專利名稱：一種用于鑒別診斷非典型肺炎病原體的懸浮點(diǎn)陣系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)和生物學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及一套包括嚴(yán)重急性呼吸道綜合征冠狀病毒(Severe acute respritory syndrome-associatedcoronavirus，簡(jiǎn)稱SARS-CoV或SARS冠狀病毒)在內(nèi)的非典型肺炎病原體快速檢測(cè)熒光微球，可以用于檢測(cè)和/或鑒別診斷發(fā)燒人群、非典型肺炎疑似病例以及非典型肺炎臨床診斷病例的病原體，包括非嚴(yán)重急性呼吸道綜合征冠狀病毒感染的排查、嚴(yán)重急性呼吸道綜合征冠狀病毒感染的確診以及急性呼吸道病原體合并感染的診斷。本發(fā)明還涉及該鑒別診斷系統(tǒng)的制作、測(cè)定和計(jì)算機(jī)軟件分析處理系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
嚴(yán)重急性呼吸道綜合征(Severe Acute Respiratory Syndrome，簡(jiǎn)稱SARS(薩斯)，即非典型肺炎)是一種新型冠狀病毒所致的急性呼吸系統(tǒng)傳染病，其發(fā)病機(jī)制尚未明確，病情進(jìn)展迅速，具有較高的死亡率，已成為世界范圍內(nèi)對(duì)人類健康的一種威脅。目前在SARS疾病控制方面，主要是要控制該病的傳播和治療患者。早期隔離、早期治療可以減少疾病的傳播并降低病死率，因此準(zhǔn)確的診斷和正確的治療是關(guān)鍵；特別是在診斷方面，缺少針對(duì)SARS冠狀病毒以及其它急性呼吸道感染的常見病原體檢測(cè)方法。目前已有的針對(duì)SARS冠狀病毒的檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫反應(yīng)方法(ELISA)和基因診斷方法。ELISA方法是通過檢測(cè)病人血清中的特異抗體含量來判斷該病人是否受到SARS病毒感染。眾所周知，血清中出現(xiàn)免疫球蛋白G(IgG)的時(shí)間約在感染后10天以上，免疫球蛋白M(IgM)也在感染后約一周才可能出現(xiàn)，因此，ELISA方法不能在感染早期作為有效的SARS病毒感染的檢測(cè)方法；而且ELISA方法的敏感度和特異性均不夠理想。目前已有的基因診斷方法大多采用單純液相反應(yīng)體系(如實(shí)時(shí)熒光PCR(聚合酶鏈反應(yīng)))或單純固相反應(yīng)體系(如基因芯片)，均存在靈敏度不夠高、檢測(cè)樣本所需量較大等缺點(diǎn)。本發(fā)明鑒別診斷系統(tǒng)采用特異性寡核苷酸探針偶聯(lián)的熒光微球，雜交反應(yīng)在固-液相之間進(jìn)行，不但克服了已有基因診斷方法的上述缺點(diǎn)，而且利用熒光微球具有高載量和高通量的特點(diǎn)，可以在檢測(cè)SARS病原體的同時(shí)，檢測(cè)其它若干種嚴(yán)重急性呼吸道感染病原體，以便在發(fā)燒早期進(jìn)行非SARS冠狀病毒感染患者的排查、SARS冠狀病毒感染的確診以及急性呼吸道病原體合并感染的診斷，從而可以減少交叉感染以及制訂適宜的治療方案。
發(fā)明目的因此，本發(fā)明的目的是提供一套用于非典型肺炎病原體特異性檢測(cè)熒光微球?qū)Πl(fā)燒患者、非典型肺炎疑似病例和臨床診斷病例進(jìn)行病原體檢測(cè)的試劑及其分析處理系統(tǒng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的上述目的是通過下列技術(shù)方案實(shí)施的一種用于檢測(cè)人類常見急性呼吸道感染病原微生物的非典型肺炎病原體懸浮點(diǎn)陣鑒別診斷系統(tǒng)，其特征在于它由質(zhì)量控制樣品、生物素標(biāo)記的特異性核酸擴(kuò)增引物、非典型肺炎病原體特異性寡核苷酸探針偶聯(lián)的熒光微球和輔助試劑組成的檢測(cè)試劑盒及其計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng)。
本發(fā)明鑒別診斷系統(tǒng)的制作方法包括陽(yáng)性和陰性質(zhì)控品的制備、生物素標(biāo)記的特異性核酸擴(kuò)增引物的制備、非典型肺炎病原體特異性寡核苷酸探針偶聯(lián)熒光微球的制備及輔助試劑的配制；以及線性判別函數(shù)公式的建立、分析方程的編制和數(shù)據(jù)庫(kù)的建立。
本發(fā)明鑒別診斷系統(tǒng)可以診斷和/或鑒別診斷的非典型肺炎病原體包括屬于正粘液病毒屬的5種甲流感病毒(包括H1N2、H1N1、H2N2、H3N2、H5N1共5種亞型)、2種乙流感病毒(包括乙型流感病毒、乙流感病毒2兩種亞型)；屬于副粘液病毒屬的腺病毒、腸道病毒、副流感病毒1型、副流感病毒3型、2種呼吸道合胞體病毒(A型和B型)、人偏肺病毒(HMPV)和SARS冠狀病毒；以及其它病原體有肺炎支原體、肺炎衣原體、嗜肺軍團(tuán)桿菌，共18種。
本發(fā)明鑒別診斷系統(tǒng)中的陽(yáng)性質(zhì)控品的制備是通過人工合成具有以下特點(diǎn)的SARS冠狀病毒和其它病原體檢測(cè)靶位點(diǎn)，并在片段5’端加上了核糖核酸(RNA)合成酶T7，在3’端加SP6。合成這些基因片段的目的是用來做為體外轉(zhuǎn)錄的模板合成RNA，以此當(dāng)作陽(yáng)性質(zhì)控品來檢驗(yàn)整個(gè)檢測(cè)體系的敏感性和特異性。這些構(gòu)建的基因片段與從野生型的病原體基因組中擴(kuò)增出的靶片段完全相同，因此可能會(huì)因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室內(nèi)部污染而導(dǎo)致假陽(yáng)性的發(fā)生。為了防止由于污染造成的假陽(yáng)性，構(gòu)建時(shí)在SARS模板與微球雜交的位置加入了一段20個(gè)堿基的“突變”片段，它與野生型的相應(yīng)片段的CG含量和長(zhǎng)度都相等。得到的這個(gè)突變型模板與野生型基因片段的大小、擴(kuò)增引物等特征都相同，唯一不同的就是片段中間的檢測(cè)探針雜交序列，這個(gè)序列不會(huì)與不同顏色的野生型微球雜交，所以不會(huì)因此而造成假陽(yáng)性。
(一)、下面以合成突變型的SARS1靶序列為例，說明陽(yáng)性質(zhì)控品的設(shè)計(jì)方法A、流程見附圖1B、野生型和“突變型”SARS1靶序列的區(qū)別a)野生型SARS1靶序列設(shè)計(jì)如下序列中劃曲線的是聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物、劃實(shí)線的是與微球顆粒上的檢測(cè)雜交探針互補(bǔ)的寡苷核酸。
ttcgtgcgtggattggctttgatg agagatgctgtgggtactaacctacc b)“突變型”SARS1靶序列設(shè)計(jì)如下。它與野生型靶序列的唯一差別就是中間的二十個(gè)堿基與檢測(cè)探針雜交的序列不同gaagctattcgtcacgttcgtgcgtggattggctttgatgTGCATGGTGCAACAATCGTGagagatgctgtgggtactaacctacctctccagctaggattttctacagC、“突變型”靶序列(即陽(yáng)性質(zhì)控品)的制備a)首先合成“野生型”靶序列；b)把合成好的“野生型”靶序列從凝膠中回收出來單獨(dú)擴(kuò)增形成野生型的陽(yáng)性質(zhì)控品基因片段；c)以構(gòu)建好的“野生型”陽(yáng)性質(zhì)控品基因片段為模板，用特別設(shè)計(jì)的PCR引物(SARSm-1和SARS1-5)來合成“突變型”陽(yáng)性質(zhì)控品的3’末端；用特別設(shè)計(jì)的PCR引物(SARSm-2和SARS1-1)來合成“突變型”陽(yáng)性質(zhì)控品的5’末端?！巴蛔冃汀标?yáng)性質(zhì)控品的結(jié)構(gòu)見附圖2。
D、PCR擴(kuò)增a)經(jīng)過電泳并凝膠回收純化后再把SARSm-1，SARS1-5的產(chǎn)物和SARSm-2，SARS1-1的產(chǎn)物放到一起相互延伸，并加SARS1-1和SARS1-5為PCR引物來合成最終的特殊基因片段，即脫氧核糖核酸(DNA)片斷。利用該“特殊基因片斷”作為體外轉(zhuǎn)錄的模板，分別用T7和SP6 RNA合成酶試劑盒(Ambion，USA)合成RNA模板；b)將這些體外轉(zhuǎn)錄出來的RNA模板經(jīng)DNA酶(DNAse)作用去除模板DNA后稀釋1000倍分裝；冰凍保存，即為陽(yáng)性質(zhì)控品。使用時(shí)不與病人標(biāo)本混合而獨(dú)立在另一個(gè)試管里進(jìn)行RNA提取和反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)，或僅做RT-PCR的模板。
(二)、以SARS冠狀病毒為例，18種非典型肺炎病原體診斷和/或鑒別診斷陽(yáng)性和陰性質(zhì)控品的具體制備方法操作步驟如下A)、陽(yáng)性質(zhì)控品的制備(1)野生型模板的制備a)將(一)、C、c)所述PCR引物SARS1-5按順序編號(hào)為引物1、2、3、4、5，在擴(kuò)增儀上進(jìn)行第一次引物延伸反應(yīng)，引物為1、2和3、4，延伸反應(yīng)的程序?yàn)?4℃1分鐘，55℃ 30秒，72℃ 15秒，共30個(gè)循環(huán)，然后在72℃ 3分鐘進(jìn)行最后的延伸反應(yīng)；通過電泳凝膠純化第一次引物延伸的反應(yīng)產(chǎn)物；b)在擴(kuò)增儀上進(jìn)行第二次引物延伸反應(yīng)，引物為1和5，以及引物1、2和引物產(chǎn)物3、4，延伸反應(yīng)的程序?yàn)?4℃ 1分鐘，55℃ 30秒，72℃ 15秒，共30個(gè)循環(huán)；然后在72℃ 3分鐘進(jìn)行最后的延伸反應(yīng)，通過電泳凝膠純化第二次引物延伸的反應(yīng)產(chǎn)物；c)將純化好的產(chǎn)物用純水進(jìn)行1∶1000倍稀釋，用于擴(kuò)增野生型模板反應(yīng)的模板，具體步驟包括在擴(kuò)增儀上再次進(jìn)行引物延伸反應(yīng)，延伸反應(yīng)的程序?yàn)?5℃ 15分鐘；94℃ 1分鐘，55℃ 30秒，72℃ 15秒，共30個(gè)循環(huán)；然后在72℃ 3分鐘進(jìn)行最后的延伸反應(yīng)，最后進(jìn)行野生型模板擴(kuò)增產(chǎn)物的純化；d)擴(kuò)增產(chǎn)物的純化上述所有擴(kuò)增產(chǎn)物的純化試劑可選用不同廠家的純化試劑盒。本發(fā)明中選用的擴(kuò)增產(chǎn)物純化試劑盒為Qiagen公司的Qiaex II Agarose GelExtraction kit(Cat#20021)。
(2)突變型模板的制備步驟同(1)。
B)、陰性質(zhì)控品的制備(1)制備本發(fā)明鑒別診斷系統(tǒng)中的SARS陰性對(duì)照樣品采用構(gòu)建陽(yáng)性質(zhì)控品類似的方法，帶有20個(gè)突變堿基的陰性質(zhì)控品靶序列如下gaacaacagactactagagattaccaggCGTTGTAAGGTTAGTATAGAcgtaactacacctgtaagtacttatatgttaactaatagtgaattattatcattaatcaatgatatgcctataaca(2)使用把用SP6 RNA合成酶體外轉(zhuǎn)錄合成了的這段無關(guān)RNA模板放在核酸提取液的RNA-sol里(含苯酚和抑制RNAse的鹽)做為陰性質(zhì)控品。這樣在從病人標(biāo)本(標(biāo)本來源包括血、尿、鼻咽拭子、糞便等)里提取RNA時(shí)，每個(gè)病人標(biāo)本里都含有大約500-1000個(gè)拷貝的陰性對(duì)照模板RNA。陰性對(duì)照模板在RNA-Solv里面很穩(wěn)定。
(三)特異性擴(kuò)增引物的制備本發(fā)明鑒別診斷系統(tǒng)中的生物素標(biāo)記的特異性擴(kuò)增引物是以寡核苷酸為原料，通過核酸合成儀制備的，核酸合成儀可選用不同廠家、不同型號(hào)的產(chǎn)品，寡核苷酸的購(gòu)買及核酸片段的合成也可以委托相關(guān)的基因公司來完成。本發(fā)明中的特異性擴(kuò)增引物是委托MWG公司(美國(guó))用DNA合成儀合成的。SARS-Cov和其余若干種急性呼吸道感染病原體的核酸特異性擴(kuò)增引物的序列及其基本特性如下，本發(fā)明為SARS冠狀病毒設(shè)計(jì)了三對(duì)引物，其余病毒各設(shè)計(jì)了一對(duì)引物。

注F、R分別表示一對(duì)引物中的5’末端引物和3’末端引物；A、C、G、T分別表示一種寡核苷酸，其中A表示腺苷，C表示胞苷，G表示脫氧鳥苷，T表示脫氧胸苷。
(四)特異性探針偶聯(lián)的熒光微球
本發(fā)明鑒別診斷系統(tǒng)中的非典型肺炎病原體特異性寡核苷酸探針偶聯(lián)的熒光微球的制作材料可選用不同的高分子材料(如聚苯乙烯，聚氯乙烯，殼聚糖等)，本發(fā)明采用熒光素載量不同的聚苯乙烯微球作為探針載體，通過與18種非典型肺炎病原體特異性寡核苷酸探針進(jìn)行化學(xué)偶聯(lián)而制作，其中與聚苯乙烯熒光微球進(jìn)行共價(jià)偶聯(lián)的寡核苷酸探針在合成過程中需要在5′端進(jìn)行氨基化修飾。本發(fā)明鑒別診斷系統(tǒng)中所采用的聚苯乙烯熒光微球可選用國(guó)內(nèi)外不同公司的產(chǎn)品，本發(fā)明中選用Luminex公司產(chǎn)品。一套非典型肺炎病原體特異性寡核苷酸探針偶聯(lián)的熒光檢測(cè)特異性寡核苷酸探針序列及其制作步驟如下A)非典型肺炎病原體特異性5’末端氨基化寡核苷酸探針序列如下

注“D”表示檢測(cè)探針；Amine表示氨基；A、C、G、T分別表示一種寡核苷酸，其中A表示腺苷，C表示胞苷，G表示脫氧鳥苷，T表示脫氧胸苷。
B)寡核苷酸探針與聚苯乙烯熒光微球的偶聯(lián)
進(jìn)行偶聯(lián)的微球的濃度可以自由選擇。本發(fā)明中經(jīng)比較在三種不同條件下(2500beads/反應(yīng)；5000beads/反應(yīng)；10000beads/反應(yīng))對(duì)檢測(cè)非典型肺炎病原體靈敏度影響的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明反應(yīng)體系中偶聯(lián)微球濃度在2500-5000/50μl時(shí)，熒光讀數(shù)與偶聯(lián)微球濃度呈線性相關(guān)；當(dāng)反應(yīng)體系中偶聯(lián)微球濃度在5000-10000/50μl時(shí)，熒光讀數(shù)與偶聯(lián)微球濃度無關(guān)。因此選擇探針雜交檢測(cè)體系偶聯(lián)微球濃度為5000beads/50μl；確定每交聯(lián)1×106個(gè)乳膠顆粒所使用的交聯(lián)探針量為0.75nmol(交聯(lián)反應(yīng)體積為50ul)。
C)以SARS冠狀病毒病原體為例說明熒光檢測(cè)微球制作工藝流程(1)用超聲波儀打散聚苯乙烯熒光微球，并將容器震蕩20秒，(2)從貯存管中將1×107熒光微球分到1.5毫升的微量離心管中；用10,000×g離心1分鐘，去上清，注意不要觸動(dòng)沉淀；(3)加入1.5M 2-(N-嗎啡基)乙磺酸(pH4.5)，震蕩并用超聲波分散，加入0.75nmol的氨基化的寡核苷酸(即0.75μl的1mM溶液)，瞬時(shí)震蕩；(4)僅在使用前，加1.0毫升的無菌水到10mg的1-乙基-(3-二甲基-丙烷)氫氯化二酰亞胺中，加2.5ml的新鮮1-乙基-(3-二甲基-丙烷)氫氯化二酰亞胺溶液到微球中，瞬時(shí)震蕩。避光室溫孵育30分鐘；(5)用新鮮的1-乙基-(3-二甲基-丙烷)氫氯化二酰亞胺重復(fù)步驟上述步驟；(6)加1.0毫升的吐溫-20(0.02％w/v)，震蕩，用10,000×g離心微球1分鐘，去上清，注意不要觸動(dòng)沉淀；(7)加1.0毫升的十二烷基硫酸鈉(0.1％w/v)。震蕩，用10,000×g離心微球1分鐘，去上清，注意不要觸動(dòng)沉淀；(8)用100毫升的0.1M 2-(N-嗎啡基)乙磺酸(pH4.5)懸浮微球，將制備的微球計(jì)數(shù)，在2-8℃避光保存?zhèn)溆谩?br> (五)本發(fā)明鑒別診斷系統(tǒng)中的輔助試劑包括(1)熒光素標(biāo)記的鏈霉親和素；熒光素可選用各種不同種類的熒光素，如異硫氰酸熒光素(FITC)、四甲基異硫氰酸羅達(dá)明(TMRITC)、若丹明、藻紅蛋白等，可從有關(guān)公司購(gòu)買。本發(fā)明中使用的藻紅蛋白標(biāo)記的鏈霉親和素購(gòu)自Sigma公司。
(2)核酸提取試劑，可從相關(guān)公司購(gòu)買，本發(fā)明中采用的核酸提取試劑為OmegaBiotek公司產(chǎn)品(3)一步法逆轉(zhuǎn)錄核酸擴(kuò)增試劑、PCR產(chǎn)物純化試劑和懸浮點(diǎn)陣雜交檢測(cè)試劑，均可從相關(guān)公司購(gòu)買。本發(fā)明中采用的一步法逆轉(zhuǎn)錄核酸擴(kuò)增試劑、PCR產(chǎn)物純化試劑和懸浮點(diǎn)陣雜交檢測(cè)試劑均為Qiagen公司產(chǎn)品。
(六)本發(fā)明鑒別診斷系統(tǒng)中的計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng)是根據(jù)懸浮點(diǎn)降檢測(cè)病原體獲得的數(shù)據(jù)，并將一定數(shù)量的三類臨床病例(即發(fā)燒患者、非典型肺炎疑似病例以及臨床診斷病例)進(jìn)行分組，經(jīng)過多元逐步回歸進(jìn)行逐步判別的方法建立的三個(gè)線性判別函數(shù)方程構(gòu)建的1、在顯著差異為0.05水平下的判別(1)分組類別 例數(shù)％ 概率確診 29 0.1746990.333333疑似 96 0.5783130.333333發(fā)燒 41 0.2469880.333333(2)由此建立的三個(gè)線性函數(shù)方程的系數(shù)表如下確診 疑似 發(fā)燒常數(shù)項(xiàng)CONSTANT -37.40594 -37.73991-42.94648病毒名稱肺炎衣原體(CPN) 0.88590-0.24935 -0.52834腸道病毒(ENTV) 2.24790-0.12706 -0.71957甲流感病毒(H5N1) 8.460585.98128 -0.34751甲流感病毒(INFA) 2.293884.02736 12.05741乙流感病毒2型(INFB2) 3.618243.15499 17.76646副流感病毒1型(PIV1) 14.37190 17.06734 15.25512副流感病毒3型(PIV3) 18.09694 19.93511 12.47616呼吸道合胞病毒B型(RSVB) 5.340516.91617 -1.70636冠狀病毒(SARS1) -1.31425 -0.60170 -2.15653冠狀病毒(SARS3) 8.782129.78919 16.22203(3)臨床診斷分類與判別函數(shù)分類的比較判別函數(shù)分類臨床診斷分類確診 疑似 發(fā)燒 合計(jì)確診22 7 0 29
％ 75.8624.140.00100.00疑似982 5 96％ 9.38 85.425.21100.00發(fā)燒0140 41％ 0.00 2.44 97.56 100.00合計(jì)31 90 45 166％ 18.6754.2227.11 100.00從上表可以看出確診的正確判別率為75.86％，疑似的正確判別率為85.42％，發(fā)燒的正確率判別為97.56％?？偟呐袛嗾_率為86.75％(錯(cuò)判率為13.25％)。
(4)三個(gè)線性函數(shù)方程式如下Y診斷＝-37.40594+0.88590cpn+2.2490entv+8.46058h5n1+2.29388infa+3.61824infb2+14.3719piv1+18.09694piv3+5.34051rsvb-1.31425sars1+8.78212sars3Y疑似＝-37.73991-0.88590cpn-0.12706entv+5.98128h5n1+4.02736infa+3.15499infb2+17.06734piv1+19.93511piv3+6.91617rsvb-0.60170sars1+9.78919sars3Y發(fā)燒＝-42.94648-0.52834cpn-0.71957entv-0.34751h5n1+12.05741infa+17.76646infb2+15.25512piv1+12.47646piv3-1.706361rsvb-2.15653sars1+16.22203sars3注cpn，肺炎衣原體；entv，腸道病毒；h5n1，甲流感病毒；infa，甲流感病毒；infb2，乙流感病毒2型；piv1，副流感病毒1型；piv3，副流感病毒3型；rsvb，呼吸道合胞病毒；sars1，冠狀病毒；sars3，冠狀病毒2、在顯著性差異為0.01水平下的判別(1)分組與步驟1、(1)相同。
(2)建立的三個(gè)線性函數(shù)方程的系數(shù)表如下確診 疑似 發(fā)燒常數(shù)項(xiàng) CONSTANT -29.84871-27.95731-33.41170乙流感病毒2型(INFB2) 6.27513 6.05405 20.72240肺炎衣原體(CPN) 1.48372 0.37915 0.48398甲流感病毒(H5N1) 11.18852 8.75797 3.16586副流感病毒3型(PIV3) 19.62581 21.76331 15.29176呼吸道合胞病毒B型(RSVB) 6.74481 8.94035 1.63531冠狀病毒(SRS3) 6.85826 7.55123 14.09893
(3)臨床診斷分類與判別函數(shù)分類的比較判別函數(shù)分類臨床診斷分類 確診 疑似 發(fā)燒合計(jì)確診 20 8 1 29％ 68.97 27.59 3.45100.00疑似 10 815 96％ 10.42 84.38 5.21100.00發(fā)燒 0 4 37 41％ 0.00 9.76 90.24 100.00合計(jì) 30 9343 166％ 18.07 56.02 25.90 100.00從上表可以看出確診的正確率為68.97％，疑似的正確率為84.38％，發(fā)燒的正確率為90.24％?？偟呐袛嗾_率為83.13％(錯(cuò)判率為16.87％)。
(4)三個(gè)線性函數(shù)方程如下Y診斷＝-29.84871+1.48372cpn+11.18852h5n1+6.27513infb2+19.62581piv3+6.74481rsvb+6.85826sars3Y疑似＝-27.95731+0.37915cpn+8.75797h5n1+6.05405infb2+21.76331piv3+8.94035rsvb+7.55123sars3Y發(fā)燒＝-33.41170+0.48398cpn+3.16586h5n1+20.72240infb2+15.29176piv3+1.63531rsvb+14.09893sars3注所有英文縮寫名詞的含義同(六)、1、(4)的注解。
3、對(duì)計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng)的評(píng)價(jià)本發(fā)明鑒定診斷系統(tǒng)的分析處理系統(tǒng)的建立采用多因素逐步回歸方法。統(tǒng)計(jì)學(xué)上一般認(rèn)為多因素分析的總判斷正確率達(dá)到80％時(shí)，即認(rèn)為判別效率良好。本發(fā)明建立的分析判斷模型在顯著性差異為0.05和0.01水平時(shí)，總判斷正確率分別達(dá)到86.75％和83.13％，說明使用該分析方法進(jìn)行檢測(cè)數(shù)據(jù)分析的統(tǒng)計(jì)效果良好。
(七)本發(fā)明鑒別診斷系統(tǒng)的檢測(cè)方法，其特征在于它依次按下述步驟進(jìn)行1、一步法逆轉(zhuǎn)錄核酸擴(kuò)增a)按照下表準(zhǔn)備PCR反應(yīng)體系

注5×，代表五倍濃縮液；1×，代表工作液；RNase-free，代表不含RNA酶。
b)按如下步驟編程進(jìn)行PCR循環(huán)i. 反轉(zhuǎn)錄50℃ 30分鐘ii. 起始PCR 95℃ 15分鐘iii. 三步循環(huán) 94℃ 30秒i.55℃ 15秒ii. 72℃ 15秒iii. 共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)(據(jù)具體情況可提高到40個(gè)循環(huán))iv. 終延伸72℃ 3分鐘2、以SARS病原體為例說明非典型肺炎病原體的懸浮點(diǎn)陣系統(tǒng)檢測(cè)操作步驟a)按照下表準(zhǔn)備反應(yīng)體系10.5ul 1×TE，PH8.05.0ul 純化的RT-PCR樣品1.5ul SARS系列偶聯(lián)微球33.0ul 1.5×TAMC50ul總體積注TE，Tris-EDTA緩沖液；TAMC，四甲基氯化銨緩沖液。
b)操作步驟將樣品放置98℃中5分鐘變性，然后立即將變性的樣品置于52℃中雜交15分鐘；在樣品孵育過程中，按1∶250稀釋配制新鮮的鏈霉抗生物素-R-藻紅素(SA-PE)，即加3ul SA-PE儲(chǔ)存液(1mg/ml)到750ul 1×TMAC；孵育完成后，以最大轉(zhuǎn)速離心2分鐘沉淀熒光檢測(cè)微球，去除上清夜，保存沉淀的微球；每管加入75μl 1∶250的SA-PE液體，旋渦震蕩使微珠重新懸浮，52℃孵育5分鐘；最后在檢測(cè)儀上對(duì)熒光標(biāo)記微球進(jìn)行計(jì)數(shù)。
3、熒光標(biāo)記微球計(jì)數(shù)熒光標(biāo)記微球的計(jì)數(shù)由檢測(cè)儀完成，檢測(cè)儀可以采用不同廠家生產(chǎn)的各種熒光微球計(jì)數(shù)儀或流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀。本發(fā)明中采用的熒光微球計(jì)數(shù)儀是型號(hào)為L(zhǎng)uminex100的懸浮點(diǎn)陣分析計(jì)數(shù)儀(Luminex公司產(chǎn)品)。
4、結(jié)果計(jì)算a)根據(jù)已經(jīng)建立的三個(gè)線性判別函數(shù)方程編制計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng)；b)每個(gè)個(gè)體進(jìn)行判別時(shí)，把檢測(cè)的各變量值代入判別函數(shù)，得出判別分?jǐn)?shù)；c)從哪一個(gè)線性函數(shù)方程得出的判別分?jǐn)?shù)高，即可以判定該個(gè)體屬于哪一類臨床分組。
與其它SARS冠狀病毒檢測(cè)指標(biāo)和技術(shù)相比較，本發(fā)明鑒別診斷系統(tǒng)具有以下優(yōu)點(diǎn)a)與已有的SARS冠狀病毒檢測(cè)指標(biāo)相比較，本發(fā)明鑒別診斷系統(tǒng)的檢測(cè)指標(biāo)是SARS病毒特異性基因片斷，克服了SARS病毒特異性抗體在感染后7-10天才可能從血液中檢出、不適宜作為早期檢測(cè)SARS病毒感染指標(biāo)的缺點(diǎn)。SARS病毒特異性抗體(IgM或IgG)的已有檢測(cè)方法為酶聯(lián)免疫反應(yīng)方法(ElISA)，本發(fā)明所采用的病毒基因懸浮點(diǎn)陣熒光微球方法克服了ElISA方法所具有的敏感度不夠高、特異性不夠強(qiáng)的缺點(diǎn)。
b)與已有的SARS病毒基因檢測(cè)方法相比較，本發(fā)明鑒別診斷系統(tǒng)采用了3個(gè)SARS冠狀病毒基因探針同時(shí)檢測(cè)的設(shè)計(jì)，克服了已有的SARS病毒基因診斷方法一般只有一個(gè)基因探針的缺點(diǎn)，提高了檢測(cè)的特異性，降低了假陰性。
c)本發(fā)明鑒別診斷系統(tǒng)的基因雜交反應(yīng)是在固-液相之間進(jìn)行的，由于聚苯乙烯微球表面的羧基基團(tuán)十分豐富(球面效應(yīng))，使得其結(jié)合的檢測(cè)探針十分充足，因此雜交所需時(shí)間短暫、快速。與已有的的基因檢測(cè)方法(如基因芯片技術(shù)是單純的固相反應(yīng)，實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)是單純的液相反應(yīng))相比較，本發(fā)明鑒別診斷系統(tǒng)具有更高的敏感度和檢測(cè)效率。
d)本發(fā)明鑒別診斷系統(tǒng)采用了熒光載量不同的聚苯乙烯微球，利用微球表面豐富的羧基團(tuán)與18種病原體特異的氨基化寡核苷酸探針進(jìn)行共價(jià)偶聯(lián)，從而實(shí)現(xiàn)了包括SARS病毒在內(nèi)的18種急性呼吸道感染病原體的基因檢測(cè)可在同一試管中同時(shí)檢測(cè)的目的，與已有的SARS病毒基因檢測(cè)方法相比，具有非常明顯的操作簡(jiǎn)便、快速有效、高通量的優(yōu)點(diǎn)，克服了已有的SARS病毒基因檢測(cè)方法只針對(duì)SARS一種病毒進(jìn)行診斷、不能對(duì)其它若干種急性呼吸道病原體合并感染進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)的缺點(diǎn)，本發(fā)明鑒別診斷的檢測(cè)結(jié)果更有利于臨床上盡早采取有效、合理的治療方案，提高治愈率，降低病死率。
本發(fā)明還包括將鑒別診斷系統(tǒng)用于鑒別或者診斷嚴(yán)重急性呼吸道綜合征的方法，包括如下步驟a.非典型肺炎病原體樣本的核酸提??；b.一步法反轉(zhuǎn)錄核酸擴(kuò)增；c.聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物的純化；d.熒光微球的檢測(cè)；e.計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng)判定檢測(cè)結(jié)果。


附圖1制備陽(yáng)性質(zhì)控品的流程圖附圖2“突變型”陽(yáng)性質(zhì)控品的結(jié)構(gòu)下面用實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。應(yīng)該理解的是，本發(fā)明的實(shí)施例是用于說明本發(fā)明而不是對(duì)本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的簡(jiǎn)單改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。除非另有說明，本發(fā)明中的百分?jǐn)?shù)是重量百分?jǐn)?shù)。
實(shí)施例一非典型肺炎病原體鑒別診斷系統(tǒng)制作方法的應(yīng)用實(shí)例一、非典型肺炎病原體鑒別診斷系統(tǒng)(50人份)，其組成包括


DEPC，焦碳酸二乙酯；HiBind，代表高鍵合；TE，Tris-EDTA緩沖液；TAMC，四甲基氯化銨緩沖液。
二、具體制作方法如下1、寡核苷酸引物合成1)制備采用HPLC純化的人工合成的特異性正向與反向寡核苷酸引物，其中反向引物5’末端進(jìn)行生物素化修飾，共包括14對(duì)引物，可特異擴(kuò)增新型冠狀病毒(SARS-Cov，RNA病毒)、腸道病毒(Enterovirus，RNA病毒)、5種甲流感病毒(INF A，RNA病毒)、2種乙流感病毒(INF B，RNA病毒)、副流感病毒1型(PIV-1，RNA病毒)、副流感病毒3型(PIV-3，RNA病毒)、2種呼吸道合胞病毒(RSV，RNA病毒)、腺病毒(Adenobirus，DNA病毒)、肺炎支原體(M.Pneumoniae)、肺炎衣原體(C.Pneumoniae)、人偏肺病毒(HMPV)和嗜肺軍團(tuán)桿菌(Legi)的相關(guān)區(qū)域。寡核苷酸引物是用DNA合成儀人工合成以及生物素修飾的，所有引物在合成后經(jīng)HPLC純化，凍干，-20℃保存。
2)質(zhì)量檢定標(biāo)準(zhǔn)純度＞99％，A260nm/A280nm＞1.6，用每對(duì)引物分別反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增相應(yīng)病毒核酸，將擴(kuò)增產(chǎn)物與和微球偶聯(lián)的對(duì)應(yīng)檢測(cè)探針進(jìn)行雜交，懸浮點(diǎn)陣檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性；與其它探針偶聯(lián)微球雜交結(jié)果為陰性。
2、5’末端氨基化寡核苷酸探針制備1)制備采用HPLC純化的特異性人工合成的寡核苷酸探針，5’末端氨基修飾，18種探針分別特異性結(jié)合如前所述18種引物相對(duì)應(yīng)的病毒核酸區(qū)域。所有探針在合成后經(jīng)HPLC純化，凍干，-20℃保存。
2)質(zhì)量檢定標(biāo)準(zhǔn)純度＞99％，A260nm/A280nm＞1.6，將氨基化的檢測(cè)探針與微球進(jìn)行偶聯(lián)，然后用與被檢測(cè)探針互補(bǔ)的5’端生物素化修飾的反義探針進(jìn)行雜交，懸浮點(diǎn)陣檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性；與其它反義探針雜交結(jié)果為陰性。
3、熒光檢測(cè)微球的制備本發(fā)明鑒別診斷系統(tǒng)中使用的熒光檢測(cè)微球是由Luminex公司提供的。
1)制備一種具有高度的物理學(xué)和熱力學(xué)穩(wěn)定性的表面羧基化的聚苯乙烯微球顆粒被采用。上百種不同顏色的熒光標(biāo)記染料分別為每一個(gè)微球標(biāo)記上不同的熒光顏色，這些不同的熒光顏色作為微球的特定編碼，為微球在Luminex100TM系統(tǒng)中設(shè)定了特定的光譜地址，可被LUMINEX 100TM系統(tǒng)檢測(cè)到。
將5’末端氨基化修飾的寡核苷酸探針用無菌純水稀釋至DNA濃度為1nmol/μl。通過共價(jià)偶聯(lián)的方式分別包被于相應(yīng)熒光編碼的表面羧基化微球，2-8℃避光保存。
2)質(zhì)量檢定標(biāo)準(zhǔn)每種微球分群的差錯(cuò)率應(yīng)＜0.5％，每種微球分群的準(zhǔn)確率應(yīng)＞98％，每種空白微球1000個(gè)的熒光強(qiáng)度應(yīng)＜104、陽(yáng)性質(zhì)控品的制備1)制備以SARS1為例1000-2000個(gè)拷貝SARS1 MT模板擴(kuò)增純化產(chǎn)物。
2)質(zhì)量檢定標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增陽(yáng)性質(zhì)控品，擴(kuò)增產(chǎn)物與所有探針偶聯(lián)微球雜交，懸浮點(diǎn)陣檢測(cè)，對(duì)應(yīng)探針檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，其它探針檢測(cè)結(jié)果為陰性。
5、陰性質(zhì)控品的制備1)制備1000-2000個(gè)拷貝RSVm模板擴(kuò)增純化產(chǎn)物。
2)質(zhì)量檢定標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增陰性質(zhì)控品，擴(kuò)增產(chǎn)物與所有探針偶聯(lián)微球雜交，懸浮點(diǎn)陣檢測(cè)，對(duì)應(yīng)探針檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，其它探針檢測(cè)結(jié)果為陰性。
6、核酸提取試劑的制備1)制備由Omega Biotek公司提供，包括RNA Solv、RNA洗液I、RNA洗液II(5×)、水(經(jīng)DEPC處理)、HiBind RNA玻璃纖維離心柱和收集管、2ml收集管等組份?？梢酝瑫r(shí)提取DNA病毒和RNA病毒的核酸。
2)質(zhì)量檢定標(biāo)準(zhǔn)用該試劑提取純化250μl SRAS病毒培養(yǎng)上清的病毒核酸，A260nm＞0.02，A260nm/A280nm＞1.8。
7、一步法遞轉(zhuǎn)錄核酸擴(kuò)增(RT-PCR)試劑的制備1)制備由Qiagen公司提供，包括一步法RT-PCR酶混合液、5×RT-PCR緩沖液、dNTP、水(RNase free)等組份。用于病毒核酸的體外反轉(zhuǎn)錄與PCR擴(kuò)增。
2)質(zhì)量檢定標(biāo)準(zhǔn)用5μl濃度為1ng/μl的SARS病毒核酸反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增，取經(jīng)過PCR產(chǎn)物純化的5μl擴(kuò)增產(chǎn)物與所有探針偶聯(lián)微球混合物雜交，懸浮點(diǎn)陣檢測(cè)結(jié)果相應(yīng)探針為陽(yáng)性，除RSVm外其它探針為陰性。
8、PCR產(chǎn)物純化試劑的制備1)制備由Qiagen公司提供，包括HiBind DNA玻璃纖維離心柱和收集管等組份。
用于一步法RT-PCR反應(yīng)后的產(chǎn)物純化。
2)質(zhì)量檢定標(biāo)準(zhǔn)用5μl濃度為1ng/μl的SARS病毒核酸反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過PCR產(chǎn)物純化后核酸純度A260/A280＞1.6。
9、懸浮點(diǎn)陣雜交檢測(cè)試劑的制備由Qiagen公司提供，包括1.5×TMAC，1×TE，SA-PE等組分。用于純化后的一步法RT-PCR產(chǎn)物的懸浮點(diǎn)陣檢測(cè)。
三、本發(fā)明技術(shù)制備的非典型肺炎病原體鑒別診斷系統(tǒng)的質(zhì)量檢測(cè)1)檢測(cè)極限以SARS1為例，將SARS1陽(yáng)性質(zhì)控品連續(xù)10-1梯度稀釋3次，分別經(jīng)核酸提取、反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增、擴(kuò)增產(chǎn)物純化、雜交、懸浮點(diǎn)陣檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的最低濃度不高于100拷貝。以SARS1模板DNA進(jìn)行過柱純化后，以UV分光光度計(jì)進(jìn)行DNA含量的測(cè)定，同時(shí)以瓊脂糖電泳檢查對(duì)比濃度。得到約2ng/ul的模板濃度，然后以此模板濃度進(jìn)行10倍梯度稀釋，以此稀釋產(chǎn)物1μl為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)、PCR產(chǎn)物純化、核酸雜交，用Luminex100TM懸浮點(diǎn)陣檢測(cè)，結(jié)果見下表。PCR反應(yīng)結(jié)束后，瓊脂糖電泳檢查反應(yīng)結(jié)果。用1D圖象分析軟件進(jìn)行紫外分析并照相，擴(kuò)增產(chǎn)物灰度掃描得A值，SARS1擴(kuò)增片段的A值與DNA MARKER相比較得出擴(kuò)增片段的濃度為2ng/μl，，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為109bp，得到每μl的分子數(shù)(即為拷貝數(shù))為1.9×108，則起始模板的檢測(cè)極限濃度為1.9×108×2。
編號(hào) 模板量SARS1雜交結(jié)果1 1.9×108×2 1172 1.9×1081603 1.9×107338.54 1.9×106368.55 1.9×1054996 1.9×1044397 1.9×1033548 1.9×10286
9 1.9×1019110 background 482)準(zhǔn)確性包括陽(yáng)性質(zhì)控品符合率，即以10份陽(yáng)性質(zhì)控品檢測(cè)結(jié)果不得出現(xiàn)假陰性；陰性質(zhì)控品符合率，即以10份正常人全血檢測(cè)結(jié)果不得出現(xiàn)假陽(yáng)性。在上述條件下用SARS1探針重復(fù)檢測(cè)同一種陽(yáng)性質(zhì)控品、正常人全血標(biāo)本各10次。結(jié)果如下

3)精密度將含102個(gè)SARS病毒拷貝參考品作為精密性參考品，連續(xù)十次分別經(jīng)核酸提取、反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增、擴(kuò)增產(chǎn)物純化、雜交、懸浮點(diǎn)陣檢測(cè)本系統(tǒng)精密性。計(jì)算每次測(cè)定結(jié)果，求出均值、SD和變異系數(shù)CV。精密度試驗(yàn)結(jié)果顯示批間CV≤20％4)靈敏度和特異性通過檢測(cè)臨床確診的SARS冠狀病毒感染樣本20份以及正常樣本80份驗(yàn)證試劑盒的檢測(cè)域值、靈敏度及特異性。按非典型肺炎病原體懸浮點(diǎn)陣鑒別診斷系統(tǒng)使用說明書操作。測(cè)試臨床樣本的結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果表明靈敏度(真陽(yáng)性率)＝100％特異性(真陰性率)＝96％假陽(yáng)性率＝0假陰性率＝4％實(shí)施例二非典型肺炎病原體鑒別診斷系統(tǒng)檢測(cè)方法的使用實(shí)例(一)非典型肺炎病原體樣本核酸提取標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程具體操作步驟如下1、取250μl的病人標(biāo)本與1ml RNA-Solv(綠顏色液體)在2ml離心管中混合，如果標(biāo)本少于250μl，相應(yīng)減少RNA-Solv的用量即可，樣本體積不應(yīng)超過工作終體積的20％。以下是幾種不同來源的標(biāo)本的采集處理方法1)拭子拭子浸入1ml的RNA-Solv中3分鐘，取出并棄掉拭子，接步驟3。
2)全血/血漿將250μl病人的全血/血漿與1ml RNA-Solv充分混合，接步驟3。
3)糞便在2ml離心管(RNase free)中用生理鹽水(經(jīng)DEPC處理)稀釋標(biāo)本，制成10％(wt/wt)懸液；4℃，3200×g離心15分鐘，將上清轉(zhuǎn)移，16000×g，4℃離心15分鐘去除剩余殘?jiān)Ｈ?50μl上清，與1ml RNA-Solv(綠顏色液體)在2ml離心管中混合，接步驟3。
4)尿?qū)?0-30ml尿，離心，收集沉淀物置于2ml螺口離心管中，加入1ml RNA-Solv(綠顏色液體)充分混合，接步驟3。
2、往步驟1的離心管中加入250μl氯仿，充分漩渦混合至少30秒。
3、設(shè)立空白對(duì)照以去離子水作為空白同時(shí)進(jìn)行核酸提取操作。
4、12,000×g離心10分鐘，使水相與有機(jī)相充分分層。
5、小心的將450μl上層水相移入一個(gè)新的1.5ml離心管(RNase free)中，并保持剩余水相與有機(jī)相的分層。
6、向步驟4的離心管中加入等體積的70％的乙醇，使用漩渦混合器將其充分混勻。
7、取700μl步驟5的樣品加入到HiBind RNA玻璃纖維離心柱的上部。10,000×g，離心15秒鐘，丟棄收集液，保留收集管并重新組裝。
8、如果步驟5的樣品還有剩余，將剩余樣品加到重新組裝的HiBind RNA離心柱上部。10,000×g，離心15秒鐘。
9、丟棄收集液和收集管。
10、將HiBind RNA離心柱與一個(gè)新的2ml收集管(試劑盒中已提供)組裝，并在HiBind RNA離心柱的上部加入500μl的RNA洗液I。
11、10,000×g離心15秒鐘，丟棄收集液，保留收集管并重新組裝。
12、在HiBind RNA離心柱的上部加入500μl的RNA洗液II(1X)(注意RNA WashBuffer I在使用前需加入100％的乙醇)。。
13、10,000×g離心15秒鐘，丟棄收集液，保留收集管并重新組裝。
14、在HiBind RNA離心柱中加入500μl的RNA洗液II15、10,000×g離心15秒鐘，丟棄收集液，保留收集管并重新組裝。
16、使用離心機(jī)的最高轉(zhuǎn)數(shù)離心1分鐘，將HiBind RNA離心柱殘液完全甩干。
17、將HiBind RNA玻璃纖維離心柱與一個(gè)新的1.5ml離心管(RNase free，試劑盒中未提供)組裝。
18、RNA/DNA洗脫。將50μl經(jīng)DEPC處理水(試劑盒中已提供)直接加到玻璃纖維離心柱基質(zhì)上，并且不要碰到離心柱，使用離心機(jī)的最高轉(zhuǎn)數(shù)離心1分鐘。
19、純化的RNA/DNA需立即用于RT-PCR，或者5μl/份分裝于Rnase free的螺口離心管中，凍存于-80℃直到用于RT-PCR。
(二)一步法反轉(zhuǎn)錄核酸擴(kuò)增RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程具體操作步驟如下1、將RNA模板溶解，并將其與引物、dNTP、一步法PCR緩沖液(5×)、一步法RT-PCR混合酶、水(RNase-free)放置于冰上。
2、按照下表準(zhǔn)備RT-PCR反應(yīng)體系。以7人份為例，應(yīng)至少配制10人份反應(yīng)混合液(含1個(gè)陽(yáng)性質(zhì)控品和1個(gè)空白樣品)。

3、用移液器輕輕的上、下抽吸RT-PCR反應(yīng)混合液幾次，使其充分混勻，按45μl/反應(yīng)管分裝，置于冰盤上。
4、在RT-PCR反應(yīng)管上標(biāo)記病人編號(hào)，每管中加入5μl RNA模板。
5、設(shè)立陽(yáng)性質(zhì)控樣品和空白質(zhì)控樣品(1)用由核酸提取操作中以去離子水代替樣本所得到的提取物為模板作為空白對(duì)照樣本。
(2)將陽(yáng)性質(zhì)控品取出，室溫溶解混勻，離心數(shù)秒，向含45μlRT-PCR反應(yīng)試劑的PCR反應(yīng)管中分別加入5ul陽(yáng)性質(zhì)控品作為陽(yáng)性對(duì)照樣本。
6、按如下步驟編程PCR循環(huán)A.反轉(zhuǎn)錄50℃ 30分鐘B.終止反轉(zhuǎn)錄95℃ 15分鐘C.三步循環(huán)94℃ 30秒55℃ 15秒72℃ 15秒共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)D.終延伸72℃ 3分鐘
7、先將加好試劑的PCR管放置冰上，待RT-PCR啟動(dòng)并升溫至50℃后再放入PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增循環(huán)。
(三)PCR產(chǎn)物純化標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程具體操作步驟如下1、將HiBind DNA玻璃纖維離心柱(藍(lán)色向上)插入收集管中，適當(dāng)標(biāo)記每個(gè)管；2、將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到組裝好的HiBind DNA玻璃纖維離心柱和收集管中；3、加400ul的pH8.01×TE于含有PCR產(chǎn)物的已經(jīng)組裝好的HiBind DNA玻璃纖維離心柱和收集管中；4、10,000×g離心5分鐘，棄去收集液；5、裝回離心柱；6、用400ul的pH8.01×TE沖洗；7、10,000×g離心5分鐘，離心后在收集管中剩有小體積(大約5ul)的收集液是合適的；8、將HiBind DNA玻璃纖維離心柱與新的收集管組裝；9、檢查樣品體積，在收集管中剩余的樣品體積不超過5ul；10、將45ul pH8.01×TE直接加到HiBind DNA玻璃纖維離心柱的表層，輕輕搖動(dòng)30秒；11、將HiBind DNA玻璃纖維離心柱顛倒并插入到收集管中(白邊向上)；12、10,000×g離心3分鐘，在收集管中大約45-50ul的液體既是RT-PCR純化產(chǎn)物。
(四)熒光微球測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程具體操作步驟如下1.將所有試劑恢復(fù)至室溫并震蕩混勻；將微球混合物充分渦旋振蕩至少15秒，并注意避光。(可置于黑暗處或用鋁箔包裹覆蓋)然后按如下說明配制好1×TE，1.5×TMAC和微球混合液加入至干凈的離心管中，并旋渦震蕩混勻，按45ul/test分裝至小管中。反應(yīng)體系如下10ul/test 1×TE，PH8.02ul/test SARS系列偶聯(lián)微球33.0ul/test 1.5×TAMC5.0μl/test純化的RT-PCR樣品(在步驟2中加入)50ul 總體積
2.在上述含核酸雜交試劑的小管中加入5.0ul純化的RT-PCR樣品；微球背景空白用0.5ul 1×TE代替純化的RT-PCR樣品加入含核酸雜交試劑的小管；3.將樣品放置98℃中變性5分鐘，然后立即將變性的樣品置于52℃中雜交15分鐘?？稍赑CR儀中進(jìn)行。請(qǐng)保持樣品閉光，可加入油覆蓋樣品以避光；4.在雜交反應(yīng)進(jìn)行過程中，按1∶250稀釋配制新鮮的藻紅蛋白標(biāo)記的鏈霉生物素，即加3ul SA-PE儲(chǔ)存液(1mg/ml)到750ul 1×TMAC(預(yù)先用250ul去離子水稀釋500ul 1.5×TMAC)；5.雜交完畢后，以最大轉(zhuǎn)速離心2分鐘沉淀微球，去除上清液，保存沉淀的微球。去除上清液時(shí)應(yīng)留下一些液體，以免將微球吸出；6.每管加入75ul 1∶250的SA-PE液體，旋渦震蕩使微球重新懸浮，52℃閉光保溫5分鐘(可在PCR儀中進(jìn)行)。
(五)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)1、數(shù)據(jù)有效性分析(1)微球背景空白熒光強(qiáng)度不高于100；(2)空白樣本中內(nèi)源性陰性對(duì)照與其它寡核苷酸探針雜交熒光強(qiáng)度不高于200；與自身對(duì)應(yīng)寡核苷酸探針特異性雜交熒光強(qiáng)度高于空白對(duì)照兩倍以上；(3)陽(yáng)性對(duì)照與自身對(duì)應(yīng)寡核苷酸探針特異性雜交熒光強(qiáng)度高于空白對(duì)照五倍以上。
當(dāng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)同時(shí)滿足上述3個(gè)條件，本次實(shí)驗(yàn)判為有效實(shí)驗(yàn)。
2、待測(cè)樣本分析通過三個(gè)線性函數(shù)方程分析待測(cè)樣本、對(duì)于每個(gè)個(gè)體進(jìn)行判別時(shí)，把測(cè)試的各變量值代入判別函數(shù)，得出判別分?jǐn)?shù)。從哪一個(gè)線性函數(shù)方程得出的判別分?jǐn)?shù)高，就可以判定該個(gè)體屬于哪一類臨床分組，包括發(fā)燒、非典型肺炎疑似病例和非典型肺炎臨床確診病例。以上分析均使用專用計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng)進(jìn)行。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測(cè)人類急性呼吸道感染病原體的非典型肺炎病原體懸浮點(diǎn)陣鑒別診斷系統(tǒng)，該系統(tǒng)由檢測(cè)試劑盒和計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng)組成，其中檢測(cè)試劑盒由質(zhì)量控制樣品、生物素標(biāo)記的特異性核酸擴(kuò)增引物、非典型肺炎病原體特異性寡核苷酸探針偶聯(lián)的熒光微球和輔助試劑組成，計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng)是帶有建立在多元逐步回歸基礎(chǔ)上的線性判別函數(shù)方程軟件的計(jì)算機(jī)處理系統(tǒng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的鑒別診斷系統(tǒng)，其中所述質(zhì)量控制樣品包括呼吸道感染病原體陽(yáng)性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的鑒別診斷系統(tǒng)，其中所述呼吸道感染病原體陽(yáng)性質(zhì)控品，是將寡核苷酸用核酸合成儀進(jìn)行合成后、獲得檢測(cè)非典型肺炎病原體的靶序列、用基因工程重組的方法構(gòu)建的“基因片斷”。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的鑒別診斷系統(tǒng)，其中所述生物素標(biāo)記特異性核酸擴(kuò)增引物是根據(jù)非典型肺炎病原體靶序列的特異性和同源性特點(diǎn)、用核酸合成儀將寡核苷酸按照上述特點(diǎn)進(jìn)行合成而制備的。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的鑒別診斷系統(tǒng)，其中所述非典型肺炎病原體特異性寡核苷酸探針偶聯(lián)的熒光微球，是用帶有熒光素的聚苯乙烯微球、分別與18種非典型肺炎病原體特異性寡核苷酸探針通過共價(jià)偶聯(lián)的化學(xué)反應(yīng)而制作的。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的鑒別診斷系統(tǒng)，其中所述非典型肺炎病原體特異性寡核苷酸探針是通過核酸合成儀制備，探針在5′-末端被氨基化；所述聚苯乙烯微球是羧基化的聚苯乙烯熒光微球。
7.根據(jù)權(quán)利要求6之一的鑒別診斷系統(tǒng)，其中所述計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng)是帶有根據(jù)懸浮點(diǎn)陣病原體檢測(cè)結(jié)果對(duì)感染患者進(jìn)行判別分類后，根據(jù)發(fā)燒患者、非典型肺炎疑似病例和臨床診斷病例病原體的分布建立三個(gè)線性判別函數(shù)方程，并由此編制的軟件程序的計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7之一的鑒別診斷系統(tǒng)，其中所述輔助試劑包括藻紅蛋白標(biāo)記的鏈霉親和素、核酸提取試劑、一步法逆轉(zhuǎn)錄核酸擴(kuò)增試劑、聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物純化試劑和懸浮點(diǎn)陣雜交檢測(cè)試劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8之一的鑒別診斷系統(tǒng)用于鑒別或者診斷嚴(yán)重急性呼吸道綜合征的用途。
10.一種使用權(quán)利要求1-8之一的鑒別診斷系統(tǒng)用于鑒別或者診斷嚴(yán)重急性呼吸道綜合征的方法，包括如下步驟a.非典型肺炎病原體樣本的核酸提??；b.一步法反轉(zhuǎn)錄核酸擴(kuò)增；c.聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物的純化；d.熒光微球的檢測(cè)；e.計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng)判定檢測(cè)結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速檢測(cè)嚴(yán)重急性呼吸道綜合征相關(guān)的冠狀病毒核糖核酸及其它人類常見非典型肺炎病原體的鑒別診斷系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括病原體懸浮點(diǎn)陣檢測(cè)試劑盒和計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng)。本鑒別診斷系統(tǒng)利用18種常見急性呼吸道感染病原微生物特異性探針偶聯(lián)的熒光微球組合，以寡核苷酸探針捕獲的方法檢測(cè)包括嚴(yán)重急性呼吸道綜合征相關(guān)冠狀病毒在內(nèi)的非典型肺炎病原體，該方法檢測(cè)指標(biāo)多、靈敏度高、特異性好、組配合理、操作簡(jiǎn)便，特別適宜進(jìn)行群體發(fā)燒的病原學(xué)篩查和非典型肺炎病原體的鑒別診斷。
文檔編號(hào)G01N33/52GK1600864SQ03126419
公開日2005年3月30日 申請(qǐng)日期2003年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月28日
發(fā)明者馬旭, 韓健 申請(qǐng)人:馬旭