專利名稱：一種抗炎癥性變態(tài)反應(yīng)的中藥組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種中藥組合物，特別涉及用于抗炎癥性變態(tài)反應(yīng)和選擇性環(huán)氧化酶2抑制作用的中藥組合物，同時(shí)涉及該組合物的制備方法和質(zhì)量控制方法。
背景技術(shù)：
在各種急性重癥感染性疾病的病理生理過程中，過激的急性炎癥反應(yīng)對(duì)機(jī)體和主要靶器官嚴(yán)重?fù)p傷導(dǎo)致多器官功能衰竭是多數(shù)急性傳染病病人死亡的主要原因之一。過激的免疫反應(yīng)是免疫反應(yīng)失調(diào)的重要表現(xiàn)，包括不同的反應(yīng)類型，統(tǒng)稱為變態(tài)反應(yīng)。例如血清性休克，阿薩斯反應(yīng)，遲發(fā)變態(tài)反應(yīng)，和抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒反應(yīng)(ADCC.antibody-dependentcell-mediated cytotoxicity)。
腎上腺皮質(zhì)激素可以抑制抗體生成，在重癥感染可以起到保護(hù)靶細(xì)胞，挽救病人的生命。但是長(zhǎng)期應(yīng)用腎上腺皮質(zhì)激素后發(fā)現(xiàn)許多毒副作用，特別是在缺乏對(duì)病原體有效控制的情況下，由于免疫抑制，抗體生成受到影響(因此部分病人可能檢測(cè)抗體滴度降低)導(dǎo)致病原體擴(kuò)散和二重感染，重要器官的出血，糖代謝和電解質(zhì)紊亂等，甚至導(dǎo)致部分病人搶救失敗和病人的死亡。醫(yī)藥界多年來期望在調(diào)節(jié)病毒感染引起的ADCC反應(yīng)中不抑制抗體產(chǎn)生而能夠阻斷誘導(dǎo)免疫活性細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的介質(zhì)，避免直接殺傷靶細(xì)胞的作用的更好的免疫調(diào)節(jié)劑和具有抗炎，抗?jié)B出和抗自由基損傷的新藥。
環(huán)氧化酶2(Cyclooxygenases，COX2)和腫瘤壞死因子(TNF)是許多急慢性炎癥性疾病病理過程的重要因素，參與ADCC反應(yīng)，誘導(dǎo)免疫活性細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用。因?yàn)樵S多原因啟動(dòng)體內(nèi)的非特異性炎癥過程主要是由COX2介導(dǎo)，故參與許多重要難治性慢性炎癥過程(Inflammation)，和腫瘤的轉(zhuǎn)移和局部侵襲。例如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis)、系統(tǒng)性紅斑性狼瘡(SLE)、疼痛(Pain)、骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis)、大腸腫瘤(Colon tumor)、原發(fā)性老年期癡呆(Alzheimers disease)直腸癌(Colorectal tumor)，贅生物(Neoplasm)，肺癌(Lung tumor)，乳腺癌(Breast tumor)皮膚腫瘤(Skin tumor)膀胱腫瘤(Bladder tumor)和食道腫瘤(Esophagus tumor).選擇性COX2抑制劑的研究已經(jīng)是非類固醇抗炎藥領(lǐng)域的重要課題，目前已經(jīng)上市的有methanesulfonanalide類和Tricyclicinhibitor類，人們期望具有抗炎，抗環(huán)氧化酶2(Cyclooxygenases，COX2)和腫瘤壞死因子(TNF)抗自由基作用，而沒有影響抗體產(chǎn)生的免疫抑制作用的純中藥制劑的出現(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的在于公開一種新的抗炎癥性變態(tài)反應(yīng)和選擇性環(huán)氧化酶2抑制作用的中藥組合物；本發(fā)明的另一個(gè)目的在于公開制備一種新的抗炎癥性變態(tài)反應(yīng)和選擇性環(huán)氧化酶2抑制作用的中藥組合物的方法；本發(fā)明目的還在于公開一種新的中藥組合物的質(zhì)量控制方法。
本發(fā)明藥物組合物的原料藥組成及配比如下(按重量份)亮葉楊桐 70-140重量份 鉤藤 30-80重量份蟬蛻 30-80重量份 紫花地丁 30-80重量份靈芝孢子粉30-80重量份。
本藥物組合物的制備方法制法將亮葉楊桐，鉤藤，蟬蛻及紫花地丁分別粉碎，混合，以80-95％乙醇浸泡22-28小時(shí)，1-3次，合并浸出液，回收酒精，70-85℃干燥，收率為20-28％，與靈芝孢子粉混合，經(jīng)過常規(guī)工序直接或加入藥學(xué)上可接受的賦型劑制成臨床可接受的劑型，如片劑、口服液體制劑、膠囊、顆粒劑、注射劑等。
本組合物制成藥劑的質(zhì)量控制方法包括鑒別和/或含量測(cè)定。
鑒別方法包括下列方法中的一種和/或幾種a.亮葉楊桐的鑒別取樣品1克，加甲醇10毫升，超聲提取25-35分，過濾，水浴上揮發(fā)到5毫升，對(duì)照品石牙茶葉5克加溫水10毫升，浸泡1-3小時(shí)過濾，濾液用吹風(fēng)機(jī)吹干，再加甲醇如標(biāo)本同法提取。按薄層層析法試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各2μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上。以17-19∶5-7∶1-2氯仿-甲醇-水為展開劑，展開取出，晾干，置365nm紫外燈下檢視，供試品與對(duì)照品(原植物)應(yīng)有相同的斑點(diǎn)；b.鉤藤鑒別取樣品粉末1克，濃氨水浸潤(rùn)，以苯提取，回收溶劑，殘?jiān)?-3∶4-7苯-乙酸乙酯溶解，供點(diǎn)樣用；以鉤藤堿，異鉤藤堿，毛溝藤堿，翅果定堿作為對(duì)照品，以無水乙醇配制成0.2mg/ml溶液備用；用高效薄層板HSGF254點(diǎn)樣，7-9∶1-2∶1-2∶0.1-0.2環(huán)己烷—乙醚—甲醇—乙酸乙酯晾干，點(diǎn)樣，曬干后，紫外燈下觀察，生物堿均顯褐色暗斑；c.紫花地丁取樣品2克，加甲醇20ml回流提取，25-35分；待測(cè)；以盧丁和槲皮素為對(duì)照品；在硅膠H-1％CMC以氯仿∶甲醇∶甲酸18-22∶8-12∶2-4展開，用1％三氯化鋁乙醇溶液噴霧，干后，紫外燈下觀察有熒光斑點(diǎn)；d.靈芝孢子體取粉末顯微鏡下觀察有小圓形孢子顆粒和破壁缺口，測(cè)定RNA陽性反應(yīng)。
含量測(cè)定包括下列方法中的一種和/或幾種a.芹菜素定量對(duì)照品溶液的制備精密稱取真空干燥至恒重的芹菜素對(duì)照品20mg，置5ml容量瓶中，搖勻，用微量注射器吸取100μl，置2ml容量瓶?jī)?nèi)，用甲醇稀釋到刻度即得；供試品溶液的制備取待測(cè)樣品0.1g精密稱定；加至5ml容量瓶?jī)?nèi)，加入甲醇3ml超聲波提取25-40分，加甲醇到刻度即可，測(cè)定方法及條件HPLC色鐠條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為添充劑，甲醇∶水∶四氫呋喃以4-6∶4-6∶1-2為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為336nm，理論塔板數(shù)按芹菜素峰計(jì)算應(yīng)不低于1000；b.山茶甙測(cè)定方法山茶甙對(duì)照品溶液的制備，精密稱取真空干燥至恒重的山茶甙對(duì)照品20mg，置5ml容量瓶中，搖勻，用微量注射器吸取100μl，置2ml容量瓶?jī)?nèi)，用甲醇稀釋到刻度即得，供試品溶液的制備取待測(cè)樣品0.1g精密稱定，加至5ml容量瓶?jī)?nèi)，加入甲醇3ml超聲波提取25-35分，加甲醇到刻度即可，測(cè)定方法及條件HPLC色鐠條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為添充劑，甲醇∶水∶四氫呋喃以4-6∶4-7∶1-2為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為336nm，理論塔板數(shù)按山茶甙峰計(jì)算應(yīng)不低于1000；c.melatonine含量測(cè)定超聲波萃取法粗提Melatonin，稱取2g本組合物制劑或原料藥亮葉楊桐，并將其研磨成粉末狀，加入20ml甲醇浸泡25-35min；然后在超聲波作用下萃取25-35min；在3500-4500轉(zhuǎn)/分鐘速度下離心8-12min，取上清液；精濾用小孔徑有機(jī)系微孔濾膜過濾樣品；收集濾液，濾液用N2吹干，最后用5％甲醇水溶液2.0ml溶解此樣品以備固相萃取精提；固相萃取法濃縮精提Melatonin，①活化首先用10ml甲醇除去柱內(nèi)所有雜質(zhì)以凈化固定相；然后再用10ml水建立一個(gè)固定相環(huán)境以得到Mel的合適保留；②上樣將粗提好的樣品直接加入到固相萃取柱上經(jīng)抽真空迫使樣品溶劑通過固定相；③固定相淋洗淋洗溶劑為10ml的5％的甲醇水溶液；④Mel洗脫準(zhǔn)確量取5ml 75-85％的甲醇水溶液洗脫固相萃取柱，同時(shí)收集洗脫液，以備分析；含量測(cè)定取預(yù)處理好的樣品20μl進(jìn)樣，通過高效液相色譜柱的分離，得到melatonin峰值代入標(biāo)準(zhǔn)melatonin二項(xiàng)式中計(jì)算melatonine含量，本組合物制劑不得低于0.5-2微克/克；亮葉楊桐不得低于1.5-4微克/克。
本發(fā)明組合物具有通過抑制環(huán)氧化酶2活性，抗自由基對(duì)細(xì)胞的損傷以抗炎癥性變態(tài)反應(yīng)作用，調(diào)節(jié)免疫過激反應(yīng)，以利免疫平衡，從而防治由炎癥導(dǎo)致的感染細(xì)胞損傷和器官功能衰竭。對(duì)各種急性發(fā)熱性傳染病的急救和對(duì)癥治療，對(duì)慢性免疫失調(diào)性疾病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，過敏性疾病有很好的效果，由于組方成份中含有黃酮類和天然松果體素，因此對(duì)和失眠，焦慮和浮腫等臨床綜合征也有很好的應(yīng)用前景。且無毒副作用。
下面實(shí)驗(yàn)例用于進(jìn)一步說明本發(fā)明。為了說明本發(fā)明組合物制劑(亮藤抗炎劑)臨床治療的藥理學(xué)基礎(chǔ)，以下試驗(yàn)設(shè)計(jì)重點(diǎn)是抗炎；對(duì)輻射引起自由基增加模型的抗自由基作用。
實(shí)驗(yàn)例一 亮藤抗炎劑對(duì)COX2抑制作用及抗自由基作用(體外實(shí)驗(yàn))材料與方法鼠科巨噬細(xì)胞與單核細(xì)胞(The murine monocyte/macrophage)J774細(xì)胞系在DMEM培養(yǎng)液加入2mM glutamine，25mM，Hepes，penicillin(100u/ml)，streptomycin(100μg/ml)，10％foetal bovine serum(FBS)and1.2％Na pyruvate(Bio Whittaker，Europe).細(xì)胞加入到24孔板進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞數(shù)為2.5×105Cells/ml.37℃在5％ CO2/95％ O2培養(yǎng)2h.立即用新鮮含有FBS培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞。加入Arachidonic acid(AA)15×10-6M(Zingarelli et al.，1997)再培養(yǎng)30分鐘。離心收集上清液以放射免疫方法測(cè)定培養(yǎng)液中的PGE2然后用以計(jì)算COX-1活性。(Sautebin etal.，1999).細(xì)胞洗滌后加入培養(yǎng)液，同時(shí)加入E.Coli lipopolysaccharide(LPS，10μg/ml)，培養(yǎng)24小時(shí)，誘導(dǎo)產(chǎn)生COX-2，加入Arachidonic acid(AA)15×10-6M，培養(yǎng)30分。以放射免疫方法測(cè)定培養(yǎng)液中的PGE2然后用以計(jì)算COX-2活性。
結(jié)果表明亮藤抗炎劑對(duì)COX2有顯著抑制作用，并且呈現(xiàn)量效關(guān)系。而對(duì)COX1沒有抑制作用。
藥物濃度COX2抑制率％ COX1抑制率0.03μg/ml 34％ 00.3μg 40％ 1％3μg55％ 2％30μg 96％ 3％實(shí)驗(yàn)例二 亮藤消炎劑抗輻射誘導(dǎo)自由基的作用1、原理脂質(zhì)過氧化物(LPO)是不飽和脂肪酸受到自由基攻擊所形成的脂質(zhì)過氧化物。不飽和脂肪酸主要存在于細(xì)胞膜、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)及血小板中。是構(gòu)成磷脂、脂蛋白和膽固醇的組分，如果大量LPO形成必然會(huì)造成細(xì)胞損傷，影響細(xì)胞功能。因此根據(jù)衰老的自由基學(xué)說，LPO可以隨增令而增加。因此老齡動(dòng)物血及主要臟器中的LPO含量可以較非老齡動(dòng)物為高。如果應(yīng)用亞劑量60Co照射誘發(fā)自由基也可以造成高LPO模型。為了證明本品的抗氧化作用。特進(jìn)行本項(xiàng)試驗(yàn)2、材料與方法六月齡昆明小鼠雌性體重34～38g 20只，(由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)用于造型預(yù)實(shí)驗(yàn)。60只雄性小鼠，體重42-45g用于正式實(shí)驗(yàn)預(yù)實(shí)驗(yàn)分2組，每組10只小鼠，造型組用60Co 450拉得照射與對(duì)照組同時(shí)采血。采血時(shí)間為照射后2，4，7，11及15天。觀察血中SOD及LPO變化曲線。
正式實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為5組，1組為正常對(duì)照組，2組為照射對(duì)照組；3組為亮藤消炎劑低劑量防護(hù)組每日0.17g/kg；4組為中劑量組每日1.7g/kg；5組為高劑量組每日3.4g/kg.將亮藤消炎劑每日劑量溶解在60ml水中供飲用。喂養(yǎng)3個(gè)月。實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行60Co 450拉得照射。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果于照射后第4天LPO及SOD反應(yīng)最明顯。故在第4天采血及處死動(dòng)物，取血清，腦勻漿進(jìn)行LPO及SOD測(cè)定。
SOD及LPO測(cè)定方法按衛(wèi)生部保健食品功能學(xué)評(píng)價(jià)程序和檢驗(yàn)方法P 22及P25所提供的方法進(jìn)行。
3、結(jié)果預(yù)實(shí)驗(yàn)小鼠經(jīng)60Co 450拉得照射后4-7天血中SOD明顯下降，同時(shí)LPO明顯升高。15天后恢復(fù)正常。表明小鼠在450拉得照射條件下LPO及SOD可逆性變化模型成功，并提示正式實(shí)驗(yàn)可以在照射后4-7天采取標(biāo)本為佳。(數(shù)據(jù)見表1，2；曲線見圖2，3)。
正式實(shí)驗(yàn)在照射后第4天采取標(biāo)本(血，腦勻漿)測(cè)定結(jié)果表明SOD在中高劑量組有顯著差異(P＜0.05)且呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。血清中LPO在3個(gè)劑量組均有極顯著降低(P＜0.01)，腦勻漿中LPO含量在低，中，高劑量組有顯著差異(P＜0.05及＜0.01，見表3。)以上結(jié)果表明亮藤消炎劑具有一定的抗氧化作用。作為在自由基損傷的情況下起到一定的保護(hù)作用。
表1 小鼠經(jīng)60Co 450拉得 照射后血清SOD含量變化時(shí)間表組別 照射前 后2天 47 11 15照射組(9) 198.5±10.9 171.8±11.5 185.4±11.1 184.7±8.9 184.4±13.6 179.6±8.5對(duì)照組(8) 195.6±12.9 178.7±19.6 199.6±14.4 209.3±7.9 193.1±16.2 181.7±8.9P ＞0.05 ＞0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＞0.05 ＞0.05表2 小鼠經(jīng)60Co 450拉得 照射后血清LPO含量變化時(shí)間表組別 照射前 后2天 47 1115照射組(9) 6.56±1.18 6.29±1.68.62±0.92 7.91±0.96 7.61±0.78 6.33±0.77對(duì)照組(8) 6.07±1.25 6.37±1.29 5.57±0.59 6.09±0.94 6.04±1.60 6.81±1.06P ＞0.05 ＞0.05 ＜0.01 ＜0.05 ＜0.05 ＞0.05
表3 亮藤消炎劑對(duì)60Co照射小鼠血清SOD及LPO水平的影響組別(N＝12)SOD PLPO P1對(duì)照組151.9±11.8*19.4±8.32照射組142.8±10.2 32.9±4.93低劑量154.2±4.72:3＞0.05 12.9±3.9＜0.014中劑量166.0±6.42:4＜0.05 15.4±5.9＜0.015高劑量181.5±7.02:5＜0.01 11.2±1.9＜0.01*X±SE表4 亮藤消炎劑對(duì)60Co照射小鼠腦勻漿SOD及LPO水平的影響組別 SOD P LPO P1對(duì)照組26.8±1.0* 3.5±0.42照射組24.0±1.9 4.0±0.33低劑量24.6±1.32組＞0.053.1±0.32組＜0.054中劑量28.1±1.2＞0.05 2.7±0.2＜0.015高劑量29.8±1.1＜0.05 2.8±0.3＜0.01●X±SE；N＝12下述實(shí)施例均能實(shí)現(xiàn)上述實(shí)驗(yàn)例的效果。
說明書附1 亮藤抗炎劑對(duì)COX2抑制作用。
圖2 60Co照射后血清LPO變化時(shí)間曲線圖3 小鼠經(jīng)60Co照射后血清LPO變化時(shí)間曲線圖4 60CO照射對(duì)小鼠血漿SOD含量圖5 小鼠60CO照射后血漿LPO含量變化圖6 小鼠60CO照射后腦內(nèi)SOD含量變化圖7 小鼠60CO照射后腦內(nèi)LOP含量變化實(shí)施例1片劑亮葉楊桐 100克鉤藤 50克蟬蛻 50克 紫花地丁 50克靈芝孢子粉50克將亮葉楊桐，鉤藤，蟬蛻及紫花地丁分別粉碎，混合，以95％乙醇浸泡24小時(shí)，兩次，合并浸出液，回收酒精，攝80度干燥，收率為23-26％，與靈芝孢子粉混合，稱量50克加入10％糊精，常規(guī)制粒，制成顆粒100克，加入賦形劑，壓片(制粒壓片機(jī)一次完成)。每片重0.5克。
用法及用量每次2-4片，每天3次。
適應(yīng)癥各種急性發(fā)熱性傳染病的對(duì)癥治療，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，過敏性疾病，失眠，焦慮。
實(shí)施例2膠囊劑亮葉楊桐 120克鉤藤 60克蟬蛻 70克 紫花地丁 70克靈芝孢子粉60克將亮葉楊桐，鉤藤，蟬蛻及紫花地丁分別粉碎，混合，以90％乙醇浸泡26小時(shí)，兩次，合并浸出液，回收酒精，攝氏85度干燥，收率為23-26％，與靈芝孢子粉混合，稱量50克加入10％糊精，常規(guī)制粒，制成顆粒100克，經(jīng)常規(guī)制成膠囊，每粒重0.5克。用法及用量每次2-4粒，每天3次。
實(shí)施例3顆粒劑亮葉楊桐 90克 鉤藤 60克蟬蛻 40克 紫花地丁 40克靈芝孢子粉70克亮葉楊桐，鉤藤，蟬蛻及紫花地丁分別粉碎，混合，以90％乙醇浸泡26小時(shí)，兩次，合并浸出液，回收酒精，攝85度干燥，收率為23-26％，與靈芝孢子粉混合，以每50克所得混合物加入10％糊精，常規(guī)制粒，制成顆粒100克，經(jīng)常規(guī)制成顆粒劑。
實(shí)施例4片劑的質(zhì)量控制方法鑒別a.亮葉楊桐的鑒別取樣品1克，加甲醇10毫升，超聲提取30分，過濾，水浴上揮發(fā)到5毫升，對(duì)照品石牙茶葉5克加溫水10毫升，浸泡2小時(shí)過濾，濾液用吹風(fēng)機(jī)吹干，再加甲醇如標(biāo)本同法提取。按薄層層析法試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各2μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上。以18∶6∶1氯仿-甲醇-水為展開劑，展開取出，晾干，置365nm紫外燈下檢視，供試品與對(duì)照品(原植物)應(yīng)有相同的斑點(diǎn)；b.鉤藤鑒別取樣品粉末1克，濃氨水浸潤(rùn)，以苯提取，回收溶劑，殘?jiān)?∶5苯-乙酸乙酯溶解，供點(diǎn)樣用；以鉤藤堿，異鉤藤堿，毛溝藤堿，翅果定堿作為對(duì)照品，以無水乙醇配制成0.2mg/ml溶液備用；用高效薄層板HSGF254點(diǎn)樣，8∶1∶1∶0.1環(huán)己烷—乙醚—甲醇—乙酸乙酯晾干，點(diǎn)樣，曬干后，紫外燈下觀察，生物堿均顯褐色暗斑；c.紫花地丁取樣品2克，加甲醇20ml回流提取，30分，待測(cè)，以盧丁和槲皮素為對(duì)照品；在硅膠H-1％CMC以氯仿∶甲醇∶甲酸20∶10∶3展開，用1％三氯化鋁乙醇溶液噴霧，干后，紫外燈下觀察有熒光斑點(diǎn)；d.靈芝孢子體取粉末顯微鏡下觀察有小圓形孢子顆粒和破壁缺口，測(cè)定RNA陽性反應(yīng)；含量測(cè)定a.芹菜素定量對(duì)照品溶液的制備精密稱取真空干燥至恒重的芹，菜素對(duì)照品20mg，置5ml容量瓶中，搖勻，用微量注射器吸取100μl，置2ml容量瓶?jī)?nèi)，用甲醇稀釋到刻度即得；供試品溶液的制備取待測(cè)樣品0.1g精密稱定；加至5ml容量瓶?jī)?nèi)，加入甲醇3ml超聲波提取30分，加甲醇到刻度即可，測(cè)定方法及條件HPLC色鐠條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為添充劑，甲醇∶水∶四氫呋喃以5∶5∶1.5為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為336nm，理論塔板數(shù)按芹菜素峰計(jì)算應(yīng)不低于1000；b.山茶甙測(cè)定方法山茶甙對(duì)照品溶液的制備，精密稱取真空干燥至恒重的山茶甙對(duì)照品20mg，置5ml容量瓶中，搖勻，用微量注射器吸取100μl，置2ml容量瓶?jī)?nèi)，用甲醇稀釋到刻度即得，供試品溶液的制備取待測(cè)樣品0.1g精密稱定，加至5ml容量瓶?jī)?nèi)，加入甲醇3ml超聲波提取30分，加甲醇到刻度即可，測(cè)定方法及條件HPLC色鐠條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為添充劑，甲醇∶水∶四氫呋喃以5∶5∶1.5為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為336nm，理論塔板數(shù)按山茶甙峰計(jì)算應(yīng)不低于1000。c.melatonine含量測(cè)定超聲波萃取法粗提Melatonin，稱取2g亮藤消炎片或其原料藥亮葉楊桐，并將其研磨成粉末狀，加入20ml甲醇浸泡30min；然后在超聲波作用下萃取30min；在4000轉(zhuǎn)/分鐘速度下離心10min，取上清液；精濾用￠25mm，0.20μm小孔徑有機(jī)系微孔濾膜過濾樣品；收集濾液，濾液用N2吹干，最后用5％甲醇水溶液2.0ml溶解此樣品以備固相萃取精提；固相萃取法濃縮精提Melatonin，①活化首先用10ml甲醇除去柱內(nèi)所有雜質(zhì)以凈化固定相；然后再用10ml水建立一個(gè)固定相環(huán)境以得到Mel的合適保留；②上樣將粗提好的樣品直接加入到固相萃取柱上經(jīng)抽真空迫使樣品溶劑通過固定相；③固定相淋洗淋洗溶劑為10ml的5％的甲醇水溶液；④Mel洗脫準(zhǔn)確量取5ml 80％的甲醇水溶液洗脫固相萃取柱，同時(shí)收集洗脫液，以備分析；含量測(cè)定取預(yù)處理好的樣品20μl進(jìn)樣，通過高效液相色譜柱的分離，HPLC條件色譜柱250×4.6mm i.d.，5μm Hypersil ODS；流動(dòng)相0.05MNa2HPO4--H3PO4緩沖液∶甲醇＝60∶40(v/v)，pH4.5，等度沖洗；流速1.0ml/min；熒光檢測(cè)器Ex＝280nm，Em＝348nm；進(jìn)樣量20μl；得到melatonin峰值代入標(biāo)準(zhǔn)melatonin二項(xiàng)式中計(jì)算melatonine含量，亮藤消炎片不得低于0.5-2微克/克；亮葉楊桐不得低于2-3微克/克。
權(quán)利要求
1.炎癥性變態(tài)反應(yīng)的中藥組合物，其特征在于該中藥組合物是由下述原料藥制成的亮葉楊桐70-140重量份 鉤藤30-80重量份蟬蛻30-80重量份紫花地丁30-80重量份 靈芝孢子粉30-80重量份。
2.如權(quán)利要求1所述的中藥組合物，其特征在于該中藥組合物是由下述原料藥制成的亮葉楊桐100重量份 鉤藤50重量份蟬蛻50重量份紫花地丁50重量份靈芝孢子粉50重量份。
3.如權(quán)利要求1所述的中藥組合物，其特征在于該中藥組合物是由下述原料藥制成的亮葉楊桐120重量份 鉤藤60重量份蟬蛻70重量份紫花地丁70重量份靈芝孢子粉60重量份。
4.如權(quán)利要求1-3所述的中藥組合物的制備方法，其特征在于該方法為將亮葉楊桐，鉤藤，蟬蛻及紫花地丁分別粉碎，混合，以80-95％乙醇浸泡22-28小時(shí)，1-3次，合并浸出液，回收酒精，70-85℃干燥，收率為20-28％，與靈芝孢子粉混合，經(jīng)過常規(guī)工序直接或加入藥學(xué)上可接受的賦型劑制成臨床可接受的劑型，如片劑、口服液體制劑、膠囊、顆粒劑、注射劑。
5.如權(quán)利要求4所述的中藥組合物的制備方法，其特征在于片劑的制備方法為將亮葉楊桐，鉤藤，蟬蛻及紫花地丁分別粉碎，混合，以95％乙醇浸泡24小時(shí)，兩次，合并浸出液，回收酒精，攝氏80度干燥，收率為23-26％，與靈芝孢子粉混合得混合物，加入相當(dāng)所得混合物重量10％的糊精，常規(guī)制粒，加入賦形劑，壓片，得片劑。
6.如權(quán)利要求1-3所述的中藥組合物制劑的質(zhì)量控制方法，其特征在于該方法中的鑒別方法包括如下鑒別中的一種或幾種a.亮葉楊桐的鑒別取樣品1克，加甲醇10毫升，超聲提取25-35分，過濾，水浴上揮發(fā)到5毫升，對(duì)照品石牙茶葉5克加溫水10毫升，浸泡1-3小時(shí)過濾，濾液用吹風(fēng)機(jī)吹干，再加甲醇如標(biāo)本同法提取，按薄層層析法試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各2μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上。以17-19∶5-7∶1-2氯仿-甲醇-水為展開劑，展開取出，晾干，置365nm紫外燈下檢視，供試品與對(duì)照品應(yīng)有相同的斑點(diǎn)；b.鉤藤鑒別取樣品粉末1克，濃氨水浸潤(rùn)，以苯提取，回收溶劑，殘?jiān)?-3∶4-7苯-乙酸乙酯溶解，供點(diǎn)樣用；以鉤藤堿，異鉤藤堿，毛溝藤堿，翅果定堿作為對(duì)照品，以無水乙醇配制成0.2mg/ml溶液備用；用高效薄層板HSGF254點(diǎn)樣，7-9∶1-2∶1-2∶0.1-0.2環(huán)己烷-乙醚-甲醇-乙酸乙酯晾干，點(diǎn)樣，曬干后，紫外燈下觀察，生物堿均顯褐色暗斑；c.紫花地丁取樣品2克，加甲醇20 ml回流提取，25-35分；待測(cè)；以盧丁和槲皮素為對(duì)照品；在硅膠H-1％CMC以氯仿∶甲醇∶甲酸18-22∶8-12∶2-4展開，用1％三氯化鋁乙醇溶液噴霧，干后，紫外燈下觀察有熒光斑點(diǎn)；d.靈芝孢子體取粉末顯微鏡下觀察有小圓形孢子顆粒和破壁缺口，測(cè)定RNA陽性反應(yīng)。
7.如權(quán)利要求6所述的中藥組合物制劑的質(zhì)量控制方法，其特征在于片劑的鑒別方法包括如下鑒別中的一種或幾種a.亮葉楊桐的鑒別取樣品1克，加甲醇10毫升，超聲提取30分，過濾，水浴上揮發(fā)到5毫升，對(duì)照品石牙茶葉5克加溫水10毫升，浸泡2小時(shí)過濾，濾液用吹風(fēng)機(jī)吹干，再加甲醇如標(biāo)本同法提取.按薄層層析法試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各2μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上.以18∶6∶1氯仿-甲醇-水為展開劑，展開取出，晾干，置365nm紫外燈下檢視，供試品與對(duì)照品應(yīng)有相同的斑點(diǎn)；b.鉤藤鑒別取樣品粉末1克，濃氨水浸潤(rùn)，以苯提取，回收溶劑，殘?jiān)?5苯-乙酸乙酯溶解，供點(diǎn)樣用；以鉤藤堿，異鉤藤堿，毛溝藤堿，翅果定堿作為對(duì)照品，以無水乙醇配制成0.2mg/ml溶液備用；用高效薄層板HSGF254點(diǎn)樣，8∶1∶1∶0.1環(huán)己烷-乙醚-甲醇-乙酸乙酯晾干，點(diǎn)樣，曬干后，紫外燈下觀察，生物堿均顯褐色暗斑；c.紫花地丁取樣品2克，加甲醇20ml回流提取，30分，待測(cè)，以盧丁和槲皮素為對(duì)照品；在硅膠H-1％CMC以氯仿∶甲醇∶甲酸20∶10∶3展開，用1％三氯化鋁乙醇溶液噴霧，干后，紫外燈下觀察有熒光斑點(diǎn)；d.靈芝孢子體取粉末顯微鏡下觀察有小圓形孢子顆粒和破壁缺口，測(cè)定RNA陽性反應(yīng)。
8.如權(quán)利要求1-3所述的中藥組合物制劑的質(zhì)量控制方法，其特征在于該方法中的含量測(cè)定方法包括如下含量測(cè)定中的一種或幾種a.芹菜素定量對(duì)照品溶液的制備精密稱取真空干燥至恒重的芹菜素對(duì)照品20mg，置5ml容量瓶中，搖勻，用微量注射器吸取100μl，置2ml容量瓶?jī)?nèi)，用甲醇稀釋到刻度即得；供試品溶液的制備取待測(cè)樣品0.1g精密稱定；加至5ml容量瓶?jī)?nèi)，加入甲醇3ml超聲波提取25-40分，加甲醇到刻度即可，測(cè)定方法及條件HPLC色鐠條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為添充劑，甲醇∶水∶四氫呋喃以4-6∶4-6∶1-2為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為336nm，理論塔板數(shù)按芹菜素峰計(jì)算應(yīng)不低于1000；b.山茶甙測(cè)定方法山茶甙對(duì)照品溶液的制備，精密稱取真空干燥至恒重的山茶甙對(duì)照品20mg，置5ml容量瓶中，搖勻，用微量注射器吸取100μl，置2ml容量瓶?jī)?nèi)，用甲醇稀釋到刻度即得，供試品溶液的制備取待測(cè)樣品0.1g精密稱定，加至5ml容量瓶?jī)?nèi)，加入甲醇3ml超聲波提取25-35分，加甲醇到刻度即可，測(cè)定方法及條件HPLC色鐠條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為添充劑，甲醇∶水∶四氫呋喃以4-6∶4-7∶1-2為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為336nm，理論塔板數(shù)按山茶甙峰計(jì)算應(yīng)不低于1000；c.melatonine含量測(cè)定超聲波萃取法粗提Melatonin，稱取2g本組合物制劑或原料藥亮葉楊桐，并將其研磨成粉末狀，加入20ml甲醇浸泡25-35min；然后在超聲波作用下萃取25-35min；在3500-4500轉(zhuǎn)/分鐘速度下離心8-12min，取上清液；精濾用小孔徑有機(jī)系微孔濾膜過濾樣品；收集濾液，濾液用N2吹干，最后用5％甲醇水溶液2.0ml溶解此樣品以備固相萃取精提；固相萃取法濃縮精提Melatonin，①活化首先用10ml甲醇除去柱內(nèi)所有雜質(zhì)以凈化固定相；然后再用10ml水建立一個(gè)固定相環(huán)境以得到Mel的合適保留；②上樣將粗提好的樣品直接加入到固相萃取柱上經(jīng)抽真空迫使樣品溶劑通過固定相；③固定相淋洗淋洗溶劑為10ml的5％的甲醇水溶液；④Mel洗脫準(zhǔn)確量取5ml 75-85％的甲醇水溶液洗脫固相萃取柱，同時(shí)收集洗脫液，以備分析；含量測(cè)定取預(yù)處理好的樣品20μl進(jìn)樣，通過高效液相色譜柱的分離，得到melatonin峰值代入標(biāo)準(zhǔn)melatonin二項(xiàng)式中計(jì)算melatonine含量，本組合物制劑不得低于0.5-2微克/克；亮葉楊桐不得低于1.5-4微克/克。
9.如權(quán)利要求8所述的中藥制劑的質(zhì)量控制方法，其特征在于片劑的含量測(cè)定方法包括如下含量測(cè)定中的一種或幾種a.芹菜素定量對(duì)照品溶液的制備精密稱取真空干燥至恒重的芹菜素對(duì)照品20mg，置5ml容量瓶中，搖勻，用微量注射器吸取100μl，置2ml容量瓶?jī)?nèi)，用甲醇稀釋到刻度即得；供試品溶液的制備取待測(cè)樣品0.1g精密稱定；加至5ml容量瓶?jī)?nèi)，加入甲醇3ml超聲波提取30分，加甲醇到刻度即可，測(cè)定方法及條件HPLC色鐠條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為添充劑，甲醇∶水∶四氫呋喃以5∶5∶1.5為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為336nm，理論塔板數(shù)按芹菜素峰計(jì)算應(yīng)不低于1000；b.山茶甙測(cè)定方法山茶甙對(duì)照品溶液的制備，精密稱取真空干燥至恒重的山茶甙對(duì)照品20mg，置5ml容量瓶中，搖勻，用微量注射器吸取100μl，置2ml容量瓶?jī)?nèi)，用甲醇稀釋到刻度即得，供試品溶液的制備取待測(cè)樣品0.1g精密稱定，加至5ml容量瓶?jī)?nèi)，加入甲醇3ml超聲波提取30分，加甲醇到刻度即可，測(cè)定方法及條件HPLC色鐠條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為添充劑，甲醇∶水∶四氫呋喃以5∶5∶1.5為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為336nm，理論塔板數(shù)按山茶甙峰計(jì)算應(yīng)不低于1000；c.melatonine含量測(cè)定超聲波萃取法粗提Melatonin，稱取2g亮藤消炎片或其原料藥亮葉楊桐，并將其研磨成粉末狀，加入20ml甲醇浸泡30min；然后在超聲波作用下萃取30min；在4000轉(zhuǎn)/分鐘速度下離心10min，取上清液；精濾用￠25mm，0.20μm小孔徑有機(jī)系微孔濾膜過濾樣品；收集濾液，濾液用N2吹干，最后用5％甲醇水溶液2.0ml溶解此樣品以備固相萃取精提；固相萃取法濃縮精提Melatonin，①活化首先用10ml甲醇除去柱內(nèi)所有雜質(zhì)以凈化固定相；然后再用10ml水建立一個(gè)固定相環(huán)境以得到Mel的合適保留；②上樣將粗提好的樣品直接加入到固相萃取柱上經(jīng)抽真空迫使樣品溶劑通過固定相；③固定相淋洗淋洗溶劑為10ml的5％的甲醇水溶液；④Mel洗脫準(zhǔn)確量取5ml 80％的甲醇水溶液洗脫固相萃取柱，同時(shí)收集洗脫液，以備分析；含量測(cè)定取預(yù)處理好的樣品20μl進(jìn)樣，通過高效液相色譜柱的分離，HPLC條件色譜柱250×4.6mm i.d.，5μm Hypersil ODS；流動(dòng)相0.05MNa2HPO4--H3PO4緩沖液∶甲醇＝60∶40(v/v)，pH4.5，等度沖洗；流速1.0ml/min；熒光檢測(cè)器Ex＝280nm，Em＝348nm；進(jìn)樣量20μl；得到melatonin峰值代入標(biāo)準(zhǔn)melatonin二項(xiàng)式中計(jì)算melatonine含量，亮藤消炎片不得低于0.5-2微克/克；亮葉楊桐不得低于2-3微克/克。
10.如權(quán)利要求1-3所述的中藥組合物制劑的質(zhì)量控制方法，其特征在于該方法包括以下步驟鑒別a.亮葉楊桐的鑒別取樣品1克，加甲醇10毫升，超聲提取25-35分，過濾，水浴上揮發(fā)到5毫升，對(duì)照品石牙茶葉5克加溫水10毫升，浸泡1-3小時(shí)過濾，濾液用吹風(fēng)機(jī)吹干，再加甲醇如標(biāo)本同法提取。按薄層層析法試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各2μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上。以17-19∶5-7∶1-2氯仿-甲醇-水為展開劑，展開取出，晾干，置365nm紫外燈下檢視，供試品與對(duì)照品應(yīng)有相同的斑點(diǎn)；b.鉤藤鑒別取樣品粉末1克，濃氨水浸潤(rùn)，以苯提取，回收溶劑，殘?jiān)?-3∶4-7苯-乙酸乙酯溶解，供點(diǎn)樣用；以鉤藤堿，異鉤藤堿，毛溝藤堿，翅果定堿作為對(duì)照品，以無水乙醇配制成0.2mg/ml溶液備用；用高效薄層板HSGF254點(diǎn)樣，7-91-2∶1-2∶0.1-0.2環(huán)己烷-乙醚-甲醇-乙酸乙酯晾干，點(diǎn)樣，曬干后，紫外燈下觀察，生物堿均顯褐色暗斑；c.紫花地丁取樣品2克，加甲醇20ml回流提取，25-35分；待測(cè)；以盧丁和槲皮素為對(duì)照品；在硅膠H-1％CMC以氯仿∶甲醇∶甲酸18-22∶8-12∶2-4展開，用1％三氯化鋁乙醇溶液噴霧，干后，紫外燈下觀察有熒光斑點(diǎn)；d.靈芝孢子體取粉末顯微鏡下觀察有小圓形孢子顆粒和破壁缺口，測(cè)定RNA陽性反應(yīng)；含量測(cè)定a.芹菜素定量對(duì)照品溶液的制備精密稱取真空干燥至恒重的芹菜素對(duì)照品20mg，置5ml容量瓶中，搖勻，用微量注射器吸取100μl，置2ml容量瓶?jī)?nèi)，用甲醇稀釋到刻度即得；供試品溶液的制備取待測(cè)樣品0.1g精密稱定；加至5ml容量瓶?jī)?nèi)，加入甲醇3ml超聲波提取25-40分，加甲醇到刻度即可，測(cè)定方法及條件HPLC色鐠條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為添充劑，甲醇∶水∶四氫呋喃以4-6∶4-6∶1-2為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為336nm，理論塔板數(shù)按芹菜素峰計(jì)算應(yīng)不低于1000；b.山茶甙測(cè)定方法山茶甙對(duì)照品溶液的制備，精密稱取真空干燥至恒重的山茶甙對(duì)照品20mg，置5ml容量瓶中，搖勻，用微量注射器吸取100μl，置2ml容量瓶?jī)?nèi)，用甲醇稀釋到刻度即得，供試品溶液的制備取待測(cè)樣品0.1g精密稱定，加至5ml容量瓶?jī)?nèi)，加入甲醇3ml超聲波提取25-35分，加甲醇到刻度即可，測(cè)定方法及條件HPLC色鐠條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為添充劑，甲醇∶水∶四氫呋喃以4-6∶4-7∶1-2為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為336nm，理論塔板數(shù)按山茶甙峰計(jì)算應(yīng)不低于1000；c.melatonine含量測(cè)定超聲波萃取法粗提Melatonin，稱取2g本組合物制劑或原料藥亮葉楊桐，并將其研磨成粉末狀，加入20ml甲醇浸泡25-35min；然后在超聲波作用下萃取25-35min；在3500-4500轉(zhuǎn)/分鐘速度下離心8-12min，取上清液；精濾用小孔徑有機(jī)系微孔濾膜過濾樣品；收集濾液，濾液用N2吹干，最后用5％甲醇水溶液2.0ml溶解此樣品以備固相萃取精提；固相萃取法濃縮精提Melatonin，①活化首先用10ml甲醇除去柱內(nèi)所有雜質(zhì)以凈化固定相；然后再用10ml水建立一個(gè)固定相環(huán)境以得到Mel的合適保留；②上樣將粗提好的樣品直接加入到固相萃取柱上經(jīng)抽真空迫使樣品溶劑通過固定相；③固定相淋洗淋洗溶劑為10ml的5％的甲醇水溶液；④Mel洗脫準(zhǔn)確量取5ml 75-85％的甲醇水溶液洗脫固相萃取柱，同時(shí)收集洗脫液，以備分析；含量測(cè)定取預(yù)處理好的樣品20μl進(jìn)樣，通過高效液相色譜柱的分離，得到melatonin峰值代入標(biāo)準(zhǔn)melatonin二項(xiàng)式中計(jì)算melatonine含量，本組合物制劑不得低于0.5-2微克/克；亮葉楊桐不得低于1.5-4微克/克。
11.如權(quán)利要求10所述的中藥組合物制劑的質(zhì)量控制方法，其特征在于用于片劑的方法包括以下步驟鑒別a.亮葉楊桐的鑒別取樣品1克，加甲醇10毫升，超聲提取30分，過濾，水浴上揮發(fā)到5毫升，對(duì)照品石牙茶葉5克加溫水10毫升，浸泡2小時(shí)過濾，濾液用吹風(fēng)機(jī)吹干，再加甲醇如標(biāo)本同法提取.按薄層層析法試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各2μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上.以18∶6∶1氯仿-甲醇-水為展開劑，展開取出，晾干，置365nm紫外燈下檢視，供試品與對(duì)照品應(yīng)有相同的斑點(diǎn)；b.鉤藤鑒別取樣品粉末1克，濃氨水浸潤(rùn)，以苯提取，回收溶劑，殘?jiān)?5苯-乙酸乙酯溶解，供點(diǎn)樣用；以鉤藤堿，異鉤藤堿，毛溝藤堿，翅果定堿作為對(duì)照品，以無水乙醇配制成0.2mg/ml溶液備用；用高效薄層板HSGF254點(diǎn)樣，8∶1∶1∶0.1環(huán)己烷-乙醚-甲醇-乙酸乙酯晾干，點(diǎn)樣，曬干后，紫外燈下觀察，生物堿均顯褐色暗斑；c.紫花地丁取樣品2克，加甲醇20ml回流提取，30分，待測(cè)，以盧丁和槲皮素為對(duì)照品；在硅膠H-1％CMC以氯仿∶甲醇∶甲酸20∶10∶3展開，用1％三氯化鋁乙醇溶液噴霧，干后， 紫外燈下觀察有熒光斑點(diǎn)；d.靈芝孢子體取粉末顯微鏡下觀察有小圓形孢子顆粒和破壁缺口，測(cè)定RNA陽性反應(yīng)；含量測(cè)定a.芹菜素定量對(duì)照品溶液的制備精密稱取真空干燥至恒重的芹，菜素對(duì)照品20mg，置5ml容量瓶中，搖勻，用微量注射器吸取100μl，置2ml容量瓶?jī)?nèi)，用甲醇稀釋到刻度即得；供試品溶液的制備取待測(cè)樣品0.1g精密稱定；加至5ml容量瓶?jī)?nèi)，加入甲醇3ml超聲波提取30分，加甲醇到刻度即可，測(cè)定方法及條件HPLC色鐠條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為添充劑，甲醇∶水∶四氫呋喃以5∶5∶1.5為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為336nm，理論塔板數(shù)按芹菜素峰計(jì)算應(yīng)不低于1000；b.山茶甙測(cè)定方法山茶甙對(duì)照品溶液的制備，精密稱取真空干燥至恒重的山茶甙對(duì)照品20mg，置5ml容量瓶中，搖勻，用微量注射器吸取100μl，置2ml容量瓶?jī)?nèi)，用甲醇稀釋到刻度即得，供試品溶液的制備取待測(cè)樣品0.1g精密稱定，加至5ml容量瓶?jī)?nèi)，加入甲醇3ml超聲波提取30分，加甲醇到刻度即可，測(cè)定方法及條件HPLC色鐠條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為添充劑，甲醇∶水∶四氫呋喃以5∶5∶1.5為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為336nm，理論塔板數(shù)按山茶甙峰計(jì)算應(yīng)不低于1000；c.melatonine含量測(cè)定超聲波萃取法粗提Melatonin，稱取2g亮藤消炎片或其原料藥亮葉楊桐，并將其研磨成粉末狀，加入20ml甲醇浸泡30min；然后在超聲波作用下萃取30min；在4000轉(zhuǎn)/分鐘速度下離心10min，取上清液；精濾用￠25mm，0.20μm小孔徑有機(jī)系微孔濾膜過濾樣品；收集濾液，濾液用N2吹干，最后用5％甲醇水溶液2.0ml溶解此樣品以備固相萃取精提；固相萃取法濃縮精提Melatonin，①活化首先用10ml甲醇除去柱內(nèi)所有雜質(zhì)以凈化固定相；然后再用10ml水建立一個(gè)固定相環(huán)境以得到Mel的合適保留；②上樣將粗提好的樣品直接加入到固相萃取柱上經(jīng)抽真空迫使樣品溶劑通過固定相；③固定相淋洗淋洗溶劑為10ml的5％的甲醇水溶液；④Mel洗脫準(zhǔn)確量取5ml 80％的甲醇水溶液洗脫固相萃取柱，同時(shí)收集洗脫液，以備分析；含量測(cè)定取預(yù)處理好的樣品20μl進(jìn)樣，通過高效液相色譜柱的分離，HPLC條件色譜柱250×4.6mm i.d.，5μm Hypersil ODS；流動(dòng)相0.05MNa2HPO4--H3PO4緩沖液∶甲醇＝60∶40(v/v)，pH4.5，等度沖洗；流速1.0ml/min；熒光檢測(cè)器Ex＝280nm，Em＝348nm；進(jìn)樣量20μl；得到melatonin峰值代入標(biāo)準(zhǔn)melatonin二項(xiàng)式中計(jì)算melatonine含量，亮藤消炎片不得低于0.5-2微克/克；亮葉楊桐不得低于2-3微克/克。
12.如權(quán)利要求1-3所述的中藥組合物在制備選擇性抑制環(huán)氧化酶2活性和/或抗自由基對(duì)細(xì)胞的損傷的藥物中的應(yīng)用。
13.如權(quán)利要求12所述的應(yīng)用，其特征在于在制備抗炎癥性變態(tài)反應(yīng)藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗炎癥性變態(tài)反應(yīng)和選擇性環(huán)氧化酶2抑制作用的中藥組合物及其制備方法和質(zhì)量控制方法。該組合物主要由亮葉楊桐、鉤藤、蟬蛻、紫花地丁、靈芝孢子粉組成。該中藥組合物制備時(shí)將亮葉楊桐，鉤藤，蟬蛻及紫花地丁分別粉碎，混合，以80－95％乙醇浸泡22－28小時(shí)，1－3次，合并浸出液，回收酒精，70－85℃干燥，收率為20－28％，與靈芝孢子粉混合，經(jīng)過常規(guī)工序直接或加入藥學(xué)上可接受的賦型劑制成臨床可接受的劑型。同時(shí)本發(fā)明還提供了對(duì)該組合物進(jìn)行成分鑒別、含量測(cè)定的質(zhì)量控制方法。本組合物有很好抗炎癥性變態(tài)反應(yīng)和選擇性環(huán)氧化酶2抑制作用。
文檔編號(hào)G01N33/15GK1572317SQ0314853
公開日2005年2月2日 申請(qǐng)日期2003年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月3日
發(fā)明者霍玉書, 霍虹 申請(qǐng)人:霍玉書