強(qiáng)劑來協(xié)助對凝結(jié)的光學(xué)監(jiān)控。
光學(xué)對比增強(qiáng)劑可以包括可懸浮的或可溶性的彩色物質(zhì)或顏料，可以懸浮或溶解在鈣離子溶液中，懸浮或溶解在具有聚合物珠?；蚱渌w粒的溶液中，或懸浮或溶解的獨(dú)立的液體中。光學(xué)對比增強(qiáng)劑可以另外或者選擇性地含有在鈣離子溶液中存在的可溶性染料，和/或在聚合物珠粒中存在的染料，或溶解在其中已經(jīng)懸浮珠粒的溶液中。染料的顏色可以根據(jù)用于表征在待校準(zhǔn)的凝結(jié)實(shí)驗(yàn)中的凝結(jié)所用的波長而改變。在常規(guī)紅色LED光源的情況下，可以使用能吸收紅色LED輸出的藍(lán)色染料。染料的用量可以根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案和各染料的強(qiáng)度而變化。當(dāng)染料溶于鈣離子溶液中時，染料可以占溶液的例如約0.01-約10重量％。在某些實(shí)施方案中，染料可以占約0.1-約1重量％，在特定的實(shí)施方案中，染料可以占約0.1-0.5重量％。
所述組合物可以進(jìn)一步含有顆粒聚集增強(qiáng)劑，其與顆粒本身無關(guān)，即與顆粒表面沒有關(guān)聯(lián)。血紅蛋白在許多實(shí)施方案中是理想的聚集增強(qiáng)劑，這是因?yàn)檠t蛋白傾向于促進(jìn)珠粒和其它顆粒在血漿中的聚集。特別是，血紅蛋白的粗品制劑提供能幫助顆粒聚集的類脂膜，并提供與血液細(xì)胞相似的細(xì)胞表面電荷，從而促進(jìn)聚集。聚合物珠粒或其它顆粒與血紅蛋白一起模擬“Rouleau效應(yīng)”，使得隨著珠粒的聚集，對照組合物的光學(xué)讀數(shù)在透過率百分比方面增加，在出現(xiàn)凝結(jié)時透過率百分比變平緩。
許多血紅蛋白可從商業(yè)以干燥的或冷凍干燥的紅細(xì)胞形式獲得，并可以用于本發(fā)明。當(dāng)血紅蛋白用作在鈣離子溶液中的聚集增強(qiáng)劑時，血紅蛋白可以占溶液的例如約1-約25重量％，和在特定的實(shí)施方案中，為約5-約15重量％。
本發(fā)明的對照組合物還可以含有各種其它組分或成分以促進(jìn)或提高在血漿中顆粒的聚集。溶解的和/或懸浮的聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)和聚乙二醇(PEG)是可以用于本發(fā)明的聚集增強(qiáng)劑的例子。在本發(fā)明組合物用于校準(zhǔn)其中通過電子方式根據(jù)電極之間樣品的檢測電勢來檢測凝結(jié)時間的凝結(jié)實(shí)驗(yàn)時，可以在組合物中包含一種或多種電解質(zhì)改性劑以促進(jìn)電壓的檢測。這種電解質(zhì)改性劑可以包括例如鈉或既鹽的溶液或其它可溶性電解質(zhì)。
所述對照組合物還可以包括血漿，其可以是人體“校準(zhǔn)血漿”的形式，已經(jīng)從具有已知凝結(jié)能力的常規(guī)血供體的凝結(jié)庫獲得。血漿可以被檸檬酸鹽化以防止凝固。檸檬酸鹽通常以可溶性檸檬酸鹽的形式存在，在血液和血漿收集管中提供，將其從收集管轉(zhuǎn)移到血漿中。檸檬酸鹽用于螯合在血漿中的鈣離子以防止凝固。當(dāng)本發(fā)明的組合物用于非人體主體的凝結(jié)實(shí)驗(yàn)時，血漿可以從相應(yīng)的主體物種的成員獲得。
本發(fā)明的對照組合物在特定的實(shí)施方案中還可以包含一種或多種凝固因子例如組織促凝血酶原激酶、血纖維蛋白原、FVII、FVIIa等，它們可用于活化血漿中的外源性凝結(jié)機(jī)制。但是，通常考慮的是使用本發(fā)明組合物的凝結(jié)實(shí)驗(yàn)將包括凝固因子，從而本發(fā)明組合物中不需要包括凝固因子。
通用方法本發(fā)明方法包括提供一種包含鈣離子和能在血漿中聚集的顆粒的組合物，將所述對照組合物與血漿組合，并將組合的顆粒、鈣離子溶液和血漿引入待校準(zhǔn)的凝結(jié)實(shí)驗(yàn)中。更具體地說，本發(fā)明的方法包括提供能在血漿中聚集的顆粒，提供鈣離子的溶液，將所述顆粒和鈣離子溶液組合，將血漿加入組合的顆粒和鈣離子溶液中以形成一種對照組合物，將所述對照組合物施用或引入到凝結(jié)實(shí)驗(yàn)中，并監(jiān)控所述對照組合物的凝結(jié)。該方法還可以進(jìn)一步包括測定所述對照組合物的凝結(jié)時間與全血的凝結(jié)時間之間的關(guān)系，其中從該全血得到在對照組合物中的血漿。該方法可以另外包括測定由凝結(jié)實(shí)驗(yàn)獲得的對照組合物的凝結(jié)時間與使用參比實(shí)驗(yàn)得到的凝結(jié)時間之間的關(guān)系。該方法還可以進(jìn)一步包括測定校準(zhǔn)曲線或?qū)δY(jié)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行校準(zhǔn)確定。所述方法可以進(jìn)一步包括將所述對照組合物施用到多個凝結(jié)實(shí)驗(yàn)中，監(jiān)控在每個凝結(jié)實(shí)驗(yàn)中對照組合物的凝結(jié)，和評價每個凝結(jié)實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量控制。
提供能在血漿中聚集的顆粒可以包括提供顆粒的懸浮液。所述顆?？梢园ㄔ谄浔砻嫔暇哂袔щ姾傻幕蚱渌囟ü倌軋F(tuán)的聚合物珠粒。所述顆?？梢詰腋≡诜纼鰟├绺视突蛏鲜銎渌后w中。所述顆粒可以被著色或含有一種染料以促進(jìn)血漿凝結(jié)的光學(xué)檢測。顆粒在防凍劑中的懸浮液可以冰凍儲存。聚合物珠?；蚱渌峁┑念w粒的量通常根據(jù)待校準(zhǔn)的校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)的類型而變化。所提供的顆粒懸浮液的量或體積可以是體積為例如約5-約500微升、約10-100微升或約25-50微升的珠粒懸浮液。如此獲得的珠粒懸浮液可以在使用之前儲存在冰箱中。
提供鈣離子溶液可以包括提供任何水或含水的可溶性Ca++鹽的溶液，包括硫酸鈣，或鹵化鈣例如氯化鈣、溴化鈣或碘化鈣，或上述的那些。提供鈣離子溶液可以進(jìn)一步包括在溶液中提供一種或多種光學(xué)對比增強(qiáng)劑和/或顆粒聚集增強(qiáng)劑，例如溶解的染料和/或上述血紅蛋白。鈣離子溶液的量通常根據(jù)待校準(zhǔn)的校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)的類型而變化。鈣離子溶液的量可以是體積為約5-約500微升、約10-100微升或約20-40微升的1.0摩爾原料溶液體積。如此獲得的鈣離子溶液可以在使用之前儲存在冰箱中。
如果在冰箱中儲存，則所述顆粒和鈣離子溶液應(yīng)該在混合之前達(dá)到環(huán)境溫度。溫度調(diào)節(jié)應(yīng)該在如下所述加入血漿或?qū)⒀獫{與分開儲存的顆粒和鈣離子溶液混合之前很短的時間內(nèi)進(jìn)行。組合或混合可以如下進(jìn)行將適宜量的顆粒懸浮液和鈣離子溶液用移液管轉(zhuǎn)移到普通的容器中，然后旋轉(zhuǎn)、搖動或攪拌該容器以進(jìn)行混合。顆粒和鈣離子溶液的儲存及其后續(xù)的混合還可以用雙室容器設(shè)備進(jìn)行，如在下面所述。
接著，將血漿加入組合的顆粒和鈣離子溶液中以形成對照組合物。血漿可以含有檸檬酸鹽化校準(zhǔn)血漿，得自血液供體庫，例如根據(jù)WHO程序，20個正常人和60個抗凝結(jié)患者。血漿還可以含有檸檬酸鹽化人體校準(zhǔn)或控制血漿，例如可從Precision Biologics Inc.DadeBehring，Instrumentation Laboratory，Pacific Hemostasis，Inc.Haematologic Technologies，Inc.，Bio Rad Inc.或其它商業(yè)來源獲得的那些。向組合的顆粒和鈣離子加入血漿的量可以是例如體積為約5-約500微升，或在特定實(shí)施方案中體積為約10-約250微升，或在一些實(shí)施方案中體積為約50-約200微升?？梢允寡獫{在加入組合的顆粒和鈣離子溶液之前達(dá)到室溫或環(huán)境溫度。
在顆粒和鈣離子溶液的混合與將血漿隨后加入其中之間的時間可以為約10秒至約1小時，在某些實(shí)施方案中可以為約30秒至約30分鐘，或約1-約10分鐘。
在將血漿加入顆粒和鈣離子溶液以形成對照組合物之后，將所述對照組合物引入或施用到待校準(zhǔn)的凝結(jié)實(shí)驗(yàn)中，凝結(jié)實(shí)驗(yàn)包括凝結(jié)或凝固因子例如組織促凝血酶原激酶、血纖維蛋白原、FVII、FVIIa等，它們能活化在對照組合物中存在的血漿中的外源性凝結(jié)機(jī)制，將其暴露于對照組合物。凝結(jié)實(shí)驗(yàn)可以包括凝血酶原時間(PT)實(shí)驗(yàn)、部分組織促凝血酶原激酶時間(PTT)、活化部分組織促凝血酶原激酶時間(APTT)、凝血酶凝血時間(TCT)、活化凝血時間(ACT)、血纖維蛋白原分析，或其它與上述血液和/或血漿有關(guān)的凝結(jié)實(shí)驗(yàn)。凝結(jié)實(shí)驗(yàn)可以設(shè)計(jì)通過光學(xué)、電子、粘度或通過其它技術(shù)檢測凝結(jié)?？梢允褂帽景l(fā)明組合物和方法的例示的凝結(jié)實(shí)驗(yàn)體系包括在美國專利3620676、3640267、4088448、4426451、4849340、4868129、5110727、5230566、5472603、5522255、5526111、5700695、5710622、5736404、5789664、6084660、6046051、6060323和6066504，以及歐洲專利申請EP 0 803 288和EP 0 974 840所述的那些，將其公開內(nèi)容引入本文作為參考。
將對照組合物引入凝結(jié)實(shí)驗(yàn)可以通常以與用于將全血樣品或血漿樣品引入凝結(jié)實(shí)驗(yàn)相同的方式進(jìn)行。在光學(xué)可讀數(shù)的凝結(jié)試條的情況下，例如對照組合物的樣品可以通過抽吸或毛細(xì)管作用被吸收入試條的這一位置，在該位置使對照組合物暴露于凝固因子，且在該位置放置一個或多個傳感器以便從光學(xué)上檢測對照組合物在試條中的凝結(jié)。光學(xué)檢測可以通過檢測光學(xué)反射、吸收、透過或其它與試條相關(guān)的效應(yīng)以常規(guī)方式進(jìn)行。
在將血漿加入顆粒和鈣離子溶液之后很短的時間內(nèi)將對照組合物引入凝結(jié)實(shí)驗(yàn)，因?yàn)殁}離子溶液和在顆粒上的帶電荷的官能團(tuán)能在血漿與顆粒和鈣離子溶液接觸時有效地誘導(dǎo)在血漿中珠粒的聚集。因此，在將血漿加入組合的顆粒和鈣離子溶液之后可以在約1秒至約20分鐘的時間內(nèi)將對照組合物引入凝結(jié)實(shí)驗(yàn)，或在特定的實(shí)施方案中，在約5秒至約10分鐘內(nèi)。
在將對照組合物引入凝結(jié)實(shí)驗(yàn)后，監(jiān)控檸檬酸鹽化血漿的凝結(jié)。該監(jiān)控通過光學(xué)、電子、粘度或其它技術(shù)進(jìn)行。如上所述，在組合物內(nèi)的顆粒和光學(xué)對比增強(qiáng)劑的聚集可以從光學(xué)上檢測。在特定的實(shí)施方案中，顆粒與作為聚集增強(qiáng)劑的粗血紅蛋白一起，模擬“Rouleau效應(yīng)”，從而可以光學(xué)方式檢測顆粒和血紅蛋白的聚集。
從凝結(jié)的監(jiān)控，凝結(jié)實(shí)驗(yàn)可以被校準(zhǔn)，凝結(jié)實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量或性能可以被確認(rèn)或控制。通過不同凝結(jié)實(shí)驗(yàn)測得的凝結(jié)時間由于不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)構(gòu)而不同，相同凝結(jié)實(shí)驗(yàn)的不同商業(yè)組可以由于在凝結(jié)實(shí)驗(yàn)中所用的不同的凝結(jié)因子樣品而不同。在同類PT實(shí)驗(yàn)中所用的不同組織促凝血酶原激酶樣品的可變性例如可以導(dǎo)致在未正確校準(zhǔn)PT實(shí)驗(yàn)時不正確的抗凝結(jié)劑量。
PT實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的WHO國際體系使用國際標(biāo)準(zhǔn)化比率(INR)和國際靈敏度因子(ISI)來校準(zhǔn)PT實(shí)驗(yàn)。ISI值包括相對于參考組織促凝血酶原激酶制劑例如WHO國際參考制劑(IRP)或具有已知性能的商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)物例如RECOMBIPLASTIN，校準(zhǔn)特定的“局部”組織促凝血酶原激酶萃取物。檢測ISI值和校準(zhǔn)PT實(shí)驗(yàn)的方法是本領(lǐng)域公知的，描述于L.Poller的“The Prothrombin Time”，WHO，1998，將其公開內(nèi)容引入本文作為參考。簡單地說，當(dāng)從供體庫(通常20個正常人和60個接受抗凝結(jié)劑治療的患者)用局部組織促凝血酶原激酶進(jìn)行PT檢測時得到的正交回歸線的斜率相對于用組織促凝血酶原激酶標(biāo)準(zhǔn)物得到的PT，以雙對數(shù)方式繪圖，提供PT實(shí)驗(yàn)的響應(yīng)的測量手段。局部組織促凝血酶原激酶的正交回歸校準(zhǔn)斜率參數(shù)b1與已被校準(zhǔn)的參比組織促凝血酶原激酶，用于根據(jù)下面的關(guān)系式計(jì)算ISIISI局部＝(b1×ISI參比)正交回歸線參數(shù)b1得自關(guān)系式y(tǒng)＝a1+b1x，其中a1和b1分別是正交回歸線的截距和斜率。a1值如下所示，a1＝y(tǒng)-b1x其中x和y是x和y的算術(shù)平均值。b1值如下所示，b1=m+n2-1]]>其中n是PT的數(shù)目，m=Σ(x-x‾)2-Σ(y-y‾)22Σ(x-x‾)(y-y‾)=12r[sysx-sxsy]]]>sx和sy是x和y值的標(biāo)準(zhǔn)偏差，r是相關(guān)系數(shù)。
考慮到在各PT實(shí)驗(yàn)中存在的偏差，PT值通過用國際標(biāo)準(zhǔn)化比率(INR)單位表示實(shí)驗(yàn)結(jié)果來標(biāo)準(zhǔn)化。INR是根據(jù)下面的方程檢測凝血酶原時間PT得到的檢測單位INR＝(PT/MNPT)ISI其中MNPT是如上所述的平均正常凝血酶原時間，ISI是如上所述的國際靈敏度指數(shù)。平均正常凝血酶原時間或MNPT是用ISI因子將PT轉(zhuǎn)化成INR單位的因子。MNPT是幾個(通常大于20個)在PT實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)上檢測的正常血漿的凝血時間的幾何平均值。對于每個PT實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，MNPT是唯一的。
本發(fā)明組合物的顆粒和鈣離子溶液與儲存的來自供體的血漿組合，以模擬在PT實(shí)驗(yàn)中的供體全血。供體血漿樣品和商業(yè)校準(zhǔn)血漿可以長期冷凍儲存，所以本發(fā)明的對照組合物當(dāng)用這種血漿制備能消除由于在每次PT實(shí)驗(yàn)的不同商業(yè)組必須校準(zhǔn)時獲取多個全血樣品所帶來的費(fèi)用和不便。代替的方法是使冷凍的血漿樣品融化，并與顆粒和鈣離子溶液混合以提供能每次在需要實(shí)驗(yàn)校準(zhǔn)時模擬全血的對照組合物。
當(dāng)本發(fā)明的對照組合物模擬在PT實(shí)驗(yàn)中的全血的作用時，由對照組合物產(chǎn)生的PT可以與向組合物供應(yīng)血漿的相應(yīng)全血不同。所以，本發(fā)明的方法包括測定對照組合物和與用于對照組合物中的血漿相應(yīng)或相關(guān)的全血之間的關(guān)系。該檢測包括測定該組合物的ISI，其可以通過相對于從向組合物中提供血漿的相應(yīng)全血得到的PT檢測結(jié)果，以雙對數(shù)形式繪制對照組合物的PT檢測結(jié)果的正交回歸線獲得。當(dāng)正交回歸線的斜率是a1時，采用關(guān)系式ISIWB＝(1/a1)×ISIC)其中ISIC是對照組合物的ISI，ISIWB是對應(yīng)于對照組合物中的血漿的全血的ISI。如下面的具體實(shí)施例所示，對于一個實(shí)施方案的組合物的a1約為0.81。
一旦測定對照組合物和相應(yīng)的全血之間的關(guān)系后，就可以檢測由PT實(shí)驗(yàn)得到的對照組合物的PT與由參比實(shí)驗(yàn)得到的對照組合物的PT之間的關(guān)系。用于檢測生產(chǎn)者的PT實(shí)驗(yàn)的“批次之間”的WHO程序建議用正交回歸分析從全血樣品的PT相對于從相應(yīng)的新鮮血漿得到的PT進(jìn)行全面校準(zhǔn)。WHO程序也允許用確認(rèn)的校準(zhǔn)血漿進(jìn)行校準(zhǔn)。
設(shè)計(jì)用于方便患者家庭應(yīng)用的PT實(shí)驗(yàn)通?；谠嚄l，向其上施用從刺手指得到的新鮮全血，通過讀數(shù)計(jì)以光學(xué)方式監(jiān)控PT。用僅僅用于這種實(shí)驗(yàn)的“批次之間”校準(zhǔn)的血漿進(jìn)行準(zhǔn)確檢測PT很難，這是因?yàn)樵谘獫{中缺乏光學(xué)可檢測的紅血細(xì)胞。但是，本發(fā)明的對照組合物模擬在光學(xué)可讀數(shù)的PT實(shí)驗(yàn)中的全血行為，這是由于在對照組合物中表面帶電荷的顆粒的聚集可以從光學(xué)檢測。通過光學(xué)對比增強(qiáng)劑，例如在顆粒本身中存在的顏料、粗血紅蛋白溶胞產(chǎn)物的存在或上述光學(xué)可檢測的粒狀顏料，在凝結(jié)期間由對照組合物提供的光學(xué)對比可以改進(jìn)或設(shè)計(jì)成所需的性能。
在從PT實(shí)驗(yàn)得到的對照組合物的PT與參比實(shí)驗(yàn)的PT之間的檢測關(guān)系可以從對照組合物的PT檢測值的正交回歸線得到，其通過以雙對數(shù)形式將檢測結(jié)果相對于用參比組織促凝血酶原激酶的參比實(shí)驗(yàn)測定的PT檢測結(jié)果得到。參比實(shí)驗(yàn)可以例如包括MLA Electra 1400C凝結(jié)分析儀或其它參比實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。參比組織促凝血酶原激酶可以包括RECOMBIPLASTIN。
在所述實(shí)驗(yàn)檢測的對照組合物的PT檢測值相對于由參比體系測定的PT檢測值得到的正交回歸線的斜率提供了校準(zhǔn)線或曲線，從其可以確定校準(zhǔn)編碼，并歸屬于所述實(shí)驗(yàn)。校準(zhǔn)編碼要求ISI和MNPT值。從上述校準(zhǔn)線的斜率確定ISIC，從WHO程序的20個正常個體測定MNPT值，作為在所述PT檢測系統(tǒng)上檢測的PT時間的幾何平均值。
設(shè)備本發(fā)明還提供用于校準(zhǔn)凝結(jié)實(shí)驗(yàn)體系的設(shè)備。參考圖1，顯示了凝結(jié)實(shí)驗(yàn)的校準(zhǔn)和對照設(shè)備10，包括容器12，其具有至少兩個室14和16。容器12的結(jié)構(gòu)可以是常規(guī)Eppendorf管的形式，或者其結(jié)構(gòu)便于旋轉(zhuǎn)、用移液管將試劑或成分轉(zhuǎn)移入和轉(zhuǎn)移出容器，和/或使用多井形式的容器或?qū)τ谏飿悠啡萜鞒Ｒ姷捏w系。隔斷18可以移動，而不是易碎的。在容器12中可以包括額外的易碎或可移動的隔斷20，作為室14和16的蓋子。
能在血漿中聚集的顆粒儲存在室14和16之一中，而鈣離子溶液儲存在另一室中。顆?？梢园ū砻婀倌芑木酆衔镏榱＃梢匀缟纤鲈趹腋∫褐?。鈣離子溶液可以包含血紅蛋白、溶解的染料和/或其它光學(xué)對比或聚集增強(qiáng)劑。在其中裝有顆粒和鈣離子溶液的容器12可以在使用之前儲存在冰箱內(nèi)。然后用移液管將適宜量的血漿轉(zhuǎn)移到容器12內(nèi)的顆粒和鈣離子溶液中，并與其混合。然后將組合的顆粒、鈣離子溶液和血漿以上述方式引入到凝結(jié)實(shí)驗(yàn)體系中。當(dāng)隔斷18和20是易碎的時，它們被一次性移液管尖端或其它儀器破碎，使得室14和16的內(nèi)容物在容器12內(nèi)一起組合或混合。
在一些實(shí)施方案中，容器12可以包括被可移動的或易碎的隔斷分開的三個室，其中第三個室設(shè)計(jì)成含有血漿。在使用過程中，隔斷破裂或被移動以使顆粒、鈣離子溶液和血漿組合。容器12可以以許多方式設(shè)計(jì)。在一些實(shí)施方案中，容器12可以含有易碎的中空珠粒，在其中儲存校準(zhǔn)組合物的顆粒和鈣離子溶液。
參考圖2，顯示另一個凝結(jié)實(shí)驗(yàn)校準(zhǔn)和對照設(shè)備22的實(shí)施方案，其包括容器24和多個中空的易碎珠?；虬碴?6、28、30。能在血漿中聚集的顆粒、鈣離子溶液和血漿在安瓿26、28、30內(nèi)分開儲存。打碎易碎的珠粒使得顆粒、鈣離子溶液和血漿混合以提供對照組合物。容器24和珠粒26、28、30可以在使用之前如上所述冷凍儲存。
試劑盒還提供用于實(shí)施本發(fā)明方法的試劑盒。本發(fā)明的試劑盒包括一種含有能在血漿中聚集的顆粒的容器，和鈣離子的容器。所述容器可以是在上述單個容器中的不同的室或易碎珠粒的形式。試劑盒可以進(jìn)一步包括一個或多個含校準(zhǔn)血漿的容器。試劑盒可以另外或者選擇性地包括一個或多個凝結(jié)實(shí)驗(yàn)設(shè)備例如PT試條。所述試劑盒可以包括用于獲得血樣的設(shè)備，例如用于刺手指的小刀、小刀調(diào)節(jié)器等。在某些實(shí)施方案中，試劑盒還包括自動化裝置，例如用于在將校準(zhǔn)組合物引入凝結(jié)實(shí)驗(yàn)后在凝結(jié)實(shí)驗(yàn)中監(jiān)控凝結(jié)的光學(xué)讀數(shù)計(jì)。所述試劑盒還可以另外包括關(guān)于進(jìn)行上述校準(zhǔn)凝結(jié)實(shí)驗(yàn)的方法的說明書。這些說明書可以在包裝、標(biāo)簽插入物、試劑盒內(nèi)的容器等上。
應(yīng)用本發(fā)明的校準(zhǔn)組合物、方法、設(shè)備和試劑盒可以用于校準(zhǔn)各種用于監(jiān)控正在接受抗凝結(jié)治療的患者的凝結(jié)實(shí)驗(yàn)，用于篩選或診斷各種患者或主體的病癥。這些病癥包括例如獲得性血小板機(jī)能缺陷、先天性血小板機(jī)能缺陷、先天性蛋白質(zhì)C或S缺乏、深層大腦內(nèi)出血；DIC(彌散性血管內(nèi)凝血)、第II因子缺陷、第V因子缺陷、第VII因子缺陷、第X因子缺陷、溶血性尿毒性綜合征(HUS)、流感A、流感B、出血性中風(fēng)、肝性腦病、肝腎綜合征、高血壓大腦內(nèi)出血、特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)；大腦內(nèi)出血、頁腦內(nèi)出血、胎盤早剝；短暫性缺血發(fā)作(TIA)，Wilson病等。
實(shí)施例提供以下實(shí)施例，從而為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員提供完整的關(guān)于怎樣制備和使用本發(fā)明的公開和描述，但不用于限制本發(fā)明的范圍，也不表示以下是發(fā)明人進(jìn)行的所有或僅僅這些實(shí)施例。已經(jīng)努力保證所有數(shù)字的準(zhǔn)確性，但是應(yīng)該考慮一些實(shí)驗(yàn)誤差和偏差。除非另有說明，份數(shù)是重量份，分子量是重均分子量，溫度由攝氏度表示，壓力是大氣壓或接近大氣壓。
實(shí)施例1對照組合物的制備除非另有說明，所有試劑和組分都從商業(yè)來源獲得。RSP 9652型Cavro分散器用于微量移液。
a.顆粒懸浮液將甘油(0.947克，Aldrich/Sigma Cat.No.G7893)轉(zhuǎn)移到30毫升小瓶(vial)中，并將25.71克Bangs羧基官能化聚苯乙烯珠粒(Bangs Cat.No.DC02B，深藍(lán)色P，S/V-COOH，0.19uM平均直徑)加入管形瓶內(nèi)的甘油中。組合的甘油和Bangs珠粒在小瓶中旋轉(zhuǎn)，形成深藍(lán)色的珠粒懸浮液，將該懸浮液在室溫下儲存。
b.著色的氯化鈣溶液將血紅蛋白(3.3克，Aldrich/Sigma Cat.No.H-3760，干燥的牛紅細(xì)胞)轉(zhuǎn)移到50毫升的瓶中，向其中加入30.0毫升蒸餾水，形成血紅蛋白原料溶液。組合的血紅蛋白和水通過搖動10分鐘來混合，從而完全溶解或分散血紅蛋白。在混合后，將裝有血紅蛋白原料溶液的瓶放在冰上。
將FD&C藍(lán)色染料粉末(0.500克，Warner Jenkinson Cat.No.05601)加入單獨(dú)的15毫升瓶中，與10.0毫升蒸餾水一起形成染料原料溶液。將瓶封蓋，并搖動10分鐘，使染料溶解在水中，然后將瓶在室溫下儲存。
在分開的15毫升瓶中，將7.650毫升的1.0M CaCl2溶液(BDH Cat.No.190464K)與2.350毫升蒸餾水混合，形成CaCl2原料溶液。然后在室溫下儲存該氯化鈣溶液。
用移液管從血紅蛋白原料溶液中除去泡沫，將27.34毫升血紅蛋白原料溶液轉(zhuǎn)移到60毫升瓶中，然后加入3.66毫升CaCl2原料溶液。組合的溶液進(jìn)行混合，將2.00毫升FD&C染料原料溶液加入瓶中，并在其中混合。然后在冰上儲存這種著色的氯化鈣溶液。
c.將顆粒懸浮液和著色的氯化鈣溶液與血漿組合向每個Eppendorf管中轉(zhuǎn)移37.0微升的顆粒懸浮液和25.0微升的著色的氯化鈣溶液，在加入血漿之前使管達(dá)到室溫。然后向每個管中加入200微升的相應(yīng)的血漿樣品(參見下面的實(shí)施例)，并將組合的顆粒懸浮液、氯化鈣溶液和血漿旋轉(zhuǎn)約3-10秒。在約30秒的混合期間，將組合的顆粒懸浮液、氯化鈣溶液和血漿涂在試條上(如下面的實(shí)施例2所述)。
實(shí)施例2對照組合物的ISI測定在該實(shí)施例中，測定對照組合物和從分離用于對照組合物的血漿得到的相應(yīng)全血樣品之間的關(guān)系。在該實(shí)施例中描述的PT試條和光學(xué)讀數(shù)計(jì)或讀數(shù)儀描述在歐洲專利申請EP 0 974840中，將其公開內(nèi)容引入本文作為參考。簡單地說，每個試條如下制備先使夾在兩個釋放襯底之間的雙面膠帶(Scapa Tapes.Cat.No.RX 675SLT，WindsorCT)通入層合和旋轉(zhuǎn)的沖切轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中。以歐洲專利申請EP 0 974840的圖10中所示的方式(除了制動連接件)從頂部釋放襯底和膠帶切下，但不切到底部釋放襯底。經(jīng)過親水處理的聚酯膜(3M Cat.No.3M9962，St.Paul，MN)層合到暴露的膠帶底邊上。通過鼓泡噴墨打印機(jī)用HP 51612A打印頭(Hewlett-Packard，Corvallis OR)將組織促凝血酶原激酶(Ortho Clinical Diagnostics，Raritan NJ)印到聚酯膜的試劑區(qū)域上。在未處理的聚酯膜中切下樣品部分(AdhesiveResearch Cat.No.AR1235，Glen Rock PA)，然后將其層合到雙面膠帶的頂部(在從上取下釋放層之后)，形成三層的夾心結(jié)構(gòu)。然后將頂部連接件通過沖切過夾心結(jié)構(gòu)的所有三層，并將一條單面膠帶(3MCat.No.MSX4841，St.Paul MN)涂在聚酯層的外側(cè)，從而密封制動連接件。這種試條可在商業(yè)上從Lifescan Inc.，Milpitas CA以HARMONYTM試條獲得，以及相應(yīng)的用于該試條的光學(xué)讀數(shù)計(jì)。
臨床位置的非靜脈血液樣品和對20個正常人和60個接受抗凝結(jié)劑治療的患者的相應(yīng)的新鮮的檸檬酸鹽化血漿樣品根據(jù)WHO程序(L.Poller，“The Prothrombin Time”，WHO 1998)獲得。含有在實(shí)施例1中如上所述制備的聚合物珠粒懸浮液和氯化鈣溶液的冷凍管被加熱到環(huán)境溫度，將200微升的每個血漿樣品移液到相應(yīng)的管中，并旋轉(zhuǎn)30秒，以制備20-25微升的對應(yīng)于每個血漿樣品的對照組合物。將每個樣品的組合的血漿、珠粒和氯化鈣溶液在旋轉(zhuǎn)后30秒內(nèi)涂在試條上，測定在試條上的每個樣品的PT時間。將相應(yīng)的全血樣品涂在試條上，并測定其PT。該過程對13個不同的樣品位置對11組不同的試條重復(fù)進(jìn)行。
對于每組試條，由全血樣品得到的PT的Log值相對于由對照組合物樣品得到的PT的Log值繪圖，根據(jù)下面的方程，用正交回歸分析測定對照組合物的ISI值ISIWB=(1/a1)×ISIC)其中ISIC是對照組合物的ISI，ISIWB是與對照組合物中的血漿對應(yīng)的全血的ISI。ISIWB和ISIC的值如表1所示。對照組合物的a1平均值是約0.8097，并在下面的實(shí)施例中用作ISIC的校正因子。
實(shí)施例3使用對照組合物和20/60檸檬酸鹽化血漿樣品確定PT試條的ISI該實(shí)施例測定對照組合物的PT值和用于校準(zhǔn)PT試條的參考組織促凝血酶原激酶的PT值之間的關(guān)系。使用Hemoliance MLA Electra1400C凝結(jié)分析儀，用Ortho RECOMBIPLASTIN作為參考物。在實(shí)施例2中描述的三個孔道試條使用對照組合物。
從實(shí)施例2的20個正常人和60個接受抗凝結(jié)劑治療的患者得到的臨床位置的檸檬酸鹽化血漿樣品在使用之前于-80℃儲存。使如實(shí)施例1所述制備的血漿樣品和含聚合物珠粒懸浮液和氯化鈣溶液的冷凍管加熱到環(huán)境溫度。將200微升的每個血漿樣品移液到相應(yīng)的管中，并旋轉(zhuǎn)3-10秒，以制備262微升的對應(yīng)于每個血漿樣品的對照組合物。將每個樣品的組合的血漿、珠粒和氯化鈣溶液在旋轉(zhuǎn)后30秒內(nèi)涂在試條上，測定在試條上的每個樣品的PT時間。
Ortho RECOMBIPLASTIN標(biāo)準(zhǔn)物的80個樣品的PT用HemolianceMLA Electra 1400C凝結(jié)分析儀檢測。由Ortho RECOMBIPLASTIN得到的PT的對數(shù)值相對于由從這80個樣品制得的對照組合物得到的PT的對數(shù)值繪圖，得到具有斜率ISIC的校準(zhǔn)線。由RECOMBIPLASTIN得到的PT的對數(shù)值相對于由毛細(xì)管血液樣品得到的PT的對數(shù)值繪圖，得到具有斜率ISIWB的線。由對照組合物樣品得到的PT的對數(shù)值還相對于由毛細(xì)管血液樣品得到的PT的對數(shù)值繪圖，得到具有斜率a1的線。該過程對實(shí)施例2中所用的相同的11組試條重復(fù)進(jìn)行。每組試條的斜率a1的均一性，以及ISIWB、ISIC、ISIC/a1，以及對于每組試條ISIWB和ISIC/a1之間的百分比差異如表1所示。從表1可見，對照組合物提供了對用于評價試條的相應(yīng)全血樣的很好的近似。
表1

從表1得到的a1的平均值是0.8097(約0.81)，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.03，CV為3.3％。
實(shí)施例3使用對照組合物和血漿標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)劑確定PT試條的ISI該實(shí)施例重復(fù)測定PT試條與參考組織促凝血酶原激酶之間的關(guān)系，只是使用商業(yè)校準(zhǔn)血漿代替從20個正常供體和60個接受抗凝結(jié)劑治療的供體得到的血漿。使用七個Precision Biologics INR校準(zhǔn)血漿(Control Normal和Control Abnormal I-Control AbnormalVI)，樣品對照組合物通過以上述方式將血漿樣品與組合的顆粒懸浮液和著色的氯化鈣溶液混合來制備。由RECOMBIPLASTIN得到的PT的對數(shù)值相對于由從Precision Biologics校準(zhǔn)血漿制得的對照組合物樣品得到的PT的對數(shù)值繪圖，得到具有斜率ISIC的校準(zhǔn)線。使用80個供體的血漿由RECOMBIPLASTIN得到的PT的對數(shù)值相對于由相同的毛細(xì)管血液樣品(20個正常，80個不正常)得到的PT的對數(shù)值繪圖，得到具有斜率ISIWB的線。由對照組合物樣品得到的PT的對數(shù)值還相對于由毛細(xì)管血液樣品得到的PT的對數(shù)值繪圖，得到具有斜率a1的線。該過程對如上述實(shí)施例2制備的試條的10個不同批次或組中的9個三孔道試條中的每個重復(fù)進(jìn)行。每組試條的ISIWB、ISIC、ISIC/a1，以及ISIWB和ISIC/a1之間的百分比差異如表2所示。由商業(yè)校準(zhǔn)血漿制得的對照組合物提供了對用于評價試條的相應(yīng)校準(zhǔn)血漿標(biāo)準(zhǔn)物的很好的近似。
表2

實(shí)施例4確定PT試條的校準(zhǔn)編碼用實(shí)施例2的三孔道(channel)試條測定的全血的PT幾何平均值用作全血MNPT值。使用在實(shí)施例3和4中得到的ISIC值，計(jì)算試條各組的校準(zhǔn)編碼。從WHO全血測定的校準(zhǔn)編碼(Cal CodeWB)和從對照組合物測定的校準(zhǔn)編碼(Cal CodeC)分別如表3和4所示。
表3

表4

使用實(shí)施例2的20/60檸檬酸鹽化血漿樣品和實(shí)施例3的Precision Biologics校準(zhǔn)血漿，在由對照組合物估計(jì)的ISI值與WHO全血校準(zhǔn)之間的平均偏差小于8％。在各組試條和臨床外校準(zhǔn)中，對照組合物和其相應(yīng)的血液之間的關(guān)系a1保持相對恒定。由用20/60檸檬酸鹽化血漿樣品或Precision Biologics校準(zhǔn)劑的對照組合物產(chǎn)生的校準(zhǔn)編碼在±2校準(zhǔn)編碼范圍內(nèi)。所以，本發(fā)明的對照組合物提供了有效確定PT試條的ISI和校準(zhǔn)編碼的方式。
實(shí)施例5對照組合物用于試條定性對照的用途體外診斷設(shè)備的標(biāo)準(zhǔn)評價要求對有限的終端使用者進(jìn)行精確的檢測。在該實(shí)施例中，用于實(shí)施例1的三孔道試條的總的精確性能根據(jù)NCCLS(National Committee for Clinical lab Standards)文件EP5-1第19卷No.2(“Evaluation of Precision Performance ofClinical Chemistry Devices；Approved Guideline”)的程序測定，將其公開內(nèi)容引入本文作為參考。NCCLS建議在進(jìn)行最少20個操作日的精確度評價實(shí)驗(yàn)。在兩個獨(dú)立的研究地點(diǎn)對兩組不同的試條進(jìn)行評價，即在San Francisco的加利福尼亞大學(xué)，Department ofHematology/Oncology and Antigcoagulation clinic(UCSF)；和Oregon Health Sciences University Antigcoagulation clinic(OHSU)(Portland，OR)。
由Precision Biologics得到兩個水平的檸檬酸鹽化血漿，以進(jìn)行檢測。水平“1”對比，INR為約1.0，水平“2”對比，INR為約2.8，它們用于評價精確度。血漿樣品冷凍儲存。在使用之前，將一份各個控制血漿按照程序融化，每份按照實(shí)施例1所述方式在涂到試條上之前與顆粒懸浮液和氯化鈣溶液組合。在該實(shí)施例中使用實(shí)施例2所述的三孔道試條。
在每個研究地點(diǎn)，在同一天評價20個試條，提供“實(shí)驗(yàn)內(nèi)”精確度實(shí)驗(yàn)。“實(shí)驗(yàn)內(nèi)”精確度實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如表5所示。
表5UCSF“實(shí)驗(yàn)內(nèi)”精確度 OHSU“實(shí)驗(yàn)內(nèi)”精確度

“日間”精確度也在兩個研究地點(diǎn)用80個試條/對比水平在20天內(nèi)在每個研究地點(diǎn)檢測。日間精確度的評價結(jié)果如表6所示。
表6UCSF 日間精確度 OHSU 日間精確度

從表5和表6可見，在每個研究地點(diǎn)，使用實(shí)驗(yàn)內(nèi)精確度實(shí)驗(yàn)的對照組合物的％CV(偏差系數(shù))是5％或更小。在每個研究地點(diǎn)，對照組合物的日間精確度實(shí)驗(yàn)的％CV小于10％。
雖然已參考具體的實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以進(jìn)行改變和替代等同物。此外，可以進(jìn)行許多改進(jìn)使特定的條件、材料、物質(zhì)的組成、工藝、工藝步驟適應(yīng)本發(fā)明的目的、精神和范圍。所有這些改進(jìn)在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種對照組合物，包含(a)能在血漿中聚集的顆粒；和(b)鈣離子。
2.權(quán)利要求1的對照組合物，進(jìn)一步包含至少一種光學(xué)對比增強(qiáng)劑。
3.權(quán)利要求1或2的對照組合物，進(jìn)一步包含至少一種聚集增強(qiáng)劑。
4.權(quán)利要求1、2或3的對照組合物，其中所述顆粒包括在其表面上具有帶電荷的官能團(tuán)的聚合物珠粒。
5.權(quán)利要求1、2、3或4的對照組合物，其中所述鈣離子源包括鹵化鈣。
6.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的對照組合物，進(jìn)一步包含血漿。
7.一種評價凝結(jié)實(shí)驗(yàn)的方法，包括使用權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的對照組合物。
8.一種凝結(jié)實(shí)驗(yàn)評價設(shè)備，包括具有第一和第二室的容器，其中(a)所述第一室包含能在血漿中聚集的顆粒；和(b)所述第二室包含鈣離子的溶液；其中所述容器的設(shè)計(jì)使得允許所述顆粒和所述鈣離子的溶液在所述容器內(nèi)一起組合。
9.權(quán)利要求8的凝結(jié)實(shí)驗(yàn)評價設(shè)備，其中所述第一室和第二室包括易碎的中空珠粒。
10.用于校準(zhǔn)凝結(jié)實(shí)驗(yàn)的試劑盒，包括(a)能在血漿中聚集的顆粒；(b)鈣離子的溶液；和(c)檸檬酸鹽化血漿的樣品。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于校準(zhǔn)凝結(jié)實(shí)驗(yàn)的對照組合物、方法、設(shè)備和試劑盒。本發(fā)明的對照組合物包括能在血漿中聚集的顆粒和鈣離子，當(dāng)其與血漿混合時，能模擬在凝結(jié)實(shí)驗(yàn)中全血的行為。所述方法包括提供鈣離子和能在血漿中聚集的顆粒，使顆粒和鈣離子與血漿組合以形成一種對照組合物，將所述對照組合物施用到凝結(jié)實(shí)驗(yàn)中。所述設(shè)備包括具有至少兩個室的容器，其中一個室裝有能促進(jìn)或誘導(dǎo)蛋白質(zhì)在血漿中聚集的顆粒，另一個室裝有鈣離子的溶液。所述試劑盒含有一種對照組合物，其包括鈣離子的容器、能在血漿中誘導(dǎo)蛋白質(zhì)聚集的顆粒的容器、和一個或多個凝結(jié)實(shí)驗(yàn)設(shè)備。
文檔編號G01N33/48GK1432814SQ0310276
公開日2003年7月30日 申請日期2003年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月16日
發(fā)明者X·Y·鄭, B·埃爾普, H·周, C·哈爾特曼恩 申請人:生命掃描有限公司