專利名稱：甲型流感病毒膠體金快速檢測試紙的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗甲型流感病毒核蛋白單克隆抗體，產(chǎn)生該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株及含有該單克隆抗體的甲型流感病毒膠體金快速檢測試紙。
背景技術(shù)：
流行性感冒(influenza)簡稱流感，是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病。臨床特點為急起高熱，全身酸痛、乏力，或伴輕度呼吸道癥狀。該病潛伏期短，傳染性強，傳播迅速。流感病毒分甲、乙、丙三型，甲型流感威脅最大。由于流感病毒致病力強，易發(fā)生變異，人群對變異株缺乏免疫力，易引起暴發(fā)流行，流感對人類的危害很大，一場流感的流行可導(dǎo)致人群平均壽命的降低。迄今為止，世界上已發(fā)生過四次大的流行和若干次小流行，造成數(shù)十億人發(fā)病，數(shù)千萬人死亡，嚴(yán)重影響了人們的生活和社會經(jīng)濟的發(fā)展。世界上最嚴(yán)重的流感爆發(fā)于1918年，有2000多萬人死亡，超過第一次世界大戰(zhàn)的總死亡人數(shù)，是造成死亡最多的一次傳染病大爆發(fā)。而目前在美國，每年因流感導(dǎo)致的死亡人數(shù)超過車禍和艾滋病造成的死亡人數(shù)，在我國和發(fā)展中國家已成為嚴(yán)重危害人類健康的頭號大敵。
甲型流感病毒是單鏈RNA病毒，基因組有8段RNA組成，而編碼流感病毒蛋白。流感病毒分為甲型流感極易導(dǎo)致世界性流行；乙型流感則可局部流行，而丙型流感常呈散發(fā)流行。甲型流感病毒自1918年世界大流行后已發(fā)生了4次大變異。1933年首次分離出A0型，相繼變異為A1(亞甲型，1946年分離)、A2(亞洲A型，1957年分離)、A3(香港亞洲A型，1968年分離)與新A1型(1977年分離)。對人危害大的是甲、乙型流感，而丙型流感危害不大。由于甲、乙型流感病毒表面的神經(jīng)氨酸酶(NA)和血凝素(HA)逃避機體免疫系統(tǒng)的選擇極易發(fā)生變異，而流感病毒的核蛋白(NP)不易發(fā)生突變，相對極為保守。因此以上流感病毒病原學(xué)的特征為流感的流行規(guī)律和診斷及防治研究奠定了基礎(chǔ)。
流感四季均可發(fā)病，但以冬春季為多。5-20歲的發(fā)病率較高，但新亞型大流行則無顯著年齡差別。本病的傳染原為病人及隱性感染者，經(jīng)飛沫傳播，人群普遍易感，特別是小孩和老年人。本病除散發(fā)外，易發(fā)生暴發(fā)流行、大流行甚至世界性大流行。流感的流行常沿交通線迅速蔓延，先集體后散居，先城市后農(nóng)村。
流感流行期間，根據(jù)接觸史和群體發(fā)病史、典型臨床癥狀和體征及實驗室檢查，可作出臨床診斷。散發(fā)病例，因與許多急性病初期癥狀相似，診斷較為困難。只要全面掌握流行病學(xué)和臨床特征及一些必要的實驗室檢查(血白細(xì)胞計數(shù)和分類、咽拭子培養(yǎng)、胸部X線檢查等)，臨床診斷也并不困難。
流感是由甲和乙型流感病毒引起的主要在冬季爆發(fā)的傳染病。傳染因素對傳染的臨床診斷很有用，在健康人群中這種傳染被認(rèn)為是可以自身抵制的，但對于幼兒和免疫力低的病人則可引起患病甚至死亡。因此在發(fā)病初期和臨床病理的每個階段執(zhí)行明確的病理診斷是十分必要的。
臨床病人由于不同的呼吸道病毒(如流感病毒，呼吸道合胞病毒，副流感，腺病毒等)感染引起的疾病癥狀可以十分相似，這導(dǎo)致了流行診斷比較困難，確診往往依賴于實驗室診斷?？焖俚脑\斷方法應(yīng)該是在疾病的發(fā)病初期就可以得到明確的診斷，便于阻止疾病的傳染及改變流行的爆發(fā)。
目前流感病毒的檢測主要有以下幾種方法一、常規(guī)實驗室檢測1、病毒分離實驗室診斷流感的金標(biāo)準(zhǔn)是分離流感病毒。采用標(biāo)本的時間以發(fā)病頭5天為宜，鼻咽分泌物作為病毒分離的標(biāo)本，陽性率高于其他標(biāo)本?？梢杂秒u胚培養(yǎng)或用細(xì)胞培養(yǎng)的方法分離病毒。當(dāng)前由于有”0”相毒株的出現(xiàn)，在分離流感病毒時應(yīng)盡量考慮采用敏感細(xì)胞，用雞胚時，采用羊膜腔接種。對分離物進(jìn)行血凝活性檢查時，不應(yīng)采用雞紅細(xì)胞，而應(yīng)采用人或豚鼠的紅細(xì)胞。分離甲型乙型流感病毒多采用9-11日齡雞胚。但是這些方法具有嚴(yán)重的缺陷。因為它們既費時又費力，通常需要2-7天才能得到最終結(jié)果，這樣在臨床方面對病人的有效治療就有一定的局限性。
2、血清學(xué)檢測用已知流感病毒抗原同時檢測患者急性期和恢復(fù)期的雙份血清，如果恢復(fù)期血清中抗流感病毒抗體效價比急性期高4倍或4倍以上有診斷意義。由于流感病毒抗原變異極為復(fù)雜，不同地區(qū)，甚至同一地區(qū)不同單位所流行毒株的抗原性不完全相同，因而進(jìn)行血清抗體測定時，所用的抗原最好用當(dāng)時當(dāng)?shù)氐牧餍兄昙由洗硇远局?，或流行株的核蛋白作為?biāo)志物為好。
2、1血凝抑制試驗此法最大的優(yōu)點是簡便可靠。缺點是易受血清中非特異性抑制物的干擾影響，血清不需處理，恢復(fù)期血清的溶血圈比急性期大2mm以上方有診斷意義。
2、2單擴溶血測定此法的優(yōu)點是敏感性比血凝抑制測定高些，不受測定血清中非特異性抑制物的干擾影響，血清不經(jīng)處理，不必稀釋就可來做實驗。缺點是實驗中需用補體。此測定所用抗原同血凝抑制試驗，急性期和恢復(fù)期血清應(yīng)在同一塊板上，并有對照板。只有恢復(fù)期血清的溶血圈比急性期的大2mm以上方有診斷意義。
二、快速診斷直接檢查病毒蛋白抗原和病毒核酸可達(dá)到快速診斷目的，常用方法有免疫熒光法、免疫酶法、放射免疫法、免疫膠體金、電鏡技術(shù)、核酸雜交和PCR法等。
1、免疫學(xué)方法1、1免疫酶法免疫酶法(EIA)的基本原理，是利用酶與抗體與抗原結(jié)合后，形成酶結(jié)合物，它既不改變抗體或抗原的免疫學(xué)活性，又保留酶本身的酶學(xué)活性，然后加入酶的相應(yīng)底物，在酶的催化作用下使原來無色的底物發(fā)生水解、氧化或其他反應(yīng)，生成有色產(chǎn)物。
利用Directigen甲型流感病毒快速診斷試劑盒(Directigen Flu-A)，診斷實驗可在15分內(nèi)完成，可直接用從病人采集的咽漱液或咽拭子浸出液進(jìn)行檢測。該實驗是以免疫酶染法為基礎(chǔ)而設(shè)計的。首先用去垢劑混合物提取各種臨床標(biāo)本中的病毒抗原，再將病毒抗原滴加于具有吸附能力的檢測膜上。然后加入堿性磷酸酶標(biāo)記的抗甲型流感病毒核蛋白單克隆抗體，待抗原與抗體充分作用后加入底物顯色。該法敏感快速，但操作復(fù)雜。
Boon A.C.M.等利用微孔滴度細(xì)胞酶免疫法(cell-EIA)用來做為地區(qū)監(jiān)測流感甲的方法。根據(jù)不同的顏色反應(yīng)或二抗不同的標(biāo)記，可以用來檢測流感甲不同的亞型(H3N2，H1N1，H5N3，H5N1，H7N7，H9N2)，此方法在一天中可以檢測大量的樣本。流感爆發(fā)季節(jié)可以作為快速有效便宜的診斷流感甲的方法。利用cell-EIA和商品化的Directigen Flu-A對樣本的診斷進(jìn)行比較，cell-EIA靈敏性(74％)和特異性(91.6％)均高于Directigen Flu-A(65％，84.6％)，但靈敏性和特異性有待提高。
Reina J等用新的dot blot EIA方法可以同時并快速直接檢測甲和乙型流感病毒抗原。他們對臨床160位標(biāo)本鑒定，利用細(xì)胞法鑒定74位為流感陽性，利用新EIA法對鑒定的陽性標(biāo)本進(jìn)一步鑒定，68.9％被鑒定陽性。其中41例甲流感利用新EIA法鑒定有34例為陽性；33例乙流感利用新EIA法鑒定有17例為陽性(P＜0.05)，利用EIA法鑒定沒有假陽性結(jié)果。結(jié)果表明可以利用此法進(jìn)行對甲流感的常規(guī)診斷。
EIA敏感性高，特異性強，操作簡便，肉眼可觀察，便于大規(guī)模檢測，在流感病毒研究中，它主要用于流感的快速診斷和單克隆抗體篩選，很少用于病毒株的抗原性分析，因發(fā)現(xiàn)它特異性不高，不同亞型毒株間易出現(xiàn)交叉反應(yīng)。
1、2免疫熒光法 將患者鼻咽分泌物脫落細(xì)胞涂片，用免疫熒光法可直接查流感病毒抗原。免疫熒光是一高度敏感和特異的技術(shù)，但它需要在標(biāo)本中少量的細(xì)胞和專業(yè)的技術(shù)人員來解釋結(jié)果。
1、3免疫膠體金 膠體金標(biāo)記，實際上是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。吸附機理可能是膠體金表面負(fù)電荷，與蛋白質(zhì)的正電荷基團因靜電吸附而形成牢固結(jié)合。目前醫(yī)學(xué)檢驗中應(yīng)用的免疫膠體金診斷技術(shù)主要有兩種，膠體金快速免疫層析法和快速斑點免疫金滲濾法。這兩種方法的基本原理都是以微孔濾膜為載體，包被已知抗原或抗體，加入待檢標(biāo)本后，經(jīng)濾膜的毛細(xì)吸管作用或滲濾作用使標(biāo)本中的抗原或抗體與膜上的包被的抗體或抗原結(jié)合，再用膠體金結(jié)合物標(biāo)記而達(dá)到檢測目的。Patterson S等利用免疫膠體金方法檢測流感內(nèi)部蛋白和外部蛋白的抗原決定簇，并可用于快速檢測流感病毒，但是特異性不高。
免疫膠體金快速診斷技術(shù)具有放射免疫法、酶免疫法等診斷方法不可取代的優(yōu)點首先，它不需要酶聯(lián)免疫法中所要求的底物，因而可省去一些操作步驟，使操作簡單化；其次。膠體金無污染，不會危害操作者、以及污染環(huán)境；再次，膠體金抗體復(fù)合物在凍干狀態(tài)下室溫儲存穩(wěn)定；此外膠體金還具有檢測迅速、靈敏、不需要復(fù)雜儀器設(shè)備、產(chǎn)物顯色永久不褪等優(yōu)點。
由于免疫膠體金快速診斷技術(shù)已日趨成熟，以及它的便捷、靈敏、安全、低成本等特點，使其在診斷領(lǐng)域中迅速推廣。目前市場上出售和各文獻(xiàn)報道主要集中在婦女妊娠測系列、病原體抗原或抗體檢測系列、藥物濫用檢測系列、疾病相關(guān)蛋白檢測系列等。
2、基因診斷2、1核酸雜交法 此法比電鏡、免疫酶標(biāo)等方法更為特異、敏感，而且可定量與分型。目前常用于流感病毒快速診斷和毒?；蚍治?。核酸分子雜交技術(shù)能廣泛的用于臨床標(biāo)本中病毒序列的檢測，只是因為常規(guī)應(yīng)用的方法(如免疫學(xué)方法等)就可成功的檢測臨床標(biāo)本中的病毒，臨床就不需要它來診斷疾病。另一方面，核酸分子雜交技術(shù)作為診斷疾病的工具仍有一定的困難，如需要一定的設(shè)備，費時長，故在許多實驗室尚不能作為常規(guī)診斷方法來應(yīng)用，因此目前該方法僅用于研究。
2、2 RT-PCR 對許多RNA病毒來說RT-PCR診斷方法比傳統(tǒng)的病毒分離和抗原診斷方法既快又靈敏。在鳥類和家禽類等動物中已檢測到流感甲具有15種HA和9種NA，并且在香港發(fā)現(xiàn)動物中的H5N1和H9N2型流感病毒也可以直接傳染給人類。雖然病毒分離和免疫熒光等是流感檢測強有力的工具，但在檢測不同表型的鳥類和畜類流感方面可能會出現(xiàn)假陰性結(jié)果。Fouchier RA.M等利用流感甲第7基因節(jié)段膜蛋白保守基因序列做引物，進(jìn)行RT-PCR檢測，快速、靈敏、特異，并且對目前所知道的流感甲基因變異種類均適用。
RT-PCR可以很容易的同時診斷多種病毒，另一些診斷方法如病毒分離和免疫熒光分析卻不能。雖然免疫熒光分析可利用臨床標(biāo)本的細(xì)胞檢測流感甲和乙，腺病毒，呼吸道合胞病毒抗原的存在，但對流感和腺病毒的診斷并不是廣泛應(yīng)用。雖然病毒分離被認(rèn)為是金標(biāo)準(zhǔn)，但由于流感和腺病毒的同時感染，可以在腺病毒生長明顯之前就破壞細(xì)胞單分子層，這樣就很難通過細(xì)胞培養(yǎng)的方法鑒定這些呼吸道病毒。
甲型、乙型流感病毒，呼吸道合胞病毒的A型B型，腺病毒，呼吸道合胞病毒等多種病毒可引起病毒性呼吸道感染、中耳炎、腮腺炎。由甲和乙流感病毒引起的感染可以從輕微的呼吸道疾病到致死性肺炎，并且可爆發(fā)世界性的發(fā)病和死亡。丙型流感病毒通常只在兒童和青少年中引起輕微的呼吸道疾病，引起地方性的流行。丙型流感病毒很難找到快速和敏感的診斷方法在于對其流行病學(xué)行為了解較少。Coiras MT等根據(jù)流感病毒核蛋白的保守區(qū)域，呼吸道合胞病毒的融合蛋白基因，腺病毒的六鄰體蛋白基因合成PCR引物，利用多重反轉(zhuǎn)錄巢式PCR的方法可同時診斷甲乙丙型流感病毒，呼吸道合胞病毒和腺病毒等引起相似臨床癥狀的呼吸道病毒[15]。Grondahl B等利用多重反轉(zhuǎn)錄PCR(m-RT-PCR)的方法可以在一次實驗中快速的診斷出流感甲乙型病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、肺炎支原體、肺炎衣原體、腸道病毒、副流感1、3型病毒這9種引起相似急性呼吸道感染的病原體。和對于較多組織不適應(yīng)的EIA法比較，m-RT-PCR診斷結(jié)果和正確結(jié)果的符合率達(dá)95％以上。
Plakokefalos E等對甲型、乙型流感病毒的診斷用ELISA和RT-PCR進(jìn)行比較，ELISA和RT-PCR的敏感性分別是64％和100％，特異性分別是98％和97％；陽性診斷分別是94％和86％，陰性診斷分別是93％和100％。結(jié)果表明RT-PCR比ELISA有明顯的敏感性，當(dāng)發(fā)生病毒滅活現(xiàn)象時仍可檢測出流感的發(fā)生；并且對流感的地區(qū)性監(jiān)測管理有診斷意義。
Rebelo H.等對流感的爆發(fā)利用病毒分離，EIA，RT-PCR，補體結(jié)合實驗進(jìn)行診斷并做比較。連續(xù)7年中的1685個流感相似樣本中RT-PCR、EIA、病毒分離的陽性診斷率分別為43.6％，17.5％，5％。結(jié)果表明RT-PCR診斷比其它三種診斷方法快、靈敏，并和地區(qū)流感爆發(fā)的形式有很好的相關(guān)性。
盡管基因檢測技術(shù)有很多優(yōu)點，但也有不足之出，如PCR技術(shù)，最大的優(yōu)點恰恰帶來了它在實際應(yīng)用中最大的障礙，DNA擴增的高效性導(dǎo)致了極微量的污染即可出現(xiàn)假陽性，因而使結(jié)果失真。此外，病毒作為外原基因的入侵者，必需在闡明其全部或部分核苷酸序列時，才可以設(shè)計引物或探針，進(jìn)行核酸分子雜交和PCR檢測。
從現(xiàn)有的流感檢測方法可見，病毒分離、EIA、RT-PCR診斷方法盡管都有一定的特異性和敏感性的優(yōu)點，但在操作上需要專業(yè)技術(shù)人員、專門的儀器設(shè)備和特定的條件及費時等缺點，而近年發(fā)展成熟的免疫膠體金診斷技術(shù)具有特異性高、敏感性高、操作簡單而不需要專業(yè)人員和儀器設(shè)備，已成為流感快速診斷的發(fā)展方向。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可以快速，準(zhǔn)確檢驗甲型流感病毒的甲型流感病毒膠體金快速檢測試紙。
本發(fā)明的另一目的是提供了抗甲型流感病毒核蛋白單克隆抗體，及產(chǎn)生該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
為達(dá)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下本發(fā)明所用產(chǎn)生甲型流感病毒核蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株3F1已于2003年7月30日，在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為CGMCC0987。
本發(fā)明抗甲型流感病毒核蛋白單克隆抗體，可以用常規(guī)技術(shù)從保藏號為CGMCC0987的雜交瘤細(xì)胞株3F1產(chǎn)生。
本發(fā)明甲型流感病毒膠體金快速檢測試紙，其包含從保藏號為CGMCC0987的雜交瘤細(xì)胞株3F1產(chǎn)生的抗甲型流感病毒核蛋白單克隆抗體。
本發(fā)明的優(yōu)點是本發(fā)明甲型流感病毒膠體金快速檢測試紙具有以下特點①檢測快速10分鐘內(nèi)出結(jié)果；②特異性僅對甲型流感病毒呈陽性，而對其它呼吸道病毒和細(xì)菌等13種以上病原體呈陰性結(jié)果；③敏感性對甲型流感病毒核蛋白可以檢出15ng的水平。
④準(zhǔn)確率高經(jīng)八所三甲醫(yī)院臨床試驗共3000例，與免疫熒光和免疫酶聯(lián)比較，總符合率為96.5％～99.0％；⑤保存和運輸方便在室溫下可保存18個月。
⑥臨床及家居使用上極為便利，而且具有產(chǎn)業(yè)性。
為了進(jìn)一步理解本發(fā)明的實質(zhì)，下面結(jié)合具體實施方式
對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
具體實施例方式
實施例1抗甲型流感病毒單克隆抗體的制備(1)髓瘤細(xì)胞SP2/0骨髓瘤細(xì)胞購于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所。用時將儲存在液氮罐中的SP2/0細(xì)胞復(fù)蘇，在含有10％小牛血清DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)48-72小時，待細(xì)胞生長良好，細(xì)胞渾圓、透亮、大小均一、排列整齊，呈對數(shù)分裂，準(zhǔn)備融合。
將DMCK細(xì)胞培養(yǎng)好后，直接涂玻片上，-30℃超低溫冰箱保存，供監(jiān)測抗細(xì)胞克隆用。
(2)免疫親代細(xì)胞流感A1(A/京防25/96 H1N1)、流感A3(A/滬防/1/98 H3N2)型病毒購于中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所國家流感中心。將病毒株復(fù)蘇分別接種在DMCK細(xì)胞中培養(yǎng)，待細(xì)胞病變達(dá)(+++)，立即放入-70℃超低溫冰箱保存，以此作為免疫動物的抗原。
流感A1、流感A3病毒抗原基質(zhì)片的制備將流感各型病毒接種在DMCK細(xì)胞培養(yǎng)，待細(xì)胞病變達(dá)(+++)時，將細(xì)胞從瓶壁上消化下來，離心沉淀，取潔凈活膠棉涂的10孔玻片，將病變細(xì)胞平鋪于玻片孔內(nèi)，立即用電風(fēng)扇吹干，丙酮固定，再吹干，-30℃超低溫冰箱保存，備抗體檢測用。
制備的抗原液從-70℃超低溫冰箱取出溶解后，用4號針頭分別給BALB/C小鼠(購于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心)鼻孔滴入5-6滴，每只二次，間隔10天。融合前3日，在小鼠脾臟和腹腔以抗原各0.15ml進(jìn)行攻擊。
(3)細(xì)胞融合融合劑PEG(分子量1500，日本產(chǎn))；培養(yǎng)液10％小牛血清DMEM。SP2/0細(xì)胞和免疫的BALB/C鼠的淋巴細(xì)胞分別按2×107和1×108比例融合。
(4)陽性孔的監(jiān)測將融合孔上清液分別加在上述病毒基質(zhì)片上和DMCK細(xì)胞片上。放37℃恒溫箱內(nèi)30分鐘。以免疫熒光技術(shù)羊抗鼠熒光標(biāo)記物顯示。以熒光顯微鏡觀察結(jié)果，凡于病毒片反應(yīng)者又于MDCK細(xì)胞片反應(yīng)者，為抗細(xì)胞陽性孔，應(yīng)棄掉。同時用重組乙型流感病毒核蛋白10μg/ml包被抗原板，加上融合孔上清，并以羊抗鼠酶標(biāo)記二抗，以酶聯(lián)儀測定，凡是大于空白對照2個OD值為陽性。
(5)獲得陽性孔流感A1檢出38孔陽性孔；流感A3檢出44孔陽性孔。
(6)陽性孔進(jìn)行擴大培養(yǎng)、傳代與克隆將各型流感陽性孔立即進(jìn)行復(fù)蘇、凍存，進(jìn)行傳代及復(fù)蘇的凍存工作。
(7)流感A1的5個株；流感A3的5個株以有限稀釋法進(jìn)行克隆化，培養(yǎng)傳代5個月。約傳40代，每傳1代進(jìn)行一次檢測，并進(jìn)行反復(fù)液氮凍存和復(fù)蘇。
(8)甲型流感核心單克隆抗體(FluA-McAb)的獲得采用間接酶聯(lián)免疫方法鑒定甲型流感病毒核心抗原單克隆抗體，首先用基因重組表達(dá)的核心蛋白抗原(15μg/ml)包被酶聯(lián)板，-4℃過夜，第二天用洗滌液洗3次，然后加入制備的FluA3-McAbs，充分結(jié)合后，加入酶標(biāo)鼠二抗反應(yīng)，篩選并獲得針對核蛋白的單克隆抗體，這樣共獲得產(chǎn)生甲型流感病毒核蛋白單克隆抗體的甲型流感核蛋白的雜交瘤細(xì)胞株5株。
(9)抗體分泌穩(wěn)定性實驗以上5株產(chǎn)生甲型流感核蛋白的雜交瘤細(xì)胞株FluA-McAb5株經(jīng)連續(xù)克隆化檢測單克隆抗體(McAb)陽性率達(dá)100％，在體外傳代5個月，并經(jīng)反復(fù)凍存復(fù)蘇均能達(dá)到保持穩(wěn)定的分泌抗體，上清效價1∶6400-1∶12800(++)IFA，或間接酶聯(lián)免疫上清效價在1∶25600-1∶51200以上。
(10)細(xì)胞核學(xué)特征對上述雜交瘤細(xì)胞中期染色體檢測流感A為84條；證明他們是SP2/0骨髓瘤與小鼠細(xì)胞的雜交瘤細(xì)胞。
(11)，選取其中的一株產(chǎn)生抗甲型流感病毒核蛋白的雜交瘤細(xì)胞株命名為3F1，并于2003年7月30日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號CGMCC0987。
實施例2鼠源病毒檢查為了鑒定制備的抗甲型流感病毒核蛋白單克隆抗體的特異性，即與所使用的鼠源病毒無交叉反應(yīng)。
檢查鼠源病毒包括出血熱病毒(EHFV)；淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCMV)；3型呼腸弧病毒(Reovirus)；仙臺病毒；脫腳病病毒；小鼠腺病毒(MAV)；小鼠肺炎病毒(PVM)。
細(xì)胞接種法將CGMCC 0987 3F1雜交瘤細(xì)胞株分泌上清分別接種于Vero(非洲綠猴腎傳代細(xì)胞)；2BS(人胚肺)二倍體細(xì)胞，接種量為107。接種細(xì)胞后傳兩代，觀察細(xì)胞是否有病變，同時制片，用IFA法檢測病毒抗原，為陰性。
動物接種法CGMCC 0987 3F1雜交瘤細(xì)胞株接種出生24小時以內(nèi)乳鼠各10只；體重15-20克成年小鼠個10只；體重300-350克的豚鼠各5只。每只動物腹腔內(nèi)接種107活細(xì)胞，存活率為85％。
雞胚接種法培養(yǎng)的CGMCC 0987 3F1雜交瘤細(xì)胞株接種SPF雞(購于北京市實驗動物研究中心)胚尿囊腔和卵黃囊，每種途徑10只，每只接種106活細(xì)胞孵育5天，用1％雞血球做HA檢測病毒血凝素為不凝集，同組雞胚中80％存活。
實施例3支原體檢查培養(yǎng)法CGMCC 0987 3F1雜交瘤細(xì)胞株細(xì)胞制片加支原體單克隆抗體(購于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所)作用30分鐘，熒光染色，同時做陰、陽性對照，結(jié)果陰性對照結(jié)果(-)；陽性對照結(jié)果(+)；檢測標(biāo)本結(jié)果陰性。培養(yǎng)上清進(jìn)行包被后加單克隆抗體，用ELISA方法檢測，同時做陰性對照，標(biāo)本結(jié)果陰性。
實施例4單克隆抗體的檢定免疫球蛋白類及亞類用免疫雙擴散法，結(jié)果CGMCC 0987 3F1雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的抗甲型流感病毒核蛋白單克隆抗體(3F1-McAb)為IgG2a。
親和力CGMCC 0987 3F1雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的抗甲型流感病毒核蛋白單克隆抗體(3F1-McAb)用IFA法測定親和力常數(shù)為1.1×10-6M/L。
實施例5特異性封閉試驗以兔抗3F1-McAb血清封閉，證實3F1-McAb分別被不同濃度的異種動物血清封閉。
采用IFA方法3F1-McAb與甲型流感病毒結(jié)合，呈陽性反應(yīng)。與MDCK細(xì)胞結(jié)合，呈陰性反應(yīng)。以上證明單抗與靶抗原的特異性，同時采用免疫印跡試驗技術(shù)識別抗原表位特性，結(jié)果表明FluA抗原經(jīng)還原劑處理后，SDS-PAGE 12％梯度膠電泳，能分辨二十多條清晰的蛋白帶，轉(zhuǎn)印后采用HRP染色，結(jié)果3F1-McAb與56KD核蛋白抗原起反應(yīng)。
實施例6交叉試驗3F1-McAb與流感B病毒、副流感病毒1、2、3型、腺病毒3、7型、呼吸道合胞病毒，呼腸病毒及SARS病毒均呈陰性反應(yīng)。
效價測定
3F1-McAb間接熒光法IFA測定效價1∶6400-1∶12800；間接酶聯(lián)測定效價1∶25600-1∶51200。
實施例7細(xì)胞庫的建立和抗甲型流感病毒核蛋白單克隆抗體的生產(chǎn)單克隆抗體生產(chǎn)場所應(yīng)符合GMP要求，潔凈無污染，工作人員無傳染病，不得從事其他可以導(dǎo)致傳染源污染單抗制劑工作；無關(guān)人員不得進(jìn)入生產(chǎn)區(qū)內(nèi)，在同一年內(nèi)，不得同時生產(chǎn)其他無關(guān)單抗。
1、細(xì)胞庫建立原始細(xì)胞庫和生產(chǎn)細(xì)胞庫及種子批。
1、1原始細(xì)胞庫3F1雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生抗甲型流感病毒核蛋白的3F1雜交瘤細(xì)胞。
1、2種子細(xì)胞庫3F1雜交瘤細(xì)胞，為擴大培養(yǎng)凍存的細(xì)胞種子，每批細(xì)胞管數(shù)20支，貼上標(biāo)簽方入液氮罐中保存。每批留取保存時進(jìn)行細(xì)菌、真菌、支原體及病毒污染的檢測。
1、3生產(chǎn)細(xì)胞庫經(jīng)檢定合格的3F1雜交瘤細(xì)胞按生產(chǎn)條件大量培養(yǎng)，凍存的細(xì)胞管數(shù)為生產(chǎn)細(xì)胞庫。每一生產(chǎn)細(xì)胞批細(xì)胞管數(shù)10支，每次生產(chǎn)腹水時取生產(chǎn)管1支復(fù)蘇、擴增及生產(chǎn)，不再回凍。
2、抗甲型流感病毒核蛋白單克隆抗體的制備2、1小鼠腹水法(1)小鼠SPF級小鼠，經(jīng)檢查無鼠源病毒污染，在腹水生產(chǎn)過程中如發(fā)現(xiàn)動物不健康、咬傷、感染者應(yīng)棄掉。
(2)動物實驗設(shè)施有北京醫(yī)學(xué)動物管理委員會頒發(fā)的醫(yī)學(xué)動物二級以上合格證。
(3)細(xì)胞擴大培養(yǎng)取生產(chǎn)批細(xì)胞管1支復(fù)蘇，加營養(yǎng)液進(jìn)行擴大培養(yǎng)，1支生產(chǎn)細(xì)胞只用一次，不再凍存。
(4)細(xì)胞接種制備腹水均需在無菌條件下進(jìn)行，注射雜交瘤細(xì)胞之前，每只小鼠腹腔注射降植烷0.5ml。一周后每只小鼠注射3F1雜交瘤細(xì)胞1-3×106。
(5)腹水的采集注射細(xì)胞后7-10天，或小鼠瀕死前一次采集腹水，亦可以多次采集。離心分離出上清即為粗提抗體。注明批號、采集日期，置-20℃保存。
2、2細(xì)胞培養(yǎng)法可用細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)收集上清液制備單克隆抗體。
(1)種子細(xì)胞來源于生產(chǎn)細(xì)胞庫。
(2)培養(yǎng)基牛血清培養(yǎng)基。
(3)抗體收集可一次性收集，也可以連續(xù)收集，每一管種子細(xì)胞擴大培養(yǎng)后收集的上清為一個批號。
2、3粗制抗體的檢測無論是小鼠腹水還是細(xì)胞培養(yǎng)法制備的單克隆抗體，都需進(jìn)行如下檢定(1)無菌試驗。(2)支原體檢查。(3)鼠源病毒檢查。(4)效價測定合格用于抗體的純化。
2、4抗體純化(1)將3F1-McAb分別用50％、33％、33％三種濃度的SAS鹽析三次。SAS一般不會引起蛋白質(zhì)變性，可以出除不需要的白蛋白分子。
(2)DEAE-52纖維素對鹽析過的單克隆抗體進(jìn)行洗脫，可見抗體活性峰與蛋白峰的重疊。
(3)結(jié)果3F1-McAb腹水純化回收率分別為100％，免疫電泳結(jié)果顯示一條清晰的沉淀線。
(4)應(yīng)用將純化的單克隆抗體按效價的4-8單位應(yīng)用于檢測。
連續(xù)生產(chǎn)三批，各批產(chǎn)品必須符合質(zhì)檢要求，批間具有良好的重復(fù)性。
1)腹水效價的檢定3F1-McAb腹水自腹腔取出后，立即分別用FluA抗原基片進(jìn)行效價測定，要求IFA效價達(dá)到1∶6400-1∶12800，或間接酶聯(lián)免疫上清效價達(dá)到1∶25600-1∶51200。
2)腹水純化隨時測定純化后的效價，要求每次測定(IFA)效價應(yīng)達(dá)1∶6400-1∶12800。
2、5純化后處理(1)滅活必要時56℃水浴滅活30分鐘，離心取上清。
(2)合并不同亞批的合格制品合格后在2-8℃放置一個月以上，除去部分不穩(wěn)定蛋白。
(3)除菌分裝將滅活單抗用0.22um濾膜過濾，過濾后，每4-8單位加入青霉素10單位，鏈霉素1ug/ml，再加入適量的20％甘露醇進(jìn)行分裝，每支2ml，-30℃過夜，次日再進(jìn)行凍干。
實施例8單克隆抗體的大量生產(chǎn)采用體內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞，制備腹水或血清。
(1)實體瘤法對數(shù)生長期的3F1雜交瘤細(xì)胞按1～3×107/ml接種于小鼠背部皮下，每處注射0.2ml，共2～4點。待腫瘤達(dá)到一定大小后(一般10～20天)則可采血，從血清中獲得單克隆抗體的含量可達(dá)到1～10mg/ml。但采血量有限。
(2)腹水的制備常規(guī)是先腹腔注射0.5ml Pristane(降植烷)或液體石蠟于BALB/C鼠，1～2周后腹腔注射1×106個雜交瘤細(xì)胞，接種細(xì)胞7～10天后可產(chǎn)生腹水，密切觀察動物的健康狀況與腹水征象，待腹水盡可能多，而小鼠頻于死亡之前，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，一般一只小鼠可獲5～10ml腹水。也可用注射器抽提腹水，可反復(fù)收集數(shù)次。腹水中單克隆抗體含量可達(dá)到5～10mg/ml，這是目前最常用的方法，還可將腹水中細(xì)胞凍存起來，復(fù)蘇后轉(zhuǎn)種小鼠腹腔則產(chǎn)生腹水快、量多。
實施例9大量單克隆抗體的純化單克隆抗體的純化方法同多克隆抗體的純化，腹水特異性抗體的濃度較抗血清中的多克隆抗體高，純化效果好。按所要求的純度不同采用相應(yīng)的純化方法。一般采用鹽析、凝膠過濾和離子交換層析等步驟達(dá)到純化目的，也有采用較簡單的酸沉淀方法。目前最有效的單克隆抗體純化方法為親和純化法，多用葡萄球菌A蛋白或抗小鼠球蛋白抗體與載體(最常用Sepharose)交聯(lián)，制備親和層析柱將抗體結(jié)合后洗脫，回收率可達(dá)90％以上。蛋白可與蛋白可與IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3結(jié)合，同時還結(jié)合少量的IgM。洗脫液中的抗體濃度可用紫外光吸收法粗測，小鼠IgG單克隆抗體溶液在A280nm時，1.44(吸光單位)相當(dāng)于1mg/ml。經(jīng)低pH洗脫后在收集管內(nèi)預(yù)置中和液或速加中和液對保持純化抗體的活性至關(guān)重要。
實施例10甲型流感病毒膠體金快速檢測試紙的制備(1)膠體金的制備采用化學(xué)還原法，向氯化金水溶液內(nèi)加入檸檬酸三鈉還原劑，使金離子聚合成40nm膠體金顆粒。先將0.01％的HAuCl4溶液500ml加熱至沸騰，迅速加入6.5ml 1％檸檬酸三鈉水溶液，加熱至出現(xiàn)紅色后繼續(xù)煮沸7～10min?；謴?fù)體積至500ml。
(2)膠體金-抗體結(jié)合物制備及純化①、取膠體金顆粒溶液500ml，在磁力攪拌器下用0.2M K2CO3調(diào)解PH至8.2。
②、將本發(fā)明實施例7或8制備的抗甲型流感病毒核蛋白單克隆抗體用0.01M PB稀釋成1mg/ml。取5支試管各加入1ml膠體金溶液，分別加入在前4管30ul、40ul、45、50ul待標(biāo)記抗體，最后一管作為對照?；靹蚝笫覝胤胖?分鐘，前4管中各加入100ul濃度為10％的NaCl?；靹蚝笫覝胤胖?0分鐘，和對照管對比，以沒有變藍(lán)色的一管所加入的抗體量作為最佳蛋白標(biāo)記量。在此基礎(chǔ)上加10％，作為標(biāo)記使用量。
③、根據(jù)體積和標(biāo)記實用量計算標(biāo)記所需蛋白量，將1mg/ml的單克隆抗體緩慢加入膠體金溶液中，加入10mg蛋白的時間不超過5分鐘。室溫下攪拌30分鐘。進(jìn)行膠體金—抗體結(jié)合物穩(wěn)定性檢定取出2支試管，每管中加入1ml已經(jīng)加入抗體的膠體金溶液，其中一管中加入100ul濃度為10％的NaCl，混勻后室溫放置10分鐘。對比兩管的顏色，應(yīng)無變化。
④、加10％BSA，至終濃度為1％，室溫攪拌5分鐘。
⑤、加10％PEG，至終濃度為0.2％，室溫攪拌5分鐘。
⑥、8000rpm/min離心30分鐘，小心吸去上清，用200ml膠體金保存液懸浮沉淀，再次以8300 RPM離心30分鐘，小心吸去上清。用50ml膠體金保存液懸浮沉淀。置4℃保存?zhèn)溆谩?br> (3)膠體金-抗體結(jié)合物玻璃纖維素膜的制備取膠體金-抗體結(jié)合物溶液，均勻噴在玻璃纖維素膜上，放在平坦的塑料板上，然后冷凍1小時，放入冷凍干燥機上凍干過夜，至完全干燥。切成0.6～0.8cm寬的條，干燥環(huán)境中保存。
(4)抗體固相硝酸纖維素膜的制備①、將本發(fā)明實施例7或8制備的抗甲型流感病毒核蛋白單克隆抗體用0.01MPBS稀釋成3.5±0.1mg/ml。用噴膜機將以上抗體以1ul/cm的速度噴于硝酸纖維素膜上(檢測線)。
②、將羊抗鼠IgG多克隆抗體稀釋用0.01MPBS稀釋成2±0.1mg/ml。用噴膜機將以上抗體以1ul/cm的速度噴于硝酸纖維素膜上(對照線)。和檢測線的間隔為0.5cm。
③、把固定有抗體的硝酸纖維素膜置37℃烤箱中干燥30分鐘。充分干燥。
④、置2℃~8℃干燥環(huán)境中保存?zhèn)溆谩?br> (5)組裝試紙①、在塑料板中間位置粘鐵抗體固相硝酸纖維素膜。
②、在塑料板上固定硝酸纖維素膜位置的頂端，粘附吸水墊，低端粘附金標(biāo)記抗體結(jié)合物-玻璃纖維素膜條帶。吸水墊和膠體金墊應(yīng)覆蓋硝酸纖維素膜邊沿約1毫米左右。
③、膠體金墊下方粘附樣品墊，樣品墊覆蓋膠體金墊約1毫米。
④、在切條機上切成0.4cm寬的條帶。
(6)包裝(7)成品入庫根據(jù)檢定結(jié)果進(jìn)行分類，然后將制備的甲型流感金標(biāo)記快速檢測試紙按要求入庫。
(8)檢定合格成品置常溫下保存。
甲型流感病毒膠體金快速檢測試紙質(zhì)量保證1雜交瘤細(xì)胞株的質(zhì)量保證(1)親本骨髓瘤細(xì)胞購于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所，該細(xì)胞具有穩(wěn)定遺傳性和無限增殖能力。
(2)免疫親代流感毒株細(xì)胞購于中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所國家流感中心，是經(jīng)過技術(shù)檢定符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞株。
(3)免疫小鼠Balb/C購于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心，該中心具備SPF級飼養(yǎng)場所，并經(jīng)過國家認(rèn)證，小鼠經(jīng)過檢定，符合國家標(biāo)準(zhǔn)。
(4)建立單克隆細(xì)胞檢定方法檢測結(jié)果抗體分泌穩(wěn)定性陽性率為100％，細(xì)胞核學(xué)特征符合雜交瘤的核學(xué)特征，鼠源病毒檢查為陰性，支原體檢查為陰性，無菌試驗為陰性。
2單克隆抗體的質(zhì)量保證(1)免疫球蛋白類及亞類用免疫雙擴散法，結(jié)果符合要求。
(2)親和力用IFA法測定親和力常數(shù)為1.1×10-6M/L，符合要求。
(3)特異性采用IFA方法，特異性為100％。
(4)交叉試驗3F1-McAb與流感B病毒、副流感病毒1、2、3型、腺病毒3、7型、呼吸道合胞病毒，SARS病毒均呈陰性反應(yīng)。
(5)效價測定用間接熒光法(IFA法)，不低于1∶6400-1∶12800，符合要求。
3粗制抗體的檢測無論是小鼠腹水還是細(xì)胞培養(yǎng)法制備的甲型單克隆抗體，都需進(jìn)行如下檢定(1)無菌試驗為無菌生長，陰性。
(2)支原體檢查為陰性。
(3)鼠源病毒檢查為陰性。
(4)效價測定用IFA法測定或間接酶聯(lián)免疫法測定，符合純化要求。
成品質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)的建立1、成品外觀檢查試紙條寬度4mm±0.2mm試紙表面平整，邊沿整齊。
試紙條個組分粘貼牢固，銜接緊密，以保證加樣后液體的移動連續(xù)。
2、液體移行速度抽提液在硝酸纖維素膜上移動2cm時間不低于15秒。
實驗本發(fā)明流感病毒甲型膠體金快速檢測試紙的檢測結(jié)果評價實驗1甲型流感病毒不同亞型的反應(yīng)15株不同甲型流感病毒雞胚培養(yǎng)病毒上清全部呈陽性。其中甲1型7株甲3型8株。
實驗2交叉反應(yīng)和呼吸道合胞病毒無交叉反應(yīng)；和副流感病毒1、2、3型無交叉反應(yīng)；和腺病毒3、7型無交叉反應(yīng)；和4株SARS病毒無交叉反應(yīng)。
實驗3流感病毒甲型膠體金快速檢測試紙的真實性評價。
靈敏度500份陽性樣品中檢測出陽性494份，靈敏度為98.8％。
特異度500份陰性樣品種檢出陰性496份，特異度為99.2％。
實驗4對比實驗選取四種甲型流感病毒雞胚培養(yǎng)病毒上清，其中甲1型和甲3型各2株。
將該四種甲型流感病毒雞胚培養(yǎng)病毒上清用抽提液作不同濃度的稀釋，然后用美國Quidel公司產(chǎn)品和本公司產(chǎn)品作對比檢測。結(jié)果如下




權(quán)利要求
1.具有保藏號為CGMCC 0987的雜交瘤細(xì)胞株。
2.抗甲型流感病毒核蛋白單克隆抗體，可以從具有保藏號為CGMCC 0987的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生。
3.甲型流感病毒膠體金快速檢測試紙，其特征在于其包含權(quán)利要求2所述的抗甲型流感病毒核蛋白單克隆抗體。
4.如權(quán)利要求3所述的甲型流感病毒膠體金快速檢測試紙，其特征在于權(quán)利要求2所述的抗甲型流感病毒核蛋白單克隆抗體包附膠體金。
全文摘要
本發(fā)明公開了保藏號CGMCC0987的雜交瘤細(xì)胞株，該雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的抗甲型流感病毒核蛋白單克隆抗體，及含有該單克隆抗體的甲型流感病毒膠體金快速檢測試紙。該檢測試紙可以檢測快速甲型流感病毒，特異性、敏感性及準(zhǔn)確率高，保存和運輸方便，臨床及家居使用上極為便利，而且具有產(chǎn)業(yè)性。
文檔編號G01N33/569GK1591014SQ0315652
公開日2005年3月9日 申請日期2003年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月3日
發(fā)明者王炳彥 申請人:北京阿斯可來生物工程有限公司