專利名稱：檢測(cè)鹽酸克倫特羅的參比免疫層析試紙及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地說(shuō)是涉及檢測(cè)鹽酸克倫特羅的參比免疫層析試紙及其檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
鹽酸克倫特羅(clenbuterol，Cl)(俗稱“瘦肉精”)，化學(xué)名稱為α-[(叔丁氨基)甲基]-4-氨基-3，5-二氯苯甲醇鹽酸鹽，又名雙氯胺、氯哮素、克喘寧，為β-腎上腺素激動(dòng)劑的一種。用Cl喂養(yǎng)生豬，可提高瘦肉率，但人食用含Cl過(guò)量的肉品，會(huì)出現(xiàn)心率過(guò)速、心悸、肌肉震顫等心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的不良反應(yīng)，嚴(yán)重危害人體健康。農(nóng)業(yè)部、對(duì)外貿(mào)易經(jīng)濟(jì)合作部和國(guó)家出入境檢驗(yàn)檢疫局等部門多次發(fā)文嚴(yán)令禁止在動(dòng)物生產(chǎn)中使用β-腎上腺素激動(dòng)劑。但國(guó)內(nèi)部分地區(qū)仍存在非法生產(chǎn)、使用“瘦肉精”等β-激動(dòng)劑類產(chǎn)品的現(xiàn)象，并發(fā)生多起中毒事件。許多國(guó)家對(duì)飼料和食品中的Cl實(shí)施了嚴(yán)格的監(jiān)控。在養(yǎng)殖場(chǎng)，Cl監(jiān)測(cè)最經(jīng)常采集的活體樣品是尿液，其它易于采集的有效樣品如血漿，奶，糞便和飼料也被經(jīng)常使用。
目前，測(cè)定Cl的方法有高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)、高效液相色譜法(HPLC)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(ELISA)和放射免疫測(cè)定法(RIA)等。目前免疫測(cè)定法、ELISA和GC-MS的靈敏度能較好地滿足Cl殘留分析要求，應(yīng)用較多，檢測(cè)限通常低于0.5μg/kg，前者是主要的篩選方法，后者則是成熟的確證方法。由于以上方法均需借助高檔的儀器和設(shè)備，成本高，同時(shí)對(duì)操作人員需要特殊培訓(xùn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)法立即顯示。因此不適合于商檢、防疫、畜牧生產(chǎn)者對(duì)懷疑對(duì)象的快速篩查和監(jiān)控。
ELISA檢測(cè)Cl已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道，目前公開的專利為“一種鹽酸克倫特羅酶免疫檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法”(申請(qǐng)?zhí)枺?2137941.6)。
免疫層析是出現(xiàn)于80年代初期的一種獨(dú)特的免疫分析方式，它通常以條狀纖維層析材料為固相，通過(guò)毛細(xì)作用使樣品溶液在層析條上泳動(dòng)，并同時(shí)使樣品中的待測(cè)物與層析材料上針對(duì)待測(cè)物的受體(如抗體或抗原)發(fā)生高特異、高親和性的免疫反應(yīng)。層析過(guò)程中免疫復(fù)合物被富集或截留在層析材料的一定區(qū)域(檢測(cè)線)，通過(guò)酶反應(yīng)、或直接利用可目測(cè)的標(biāo)記物(如膠體金)所看到的直觀的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象(如顯色)而獲得測(cè)定結(jié)果。而游離標(biāo)記物(即未與待測(cè)物結(jié)合的標(biāo)記物)則越過(guò)檢測(cè)帶，達(dá)到與結(jié)合標(biāo)記物自動(dòng)分離之目的。免疫層析技術(shù)常見(jiàn)的示蹤粒子有膠體金、乳膠、膠體硒、明膠等，其中運(yùn)用最成功的標(biāo)記物為膠體金。
免疫層析用于測(cè)定Cl，目前公開的相關(guān)專利如下①樣本中的Cl/層析膜上的Cl共同競(jìng)爭(zhēng)示蹤粒子標(biāo)記的限量抗體，通過(guò)檢測(cè)條帶出現(xiàn)與否判斷結(jié)果。如本發(fā)明人先前公開的發(fā)明專利“一種免疫層析一步法檢測(cè)β-腎上腺素激動(dòng)劑類藥物的方法及試紙的制備”(申請(qǐng)?zhí)枺?2131321.0)。另外，發(fā)明專利“鹽酸克倫特羅快速檢測(cè)試紙條”(申請(qǐng)?zhí)枺?2101928.2)和實(shí)用新型專利“鹽酸克倫特羅快速檢測(cè)試紙條”(申請(qǐng)?zhí)枺?2202033.0)也用了類似的方法。
②樣本中的Cl/示蹤粒子標(biāo)記的Cl共同競(jìng)爭(zhēng)層析膜上的限量抗體，通過(guò)檢測(cè)條帶出現(xiàn)與否判斷結(jié)果。例如，公開的實(shí)用新型專利“鹽酸克倫特羅快速檢測(cè)試紙條(II)”(申請(qǐng)?zhí)枺?2228104.5)。
③樣本中的Cl/示蹤粒子標(biāo)記的Cl共同競(jìng)爭(zhēng)層析膜上的限量抗體，通過(guò)檢測(cè)條帶出現(xiàn)的條數(shù)判斷結(jié)果。例如，公開的專利“半定量快速檢測(cè)鹽酸克倫特羅的膠體金試紙條及生產(chǎn)和使用方法”(申請(qǐng)?zhí)枺?2139704.X)。
上述3種免疫層析檢測(cè)模式有一個(gè)共同的特點(diǎn)，就是用于定量時(shí)沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)品作參照，必需通過(guò)檢測(cè)體系中加入Cl/抗Cl抗體的量或選擇嚴(yán)格的檢測(cè)材料，通過(guò)控制檢測(cè)靈敏度的方法來(lái)定量。由此產(chǎn)生的缺點(diǎn)為生產(chǎn)工藝復(fù)雜化，或定量的準(zhǔn)確性隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)而發(fā)生變化。另外，上述3種免疫層析檢測(cè)模式不能同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣本，檢測(cè)模式1和2不能對(duì)鹽酸克倫特羅具體含量作一個(gè)初步判斷。而ELISA檢測(cè)Cl操作復(fù)雜，檢測(cè)步驟多，需要的試劑多，不能常溫保存，只能批量檢測(cè)，不適合于商檢、防疫、畜牧生產(chǎn)者對(duì)懷疑對(duì)象的快速篩查和監(jiān)控。因此，迫切需要有一種簡(jiǎn)單、快速、便于保存、適合于非批量、多個(gè)樣品現(xiàn)場(chǎng)篩查Cl的檢測(cè)試紙，并建立其檢測(cè)的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足之處，而提供一種結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、使用方便、保存時(shí)間長(zhǎng)、可在并排的2-10張單元試紙條上分別加入樣本和標(biāo)準(zhǔn)品而同時(shí)進(jìn)行非批量、多個(gè)樣品檢測(cè)的一種檢測(cè)鹽酸克倫特羅(clenbuterol，Cl)濃度的參比免疫層析試紙。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種步驟簡(jiǎn)單、快速、靈敏、準(zhǔn)確的利用本發(fā)明的參比免疫試紙檢測(cè)鹽酸克倫特羅的方法。
本發(fā)明的目的通過(guò)以下的方案來(lái)實(shí)現(xiàn)制備檢測(cè)鹽酸克倫特羅的參比免疫層析試紙，它包括以下兩種形式A.試紙由底卡、面卡和參比免疫層析試紙芯組成，其中由2-10條單元試紙條并排組成的參比免疫層析試紙芯固定在底卡和面卡之間，面卡上預(yù)留加樣孔和觀察窗，加樣孔的位置與單元試紙條的樣品墊對(duì)應(yīng)，觀察窗的位置與單元試紙條的層析膜對(duì)應(yīng)；B.試紙由底卡、面卡、參比免疫層析試紙芯和樣品杯組成其中由2-10條單元試紙條并排組成的參比免疫層析試紙芯固定在底卡和面卡之間，單元試紙條的樣品墊伸出底卡和面卡之外，面卡上預(yù)留觀察窗，觀察窗的位置與單元試紙條的層析膜對(duì)應(yīng)，樣品杯位于參比免疫層析試紙之下，每個(gè)樣品杯的位置與每條單元試紙條對(duì)應(yīng)。
單元試紙條的層析膜上有1-4條鹽酸克倫特羅抗體線狀點(diǎn)樣的檢測(cè)線，示蹤粒子 結(jié)合墊上有示蹤粒子標(biāo)記鹽酸克倫特羅-載體蛋白偶聯(lián)物的結(jié)合物；或者，單元試紙條的層析膜上有1-4條鹽酸克倫特羅-載體蛋白偶聯(lián)物線狀點(diǎn)樣的檢測(cè)線，示蹤粒子結(jié)合墊上有示蹤粒子標(biāo)記鹽酸克倫特羅抗體的結(jié)合物。單元試紙條層析膜上的鹽酸克倫特羅抗體線狀點(diǎn)樣的檢測(cè)線或鹽酸克倫特羅-載體蛋白偶聯(lián)物線狀點(diǎn)樣的檢測(cè)線優(yōu)選為1-2條。
用本發(fā)明的檢測(cè)鹽酸克倫特羅的免疫層析試紙檢測(cè)鹽酸克倫特羅的方法，包括按以下順序進(jìn)行的步驟[1]樣品處理；[2]在參比免疫層析試紙的加樣孔上分別加入Cl標(biāo)準(zhǔn)和樣本，加入Cl標(biāo)準(zhǔn)與加入樣本的單元試紙條數(shù)為任意比例；或者，將形式B的參比免疫層析試紙芯的單元試紙條的樣品墊插入對(duì)應(yīng)的樣品杯中，加入Cl標(biāo)準(zhǔn)與加入樣本的樣品杯數(shù)為任意比例；[3]用以下兩種方法中的任何一種檢測(cè)樣本中鹽酸克倫特羅的濃度①比較在相同的位置，樣本單元試紙條與標(biāo)準(zhǔn)單元試紙條出現(xiàn)條帶 的時(shí)間，樣本單元試紙條在相同位置出現(xiàn)條帶的時(shí)間比某標(biāo)準(zhǔn)單元試紙條出現(xiàn)的時(shí)間晚，則樣品內(nèi)Cl濃度大于某標(biāo)準(zhǔn)濃度；②在相同時(shí)間內(nèi)，比較樣本單元試紙條和單元試紙條出現(xiàn)的條帶顏色，在相同時(shí)間內(nèi)，樣本單元試紙條在相同位置出現(xiàn)條帶的顏色比某標(biāo)準(zhǔn)單元試紙條出現(xiàn)的顏色淺，則樣本內(nèi)Cl濃度大于某標(biāo)準(zhǔn)濃度。
用本發(fā)明的方法檢測(cè)鹽酸克倫特羅時(shí)，其檢測(cè)下限為1ng/ml。
本發(fā)明的檢測(cè)鹽酸克倫特羅參比免疫層析試紙制作方法如下[1]單元試紙的制作單元試紙條的層析膜上的檢測(cè)線用以下的模式1或模式2制備模式1用抗鹽酸克倫特羅抗體(ClenbuteroAntibody，Cl-Ab)在層析膜上線狀點(diǎn)樣作為檢測(cè)線。將硝酸纖維素膜(NC膜)按10-35mm寬的尺寸剪裁。Cl-Ab用緩沖液充分透析后，將濃度調(diào)整為0.01-5mg/ml，在膜上分別線狀點(diǎn)樣作為檢測(cè)線，檢測(cè)線點(diǎn)樣位置離膜底邊4-16mm，兩條檢測(cè)線之間的距離為2-12mm。
模式2用鹽酸克倫特羅-載體蛋白偶聯(lián)物(Clenbuterol-carrier protein，Cl-Cp)在層析膜上線狀點(diǎn)樣作為檢測(cè)線。將NC膜按10-35mm寬的尺寸剪裁。Cl-Cp溶液用緩沖液充分透析后，將濃度調(diào)整為0.01-5mg/ml，在膜上分別線狀點(diǎn)樣作為檢測(cè)線，檢測(cè)線點(diǎn)樣位置離膜底邊4-16mm，兩條檢測(cè)線之間的距離為2-12mm。
根據(jù)層析的原理，層析的距離離加樣孔越遠(yuǎn)，層析的速度越慢，分辨率越高。本發(fā)明利用了層析的原理，采用多條層析膜檢測(cè)線，以提高分辨率，本發(fā)明根據(jù)被測(cè)樣品中Cl含量的范圍，采用的層析膜檢測(cè)線為1-4條，優(yōu)選為1-2條。
單元試紙條的示蹤粒子結(jié)合物墊用以下的模式3或模式4制備模式3用示蹤粒子標(biāo)記的Cl-Cp結(jié)合物分散在玻璃纖維紙上，作為示蹤粒子結(jié)合物墊；模式4用示蹤粒子標(biāo)記的Cl-Ab結(jié)合物分散在玻璃纖維紙上，作為示蹤粒子結(jié)合物墊。
制備示蹤粒子結(jié)合物墊的示蹤粒子選自膠體金顆粒、膠體硒顆粒、乳膠顆粒，其制備和標(biāo)記方法如下(a)膠體金顆粒膠體金溶膠制備取0.01％四氯化金水溶液200ml，加熱至沸騰，加入1-20ml1％檸檬酸鈉水溶液，煮沸5min，出現(xiàn)橙紅色，膠體金顆粒直徑由電鏡測(cè)定為10-80nm；膠體金標(biāo)記Cl-Cp/Cl-Ab取50ml膠體金，用0.1mol/L碳酸鉀調(diào)pH(標(biāo)記Cl-Cp選用pH6.0-7.5，標(biāo)記Cl-Ab選用pH7.5-9.0)，攪拌下將膠體金溶膠和Cl-Cp/Cl-Ab混合，再加入聚乙二醇水溶液，使其終濃度為0.05％。將粗制品在4,000-20,000×g下離心45min，沉淀用生理鹽水混懸至1.5ml，4℃保存。
(b)膠體硒顆粒膠體硒溶膠制備在1升容量的四頸圓底燒瓶?jī)?nèi)加入去離子水550ml和聚丙烯酸5-20g，通氮室溫?cái)嚢璨⒓尤胨想?0-100ml，繼續(xù)攪拌10-30分鐘。將亞硒酸5-15g溶解于280ml水中，室溫?cái)嚢柘碌稳敕磻?yīng)混合液得到50-250nm紅色硒溶膠。
膠體硒標(biāo)記Cl-Cp/Cl-AbCl-Cp/Cl-Ab用20mmol/L磷酸鹽緩沖液(標(biāo)記Cl-Cp選用pH6.0-7.5，標(biāo)記Cl-Ab選用pH7.5-9.0)配成1-8mg/ml濃度溶液，取25μl加入25ml硒溶膠中，室溫?cái)嚢?0分鐘后加1ml1％的PEG 8000，混勻，于4℃以3,000-10,000rpm離心5分鐘，得到松軟的紅色沉淀，用含0.05％NaN3的磷酸鹽緩沖液配成1ml懸液。
(c)乳膠顆粒彩色乳膠顆粒購(gòu)自Bangs Laboratories公司。
乳膠顆粒標(biāo)記Cl-Cp/Cl-Ab用磷酸鹽緩沖液將乳膠稀釋到1％濃度，攪拌下加入一定量的Cl-Cp/Cl-Ab溶液，室溫?cái)嚢?0分鐘后于37℃水浴保溫60分鐘，4℃放置4-5小時(shí)。15,000rpm離心30分鐘，用適量磷酸鹽緩沖液重懸。
單元試紙用以下的模式5或模式6組裝，其中的襯墊為涂布粘膠的塑料板或紙板模式5參照?qǐng)D3，在襯墊上先加上用模式1制備檢測(cè)線的層析膜、然后向下依次加上用模式3制備的示蹤粒子結(jié)合物墊、樣品墊、最后在層析膜之上加上吸水墊；模式6參照?qǐng)D4，在襯墊上先加上用模式2制備檢測(cè)線的層析膜、然后向下依次加上用模式4制備的示蹤粒子結(jié)合物墊、樣品墊、最后在層析膜之上加上吸水墊。
試紙組裝完成后剪切成適當(dāng)寬度，即為單元試紙條。
參比免疫層析試紙的制作把2-10張單元試紙條并排固定在底卡上，形成參比免疫層析試紙芯，底卡一般為塑料卡，它能使襯墊上的層析膜、示蹤粒子結(jié)合物墊、樣品墊和吸水墊緊密結(jié)合，并排的單元試紙條的表面用面卡壓緊，面卡一般也為塑料卡，它可保護(hù)試紙，使其不受損壞。根據(jù)本發(fā)明的參比免疫層析試紙適用于非批量、多個(gè)樣品測(cè)定的特征，選用2-10張單元試紙條為合適。
用以下的模式7或模式8制作檢測(cè)鹽酸克羅特倫的參比免疫層析試紙模式7參照?qǐng)D1，將單元試紙條固定在底卡上，形成參比免疫層析試紙芯，試紙表面用面卡壓緊，面卡上預(yù)留加樣孔和觀察窗；加樣孔的位置與單元試紙條的樣品墊對(duì)應(yīng)，觀察窗的位置與單元試紙條的層析膜對(duì)應(yīng)。檢測(cè)時(shí)從加樣孔加樣，結(jié)果從觀察窗讀取。
模式8參照?qǐng)D2，參比免疫層析試紙分為上、下兩部分，上部為并排的單元試紙條，下部為樣品杯，單元試紙條樣品墊以上的部分固定在底卡上，試紙表面用面卡壓緊，樣品墊伸出底卡和面卡之外，面卡上對(duì)應(yīng)于層析膜的位置預(yù)留觀察窗。檢測(cè)時(shí)在樣品杯中分別裝入Cl標(biāo)準(zhǔn)品和樣本，伸出底卡和面卡的樣本墊同時(shí)插入下部的樣品杯中，結(jié)果從觀察窗讀取。
本發(fā)明的檢測(cè)鹽酸克倫特羅參比免疫層析試紙檢測(cè)鹽酸克倫特羅的方法如下[1]待檢樣品的處理1)尿樣無(wú)需處理取適量尿樣直接進(jìn)行試驗(yàn)(尿樣混濁時(shí)建議離心或過(guò)濾)。
2)低脂肪含量的肝、肉、組織取絞碎的樣品5g，加入5mM Hcl 25ml搖動(dòng)作用1.5h使其充分勻漿；取6g勻漿(相當(dāng)于1.0肝)置于離心管中離心，取上清液置另一離心管，加入1M NaOH 300μl混合作用15分鐘，加0.5M KH2PO4(pH3.0)45ml，迅速混勻，4℃下至少放置1.5小時(shí)或過(guò)夜處理。4000×g離心1分鐘或10-15℃高速離心，取上清液(幾乎清亮)，平衡至室溫。
3)高脂肪肉類組織取絞碎樣品5克加入PH 8.5，50mM Tris緩沖液25ml，振蕩作用0.5小時(shí)使其充分勻漿；加入15ml正庚烷，振動(dòng)5分鐘，4000×g或10-15℃高速離心5分鐘，用滅菌吸管移去上層庚烷液和中層脂肪液；用15ml正庚烷重復(fù)提取一次，于水溶性肉勻漿中加入0.5ml HCl，振蕩1小時(shí)；取6克肉勻漿(相當(dāng)于1.0g肉或組織)離心，上清液置另一離心管，加入1M NaOH 300μl混合作用15分鐘；加0.5M KH2PO4(pH3.0)45ml，迅速混勻，4℃下至少放置1.5小時(shí)或過(guò)夜處理。4000×g離心1分鐘或10-15℃高速離心，取上清液(幾乎清亮)，平衡至室溫。
5)飼料樣品處理方法用乳缽研碎飼料樣品，稱2.0g研碎的飼料樣品，加入2ml 1M HCl，加入16ml雙蒸水。旋流3分鐘，放振蕩器上振蕩15分鐘。2000rpm離心20分鐘，轉(zhuǎn)移出上清液并加入2ml 1M NaOH至上清液中混合，檢查pH值是否在6.5-7.5之間。2000rpm離心20分鐘，轉(zhuǎn)移出上清液。(如果上清液仍然渾濁可提高轉(zhuǎn)速或用濾紙過(guò)濾)。用雙蒸水將上清液稀釋10倍(加100μl上清液到900μl雙蒸水中并且混合好)，此時(shí)樣品總的稀釋倍數(shù)為100。取適量的稀釋上清液進(jìn)行檢測(cè)。
加樣在參比免疫層析試紙的結(jié)構(gòu)為模式7的場(chǎng)合，在2-10張單元條試紙條的加樣孔上分別加入Cl標(biāo)準(zhǔn)和樣本，加入Cl標(biāo)準(zhǔn)與加入樣本的單元試紙條數(shù)為任意比例；在參比免疫層析試紙的結(jié)構(gòu)為模式8的場(chǎng)合，在2-10個(gè)樣品杯中分別加入Cl標(biāo)準(zhǔn)和樣本，加入Cl標(biāo)準(zhǔn)與加入樣本的樣品杯數(shù)為任意比例，然后將伸出底卡和面卡外的單元試紙條的樣品墊插入樣品杯內(nèi)進(jìn)行測(cè)試。
檢測(cè)加樣后，按照下述兩種檢測(cè)方式，根據(jù)檢測(cè)線出現(xiàn)時(shí)間，或一定時(shí)間內(nèi)檢測(cè)線的顏色差異來(lái)判斷結(jié)果。
①樣本單元試紙條在相同位置出現(xiàn)條帶的時(shí)間比某標(biāo)準(zhǔn)單元試紙條出現(xiàn)的時(shí)間晚，則樣品內(nèi)Cl濃度大于某標(biāo)準(zhǔn)濃度。
②在相同時(shí)間內(nèi)，樣本單元試紙條在相同位置出現(xiàn)條帶的顏色比某標(biāo)準(zhǔn)單元試紙條出現(xiàn)的顏色淺，則樣品內(nèi)Cl濃度大于某標(biāo)準(zhǔn)濃度。
本發(fā)明同以往檢測(cè)Cl的方法，特別是ELISA相比有如下優(yōu)點(diǎn)①操作簡(jiǎn)便，只需1-2個(gè)操作步驟；②檢測(cè)速度快，5-15分鐘即可得到結(jié)果；③可單份測(cè)定也可數(shù)份同時(shí)測(cè)定、室溫保存、保存時(shí)間長(zhǎng)，并可隨身攜帶。
本發(fā)明同以往檢測(cè)Cl的方法，特別是免疫層析法相比有如下優(yōu)點(diǎn)①用標(biāo)準(zhǔn)單元試紙條作參照，不需要額外的質(zhì)控線抗體(抗示蹤粒子標(biāo)記物抗體)；②定量的準(zhǔn)確性隨著保存時(shí)間的增長(zhǎng)不會(huì)發(fā)生變化；③檢測(cè)方式靈活，可根據(jù)檢測(cè)線出現(xiàn)時(shí)間或一定時(shí)間檢測(cè)線的顏色差異來(lái)判斷結(jié)果；④可加入一個(gè)Cl標(biāo)準(zhǔn)，也可同時(shí)作幾個(gè)Cl標(biāo)準(zhǔn)；⑤可檢測(cè)一個(gè)樣本，也可同時(shí)檢測(cè)數(shù)個(gè)樣本。
本發(fā)明可應(yīng)用于檢測(cè)豬尿、人尿、奶制品、糞便、飼料、肉類食品、動(dòng)物內(nèi)臟等的Cl濃度。本發(fā)明的試紙的使用單位主要為醫(yī)院、公檢法部門、運(yùn)動(dòng)員興奮劑檢測(cè)部門、防疫站等國(guó)家監(jiān)測(cè)部門等，個(gè)人也可使用。


圖1.是參比免疫層析試紙(模式7)的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖中1.底卡；2.面卡；3.參比免疫層析試紙芯；4.加樣孔；5.觀察窗；7.層析膜；10.檢測(cè)線；1-1、1-2、1-3、1-4、1-5為單元試紙條。
圖2.是參比免疫層析試紙(模式8)的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖中1.底卡；2.面卡；3.參比免疫層析試紙芯；5.觀察窗；6.樣品墊；7.層析膜；10.檢測(cè)線；2-1、2-2、2-3、2-4、2-5為單元試紙條；8-1、8-2、8-3、8-4、8-5為樣品杯。
圖3.是參比免疫層析(模式5)試紙芯的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖中6.樣品墊；7.層析膜；9.Cl-Ab；10.檢測(cè)線；11.示蹤粒子結(jié)合物墊；12.Cl-Cp偶聯(lián)物；13示蹤粒子標(biāo)記Cl-Cp偶聯(lián)物結(jié)合物；15.吸水墊。
圖4.是參比免疫層析(模式6)試紙芯的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖中6.樣品墊；7.層析膜；9.Cl-Ab；10.檢測(cè)線；11.示蹤粒子結(jié)合物墊；12.Cl-Cp偶聯(lián)物；14.示蹤粒子標(biāo)記Cl-Ab結(jié)合物；15.吸水墊。
本發(fā)明的參比免疫層析試紙利用樣本中的Cl/示蹤粒子標(biāo)記的Cl共同競(jìng)爭(zhēng)層析膜上的限量抗體，或樣本中的Cl/層析膜上的Cl共同競(jìng)爭(zhēng)示蹤粒子標(biāo)記的限量抗體，根據(jù)檢測(cè)線出現(xiàn)時(shí)間，或一定時(shí)間內(nèi)檢測(cè)線的顏色差異來(lái)檢測(cè)樣品中Cl的原理說(shuō)明如下
參照?qǐng)D3，在樣品墊上滴加樣本或Cl標(biāo)準(zhǔn)后，樣本或Cl標(biāo)準(zhǔn)向吸水墊端擴(kuò)散，使示蹤粒子結(jié)合物墊上的示蹤粒子標(biāo)記Cl-Cp偶聯(lián)物結(jié)合物進(jìn)入樣本或Cl標(biāo)準(zhǔn)的液相，并與其一起向吸水墊端擴(kuò)散，在層析膜上，樣本或Cl標(biāo)準(zhǔn)中的Cl與示蹤粒子結(jié)合物中的Cl-Cp競(jìng)爭(zhēng)，阻止示蹤粒子結(jié)合物和Cl-Ab的反應(yīng)。由于擴(kuò)散速度較快，反應(yīng)是動(dòng)態(tài)且不完全的。在參比單元試紙條的樣品墊上加入Cl標(biāo)準(zhǔn)后，標(biāo)準(zhǔn)中的Cl和示蹤粒子合物上的標(biāo)記Cl比例是一定的，因此，標(biāo)準(zhǔn)品阻止示蹤粒子結(jié)合物和Cl-Ab的反應(yīng)的速率一定，檢測(cè)線出現(xiàn)可見(jiàn)顏色所需的時(shí)間也就一定。在檢測(cè)單元試紙條的樣品墊上同時(shí)加入樣本，如果樣本中的Cl濃度大于標(biāo)準(zhǔn)，樣本中Cl阻止示蹤粒子結(jié)合物的Cl-Cp和Cl-Ab9反應(yīng)的速率增大，檢測(cè)線上的Cl-Ab富集示蹤粒子結(jié)合物至可見(jiàn)顏色所需的時(shí)間也增加；或者，在一定的時(shí)間內(nèi)，檢測(cè)單元試紙條的檢測(cè)線條帶顏色比參比單元試紙條的淺。反之，如果樣本中的Cl濃度小于標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)線上的Cl-Ab富集示蹤粒子結(jié)合物至可見(jiàn)顏色所需的時(shí)間減少；或者，在一定的時(shí)間內(nèi)，檢測(cè)單元試紙條的檢測(cè)線條帶顏色比參比單元試紙條的深。根據(jù)可見(jiàn)顏色出現(xiàn)的先后，或同一時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)的條帶的顏色深淺便可判斷樣本中的Cl濃度大于或小于標(biāo)準(zhǔn)。
參照?qǐng)D4，在樣品墊上滴加樣本或Cl標(biāo)準(zhǔn)，樣本或Cl標(biāo)準(zhǔn)向吸水墊端擴(kuò)散，使示蹤粒子結(jié)合物墊上的示蹤粒子結(jié)合物進(jìn)入樣本或Cl標(biāo)準(zhǔn)的液相，并與其一起向吸水墊端擴(kuò)散，在層析膜上，樣本或Cl標(biāo)準(zhǔn)中的Cl與檢測(cè)線上的Cl-Cp競(jìng)爭(zhēng)，阻止檢測(cè)線上的Cl-Cp和示蹤粒子結(jié)合物的反應(yīng)。由于擴(kuò)散速度較快，反應(yīng)是動(dòng)態(tài)且不完全的。在參比單元試紙條的樣品墊上加入Cl標(biāo)準(zhǔn)后，標(biāo)準(zhǔn)中的Cl阻止檢測(cè)線中的Cl和示蹤粒子結(jié)合物反應(yīng)的速率是一定的，檢測(cè)線出現(xiàn)可見(jiàn)顏色所需的時(shí)間也就一定。在檢測(cè)單元試紙條的樣品墊上同時(shí)加入樣本，如果樣本中的Cl濃度大于標(biāo)準(zhǔn)，樣本中Cl阻止檢測(cè)線中的Cl-Cp和示蹤粒子結(jié)合物中的Cl-Ab反應(yīng)的速率增大，檢測(cè)線上Cl-Cp富集示蹤粒子結(jié)合物至可見(jiàn)顏色所需的時(shí)間增加?；蛘?，在一定的時(shí)間內(nèi)，檢測(cè)單元試紙條的檢測(cè)線條帶顏色比參比單元試紙條的淺。反之，如果樣本中的Cl濃度小于標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)線上Cl-Cp富集示蹤粒子結(jié)合物至可見(jiàn)顏色所需的時(shí)間減少?；蛘?，在一定的時(shí)間內(nèi)，檢測(cè)單元試紙條的檢測(cè)線條帶顏色比參比單元試紙條的深。根據(jù)可見(jiàn)顏色出現(xiàn)的先后，或同一時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)的條帶的顏色深淺便可判斷樣本中的Cl濃度大于或小于標(biāo)準(zhǔn)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一膠體硒參比免疫層析試紙檢測(cè)尿液的鹽酸克倫特羅濃度1.單元試紙的制作[1]硝酸纖微素層析膜(NC膜)檢測(cè)線10的制備將NC膜按25mm寬的尺寸剪裁。鹽酸克倫特羅-載體蛋白(Clenbuterol-carrier protein，Cl-Cp)12的溶液用磷酸鹽緩沖液充分透析后，將濃度調(diào)整為1mg/ml，在膜上線狀點(diǎn)樣作為檢測(cè)線，檢測(cè)線點(diǎn)樣位置離膜底邊8mm，檢測(cè)線為1條。點(diǎn)樣后的NC膜在室溫下干燥30min，再置于1％牛血清白蛋白的生理鹽水中浸泡30min，取出吸干水分，于37℃保溫30min，置室溫干燥處密封儲(chǔ)藏。
膠體硒結(jié)合物墊11的制備①膠體硒溶膠制備在1升容量的四頸圓底燒瓶?jī)?nèi)加入去離子水550ml和聚丙烯酸10g，通氮室溫?cái)嚢璨⒓尤胨想?9.5ml，繼續(xù)攪拌20分鐘。將9.63g亞硒酸溶解于280ml水中，室溫?cái)嚢柘碌稳敕磻?yīng)混合液內(nèi)，得到顆粒直為120nm的紅色硒溶膠。
②膠體硒標(biāo)記抗鹽酸克倫特羅抗體(clenbuterolantibody，Cl-Ab)9IgG型Cl-Ab用20mmol/LpH7.3磷酸鹽緩沖液配成濃度為4.6mg/ml的溶液，取25μl加入pH7.3的25ml硒溶膠中，室溫?cái)嚢?0分鐘后加1％PEG80001ml，混勻，于4℃下，以5,000rpm離心5分鐘，得到松軟的紅色沉淀，用含0.05％NaN3的磷酸鹽緩沖液配成1ml懸液。
③將膠體硒標(biāo)記的Cl-Ab結(jié)合物13分散在厚度為1mm的玻璃纖維紙上，凍干密封干燥保存。
單元試紙的組裝
在襯墊上先加上有Cl-Cp檢測(cè)線的NC膜7、然后向下依次加上膠體硒結(jié)合物墊11、樣品墊6、最后在NC膜之上加上吸水墊15。
單元試紙條的剪切單元試紙組裝完成后剪切成4mm的寬度，即為單元試紙條。
2.參比免疫層析試紙制作把10張單元試紙條并排安裝在塑料底卡1上，即成為參比免疫層析試紙芯3，試紙表面用面卡2壓緊，同時(shí)使單元試紙條的樣品墊6伸出底卡和面卡之外，面卡上對(duì)應(yīng)單元試紙條層析膜7的部位預(yù)留觀察窗5。試紙下部是和上部單元試紙條位置對(duì)應(yīng)的樣品杯8。
3.檢測(cè)方法在2個(gè)樣品杯中分別加入濃度為0和10ng/ml的Cl標(biāo)準(zhǔn)品，其余8個(gè)加入尿液樣本，把上部單元試紙條的樣品墊6平行插入下部的樣品杯中，用以下方式判斷結(jié)果。
①反應(yīng)15min，觀測(cè)條帶顏色深淺。標(biāo)準(zhǔn)0ng/ml單元試紙出現(xiàn)紅色條帶，標(biāo)準(zhǔn)10ng/ml單元試紙出現(xiàn)較弱的淺紅色條帶。如果尿樣單元試紙不出現(xiàn)條帶則Cl濃度大于10ng/ml；如果尿樣單元試紙出現(xiàn)淺紅色條帶顏色在0和10ng/ml標(biāo)準(zhǔn)單元試紙之間，則Cl濃度在0和10ng/ml之間；如果尿樣單元試紙條帶顏色和0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)單元試紙條帶顏色一致，則結(jié)果為陰性。
②反應(yīng)5min左右，標(biāo)準(zhǔn)0ng/ml單元試紙剛出現(xiàn)較弱紅色條帶，10ng/ml單元試紙不出現(xiàn)條帶，同時(shí)觀測(cè)尿樣單元試紙，如果出現(xiàn)條帶為陰性，不出現(xiàn)條帶為陽(yáng)性。
實(shí)施例二膠體金參比免疫層析試紙檢測(cè)豬肝臟樣品中鹽酸克倫特羅濃度1.單元試紙的制作[1]NC膜檢測(cè)線10的制備將NC膜按25mm寬的尺寸剪裁。Cl-Ab9用磷酸鹽緩沖液充分透析后，將濃度調(diào)整為0.1mg/ml，在膜上線狀點(diǎn)樣作為檢測(cè)線，檢測(cè)線點(diǎn)樣位置離膜底邊8mm，檢測(cè)線為1條，兩條檢測(cè)線之間的距離為6mm。點(diǎn)樣后的NC膜在室溫下干燥30min，再置于1％牛血清白蛋白的生理鹽水中浸泡30min，取出吸干水分，于37℃保溫30min，置室溫干燥處密封儲(chǔ)藏。
膠體金結(jié)合物墊的制備①膠體金溶膠制備取0.01％四氯化金水溶液200ml，加熱至沸騰，加入2ml1％檸檬酸鈉水溶液，煮沸5min，出現(xiàn)橙紅色，膠體金顆粒直徑為35-45nm；②膠體金標(biāo)記Cl-Cp12Cl-Cp的載體蛋白選用牛血清白蛋白，取50ml膠體金，用0.1mol/L碳酸鉀調(diào)pH到6.5，攪拌下加入親和純化的Cl-Cp5ml，再加入聚乙二醇水溶液，使其終濃度為0.05％。將粗制品在12000×g下離45min，沉淀用生理鹽水混懸至1.5ml并稀釋到OD520為3，4℃保存。
③將膠體金標(biāo)記的Cl-Cp結(jié)合物14分散在厚度為1mm的玻璃纖維紙上，凍干密封干燥保存。
單元試紙的組裝在襯墊上先加上有Cl-Ab檢測(cè)線的NC膜7、然后向下依次加上膠體金結(jié)合物墊11、樣品墊6、最后在NC膜之上加上吸水墊15。
單元試紙條的剪切單元試紙組裝完成后剪切成4mm的寬度，即為單元試紙條。
2.參比免疫層析試紙制作把3張單元試紙條并排安裝在塑料底卡1上，即成為參比免疫層析試紙芯3，試紙表面用面卡2壓緊，面卡在對(duì)應(yīng)單元試紙的樣品墊6和層析膜7的部位分別預(yù)留加樣孔4和觀察窗5。
3.檢測(cè)方法豬肝臟樣本按本說(shuō)明書所述方法處理，得到的上清液作為檢測(cè)樣，檢測(cè)時(shí)在加樣孔4中分別加入0ng/ml、5ng/mlCl標(biāo)準(zhǔn)品和檢測(cè)樣，結(jié)果從觀察窗讀取，用以下方式判斷結(jié)果。
①反應(yīng)15min，觀測(cè)條帶顏色的深淺。此時(shí)0ng/ml、5ng/ml Cl標(biāo)準(zhǔn)單元試紙均出現(xiàn)條帶，如檢測(cè)單元試紙不出現(xiàn)條帶，或條帶顏色比5ng/ml Cl標(biāo)準(zhǔn)單元試紙的淺，則檢測(cè)樣的Cl＞5ng/ml；如檢測(cè)單元試紙出現(xiàn)的條帶顏色比5ng/ml Cl標(biāo)準(zhǔn)單元試紙的深，但比0ng/ml的淺，則檢測(cè)樣的Cl在0ng/ml和5ng/ml之間。
②反應(yīng)5-10min，觀測(cè)條帶出現(xiàn)先后。0ng/ml、5ng/ml標(biāo)準(zhǔn)單元試紙出現(xiàn)檢測(cè)線時(shí)未見(jiàn)檢測(cè)單元條帶，則檢測(cè)樣的Cl＞5ng/ml；0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)單元出現(xiàn)檢測(cè)線時(shí)未見(jiàn)5ng/ml標(biāo)準(zhǔn)單元和檢測(cè)單元出現(xiàn)條帶，則檢測(cè)樣的Cl在0ng/ml和5ng/ml之間。
實(shí)施例三膠體金參比免疫層析試紙檢測(cè)豬肉樣本中鹽酸克倫特羅濃度除檢測(cè)線為Cl-Cp，檢測(cè)線為2條以外，1.單元試紙的制作、2.參比免疫層析試紙制作同實(shí)施例二。
3.檢測(cè)方法豬肉樣本按本說(shuō)明書所述方法處理，得到的上清液作為檢測(cè)樣，檢測(cè)時(shí)在加樣孔4中分別加入0ng/ml、1ng/mlCl標(biāo)準(zhǔn)品和檢測(cè)樣，結(jié)果從觀察窗讀取，用以下方式判斷結(jié)果。
①反應(yīng)15min，觀測(cè)條帶顏色的深淺。此時(shí)0ng/ml、1ng/ml Cl標(biāo)準(zhǔn)單元試紙均出現(xiàn)條帶，如檢測(cè)單元試紙不出現(xiàn)條帶，或條帶顏色比1ng/ml Cl標(biāo)準(zhǔn)單元試紙的淺，則檢測(cè)樣的Cl＞1ng/ml；如檢測(cè)單元試紙出現(xiàn)的條帶顏色比1ng/ml Cl標(biāo)準(zhǔn)單元試紙的深，但比0ng/ml的淺，則檢測(cè)樣的Cl在0ng/ml和1ng/ml之間；檢測(cè)單元試紙出現(xiàn)的條帶顏色與0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)單元試紙的顏色無(wú)明顯差異，則檢測(cè)樣的Cl為陰性。
②反應(yīng)5-10min，標(biāo)準(zhǔn)單元試紙和檢測(cè)單元試紙出現(xiàn)的檢測(cè)線為以下情況時(shí)，檢測(cè)樣的Cl＞1ng/ml0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)單元出現(xiàn)第一條線，1ng/m標(biāo)準(zhǔn)單元和檢測(cè)單元未出現(xiàn)條帶；0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)單元出現(xiàn)第一、第二條線，1ng/ml標(biāo)準(zhǔn)單元出現(xiàn)第一條線，檢測(cè)單元未出現(xiàn)條帶；0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)單元、1ng/ml標(biāo)準(zhǔn)單元均出現(xiàn)第一、第二條線，檢測(cè)單元出現(xiàn)第一條線。標(biāo)準(zhǔn)單元試紙和檢測(cè)單元試紙出現(xiàn)的檢測(cè)線為以下情況時(shí)，檢測(cè)樣的Cl在0ng/ml和1ng/ml之間0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)單元、及檢測(cè)單元均出現(xiàn)第一條線，但1ng/ml標(biāo)準(zhǔn)單元未出現(xiàn)條帶；0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)單元出現(xiàn)第一、第二條線，檢測(cè)單元出現(xiàn)第一條線但1ng/ml標(biāo)準(zhǔn)單元未出現(xiàn)條帶；0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)單元檢測(cè)單元均出現(xiàn)第一、第二條線，1ng/ml標(biāo)準(zhǔn)單元均出現(xiàn)第一條線。
檢測(cè)單元試紙出現(xiàn)的條帶數(shù)和顏色與0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)單元試紙的顏色無(wú)明顯差異，則檢測(cè)樣的Cl為陰性。
實(shí)施例四乳膠參比免疫層析試紙檢測(cè)飼料樣本中鹽酸克倫特羅濃度1.單元試紙的制作[1]NC膜7上檢測(cè)線10的制備將NC膜按25mm寬的尺寸剪裁。Cl-Ab9用磷酸鹽緩沖液充分透析后，將濃度調(diào)整為0.05mg/ml，在膜上線狀點(diǎn)樣作為檢測(cè)線，檢測(cè)線點(diǎn)樣位置離膜底邊6mm，檢測(cè)線為4條，兩條檢測(cè)線之間的距離為2.5mm。點(diǎn)樣后的NC膜在室溫下干燥30min，再置于1％牛血清白蛋白的生理鹽水中浸泡30min，取出吸干水分，于37℃保溫30min，置室溫干燥處密封儲(chǔ)藏。
乳膠結(jié)合物墊的制備①乳膠標(biāo)記Cl-Cp彩色乳膠顆粒購(gòu)自BangsLaboratories公司，Cl-Cp的載體蛋白選用牛血清白蛋白。取100ml用磷酸鹽緩沖液稀釋到濃度為1％的乳膠，攪拌下加入500μg的Cl-Cp溶液，室溫?cái)嚢?0分鐘后于37℃水浴保溫60分鐘，4℃放置4-5小時(shí)。15,000rpm離心30分鐘，用適量磷酸鹽緩沖液重懸。
②將乳膠標(biāo)記的Cl-Cp結(jié)合物14分散在厚度為1mm的玻璃纖維紙上，凍干密封干燥保存。
單元試紙的組裝在襯墊上先加上有Cl-Ab檢測(cè)線10的層析膜7、然后向下依次加上膠體金結(jié)合物墊11、樣品墊6、最后在層析膜之上加上吸水墊15。
單元試紙條的剪切單元試紙組裝完成后剪切成4mm的寬度，即為單元試紙條。
2.參比免疫層析試紙制作把4張單元試紙條并排安裝在塑料底卡1上，即成為參比免疫層析試紙芯3，試紙表面用面卡2壓緊，面卡在對(duì)應(yīng)單元試紙的樣品墊6和層析膜7的部位分別預(yù)留加樣孔4和觀察窗5。
3.檢測(cè)流程。
飼料樣本處理按本說(shuō)明書所述方法處理，所得的上清液作為檢測(cè)樣。
檢測(cè)時(shí)在加樣孔4中分別加入0ng/mlCl標(biāo)準(zhǔn)品和檢樣，結(jié)果從觀察窗讀取，用以下方式判斷結(jié)果。
①反應(yīng)15min，觀測(cè)條帶顏色深淺。強(qiáng)陽(yáng)性(＞10ng/ml)標(biāo)準(zhǔn)單元試紙出現(xiàn)條帶，檢測(cè)單元試紙不出現(xiàn)條帶。陽(yáng)性(＞5ng/ml)標(biāo)準(zhǔn)單元試紙和檢測(cè)單元試紙均出現(xiàn)第一條檢測(cè)線，標(biāo)準(zhǔn)單元試紙出現(xiàn)第二條檢測(cè)線而檢測(cè)單元試紙不出現(xiàn)。弱陽(yáng)性(＞1ng/ml)標(biāo)準(zhǔn)單元試紙和檢測(cè)單元試紙均出現(xiàn)第一、第二條檢測(cè)線，標(biāo)準(zhǔn)單元試紙出現(xiàn)第三條檢測(cè)線而檢測(cè)單元試紙不出現(xiàn)。弱陽(yáng)性(＞0.5ng/ml)標(biāo)準(zhǔn)單元試紙和檢測(cè)單元試紙均出現(xiàn)第一、第二、第三條檢測(cè)線，標(biāo)準(zhǔn)單元試紙出現(xiàn)第四條檢測(cè)線而檢測(cè)單元試紙不出現(xiàn)。陰性(0ng/ml)標(biāo)準(zhǔn)單元試紙和檢測(cè)單元試紙出現(xiàn)2條檢測(cè)線顏色無(wú)明顯差異。
②反應(yīng)5-10min，觀測(cè)條帶出現(xiàn)先后。陽(yáng)性(＞5ng/ml)標(biāo)準(zhǔn)單元出現(xiàn)第一條檢測(cè)線時(shí)未見(jiàn)檢測(cè)單元條帶；陽(yáng)性(＞2ng/ml)標(biāo)準(zhǔn)單元出現(xiàn)第二條檢測(cè)線時(shí)未見(jiàn)檢測(cè)單元第二條帶。弱陽(yáng)性(＞1ng/ml)標(biāo)準(zhǔn)單元出現(xiàn)第三條檢測(cè)線時(shí)未見(jiàn)檢測(cè)單元第三條帶。弱陽(yáng)性(＞0.5ng/ml)標(biāo)準(zhǔn)單元出現(xiàn)第四條檢測(cè)線時(shí)未見(jiàn)檢測(cè)單元第四條帶。陰性(0ng/ml)標(biāo)準(zhǔn)單元和檢測(cè)單元條帶出現(xiàn)無(wú)差異。
本發(fā)明方法用于生物樣品中鹽酸克倫特羅的定量檢測(cè)。
權(quán)利要求
1.檢測(cè)鹽酸克倫特羅的參比免疫層析試紙，其特征在于它包括以下二種形式A.試紙由底卡(1)、面卡(2)和參比免疫層析試紙芯(3)組成，其中由2-10條單元試紙條并排組成的參比免疫層析試紙芯(3)固定在底卡和面卡之間，面卡上預(yù)留加樣孔(4)和觀察窗(5)，加樣孔的位置與單元試紙條的樣品墊(6)對(duì)應(yīng)，觀察窗的位置與單元試紙條的層析膜(7)對(duì)應(yīng)；B.試紙由底卡(1)、面卡(2)、參比免疫層析試紙芯(3)和樣品杯(8)組成，其中由2-10條單元試紙條并排組成的參比免疫層析試紙(3)固定 在底卡和面卡之間，單元試紙條的樣品墊(6)伸出底卡和面卡之外，面卡上預(yù)留觀察窗(5)，觀察窗的位置與單元試紙條的層析膜(7)對(duì)應(yīng)，樣品杯位于參比免疫層析試紙之下，每個(gè)樣品杯的位置與每條單元試紙條對(duì)應(yīng)；單元試紙條的層析膜(7)上有1-4條用鹽酸克倫特羅抗體(9)線狀點(diǎn)樣的檢測(cè)線(10)，示蹤粒子結(jié)合墊(11)上有示蹤粒子標(biāo)記鹽酸克倫特羅-載體蛋白偶聯(lián)物(12)的結(jié)合物(13)；或者，單元試紙條的層析膜上有1-4條鹽酸克倫特羅-載體蛋白偶聯(lián)物(12)線狀點(diǎn)樣的檢測(cè)線(10)，示蹤粒子結(jié)合墊(11)上有示蹤粒子標(biāo)記鹽酸克倫特羅抗體(9)的結(jié)合物(14)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)鹽酸克倫特羅的參比免疫層析試紙，其特征在于單元試紙條上的鹽酸克倫特羅抗體線狀點(diǎn)樣的檢測(cè)線，或鹽酸克倫特羅-載體蛋白偶聯(lián)物線狀點(diǎn)樣的檢測(cè)線為1-2條。
3.一種用檢測(cè)鹽酸克倫特羅的免疫層析試紙檢測(cè)鹽酸克倫特羅的方法，其特征在于它包括按以下順序進(jìn)行的步驟[1]樣品處理；[2]在形式A的參比免疫層析試紙的加樣孔(4)上分別加入Cl標(biāo)準(zhǔn)和樣本，加入Cl標(biāo)準(zhǔn)與加入樣本的單元試紙條數(shù)為任意比例；或者，將形式B的參比免疫層析試紙的單元試紙條的樣品墊(6)插入對(duì)應(yīng)的樣品杯(8)中，加入Cl標(biāo)準(zhǔn)與加入樣本的樣品杯數(shù)為任意比例；[3]用以下兩種方法中的任何一種檢測(cè)樣本中鹽酸克倫特羅的濃度①比較在相同的位置，樣本單元試紙條與標(biāo)準(zhǔn)單元試紙條出現(xiàn)條帶 的時(shí)間，樣本單元試紙條在相同位置出現(xiàn)條帶的時(shí)間比某標(biāo)準(zhǔn)單元試紙條出現(xiàn)的時(shí)間晚，則樣品內(nèi)Cl濃度大于某標(biāo)準(zhǔn)濃度；②在相同時(shí)間內(nèi)，比較樣本單元試紙條和單元試紙條出現(xiàn)的條帶顏色，在相同時(shí)間內(nèi)，樣本單元試紙條在相同位置出現(xiàn)條帶的顏色比某標(biāo)準(zhǔn)單元試紙條出現(xiàn)的顏色淺，則樣本內(nèi)Cl濃度大于某標(biāo)準(zhǔn)濃度。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中鹽酸克倫特羅的檢測(cè)下限為1ng/ml。
全文摘要
本發(fā)明涉及檢測(cè)鹽酸克倫特羅(clenbuterol，Cl)的參比免疫層析試紙及其檢測(cè)方法。該試紙包括兩種形式A.試紙由底卡、面卡和參比免疫層析試紙組成，面卡上預(yù)留加樣孔和觀察窗；B.試紙由底卡、面卡、參比免疫層析試紙和樣品杯組成，面卡上預(yù)留觀察窗。單元試紙條的層析膜上有1－4條鹽酸克倫特羅抗體或鹽酸克倫特羅載體蛋白偶聯(lián)物線狀點(diǎn)樣的檢測(cè)線；示蹤粒子結(jié)合墊上有示蹤粒子標(biāo)記鹽酸克倫特羅－載體蛋白偶聯(lián)物的結(jié)合物或示蹤粒子標(biāo)記鹽酸克倫特羅抗體的結(jié)合物。本發(fā)明的試紙結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、使用方便、保存時(shí)間長(zhǎng)，檢測(cè)步驟少、快速、準(zhǔn)確，適合于商檢、防疫、畜牧生產(chǎn)者對(duì)懷疑對(duì)象樣品的Cl進(jìn)行非批量、多個(gè)樣品的現(xiàn)場(chǎng)快速篩查和監(jiān)控。
文檔編號(hào)G01N33/543GK1484031SQ0315334
公開日2004年3月24日 申請(qǐng)日期2003年8月11日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月11日
發(fā)明者陳高明, 李林 申請(qǐng)人:江西中德生物工程有限公司