專利名稱：用妊娠相關(guān)蛋白-a檢測(cè)孕早期唐氏綜合征的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)和生物學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及一種用妊娠相關(guān)蛋白-A(即Pregnancy-Associated Plasma Protein-A簡(jiǎn)稱PAPP-A)檢測(cè)孕早期唐氏綜合征的試劑盒，這種試劑盒可以用于唐氏綜合征診斷，尤其可用于孕早期(9-13周)發(fā)生唐氏綜合征的危險(xiǎn)性評(píng)估，本發(fā)明還涉及該試劑盒的制作方法和測(cè)定方法。
唐氏綜合征(Down’s Syndrome)又稱先天愚型，是人類最常見(jiàn)的染色體疾病(21三體)，發(fā)病率為活產(chǎn)新生兒的1/600～1/800。唐氏綜合征的臨床特征為嚴(yán)重先天性智力低下，具有獨(dú)特的面容(如寬眼距、低鼻梁)、及肢體短小等；并常伴有先天性心臟病、消化道畸形等癥狀。唐氏綜合征缺乏有效的治療手段。為了降低唐氏綜合征的發(fā)病率和提高我國(guó)人口素質(zhì)，目前只有加強(qiáng)產(chǎn)前診斷，盡早終止妊娠和防止患兒出生。進(jìn)行絨毛活檢或羊膜腔穿刺是一種目前采用的產(chǎn)前診斷方法，雖然準(zhǔn)確度很高，但這是一種侵入性檢查，有引起流產(chǎn)的危險(xiǎn)(約有1％～2％的流產(chǎn)率)；而且實(shí)驗(yàn)方法繁瑣、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，不適宜大規(guī)模普查。八十年代末人們開(kāi)始用甲胎蛋白(AFP)和人絨毛膜促性腺激素(hCG)等生物化學(xué)指標(biāo)來(lái)篩查唐氏綜合征。生化指標(biāo)具有快速簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，但是當(dāng)唐氏綜合征的發(fā)生時(shí)，血清中AFP和hCG濃度的改變一般在孕中期才比較明顯，因此它們不適宜作為孕早期的唐氏綜合征的篩查指標(biāo)。本發(fā)明的目的正是為了克服上述已有檢測(cè)指標(biāo)的缺點(diǎn)和不足，本發(fā)明根據(jù)妊娠相關(guān)蛋白-A(即PAPP-A)在唐氏綜合征剛發(fā)生時(shí)即呈現(xiàn)血清濃度明顯降低的特點(diǎn)，將PAPP-A作為一種孕早期唐氏綜合征的篩查指標(biāo)，同時(shí)建立了PAPP-A的酶免定量檢測(cè)試劑盒和測(cè)定方法，從而可以提高唐氏綜合征的產(chǎn)前篩查率，有效地降低唐氏胎兒的出生率。
因此，本發(fā)明的目的是提供了一種用妊娠相關(guān)蛋白-A(PAPP-A)檢測(cè)孕早期唐氏綜合征的試劑盒。
本發(fā)明的上述目的是通過(guò)下列技術(shù)方案實(shí)施的一種妊娠相關(guān)蛋白-A(PAPP-A)的定量酶聯(lián)免疫檢測(cè)孕早期唐氏綜合征的試劑盒，其特征在于它由PAPP-A標(biāo)準(zhǔn)品、多克隆抗體包被板、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的PAPP-A單克隆抗體、質(zhì)控品和輔助試劑組成。
本發(fā)明試劑盒的制作方法包括標(biāo)準(zhǔn)品的制備、多克隆抗體包被板的制作、酶標(biāo)單克隆抗體的制備、質(zhì)控品的制備以及輔助試劑的配制。
PAPP-A標(biāo)準(zhǔn)品可外購(gòu)(比如，DSL公司)，也可自行制備。本發(fā)明試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)品是從足月產(chǎn)婦血清中提取制備的。一種制備步驟包括收集足月產(chǎn)婦靜脈血，及時(shí)分離血清，低溫貯存?zhèn)溆茫焕鄯e的足月產(chǎn)婦血清經(jīng)S-300凝膠過(guò)濾層析、DEAE離子交換層析、Heparin親和層析三步層析進(jìn)行PAPP-A的分離純化，三步層析的順序可以變換，本發(fā)明試劑盒使用的一種順序依次為凝膠過(guò)濾層析、離子交換層析和親和層析；將獲得的PAPP-A純品按試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線最高點(diǎn)濃度(160ng/ml)進(jìn)行稀釋，然后進(jìn)行分裝、冷凍干燥，即獲得PAPP-A標(biāo)準(zhǔn)品。
本發(fā)明試劑盒中的多克隆抗體包被板可用PAPP-A蛋白水解酶純品對(duì)兔或鼠免疫而獲得的多克隆抗體包被酶標(biāo)板而制作。本發(fā)明試劑盒中的多克隆抗體包被板是用經(jīng)三次層析分離純化得到的PAPP-A純品對(duì)兔子免疫而獲得的兔抗人多克隆抗體包被酶標(biāo)板而制作的。酶標(biāo)板可選用國(guó)產(chǎn)板或進(jìn)口板；規(guī)格可以是96孔平板或12×8、6×8可拆條板。本發(fā)明試劑盒采用一種進(jìn)口酶標(biāo)板(Costar公司產(chǎn)品)。一種多克隆抗體包被酶標(biāo)板的制作步驟如下a)制備多克隆抗體(1)免疫兔子選用三月齡大耳白雄兔3只，用PAPP-A純品按常規(guī)進(jìn)行免疫。基礎(chǔ)免疫抗原用量為每只兔子500μg PAPP-A，加強(qiáng)免疫抗原用量250μg/只，共兩次。一個(gè)月后開(kāi)始從耳緣靜脈取血，每周一次，分離血清貯存于4℃。(2)血清篩選用PAPP-A純品按2μg/孔包被酶標(biāo)板，及時(shí)跟蹤監(jiān)測(cè)每只免疫雄兔血清中的PAPP-A抗體滴度上升狀況。將篩選出的雄兔進(jìn)行頸動(dòng)脈放血，分離血清，加0.01％硫柳汞于4℃保存。(3)抗血清純化高滴度的抗血清經(jīng)飽和硫酸銨沉淀等步驟純化后即獲得PAPP-A多克隆抗體。
b)包被將上述多克隆抗體用0.05M碳酸鹽緩沖液稀釋后加入酶標(biāo)板各孔，每孔100ul，吸附過(guò)夜，用吐溫磷酸鹽緩沖液洗板，再用吐溫磷酸鹽緩沖液封閉過(guò)夜，甩干后晾干，即獲得多克隆抗體包被酶標(biāo)板。
本發(fā)明試劑盒中的酶標(biāo)單克隆抗體是用PAPP-A純品免疫小鼠、獲取脾細(xì)胞、經(jīng)過(guò)與骨髓瘤細(xì)胞融合等步驟獲得單克隆抗體，再將單克隆抗體用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記而制備的。一種酶標(biāo)單克隆抗體的制備步驟如下a)免疫小鼠獲取脾細(xì)胞用PAPP-A純品作為抗原免疫Balb/c小鼠，免疫程序結(jié)束后獲取脾細(xì)胞，在二氧化碳孵育箱中按常規(guī)方法進(jìn)行培養(yǎng)；b)細(xì)胞融合及陽(yáng)細(xì)胞篩選將上述脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合，在甲基纖維素半固體培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇性培養(yǎng)；篩選陽(yáng)性融合細(xì)胞后進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，可獲得強(qiáng)陽(yáng)性單克隆雜交瘤細(xì)胞株；c)獲取腹水和腹水純化將上述雜交瘤細(xì)胞注入小鼠腹腔，獲得小鼠腹水；使用重組Protein G親和層析預(yù)裝柱純化小鼠腹水即可獲得PAPP-A單克隆抗體。
d)HRP酶標(biāo)采用改良過(guò)碘酸鈉氧化法適量HRP酶溶于0.5ml乙酸緩沖液(pH5.6)，加入新鮮配置的適量NaIO4(0.06M)溶液，反應(yīng)充分后加入0.5ml乙二醇(2.5％)；將5mg純化好的PAPP-A單抗隆抗體溶液加入，經(jīng)透析、硼氫化鈉反應(yīng)、飽和硫酸銨沉淀等步驟后，即獲得HRP酶標(biāo)PAPP-A單克隆抗體。
e)純化用重組Protein G親和層析預(yù)裝柱去除游離的HRP酶，獲得克分子比接近0.4的HRP酶標(biāo)PAPP-A單克隆抗體。
本發(fā)明試劑盒中的質(zhì)控品是用正常婦女血清稀釋混合足月產(chǎn)婦血清、并按照本試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍要求而調(diào)配制備的。本發(fā)明試劑盒采用的一種質(zhì)控品制備方法包括如下步驟a)收集足月產(chǎn)婦靜脈血(經(jīng)HIV、肝類病毒、AIDS、梅毒等測(cè)定均為陰性者)，經(jīng)離心后收集血清于-20℃保存；b)將積累的各個(gè)血清混合，用ELISA方法測(cè)定PAPP-A含量，并按標(biāo)準(zhǔn)曲線要求，用正常婦女血清將兩份混合產(chǎn)婦血清的濃度分別調(diào)至20±5ng/ml、85±15ng/ml范圍；c)將步驟b)所獲得的兩份血清按每個(gè)試劑盒的需要量分裝，冷凍干燥，即制備成低、高值質(zhì)控品。
本發(fā)明試劑盒中的輔助試劑包括酶聯(lián)反應(yīng)的底物溶液，顯色液，反應(yīng)終止液和清洗緩沖液。一種配制輔助試劑的方法如下a)底物溶液磷酸-檸檬酸緩沖液(pH5.0)配制的3％過(guò)氧化氫溶液；b)顯色液四甲基聯(lián)苯胺(TMB)甲醇溶液，濃度為0.1mg/ml；c)反應(yīng)終止液2M硫酸d)清洗緩沖液(20倍濃縮液，20X)PBS(pH7.4)配制的0.05％吐溫20溶液。
本發(fā)明試劑盒的測(cè)定方法，其特征在于它依次按下述步驟進(jìn)行a)抗原-抗體反應(yīng)在試劑盒提供的抗體包被板的微孔中分別加入100μl已稀釋好的不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品，或待測(cè)血清樣品，37℃水浴保溫60分鐘；然后用清洗緩沖液重復(fù)洗板4次。
b)酶聯(lián)反應(yīng)將HRP酶標(biāo)單克隆抗體溶液加入各孔，每孔100μl，37℃水浴保溫60分鐘。重復(fù)洗板操作4次。
c)顯色反應(yīng)每孔依次加入底物溶液、顯色液各50μl，37℃水浴保溫10分鐘，每孔再加入50μl反應(yīng)終止液結(jié)束反應(yīng)。
d)比色以空白對(duì)照孔的吸光值調(diào)零，用酶標(biāo)儀在450nm測(cè)定OD值并記錄。
e)結(jié)果計(jì)算A.制作標(biāo)準(zhǔn)曲線以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定的OD值為縱坐標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線；計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸系數(shù)R2，當(dāng)R2＞0.98時(shí)本次測(cè)定有效；B.評(píng)判質(zhì)控品濃度根據(jù)質(zhì)控品的OD值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取相應(yīng)的濃度值；當(dāng)?shù)椭蒂|(zhì)控品、高值質(zhì)控品的濃度均在給定范圍內(nèi)時(shí)，本次測(cè)定判為有效；C.計(jì)算待測(cè)血清樣品濃度當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控品均被判定有效時(shí)，根據(jù)待測(cè)樣本的OD值從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)血清樣品的濃度。
與已有的唐氏綜合征檢測(cè)指標(biāo)和技術(shù)相比較，本發(fā)明試劑盒具有以下優(yōu)點(diǎn)a).與已有的生化指標(biāo)甲胎蛋白(AFP)和人絨毛膜促性腺激素(hCG)相比較，PAPP-A可作為孕早期篩查唐氏綜合征的生化指標(biāo)，克服了AFP和hCG只在孕中期才有效、不適宜對(duì)孕早期篩查唐氏綜合征的缺點(diǎn)；b).與已有的絨毛活檢或羊膜腔穿刺方法相比較，本發(fā)明試劑盒采用了雙抗體夾心定量酶免檢測(cè)法，操作簡(jiǎn)便，快速有效，克服了絨毛活檢或羊膜腔穿刺檢查需要進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和核型分析而耗費(fèi)較多時(shí)間和人力的缺點(diǎn)；而且本發(fā)明屬于無(wú)創(chuàng)傷檢測(cè)，克服了絨毛活檢或羊膜腔穿刺的侵入性檢查可能引起流產(chǎn)的危險(xiǎn)，對(duì)孕婦更加安全，增加了可接受性，適宜在人群中進(jìn)行大規(guī)模產(chǎn)前篩查，可更有效地達(dá)到降低唐氏綜合征發(fā)病率的目的。
下面用實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。應(yīng)該理解的是，本發(fā)明的實(shí)施例是用于說(shuō)明本發(fā)明而不是對(duì)本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的簡(jiǎn)單改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。除非另有說(shuō)明，本發(fā)明中的百分?jǐn)?shù)是重量百分?jǐn)?shù)。
實(shí)施例一PAPP-A定量酶免檢測(cè)試劑盒制作方法的應(yīng)用實(shí)例PAPP-A定量酶免檢測(cè)試劑盒(48人份)，其組成包括PAPP-A凍干標(biāo)準(zhǔn)品1瓶；PAPP-A多克隆抗體包被板(48孔)1塊；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記PAPP-A單克隆抗體1瓶，6ml/瓶；凍干低值質(zhì)控品1瓶；
凍干高值質(zhì)控品1瓶；底物溶液1瓶，3ml/瓶；顯色液(TMB)1瓶，3ml/瓶；反應(yīng)終止液1瓶，3ml/瓶；清洗緩沖液(20X濃縮)1瓶，15ml/瓶。
具體制作方法如下1.制備PAPP-A標(biāo)準(zhǔn)品1)收集血清從產(chǎn)房獲得健康足月產(chǎn)婦靜脈血，3000rpm離心15分鐘，分離血清于-70℃保存?zhèn)溆谩?br> 2)PAPP-A的分離純化使用AKTA蛋白純化儀(Pharmacia公司產(chǎn)品，型號(hào)Purifier100)從上述血清中分離純化PAPP-A。選用的操作步驟依次為a)S-300凝膠過(guò)瀘層析，緩沖液為0.02M Tris-HCl，(PH7.2)，流速2ml/min；b)DEAE離子交換層析，緩沖液為0.02MTris-HCl(PH7.2)，1MNaCl，流速3ml/min；c)Heparin親和層析，緩沖液為0.02M Tris-HCl(PH7.2)，1M NaCl，流速1.5ml/min。層析過(guò)程中用UNICRN V400軟件控制NaCl的濃度梯度及蛋白峰的紫外吸收監(jiān)測(cè)。每一步層析所獲蛋白峰的活性檢測(cè)采用ELISA法。最后將活性蛋白洗脫峰合并，裝透析袋，透析除鹽后濃縮，貯存于-70℃。
3)PP-A純品按試劑盒說(shuō)明書中標(biāo)準(zhǔn)曲線第一點(diǎn)所需要濃度分裝(160ng/ml)、冷凍干燥、貯存于4℃。
2.制作PAPP-A多克隆抗體包被板1)PAPP-A多克隆抗體制備(1)免疫兔子選用三月齡大耳白雄兔3只，用PAPP-A純品按常規(guī)進(jìn)行免疫。每只雄兔用含500μg PAPP-A純品的生理鹽水與等量弗氏完全佐劑制成2ml乳劑，在背部皮內(nèi)多點(diǎn)注射；同時(shí)在后肢根部注射0.5ml滅活百日咳菌苗。3個(gè)月后用1ml同樣的抗原乳劑在四肢根部皮下做加強(qiáng)注射。一個(gè)月后開(kāi)始從耳緣靜脈取血，每周一次，分離血清貯存于4℃。
(2)血清篩選用PAPP-A純品按2μg/孔包被酶標(biāo)板，及時(shí)跟蹤監(jiān)測(cè)每只免疫雄兔血清中的PAPP-A抗體滴度上升狀況，從中篩選出2#雄兔的抗血清滴度高于1.5×106；待連續(xù)三次采血檢查結(jié)果均呈現(xiàn)抗血清滴度后，對(duì)2#雄兔進(jìn)行頸動(dòng)脈放血，獲兔血110ml；將所有兔血于2000rpm/min離心10分鐘，合并血清，加0.01％硫柳汞于4℃保存。
(3)抗血清純化高滴度的抗血清經(jīng)飽和硫酸銨沉淀、DEAE-纖維素柱層析純化后即獲得PAPP-A多克隆抗體；加入等量中性甘油后，分裝小瓶于-20℃保存。
2)包被酶標(biāo)板采用Costar公司生產(chǎn)的6×8可拆條板。將步驟1)所獲多克隆抗體用0.05M碳酸鹽緩沖液稀釋為10μg/ml后加入酶標(biāo)板各孔，每孔100ul，吸附過(guò)夜，用清洗緩沖液洗板，再用該緩沖液封閉過(guò)夜，甩干后晾干，即獲得多克隆抗體包被酶標(biāo)板。按48孔/塊用錫箔紙包裝、真空封閉。
3.制備辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的PAP-A單克隆抗體1)獲取免疫小鼠脾細(xì)胞用PAPP-A純品作為抗原免疫Balb/c小鼠，免疫程序結(jié)束后獲取脾細(xì)胞，在CO2孵育箱中按常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；2)細(xì)胞融合、篩選將步驟1)所得脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合，在IMDM甲基纖維素半固體培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇性培養(yǎng)、陽(yáng)性融合細(xì)胞篩選，再進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，即獲得強(qiáng)陽(yáng)性單克隆雜交瘤細(xì)胞株；3)小鼠腹水獲取、純化將步驟2)獲得的雜交瘤細(xì)胞注入小鼠腹腔進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，5只小鼠在注入雜交瘤細(xì)胞前一周先注射0.5ml石蠟油，每只小鼠注射的雜交瘤細(xì)胞數(shù)為0.5～1.0×106個(gè)，約10天后可收獲小鼠腹水，每次3～5ml，每只小鼠可收集2～3次。用重組Protein G親和層析預(yù)裝柱從小鼠腹水中純化PAPP-A單克隆抗體，緩沖液為0.02M磷酸緩沖液，pH7.0；洗脫液為0.1M甘氨酸-鹽酸緩沖液，pH 2.7。
4)辣根過(guò)氧化物酶(HRP)酶標(biāo)采用改良過(guò)碘酸鈉氧化法用于標(biāo)記的HRP酶的RZ值不低于3.0；5mg HRP酶溶于0.5ml乙酸緩沖液(pH5.6)，加入新鮮配置的0.5mlNaIO4(0.06M)溶液，反應(yīng)充分后加入0.5ml乙二醇(2.5％)；將5mg純化好的PAPP-A單抗隆抗體溶液加入，經(jīng)透析、硼氫化鈉反應(yīng)、飽和硫酸銨沉淀等步驟后，即獲得HRP酶標(biāo)PAPP-A單克隆抗體。
5)純化用重組Protein G親和層析預(yù)裝柱去除游離的HRP酶，獲得克分子比接近0.4的HRP酶標(biāo)PAPP-A單克隆抗體。
6)組裝用含10％胎牛血清的緩沖液稀釋由步驟5)獲得的酶標(biāo)單克隆抗體至合適的工作濃度，按6ml/瓶分裝，貯存于4℃。
4.制備質(zhì)控品收集足月產(chǎn)婦靜脈血(經(jīng)HIV、肝類病毒、AIDS、梅毒等測(cè)定均為陰性者)，3000rpm離心15分鐘后收集血清于-20℃保存。將積累的各個(gè)血清混合，用ELISA方法測(cè)定PAPP-A濃度，并用非孕婦女血清將兩份混合血清的濃度調(diào)至20±5ng/ml、85±15ng/ml范圍，制備成低、高質(zhì)控品。按每個(gè)試劑盒的需要量分裝，冷凍干燥后貯存于4℃。每個(gè)試劑盒中含低濃度質(zhì)控品和高濃度質(zhì)控品各一瓶。
5.配制輔助試劑1)底物溶液磷酸-檸檬酸緩沖液(pH5.0)配制的3％過(guò)氧化氫溶液，按3ml/瓶分裝。
2)配制顯色液TMB(0.1mg/ml)甲醇溶液，按3ml/瓶分裝。
3)配制反應(yīng)終止液2M H2SO4，按3ml/瓶分裝。
4)配制清洗緩沖液(20倍濃縮液)PBS(pH7.4)配制的1％吐溫20溶液，按15ml/瓶分裝。
應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)制備PAPP-A定量酶免檢測(cè)試劑盒的質(zhì)量檢測(cè)1)準(zhǔn)確性取三份待測(cè)樣品混合后分為三份混合血清標(biāo)本，每份1ml。分別加入0、30、100ng的PAPP-A純品，制成回收試驗(yàn)血清標(biāo)本#1、#2、#3。按說(shuō)明書操作步驟進(jìn)行測(cè)定并計(jì)算結(jié)果。然后按回收率計(jì)算公式計(jì)算回收率。標(biāo)本#2、#3的回收率分別為96.5％和97.5％，平均回收率為97.0％，即試劑盒的比例偏差為3.0％，準(zhǔn)確性為97.0％。
2)精密度隨機(jī)抽取20盒不同批次試劑盒，用同一份待測(cè)樣本按說(shuō)明書操作步驟進(jìn)行重復(fù)測(cè)定。計(jì)算每次測(cè)定結(jié)果，求出均值、SD和變異系數(shù)CV。精密度試驗(yàn)結(jié)果顯示批間CV≤15％3)線范圍用PAPP-A純品稀釋成一系列不同濃度的純品溶液320ng、160ng、80ng、40ng、20ng、10ng、5ng、2.5ng、1.25ng/ml。按照說(shuō)明書操作步驟進(jìn)行測(cè)定。以濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制曲線。線性范圍內(nèi)最高檢測(cè)上限值為160ng/ml，最低檢測(cè)下限值為5ng/ml。試劑盒的線性范圍為5～160ng/ml。
4)檢測(cè)靈敏度根據(jù)上述線性范圍測(cè)定結(jié)果，本試劑盒的檢測(cè)靈敏度為5.0ng/ml。
5)特異性取四份待測(cè)樣品混合后分為四份混合血清標(biāo)本，每份1ml。分別加入50ng劑量的人絨毛膜促性腺激素(hCG)、人胎盤泌乳素(hPL)、妊娠特異性糖蛋白1(SP1)后制成干擾試驗(yàn)血清標(biāo)本#1、#2、#3，未加任何干擾物的#4混合血清標(biāo)本作為基礎(chǔ)樣品。按說(shuō)明書操作步驟進(jìn)行測(cè)定并計(jì)算結(jié)果。然后按干擾試驗(yàn)計(jì)算公式計(jì)算干擾率。標(biāo)本#1、#2、#3的干擾誤差均小于1.5％。
實(shí)施例二PAPP-A定量酶免檢測(cè)試劑盒的使用實(shí)例1.清洗緩沖液配制將試劑盒提供的濃縮清洗緩沖液加蒸餾水20倍稀釋。
2.將試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品第一點(diǎn)凍干粉(濃度160ng/ml)用500μl清洗緩沖液溶解，然后進(jìn)行倍比稀釋5次。試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)曲線由6個(gè)不同濃度的PAPP-A標(biāo)準(zhǔn)品組成，標(biāo)準(zhǔn)曲線各點(diǎn)濃度分別為160ng/ml、80ng/ml、40ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml。
3.質(zhì)控品的稀釋將試劑盒提供的低、高質(zhì)控品凍干粉分別用110μl清洗緩沖液溶解。
4.抗原-抗體反應(yīng)在試劑盒提供的抗體包被板的微孔中分別加入100μl已稀釋好的不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品，或待測(cè)血清樣品，37℃水浴保溫60分鐘。然后用清洗緩沖液重復(fù)洗板4次，每次3min。
5.酶聯(lián)反應(yīng)將HRP酶標(biāo)單克隆抗體溶液加入各孔，每孔100μl，37℃水浴保溫60分鐘。重復(fù)洗板操作4次，每次3min。
6.顯色反應(yīng)每孔依次加入底物溶液、TMB顯色液各50μl，37℃水浴保溫10分鐘，每孔再加入50μl反應(yīng)終止液結(jié)束反應(yīng)。
7.比色以空白對(duì)照孔的吸光值調(diào)零，用酶標(biāo)儀在450nm測(cè)定OD平均值；記錄各孔吸光值；計(jì)算雙孔標(biāo)準(zhǔn)品OD值的平均值。
8.結(jié)果計(jì)算1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定的平均OD值為縱坐標(biāo)，繪制本次測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線；計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸系數(shù)R2，當(dāng)R2＞0.98時(shí)本次實(shí)驗(yàn)有效。
2)質(zhì)控品濃度的評(píng)判根據(jù)質(zhì)控品的OD值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取相應(yīng)的質(zhì)控品濃度值。當(dāng)?shù)椭蒂|(zhì)控品濃度在20±5ng/ml、高值質(zhì)控品濃度在85±15ng/ml范圍內(nèi)時(shí)，本次測(cè)定判為有效；3)計(jì)算待測(cè)血清樣品濃度當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控品均被判定有效時(shí)，根據(jù)待測(cè)樣本的OD值從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)血清樣品中的PAPP-A濃度。
權(quán)利要求
1.一種用于診斷孕早期唐氏綜合征的妊娠相關(guān)蛋白-A酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，其由妊娠相關(guān)蛋白-A標(biāo)準(zhǔn)品，多克隆抗體包被板，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的妊娠相關(guān)蛋白-A單克隆抗體，質(zhì)控品和輔助試劑組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其中所述妊娠相關(guān)蛋白-A標(biāo)準(zhǔn)品是用足月產(chǎn)婦血清經(jīng)凝膠過(guò)濾層析、離子交換層析、親和層析分離純化而獲得的妊娠相關(guān)蛋白-A純品制備的。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的試劑盒，其中所述多克隆抗體包被板是用妊娠相關(guān)蛋白-A純品免疫動(dòng)物而獲得的妊娠相關(guān)蛋白-A多克隆抗體包被酶標(biāo)板而制作的。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的試劑盒，其中所述妊娠相關(guān)蛋白-A多克隆抗體是由妊娠相關(guān)蛋白-A純品免疫兔子而獲得的血清制備的。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的試劑盒，其中所述多克隆抗體包被板的制作是將妊娠相關(guān)蛋白-A多克隆抗體用碳酸鹽緩沖液稀釋后滴入酶標(biāo)板各孔內(nèi)，經(jīng)吸附、洗板、封閉、吹干等步驟處理后而制作的。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的試劑盒，其中所述辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)的妊娠相關(guān)蛋白-A單克隆抗體是用妊娠相關(guān)蛋白-A純品免疫小鼠后制備的單克隆抗體，經(jīng)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記而制備的。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6之一的試劑盒，其中所述質(zhì)控品是用足月正常產(chǎn)婦血清經(jīng)混合、稀釋調(diào)配而制備的。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的試劑盒，其中所述輔助試劑包括酶聯(lián)反應(yīng)的底物溶液、顯色液、反應(yīng)終止液及清洗緩沖液。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8之一的試劑盒用于檢測(cè)和/或診斷孕早期唐氏綜合征的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種妊娠相關(guān)蛋白－A檢測(cè)孕早期唐氏綜合征的試劑盒，它由標(biāo)準(zhǔn)品、多克隆抗體包被板、酶標(biāo)單克隆抗體、質(zhì)控品和輔助試劑組成，本發(fā)明還涉及這種試劑盒的制作方法及其檢測(cè)方法。本發(fā)明試劑盒可用于唐氏綜合征診斷，尤其可用于孕早期(9－13周)發(fā)生唐氏綜合征的危險(xiǎn)性評(píng)估。本試劑盒采用定量雙抗體夾心酶聯(lián)免疫反應(yīng)法，靈敏度高，特異性好，組配合理，操作簡(jiǎn)便，適宜大規(guī)模產(chǎn)前篩查使用。
文檔編號(hào)G01N33/573GK1553191SQ03136490
公開(kāi)日2004年12月8日 申請(qǐng)日期2003年6月5日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月5日
發(fā)明者馬旭, 吳爾若, 馬 旭 申請(qǐng)人:北京新科基業(yè)生物科技有限責(zé)任公司