專利名稱：一種毛細(xì)管區(qū)帶電泳對藥物進(jìn)行篩選的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種對藥物進(jìn)行篩選的方法，一種用毛細(xì)管區(qū)帶電泳方法對藥物進(jìn)行篩選，尤其適用于生物工程。
背景技術(shù)：
目前在藥物篩選中采用親和毛細(xì)管電泳方法，如在相關(guān)文獻(xiàn)1)D.Chen，L.Clohs，J.Chapman，“Capillary Electrophoresis and Its Applicationsin Pharmaceutical Industry”，the educational short course of Canadian Societyfor Chemistry Conference and Exhibition，2002，Vancouver，Canada.2)J.N.Little，J.L.WATERS，D.E.Hughes，”Affinity capillary electro-phoresis forrapid assay development and Screening of newly discovered targets”，Societyfor Biomolecular Screening，2001，USA中，親和毛細(xì)管電泳通過監(jiān)測溶質(zhì)的遷移速率變化來定量，重現(xiàn)性較好，但是需要將受體或配體加入到運(yùn)行緩沖液中，樣品消耗比較大，只能用于弱相互作用體系，而且在尋找用于衡量電滲流變化的標(biāo)示物方面也比較苛刻。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種更有效的用毛細(xì)管區(qū)帶電泳對藥物進(jìn)行篩選的方法，該方法分離效果比較好，并且試劑及樣品消耗極少，適用于強(qiáng)結(jié)合及弱結(jié)合體系，可用于天然產(chǎn)物(如中藥)、合成藥物或生物工程制藥的藥物篩選。
本發(fā)明提供的毛細(xì)管區(qū)帶電泳對藥物進(jìn)行篩選的方法，其具體步驟如下1)將受體或配體配制成一系列標(biāo)準(zhǔn)濃度進(jìn)樣，加壓運(yùn)行、檢測，獲得電泳信號譜圖，測量峰高h(yuǎn)，每個(gè)濃度對應(yīng)一個(gè)峰高，由此求得線性相關(guān)方程，作為工作曲線；2)將與1)相同濃度的受體或配體分別與不同濃度的配體或受體混合進(jìn)樣；在與1)相同的工藝條件下加壓運(yùn)行、檢測，獲得電泳信號譜圖，測量峰高h(yuǎn)’，將h’代入工作曲線，求得相應(yīng)的受體或配體的游離濃度Cf；3)如果以受體為考察對象，Cf是游離的受體濃度，則γ＝(C0-Cf)/Ct，其中，C0是加入的受體總濃度，Ct是加入的配體總濃度；4)采用方程γ/Cf＝-Kγ+nK，式中K是熱力學(xué)結(jié)合常數(shù)，n是結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，γ是與配體結(jié)合的受體濃度與配體總濃度之比(與受體體結(jié)合的配體體濃度與受體體總濃度之比)。
按上述方程回歸，定量求得熱力學(xué)結(jié)合常數(shù)K、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n。
經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在只有受體進(jìn)樣時(shí)的受體信號峰高與受體、配體混合物進(jìn)樣(兩中情況下的受體濃度是一樣的)時(shí)的峰高有明顯差別。本發(fā)明正是利用濃度和峰高的線性相關(guān)性，通過簡單地測量譜線的峰高，然后由步驟1)-4)定量地求得了熱力學(xué)結(jié)合常數(shù)K、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n。
本發(fā)明提供的毛細(xì)管區(qū)帶電泳對藥物進(jìn)行篩選的方法中，可以采用涂漬的毛細(xì)管柱，毛細(xì)管柱上可以涂漬丙烯酰胺，以取得較好的柱效和峰值。
本發(fā)明提供的毛細(xì)管區(qū)帶電泳對藥物進(jìn)行篩選的方法，其受體可以是蛋白，配體是藥物；受體可以是酶，配體是酶抑制劑；或者受體可以是核酸，配體是藥物。
本發(fā)明提供的毛細(xì)管區(qū)帶電泳對藥物進(jìn)行篩選的方法，其緩沖液是三羥甲基氨基甲烷-乙酸鹽(含有一定濃度的氯化鈉)溶液。
本發(fā)明提供的毛細(xì)管區(qū)帶電泳對藥物進(jìn)行篩選的方法，其檢測方法可以是紫外的，也可以是熒光的。
本發(fā)明提供的毛細(xì)管區(qū)帶電泳對藥物進(jìn)行篩選的方法，必要時(shí)在混合后要溫育一段時(shí)間再進(jìn)樣。
用毛細(xì)管區(qū)帶方法定量求算藥物(配體)和受體相互作用的結(jié)合常數(shù)大都是藥物和蛋白體系，并且同時(shí)得出結(jié)合常數(shù)和計(jì)量結(jié)合比(結(jié)合位點(diǎn)數(shù))的例子甚少，在核酸和藥物的作用中更未見有能同時(shí)給出這兩方面信息的報(bào)導(dǎo)；我們的方法適合于蛋白-藥物、酶-抑制劑、核酸-藥物等受體-配體體系，覆蓋面比較廣，而且能同時(shí)給出結(jié)合常數(shù)和計(jì)量結(jié)合比。
我們的毛細(xì)管電泳方法具有低成本、高效、節(jié)時(shí)等效果，并且可以靈活采毛細(xì)管區(qū)帶技術(shù)定量考察藥物(配體)和受體的相互作用，并可以比較其合理性，這種方法在生物工程中的藥物篩選中無疑是一種很有吸引力的方法。


圖1是11.1μM 14-mer DNA與不同濃度紡錘菌素相互作用的結(jié)果線a)0μM紡錘菌素，線b)3μM紡錘菌素，線c)19.8μM紡錘菌素，
線d)23.8μM紡錘菌素，線e)39.9μM紡錘菌素；圖2是根據(jù)圖1的曲線按Scatchard方程回歸的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以紡錘菌素和雙鏈DNAR的反應(yīng)體系為例工藝上采用20mM三羥甲基氨基甲烷-乙酸(Tris-acetate)，10mM氯化鈉(pH7.0-7.2)為運(yùn)行緩沖液，使用紫外檢測(260nm)，內(nèi)徑50μm的丙烯酰胺涂層毛細(xì)管柱(柱長31.2cm，有效長21cm)，在壓力0.5psi下進(jìn)樣4秒，施加8kV的反向電壓運(yùn)行；受體為11.1μM 14-mer DNA，配體分別為0μM紡錘菌素，3μM紡錘菌素，19.8μM紡錘菌素，23.8μM紡錘菌素，39.9μM紡錘菌素；很方便地檢測到DNA的信號(峰形及柱效都比較好)(見圖1)，并經(jīng)按方程γ/h＝-Kγ+nK回歸，很好地反映出加入紡錘菌素后DNA信號的變化；γ/Cf＝0.125-0.107γ，即K＝0.107，nK＝0.125，n＝1.168。
權(quán)利要求
1.一種毛細(xì)管區(qū)帶電泳對藥物進(jìn)行篩選的方法，其特征在于具體步驟如下1)將受體或配體配制成一系列標(biāo)準(zhǔn)濃度進(jìn)樣，加壓運(yùn)行、檢測，獲得電泳信號譜圖，測量峰高h(yuǎn)，每個(gè)濃度對應(yīng)一個(gè)峰高，由此求得線性相關(guān)方程，作為工作曲線；2)將與1)相同濃度的受體或配體分別與不同濃度的配體或受體混合進(jìn)樣；在與1)相同的工藝條件下加壓運(yùn)行、檢測，獲得電泳信號譜圖，測量峰高h(yuǎn)’，將h’代入工作曲線，求得相應(yīng)的受體或配體的游離濃度Cf；3)如果以受體為考察對象，Cf是游離的受體濃度，則γ＝(C0-Cf)/Ct，其中，C0是加入的受體總濃度，Ct是加入的配體總濃度；4)采用方程γ/Cf＝-Kγ+nK，式中K是熱力學(xué)結(jié)合常數(shù)，n是結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，按上述方程回歸，定量求得熱力學(xué)結(jié)合常數(shù)K、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n。
2.按照權(quán)利要求1所述的毛細(xì)管區(qū)帶電泳對藥物進(jìn)行篩選的方法，其特征在于運(yùn)行時(shí)采用涂漬的毛細(xì)管柱。
3.按照權(quán)利要求1所述的毛細(xì)管區(qū)帶電泳對藥物進(jìn)行篩選的方法，其特征在于毛細(xì)管柱上涂漬丙烯酰胺。
4.按照權(quán)利要求1～3之一所述的毛細(xì)管區(qū)帶電泳對藥物進(jìn)行篩選的方法，其特征在于受體是蛋白或核酸，配體是待篩選藥物。
5.按照權(quán)利要求1～3之一所述的毛細(xì)管區(qū)帶電泳對藥物進(jìn)行篩選的方法，其特征在于緩沖液是三羥甲基氨基甲烷-乙酸鹽(含有一定濃度的氯化鈉)溶液。
6.按照權(quán)利要求4所述的毛細(xì)管區(qū)帶電泳對藥物進(jìn)行篩選的方法，其特征在于緩沖液是三羥甲基氨基甲烷-乙酸鹽(含有一定濃度的氯化鈉)溶液。
7.按照權(quán)利要求1～3之一所述的毛細(xì)管區(qū)帶電泳對藥物進(jìn)行篩選的方法，其特征在于其檢測方法是紫外的或熒光的。
8.按照權(quán)利要求4所述的毛細(xì)管區(qū)帶電泳對藥物進(jìn)行篩選的方法，其特征在于其檢測方法是紫外的或熒光的。
9.按照權(quán)利要求5所述的毛細(xì)管區(qū)帶電泳對藥物進(jìn)行篩選的方法，其特征在于其檢測方法是紫外的或熒光的。
10.按照權(quán)利要求6所述的毛細(xì)管區(qū)帶電泳對藥物進(jìn)行篩選的方法，其特征在于其檢測方法是紫外的或熒光的。
全文摘要
本發(fā)明提供一種毛細(xì)管區(qū)帶電泳對藥物進(jìn)行篩選的方法，具體步驟如下1)將受體或配體配制成一系列標(biāo)準(zhǔn)濃度進(jìn)樣，加壓運(yùn)行、檢測，獲得電泳信號譜圖，測量峰高h(yuǎn)，每個(gè)濃度對應(yīng)一個(gè)峰高，由此求得線性相關(guān)方程，作為工作曲線；2)將與1)相同濃度的受體或配體分別與不同濃度的配體或受體混合進(jìn)樣；在與1)相同的工藝條件下加壓運(yùn)行、檢測，獲得電泳信號譜圖，測量峰高h(yuǎn)，將h代入工作曲線，求得相應(yīng)的受體或配體的游離濃度C
文檔編號G01N33/15GK1530648SQ0311116
公開日2004年9月22日 申請日期2003年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月14日
發(fā)明者何新亞, 林炳承 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所