專利名稱：β－二酮－三價銪配合物納米熒光探針及其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及納米稀土熒光探針，具體地說是一種β-二酮-三價銪配合物納米(稀土)熒光探針及其制備和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
醫(yī)學(xué)及生命科學(xué)的飛速發(fā)展對分析化學(xué)提出了大量新的課題，核酸、多肽、蛋白質(zhì)等生物大分子、生物藥物、微生物、超微量生物活性物質(zhì)等的分析測定對醫(yī)學(xué)及生命科學(xué)的發(fā)展正起著越來越重要的作用，因此生物分析化學(xué)已成為當(dāng)今國際分析科學(xué)領(lǐng)域最重要的前沿研究領(lǐng)域之一；基于上述形勢所需，許多新的分析方法和技術(shù)不斷被開發(fā)出來，如納米熒光探針技術(shù)、生物芯片技術(shù)、納米通道技術(shù)、分子印跡技術(shù)、分子信標技術(shù)等，其中納米熒光探針技術(shù)是一個具有廣泛應(yīng)用價值和超高靈敏度的生物分析檢測技術(shù)。
分子光譜分析方法是醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)中應(yīng)用最多的方法，由于熒光分析方法的靈敏度高、選擇性好、所需樣品量少，因而基于熒光測定的生物分析方法已廣泛地應(yīng)用于各種醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)的分析檢測中。熒光分析法常用來測定生物樣品中某些成份的含量，由于生物體系的高度復(fù)雜性，為了能獲得更多的有價值的信息，對于所使用的熒光探針有很高的要求，如較好的光穩(wěn)定性，不易被光漂白或光解，探針本身非常穩(wěn)定，發(fā)光持續(xù)不閃爍，對被分析的生物成份的活性影響小，具備良好的熒光量子效率，光譜特征突出，最好是類線性光譜，且最大激發(fā)峰對最大發(fā)射峰的干擾要較小等。
納米熒光探針是指可標記到生物分子上作為熒光檢測探針使用的納米發(fā)光粒子，目前已經(jīng)開發(fā)出來的納米熒光探針主要有下述幾種(1)金納米粒子(膠體金)探針(文獻1W.P.Faulk，Immunochem.，1971，8，1081-1083)金納米粒子探針的研究始于20世紀60年代，1971年，F(xiàn)aulk和Taylor首次報道了免疫金染色法；當(dāng)吸附在膠體金表面的抗原或抗體遇到組織或細胞中相應(yīng)的抗體或抗原時，就會發(fā)生特異的結(jié)合反應(yīng)，由于金納米粒子具有較高的電子密度，因此在電鏡下清晰可辨；但要獲得較高的靈敏度，就需要較高的探針濃度，且需要較大直徑的金粒子，因此往往導(dǎo)致標記物不穩(wěn)定，長期儲存易發(fā)生自動凝集。針對上述問題，后來又開發(fā)了銀染色法，其原理是將含銀離子的顯影液加入到發(fā)生完反應(yīng)的金納米粒子中，由于金粒子大量的電荷吸引，使銀離子吸附于金粒子周圍，然后被還原成單質(zhì)銀，結(jié)果呈現(xiàn)金屬銀的藍灰色，信號被進一步放大，其靈敏度往往可以達到pg/ml水平。此外還有利用HAuCl4和NH2OH·HCl使標記的金粒子進一步增大，從而增強檢測信號的方法，該法用于人免疫球蛋白(IgG)的檢測靈敏度較銀染色法還高，甚至可與熒光免疫、放射免疫及化學(xué)發(fā)光免疫法相比(文獻2Z.Ma，S.Sui，Angew.Chem.Int.Ed.，2002，41，2176-2179)。
(2)半導(dǎo)體納米晶(又稱量子點)(文獻3W.C.W.Chan，S.Nie，Science，1998，281，2016-2018；文獻4Y.W.Cao，Angew.Chem.Int.Ed.，1999，38，3692-3694)量子點的發(fā)明開創(chuàng)了納米發(fā)光微粒作為標記物應(yīng)用的新領(lǐng)域；目前文獻報道的量子點主要是II-VI族和III-V族元素的化合物，如CdSe，InP和InAs等；量子點激發(fā)光范圍寬，發(fā)射峰尖銳，Stokes位移大，個別量子點的量子產(chǎn)率，如CdSe/CdS納米晶甚至可以達到100％，在激發(fā)光的激發(fā)下，量子點發(fā)光的顏色隨其尺寸的大小而改變，幾乎可以獲得從藍色到紅色所有波長的發(fā)光；將表面修飾后的量子點與生物分子相結(jié)合，可用來作為激光掃描成像及免疫分析的熒光探針；量子點熒光探針的缺點是發(fā)光不穩(wěn)定，易閃爍，且不具備足夠好的單分散性。
(3)內(nèi)含熒光分子的納米熒光探針其中一類是高分子塑料納米熒光探針(文獻5H.Hrm，T.Soukka，T.Lvgren，Clin.Chem.，2001，47，561-568；文獻6趙藝強，高海峰，楊武利，府壽寬，熒光標記的高分子微粒及其制備方法，中國專利，
公開日2001年1月3日，公開號CN1278534A)，它是用聚苯乙烯內(nèi)包β-二酮-銪熒光配合物的納米塑料熒光微粒，該類高分子塑料微粒在水中易凝集，而在有機溶劑中高分子又易溶脹而導(dǎo)致微粒內(nèi)熒光分子泄漏；還有一種是以聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯類為微粒主體，表面鍵合或吸附熒光素(如異硫氰酸熒光素)、若丹明(如若丹明6G)、青色素(Cy染料)等熒光物質(zhì)的納米熒光微粒。由于這些微粒表面鍵合或吸附的是常規(guī)熒光物質(zhì)，除了高分子塑料微粒存在的缺點外，還存在熒光測定時各種散亂光和背景熒光干擾測定的問題。
另一類是內(nèi)包三(聯(lián)二吡啶)釕熒光配合物的納米硅膠微粒(文獻7S.Santra，P.Zhang，K.Wang，R.Tapec，W.Tan，Anal.Chem.，2001，73，4988-4993；文獻8S.Santra，K.Wang，R.Tapec，W.Tan，Journal of BiomedicalOptics，2001，6，160-166；文獻9譚蔚泓，王柯敏，肖丹，核殼型納米顆粒，中國專利，
公開日2002年4月3日，公開號CN1342515A)，該法以三(聯(lián)二吡啶)釕熒光配合物為核，硅膠為外殼制備了大小均勻的納米熒光微粒；與傳統(tǒng)方法相比較，該法制得的納米微粒的耐氧化、耐光穩(wěn)定性都有顯著提高，應(yīng)用于識別人外周血中SmIgG+B淋巴細胞的測定結(jié)果與用異硫氰酸熒光素標記抗體方法的檢測值相近。由于此類納米熒光微粒的發(fā)光內(nèi)核-三(聯(lián)二吡啶)釕熒光配合物所發(fā)出的仍然是常規(guī)熒光，無法解決各種散亂光和短壽命熒光對熒光測定干擾的問題。
還有一類是申請人最近開發(fā)的一種功能性納米稀土熒光微粒及其制備和應(yīng)用(文獻10袁景利，譚明乾，葉志強，王桂蘭，中國專利申請?zhí)?2144517.6)。時間分辨熒光生物檢測技術(shù)的最大優(yōu)點就是可完全消除各種散亂光和短壽命熒光對測定的影響，從而極大地提高測定靈敏度；此類納米稀土熒光探針具有稀土熒光的優(yōu)點①熒光壽命極長，有機熒光化合物的熒光壽命通常在10納秒以內(nèi)，而納米稀土熒光探針的熒光壽命在數(shù)百微秒以上；②Stokes位移大，納米稀土熒光探針的最大激發(fā)光波長通常在310-370nm的紫外區(qū)，而最大熒光發(fā)光波長在500nm以上，比普通熒光染料熒光的Stokes位移可大至10倍；③熒光發(fā)光的能量非常集中，熒光發(fā)光峰的半峰寬在15nm以下；④較高的光穩(wěn)定性，不易被光漂白或光解。由于此類納米稀土熒光探針是采用硅膠包裹的方法將一些稀土熒光配合物包在硅膠納米微粒中制備而成的，在表面修飾及標記生物分子的過程中，可能會由于硅膠外殼的修飾等原因?qū)е滤南⊥翢晒馀浜衔镄孤蛊錈晒鉁p弱，進而降低了測定靈敏度。為解決這種問題，研制一種化學(xué)性質(zhì)更穩(wěn)定，熒光發(fā)光更強，結(jié)合更為牢固的納米稀土熒光探針十分必要。

發(fā)明內(nèi)容
針對以上的問題，本發(fā)明的目的是提供一種穩(wěn)定的、發(fā)光強度高的β-二酮-三價銪配合物納米熒光探針(Nanoparticle LanthanideFluorescence Probe，簡稱NP)及其制備和應(yīng)用。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為由可與硅酸酯共聚合的單體(多為含有三烷氧基硅基團的化合物)與三價銪-β-二酮類熒光配合物于有機溶劑中發(fā)生共價鍵合反應(yīng)，然后其再與硅酸酯發(fā)生共聚，形成的功能性納米稀土熒光微粒；所述三價銪離子、β-二酮有機配位體、可與硅酸酯共聚合的單體及硅酸酯，它們之間的摩爾比例為1∶2～3(三價銪離子與四齒β-二酮和二齒β-二酮有機配位體的摩爾比分別為1∶2和1∶3)∶10～100∶350～450。
所述可與硅酸酯共聚合的單體較佳的為3-氨基丙基三烷氧基硅或3-巰基丙基三烷氧基硅等，所述硅酸酯的分子式為Si(OR)4，其中的R是-CnH2n+1，n＝1～5；所述β-二酮有機配位體較好的為二齒β-二酮類化合物或四齒β-二酮類化合物；二齒β-二酮類化合物，結(jié)構(gòu)式可表示如下 式中R1＝C6F5或脂肪烴類取代基CnH2n+1，CnF2n+1，其中n＝1、2、3、4或5；R2為芳香烴類取代基 中之一；R3為氯磺?；?-SO2Cl)、異硫睛基(-NCS)、氨基(-NH2)或肼磺?；?-SO2NHNH2)；四齒β-二酮類化合物，結(jié)構(gòu)式可表示如下
式中R4為氯磺?；?-SO2Cl)、異硫睛基(-NCS)、氨基(-NH2)或肼磺?；?-SO2NHNH2)；R5＝C6F5或脂肪烴類取代基CnH2n+1，CnF2n+1，其中n＝1、2、3、4或5。
β-二酮-三價銪配合物納米熒光探針具體制備過程為1)熒光前軀體在室溫條件下，于有機溶劑中，β-二酮有機配位體和可與正硅酸乙酯共聚合的單體發(fā)生共價結(jié)合反應(yīng)，它們的用量摩爾比為1∶5～1∶50，體系中β-二酮有機配位體的摩爾濃度為0.05～0.9μmol/ml，然后加入β-二酮有機配位體摩爾量二分之一的Eu3+，制成熒光前軀體；2)配制微乳液將有機溶劑、助表面活性劑、表面活性劑和水按摩爾比為15～25∶2～7∶1∶6～10均勻混合后制成微乳液；3)在微乳液中加入熒光前軀體，室溫條件下攪拌1小時后，加入硅酸酯，最后用3-25％的氨水(NH3占水相的重量百分比)引發(fā)聚合，攪拌下室溫反應(yīng)4～48小時，離心分離即可。
總之，本發(fā)明以三價銪與β-二酮類配位體所形成的強熒光性配合物為發(fā)光物質(zhì)，納米稀土熒光探針微粒采用化學(xué)共價鍵鍵合的方法將稀土熒光配合物牢固地固定在硅膠的網(wǎng)絡(luò)體系中，通過反相乳液共聚合成粒技術(shù)制備而成，并且納米微粒表面同時引入可與生物分子共價鍵結(jié)合的活性官能團。
所述β-二酮有機配位體和可與正硅酸乙酯共聚合的單體的用量摩爾比為1∶7～1∶18；所述有機溶劑為苯、正己烷、環(huán)己烷或石油醚；助表面活性劑為乙醇、丙醇、異丙醇、正己醇、乙二醇、正辛醇或正癸醇；表面活性劑為聚氧乙烯基辛基苯基醚(Triton X-100系列)或聚氧乙烯基壬基苯基醚(NP-5系列)；有機溶劑、助表面活性劑和表面活性劑按摩爾比為摩爾比為20～25∶3～7∶1。
β-二酮-三價銪配合物納米熒光探針可在時間分辨熒光測定法中應(yīng)用。所述的時間分辨熒光測定法為時間分辨熒光免疫測定法，時間分辨熒光DNA雜交測定法，時間分辨熒光顯微鏡成象測定法，時間分辨熒光細胞測定法及時間分辨熒光生物芯片測定法。
本發(fā)明的納米稀土熒光探針除了可以顯著增強熒光探針的光穩(wěn)定性，解決熒光漂白問題，避免標記物大量使用時的“濃度消光”現(xiàn)象等優(yōu)點以外，還具有如下優(yōu)點(1)穩(wěn)定性好。本發(fā)明采用共價鍵合方法將稀土熒光配合物牢牢地固定在納米微球內(nèi)，因此獲得的納米稀土熒光探針具有十分穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，解決了采用硅膠包裹的方法制備的納米硅膠熒光微球易發(fā)生熒光分子泄漏，而造成納米探針熒光強度減弱的問題。
(2)發(fā)光強度高。完全解決了β-二酮類配位體由于難溶于水相，而導(dǎo)致用硅膠包裹技術(shù)制備的納米探針熒光強度較弱的問題。由于納米硅膠熒光微粒是在油包水的反相乳液中制備而成的，這種方法對于那些具有較多羧基或冠醚結(jié)構(gòu)等親水性基團的稀土配合物來說，由于稀土熒光配合物主要集中在水相中，從而容易制備出含有較高濃度熒光配合物的納米熒光微粒，即易制備出熒光強度較大的納米探針，但β-二酮類配位體與銪的配合物由于難溶于水相，用油包水的反相乳液聚合方法制備的納米探針熒光強度往往較弱，而先將β-二酮類配位體與銪的配合物共價鍵合到三烷氧基氨丙基硅烷等單體上，再與硅膠進行共聚，則可以使所得到的單個納米探針上固定有大量的β-二酮-銪配合物，極大地提高了納米稀土熒光探針的發(fā)光強度。
(3)制備方法簡單。在制備納米硅膠熒光微粒的同時(在結(jié)合體中可與正硅酸乙酯共聚的單體相對于稀土熒光配合物是過量的)，一次性地導(dǎo)入了氨基等可與生物分子共價鍵合的活性官能團，可以直接用于生物分子的標記，省卻了繁瑣的納米硅膠微粒用于生物標記前的表面修飾過程。雖然硅膠納米探針表面有硅羥基，但對硅羥基的表面修飾技術(shù)往往要采用劇毒的溴化氰(CNBr)，由于要求條件苛刻，對操作人員會產(chǎn)生極大地不便，甚至?xí)斐缮眢w危害；而采用在硅羥基上引入氨基(將硅膠微球繼續(xù)與三烷氧基氨丙基硅烷等反應(yīng))等方法，一是操作復(fù)雜，二是可能使硅膠微粒間發(fā)生相互交聯(lián)，影響納米探針的分散性，而本項發(fā)明則很好地解決了這一問題，制備的納米微粒探針不但表面具有可用于標記的活性基團，而且大小均勻，分散性良好。
(4)應(yīng)用范圍廣。本發(fā)明標記后的生物分子可用于各種時間分辨熒光生物檢測技術(shù)，如時間分辨熒光免疫測定、DNA雜交測定、細胞識別、顯微鏡成像測定、單細胞原位測定、生物芯片等，適用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中。


圖1為共價鍵合銪配合物BHHCT-Eu3+的納米熒光微粒的透射電子顯微鏡照片。
圖2為共價鍵合銪配合物BHHCT-Eu3+的納米熒光微粒的常規(guī)熒光光譜和時間分辨熒光光譜；(其中-------常規(guī)熒光光譜，—時間分辨熒光光譜)。
圖3A為共價鍵合銪配合物BHHCT-Eu3+的納米熒光微粒(NP)的耐光漂白實驗結(jié)果圖。
圖3B為自由BHHCT-Eu3+配合物的耐光漂白實驗結(jié)果圖。
圖4為用共價鍵合銪配合物BHHCT-Eu3+制備的納米微粒與用硅膠包裹BHHCT-Eu3+和BHHT-Eu3+方法制備的納米微粒的熒光測定靈敏度比較圖；(其中◆為共價鍵合銪配合物制備的納米微粒，為用硅膠包裹制備的納米微粒，▲為BHHT-Eu3+方法制備的納米微粒)。
圖5為用共價鍵合銪配合物BHHCT-Eu3+的納米熒光微粒標記蛋白質(zhì)的反應(yīng)原理圖。
圖6為共價鍵合銪配合物BHHCT-Eu3+的納米熒光微粒標記鏈親合素(SA)用于測定乙型肝炎表面抗原(簡稱HBsAg)的測定原理圖。
圖7為用共價鍵合銪配合物BHHCT-Eu3+的納米熒光微粒標記鏈親合素測定人血清中乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的工作曲線。
具體實施例方式
下面通過實施例對本發(fā)明作進一步說明。
實施例1共價鍵合4，4’-二(1”，1”，1”，2”，2”，3”，3”-七氟-4”，6”-己二酮-6”-基)氯磺?；?鄰二苯基苯(簡稱BHHCT)-銪配合物的納米熒光微粒的制備及表征(1)共價鍵合BHHCT-Eu3+配合物的納米熒光微粒的制備環(huán)己烷中加入BHHCT(合成方法參見文獻11J.Yuan，K.Matsumoto，H.Kimura，Anal.Chem.，1998，70，596-601)和氨丙基三乙氧基硅(簡稱APS)，BHHCT與APS的摩爾比1∶5～1∶50，優(yōu)選1∶7～1∶18，體系中BHHCT的摩爾濃度為0.05～0.9μmol/ml，室溫下攪拌反應(yīng)2小時，然后加入BHHCT摩爾量二分之一的三氯化銪(EuCl3)，超聲波振蕩20分鐘，制備好的APS-BHHCT-Eu3+結(jié)合體保存?zhèn)溆谩h(huán)己烷、正辛醇和Triton X-100和水按一定比例(摩爾比為15～25∶2～7∶1∶6～10均勻混合后制成微乳液；再加入30μl的APS-BHHCT-Eu3+結(jié)合體溶液及200μl的正硅酸乙酯(TEOS)，用6％氨水(NH3占水相重量百分比)引發(fā)聚合，室溫下攪拌反應(yīng)24小時，離心分離后即得到含有共價鍵合BHHCT-Eu3+配合物的納米稀土熒光微粒。
(2)共價鍵合BHHCT-Eu3+配合物的納米熒光微粒的性質(zhì)表征(a)納米熒光微粒的形態(tài)及大小尺寸圖1是共價鍵合BHHCT-Eu3+配合物的納米熒光微粒的透射電子顯微鏡照片，從照片可見用共價鍵合的方法制備的納米微粒與用硅膠包裹方法制備的納米微粒有很明顯的不同，用包裹方法制得的納米微粒中由于銪離子會被集中到微粒中心，因此透射電鏡照片上可以清晰地看到納米微粒中心銪離子所形成的黑點，而用共價鍵合的方法制備的納米微粒的中心看不到有黑點，且納米微粒顏色均勻，無可見的明暗差別，這說明稀土銪離子已不是象用包裹的方法制得的納米微粒那樣主要聚集在微粒的中心，而是均勻地分布在整個納米微粒當(dāng)中。用該法制得的納米微粒大小均勻，粒徑尺寸為37±3nm。粒徑的大小可以通過調(diào)整水與表面活性劑的比例、助表面活性劑的種類、氨水的濃度、TEOS的量以及反應(yīng)時間等來進行調(diào)控。
(b)納米稀土熒光微粒的熒光光譜特性圖2是共價鍵合BHHCT-Eu3+配合物的納米熒光微粒水溶液的熒光光譜和時間分辨熒光光譜。圖中可見NP的熒光光譜的發(fā)光峰存在嚴重的散亂光干擾峰，而它的時間分辨熒光光譜的發(fā)光峰則徹底沒有干擾峰的存在。自由配合物BHHCT-Eu3+的熒光光譜上其最大發(fā)光波長是612nm，而制成納米熒光微粒后其熒光光譜的最大發(fā)光波長也是612nm，波長沒有發(fā)生變化。該法制得的納米熒光微粒的熒光壽命經(jīng)測定為0.376秒，說明納米熒光微粒的熒光仍保持了銪配合物的長熒光壽命的特征。
(c)納米稀土熒光微粒的光穩(wěn)定性實驗共價鍵合BHHCT-Eu3+配合物的納米熒光微粒的光穩(wěn)定性實驗結(jié)果如圖3所示，所用光源為25W氘燈，樣品距離氘燈12cm，每5分鐘測量一次發(fā)射光譜。經(jīng)強紫外光照射60分鐘后，自由BHHCT-Eu3+配合物本身的熒光強度衰減到起始時的40.1％，而納米熒光微粒的熒光強度僅衰減到起始時的84.2％，說明納米微粒的抗光漂白能力遠遠強于自由BHHCT-Eu3+熒光配合物。
(d)共價鍵合BHHCT-Eu3+配合物的納米熒光微粒與用直接硅膠包裹方法制備的BHHCT-Eu3+和BHHT-Eu3+配合物[4，4’-二(1”，1”，1”，2”，2”，3”，3”-七氟-4”，6”-己二酮-6”-基)-鄰二苯基苯-銪配合物]納米熒光微粒的熒光測定靈敏度比較為了比較采用共價鍵合BHHCT-Eu3+配合物方法與采用硅膠直接包裹方法制備的納米微粒在熒光強度方面的差異，我們采用相同反應(yīng)體系和相同初始配合物濃度(0.164μmol/ml)，分別用共價鍵合方法和硅膠包裹方法制備了納米稀土熒光微粒，并測試了兩種方法制得的納米微粒的熒光測定靈敏度，具體測定結(jié)果見下表

在制備納米微粒時反應(yīng)體系中的銪配合物濃度完全相同，但是從表中結(jié)果可見，共價鍵合方法和硅膠包裹方法制備的納米熒光微粒的熒光測定最低檢測下限卻相差很大，用共價鍵合方法制備的納米微粒的最低檢測下限可達0.41ng/ml(納米粒子的重量/溶液體積)，而用硅膠包裹方法制備的納米熒光微粒的最低檢測下限只能達到87.5和382.6ng/ml，并且納米微粒的粒徑相近，由此可以得知用共價鍵合方法制備的納米微粒的熒光強度要遠遠大于用硅膠包裹方法制備的納米微粒的熒光強度，三種納米微粒稀釋溶液熒光測定的結(jié)果見圖4。
實施例2使用共價鍵合BHHCT-Eu3+配合物的納米熒光微粒作為標記物的時間分辨熒光免疫測定法測定人血清中的乙型肝炎表面抗原(簡稱HBsAg)。
(1)利用納米稀土熒光微粒標記鏈親和素(簡稱SA)取1mg納米微粒分散到1.0ml的0.1mol/L磷酸緩沖溶液(pH＝7.1)中，用超聲波振蕩20分鐘后，加入5mg牛血清白蛋白(簡稱BSA)，攪拌下加入300μl的1％戊二醛(磷酸緩沖溶液)，室溫反應(yīng)24小時，離心收集沉淀。沉淀用200μl磷酸緩沖液洗兩次后加入到200μl的1％戊二醛(磷酸緩沖溶液)中，然后加入1mg SA，室溫反應(yīng)24小時后，加入0.5mg NaBH4還原，室溫反應(yīng)2小時，用磷酸緩沖溶液洗滌數(shù)次后懸浮于含有0.2％BSA-0.1％NaN3-0.9％NaCl的pH值7.8的0.05mol/L Tris-HCl緩沖溶液(緩沖溶液1)中備用，該標記法的反應(yīng)原理見圖5。
(2)生物素標記豚鼠抗人HBsAg抗體的制備1.4ml(0.5mg/ml)的豚鼠抗人HBsAg抗體(上?？迫A公司)在4℃，24小時對3L含0.9％NaCl的水溶液兩次透析后，加入12mg的NaHCO3和3mg的NHS-LC-biotin(Pierce Chemical Co.)，室溫攪拌1小時后，4℃下放置24小時。反應(yīng)液在4℃，24小時對3L含有0.25g NaN3的0.1mol/L NaHCO3水溶液兩次透析后加入10mg的BSA和20mg的NaN3，放置-20℃?zhèn)溆?。?dāng)用于免疫測定時，用(緩沖溶液1)稀釋1000倍后使用。
(3)人血清中HBsAg的測定(a)96微孔板的包被將含抗人HBsAg單克隆抗體(上?？迫A公司，10μg/ml)的0.1mol/L，pH值9.6的NaHCO3緩沖溶液50μl分注于96微孔板的各孔中，4℃，24小時包被后，用含有0.05％Tween 20的0.05mol/L，pH值7.8的Tris-HCl緩沖溶液(緩沖溶液2)洗兩次，再用0.05mol/L，pH值7.8的Tris-HCl緩沖溶液(緩沖溶液3)洗1次，包被后的微孔板在-20℃下可保存1個月以上。
(b)HBsAg的時間分辨熒光免疫測定該測定的反應(yīng)原理如圖6所示。用含有0.01％BSA-0.9％NaCl-0.1％NaN3的pH值7.8的0.05mol/L Tris-HCl緩沖溶液注入上述包被后的微孔板的各孔中，37℃，1小時反應(yīng)后用緩沖溶液2洗兩次，緩沖溶液3洗1次。用含有5％BSA-0.9％NaCl-0.1％NaN3的pH值7.8的0.05mol/L Tris-HCl緩沖溶液(緩沖溶液4)稀釋人HBsAg(Dakopatts，Denmark)制得HBsAg標準溶液。將此標準溶液和血清樣品分別50μl注入上述包被后的微孔板的各孔中，37℃，1小時反應(yīng)后，用緩沖溶液2，緩沖溶液3洗凈，然后加入50μl生物素標記的抗HBsAg抗體溶液，37℃，1小時反應(yīng)后，用緩沖溶液2，緩沖溶液3洗凈，再加入50μ1 NP標記的SA溶液，37℃，1小時反應(yīng)后，用含0.05％Tween 20的0.05mol/L，pH值9.1的Tris-HCl緩沖液洗4次，然后進行固相時間分辨熒光測定。測定用儀器為WALLAC VICTOR 1420多標記計數(shù)儀(PerkinElmerLife Science公司產(chǎn))，測定條件為激發(fā)波長，340nm；檢測波長，615nm；遲延時間，0.2ms；窗口時間，0.4ms；循環(huán)時間，1.0ms。
用該法測定HBsAg的工作曲線如圖7所示，用零濃度時的熒光信號(本底)的標準偏差(SD)的3倍計算HBsAg測定的最低檢出下限，得本法的最低檢出下限為30pg/ml。工作曲線上限可達10ng/ml。
該法用于人血清樣品中HBsAg添加回收率的測定結(jié)果和測定精度如下表所示，平均添加回收率的測定結(jié)果為95.9％，平均相對標準偏差為6.20％，說明本發(fā)明的方法用于人血清中HBsAg的測定具有非常好的準確度和精密度。

權(quán)利要求
1.β-二酮-三價銪配合物納米熒光探針，其特征在于其是由可與硅酸酯共聚合的單體，與三價銪-β-二酮類熒光配合物于有機溶劑中發(fā)生共價鍵合反應(yīng)，然后其再與硅酸酯發(fā)生共聚，形成的功能性納米稀土熒光微粒；所述三價銪離子、β-二酮有機配位體、可與硅酸酯共聚合的單體及硅酸酯，它們之間的摩爾比例為1∶2～3∶10～100∶350～450。
2.按照權(quán)利要求1所述的β-二酮-三價銪配合物納米熒光探針，其特征在于所述可與硅酸酯共聚合的單體為3-氨基丙基三烷氧基硅或3-巰基丙基三烷氧基硅。
3.按照權(quán)利要求1所述的β-二酮-三價銪配合物納米熒光探針，其特征在于所述硅酸酯的分子式為Si(OR)4，其中的R是-CnH2n+1，n＝1～5。
4.按照權(quán)利要求1所述的β-二酮-三價銪配合物納米熒光探針，其特征在于所述β-二酮有機配位體為二齒β-二酮類化合物或四齒β-二酮類化合物；二齒β-二酮類化合物，結(jié)構(gòu)式可表示如下 式中R1＝C6F5或脂肪烴類取代基CnH2n+1，CnF2n+1，其中n＝1、2、3、4或5；R2為芳香烴類取代基 中之一；R3為氯磺?；?-SO2Cl)、異硫睛基(-NCS)、氨基(-NH2)或肼磺?；?-SO2NHNH2)；四齒β-二酮類化合物，結(jié)構(gòu)式可表示如下 式中R4為氯磺?；?-SO2Cl)、異硫睛基(-NCS)、氨基(-NH2)或肼磺?；?-SO2NHNH2)；R5＝C6F5或脂肪烴類取代基CnH2n+1，CnF2n+1，其中n＝1、2、3、4或5。
5.一種權(quán)利要求1所述的β-二酮-三價銪配合物納米熒光探針的制備方法，其特征在于具體操作過程為，1)熒光前軀體在室溫條件下，在有機溶劑中，β-二酮有機配位體和可與正硅酸乙酯共聚合的單體發(fā)生共價結(jié)合反應(yīng)，它們的用量摩爾比為1∶5～1∶50，體系中β-二酮有機配位體的摩爾濃度為0.05～0.9μmol/ml，然后加入β-二酮有機配位體摩爾量二分之一的Eu3+，制成熒光前軀體；2)配制微乳液將有機溶劑、助表面活性劑、表面活性劑和水按摩爾比為15～25∶2～7∶1∶6～10均勻混合后制成微乳液；3)在微乳液中加入熒光前軀體，室溫條件下攪拌1小時后，加入硅酸酯，最后用重量含量3-25％的氨水引發(fā)聚合，攪拌下室溫反應(yīng)4～48小時，離心分離即可。
6.按照權(quán)利要求5所述的β-二酮-三價銪配合物納米熒光探針的制備方法，其特征在于所述有機溶劑為苯、正己烷、環(huán)己烷或石油醚；助表面活性劑為乙醇、丙醇、異丙醇、正己醇、乙二醇、正辛醇或正癸醇；表面活性劑為聚氧乙烯基辛基苯基醚或聚氧乙烯基壬基苯基醚。
7.一種權(quán)利要求1所述的β-二酮-三價銪配合物納米熒光探針在時間分辨熒光測定法中的應(yīng)用。
8.按照權(quán)利要求7所述的β-二酮-三價銪配合物納米熒光探針在時間分辨熒光測定法中的應(yīng)用，其特征在于所述的時間分辨熒光測定法為時間分辨熒光免疫測定法，時間分辨熒光DNA雜交測定法，時間分辨熒光顯微鏡成象測定法，時間分辨熒光細胞測定法及時間分辨熒光生物芯片測定法。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種β－二酮－三價銪配合物納米熒光探針及其制備和應(yīng)用，是由可與硅酸酯共聚合的單體，與三價銪－β－二酮類熒光配合物于有機溶劑中發(fā)生共價鍵合反應(yīng)，然后其再與硅酸酯發(fā)生共聚，形成的功能性納米稀土熒光微粒；所述三價銪離子、β－二酮有機配位體、可與硅酸酯共聚合的單體及硅酸酯，它們之間的摩爾比例為1∶2～3∶10～100∶350～450；所得微粒熒光更強，性能更穩(wěn)定，表面具有可直接用于生物標記的活性官能團，作為熒光探針用于時間分辨熒光測定時不受各種散亂光和短壽命熒光的干擾，在時間分辨熒光的免疫檢測、細胞化學(xué)、顯微鏡成像、DNA雜交測定及生物芯片測定等生化檢測技術(shù)領(lǐng)域有重要的應(yīng)用價值。
文檔編號G01N21/64GK1566954SQ0313385
公開日2005年1月19日 申請日期2003年7月4日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月4日
發(fā)明者袁景利, 譚明乾, 海曉丹, 王桂蘭 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所