專利名稱：一種對樣品中的目標(biāo)物進(jìn)行定性和/或定量分析的方法及其檢測裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種對樣品中、特別是生物樣品中的目標(biāo)物進(jìn)行定性和/或定量分析的檢測方法及其檢測裝置。
背景技術(shù)：
對樣品中、特別是生物樣品中的目標(biāo)物進(jìn)行定性和/或定量分析的方法，其范圍很廣，其中基于探針-目標(biāo)物特異性反應(yīng)的一類的基本原理為使探針與樣品中的目標(biāo)分子進(jìn)行特異反應(yīng)，再分析此一特異反應(yīng)的結(jié)果。此類分析方法的基本步驟為準(zhǔn)備一種含探針反應(yīng)器的裝置、使樣品與所述反應(yīng)器接觸并進(jìn)行相關(guān)反應(yīng)、分析所述反應(yīng)結(jié)果。由于所用的探針反應(yīng)器裝置的不同，衍生出很多定性和/或定量分析的方法，例如，生物芯片法、PCR法、快速檢測試劑條法、ELISA法、免疫熒光法、等等。
在本發(fā)明中，定性和/或定量分析方法中的“檢測裝置”，是指定性和/或定量分析方法中包含有反應(yīng)器的相關(guān)裝置，其中反應(yīng)器中固定有用以同樣品中的目標(biāo)分子發(fā)生特異反應(yīng)的探針，例如生物芯片或生物芯片試劑盒、快速檢測試劑條或快速檢測試劑盒、酶標(biāo)板或酶標(biāo)板試劑盒、等等；“生物芯片”是指定性和/或定量分析方法中的一種檢測裝置，其反應(yīng)器中探針同樣品中的目標(biāo)分子發(fā)生特異反應(yīng)的結(jié)果可以以可尋址的方式進(jìn)行識別；“生物芯片法”是指利用生物芯片對樣品中、特別是生物樣品中的目標(biāo)物進(jìn)行定性和/或定量分析的方法。
最常用的生物芯片是多肽芯片和基因芯片。多肽芯片是以多個(gè)氨基酸的序列結(jié)構(gòu)(包括蛋白質(zhì))作為探針固定在基板上制備的生物芯片?；蛐酒怯么龣z標(biāo)本中核酸、核苷酸與互補(bǔ)核酸、核苷酸探針雜交，形成雜交體，或與特異性抗體結(jié)合，再用呈色反應(yīng)顯示檢測結(jié)果的芯片。生物芯片有著廣泛的應(yīng)用范圍，包括基因表達(dá)檢測、基因篩選、藥物篩選、疾病診斷治療、環(huán)境監(jiān)測和治理、司法鑒定等領(lǐng)域。生物芯片的核心是其中固定的探針。生物芯片的探針，包括所有可以固定在固相載體上的具有生物活性的物質(zhì)，例如抗原、抗體、單鏈和多鏈DNA、RNA、核苷酸、配體、配基、多肽、細(xì)胞、組織成分等生物成分。
下面簡單地說明現(xiàn)有以生物芯片為基礎(chǔ)的定性和/或定量分析方法及檢測裝置尚待解決的問題。
現(xiàn)有的生物芯片法，包括發(fā)光檢測方法和非發(fā)光撿測方法兩類。非發(fā)光撿測方法的例子有SELDI-TOF-MS方法(表面增強(qiáng)的激光解離和激光離子化的飛時(shí)質(zhì)譜Surface-Enhanced Laser Desorption/Ionization-Time Of Flight-MassSpectra，例如包含金屬片基的美國Ciphergen公司的ProteinChip Array系統(tǒng))。然而，目前最廣泛應(yīng)用的生物芯片檢測方法仍為發(fā)光檢測方法。發(fā)光檢測方法主要包括熒光檢測法、化學(xué)發(fā)光檢測法和復(fù)合光照射檢測法。目前，熒光檢測法中所用的片基基本上是透明玻片(例如，氨基化、醛基化、多聚賴氨酸片基)，化學(xué)發(fā)光檢測法中所用片基基本上是透明的玻片、塑料板或金屬膜(例如銀薄膜)，復(fù)合光照射檢測法中所用片基基本上可擴(kuò)散的聚合物膜(例如PVDF膜、尼龍膜、硝酸纖維膜、醋酸纖維膜等)。然而，目前以可擴(kuò)散的聚合物膜片基為基礎(chǔ)的復(fù)合光照射檢測法，其靈敏度不高；目前的化學(xué)發(fā)光檢測法靈敏度也不很高；目前的熒光檢測法，雖然靈敏度比前兩者高，但仍存在玻片片基的背景噪聲不低、活化片基成本高、檢測儀器昂貴等不足之處，影響了生物芯片法的大規(guī)模應(yīng)用?？傊壳暗纳镄酒吧镄酒?，尚待提高靈敏度和降低檢測成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明以降低生物芯片發(fā)光檢測法的成本而不降低其靈敏度、甚至提高其靈敏度為主要目標(biāo)。因而，本發(fā)明的研究選擇了“以著色劑與片基的光學(xué)反差最大化來保證或提高檢測靈敏度，降低片基技術(shù)要求擴(kuò)大片基選擇范圍，以及降低發(fā)光檢測儀器的技術(shù)要求從而擴(kuò)大儀器選擇范圍”的技術(shù)路線來實(shí)現(xiàn)此一目標(biāo)。
實(shí)際上，本發(fā)明的目標(biāo)是與目前的隱身技術(shù)的目標(biāo)相關(guān)的，隱身技術(shù)致力于使目標(biāo)與背景有最小化的反差，本發(fā)明的技術(shù)致力于使目標(biāo)與背景有最大化的反差。本發(fā)明的技術(shù)可稱為顯身技術(shù)，本發(fā)明的檢測方法可稱為顯身技術(shù)檢測方法。隱身技術(shù)的一些方法、甚至使用的一些材料(例如超黑材料等)對于達(dá)到我們的目的是特別有用的。例如，對紅外隱身技術(shù)而言，Maclean等人用反差比幅射C的大小來表示熱像儀的可探測性C＝Eo-Eb。式中Eo為目標(biāo)比輻射率，Eb為背景比幅射率，Eo和Eb分別與目標(biāo)材料和背景材料的吸收率有正比關(guān)系。對紅外隱身而言，C越大，熱像儀分辨率越高、可探測性越大。反之，C趨于零時(shí)處于隱身最佳狀態(tài)。同理，生物芯片法的靈敏度也是與目標(biāo)(例如著色劑)材料和背景(片基)材料的光學(xué)性質(zhì)的反差有關(guān)的。在我們的研究中，我們發(fā)現(xiàn)，使用反差大的片基-著色劑系統(tǒng)，可以提高目標(biāo)物-樣品反應(yīng)的可探測性，從而引入更多的生物芯片或生物芯片試劑盒新類型，增加生物芯片檢測方法的選擇自由度，以達(dá)到本發(fā)明目標(biāo)(見實(shí)施例)。
從而，本發(fā)明提供一種對樣品、特別是生物樣品中的目標(biāo)物進(jìn)行定性和/或定量分析的方法，其包括下列基本步驟a、將目標(biāo)物或含目標(biāo)物的物質(zhì)與有色生物芯片的反應(yīng)器接觸并在其中反應(yīng)，所述有色芯片反應(yīng)器含有提供有色背景的有色片基，所述反應(yīng)器中有色片基上的探針或探針-微粒的密度大于2點(diǎn)/cm2、優(yōu)選方案大于10點(diǎn)/cm2、更優(yōu)選方案大于20點(diǎn)/cm2；b、將著色劑或含有著色劑的物質(zhì)固著在a所述反應(yīng)器中反應(yīng)處，以形成有色目標(biāo)；c、將波長在200-780nm之間的單色或復(fù)合照射光線、或可使著色劑發(fā)光的其它條件應(yīng)用到b所述反應(yīng)器中；d、對c所述反應(yīng)器中光線、有色背景與有色目標(biāo)及有時(shí)還有信號檢出裝置之間的相互作用產(chǎn)生的信號光線進(jìn)行檢出；e、根據(jù)d所述檢出結(jié)果分析a所述反應(yīng)結(jié)果。
在本發(fā)明中，“芯片反應(yīng)器”或簡稱“反應(yīng)器”是指生物芯片中固定有探針陣列，在檢測時(shí)與目標(biāo)物發(fā)生特異性反應(yīng)的場所及與其連通的其它相關(guān)結(jié)構(gòu)，“片基”是指用以固定探針或探針-微粒的固相載體，“探針”是指固定在反應(yīng)器中同目標(biāo)物發(fā)生選擇性反應(yīng)以對目標(biāo)物進(jìn)行定性和/或定量分析的物質(zhì)，“探針-微?！笔侵腹潭ㄓ刑结樀奈⒚谆蚣{米尺寸的載體，探針密度單位中的一個(gè)“點(diǎn)”是指探針或/和探針-微粒固定在片基上形成的一個(gè)可區(qū)別的有邊界的區(qū)域。
在本發(fā)明中，“有色片基”是指不透明、無鏡面反光的非多孔膜片基。本發(fā)明中的有色片基除用作固相載體外，還獨(dú)立提供有色背景，因而不同于現(xiàn)在廣泛使用的無機(jī)或有機(jī)透明片基、鏡面反光的金屬箔片片基及表面粗糙度過高的多孔膜片基。在本發(fā)明中，“著色劑”是指可將目標(biāo)物在反應(yīng)器中的反應(yīng)結(jié)果以波長在200-780nm之間的光線的色別或/和飽和度或/和亮度的方式進(jìn)行標(biāo)記的標(biāo)記物質(zhì)，“自主發(fā)光物質(zhì)”是指不需外部提供照射光線而由化學(xué)或電化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生信號光線的物質(zhì)。
又一方面，本發(fā)明提供的定性和/或定量分析的方法，其中有色背景與有色目標(biāo)之間在所述相互作用中形成色別或/和飽和度或/和亮度的明顯反差、優(yōu)選方案形成最大化反差。
在本發(fā)明中，“色別”是指光譜反射中占比例最高的波長(主波長)不同形成的顏色區(qū)別，“飽和度”是指顏色的純度(含消色百分比愈大的顏色愈不飽和)，“亮度”是指顏色的明亮程度。
另一方面，本發(fā)明提供的定性和/或定量分析方法，當(dāng)其中主要由著色劑提供所述有色目標(biāo)上的信號光線時(shí)，所述片基有色背景對信號光線的光反射率小于10％。由著色劑提供所述有色目標(biāo)上的信號光線，是指著色劑自主發(fā)光(例如自主化學(xué)發(fā)光)，或在照射光線作用下發(fā)光(例如著色劑為熒光物質(zhì))，或在其它外來作用下發(fā)光(例如電化學(xué)發(fā)光)，等等。在這些情況下，有色背景的光反射率越小，則有色背景上的有色目標(biāo)的可觀測性越高。
本發(fā)明提供的定性和/或定量分析方法，其中著色劑為可提供所述有色目標(biāo)上的信號光線的物質(zhì)(例如熒光物質(zhì)和化學(xué)發(fā)光物質(zhì))，片基為其有色背景在白光下為深色(例如深紅色、深綠色、等等)、優(yōu)選方案為黑色的片基。
又一方面，本發(fā)明提供的定性和/或定量分析方法，當(dāng)其中主要由著色劑的選擇性反射提供所述有色目標(biāo)上的信號光線時(shí)，所述片基有色背景對信號光線的選擇性反射率小于10％或其非選擇性反射率大于50％。在此情況下，著色劑的選擇性反射率越大、有色背景的選擇性反射率越小或非選擇性反射率越大，則有色背景上的有色目標(biāo)的可觀測性越高。
本發(fā)明提供的定性和/或定量分析方法，其中所述著色劑為單色或接近單色的著色劑，優(yōu)選方案為在白光下主波長為紅色、綠色、藍(lán)色、青色或紫色的著色劑；所述片基為其有色背景在白光下為淺色、優(yōu)選方案為白色的片基。
又一方面，本發(fā)明提供的定性和/或定量分析方法，其中當(dāng)主要由著色劑的非選擇性反射提供所述有色目標(biāo)上的信號光線時(shí)，所述基片有色背景非選擇性反射率大于50％或者小于10％。在此情況下，著色劑的非選擇性反射率越大、有色背景的非選擇性反射率越小，或者著色劑的非選擇性反射率越小、有色背景的非選擇性反射率越大，則有色背景上的有色目標(biāo)的可觀測性越高。
本發(fā)明提供的定性和/或定量分析方法，其中所述著色劑為黑色或深色的著色劑，所述片基為其有色背景在白光下為淺色(例如淺黃色片基、淺灰色片基、等等)、優(yōu)選方案為白色的片基；或者所述著色劑為淺色或白色的著色劑，所述片基為其有色背景在白光下為深色(例如深紅色、深綠色、等等)、優(yōu)選方案為黑色的片基。特征在于所述著色劑為黑色或深色(例如深紅色、深綠色、等等)，所述片基有色背景在白光下為淺色(例如淺黃色片基、淺灰色片基、等等)、優(yōu)選方案為白色。
又一方面，本發(fā)明提供一種生物芯片，其特征在于其反應(yīng)器中至少包含有色片基與探針或/和探針微粒，所述反應(yīng)器中有色片基上的探針或探針-微粒的密度大于2點(diǎn)/cm2、優(yōu)選方案大于10點(diǎn)/cm2、更優(yōu)選方案大于20點(diǎn)/cm2。所述有色片基與本發(fā)明提供的定性和/或定量分析方法中上述有色片基相同。
本發(fā)明提供的生物芯片，其有色片基包括一元有色材料片基、有色涂層-結(jié)構(gòu)片片基、有色膜片-結(jié)構(gòu)片片基、最小化反射結(jié)構(gòu)層-有色結(jié)構(gòu)片片基、透過-有色材料片基和納米有色材料片基。
在本發(fā)明中，“一元有色材料片基”是指由同一種有色材料形成所述有色背景和片基結(jié)構(gòu)的片基，“有色涂層-結(jié)構(gòu)片片基”是指由有色涂層形成所述有色背景而其它材料形成片基幾何結(jié)構(gòu)的片基，“有色膜片-結(jié)構(gòu)片片基”是指由有色膜片形成所述有色背景而其它材料形成片基幾何結(jié)構(gòu)的片基，“最小化反射結(jié)構(gòu)層-有色結(jié)構(gòu)片片基”是指由反射結(jié)構(gòu)層和有色結(jié)構(gòu)片形成所述有色背景的片基，“透過-有色材料片基”是指由透明或?yàn)V光材料與有色材料共同形成所述有色背景的片基，“納米有色材料片基”是指由納米有色材料形成所述有色背景的片基。
本發(fā)明提供的生物芯片，其特征在于其片基中形成所述有色背景的有色材料、透明材料和濾光材料中，含有下述一種或多種有機(jī)物硝化纖維素、聚苯乙烯、聚丙烯酸脂、聚砜、聚醚砜、聚氯乙烯、氨基樹脂，等等。實(shí)際上，所有附合上述“顯色技術(shù)”原理、可直接連接探針或間接連接探針(例如通過微?；蚋男跃鄱嗵亲鬟B接介質(zhì))而不喪失探針活性的有色物質(zhì)均可制作有色片基。
本發(fā)明提供的生物芯片，其納米有色材料片基中，所述納米微粒平均粒徑為1-500nm、分布于片基局部或全部表面、或分布于有色材料層中。實(shí)際上，納米微粒在本發(fā)明的有色片基中，可控制有色片基與著色劑之間色別或/和飽和度或/和亮度反差，和/或片基頂面表面親水性。很多文獻(xiàn)巳證明，納米微?？梢愿淖儾牧系墓鈱W(xué)性質(zhì)(例如透光性、光吸收率、表面光澤度、等等)。納米材料巳用于“隱身技術(shù)”。又一方面，加入具有親水性的納米微粒又可以改進(jìn)疏水表面的疏水性(某些有色涂料片基往往具有疏水表面)，而適當(dāng)?shù)钠H水性又是生物芯片穩(wěn)定性等反應(yīng)活性的重要控制基礎(chǔ)之一。
本發(fā)明提供的生物芯片，其納米有色材料片基中的一納米微粒，包括金、釩、鉛、銀、鐵及其氧化物微粒，氧化硅、氧化鈦、氧化鋁微粒，塑料、多糖、乳膠、樹脂和其它高分子材料微粒，還包括上述微粒修飾結(jié)合有功能基團(tuán)和/或功能物的微粒衍生物。
又一方面，本發(fā)明提供的生物芯片，其探針包括配體、配基、抗原、抗體、多肽、蛋白質(zhì)和單鏈或多鏈DNA、RNA、核苷酸，其探針-微粒為平均粒徑尺寸為0.1nm-10um、優(yōu)選方案為1-100nm的微粒與探針的連接物。
又一方面，本發(fā)明提供的生物芯片，其有色片基上固定探針或/和探針微粒處及其周圍區(qū)域，在白光下看上去是下列之一種顏色黑色，主波長為紅色、綠色、藍(lán)色、青色或紫色的深色，白色，及主波長為紅色、黃色、綠色、藍(lán)色、青色或紫色的淺色。
另一方面，本發(fā)明提供的生物芯片，其特征在于所述有色片基上提供有色背景的表面的粗糙度Ra在0.02-3.0um之間、優(yōu)選方案在0.25-3.0um之間。在一些情況中，表面光潔度太高并不有利于提高所述有色背景與有色目標(biāo)之間的色別或/和飽和度或/和亮度的反差。
又一方面，本發(fā)明提供一種生物芯片試劑盒，其特征在于其含有有色生物芯片和著色劑或含著色劑的物質(zhì)。本發(fā)明生物芯片試劑盒中的有色生物芯片，同于上述有色生物芯片。本發(fā)明生物芯片試劑盒中的著色劑或含著色劑的物質(zhì)，同于本發(fā)明提供的定性和/或定量分析方法中上述著色劑或含著色劑的物質(zhì)。
本發(fā)明提供的生物芯片試劑盒，其著色劑包括目前已用作生物芯片標(biāo)記物質(zhì)的熒光物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光催化劑、顯色和發(fā)光底物、有色金屬或有色金屬鹽，以及目前尚未用作生物芯片標(biāo)記物質(zhì)的有機(jī)及無機(jī)染料、顏料；其含有著色劑的物質(zhì)包括著色標(biāo)記物、納米微粒著色標(biāo)記物和分子載體著色標(biāo)記物。
在本發(fā)明中，“著色標(biāo)記物”是指含有著色劑和標(biāo)記配基的標(biāo)記物，“納米微粒著色標(biāo)記物”是指含有著色劑和標(biāo)記配基的、用作標(biāo)記物的納米尺寸的微粒，“分子載體著色標(biāo)記物”是指含有著色劑、標(biāo)記配基與它們的分子載體的標(biāo)記物。本發(fā)明中納米微粒著色標(biāo)記物的使用，使得著色劑的選擇范圍擴(kuò)大。實(shí)際上，結(jié)合有抗體或DNA的功能化二、六族半導(dǎo)體納米粒子，結(jié)合有抗體的稀土納米微粒，可結(jié)合生物物質(zhì)的不同顏色的有機(jī)物包被納米粒子，等等新的標(biāo)記物已有報(bào)道，都可以用在本發(fā)明方法中。
本發(fā)明提供的生物芯片試劑盒，其納米微粒著色標(biāo)記物中的納米微粒，為可固定配基和/或著色劑而不損失其活性、平均粒徑1-500nm的納米微粒。
本發(fā)明提供的生物芯片試劑盒，其特征在于其所含納米微粒著色標(biāo)記物中的微粒，包括金、釩、鉛、銀、鐵及其氧化物微粒；氧化硅、氧化鈦、氧化鋁微粒；塑料(例如聚苯乙烯類、聚氯乙烯類、聚丙烯類、聚丙烯酰胺類、聚酰亞胺類、聚醚酮類)、多糖(例如葡聚糖、瓊脂糖、淀粉、及它們的改性物)、乳膠、樹脂和其它高分子材料(例如尼龍)微粒，還包括上述微粒修飾結(jié)合有功能基團(tuán)和/或功能物的微粒衍生物。實(shí)際上，可固定配基和/或著色劑而不損失其生物活性的微粒很多，例如已用于生化和免疫檢測方法中的納米微球、用作藥物緩釋載體的某些納米載體，等等。
本發(fā)明提供的生物芯片試劑盒，其特征在于所述功能基團(tuán)包括氨基、?；Ⅳ然?、羥基、醛基和環(huán)氧基，等等。
本發(fā)明還提供一種生物芯片分析裝置或生物芯片試劑盒的制備方法，其具體步驟為A、提供上述有色片基、探針或/和探針-微粒，制成有所述有色背景的有色芯片；B、提供上述著色劑、配基或/和納米顆粒，制成所述有色標(biāo)記物或/和有色標(biāo)記納米微粒。
本發(fā)明生物芯片分析方法與裝置的優(yōu)點(diǎn)是就生物芯片而言，與目前占主流的透明片基比較，本發(fā)明中的有色探針板的供給范圍是非常之大，為不同分析檢測的不同需要提供了很大的自由度，為降低片基成本提供高得多的可行性；就標(biāo)記系統(tǒng)而言，由于可以使用范圍廣闊的著色劑，為利用更便利的掃描儀檢出有色背景與有色目標(biāo)之間最大化色別或/和飽和度或/和亮度反差提供了高的選擇自由度；總之，本發(fā)明生物芯片分析方法，可以在較低檢測成本條件下實(shí)現(xiàn)較高的檢測靈敏度。
具體實(shí)施例實(shí)施例1熒光顯身檢測方法和黑色生物芯片在本例中，所用生物芯片為含有黑色片基的黑色生物芯片，所用著色劑為羅丹明，所用含著色劑的標(biāo)記物為羅丹明標(biāo)記的羊抗人二抗(美國JacksonImmunoRresearch Laboratories公司)，所用參照片基為尺寸75×25×1mm的透明氨基改性玻片(美國Telechem International公司，以下記作片基0)。
本實(shí)施例步驟如下-黑色片基的制備本實(shí)施例所制備的黑色背景片基為一元黑色材料片基、黑色涂層-結(jié)構(gòu)片片基、黑色膜片-結(jié)構(gòu)片片基和透明-黑色材料復(fù)合片基。
本實(shí)施例所制備的一元黑色材料片基為黑色塑料片基，其為熱塑性聚氯乙烯在加入槽法碳黑等填充劑后，經(jīng)模壓成型制得，尺寸為75×25×1mm，以下記作片基1。
本實(shí)施例所制備的涂層-結(jié)構(gòu)片片基為黑色有機(jī)涂層片基，涂層由自制黑色高聚物溶液形成，結(jié)構(gòu)片為尺寸75×25×1mm的透明載玻片(美國Erie Scientific公司)。本實(shí)施例所用黑色高聚物溶液，為以槽法炭黑(瀘卅天然氣化工廠)為色料、以苯為溶劑、含適量膠粘劑(膠粘劑555，成都晨光化工設(shè)計(jì)院)的聚氯乙烯黑色溶液。將聚氯乙烯黑色溶液噴涂在載玻片上，干燥后形成黑色涂層。所形成的黑膜層厚度在30um左右。盡管涂層-結(jié)構(gòu)片片基中，在結(jié)構(gòu)片的頂面和底面上都可以形成黑色涂層，本實(shí)施例中只在結(jié)構(gòu)片的頂面上形成黑色涂層。以上制備的黑色多元材料片基記作片基2。
本實(shí)施例所制備的黑色膜片-結(jié)構(gòu)片片基，其有色膜片為壓塑成型后剪裁成平面尺寸75×25mm的黑色聚氯乙烯薄膜(膜厚80um)，其結(jié)構(gòu)片為75×25×1.0mm的透明載玻片(Erie Scientific公司)。黑色聚氯乙烯薄膜通過熱貼合工藝結(jié)合在透明載玻片上頂面。所制得的片基記作片基3。
本實(shí)施例所制備的透明-黑色材料復(fù)合片基，其透明材料為75mm×25mm×15um(長×寬×厚)的聚氯乙烯薄膜，其有色材料為上述制備的黑色塑料片基。聚氯乙烯薄膜熱塑貼合在黑色塑料片基的頂面。制得的片基記作片基4。
-黑色生物芯片的制備本實(shí)施例的黑色生物芯片，是通在上述黑色片基的頂面上形成反應(yīng)器隔離結(jié)構(gòu)制得片基池，然后在片基池內(nèi)固定探針并用封閉液封閉片基池內(nèi)裸露的片基而成。
生物芯片反應(yīng)器的隔離結(jié)構(gòu)，是用高疏水有機(jī)硅涂料(成都晨光化工設(shè)計(jì)院)涂抹在上述制備的4種片基和參照片基(片基0)上，然后干燥成膜(膜厚小于0.05mm)后在片基上形成的(參考我們的另一項(xiàng)發(fā)明《一種反應(yīng)器隔離結(jié)構(gòu)高度最小化的生物芯片及制備方法》，專利申請?zhí)?3117397.7)。每1個(gè)片基形成8個(gè)片基池，每個(gè)片基池尺寸為4.5mm×4.5mm，片基池間隔離結(jié)構(gòu)寬度為4.5mm。片基0上的片基池隔離結(jié)構(gòu)直接形成于氨基化玻片的頂面上，片基1的反應(yīng)器隔離結(jié)構(gòu)直接形成于黑色塑料片基頂面上，片基2上的反應(yīng)器隔離結(jié)構(gòu)直接形成于片基頂部黑色涂層表面上，片基3上的反應(yīng)器隔離結(jié)構(gòu)直接形成于片基頂部黑色聚氯乙烯薄膜表面上、片基4上的反應(yīng)器隔離結(jié)構(gòu)直接形成于片基頂部透明薄膜表面上。
本實(shí)施例所用探針為HCV抗原(中國北京人民醫(yī)院肝病研究所)和HIV1+2抗原(中國北京人民醫(yī)院肝病研究所)。在每一個(gè)上述制備的片基池中，分別將HCV抗原(1.5mg/ml)和HIV1+2抗原溶液(1.5mg/ml)點(diǎn)樣固定形成反應(yīng)器。在一個(gè)反應(yīng)器中，兩種抗原各點(diǎn)2個(gè)直徑為200um的點(diǎn)，形成2×2陣列。包被完成后，用封閉液封閉備用。所制備的芯片，根據(jù)所使用的片基編號，分別記做芯片0、芯片1、芯片2、芯片3、芯片4。
-熒光顯身檢測方法在本實(shí)施例中，1號樣為HCV抗體陽性血清，2號樣為HIV1+2抗體陽性人血清，3號樣為陽性對照物(HCV抗體和HIV1+2抗體陽性血清對照物的混合物)，4號樣品為陰性對照物(HCV抗體和HIV1+2抗體都為陰性的血清對照物)。所有的樣品，均經(jīng)使用經(jīng)典的ELISA方法在血清20倍稀釋反應(yīng)條件下預(yù)先檢測。
實(shí)驗(yàn)時(shí)4種樣品分別加入上述芯片的反應(yīng)器中。在每一個(gè)生物芯片的4個(gè)反應(yīng)器中均分別加有1∶50稀釋的樣品。加樣量均為5ul。反應(yīng)30分鐘后洗滌5次，洗滌液每次加入量為15ul。
所用著色劑為羅丹明，標(biāo)記物為羅丹明標(biāo)記的羊抗人二抗(JacksonImmunoRresearch Laboratories公司)，加入量為5ul，反應(yīng)后洗滌5次，洗滌液每次加入量為15ul，干燥后進(jìn)行掃描。掃描儀為共聚焦激光掃描儀(Afymetrix公司GMS418芯片掃描儀)，掃描激發(fā)光波長532nm，發(fā)射光波長570nm，讀取的信號經(jīng)處理軟件(Afymetrix JAGUAR 2.0)處理，然后取平均值后得到結(jié)果如表1。
表1熒光顯身生物芯片的檢測結(jié)果

注釋表中“+”為陽性結(jié)果，“-”為陰性結(jié)果。片基反射率(％)由成都市計(jì)量監(jiān)督檢定測試所檢測。
實(shí)施例2熒光顯身檢測方法和黑色“粗糙”生物芯片在本實(shí)施例中，所用生物芯片為含有黑色“粗糙”片基的黑色“粗糙”生物芯片，所用著色劑、含著色劑的標(biāo)記物和參照片基0與實(shí)施例1相同。
本實(shí)施例步驟如下本實(shí)施例所制備的黑色“粗糙”片基為涂層-結(jié)構(gòu)片片基。涂層由黑漆形成，結(jié)構(gòu)片為尺寸75×25×1mm的透明載玻片(美國Erie Scientific公司)。本實(shí)施例所用黑漆為汽車面漆(珍珠黑，上海啟阜實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司)。噴涂黑漆在載玻片頂面，干燥后形成黑色涂層(厚度在30um左右)，記作片基21。片基21的粗糙度為(由成都市計(jì)量監(jiān)督檢定測試所檢測)。
黑色“粗糙”生物芯片的制備，除使用本實(shí)施例制備的黑色“粗糙”片基外，制備方法與例1中的制備方法相同。
本實(shí)施例熒光顯身檢測方法，除使用本實(shí)施例制備的黑色“粗糙”片基外，其它如熒光標(biāo)記物、樣品、檢測步驟均與例1相同。
同例1，掃描儀為共聚焦激光掃描儀(Afymetrix公司GMS 418芯片掃描儀)，掃描激發(fā)光波長532nm，發(fā)射光波長570nm，讀取的信號經(jīng)處理軟件(AfymetrixJAGUAR 2.0)處理。所得結(jié)果如表2。
表2熒光顯身生物芯片的檢測結(jié)果

注釋表中“+”為陽性結(jié)果，“-”為陰性結(jié)果。片基粗糙度由成都市計(jì)量監(jiān)督檢定測試所檢測。
實(shí)施例3復(fù)合光顯身檢測方法和白色生物芯片在本實(shí)施例中，所制備及所用生物芯片為含有白色片基的白色生物芯片，所用參照片基0與實(shí)施例1相同。
本實(shí)施例步驟如下-白色片基的制備本實(shí)施例所制備的白色背景片基為一元白色材料片基、白色涂層-結(jié)構(gòu)片片基和透明-白色材料復(fù)合片基。
本實(shí)施例所制備的一元白色材料片基為白色塑料片基，其為熱塑性聚氯乙烯在加入鈦白粉等填充劑后，經(jīng)模壓成型制得，尺寸為75×25×1mm，以下記作片基31。
本實(shí)施例所制備的白色涂層-結(jié)構(gòu)片片基，涂層由白色涂料形成，結(jié)構(gòu)片為尺寸75×25×1mm的透明載玻片(美國Erie Scientific公司)。本實(shí)施例所用白漆為川洋自動(dòng)噴漆(成都市紅光油漆廠)。在透明載玻片頂面上噴涂白漆，干燥后形成白色涂層。所形成的白膜層厚度在30um左右。以上制備的白色片基記作片基32。
本實(shí)施例所制備的透明-白色材料復(fù)合片基，其透明材料分別為75mm×25mm×15um(長×寬×厚)的聚氯乙烯薄膜和參照基片0，其白色材料分別為白色塑料片基31和白色涂層(川洋自動(dòng)白色噴漆，成都市紅光油漆廠)。聚氯乙烯薄膜熱塑貼合在白色塑料片基的頂面，制得的片基記作片基33。白色自動(dòng)噴漆噴涂在透明載玻片的底面，干燥成白色膜，制得的片基記作片基34。
-白色生物芯片的制備本實(shí)施例的白色生物芯片的制備，除使用本實(shí)施例制備的白色片基外，制備方法與例1中的制備方法相同。其中的反應(yīng)器，在31上是形成于白色塑料片基頂面上，在片基32上是形成于片基頂部白色涂層表面上，在片基33上是形成于片基頂部透明薄膜表面上，在片基34上是形成于片基頂部氨基化玻片表面上。
在本例中，所用探針為HCV抗原(中國北京人民醫(yī)院肝病研究所)和HIV1+2抗原(中國北京人民醫(yī)院肝病研究所)。在每一個(gè)上述制備的反應(yīng)器中，分別將HCV抗原(1.5mg/ml)和HIV1+2抗原溶液(1.5mg/ml)點(diǎn)樣固定。在一個(gè)反應(yīng)池中，兩種抗原各點(diǎn)2個(gè)直徑為200um的點(diǎn)，形成2×2陣列。包被完成后，用封閉液封閉備用。所制備的芯片，根據(jù)所使用的片基編號，分別記做芯片31、芯片32、芯片33、芯片34。
-復(fù)合光顯身檢測方法在本實(shí)施例中，所用有色標(biāo)記物為膠體金標(biāo)記的羊抗人二抗(福建泉州長立生化有限公司)，所用信號放大劑為銀增強(qiáng)劑(Sigma公司)，所用樣品同實(shí)施例1。
實(shí)驗(yàn)時(shí)4種樣品分別加入上述芯片的反應(yīng)器中。在每一個(gè)生物芯片的4個(gè)反應(yīng)器中均分別加有1∶50稀釋的樣品。加樣量均為5ul。反應(yīng)5分鐘后洗滌5次，洗滌液每次加入量為15ul。
有色標(biāo)記物加入量為5ul，反應(yīng)后洗滌5次，洗滌液每次加入量為15ul，干燥后進(jìn)行掃描。掃描儀為EPSON 1260掃描儀(EPSON公司)，掃描照射光線為白光，信號光線亦為白光，讀取的信號經(jīng)處理軟件(Afymetrix JAGUAR 2.0)處理，然后取平均值后得到反應(yīng)結(jié)果(表3)
表3，白光顯身檢測芯片的檢測結(jié)果

注釋表中“+”為陽性結(jié)果，“-”為陰性結(jié)果。
實(shí)施例4應(yīng)用納米有色材料生物芯片的生物芯片檢測方法及納米有色材料生物芯片試劑盒在本實(shí)施例中，所制備及所用生物芯片為含有白色片基的白色生物芯片，所用參照片基0與實(shí)施例1相同。
本實(shí)施例步驟如下-納米有色材料片基的制備本實(shí)施例中所制備的片基為納米白色材料片基，包括納米顆粒在片基頂面表層的片基和納米顆粒在片基整個(gè)有色層中的片基。
本實(shí)施例所制備的納米顆粒在片基頂面表層的片基，所使用的白色基底為實(shí)施例3中制備的白色涂層片基(片基32)，所使用的納米材料為己高度分散的氧化硅納米粒子液(平均粒徑40nm，Sigma-Aldrich公司)。本實(shí)施例所制備的片基41，是將預(yù)先稀釋的氧化硅納米粒子液涂覆在基片32的白色有機(jī)涂層表面上制得的。
本實(shí)施例所制備的片基42，是將預(yù)先稀釋的氧化硅納米粒子液涂覆在基片32的白色有機(jī)涂層表面上局部區(qū)域內(nèi)制得的。氧化硅納米粒子液涂覆處形成片基池，隔離結(jié)構(gòu)則為末涂覆的相對疏水的白漆涂層表面。每1個(gè)片基形成8個(gè)片基池，每個(gè)片基池尺寸為4.5mm×4.5mm，片基池間隔離結(jié)構(gòu)寬度為4.5mm。
本實(shí)施例所制備的納米顆粒固定在片基整個(gè)白色層中的片基，是用己高度分散的氧化硅納米粒子液(平均粒徑40nm，Sigma-Aldchi公司)，以已選定的比例與川洋自動(dòng)噴漆(成都市紅光油漆廠)混合后，涂覆在透明載玻片(美國ErieScientific公司)的頂面，再干燥制得。所制得的片基記作片基43。
-納米有色材料生物芯片的制備本實(shí)施例中的基片42以經(jīng)具有隔離結(jié)構(gòu)。本實(shí)施例中的基片41和43，如同例1中的片基一樣，是通在片基頂面上用高疏水有機(jī)硅涂料(成都晨光化工設(shè)計(jì)院)形成反應(yīng)器隔離結(jié)構(gòu)的。每個(gè)片基上形成8個(gè)池，每個(gè)池的尺寸為4.5mm×4.5mm，池間隔離結(jié)構(gòu)寬度為4.5mm。
在本例中，所用探針同實(shí)施例1，為HCV抗原(中國北京人民醫(yī)院肝病研究所)和HIV1+2抗原(中國北京人民醫(yī)院肝病研究所)。在每一個(gè)上述制備的反應(yīng)器中，分別將HCV抗原(1.5mg/ml)和HIV1+2抗原溶液(1.5mg/ml)點(diǎn)樣固定。在一個(gè)反應(yīng)池中，兩種抗原各點(diǎn)2個(gè)直徑為200um的點(diǎn)，形成2×2陣列。包被完成后，用封閉液封閉備用。所制備的芯片，根據(jù)所使用的片基編號，分別記做芯片41、芯片42和芯片43。
-復(fù)合光顯身檢測方法在本實(shí)施例中，所用標(biāo)記物和樣品同實(shí)施例3。在本實(shí)施例中，樣品適當(dāng)稀釋，其它檢測方法同實(shí)施例3。
在本實(shí)施例中，掃描儀為EPSON 1260掃描儀(EPSON公司)，掃描照射光線為白光，信號光線亦為白光，讀取的信號經(jīng)處理軟件(Afymetrix JAGUAR 2.0)處理，然后取平均值后得到反應(yīng)結(jié)果(表4)表4納米白色材料生物芯片的檢測結(jié)果

注釋表中“+”為陽性結(jié)果，“-”為陰性結(jié)果。
實(shí)施例5應(yīng)用納米微粒著色標(biāo)記物的生物芯片檢測方法及含有納米微粒著色標(biāo)記物的生物芯片試劑盒在本實(shí)施例中，所所用參照片基0與實(shí)施例1相同，制備及所用生物芯片為納米白色材料生物芯片41。
本實(shí)施例步驟如下-納米微粒著色標(biāo)記物的制備本實(shí)施例納米微粒著色標(biāo)記物中，標(biāo)記配基為羊抗人二抗(天壇生物制品股份有限公司)，著色劑為結(jié)晶紫(成都科龍化工試劑廠)，納米微粒為平均粒徑為35nm的膠體金(福建泉州長立生化有限公司)。
本實(shí)施例著色標(biāo)記微粒的制備，是將著色劑、標(biāo)記配基與納米微粒按照預(yù)先確定的濃度和比例混合，在室溫下反應(yīng)18小時(shí)。然后，在5000r/min下離心5分鐘，去上清。再用PBS洗滌，再離心，反復(fù)三次，最后在PBS中備用。
-復(fù)合光顯身檢測方法本實(shí)施例中使用的生物芯片是固定有HCV抗原和HIV1+2抗原探針的納米白色材料生物芯片41，所加入的納米微粒著色標(biāo)記物為結(jié)晶紫納米微粒。
在本實(shí)施例中，所用樣品及檢測方法同于實(shí)施例3。
在本實(shí)施例中，掃描儀為EPSON 1260掃描儀(EPSON公司)，掃描照射光線為白光，信號光線亦為白光，讀取的信號經(jīng)處理軟件(Afymetrix JAGUAR 2.0)處理，然后取平均值后得到反應(yīng)結(jié)果(表5)。
表5， 納米微粒著色標(biāo)記物生物芯片試劑盒的檢測結(jié)果

注釋表中“+”為陽性結(jié)果，“-”為陰性結(jié)果。
權(quán)利要求
1.一種對樣品、特別是生物樣品中的目標(biāo)物進(jìn)行定性和/或定量分析的方法，其包括下列基本步驟a、將目標(biāo)物或含目標(biāo)物的物質(zhì)與有色生物芯片的反應(yīng)器接觸并在其中反應(yīng)，所述有色芯片反應(yīng)器含有提供有色背景的有色片基，所述反應(yīng)器中有色片基上的探針或探針-微粒的密度大于2點(diǎn)/cm2、優(yōu)選方案大于10點(diǎn)/cm2、更優(yōu)選方案大于20點(diǎn)/cm2；b、將著色劑或含有著色劑的物質(zhì)固著在a所述反應(yīng)器中反應(yīng)處，以形成有色目標(biāo)；c、將波長在200-780nm之間的單色或復(fù)合照射光線、或可使著色劑發(fā)光的其它條件應(yīng)用到b所述反應(yīng)器中；d、對c所述反應(yīng)器中光線、有色背景與有色目標(biāo)及有時(shí)還有信號檢出裝置之間的相互作用產(chǎn)生的信號光線進(jìn)行檢出；e、根據(jù)d所述檢出結(jié)果分析a所述反應(yīng)結(jié)果。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種對樣品、特別是生物樣品中的目標(biāo)物進(jìn)行定性和/或定量分析的方法，其特征在于所述有色背景與有色目標(biāo)之間在所述相互作用中形成色別或/和飽和度或/和亮度的明顯反差、優(yōu)選方案形成最大化反差。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種對樣品、特別是生物樣品中的目標(biāo)物進(jìn)行定性和/或定量分析的方法，其特征在于當(dāng)主要由著色劑提供所述有色目標(biāo)上的信號光線時(shí)，所述片基有色背景對信號光線的光反射率小于10％。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種對樣品、特別是生物樣品中的目標(biāo)物進(jìn)行定性和/或定量分析的方法，其特征在于所述著色劑為可提供所述有色目標(biāo)上的信號光線的物質(zhì)，所述片基為其有色背景在白光下為深色、優(yōu)選方案為黑色的片基。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種對樣品、特別是生物樣品中的目標(biāo)物進(jìn)行定性和/或定量分析的方法，其特征在于當(dāng)主要由著色劑的選擇性反射提供所述有色目標(biāo)上的信號光線時(shí)，所述片基有色背景對信號光線的選擇性反射率小于10％或其非選擇性反射率大于50％。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種對樣品、特別是生物樣品中的目標(biāo)物進(jìn)行定性和/或定量分析的方法，其特征在于所述著色劑為單色或接近單色的著色劑，優(yōu)選方案為在白光下主波長為紅色、綠色、藍(lán)色、青色或紫色的著色劑；所述片基為其有色背景在白光下為淺色、優(yōu)選方案為白色的片基。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種對樣品、特別是生物樣品中的目標(biāo)物進(jìn)行定性和/或定量分析的方法，其特征在于當(dāng)主要由著色劑的非選擇性反射提供所述有色目標(biāo)上的信號光線時(shí)，所述基片有色背景非選擇性反射率大于50％或者小于10％。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種對樣品、特別是生物樣品中的目標(biāo)物進(jìn)行定性和/或定量分析的方法，其特征在于所述著色劑為黑色或深色的著色劑，所述片基為其有色背景在白光下為淺色、優(yōu)選方案為白色的片基；或者所述著色劑為淺色或白色的著色劑，所述片基為其有色背景在白光下為深色、優(yōu)選方案為黑色的片基。
9.一種生物芯片，其特征在于其反應(yīng)器中至少包含有色片基與探針或/和探針微粒，所述反應(yīng)器中有色片基上的探針或探針-微粒的密度大于2點(diǎn)/cm2、優(yōu)選方案大于10點(diǎn)/cm2、更優(yōu)選方案大于20點(diǎn)/cm2。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種生物芯片，其特征在于所述有色片基包括一元有色材料片基、有色涂層-結(jié)構(gòu)片片基、有色膜片-結(jié)構(gòu)片片基、最小化反射結(jié)構(gòu)層-有色結(jié)構(gòu)片片基、透過-有色材料片基和納米有色材料片基。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的一種生物芯片，其特征在于其片基中形成所述有色背景的有色材料、透明材料和濾光材料中，含有下述一種或多種有機(jī)物硝化纖維素、聚苯乙烯、聚丙烯酸脂、聚砜、聚醚砜、聚氯乙烯、氨基樹脂。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的一種生物芯片，其特征在于所述納米有色材料片基中，所述納米微粒平均粒徑為1-500nm、分布于片基局部或全部表面、或分布于有色材料層中。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的一種生物芯片，其特征在于所述納米微粒，包括金、釩、鉛、銀、鐵及其氧化物微粒，氧化硅、氧化鈦、氧化鋁微粒，塑料、多糖、乳膠、樹脂和其它高分子材料微粒，還包括上述微粒修飾結(jié)合有功能基團(tuán)和/或功能物的微粒衍生物。
14.根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種生物芯片，其特征在于所述探針包括配體、配基、抗原、抗體、多肽、蛋白質(zhì)和單鏈或多鏈DNA、RNA、核苷酸，所述探針-微粒為平均粒徑尺寸為0.1nm-10um、優(yōu)選方案為1-100nm的微粒與探針的連接物。
15.根據(jù)權(quán)利要求9-14之一所述的一種生物芯片，其特征在于其有色片基上固定探針或/和探針微粒處及其周圍區(qū)域，在白光下看上去是下列之一種顏色黑色，主波長為紅色、綠色、藍(lán)色、青色或紫色的深色，白色，及主波長為紅色、黃色、綠色、藍(lán)色、青色或紫色的淺色。
16.根據(jù)權(quán)利要求9-15之一所述的一種生物芯片，其特征在于所述有色片基上提供有色背景的表面的粗糙度Ra在0.02-3.0um之間、優(yōu)選方案在0.25-3.0um之間。
17.一種生物芯片試劑盒，其特征在于其含有有色生物芯片和著色劑或含著色劑的物質(zhì)。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的一種生物芯片試劑盒，其特征在于所述著色劑包括熒光物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光催化劑、顯色和發(fā)光底物、有色金屬或有色金屬鹽、染料和顏料，所述含有著色劑的物質(zhì)包括著色標(biāo)記物、納米微粒著色標(biāo)記物和分子載體著色標(biāo)記物。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的一種生物芯片試劑盒，其特征在于其著色劑為下述之一種或多種物質(zhì)熒光素、羅丹明、氨基黑、考馬斯亮藍(lán)、銀鹽、結(jié)晶紫、膠體或納米金、膠體硒、改性炭黑、鈦白粉、化學(xué)發(fā)光催化劑、水性染料、水油兩性染料、印花涂料色漿。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的一種生物芯片試劑盒，其特征在于所述納米微粒著色標(biāo)記物，其中的納米微粒平均粒徑為1-500nm。
21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的一種生物芯片試劑盒其特征在于所述納米微粒，包括金、釩、鉛、銀、鐵及其氧化物微粒氧化硅、氧化鈦、氧化鋁微粒，塑料、多糖、乳膠、樹脂和其它高分子材料微粒，還包括上述微粒修飾結(jié)合有功能基團(tuán)和/或功能物的微粒衍生物。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的一種生物芯片試劑盒，其特征在于所述功能基團(tuán)包括氨基、?；?、羧基、羥基、醛基和環(huán)氧基。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種使用有色生物芯片對樣品、特別是生物樣品中的目標(biāo)物進(jìn)行定性和/或定量分析的方法及裝置。由于利用芯片上有色背景與有色目標(biāo)之間形成信號光線色別或/和飽和度或/和亮度的明顯反差、優(yōu)選方案形成最大化反差，增加了提高分析靈敏度的可能，及大大擴(kuò)大了片基選擇的自由度和掃描儀選擇的自由度，可以在較低檢測成本條件下實(shí)現(xiàn)較高的檢測靈敏度。
文檔編號G01N33/48GK1514244SQ0311764
公開日2004年7月21日 申請日期2003年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月8日
發(fā)明者鄒方霖, 陳春生, 王建霞, 陳寧 申請人:成都夸常科技有限公司