專利名稱：抗人精液特異蛋白p30檢測試劑條及其含有的單克隆抗體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于法醫(yī)學與免疫學檢驗技術領域，可直接用于法醫(yī)物證對人精斑的確證，更具體地，本發(fā)明涉及抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體，產(chǎn)生該抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體的雜交瘤細胞，抗人精液特異蛋白P30膠體金免疫層析檢測試劑條及試劑條的制備方法。
背景技術：
在公安法醫(yī)工作中，案件物證的盡快檢驗和做出鑒定，對于案件的及時偵破、抓捕犯罪分子或釋放犯罪嫌疑人具有決定性的作用。膠體金免疫層析檢測試劑條出現(xiàn)前，免疫學檢驗同類技術采用免疫電泳、免疫擴散、酶聯(lián)免疫吸附分析(即ELISA)等方法進行，這些方法或?qū)嶒灢襟E相對較多、操作復雜、對檢驗人員的技術要求程度高，或檢驗所用時間較長，而且全都必需在室內(nèi)進行。因此，建立一新方法對上述這些問題和缺點進行改進、加以克服是很有必要的。膠體金免疫層析檢測試劑條的研制及使用使得案件物證在現(xiàn)場就能檢驗并做出鑒定、甚至可由此確定犯罪嫌疑人，快速破案。但是目前國內(nèi)外檢測人精斑的膠體金免疫層析檢測試劑條，由于其中的抗人精液特異蛋白P30抗體的特異性沒有完全達到公安或司法的檢驗標準，時有出現(xiàn)檢驗錯誤的情況，將陰道分泌物鑒定成了人精斑，而眾所周知，公安或司法的檢驗是不允許出現(xiàn)錯檢的，因為這關系著某個人的前途或命運。因此研制只對人精液特異蛋白P30起反應、完全符合法醫(yī)學檢驗標準和要求的抗人精液特異蛋白P30的單克隆抗體及試劑條非常迫切。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供對人精液、純化人P30液和人前列腺液起反應的抗人精液特異蛋白P30膠體金免疫層析檢測試劑條，及該試劑條的制備方法。
本發(fā)明的另一目的是提供抗人精液特異蛋白P30的單克隆抗體。
本發(fā)明的另一目的是提供產(chǎn)生上述抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體的雜交瘤細胞株。
為達上述目的，本發(fā)明的技術方案如下本發(fā)明使用的雜交瘤細胞株A7，H3F3已經(jīng)于2003年7月1日，在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號分別為CGMCC 0971，CGMCC 0972。
本發(fā)明提供了兩種抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體，它們可以用常規(guī)技術分別從保藏號為CGMCC 0971，CGMCC 0972的雜交瘤細胞株A7，H3F3中產(chǎn)生。
本發(fā)明提供了抗人精液特異蛋白P30膠體金免疫層析檢測試劑條，該試劑條包含至少一種本發(fā)明所述CGMCC 0971雜交瘤細胞株A7或CGMCC 0972雜交瘤細胞株H3F3產(chǎn)生的抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體。
本發(fā)明提供了抗人精液特異蛋白P30膠體金免疫層析檢測試劑條，該試劑條依次包括加樣區(qū)，其包括空白惰性材料區(qū)及包含包附膠體金的本發(fā)明所述的一種抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體區(qū)；反應區(qū)，其包含檢測線和質(zhì)控線；吸附區(qū)；本發(fā)明檢測試劑條，其特征是加樣區(qū)的空白惰性材料區(qū)一端與包含包附膠體金的本發(fā)明所述的一種抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體區(qū)一端有部分重疊。
本發(fā)明所述的檢測試劑條，其特征是加樣區(qū)的一端與反應區(qū)的一端有部分重疊，反應區(qū)的另一端與吸附區(qū)的一端有部分重疊。
本發(fā)明所述的檢測試劑條，其特征是加樣區(qū)、反應區(qū)和吸附區(qū)固定在單面膠塑料墊板層上。
本發(fā)明所述的檢測試劑條，其特征是反應區(qū)的一端部分與加樣區(qū)上粘有單面膠帶層，反應區(qū)的另一端部分與吸附區(qū)上粘有單面膠帶層，其中反應區(qū)的一端部分與加樣區(qū)上粘有的單面膠帶層上標有檢測時液面可達最大高度的MAX線。
本發(fā)明所述的檢測試劑條，其特征是反應區(qū)的一端部分與加樣區(qū)上粘有的單面膠帶層可以順延回折包覆加樣區(qū)的一端，并粘附固定在單面膠塑料墊板層的背面，反應區(qū)的另一端部分與吸附區(qū)上粘有的單面膠帶層可以順延回折包覆吸附區(qū)另一端，并粘附固定在單面膠塑料墊板層的背面。
本發(fā)明所述的檢測試劑條，其特征是加樣區(qū)包附膠體金的本發(fā)明所述一種抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體加載在玻璃纖維中，加樣區(qū)的空白惰性材料區(qū)是玻璃纖維。
本發(fā)明所述的檢測試劑條，其特征是檢測線和質(zhì)控線加載在硝酸纖維素膜上。
本發(fā)明所述的檢測試劑條，其特征是反應區(qū)的檢測線是另一抗人精液特異蛋白P30的多或單克隆抗體，其與包附膠體金的本發(fā)明所述抗人精液特異蛋白P30的抗體針對的是相同的抗原，但當其為單克隆抗體時，其抗原結(jié)合位點或稱抗原決定簇不相同，當其為多克隆抗體時，其抗原結(jié)合位點或稱抗原決定簇既有相同又有不相同。
本發(fā)明所述的檢測試劑條，其特征是反應區(qū)的檢測線噴涂的是含有0.2-1％蔗糖的本發(fā)明所述CGMCC 0971雜交瘤細胞株A7產(chǎn)生的抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體。
本發(fā)明所述的檢測試劑條，其特征是反應區(qū)的質(zhì)控線是與包附膠體金的本發(fā)明所述的抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體起特異反應的物質(zhì)。
本發(fā)明所述的檢測試劑條，其特征是反應區(qū)的質(zhì)控線噴涂的是含有0.2-1％蔗糖的羊抗鼠IgG抗體。
本發(fā)明所述的檢測試劑條，其特征是吸附區(qū)是濾紙，本發(fā)明所用濾紙是特定厚度的濾紙。
本發(fā)明的制備抗人精液特異蛋白P30膠體金免疫層析檢測試劑條的方法，包括以下步驟1)人精液特異蛋白P30單克隆抗體的制備將保藏號為CGMCC 0971雜交瘤細胞株A7或CGMCC 0972雜交瘤細胞株H3F3按常規(guī)方法復蘇并培養(yǎng)，分別注入小鼠腹腔內(nèi)，處死小鼠，收集腹水；2)分離純化本發(fā)明抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體以常規(guī)正辛酸加硫酸銨法或者親和層析法等進行；3)膠體金的制備將氯金酸(HAuCl4)以還原劑加熱制成膠體金溶液；4)膠體金—抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體結(jié)合物制備將步驟2)中制得的一種單克隆抗體加入膠體金溶液中，攪拌使抗體包附在膠體金顆粒表面上；5)試劑條原材料的預處理對與檢測過程直接相關的材料玻璃纖維和硝酸纖維素膜進行預處理；6)膠體金—抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體結(jié)合物處理及載入玻璃纖維用稀釋液稀釋步驟4)制得的膠體金—抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體結(jié)合物，然后用稀釋后的該結(jié)合物飽和浸泡玻璃纖維，然后干燥；7)在處理好的反應區(qū)硝酸纖維素膜上噴涂檢測線和質(zhì)控線；8)組裝試劑條在單面膠塑料板層上粘貼固定有加樣區(qū)的步驟5)處理過的空白玻璃纖維區(qū)及步驟6)制得的膠體金—抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體結(jié)合物飽和的玻璃纖維，反應區(qū)的硝酸纖維素膜及吸收區(qū)的濾紙；加樣區(qū)的空白玻璃纖維區(qū)一端與步驟6)制得的膠體金—抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體結(jié)合物飽和的玻璃纖維區(qū)一端有部分重疊；加樣區(qū)的玻璃纖維一端與反應區(qū)的硝酸纖維素膜的一端有部分重疊，反應區(qū)的硝酸纖維素膜的另一端與吸收區(qū)濾紙的一端有部分重疊；其中反應區(qū)的硝酸纖維素膜的一端部分與加樣區(qū)的玻璃纖維上粘有單面膠帶層，反應區(qū)的硝酸纖維素膜的另一端部分與濾紙上粘有單面膠帶層；9)將8)所制成的母版試劑條裁剪成成品試劑條；10)檢測試劑條的性能，確定其是否合格。
本發(fā)明所述的制備抗人精液特異蛋白P30膠體金免疫層析檢測試劑條的方法的一個特征是其中步驟4)攪拌后，以10％NaCI鑒定其穩(wěn)定情況，加BSA(牛血清白蛋白)和PEG(聚乙二醇)溶液，12,000r/min離心50分鐘，沉淀以保護液1.0mmol/L四硼酸鈉-HCI，0.1％BSA，0.01％NaN3，(pH 7.4)重懸，置4℃保存?zhèn)溆谩?br>
本發(fā)明所述的制備抗人精液特異蛋白P30膠體金免疫層析檢測試劑條的方法的一個特征是其中步驟5)是用含0.5％吐溫80的50mM Tris-HCI，pH8.0緩沖液浸泡玻璃纖維過夜，現(xiàn)用現(xiàn)泡，以無菌超純水漂洗去鹽，無菌高效過濾器下吹干；以含0.05％吐溫20的20mM磷酸鹽生理鹽水緩沖液(pH7.4)浸泡硝酸纖維素膜1至2小時，以無菌超純水漂洗去鹽，亦現(xiàn)用現(xiàn)泡并吹干，并且所有緩沖液均以0.45μm濾器過濾除菌。
本發(fā)明所述的制備抗人精液特異蛋白P30膠體金免疫層析檢測試劑條的方法的一個特征是其中步驟6)中的稀釋液是0.2～1.0％牛IgG、0.1～0.5％PVP40或30、0.05～0.1％PEG20,000、0.5～2.0％BSA、0.02％NaN3的生理PBS緩沖液，pH7.4。
本發(fā)明所述的制備抗人精液特異蛋白P30膠體金免疫層析檢測試劑條其特征是反應區(qū)的檢測線噴涂的是含有0.2-1％蔗糖的本發(fā)明所述CGMCC 0971雜交瘤細胞株A7產(chǎn)生的抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體。
本發(fā)明所述的制備抗人精液特異蛋白P30膠體金免疫層析檢測試劑條的方法，其特征是反應區(qū)的質(zhì)控線噴涂的是含有0.2-1％蔗糖的羊抗鼠IgG抗體。
本發(fā)明保藏號為CGMCC 0971的雜交瘤細胞株A7和保藏號為CGMCC 0972的雜交瘤細胞株H3F3產(chǎn)生的抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體及制成的試劑條的靈敏度與國外最高水平的同類產(chǎn)品相當；但是特異性優(yōu)于國外產(chǎn)品，或與最好的國外產(chǎn)品相同，完全符合法醫(yī)學檢驗標準和要求，有利于迅速，準確地檢驗鑒定案件物證，快速破案，利國利民。
為了進一步理解本發(fā)明的實質(zhì)，下面結(jié)合附圖及具體實施方式
對本發(fā)明做進一步說明。
圖1是本發(fā)明實施例2制得的抗人精液特異蛋白P30膠體金免疫層析檢測試劑條靈敏度和特異性的測試結(jié)果。
圖2是加拿大IND公司抗人精液特異蛋白P30膠體金免疫層析檢測試劑條靈敏度和特異性的測試結(jié)果。
圖3是美國Pan Probe公司抗人精液特異蛋白P30膠體金免疫層析檢測試劑條靈敏度和特異性的測試結(jié)果。
圖4是美國Acon公司(杭州加工)抗人精液特異蛋白P30膠體金免疫層析檢測試劑條靈敏度和特異性的測試結(jié)果。
圖5是美國Medyl公司抗人精液特異蛋白P30膠體金免疫層析檢測試劑條靈敏度和特異性的測試結(jié)果。
圖6是對保存不同年限(分別為1985年、1995年和1998年的人精斑，分別編號為一、二、三號)的陳舊人精斑進行檢驗，用本發(fā)明實施例2制得的產(chǎn)品(A)，同時與加拿大IND公司(B)、美國Acon(在杭州加工制作)(C)、Medyl(D)、PanProbe(E)公司的抗人精液特異蛋白P30膠體金試劑條進行測定的檢驗結(jié)果。
圖7是從人血痕、常見十種動物(豬、羊、牛、馬、驢、狗、兔、雞、鴨、鵝)血痕及其混合血痕、空白檢材、人精斑、人唾液斑、人初乳斑、陰道分泌物以及來自案件的人血痕等共32份中隨機抽取20份，用本發(fā)明實施例2制得的產(chǎn)品A檢測的結(jié)果。
圖8是本發(fā)明抗人精液特異蛋白P30膠體金免疫層析檢測試劑條的最佳示意圖。
具體實施例方式
實施例1 產(chǎn)生抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體的CGMCC 0971雜交瘤細胞株A7和CGMCC 0972雜交瘤細胞株H3F3的制備按張琦、嚴紅、王香菊《中國法醫(yī)學雜志》1990；5(2)72-76頁“分泌抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體雜交瘤細胞系的建立和初步應用”一文進行。經(jīng)檢測，制備出了只與人精液、純化人P30液和人前列腺液起反應的多個雜交瘤細胞株，其中包括CGMCC 0971雜交瘤細胞株A7和CGMCC 0972雜交瘤細胞株H3F3。產(chǎn)生抗體均是小鼠IgG1亞類，效價分別是，H3F3培養(yǎng)上清320倍，腹水1.28×105倍；A7培養(yǎng)上清32倍，腹水1.0×104倍。
實施例2 抗人精液特異蛋白P30膠體金免疫層析檢測試劑條的制備①腹水單抗制備從液氮中取出A7和H3F3細胞株，常規(guī)方法復蘇并培養(yǎng)。分別將培養(yǎng)好的適當數(shù)量的A7和H3F3培養(yǎng)細胞注入小鼠腹腔內(nèi)，7～10天后或觀察可以宰殺時處死小鼠、分別收集小鼠腹水。
②分離純化的抗人精液特異蛋白P30抗體以常規(guī)正辛酸加硫酸銨法或者親和層析法進行，后者具體是小鼠腹水中加入1/10體積的1.0mol/L Tris-HCI，pH 8.0緩沖液，而后再加入飽和硫酸銨溶液或固體硫酸銨至50％飽和度，放置2hr后，離心，沉淀以生理PBS(20mmol/L磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉，0.1mol/L NaCI，pH7.4)緩沖液重溶并對該緩沖液充分透析。以透析緩沖液平衡HiTrapTMProtein GHP柱，透析后蛋白溶液上柱，而后先以平衡柱的緩沖液洗脫未結(jié)合的雜蛋白，再以0.1mol/L甘氨酸-HCI，pH2.7緩沖液洗脫結(jié)合的蛋白，測A280值，合并該值在0.1以上的組份，此即為純化的CGMCC 0971雜交瘤細胞株A7和CGMCC0972雜交瘤細胞株H3F3產(chǎn)生的抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體，SDS-PAGE(即SDS聚丙烯酰胺凝膠變性電泳)測純度，對5mMNaCI溶液透析，濃縮至適宜的濃度，待用。
③膠體金制備稱取Sigma公司產(chǎn)氯金酸(貨號G-4022)并配成1％濃度，取適量加入超純水中，加熱煮沸，快速加入1％的檸檬酸鈉溶液，煮至溶液變?yōu)樽霞t色。冷卻，以0.2mol/L K2CO3調(diào)pH至8.0～8.2，0.45μm過濾。取適量稀釋1倍，測A530值為1.915。
④膠體金-本發(fā)明抗人精液特異蛋白P30抗體結(jié)合物制備按25μg/ml將純化的CGMCC 0972雜交瘤細胞株H3F3產(chǎn)生的抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體加入到膠體金溶液中，攪拌20～30分鐘，以10％NaCI鑒定其穩(wěn)定情況。加BSA(牛血清白蛋白)和PEG(聚乙二醇)溶液適量，12,000r/min離心50分鐘，沉淀以保護液(1.0mmol/L四硼酸鈉-HCI，0.1％BSA，0.01％NaN3，pH 7.4)重懸，置4℃保存?zhèn)溆谩?br>
⑤試劑條原材料處理為保證檢驗結(jié)果的準確性、特異性，對與檢測過程直接相關的材料要進行預處理。具體是以含0.5％吐溫80的50mM Tris-HCI，pH8.0緩沖液浸泡玻璃纖維過夜，以無菌超純水漂洗去鹽，無菌高效過濾器下吹干；以含0.05％吐溫20的20mM磷酸鹽生理鹽水緩沖液(pH7.4)浸泡硝酸纖維素膜1至2小時，以無菌超純水漂洗去鹽，亦現(xiàn)用現(xiàn)泡并涼干。(注所有緩沖液均以0.45μm濾器過濾除菌)⑥膠體金-抗人精液特異蛋白P30抗體結(jié)合物的處理和載入玻璃纖維以含0.2％牛IgG、0.5％PVP40(或30)、0.1％PEG20,000、0.5BSA、0.02％NaN3的生理PBS緩沖液，pH7.4的稀釋液將膠體金-單抗結(jié)合物稀釋8倍，均勻地加到處理過的玻璃纖維上，37℃烘干。
⑦在處理好的反應區(qū)硝酸纖維素膜上噴涂檢測線和質(zhì)控線將步驟②純化的CGMCC 0971雜交瘤細胞株A7產(chǎn)生的抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體(含量在3mg/ml以上)溶液(含0.2～1％蔗糖)1μl點在硝酸纖維素膜(寬約20mm)上，點距硝酸纖維素膜相近的寬度邊約6～8mm；在距該點約4～5mm的地方點1μl的羊抗鼠IgG(含量1mg/ml，也含0.2～1％蔗糖)；涼干后，膜置封閉液(PBS配制的1.0-10％脫脂奶粉)中，37℃溫育1小時，取出再以洗滌液(20mM磷酸緩沖液，pH7.0)洗兩次，涼干。(注以機器點樣時，兩個點樣點為約1mm寬噴涂而成的線，其中噴CGMCC 0971雜交瘤細胞株A7產(chǎn)生的抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體的線稱為檢測線，而噴羊抗鼠IgG的線稱為質(zhì)控線。)⑧組裝試劑條在單面膠塑料墊板層(寬約80mm、厚約0.8mm)上，先粘貼⑦處理好的硝酸纖維素膜(注意不要粘貼有樣品的一面)，使其點或噴有CGMCC 0971雜交瘤細胞株A7產(chǎn)生的抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體即檢測線的一端距該墊板臨近的寬度邊約30mm，點或噴有羊抗鼠IgG即質(zhì)控線的一端距墊板另一寬度邊也約30mm，形成反應區(qū)；將⑥處理好的材料覆蓋點或噴有CGMCC 0971雜交瘤細胞株A7產(chǎn)生的抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體一端的硝酸纖維素膜約2mm，其余部分粘貼于墊板上；以⑤處理過的玻璃纖維(寬25mm)一端同墊板寬度邊找齊并向上粘貼，其余部分覆蓋已粘貼于墊板的⑥處理好的材料，形成加樣區(qū)；在已粘貼的硝酸纖維素膜的另一端，以Whatman3M或浙江產(chǎn)新華厚濾紙(寬約30mm)覆蓋約2mm，其余部分粘貼于墊板上形成吸附區(qū)；以單面膠膠帶(其上應標示有指示檢測時液面可達的最大高度的MAX線，該線應距墊板臨近寬度邊約15mm)在粘有玻璃纖維的墊板一端覆蓋約33-35mm再回折并粘貼于墊板背面，在粘有濾紙的墊板另一端以單面膠膠帶(通常帶不同顏色)覆蓋約33mm也回折并粘貼于墊板背面，注意膠帶與硝酸纖維素的兩個相接端一定要粘貼結(jié)實。由此而制成母版膠體金試劑條，而后按3～4mm寬度順墊板寬度方向裁切，所得即為成品抗人精液蛋白P30膠體金檢測試劑條，如圖8所示。
實驗結(jié)果成品試劑條的檢測實驗1 靈敏度測定以6人份凍存混合人精液，SIGMA公司產(chǎn)人PSA(ProstateSpecificAntigen前列腺特異抗原)(貨號P-3338)純化蛋白為抗原，用本發(fā)明實施例2制得的抗人精液特異蛋白P30膠體金檢測試劑條(A)，同時與加拿大IND公司(B)、美國Acon(在杭州加工制作)(C)、Medyl(D)、PanProbe(E)公司的抗人精液蛋白P30膠體金檢測，結(jié)果見圖1到圖5，及表1。
表1 靈敏度及與國外同類產(chǎn)品比較抗原稀 A B C D E釋倍數(shù) 1030 1030103010301030100 + + + + + + + + + +2000+ + + + + + + + - -5000+ + + + + + + + - -10000 + + + + + + + + - -50000 + + + + + + + + - -100000 + + + + + + + + - -200000 + + + + + + + + - -300000 + + + + + + + + - -抗原定量濃度(ng/ml)500 + + + + + + + + - -100 + + + + + + + + - -50 + + + + + + + + - -10 + + + + + + + + - -4 + + ± ± + + + + - -2 ± ± - - + + + + - -注表中“+”代表陽性；“-”代表陰性；“±”似陰似陽；10和30單位為分鐘，表示觀察時間。
結(jié)論本發(fā)明抗人精液特異蛋白P30膠體金免疫層析檢測試劑條的靈敏度相當或優(yōu)于國外同類產(chǎn)品。
實驗2 準確性、特異性測定以人陰道分泌物斑、混合人血清、唾液和初乳為抗原，用本發(fā)明實施例2制得的抗人精液蛋白P30膠體金檢測試劑條(A)，同時與加拿大IND公司(B)、美國Acon(在杭州加工制作)(C)、Medyl(D)、Pan Probe(E)公司的抗人精液蛋白P30膠體金檢測，結(jié)果見圖1到圖5，及表2。
表2準確性、特異性、國外同類產(chǎn)品比較抗原及A B C D E稀釋倍數(shù) 10301030103010301030陰 20- - - - - - - ± + +道分 100 - -- - - - - - + +泌物 1000 - -- - - - - - ±±人 20- -- - - - + + ±±血 100 - -- - - - + + ±±清 1000 - -- - ± + - - - -人 20- -- - - - - - - -唾 100 - -- - - - - - - -液 1000 - -- - - - - - - -人 20- -- - + + - - - -初 100 - -- - + + - - - -乳 1000 - -- - ± ± - - - -生理鹽水 - -- - - - - - - -注表中“+”代表陽性；“-”代表陰性；“±”似陰似陽；10和30單位為分鐘，表示觀察時間。
結(jié)論本發(fā)明抗人精液特異蛋白P30膠體金免疫層析檢測試劑條的準確性和特異性優(yōu)于國外同類產(chǎn)品。
實驗3 陳舊人精斑檢驗對保存不同年限(分別為1985年、1995年和1998年的人精斑，分別編為一、二、三號)的陳舊人精斑進行檢驗；用本發(fā)明實施例2制得的抗人精液蛋白P30膠體金檢測試劑條(A)，同時與加拿大IND公司(B)、美國Acon(在杭州加工制作)(C)、Medyl(D)、PanProbe(E)公司的抗人精液蛋白P30膠體金檢測，結(jié)果見圖6，及表3。
表3與國外同類產(chǎn)品對陳舊人精斑的檢測比較不同年 ABC D E代人精斑 530 530 103010301030一++ ++ + + + + + +二++ ++ + + + + + +三++ ++ ± + + + ± +注表中“+”代表陽性；“-”代表陰性；“±”似陰似陽；5、10和30單位為分鐘，表示觀察時間。
結(jié)論抗人精液特異蛋白P30膠體金免疫層析檢測試劑條在檢測陳舊人精斑方面性能相當或優(yōu)于國外同類產(chǎn)品。
實驗4隨機盲測從人血痕、常見十種動物(豬、羊、牛、馬、驢、狗、兔、雞、鴨、鵝)血痕及其混合血痕、空白檢材、人精斑、人唾液斑、人初乳斑、陰道分泌物以及來自案件的人血痕等共32份中隨機抽取20份，對本發(fā)明所研制抗人精液蛋白P30膠體金檢測試劑條進行檢測，結(jié)果見表4。
表4盲測檢驗結(jié)果編號 檢材名稱 結(jié)果 編號 檢材名稱 結(jié)果1 人血斑 - 11 人精斑 +2 唾液斑 - 12 狗血痕 -3 陰道分泌物 - 13 雞血痕 -4 人精斑 + 14 人血斑 -5 兔血痕 - 15 豬血痕 -6 空白檢材 - 16 王輝血樣 -7 人初乳 - 17 人精斑 +8常見十種動物混合血斑- 18 羊血痕 -9 死者賈繼兵血樣 - 19 陰道分泌物 -10 人精斑 + 20 牛血痕 -
結(jié)論本發(fā)明抗人精液特異蛋白P30膠體金免疫層析檢測試劑條對盲測檢材做出了準確檢驗。
實驗結(jié)果表明，本發(fā)明所制備的抗人精液蛋白P30膠體金檢測試劑條靈敏度與國外最高水平的同類產(chǎn)品相當；但特異性則優(yōu)于國外產(chǎn)品，國外產(chǎn)品都或多或少存在非特異反應；而對陳舊人精斑的檢驗也說明其達到國際領先水平；對實際檢材的盲測完全正確。證明了其在法醫(yī)學上的獨特價值。
權利要求
1.具有保藏號為CGMCC 0971的雜交瘤細胞株A7。
2.具有保藏號為CGMCC 0972的雜交瘤細胞株H3F3。
3.抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體，其可以從具有保藏號為CGMCC 0971的雜交瘤細胞株A7產(chǎn)生。
4.抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體，其可以從具有保藏號為CGMCC 0972的雜交瘤細胞株H3F3產(chǎn)生。
5.抗人精液特異蛋白P30的膠體金免疫層析檢測試劑條，其特征是該試劑條中包含權利要求4所述的抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體。
6.如權利要求5所述的檢測試劑條，其特征在于其包括加樣區(qū)，其包括空白惰性材料區(qū)及包含包附膠體金的權利要求4所述抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體區(qū)；反應區(qū)，其包含檢測線和質(zhì)控線；吸附區(qū)。
7.如權利要求6所述的檢測試劑條，其特征是加樣區(qū)包附膠體金的權利要求4所述抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體加載在玻璃纖維中，加樣區(qū)的空白惰性材料區(qū)是玻璃纖維。
8.如權利要求6所述的檢測試劑條，其特征是檢測線和質(zhì)控線加載在硝酸纖維素膜上。
9.如權利要求6或8所述的檢測試劑條，其特征是反應區(qū)的檢測線是另一抗人精液特異蛋白P30多或單克隆抗體，其與包附膠體金的權利要求4所述抗人精液特異蛋白P30抗體針對的是相同的抗原。
10.如權利要求9所述的檢測試劑條，其特征是反應區(qū)的檢測線噴涂的是含有0.2-1％蔗糖的權利要求3所述的抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體。
11.如權利要求6或8所述的檢測試劑條，其特征是反應區(qū)的質(zhì)控線是與包附膠體金的權利要求4所述的抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體起特異反應的物質(zhì)。
12.如權利要求11所述的檢測試劑條，其特征是反應區(qū)的質(zhì)控線噴涂的是含有0.2-1％蔗糖的羊抗鼠IgG抗體。
13.如權利要求6所述的檢測試劑條，其特征是吸附區(qū)是濾紙。
14.一種制備抗人精液特異蛋白P30膠體金免疫層析檢測試劑條的方法，包括以下步驟1)人精液特異蛋白P30單克隆抗體的制備將保藏號為CGMCC 0971雜交瘤細胞株A7或CGMCC 0972雜交瘤細胞株H3F3按常規(guī)方法復蘇并培養(yǎng)，分別注入小鼠腹腔內(nèi)，處死小鼠，收集腹水；2)分離純化步驟1)制備的本發(fā)明抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體以常規(guī)正辛酸加硫酸銨法或者親和層析法等進行；3)膠體金的制備將氯金酸(HAuCl4)以還原劑加熱制成膠體金溶液；4)膠體金—抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體結(jié)合物制備將步驟2)中制得的一種單克隆抗體加入膠體金溶液中，攪拌使抗體包附在膠體金顆粒表面上；5)試劑條原材料的預處理對與檢測過程直接相關的材料玻璃纖維和硝酸纖維素膜進行預處理；6)膠體金—抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體結(jié)合物處理及載入玻璃纖維用稀釋液稀釋步驟4)制得的膠體金—抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體結(jié)合物，然后用稀釋后的該結(jié)合物飽和浸泡玻璃纖維，然后干燥；7)在處理好的反應區(qū)硝酸纖維素膜上噴涂檢測線和質(zhì)控線；8)組裝試劑條在單面膠塑料板層上粘貼固定有加樣區(qū)的步驟5)處理過的空白玻璃纖維區(qū)及步驟6)制得的膠體金—抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體結(jié)合物飽和浸泡的玻璃纖維，反應區(qū)的硝酸纖維素膜及吸收區(qū)的濾紙；加樣區(qū)的空白玻璃纖維區(qū)一端與步驟6)制得的膠體金—抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體結(jié)合物飽和的玻璃纖維區(qū)一端有部分重疊；加樣區(qū)的玻璃纖維一端與反應區(qū)的硝酸纖維素膜的一端有部分重疊，反應區(qū)的硝酸纖維素膜的另一端與吸收區(qū)濾紙的一端有部分重疊；其中反應區(qū)的硝酸纖維素膜的一端部分與加樣區(qū)的玻璃纖維上粘有單面膠帶層，反應區(qū)的硝酸纖維素膜的另一端部分與濾紙上粘有單面膠帶層；9)將8)所制成的母版試劑條裁剪成成品試劑條；10)檢測試劑條的性能，確定其是否合格。
15.如權利要求14所述的制備抗人精液特異蛋白P30膠體金免疫層析檢測試劑條的方法，其特征是其中步驟5)是用含0.5％吐溫80的50mM Tris-HCI，pH8.0緩沖液浸泡玻璃纖維過夜，現(xiàn)用現(xiàn)泡，無菌超純水漂洗去鹽，無菌高效過濾器下吹干；以含0.05％吐溫20的20mM磷酸鹽生理鹽水緩沖液，pH7.4，浸泡硝酸纖維素膜1至2小時，無菌超純水漂洗去鹽，亦現(xiàn)用現(xiàn)泡并吹干，并且所有緩沖液均以0.45μm濾器過濾除菌。
16.如權利要求14所述的制備抗人精液特異蛋白P30膠體金免疫層析檢測試劑條的方法，其特征是其中步驟6)中的稀釋液是0.2～1.0％牛IgG、0.1～0.5％PVP40或30、0.05～0.1％PEG20,000、0.5～2.0％BSA、0.02％NaN3的生理PBS緩沖液，pH7.4。
17.如權利要求14所述的制備抗人精液特異蛋白P30膠體金免疫層析檢測試劑條的方法，其特征是反應區(qū)的檢測線噴涂的是含有0.2-1％蔗糖的權利要求3所述的單克隆抗體，反應區(qū)的質(zhì)控線噴涂的是含有0.2-1％蔗糖的羊抗鼠IgG抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開了保藏號為CGMCC 0971和CGMCC 0972的雜交瘤細胞株A7和H3F3，以及其產(chǎn)生的抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體及含有該抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體的膠體金免疫層析檢測試劑條及該試劑條的制備方法。本發(fā)明由保藏號為CGMCC 0971和CGMCC 0972的雜交瘤細胞株A7和H3F3產(chǎn)生的抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體及制成的試劑條的靈敏度與國外最高水平的同類產(chǎn)品相當；但是特異性優(yōu)于國外產(chǎn)品，或與最好的國外產(chǎn)品相同，完全符合法醫(yī)學檢驗標準和要求，有利于迅速，準確地檢驗鑒定案件物證，快速破案，利國利民。
文檔編號G01N33/543GK1490408SQ0315344
公開日2004年4月21日 申請日期2003年8月13日 優(yōu)先權日2003年8月13日
發(fā)明者李兆隆, 王儉, 徐秀蘭, 張英蘭, 張琦, 常彩琴, 嚴紅, 王香菊, 孫云青, 陳東風 申請人:公安部第二研究所