專利名稱：檢測sars冠狀病毒抗體的方法及其試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人類醫(yī)學(xué)衛(wèi)生領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測SARS冠狀病毒抗體的方法及其試劑盒。
背景技術(shù)：
2002年底在世界各地爆發(fā)了導(dǎo)致全球150多人死亡的非典型肺炎，這次流行的非典型肺炎是一種急性呼吸道傳染病，國外稱其為重癥急性呼吸綜合征(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)，主要通過近距離空氣飛沫和密切接觸傳播，起病急、傳播快，病死率高達(dá)4.9％。目前涉及到世界近30個國家和地區(qū)，全球患者已達(dá)3389多例，且發(fā)病人數(shù)仍有不斷增加的趨勢。
美國疾病控制和預(yù)防中心的專家利用“非典”患者的組織樣本，借助電子顯微鏡分離并判定“非典”病原體可能是新型冠狀病毒。幾乎同時，包括中國、新加坡、加拿大、德國在內(nèi)的幾個實驗室也都確認(rèn)了這種新型冠狀病毒的存在。
2003年4月16日，世界衛(wèi)生組織宣布，經(jīng)過全球10個國家和地區(qū)13個實驗室的通力合作，在全球多個國家快速傳染的非典型肺炎(英文名稱為SARS，下文簡稱“非典”)的病原體最終被確認(rèn)。這是一種冠狀病毒，以前從未在人體中發(fā)現(xiàn)過。非典型肺炎病原，即SARS病毒的分離和確證，對于該病的臨床診斷、治療及預(yù)防至關(guān)重要，這也是本發(fā)明所要解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測SARS冠狀病毒抗體的方法及其試劑盒。
其具體步驟如下1)利用純化的全病毒裂解液包被一種固相支持物；2)將待檢測的生物學(xué)樣本加入經(jīng)包被的固相支持物上，在適合形成抗原抗體免疫結(jié)合復(fù)合物的條件下孵育；3)清洗去除任何未結(jié)合的SARS冠狀病毒抗體；4)加入經(jīng)標(biāo)記的針對人抗體的第二抗體，在適合形成抗原抗體免疫復(fù)合物的條件下孵育；5)清洗去除任何未結(jié)合的第二抗體；6)檢測孵育混合物中抗原抗體免疫結(jié)合復(fù)合物的存在。
其試劑盒組成為
1)包被抗原SARS冠狀病毒全病毒裂解液；2)抗原包被板采用國產(chǎn)96孔可拆板，并包被SARS冠狀病毒全病毒裂解液；3)酶標(biāo)抗體辣根過氧化物酶標(biāo)記的第二抗體(IgG或IgM)；4)陰性對照及陽性對照血清含0.05％硫柳汞，0.01％疊氮鈉；5)酶標(biāo)抗體工作液用含20％羊血清，0.05％硫柳汞的稀釋液將酶標(biāo)抗體稀釋至適當(dāng)?shù)男r；6)底物液A0.06％過氧化脲的0.01M pH4.5檸檬酸緩沖液；底物液B0.06％TMB0.01M pH4.5檸檬酸緩沖液；7)終止液1M硫酸；8)洗滌液PBS，含0.1％吐溫-20；9)間接法檢測SARS冠狀病毒抗體試劑盒說明書一份。
本發(fā)明解決了臨床對SARS冠狀病毒感染者的快速診斷問題，具有較高的準(zhǔn)確性，為臨床檢測該病提供了快速、準(zhǔn)確的診斷方法。


圖1是SARS冠狀病毒全病毒裂解液抗原的SDS-PAGE結(jié)果示意圖；圖2是酶標(biāo)第二抗體為IgG時cut-off態(tài)分布示意圖。
具體實施例方式
本發(fā)明所述的生物學(xué)樣本是指來自受試者(包括患者和陰性對照)的血液、血清、血漿、尿樣、體液、唾液和其它分泌物或排泄物以及組織或細(xì)胞提取物。
針對人抗體的第二抗體可以是用放射性同位素標(biāo)記的(即RIA)，也可以是用辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶進(jìn)行標(biāo)記的(即ELISA)。
所述第二抗體可以是抗人-IgG或/和-IgM或/和-IgA抗體。這些第二抗體可以從市場上購得，如綿羊抗人-IgG或/和-IgM、山羊抗人-IgG或/和-IgM、小鼠抗人-IgG或/和-IgM、大鼠抗人-IgG或/和-IgM、兔抗人-IgG或/和-IgM等。
利用不同的第二抗體可以檢測出樣本中特定的抗體是否存在，以及不同抗體的相對存在量。由于在SARS冠狀病毒感染的不同時期IgG和IgM在人體內(nèi)的相對量不同，利用不同的第二抗體進(jìn)行多次檢測有助于判定患者的病程。
所述的“固相支持物”包括本領(lǐng)域周知的有機(jī)和無機(jī)多聚物，諸如包括但不局限于葡聚糖、天然或經(jīng)修飾的纖維素、聚乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺，瓊脂糖，乳膠，容器內(nèi)壁如試管、滴定板、玻璃杯等。
可使用本領(lǐng)域周知的多種方法包被固相支持物。例如利用雙功能試劑活化，參見美國專利5399501。
所述的“適合形成抗原抗體免疫復(fù)合物的條件”為本領(lǐng)域周知，是指在適當(dāng)?shù)臏囟燃皶r間條件下孵育抗原與含抗體的樣品的混合物，例如在約0-50攝氏度，優(yōu)選約4-30攝氏度下，標(biāo)記約20分鐘至約48小時，優(yōu)選標(biāo)記約20分鐘至約4小時。
經(jīng)孵育形成抗原抗體免疫復(fù)合物后，用本領(lǐng)域常用的適當(dāng)洗滌溶液洗滌檢測板數(shù)次，以清除未結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記的抗原。所用清洗液一般為pH約5-8，優(yōu)選為pH約7.4的磷酸鹽緩沖溶液。
可采用多種本領(lǐng)域周知的方法定量檢測抗原抗體復(fù)合物的形成。根據(jù)標(biāo)記第二抗體所使用的方法，選擇適當(dāng)?shù)亩繖z測方案。本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案中，標(biāo)記抗原時使用辣根過氧化物酶，所以使用以過氧化物溶液為A液及聯(lián)苯胺類物質(zhì)為B液的底物與帶有含標(biāo)記的辣根過氧化物酶的抗原抗體免疫復(fù)合物作用，顯色后在波長為450nm(參比波長630nm)酶標(biāo)儀讀取吸光值。將所得讀數(shù)與陰性對照的讀數(shù)加以比較，判斷所測樣本的結(jié)果。
利用本發(fā)明的SARS冠狀病毒全病毒裂解液作為抗原，通過免疫法檢測個體生物學(xué)樣本中SARS冠狀病毒抗體的方法還包括本領(lǐng)域中常規(guī)使用的利用特定抗原檢測抗體的其它方法。
本發(fā)明也涉及用于這些方法檢測SARS冠狀病毒抗體的檢測試劑盒。根據(jù)本發(fā)明檢測SARS冠狀病毒抗體的試劑盒包括用純化的本發(fā)明經(jīng)修飾的重組非典型性肺炎病毒蛋白質(zhì)作為抗原包被的固相支持物；和使用該試劑盒的說明。還包括如上文所述標(biāo)記的第二抗體。該第二抗體可以是抗IgG抗體和/或抗IgM和/或抗IgA抗體。在上述檢測試劑盒中，還可以含有提供判斷檢測結(jié)果的相應(yīng)的范圍。SARS冠狀病毒全病毒裂解液是采用Vero-E6細(xì)胞接種病毒后培養(yǎng)，經(jīng)超聲裂解純化而得到的。
下列實施例詳細(xì)解釋本發(fā)明，但這并不限制本發(fā)明的范圍。實施例1、SARS冠狀病毒全病毒裂解液的制備及鑒定1、將病毒直接接種Vero E6后，每天觀察病變，當(dāng)表現(xiàn)為聚集，圓形細(xì)胞，折光，并出現(xiàn)散在細(xì)胞脫落時，將細(xì)胞在-20C反復(fù)凍溶2此，離心取上清。
2、SARS冠狀病毒純化過程，得到SARS冠狀病毒全裂解液。
1)上述上清進(jìn)行超聲破碎(功率150W，超聲時間2秒，間歇時間4秒，60個循環(huán))；2)13000RPM離心20分鐘；
3)置入透析袋進(jìn)行透析(cut-off10000)；4)采用PEG20000濃縮樣品約6-7倍；5)將濃縮樣品轉(zhuǎn)移至潔凈試管；6)超聲破碎(功率150W，超聲時間2秒，間歇時間4秒，60個循環(huán))；7)13000RPM離心10分鐘；除去不溶物；8)加入固體尿素至濃度為6M；9)超聲破碎(功率150W，超聲時間2秒，間歇時間4秒，60個循環(huán))；10)13000RPM離心10分鐘，除去不溶物。得到SARS冠狀病毒全病毒裂解液。
3、純度鑒定以VERO-E6 CELL超聲粉碎的細(xì)胞液和全病毒裂解液同時進(jìn)行SDS-PAGE電泳測定，濃縮膠濃度5％，分離膠濃度為10％，樣品上樣量為10μg。對照細(xì)胞及中毒細(xì)胞條帶應(yīng)有明顯差異；比活用1μg/ml抗原包被的微孔板條，用質(zhì)控P1號血清進(jìn)行檢定，定義A值等于0.2時抗原比活為一個單位(IU)，比活應(yīng)大于10IU。SARS冠狀病毒全病毒裂解液抗原的SDS-PAGE結(jié)果見附圖1。實施例2、SARS冠狀病毒全病毒裂解液包被固相支持物96孔板條選用吸附性良好的聚苯乙烯板(孔間，板間和批間差CV＜10％)，選用0.05M pH9.6碳酸鹽緩沖液(CB)為包被液，每孔加入按照實驗設(shè)計濃度配好抗原的包被液100微升，室溫包被過夜。然后棄去抗原液，包被板用含有0.5％TW-20的0.02M PBS洗滌液(PBS-T)洗兩次，拍干，加入1％牛血清白蛋白(BSA)和1％脫脂奶粉的0.02M pH7.4磷酸鹽緩沖液(PBS)室溫封閉2小時。棄去封閉液，風(fēng)干包被板，鋁箔袋真空包裝4℃保存。用內(nèi)控SARS冠狀病毒血清進(jìn)行效價滴定，用間接法測定用于包被的SARS冠狀病毒抗原效價，結(jié)果見表1，結(jié)果確定用于包被的SARS冠狀病毒抗原的效價為1∶60。
表1.用于包被的SARS冠狀病毒抗原效價滴定結(jié)果。

實施例3、酶標(biāo)用抗人IgG、IgM的辣根過氧化物酶標(biāo)記及鑒定酶標(biāo)用抗人IgG、IgM經(jīng)檢定合格后用于酶標(biāo)記。辣根過氧化物酶購自Sigma公司，RZ＞3.0。標(biāo)記方法采用改良過碘酸鈉法。
激活HRP稱取5mg HRP，溶于1ml 0.2M pH5.6醋酸鹽緩沖液中，加入新鮮配制的0.1M NaIO4 0.25ml，充分混勻，置于磁力攪拌器上充分反應(yīng)，避光反應(yīng)(150rpm)20分鐘，用1mM pH4.4的醋酸鹽緩沖液4℃充分透析24小時以除去小分子的雜質(zhì)。
與抗人IgG/IgM抗體的交聯(lián)上述激活后的HRP中加入1/4體積1.0M pH9.6碳酸鹽緩沖液，調(diào)節(jié)pH值至9.6(HRP濃度變?yōu)?mg/ml)。取1.25mg抗人IgG/IgM加入1/4體積的1.0M pH9.6碳酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH值至9.6，將抗人IgG/IgM溶液緩慢加入到激活的HRP中，室溫，避光反應(yīng)2小時。
還原Shiff堿將上述交聯(lián)后的產(chǎn)物中加入0.01ml 5mg/ml的NaBH4，充分混勻后4℃避光靜置2小時。
除去小分子雜質(zhì)將上述的交聯(lián)產(chǎn)物對0.01MpH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)充分透析16小時。
去除游離未標(biāo)記的HRP從透析袋取出液體，緩慢加入等體積的飽和(NH4)2SO4，充分混勻后4℃靜置過夜，離心4000rpm 20分鐘，收集沉淀，用0.01MpH7.4的PBS溶解沉淀，對0.01M pH7.4 PBS充分透析16小時。
標(biāo)記抗體經(jīng)Sephadex G-50柱層析，收集第一峰，合并樣品管，濃縮。
保存加入等體積滅菌甘油，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 酶標(biāo)記抗體外觀澄清、無混濁、無沉淀?；钚詸z定用HCV系統(tǒng)檢測酶標(biāo)記抗體的敏感性和特異性，結(jié)果見表2。結(jié)果表明該酶標(biāo)抗體敏感性和特異性良好，可用于SARS系統(tǒng)。
表2.酶標(biāo)記的抗體活性檢定結(jié)果。

實施例4合適的抗原抗體反應(yīng)條件及時間的確定在上述實施例確定的包被抗原及酶標(biāo)第二抗體濃度下，采用如前述的酶標(biāo)板和反應(yīng)緩沖液，研究適于抗原抗體反應(yīng)形成免疫結(jié)合復(fù)合物的條件。選用弱、中、強(qiáng)3個陽性血清及陰性對照，按照實施例6中詳細(xì)描述的操作方法進(jìn)行間接法實驗。通過在37℃條件下分別反應(yīng)20、30、60、90、120分鐘，標(biāo)記抗體反應(yīng)20、30、60分鐘，顯色10分鐘。
1)當(dāng)酶標(biāo)第二抗體為IgM時，所測的OD值在60分鐘時達(dá)到最高值。故選擇反應(yīng)時間為60分鐘。
2)當(dāng)酶標(biāo)第二抗體為IgG時，所測的OD值在30分鐘時達(dá)到最高值。故選擇反應(yīng)時間為30分鐘。實施例5間接法免疫檢測樣品的陽性閾值cut-off的確定1)酶標(biāo)第二抗體為IgG按照實施例6所述免疫檢測的方法，檢測300份經(jīng)間接ELISA法確定為陰性的正常義務(wù)獻(xiàn)血員血清，取正態(tài)分布值進(jìn)行統(tǒng)計分析。得均值為0.021，SD為0.004。設(shè)定陽性閾值為0.18+陰性對照均值。
檢測1000份正常獻(xiàn)血員隨機(jī)血清標(biāo)本，將S/Co比值進(jìn)行正態(tài)統(tǒng)計分析，同時檢測10份臨床確診SARS的患者血清標(biāo)本，分析S/Co值，設(shè)定Cut-off值。檢測1000份正常獻(xiàn)血員隨機(jī)血清標(biāo)本，陰性對照OD值低于0.05按0.05計算，高于0.05按實際值計算，計算A值，將A值進(jìn)行正態(tài)統(tǒng)計分析，均值為0.05，標(biāo)準(zhǔn)差(SD)為0.044。以均值+3倍標(biāo)準(zhǔn)差＝0.05+3×0.044＝0.182Cut-off值＝0.13+陰性對照A值其正態(tài)分布圖見圖2。
據(jù)此設(shè)定Cut-off值為判定界值。如大于Cutoff為陽性，反之為陰性。同時檢測10份臨床確診為SARS的患者血清標(biāo)本，均大于Cut-off值。
2)同理，酶標(biāo)第二抗體為IgM時，計算得Cut-off值為0.14。實施例6、間接法檢測SARS冠狀病毒抗體1)每次試驗設(shè)空白對照、陰性對照和陽性對照各1孔。空白孔不加液體；陰、陽性對照無需稀釋直接取50μl加入陰、陽性對照孔中；其余檢測孔加入樣品稀釋液，每孔100μl，再加入待測樣品10μl。充分混勻，貼上封口膠，置37℃溫育30分鐘。
2)將50倍濃縮洗板液用雙蒸水50倍稀釋后用于洗滌板孔。
3)棄去各孔中樣品，每孔加滿洗液，靜置數(shù)秒后棄去，重復(fù)5次，拍干。
4)每孔加入酶標(biāo)抗人IgG工作液100μl，貼上封口膠。置37℃溫育20分鐘。
5)棄去各孔中液體，用洗板液反復(fù)洗滌5次，拍干。
6)每孔加入底物液A 50μl，再加入底物液B 50μl，輕拍混勻，置37℃避光溫育10分鐘。
7)顯色完畢后，每孔加入終止液50μl，輕拍混勻，立即以空白孔調(diào)零，置酶標(biāo)儀450nm波長下測定OD值(參考波長為630nm)。實施例7、SARS冠狀病毒檢測試劑盒的組成本發(fā)明優(yōu)選的SARS冠狀病毒檢測試劑盒由以下幾個部分組成包被抗原SARS冠狀病毒全病毒裂解液；抗原包被板為國產(chǎn)96孔可拆板，按照實施例4所述包被SARS冠狀病毒全病毒裂解液；酶標(biāo)抗體辣根過氧化物酶標(biāo)記的第二抗體(IgG或IgM)；陰性對照及陽性對照血清各0.2毫升，含0.05％硫柳汞，0.01％疊氮鈉；酶標(biāo)抗體工作液用含20％羊血清，0.05％硫柳汞的稀釋液將酶標(biāo)抗體稀釋至適當(dāng)?shù)男r。
底物液A0.06％過氧化脲的0.01M pH4.5檸檬酸緩沖液；底物液B0.06％TMB0.01M pH4.5檸檬酸緩沖液；終止液1M硫酸洗滌液50×PBS，含0.1％吐溫-20；抗SARS冠狀病毒陽性血清OD值當(dāng)在0.13(IgG)陰性對照均值以上。
抗SARS冠狀病毒陰性血清OD值當(dāng)在0.13(IgG)以下。
抗SARS冠狀病毒陽性血清OD值當(dāng)在0.11(IgM)陰性對照均值以上。
抗SARS冠狀病毒陰性血清OD值當(dāng)在0.11(IgM)以下。
間接法檢測SARS冠狀病毒抗體試劑盒說明書一份。
權(quán)利要求
1.一種檢測SARS冠狀病毒抗體的方法，其特征在于具體檢測步驟如下1)利用純化的全病毒裂解液包被一種固相支持物；2)將待檢測的生物學(xué)樣本加入經(jīng)包被的固相支持物上，在適合形成抗原抗體免疫結(jié)合復(fù)合物的條件下孵育；3)清洗去除任何未結(jié)合的SARS冠狀病毒抗體；4)加入經(jīng)標(biāo)記的針對人抗體的第二抗體，在適合形成抗原抗體免疫復(fù)合物的條件下孵育；5)清洗去除任何未結(jié)合的第二抗體；6)檢測孵育混合物中抗原抗體免疫結(jié)合復(fù)合物的存在。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測SARS冠狀病毒抗體的方法，其特征在于所說的生物學(xué)樣本是指來自受試者的血液、血清、血漿、尿樣、體液、唾液和其它分泌物或排泄物以及組織或細(xì)胞提取物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測SARS冠狀病毒抗體的方法，其特征在于所說的固相支持物包括有機(jī)和無機(jī)多聚物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測SARS冠狀病毒抗體的方法，其特征在于所說的適合形成抗原抗體免疫復(fù)合物的條件，是指可以孵育抗原與含抗體的樣品的混合物的適當(dāng)?shù)臏囟燃皶r間條件，其中溫度為0-50攝氏度，時間約20分鐘至約48小時。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種檢測SARS冠狀病毒抗體的方法，其特征在于所說的權(quán)利要求4中所述的條件，其中溫度為4-30攝氏度，時間為20分鐘至4小時。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測SARS冠狀病毒抗體的方法，其特征在于所說的第二抗體是抗IgG抗體和/或抗IgM或IgA抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測SARS冠狀病毒抗體的方法，其特征在于所說的第二抗體是用放射性同位素標(biāo)記的，或者是用辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶進(jìn)行標(biāo)記。
8.一種檢測SARS冠狀病毒抗體的試劑盒，其特征在于其試劑盒組成為1)包被抗原SARS冠狀病毒全病毒裂解液；2)抗原包被板采用為國產(chǎn)96孔可拆板，并包被SARS冠狀病毒全病毒裂解液3)酶標(biāo)抗體辣根過氧化物酶標(biāo)記的第二抗體(IgG或IgM或IgA)；4)陰性對照及陽性對照血清含0.05％硫柳汞，0.01％疊氮鈉；5)酶標(biāo)抗體工作液用含20％羊血清，0.05％硫柳汞的稀釋液將酶標(biāo)抗體稀釋至適當(dāng)?shù)男r；6)底物液A0.06％過氧化脲的0.01M pH4.5檸檬酸緩沖液；底物液B0.06％TMB0.01M pH4.5檸檬酸緩沖液；7)終止液1M硫酸；8)洗滌液PBS，含0.1％吐溫-20；9)間接法檢測SARS冠狀病毒抗體試劑盒說明書一份。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種檢測SARS冠狀病毒抗體的試劑盒，其特征在于所說的SARS冠狀病毒全病毒裂解液是采用Vero-E6細(xì)胞接種病毒后培養(yǎng)，經(jīng)超聲裂解純化而得到的。
全文摘要
本發(fā)明提供了公開了一種檢測SARS冠狀病毒抗體的方法及其試劑盒。具體檢測步驟如下(1)利用純化的全病毒裂解液包被一種固相支持物；(2)將待檢測的生物學(xué)樣本加入經(jīng)包被的固相支持物上，在適合形成抗原抗體免疫結(jié)合復(fù)合物的條件下孵育；(3)適度清洗去除任何未結(jié)合的SARS冠狀病毒抗體；(4)加入經(jīng)標(biāo)記的針對人抗體的第二抗體，在適合形成抗原抗體免疫復(fù)合物的條件下孵育；(5)適度清洗去除任何未結(jié)合的第二抗體；(6)定量檢測孵育混合物中抗原抗體免疫結(jié)合復(fù)合物的存在。本發(fā)明解決了臨床對SARS冠狀病毒感染者的快速診斷問題，具有較高的準(zhǔn)確性，為臨床檢測該病提供了快速、準(zhǔn)確的診斷方法。
文檔編號G01N33/536GK1469126SQ0311666
公開日2004年1月21日 申請日期2003年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月26日
發(fā)明者汪建, 祝慶余, 方健秋, 秦鄂德, 文潔, 于曼, 牟峰, 司炳銀, 陳唯軍, 劉斯奇, 胡詠武, 殷劍寧, 王俊, 楊煥明, 汪 建 申請人:杭州華大基因研發(fā)中心, 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所