專利名稱:抗核周因子試劑盒及其制備和保存方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎早期診斷用試劑盒,特別是涉及一種抗核周因子檢測試劑盒。本發(fā)明還涉及該試劑盒的制備方法和保存方法。
背景技術(shù):
類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis,RA)的診斷,尤其是早期診斷是世界性的難題。目前國際常用的ACR 1987年RA分類診斷標(biāo)準(zhǔn)主要是依靠臨床表現(xiàn)、X線改變和類風(fēng)濕因子(RF)的檢測進(jìn)行綜合判斷,缺乏可靠的客觀指標(biāo),往往是符合上述判斷標(biāo)準(zhǔn)時(shí),病人已經(jīng)出現(xiàn)了骨質(zhì)的破壞,使得早期病例難以診斷。RF是分類診斷標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)唯一的血清學(xué)指標(biāo),但RF可出現(xiàn)于許多結(jié)締組織病及其它疾病中,如急性病毒感染和結(jié)核患者,甚至5%的正常人群中也可能出現(xiàn),對(duì)于診斷RA的特異性很差。因此,國內(nèi)外學(xué)者在探討RA特異性診斷指標(biāo)方面進(jìn)行了大量研究工作,相斷發(fā)現(xiàn)了一些對(duì)RA較為特異的自身抗體。
抗核周因子(antiperinuclear facror antibodies,APF)是最早發(fā)現(xiàn)的一個(gè)RA特異性自身抗體,自1964年Nienhuis首次發(fā)現(xiàn)APF以來,國內(nèi)外研究證實(shí)APF不僅可以出現(xiàn)在RA疾病的早期階段,甚至可以出現(xiàn)于RA臨床癥狀發(fā)生以前若干年,對(duì)RA高度特異,因此具有早期診斷價(jià)值。
但是有關(guān)APF的檢測一直未能廣泛開展,且遲遲不能應(yīng)用于臨床,包括著名的德國歐盟醫(yī)學(xué)診斷有限公司也沒有APF檢測的試劑盒。其原因主要是存在以下兩個(gè)問題一、合適的抗原底物獲取有一定困難。APF檢測是以人頰粘膜細(xì)胞作為抗原底物,用間接免疫熒光法進(jìn)行檢測,不同提供者頰粘膜細(xì)胞的抗原性不同,不是每個(gè)人的頰粘膜細(xì)胞均適合做抗原底物,據(jù)國外文獻(xiàn)報(bào)道,僅有10%的人可以提供合適的抗原。
二、抗原底物的保存困難,即APF的制片困難。APF檢測的每次實(shí)驗(yàn)均需要重新制備抗原底物,首先刮取頰粘膜脫落細(xì)胞,用磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次,離心、棄上清液,置于倒置顯微鏡下計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞數(shù),滴至玻片制得抗原片后,才能進(jìn)行間接免疫熒光檢測,而制備抗原片的過程大約需要3~4小時(shí)。由于APF每次實(shí)驗(yàn)均要從制備抗原開始,過程復(fù)雜,檢測周期長,難以避免檢測批間差異,穩(wěn)定性差,因此很難在臨床上大規(guī)模應(yīng)用。而且通常制備的APF抗原片是直接放置在-30℃保存,一般一個(gè)月后就不能再用于檢測,其抗原片的保存也是一大難題。
Hoet.R.M.A.對(duì)抗核周因子抗原片的制備進(jìn)行了研究(Annals of theRheumatic Diseases,1991.50.611~618),他發(fā)現(xiàn),如果使用0.5%Triton-X100的PBS緩沖液漂洗人頰粘膜細(xì)胞后,制得的APF抗原片檢測敏感性顯著提高,至少70%正常健康人的頰粘膜細(xì)胞可以作為核周因子抗原的提供者,而且制備的抗原片可以在-70℃保存二周。
但是,Hoet的研究結(jié)果僅將頰粘膜細(xì)胞提供者的比例提高到70%,仍然沒有完全解決抗原底物的獲取問題,而且由于制備的抗原片保存時(shí)間過短,不能規(guī)?;恐苽銩PF檢測試劑盒,也沒有解決臨床大規(guī)模應(yīng)用的問題。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可供臨床應(yīng)用的抗核周因子試劑盒。
提供該試劑盒的制備方法,是本發(fā)明的另一發(fā)明目的。
本發(fā)明的目的還在于提供該試劑盒的保存方法。
本發(fā)明的試劑盒是將人頰粘膜細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液漂洗離心后,再用含0.5%Triton-X100的磷酸鹽緩沖液靜置10~15分鐘后離心,用磷酸鹽緩沖液漂洗離心后,置于試劑盒中,干燥密封后得到。
其具體的制備方法是a、清潔口腔,用海綿涂抹兩側(cè)頰粘膜;b、將海綿置于10mL磷酸鹽緩沖液中,擠壓海綿,使頰粘膜細(xì)胞溶入緩沖液中;c、以800g/min離心3分鐘,棄去上清液;d、沉淀細(xì)胞中加入10mL含0.5%Triton-X100的磷酸鹽緩沖液,靜置10~15分鐘,以800g/min離心3分鐘,棄去上清液;e、沉淀細(xì)胞用10mL磷酸鹽緩沖液洗滌,并以800g/min離心3分鐘,棄去上清液;
f、沉淀細(xì)胞置于倒置顯微鏡下計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1000個(gè)/10μL,在試劑盒上每孔加入15μL,干燥并密封試劑盒。
其中,使用的磷酸鹽緩沖液是pH=7.4的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液。制備出的試劑盒干燥后放入鋁箔袋中密封,置于-70℃保存。
試劑盒產(chǎn)品的臨床使用方法為將待測血清用PBS液以1∶10的比例稀釋,試劑盒放置到室溫,打開包裝,每孔中加入25μL稀釋好的血清,于室溫下孵育90分鐘,之后用PBS液洗滌三次,每次洗滌5分鐘。
再在每孔中滴加15μL以1∶40稀釋的羊抗人IgG熒光二抗,置溫盒中室溫孵育45分鐘,再用PBS液洗滌三次,每次5分鐘。
以緩沖甘油(50%甘油、50%PBS,含0.5μg/mLEB)封片,立即在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。
檢測的判定標(biāo)準(zhǔn)為全片出現(xiàn)2個(gè)以上APF典型核周均質(zhì)圓形熒光顆粒時(shí),判定為陽性;全片僅見1個(gè)APF典型熒光顆粒時(shí),判定為可疑,進(jìn)行重復(fù)檢測。
Hoet首先采用了Triton-X100處理人頰粘膜細(xì)胞,使得處理后細(xì)胞的APF檢測敏感性顯著提高,由原來報(bào)道的10%左右提高到了70%(未給出數(shù)據(jù)),從而使絕大多數(shù)人群都可以作為頰粘膜細(xì)胞抗原底物的提供者。但是,Hoet的方法雖然擴(kuò)大了抗原底物提供者人群的范圍,仍然還需要通過試驗(yàn)來篩選合適的頰粘膜細(xì)胞作為抗原底物,沒有完全解決抗原底物獲取困難的問題。
Triton-X100是一種表面活性劑,對(duì)于細(xì)胞膜能起到打孔效應(yīng),當(dāng)它作用于細(xì)胞時(shí),能與細(xì)胞膜充分作用,增加細(xì)胞膜對(duì)抗體的通透性,有利于抗體進(jìn)入細(xì)胞膜與抗原結(jié)合;同時(shí),Triton-X100還具有清洗作用,可以除掉雜質(zhì),使背景更清楚,抗原片的質(zhì)量更高,從而增加陽性檢出率。本發(fā)明對(duì)Hoet的方法進(jìn)行了改進(jìn),將Triton-X100的作用時(shí)間從漂洗一次改變?yōu)殪o置10~15分鐘,以增加Triton-X100與細(xì)胞膜之間的作用,通過上述改進(jìn),進(jìn)一步提高了APF檢測的敏感性,取得了意想不到的效果。
隨機(jī)選取10例正常健康人(其中4例女性)的頰粘膜細(xì)胞作為抗原底物進(jìn)行APF檢測,結(jié)果顯示全部為陽性,敏感性達(dá)到了100%,只是其中女性頰粘膜細(xì)胞偏小,相應(yīng)的核周熒光顆粒也偏小,不利于結(jié)果的判斷。上述試驗(yàn)結(jié)果表明了任何正常健康的人群都可以提供合適的頰粘膜細(xì)胞作為抗原底物,從而徹底解決了尋找抗原提供者,獲取抗原底物的問題。
由于先前制備的抗原片不能長期保存,因此每次進(jìn)行APF檢測時(shí)必須從制備抗原片開始,不僅過程復(fù)雜、檢測周期長,也難以避免批間差異,使得APF檢測一直不能應(yīng)用于臨床常規(guī)檢測中。本發(fā)明將制備得到的抗原片干燥后密封,于-70℃保存,可以防止潮解,抗原底物脫落及蛋白變性,有利于APF抗原長期保存的穩(wěn)定性,解決了抗原底物保存的難題,制備出了可供臨床應(yīng)用的試劑盒,利用該試劑盒可直接進(jìn)行間接免疫熒光檢測,2~3小時(shí)即可得出結(jié)論,使大規(guī)模開展常規(guī)檢測成為了可能。
將制備的試劑盒密封后,置于-70℃保存,分別在3個(gè)月,6個(gè)月、11個(gè)月時(shí),用相同的血清與新鮮抗原和保存試劑盒進(jìn)行檢測對(duì)比。共檢測了20例標(biāo)本,其中采用新鮮抗原檢測的14例陽性中,保存11個(gè)月后的試劑盒檢測有13例呈陽例,僅有1例為陰性,其它6例新鮮抗原與試劑盒檢測結(jié)果皆為陰性,兩組對(duì)照結(jié)果無差異(P=1),顯示檢測結(jié)果陽性與陰性都有很高的符合率,說明試劑盒經(jīng)干燥密封,-70℃保存后,至少11個(gè)月仍可使用,從而徹底解決了抗原底物的保存問題。
由于本發(fā)明解決了APF抗原底物的提供和保存兩大難題,使得批量生產(chǎn)APF試劑盒成為了可能,不需要再從頭制備APF抗原片進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測,用制備的試劑盒可以直接開始間接免疫熒光檢測,2~3小時(shí)即可出結(jié)果,為大規(guī)模臨床應(yīng)用提供了可能。
具體實(shí)施例方式
選擇正常健康人,清潔口腔后,用海綿涂抹兩側(cè)頰粘膜,收集頰粘膜細(xì)胞。將海綿置于10mL pH=7.4的0.01mol/L PBS液中,反復(fù)擠壓海綿,使頰粘膜細(xì)胞脫落,溶入PBS液中,先于800g/min離心3分鐘,使細(xì)胞沉淀,并棄去上清液,再將收集的細(xì)胞中加入10mL含0.5%Triton-X100的PBS液,靜置10~15分鐘,以800g/min離心3分鐘,棄去上清液,最后用PBS液洗滌,并以800g/min離心3分鐘,棄去上清液。
制備好的細(xì)胞于倒置顯微鏡下計(jì)數(shù),并調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1000個(gè)/10μL,于試劑盒中每孔加入15μL,之后風(fēng)干,放入鋁箔袋中,加干燥劑密封包裝,于-70℃保存?zhèn)溆谩?br>
權(quán)利要求
1.抗核周因子試劑盒,其特征是由下述方法制備得到將人頰粘膜細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液漂洗離心后,再用含0.5%Triton-X100的磷酸鹽緩沖液靜置10~15分鐘后離心,用磷酸鹽緩沖液漂洗離心后,置于試劑盒中,干燥密封。
2.權(quán)利要求1所述抗核周因子試劑盒的制備方法,其特征是包括以下步驟a、清潔口腔,用海綿涂抹兩側(cè)頰粘膜;b、將海綿置于10mL磷酸鹽緩沖液中,擠壓海綿,使頰粘膜細(xì)胞溶入磷酸鹽緩沖液中;c、以800g/min離心3分鐘,棄去上清液;d、沉淀細(xì)胞中加入10mL含0.5%Triton-X100的磷酸鹽緩沖液,靜置10~15分鐘,以800g/min離心3分鐘,棄去上清液;e、沉淀細(xì)胞用10mL磷酸鹽緩沖液洗滌,并以800g/min離心3分鐘,棄去上清液;f、沉淀細(xì)胞置于倒置顯微鏡下計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1000個(gè)/10μL,在試劑盒上每孔加入15μL,干燥并密封試劑盒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述抗核周因子試劑盒的制備方法,其特征是所述的磷酸鹽緩沖液是pH=7.4的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液。
4.權(quán)利要求1所述抗核周因子試劑盒的保存方法,其特征是將試劑盒干燥后密封,置于-70℃保存。
全文摘要
抗核周因子試劑盒,是將人頰粘膜細(xì)胞用PBS液漂洗離心后,用含0.5%Triton-X100的PBS液靜置10~15分鐘,再用PBS液漂洗離心,置于試劑盒中,干燥密封制得,并于-70℃保存。本發(fā)明的APF試劑盒解決了抗原底物獲取和保存的兩大難題,可以使用任何健康人群的頰粘膜細(xì)胞作為抗原底物,并可在-70℃至少保存11個(gè)月,從而成功制備出了可應(yīng)用于臨床的APF檢測試劑盒。
文檔編號(hào)G01N33/53GK1484030SQ0313893
公開日2004年3月24日 申請(qǐng)日期2003年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月29日
發(fā)明者李小峰, 李鴻斌, 王彩虹, 羅靜, 張乃崢, 唐福林, 趙春陽, 王建民 申請(qǐng)人:李小峰