專利名稱：蛋白質(zhì)、病毒快速富集方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)、病毒快速富集方法，適合從人或動(dòng)物的各種樣品(包括漱口液、培養(yǎng)上清、尿液、糞便抽提液、血清、咳痰抽提液、鼻拭子抽提液、咽拭子抽提液)，以及其它動(dòng)植物試樣中快速富集并部分純化蛋白質(zhì)、病毒顆粒的方法。
背景技術(shù)：
在化驗(yàn)所需的樣品中，蛋白質(zhì)、病毒的數(shù)量相差很大。如因病毒致患病人在不同病程的尿液、糞便、血清等臨床樣品以及潛伏期病人中的病毒數(shù)量就極少。目前的檢驗(yàn)方法對(duì)樣品體積大小都有一定的限制，不能從大體積的樣品中提取蛋白質(zhì)、病毒RNA，常常導(dǎo)致假陰性的檢測(cè)結(jié)果。中國(guó)專利文獻(xiàn)CN1285878公開(kāi)了一種“用于富集和尋找微生物樣品的方法和裝置”，該方法對(duì)微生物的富集培養(yǎng)是在注射器或同等物中完成的，由于常規(guī)培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，不適應(yīng)快速檢測(cè)的需要。對(duì)蛋白質(zhì)、病毒顆粒進(jìn)行快速濃縮和部分純化技術(shù)，中國(guó)醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)和中國(guó)專利文獻(xiàn)未見(jiàn)公開(kāi)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問(wèn)題是，克服已有技術(shù)所存在的不足，提供一種從大體積樣品中對(duì)蛋白質(zhì)、病毒顆粒濃縮和部分純化速度快，濃縮率高的蛋白質(zhì)、病毒快速富集方法，使蛋白質(zhì)、病毒檢出率和準(zhǔn)確性大大提高。
本發(fā)明蛋白質(zhì)、病毒快速富集方法，其特征在于在由以下操作步驟構(gòu)成1)蛋白絮凝稀釋樣品釋放蛋白質(zhì)、病毒顆粒，加凝集溶劑，使蛋白質(zhì)、病毒顆粒和細(xì)胞形成凝集物；2)分相沉淀加分相溶劑，將蛋白質(zhì)、病毒顆粒和細(xì)胞沉淀到相間；3)二次沉淀加沉淀溶劑，將蛋白質(zhì)、病毒顆粒和細(xì)胞沉淀到管底；4)棄清留沉棄上清，洗滌，離心，再棄上清，再離心，吸盡上清得富集液。
上述操作步驟一般在10～20分鐘完成。
在含蛋白質(zhì)、病毒顆粒的樣品中加入凝集溶劑，使蛋白質(zhì)、病毒顆粒呈脫水狀態(tài)或部分鹽析而得到保護(hù)。加入分相溶劑后，立即形成二相體系，下相的水分被抽提到上相，而下相的凝集溶劑幾乎達(dá)到100％的飽和度，蛋白質(zhì)在兩相中均不相容，而被有效地析出形成沉淀分布在相間，并在離心過(guò)程中沉淀到相間。加入沉淀溶劑消除兩相，再經(jīng)離心沉淀回收蛋白質(zhì)、病毒顆粒。同時(shí)蛋白質(zhì)、病毒顆粒也得到部分純化(如糞便中的細(xì)菌、食物殘?jiān)癛T-PCR[逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈?zhǔn)綐臃磻?yīng)]抑制物都被去除)，使檢測(cè)靈敏性得到進(jìn)一步的提高。用50％乙醇(或異丙醇)洗滌去除殘留的鹽離子后，蛋白質(zhì)、病毒顆粒沉淀即可用于蛋白質(zhì)、病毒RNA的純化。另外，分相溶劑能直接殺死病毒，減少實(shí)驗(yàn)室感染的危險(xiǎn)；凝集溶劑和分相溶劑均能抑制RNA酶活性，防止RNA的降解。
所述的蛋白質(zhì)凝集溶劑是90～100％飽和度的硫酸銨；所述的分相溶劑是異丙醇∶無(wú)水乙醇＝3～10∶1；所述的蛋白質(zhì)沉淀溶劑是10～30％聚乙二醇6000；如果在蛋白質(zhì)凝集溶劑中添加有80mM NaH2PO4和80mM Na2HPO4，在分相溶劑中添加有冰乙酸2～5ml/L則富集效果更好。這可以降低PH值，促使凝結(jié)塊更加緊實(shí)，易于沉淀回收。
所述的分相溶劑和離心機(jī)預(yù)冷后使用，其分相效果更好，預(yù)冷通常不高于10℃。
根據(jù)不同的樣品體積，它和三種溶劑一般有如下比例關(guān)系，即樣品體積∶凝集溶劑體積∶分相溶劑體積∶沉淀溶劑體積＝5∶2～3∶6～8∶5～6；操作中常用比例關(guān)系為5∶2∶6.5∶5。
為了規(guī)范操作，各樣品體積都需要定量，并符合上述比例關(guān)系。I類樣品5ml中凝集溶劑加量是2ml；分相溶劑加量是6.5ml，沉淀溶劑加量是5ml；II類樣品2ml中凝集溶劑加量是0.8ml；分相溶劑加量是2.5ml，沉淀溶劑加量是2ml。上述I類樣品是指漱口液，培養(yǎng)上清，尿液，糞便抽提液；II類樣品是指血清，咳痰抽提液，鼻拭子抽提液，咽拭子抽提液。
本發(fā)明方法構(gòu)思合理，操作簡(jiǎn)單易行，從大體積樣品中對(duì)蛋白質(zhì)、病毒顆粒濃縮和部分純化速度快，可濃縮約100倍，使蛋白質(zhì)、病毒檢出率、準(zhǔn)確率提高100～1000倍。特別是富集速度快，對(duì)于控制高傳染性病毒流行具有重要意義。
具體實(shí)施例方式
下面通過(guò)實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步具體的說(shuō)明。
一、富集實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備從所有樣品中富集蛋白質(zhì)、病毒顆粒需作如下準(zhǔn)備1.含消毒液的廢物缸。
2.吸管。
3. 4℃預(yù)冷分相溶劑。
4. 50％乙醇，4℃預(yù)冷。
5.將離心機(jī)預(yù)冷至4℃。
從各種樣品中富集蛋白質(zhì)、病毒顆粒分別作以下準(zhǔn)備1.漱口液、培養(yǎng)上清、尿液50ml離心管。
2.血清15ml離心管。
3.糞便50ml離心管；生理鹽水或PBS。
4.咳痰50ml離心管；生理鹽水或PBS，使用前加乙酰半胱氨酸(acetylcysteine)至終濃度為1％。
5.鼻拭子15ml離心管；生理鹽水或PBS。
6.咽拭子15ml和50ml離心管；生理鹽水或PBS。
其中，生理鹽水0.9％NaCl；PBS1.44g Na2HPO4·2H2O(或1.15g Na2HPO4)，0.2g KH2PO4，0.2g KCl，8.0g NaCl，加水至1升，調(diào)節(jié)pH至7.2，高壓滅菌。
本例的蛋白質(zhì)、病毒凝集溶劑是96％飽和度的硫酸銨；分相溶劑是異丙醇∶無(wú)水乙醇＝3∶1；蛋白質(zhì)、病毒沉淀溶劑是10％聚二醇6000。
二、操作步驟此操作步驟是按以下體積的樣品為例而設(shè)計(jì)的
A.5ml漱口液、培養(yǎng)上清、尿液、糞便抽提液；B.2ml血清、咳痰抽提液、鼻拭子抽提液、咽拭子抽提液。
(一)從I類樣品——漱口液、培養(yǎng)上清、尿液、糞便抽提液中富集蛋白質(zhì)、病毒顆粒1、蛋白絮凝釋放蛋白質(zhì)、病毒顆粒，加凝集溶劑A.漱口液、培養(yǎng)上清、尿液取5ml樣品，轉(zhuǎn)入50ml離心管中，加2ml凝集溶劑。
B.新鮮糞便(1)稱取2克樣品，轉(zhuǎn)入50ml離心管中。
(2)加6ml生理鹽水或PBS，用吸管攪拌搗碎，再反復(fù)吹打徹底混合均勻(注意，勿濺到管外)，充分釋放蛋白質(zhì)、病毒顆粒。4℃，5000×g離心5分鐘。
(3)吸取5ml上清，轉(zhuǎn)入50ml離心管中，加2ml凝集溶劑。
2、分相沉淀加6.5ml 4℃預(yù)冷的分相溶劑，用吸管反復(fù)吹打混勻，室溫靜置5分鐘后劇烈振搖混合均勻。4℃，≥5000×g離心5分鐘，將蛋白質(zhì)、病毒顆粒和細(xì)胞沉淀到相間。
注意分相溶劑能殺死蛋白質(zhì)、病毒。為防止實(shí)驗(yàn)室污染，加入凝集溶劑和分相溶劑后勿先劇烈震搖，以免濺出，造成污染。宜用吸管吹打混勻，并等待分相溶劑作用5分鐘殺死蛋白質(zhì)、病毒顆粒后再劇烈振搖混合均勻。
3、二次沉淀加5ml沉淀溶劑，混合均勻，4℃，≥5000×g離心3分鐘，將蛋白質(zhì)、病毒顆粒和細(xì)胞沉淀到管底。
4、棄清留沉倒置離心管丟棄上清，加5ml 4℃預(yù)冷的50％乙醇，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)離心管洗下沾在管壁上的溶液(勿攪動(dòng)管底沉淀)。4℃，≥5000×g離心3分鐘。倒置離心管丟棄上清，簡(jiǎn)短離心，用滴頭吸盡殘留的上清。注意，勿吸走管底沉淀。
沉淀的蛋白質(zhì)、病毒顆粒應(yīng)立即用于RNA純化，或置-20℃保存。
(二)從從II類樣品——血清、咳痰抽提液、鼻拭子抽提液或咽拭子抽提液中富集蛋白質(zhì)、病毒顆粒
1、蛋白絮凝釋放蛋白質(zhì)、病毒顆粒，加凝集溶劑A.血清取2ml血清，加入15ml離心管中，加0.8ml凝集溶劑。
B.咳痰(1)收集咳痰，轉(zhuǎn)入50ml離心管中。
(2)加3ml含1％乙酰半胱氨酸(acetylcysteine)的生理鹽水或PBS，旋渦振蕩3～10分鐘(旋渦振蕩時(shí)間視咳痰的粘稠度而定)，充分釋放蛋白質(zhì)、病毒顆粒?！?000×g離心5分鐘。
(3)吸取2ml上清，轉(zhuǎn)入15ml離心管中，加0.8ml凝集溶劑。
C.鼻拭子(1)將鼻拭子轉(zhuǎn)入15ml離心管中。
(2)加3ml生理鹽水或PBS，旋渦振蕩1分鐘充分釋放蛋白質(zhì)、病毒顆粒。用有齒鑷夾持住鼻拭子，輕輕壓在管壁上擠出殘余抽提液，仔細(xì)取出(勿沾染到管的出口)，丟棄到含消毒液的廢物缸中。
(3)吸取2ml溶液，轉(zhuǎn)入15ml離心管中，加0.8ml凝集溶劑。
D.咽拭子(1)將咽拭子轉(zhuǎn)入50ml離心管中。
(2)加3ml生理鹽水或PBS，反復(fù)攪動(dòng)咽拭子1～2分鐘充分釋放蛋白質(zhì)、病毒顆粒。將咽拭子輕輕壓在管壁上，擠出殘余抽提液。取出咽拭子并丟棄到含消毒液的廢物缸中。
(3)吸取2ml溶液，轉(zhuǎn)入15ml離心管中，若溶液體積不足2ml，加生理鹽水或PBS補(bǔ)足到2ml；加0.8ml凝集溶劑。
2、分相沉淀加2.5ml 4℃預(yù)冷的分相溶劑，用吸管反復(fù)吹打混勻，室溫靜置5分鐘后劇烈振搖混合均勻。4℃，≥5000×g離心5分鐘，將蛋白質(zhì)、病毒顆粒和細(xì)胞沉淀到相間。
3、二次沉淀加2ml沉淀溶劑，混合均勻，4℃，≥5000×g離心3分鐘，將蛋白質(zhì)、病毒顆粒和細(xì)胞沉淀到管底。
4、棄清留沉同上。
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)、病毒快速富集方法，其特征在于在由以下操作步驟構(gòu)成1)蛋白絮凝稀釋樣品釋放蛋白質(zhì)、病毒顆粒，加凝集溶劑，使蛋白質(zhì)、病毒顆粒和細(xì)胞形成凝集物；2)分相沉淀加分相溶劑，將蛋白質(zhì)、病毒顆粒和細(xì)胞沉淀到相間；3)二次沉淀加沉淀溶劑，將蛋白質(zhì)、病毒顆粒和細(xì)胞沉淀到管底；4)棄清留沉棄上清，洗滌，離心，再棄上清，再離心，吸盡上清得富集液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)、病毒快速富集方法，其特征在于所述的蛋白質(zhì)凝集溶劑是90～100％飽和度的硫酸銨；所述的分相溶劑是異丙醇∶無(wú)水乙醇＝3～10∶1；所述的蛋白質(zhì)沉淀溶劑是10～30％聚二醇6000；
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的蛋白質(zhì)、病毒快速富集方法，其特征在于所述的蛋白質(zhì)凝集溶劑中還含有80mM NaH2PO4和80mM Na2HPO4；所述的分相溶劑中還有冰乙酸2～5ml/L；
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的蛋白質(zhì)、病毒快速富集方法，其特征在于所述的分相溶劑和離心機(jī)均預(yù)冷。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的蛋白質(zhì)、病毒快速富集方法，其特征在于所述的樣品體積∶凝集溶劑體積∶分相溶劑體積∶沉淀溶劑體積＝5∶2～3∶6～8∶5～6。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的蛋白質(zhì)、病毒快速富集方法，其特征在于所述的樣品體積∶凝集溶劑體積∶分相溶劑體積∶沉淀溶劑體積＝5∶2～3∶6～8∶5～6。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的蛋白質(zhì)、病毒快速富集方法，其特征在于在I類樣品5ml中凝集溶劑加量是2ml；分相溶劑加量是6.5ml，沉淀溶劑加量是5ml；II類樣品2ml中凝集溶劑加量是0.8ml；分相溶劑加量是2.5ml，沉淀溶劑加量是2ml。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的蛋白質(zhì)、病毒快速富集方法，其特征在于在I類樣品5ml中凝集溶劑加量是2ml；分相溶劑加量是6.5ml，沉淀溶劑加量是5ml；II類樣品2ml中凝集溶劑加量是0.8ml；分相溶劑加量是2.5ml，沉淀溶劑加量是2ml。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)、病毒快速富集方法，適用于從人或動(dòng)物的各種樣品。它由以下操作步驟構(gòu)成1)蛋白絮凝稀釋樣品釋放蛋白質(zhì)、病毒顆粒，加凝集溶劑，使蛋白質(zhì)、病毒顆粒和細(xì)胞形成凝集物；2)分相沉淀加分相溶劑，將蛋白質(zhì)、病毒顆粒和細(xì)胞沉淀到相間；3)二次沉淀加沉淀溶劑，將蛋白質(zhì)、病毒顆粒和細(xì)胞沉淀到管底；4)棄清留沉棄上清，洗滌，離心，再棄上清，再離心，吸盡上清得富集液。本發(fā)明方法構(gòu)思合理，操作簡(jiǎn)單易行，富集速度快，可在10～20分鐘完成?？蓾饪s約100倍，使蛋白質(zhì)、病毒檢出率、準(zhǔn)確率提高100～1000倍。特別是富集速度快，對(duì)于控制高傳染性病毒流行具有重要意義。
文檔編號(hào)G01N1/40GK1523337SQ03129408
公開(kāi)日2004年8月25日 申請(qǐng)日期2003年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月17日
發(fā)明者余偉明 申請(qǐng)人:余偉明