專利名稱：活版化合物微陣列及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種化合物微陣列，尤其是一種生物大分子微陣列，同時本發(fā)明還涉及制備化合物微陣列的方法，屬于生物化學分析技術(shù)領(lǐng)域。
在對傳統(tǒng)方法進行改進的過程中，以基因芯片為代表的生物芯片技術(shù)應運而生。這一技術(shù)的成熟和應用將為新藥的開發(fā)和鑒定、食品和環(huán)境等生命科學相關(guān)領(lǐng)域帶來一場革命，為生物信息的獲取及分析提供強有力的手段。
基因芯片制備技術(shù)可分為點樣法和原位合成法。所謂點樣法，即運用各種方法(打印、噴印、點樣)將預先合成的DNA探針或cDNA探針固定到玻片或其它固體載片上形成微探針陣列。原位合成則是按照預先設計的堿基序列直接將探針合成在基片上。點樣法適合于低密度基因芯片的制備，稍高的探針數(shù)量即需要很高的成本(例如，當20目的探針數(shù)量達到1000條時，探針成本即在300,000元人民幣左右)，因而當探針數(shù)目較多時，這一技術(shù)無法與原位合成技術(shù)想比擬，此外還有各種客觀因素導致探針密度不均勻因而雜交信號不均勻的缺點。從今后大規(guī)模的批量化生產(chǎn)及應用前景的角度，利用高度自動化技術(shù)平臺批量化制備基因芯片是重要的發(fā)展趨勢，目前在國際上，已經(jīng)開發(fā)了多種DNA陣列原位合成技術(shù)，但由于這樣那樣的不足，僅美國Affymetrix公司擁有的光脫保護原位合成制備專利技術(shù)已有規(guī)?；幕蛐酒a(chǎn)線為需求者提供商業(yè)芯片，其主要不足之處是特有的光脫保護方法需要制作一系列特定的光掩模，成本高，不適合小批量需求。并且對不同的用戶需求和不同的基因芯片必須重新設計光掩模。
東南大學吳健雄實驗室經(jīng)過數(shù)年的努力，開發(fā)了分子印章接觸壓印DNA微陣列原位合成技術(shù)，完全采用現(xiàn)有最成熟的DNA合成路線，可望降低成本。美中不足是在掩模設計上和Affymetrix公司擁有的光脫保護原位合成制備專利技術(shù)一樣，針對不同的用戶需求和不同的基因芯片，必須重新設計掩模，此外，由于所使用的PDMS材料的的高度疏水性，因而需要對印章進行表面改性增加極性，但這種改性效果的保持具有時效性，只能保持一定時間。另一個有待進一步改進之處是受光刻材料和技術(shù)的限制，所制備的印章表面的陣點突出高度有限(理想狀況可達到40μm以上，通常在10-20μm之間)，容易導致不同區(qū)域之間的交叉污染。
為了達到以上目的，本發(fā)明活版化合物微陣列的基本技術(shù)方案為活版化合物微陣列包括基板和基片，所述基板上按照預定排布規(guī)律，固定有至少兩種表面性狀有別的微小塊體材料，構(gòu)成可以所述預定規(guī)律附著反應試劑的組合陣列壓印母版；所述基片表面制有功能化修飾層，并通過化學偶聯(lián)附著有至少一層按對應所述預定規(guī)律排布的反應試劑組合陣列壓印層。
以上表面性狀的不同可以是親水與疏水的區(qū)別、實體與多孔體的區(qū)別，或者是高凸與低凹的區(qū)別，也可以是以上幾種性狀特征的相互組合。
制備本發(fā)明活版化合物微陣列的方法為預備至少兩種表面性狀有別的微小塊體材料(可以將整塊無機或有機塊體材料分割成小塊，或直接應用微小無機或有機塊體材料)，將微小塊體材料按預定規(guī)律固定在母板基板上，構(gòu)成可以預定規(guī)律附著反應試劑的組合陣列的壓刷母板，再將反應試劑附著于(可以涂附或吸附)壓印母板上，形成微陣列印章；對基片表面進行功能化修飾，應用組合化學原理循序?qū)河∧赴鎵河〉交希M行化學偶聯(lián)，得到所需的化合物微陣列。
本發(fā)明的組合壓印母版完全免除了原位合成技術(shù)中昂貴而煩瑣的掩模制作過程，不僅使操作簡單化，易實現(xiàn)自動控制，而且提供了類似于液相反應環(huán)境，因而又保障了極高的偶聯(lián)效率，有利于提高工效。
此外，由于具有類似于液相的反應環(huán)境，因而所耗試劑甚微，可以顯著降低成本，適用于化合物及其組合、生物分子或藥物的高通量篩選，傳統(tǒng)藥物的現(xiàn)代化研究，多疾病多人份的高通量同時檢測與分析，以及基因組或cDNA文庫的篩選，新基因的發(fā)現(xiàn)和基因功能的研究，蛋白質(zhì)組學的研究等。
總之，本發(fā)明將大大加快新藥開發(fā)的速度，減少開發(fā)成本，提高效率和準確性，而且對傳統(tǒng)藥物(包括中藥)的現(xiàn)代化具有重要的價值。


圖1為本發(fā)明實施例一的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2為本發(fā)明實施例二的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖3為本發(fā)明實施例三的結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實施例方式
應該特別指出的是在以下實施例中，寡核苷酸所含堿基個數(shù)為8，而所合成的寡核苷酸微陣列點陣數(shù)為16，純粹只是為了簡單明了地說明原理，并不受此限制，實際需求中寡核苷酸所含堿基個數(shù)可以多至任何現(xiàn)有DNA合成儀所能達到的數(shù)目，而微陣列點陣總數(shù)及單位面積內(nèi)點陣點數(shù)目可以很高，能達到的水平完全取決于現(xiàn)有微細加工水平。還應該指出的是，除了上述說明中對微小塊體a和b有所要求外，對組合壓印母版基材g及芯片基片材料S只要求它們與所用試劑相互之間沒有化學作用即可，其它方面并沒有什么特別要求，可以是任何合適的有機或無機材料。例如玻璃、功能化的聚四氟乙烯、功能化的聚丙稀、尼龍、硅片、云母、金屬、陶瓷、天然和人造纖維等。實施例一平面組合壓印母版的構(gòu)建及8mer 16陣點寡核苷酸化合物微陣列芯片的原位合成。
在圖1中，圖1-1a、b為兩種微小塊體材料，在基板g上構(gòu)成圖1-2中組合壓印母版c、d、e、f。兩微小塊體材料a、b的立體幾何形狀并沒有一定的限制，既可以由整塊材料切割而成，也可以直接微模鑄出，或直接造粒而來。兩種材料中一種具有疏水性質(zhì)(設為a)，另一種具有親水性質(zhì)(設為b)，其不同的表面性質(zhì)可以由于自身固有性質(zhì)所決定，也可以通過表面物理化學改性而來。例如等離子處理改性、化學接枝改性、表面組裝改性等。
為了改善表面接觸反應微環(huán)境，其中一種可以為實體，而另一種可以為多孔。當兩種材料皆為實體時，兩種微小塊體材料表面性質(zhì)必須不同，每次反應前需將反應試劑涂抹在整個壓印母版表面，借助于兩種微小顆粒材料表面性質(zhì)的不同達到按設計要求在壓印母版表面選區(qū)分布反應試劑的效果。
當其中微小塊體b為多孔材料時，兩種材料表面性質(zhì)可以一樣或類似，只需讓多孔微小塊體b事先吸滿飽和反應試劑，在后面的壓印過程中就不需再每次涂抹反應試劑。如圖1-3所示，基片S表面經(jīng)過功能化修飾的，修飾方法可以是化學接枝改性、等離子改性，或表面化學組裝改性。當將表面分別涂有或吸滿A、T、C、G反應試劑的壓印母版分別壓印到微陣列基片S上時，就相應在基片S上選區(qū)偶聯(lián)上了A、T、C、G(參見圖1-3(1)和(2))，然后更換另一套壓印母版，就可偶聯(lián)上第二層單體如圖1-3(3)所示，…………………，依次類推，可以在微陣列基片S上偶聯(lián)上若干層單體。圖1-4是偶聯(lián)8層單體的示意圖，容易理解，如果只有四種單體，每一層就只需用a、b兩種微小塊體組合構(gòu)件四張壓印母版。當總共偶聯(lián)n層單體時，只需用a、b兩種微小塊體組合構(gòu)建n×4張壓印母版。
確切些說，如圖1所示，將圖1-1中的兩種微小塊體a、b粘在基板g上，構(gòu)建成圖1-2中組合壓印母版c、d、e、f。由于用于寡核苷酸合成的單體試劑是極性的，所以用微小塊體材料b按設計要求轉(zhuǎn)印反應試劑。因此，微小塊體材料a表面是疏水的(如聚合二甲基硅烷PDMS)。當微小塊體材料b是實體材料時，其表面應該具有相當?shù)臉O性(如聚脂、聚胺脂、表面極性功能化改性PDMS、功能化聚四氟乙烯材料等)。當微小塊體b是多孔材料時，則b可以是極性也可以是非極性材料。壓印時，將單體反應試劑dA涂布于組合壓印母版c上，然后壓印到基片S上，單體A就被偶聯(lián)到基片上相應的區(qū)域。類似地，將涂布有單體dT、dC和dG的組合母版d、e、f壓印到基片S上，則單體T、C、G被分別轉(zhuǎn)移偶聯(lián)到基片上相應的區(qū)域，見圖1-3。然后經(jīng)洗滌、氧化、洗滌、脫保護和洗滌過程后，即可用對應于第二層的四張組合壓印母版開始第二層單體的壓印偶聯(lián)，…………，依次循環(huán)下去，直至完成設計的全部過程，最終得到如圖1-4所示的8mer點陣數(shù)為16的寡核苷酸微陣列芯片，單步偶聯(lián)效率大于98％。實施例二凸凹組合壓印母版的構(gòu)建及8mer 16陣點寡核苷酸化合物陣列芯片的原位合成。
本實施例如圖2所示，其原理、方法及過程與實施實例一相同，但因為采用凸凹結(jié)構(gòu)的組合印刷母版，凸出的高度足以防止壓印時單體反應試劑對非反應區(qū)的污染，所以對應于非反應區(qū)的微小塊體a的表面并不特別需要是非極性的來阻止反應單體的浸潤污染。其它方面和具體操作完全等同于實施例一。最終得到如圖2-5所示的8mer點陣數(shù)為16的寡核苷酸微陣列芯片。單步偶聯(lián)效率大于98％。
具體來說，在圖2中，將圖2-1的a、b兩種微小塊體材料固定在基板g上構(gòu)成圖2-2中組合壓印母版c、d、e、f。為了有效地防止壓印時反應試劑對不需壓印區(qū)域的污染，特地使按設計擬壓印反應物的微小顆粒塊體(設為b)比不壓印反應物的微小塊體a高一些，即壓印反應試劑的微小塊體b凸出于由a、b組合構(gòu)建而成的組合壓印母版平面。由于b凸出于表面，壓印時微小塊體a不會與基片接觸，所以a、b可以具有相同的表面性質(zhì)。為了獲得最佳壓印效果，a、b兩種材料最好具于不同的表面性質(zhì)。為了改善表面接觸反應微環(huán)境，兩種微小塊體中，其中a可以為實體，而b可以為多孔。此時兩種材料可以具有完全一樣的表面性質(zhì)。
當兩種材料皆為實體時，每次偶聯(lián)反應前需將反應試劑涂抹在整個壓印母版表面，但只有凸出的微小塊體b會將反應試劑壓印到基片S上，當其中微小塊體b是多孔材料時，只需讓多孔微小塊體b事先吸滿飽和反應試劑，在后面的壓印過程中就不需再每次涂抹反應試劑。如圖2-3所示，當將表面分別涂有或吸滿A、T、C、G反應試劑的壓印母版分別壓印到基片S上時，就相應在基片S上選區(qū)偶聯(lián)上了A、T、C、G(示意圖見圖2-3(1)和(2))，然后更換另一套壓印母版，就可偶聯(lián)上第二層單體如圖2-3(3)所示，………………，依次類推，可以在基片上偶聯(lián)上若干層單體，…………，圖2-5是偶聯(lián)8層單體的示意圖。當總共偶聯(lián)n層單體時，只需用a、b兩種微小塊體組合構(gòu)建n×4張壓印母版。實施例三具有微溝槽及儲液槽之組合壓印母版的構(gòu)建及8mer 16陣點寡核苷酸化合物陣列芯片的原位合成。
本實施例如圖3所示，其原理、方法及過程與實施例一和實施例二基本相同，但用于壓印轉(zhuǎn)移單體的微小塊體b或b′是多孔的，對其表面是否為極性則沒有嚴格的要求。整個組合印刷母版上的所有多孔微小塊體由基板上的微細溝槽相互連接與貫通。又因組合壓印基板上具有儲液槽及便于液體浸潤與流動的微溝槽，所以在整個寡核苷酸微陣列芯片制備前先通過組合印刷基板上的儲液槽上的小孔將槽內(nèi)注滿反應單體，反應單體即通過微溝槽充滿于多孔微小塊體b或b′中，芯片制備過程中所耗又可由儲液槽中儲備之單體溶液經(jīng)由微細溝槽得到補充，所以此實施例除了具有實施例一和二的各種優(yōu)點外，更有反應試劑分布極其理想且整個芯片原位合成過程中不需補充單體反應試劑的特點。對反應單體的控制變得非常簡單易行，其它方面和具體操作完全等同于實施例一。最終得到如圖3-5所示的8mer點陣數(shù)為16的寡核苷酸微陣列芯片。單步偶聯(lián)效率大于98％。
結(jié)合圖3更具體些說，為了更好地避免壓印時反應試劑對非壓印區(qū)的污染以及避免整個反應過程中不斷補充試劑的煩瑣，本實施例不僅用于壓印偶聯(lián)單體到芯片基片上的微小塊體b是多孔的，還特別采用了圖3-1中g(shù)′和g″所示的組合印刷基板。特別地，在組合壓印母版基底g′和g″底面表面具有微溝槽wgc，即可用于儲存試劑，又可吸收壓印時擠出的試劑。而在基板g″一側(cè)更設有密閉儲液槽cyc用于儲備反應試劑，儲液槽cyc上有一可以打開和封閉的小孔cyk用于重新注入試劑。此儲液槽cyc的設置使得具有更好的緩沖調(diào)節(jié)作用，不僅可不斷通過基板上的微溝槽wgc向基板上的多孔微小塊體補充消耗的反應液，而且又可更好地吸收壓印時擠出的試劑。這樣設計便于反應試劑在多孔微小塊體b中的分配和不斷充填，圖3-1a、b及b′為三種微小塊體材料，a和b一樣高，b′比b高，在基板g′和g″上構(gòu)成圖3-2組合壓印母版a、d、e、f和圖3-3組合壓印母版c′、d′、e′、f′。實際上a、b、b′其立體幾何形狀并沒有一定的限制，它們可以是由整塊材料切割而來，也可以直接微鑄模而來，或直接造粒而來。但為了有效地防止壓印時反應試劑對不需壓印區(qū)域的污染，特地使按設計擬壓印反應物的微小顆粒塊體(設為b′)比不壓印反應物的微小塊體a高一些，即壓印反應試劑的微小塊體b′凸出于由a、b′組合構(gòu)建而成的組合壓印母版平面。由于b′凸出于表面，壓印時微小塊體a不會與基片接觸，所以a、b′可以具有相同的表面性質(zhì)。為了獲得最佳壓印效果，a、b′兩種材料最好具于不同的表面性質(zhì)，即，可以一種具有疏水性質(zhì)(設為a)，另一種具有親水性質(zhì)(設為b′，此時反應物為極性試劑；若反應物為非極性試劑，則應使微小塊體a表面為極性，微小塊體b′表面為非極性)，兩種材料不同的表面性質(zhì)，可以是由于自身固有性質(zhì)所決定，也可以是通過表面物理化學改性而來，例如等離子處理改性、化學接枝改性、表面組裝改性等。為了改善表面接觸反應微環(huán)境，兩種微小塊體中，其中a可以為實體，而b′則為多孔。壓印時，先將多孔微小塊體b′事先吸滿飽和反應試劑，在后面的壓印過程中就不需再補充反應試劑。只有凸出的微小塊體b′會將反應試劑壓印到基片S上。消耗的反應試劑由儲液槽通過組合壓印母版上的微小溝槽不斷補充到多孔微小塊體a中，如圖3-4所示，當將分別吸滿A、T、C、G反應試劑的壓印母版分別壓印到基片S上時，就相應在基片S上按設計要求選區(qū)偶聯(lián)上了A、T、C、G，示意圖見圖3-4(1)和(2))，然后更換另一套壓印母版，就可偶聯(lián)上第二層單體如圖3-4(3)所示，………，類似地，可以在基片上偶聯(lián)上若干層單體，圖3-5是偶聯(lián)8層單體的示意圖，很容易理解，如果只有四種單體，每一層就只需用a、b或b′兩種微小塊體組合構(gòu)建四張壓印母版。當總共偶聯(lián)n層單體時，只需用a、b或b′兩種微小塊體組合構(gòu)建n×4張壓印母版。
總而言之，以上實施例通過將整塊材料分割成小塊，或直接應用微小塊體材料，并將這些微小塊體材料按預先設計的方案進行組合，構(gòu)成一系列組合平面或凹凸結(jié)構(gòu)母版。不需要經(jīng)過光刻等復雜過程來制備壓印母版，特別快捷，特別簡單方便；需要的壓印位點對反應試劑具有很高的親和性，因而反應效率類似于均相體系。微小塊體是微孔材料時，由于反應試劑儲存于微孔內(nèi)，壓印受到擠壓作用會充滿于界面，因而獲得一個類似于液相過程的反應環(huán)境，從而保證了很高的偶聯(lián)效率。應用上述組合母版，可以十分快捷低廉地制備化合物尤其是生物大分子化合物微陣列。
以上實施例的顯著優(yōu)點是所提出的組合壓印母版可以完全免除現(xiàn)有寡核苷酸微陣列原位合成技術(shù)中昂貴而煩瑣的掩模制作過程，當探針密度不是特別高時，特別實用、高效、簡潔而成本低廉；而所提出的微孔壓印母版因可儲存試劑又可免除現(xiàn)有分子印章法由于試劑的揮發(fā)須反復涂抹試劑并且難于控制試劑揮發(fā)和壓印最佳時刻的不足之處，不僅使操作簡單化，易實現(xiàn)自動控制，而且提供了類似于液相反應環(huán)境，因而又保障了極高的偶聯(lián)效率，有利于提高工效。此外，由于具有類似于液相的反應環(huán)境，因而所耗試劑甚微，可以顯著降低成本。還可采用光、聲、電、磁等方法加速反應過程?？傊?，可以廉價高效地在基片表面同時合成或者覆蓋大量不同的化合物。利用這些不同的化合物可以進行大量的基因或者蛋白等生物化學信息的定性或定量分析，所得結(jié)果可以用光、電、熱、聲、納米技術(shù)或化學等方法進行檢測。例如可用普通光學顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、CCD觀察或表面激元共振(SPR)，表面干涉反射(RIFS)、納米顆粒標記檢測(如金標-銀染)、石英晶振等光學、電學技術(shù)和化學方法進行檢測，大大提高工作效率，減少試劑用量，真正做到快速、實時、準確、自動化和無污染。它可用于化合物及其組合、生物分子或藥物的高通量篩選，多疾病多人份的高通量同時檢測與分析，傳統(tǒng)藥物的現(xiàn)代化研究，以及基因組或cDNA文庫的篩選，新基因的發(fā)現(xiàn)和基因功能的研究，蛋白質(zhì)組學的研究等。
本發(fā)明將大大加快新藥開發(fā)的速度，減少開發(fā)成本，提高效率和準確性，而且對傳統(tǒng)藥物(包括中藥)的現(xiàn)代化具有重要的價值。
權(quán)利要求
1.一種活版化合物微陣列，包括基板和基片，其特征在于所述基板上按照預定排布規(guī)律，固定有至少兩種表面性狀有別的微小塊體材料，構(gòu)成可以所述預定規(guī)律附著反應試劑的組合陣列壓印母版；所述基片表面制有功能化修飾層，并通過化學偶聯(lián)附著有至少一層按對應所述預定規(guī)律排布的反應試劑組合陣列壓印層。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述活版化合物微陣列，其特征在于所述微小塊體材料分別為親水材料和疏水材料，所述壓印母版為平面組合壓印母版。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述活版化合物微陣列，其特征在于所述微小塊體材料分別為高凸材料和低凹材料，所述壓印母版為凹凸組合壓印母版。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述活版化合物微陣列，其特征在于所述微小塊體材料分別為實體材料和多孔材料。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述活版化合物微陣列，其特征在于所述基板表面制有微溝槽，所述微溝槽與有多孔微小塊體相互連接貫通。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述活版化合物微陣列，其特征在于所述基板表面一側(cè)設有密閉儲液槽，所述儲液槽上有注入試劑的小孔。
7.一種活版化合物微陣列的制備方法，其特征在于預備至少兩種表面性狀有別的微小塊體材料，將微小塊體材料按預定規(guī)律固定在母板基板上，構(gòu)成可以預定規(guī)律附著反應試劑的組合陣列壓刷母板，再將反應試劑附著于壓刷母板上，形成微陣列印章；對基片表面進行功能化修飾，應用組合化學原理循序?qū)⒂∷⒛赴鎵河〉交希M行化學偶聯(lián)，得到所需的化合物微陣列。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述活版化合物微陣列的制備方法，其特征在于所述微小塊體材料的表面性狀差異通過功能化修飾獲得。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述活版化合物微陣列的制備方法，其特征在于所述功能化修飾為等離子處理改性、化學接枝改性或表面組裝改性。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生物大分子微陣列，同時還涉及其制備方法，屬于生物化學分析技術(shù)領(lǐng)域。該微陣列包括基板和基片，基板上按照預定排布規(guī)律，固定有至少兩種表面性狀有別的微小塊體材料，構(gòu)成可以所述預定規(guī)律附著反應試劑的組合陣列壓印母版；基片表面制有功能化修飾層，并通過化學偶聯(lián)附著有至少一層按對應所述預定規(guī)律排布的反應試劑組合陣列壓印層。制備時，將表面性狀有別的微小塊體材料按預定規(guī)律固定在母板基板上，構(gòu)成壓刷母板，再壓印到基片上，進行化學偶聯(lián)，得到化合物微陣列。本發(fā)明完全免除了昂貴而煩瑣的掩模制作過程，操作簡單，易實現(xiàn)自動控制，保障了極高的偶聯(lián)效率，提高了效率和準確性，對傳統(tǒng)藥物的現(xiàn)代化具有重要的價值。
文檔編號G01N33/50GK1438327SQ0311300
公開日2003年8月27日 申請日期2003年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月20日
發(fā)明者何農(nóng)躍, 楊春, 湯建新, 郭會時 申請人:何農(nóng)躍, 楊春