專利名稱：用蛋白生物芯片檢測sars患者血液中生物標記的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種新的生物樣品中蛋白質分析方法，一種通過捕獲陰離子吸附表面芯片的生物標記，并用激光解析電離質譜分析來檢測生物標記。在此提及的此項發(fā)明大體上與SARS研究領域有關。更確切地講，此發(fā)明涉及到血清生物標記(Serum Biomarkers)，而這些生物標記能被用來以更高的特異性和靈敏度將SARS患者區(qū)分出來。
背景技術：
不論是細胞的正常功能還是病理特性都在一定程度上取決于細胞所表達的蛋白質功能。因此，鑒定細胞內表達的蛋白質的區(qū)別，可用于診斷疾病，并最終用于藥物開發(fā)和疾病治療。而要進行蛋白質表達和功能的差異化分析，要求能夠達到分辨細胞內分子的復雜混合物的程度。但細胞內許多物質往往以微量存在，目前用于分析蛋白的方法在上述各方面都有局限，用這些常規(guī)手段難以進行定性鑒定和定量分析。
如，一種常用的分子分離方法是凝膠電泳。通常是用凝膠內等電點聚焦先分離蛋白質，再用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳進行第二次分離。結果得到一張根據(jù)等電點范圍(凈電荷)和大小(質量)來區(qū)分蛋白質的圖。雖然有用，但是該方法存在以下幾方面的局限。首先，該方法只提供生物分子的兩項特征—質量和等電點(pI)。其次，各維度的分辨率受到凝膠分辨能力的限制。例如，通常很難區(qū)分質量差異小于5％或pI差異的生物分子。第三，凝膠的容量和靈敏度都有限，可能無法檢測出少量表達的生物分子。第四，無法觀察到分子量低于約10-20kDa的小蛋白或小肽。
又如，臨床診斷疾病一般方法是要求特異性地檢測出疾病的已知標記。但是，制備特異性結合標記并且能在復雜的混合物中鑒別出標記的試劑需要大量時間，這阻礙了此類診斷方法的發(fā)展。
其它分析方法可能克服以上局限之一或幾項，但是難以將它們有效組合。例如，分析層析能夠根據(jù)多種分析物/吸附劑相互作用來分離生物分子，但是作多維度分析卻困難而費時。而且，該方法的靈敏度也很有限。
用質譜的方法測定蛋白質是較新的方法，但目前的質譜分析方法只能對蛋白質進行定性分析，無法進行定量分析，尤其在是樣品中混合物復雜，蛋白質含量極小的情況下。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是建立一種在生物樣品中檢測正常人細胞，非SARS但發(fā)燒患者細胞，SARS患者細胞在血液中生物標記的用途。此發(fā)明涉及到血清生物標記(SerumBiomarkers)，而這些生物標記能被用來以更高的特異性和靈敏度將SARS患者區(qū)分出來。
本發(fā)明涉及一種通過捕獲陰離子吸附表面芯片的生物標記，并用激光解析電離質譜分析來檢測SARS生物標記。
本發(fā)明中的生物標記是利用一臺賽弗吉生物系統(tǒng)公司(Ciphergen Biosystems，Inc.，F(xiàn)remont，CA，USA)的PBS II型質譜儀來發(fā)現(xiàn)的。該設備的質量精確度約為+/-0.15％。
賽弗吉生物系統(tǒng)公司生產的蛋白生物芯片WCX-2(陰離子吸附表面芯片，有羧酸化功能)，結合血清中陽離子蛋白。具吸收劑的陰離子底基與樣本接觸，例如患者血清，經過一段足夠的時間使標記物或生物標記物能與陰離子吸附劑結合。經過一段培育期，底基洗去未吸附的物質。任何適宜的洗液均可使用，最好用水溶液。被吸附的分子范圍可以通過調整洗滌的嚴格度。洗液的洗提特性依靠的因素有pH，離子濃度和溫度。
生物標記物首先能夠被具有能與生物標記物結合的陰離子吸附表面芯片捕獲，非吸附物能從芯片上洗脫，吸附到底基的生物標記物在飛行質譜儀中被檢測。生物標記物通過離子發(fā)生源，如激光，被離子化，產生的離子被一個離子感受集合器收集，然后質量分析器分析那些通過的離子。之后，檢測器將檢測的離子信息轉換為質荷比。生物標記物的檢測明顯地將與信號強度的檢測有關。這樣，生物標記物的數(shù)量與質量都可以被檢測出來。
飛行質譜對待分析物的分析生成飛行時間譜。該飛行時間譜的最終分析并不表示離子化能量攻擊一個樣本產生的單獨的脈沖信號，而是一系列脈沖的信號之和。這樣降低了干擾，并增加了動態(tài)范圍。該飛行時間數(shù)據(jù)受數(shù)據(jù)處理軟件的影響。在賽弗吉生物系統(tǒng)公司軟件中數(shù)據(jù)處理主要包括轉換飛行時間與質荷比而產生質譜，降低基線而減少儀器的偏移量，和過濾高頻噪音而減輕高頻噪音。
通過對生物標記物的吸附和檢測而產生的數(shù)據(jù)可利用計算機的數(shù)據(jù)分析程序進行分析。該計算機程序分析這些數(shù)據(jù)以顯示檢測出的標記物的數(shù)量，并顯示信號的強度和確定被檢測的每個生物標記物的分子量。數(shù)據(jù)分析還能包括一系列的確定生物標記物的信號強度和矯正數(shù)據(jù)對預定統(tǒng)計分布狀態(tài)的偏離。例如，通過計算與某些參數(shù)相關的每個峰值的高度，可規(guī)范觀測到的峰。該參數(shù)可能是由儀器和類似能量吸收分子等化學成分產生的不重要的干擾，這可以設置調零。
計算機可以將計算結果數(shù)據(jù)轉換成各種形式來表現(xiàn)。其標準譜可以表示，但在一種形式中只有峰高和質量信息可以在譜帶中保留，產生一個較清晰的圖，并使具有幾乎相同分子量的生物標記物更易顯現(xiàn)。在另一種形式中，兩個或更多的譜比較，便于突顯獨特的生物標記物和那些高于或低于校準樣本的生物標記物。
分析一般包括展示從待分析物得到的信號的圖譜中峰的鑒定。峰可以通過視圖進行選擇，軟件是可用的，它可自動檢測峰。一般情況下，該軟件通過鑒定信號具有信噪比高于一個選擇閾值并標記出在峰信號的質心處的峰的質量這樣的方式操作。在一個有效的程序中，比較許多譜線以認定出現(xiàn)在質譜中某一選定范圍內同樣的一些峰。該軟件的一個版本聚集所有出現(xiàn)在確定的質量范圍內的各條光譜的峰，對所有在質量(質荷比)中值附近的峰指定一個質量(質荷比)簇。
通常用于分析數(shù)據(jù)的軟件可包括代碼用于一個運算法則來分析信號以確定該信號是否表示一個信號中的峰，按照目前的發(fā)明，該峰相應于一個生物標記物的信號。該軟件也能結合分類樹或ANN分析。從觀測生物標記物的峰中獲得的數(shù)據(jù)，以決定一條生物標記物峰或生物標記物的峰組合的出現(xiàn)是否代表SARS狀態(tài)。數(shù)據(jù)的分析直接或間接地將從樣本的質譜分析獲得的多種參數(shù)轉換為函數(shù)關系。這些參數(shù)包括，但不局限于一條或多條峰是否出現(xiàn)，一條或一組峰的形狀，一條或多條峰的高度，及峰高數(shù)據(jù)的其他算法。
任何合適的數(shù)字化計算機都可完成并使用分類模型。合適的數(shù)字化計算機包括小型、微型、大型計算機使用標準或特殊操作系統(tǒng)，如Unix，WindowsTM，或LinuxTM為基礎的操作系統(tǒng)。數(shù)字化計算機可以與質譜儀分開，也可連在一起。此發(fā)明體現(xiàn)在訓練數(shù)據(jù)集和分類模式上，訓練數(shù)據(jù)集和分類模式可用計算機編碼表示，一臺數(shù)字計算機即可運行這種編碼。計算機編碼儲存在任何合適的計算機可讀工具中包括光盤、磁盤、內存條、磁帶等，并且能寫入任何合適的計算機操作語言包括C，C++，可視basic，等。
不管是發(fā)展已知生物標記的分類系統(tǒng)，還是尋找新的SARS生物標記，上述系統(tǒng)都是很有用的。反過來，分類系統(tǒng)是試驗診斷的基礎，為單個或聯(lián)合使用分子標記提供診斷依據(jù)。
發(fā)明中使用的生物標記是包含一個多肽分子(polypeptide)的生物分子。這些生物標記是通過由質譜測定法(mass spectrometry)測定的不同的分子量，在質譜測定法中光譜峰圖的形狀以及它們對于吸附表面的吸附特性而彼此進行辨別。
在本發(fā)明中，像在此描述的那樣，將一個給定的生物標記的質量和親和特性表現(xiàn)出來從而標識出該生物標記，這樣的標識使得研究人員可以確定一個特殊的被檢測的生物分子能否成為本發(fā)明中的生物標記。這些特征反映了這些生物分子的固有特征，而沒有對這些生物分子的辨別設定限制。
對生物標記的檢測需要將一個血清樣本放在賽弗吉生物系統(tǒng)公司W(wǎng)CX2芯片的一個吸附點上，接著用pH4.0的50mM的乙酸鈉進行清洗。向吸附點上加入SINAPINICS酸并讓其干燥。而后，用表面加強激光解析電離飛行時間質譜測定法(SELDI-TOF-MS，PBSII)對芯片進行分析，而一個顯示了單個蛋白質分子的遺留物圖將生成，這張圖是在蛋白質分子的質量-電荷比的基礎上，以彼此分開的峰圖的形式顯示出來的。
用此種方法收集到的光譜數(shù)據(jù)將用數(shù)據(jù)管理軟件進行分析。每組的質量光譜都符合散點分析(scatterplotanalysis)的條件。作為在SARS組和對照組中有相同的表達水平(levelof expression)的潛在的生物標記，在散點上的蛋白質簇(protein cluster)被消除了，也就是那些在兩種環(huán)境下都增強或都衰減的蛋白質簇。殘留下來的多肽將被進一步分析以確定它們將SARS組和對照組準確區(qū)分開來的能力。在兩組中表現(xiàn)差異最大的蛋白質簇會被收集起來。
因為本項發(fā)明中的生物標記是通過質量和吸附特性來標識的，因而它們可通過質譜測定法進行檢測而無需知道它們特定的身份。然而，如果有必要，這些生物標記也可通過，比如，確定多肽的氨基酸序列來進行鑒別。例如，一個生物標記能用許多酶描繪出來，例如V8蛋白酶(V8 protease)，而且消化片段(digestion fragments)的分子量可被用來在數(shù)據(jù)庫中搜索序列，這些序列與由多種酶生成的消化片斷的分子量相吻合?；蛘撸绻松飿擞洸皇且阎獢?shù)據(jù)庫中的蛋白質分子，在生物標記的N極氨基酸序列(N-terminal AminoAcid Sequence)的基礎上，可使用降解探針，而后，這些探針會被用來描繪由探測到了生物標記的樣本所生成的基因組或cDNA庫。最后，蛋白質生物標記可用蛋白質梯狀排序法(Protein Ladder Sequencing)進行排序。通過將分子碎成碎片并將碎片用酶解作用或其他可按順序從碎片末端除去一個單個氨基酸分子的方法進行處理后，可生成蛋白質梯度(Protein Ladders)。然后，用質譜對此梯度進行分析。階梯狀碎片(Ladder Fragments)在質量上的差異可鑒別出從分子末端被除去的氨基酸。
SARS是一種由冠狀病毒(Corona Virus)引起的致命的疾病。一種基于聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction，即“PCR”)技術，針對SARS的診斷方法已經開發(fā)出來。然而，此項技術只在50％的樣本中是準確的，而且較高的假陰性(False Negatives)比例，限制了其臨床應用。
通過對比從血清中獲得的樣本的質譜，鑒別出了本發(fā)明中的生物標記。生物標記呈現(xiàn)在血清中，而血清是從不同的對象組中獲得的。這其中包括急性SARS對象，非SARS但發(fā)燒對象(None-SARS Fever)，SARS康復對象—感染后30天，以及非SARS對照對象—健康個體或由其他疾病的個體。
具體實施例方式
實施例1 正常人細胞及非SARS但發(fā)燒患者細胞，急性SARS患者細胞在血液中生物標記的區(qū)分(1)實驗方法一、材料1.標本來源收集2003年中國用WHO標準評價(臨床診斷)的SARS病人的血清/血漿樣本。
2.試劑尿素、乙腈、三氟乙酸、SPA(Sinapinic acid)均購自Sigma公司。
二、方法1.樣品的收集全血采集后吸取血清，置于-80℃保存；2.樣品的準備最初用賽弗吉蛋白芯片系統(tǒng)各種化學物質芯片(疏水性、離子性、金屬結合物)來評價以決定哪種親和性化學物質在蛋白質數(shù)目和分析方面提供最好的血清圖形。我們觀察到WCX2芯片效果最好。
3.芯片的預處理樣本(3μl)用U9(6μl)稀釋(一種緩沖液包含50mMTris-HCI pH9，9摩爾尿素，2％CHAPS)，4℃放置30分鐘，然后放入108μl結合緩沖液(50mM NaAOc，pH4.0)(完全稀釋39倍)充分混勻。100μl稀釋樣本用微加樣器加到WCX2生物芯片上。100μl稀釋樣本加載到覆蓋一個芯片位點的槽中并在室溫條件下輕微震蕩1小時。從槽中移去緩沖液。200μl同樣的結合緩沖液加到每個槽中并震蕩洗滌5分鐘。重復洗滌。移去緩沖液并在每個槽中加200μl HPLC-梯度水快速沖洗。水從槽中去除。在分析前，加入0.5μl的SINAPINIC酸(5mg/mL 50％乙腈；0.5％三氟乙酸)，任其自然干燥。
4.芯片檢測芯片放入賽弗吉生物系統(tǒng)公司PBSII質譜閱讀器中，就會生成飛行時間質譜。外部使用All-in-1肽分子質量標準來校正質量精確性。絕大多數(shù)閱讀器設定激光強度為170-190，靈敏度為8-10。在自動資料收集前需要手工設定來評估閱讀條件。
此研究所用的資料分析處理包括三個階段(a)峰值檢測和排列；(b)選出鑒別能力最高的峰；(c)利用生物標記圖軟件進行資料分析。
選出2,000-50,000Da質量范圍進行分析，因為此范圍包含絕大多數(shù)分解的蛋白和肽。分子量0-1,000Da從分析中剔除掉。峰值測定包括(a)基線扣除，(b)質量準確性的校正，(c)自動峰值檢測。
生物標志圖軟件利用一套訓練數(shù)據(jù)集來分析蛋白質特性。分類樹將一套數(shù)據(jù)集分成兩個節(jié)點，每次對一種形式的問題使用一個規(guī)則。根據(jù)峰的出現(xiàn)或缺失和強度水平作出分開的決定。樣本級別決定終點的分類，而樣本級別由此點大多數(shù)樣本決定。成本函數(shù)的計算體現(xiàn)在每個節(jié)點的多樣性。此過程選擇的峰決定了分開的規(guī)則，這些峰是兩派生節(jié)點上最大降低成本的關鍵。
(2)實驗結果用統(tǒng)計學方法，分析所得數(shù)據(jù)的形式是用計算機讀取的格式。過分析幾千種血清蛋白峰，發(fā)現(xiàn)下述4種生物標志物可以用于區(qū)分對照組(正常人，非SARS但發(fā)燒患者)細胞及急性SARS(感染發(fā)燒后1-7天)患者細胞。
分析37例急性SARS(感染發(fā)燒后1-7天)病人與74例對照組(正常人及非SARS但發(fā)燒患者)血清中蛋白質的組成，結果發(fā)現(xiàn)3939±1Da，8136±1Da，11514±1Da，4137±1Da中4個蛋白質組成的生物標志物可將對照組(正常人及非SARS但發(fā)燒患者)與急性SARS(感染發(fā)燒后1-7天)患者準確的分組。
預測準確率用統(tǒng)計學分析及雙盲分析中，結果顯示用這4個蛋白質組成的生物標志物進行檢測，發(fā)現(xiàn)36/37例急性SARS(感染發(fā)燒后1-7天)患者與67/73例對照組(正常人及非SARS但發(fā)燒患者)被正確分組，準確率為93.6％(103/110)。
敏感度和特異性在雙盲分析中37例急性SARS患者(感染發(fā)燒后1-7天)中有36例患者被本方法診斷為SARS患者，73例對照組(正常人及非SARS但發(fā)燒患者)均被本方法診斷為非SARS患者。靈敏度為97.3％(36/37)，特異性為91.8％(67/73)。
(2)結論將來自具有統(tǒng)計意義的急性SARS(感染發(fā)燒后1-7天)患者群的樣品與對照組(正常樣品，非SARS但發(fā)燒患者)比較，用陰離子吸附表面芯片所捕獲的4種血清蛋白生物標記，可以用于鑒別診斷。
本項發(fā)明提供了根據(jù)SARS的不同階段而而在對象中表現(xiàn)異常的生物標記。本項發(fā)明中的生物標記依據(jù)其質量-電荷比(即mass-to-charge ratio，例如M3939表明其質量-電荷比為3939)來確定名稱。所有的生物標記在用50mM的乙酸鈉，pH4.0，進行清洗后，都被吸附在陰離子吸附表面芯片上(WCX2芯片)。首選的所有生物標記的生物源是血清。
本發(fā)明利用陰離子吸附表面芯片對37例確診為急性SARS(感染發(fā)燒后1-7天)患者與73人對照組(正常人和非SARS但發(fā)燒患者)血清進行蛋白質對比分析，結果發(fā)現(xiàn)血清中質荷比3939±1Da，8136±1Da，11514±1Da，4137±1Da中的4個蛋白質相對含量有明顯的差異，并且4個蛋白質所組合成的分組標準診斷急性SARS(感染發(fā)燒后1-7天)的靈敏度為97.3％，特異性為91.8％。因此，這是目前最好的診斷方法。
權利要求
1.一種用蛋白生物芯片捕獲生物樣品中蛋白質的蛋白質分析方法，其特征是采用激光解析電離分析對樣品中蛋白質組進行鑒別檢測。
2.權利要求1所述的蛋白質分析方法，其中所述的鑒別檢測中蛋白質組的方法是質譜法。
3.權利要求1所述的蛋白質分析方法，所用蛋白生物芯片的吸附劑是陰離子。
4.權利要求1所述的蛋白質分析方法，所用蛋白生物芯片的吸附表面捕獲多個生物標記，可以檢測多個生物標記群。
5.權利要求1所述的蛋白質分析方法，所用蛋白生物芯片的吸附表面捕獲涉及到血清生物標記(Serum Biomarkers)。
6.用權利要求1的方法分析生物樣品中特異的生物標記以檢測正常人細胞及非SARS但發(fā)燒患者細胞，急性SARS患者細胞在血液中生物標記的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種通過被陰離子吸附表面芯片上捕獲的生物標記，并用激光解析電離質譜分析來檢測生物標記。在一個蛋白生物芯片的吸附表面上捕獲多個生物標記，并對捕獲的生物標記進行分析?？梢詸z測多個生物標記群。本發(fā)明的方法可用于檢測血液中正常人細胞及非SARS但發(fā)燒患者細胞，急性SARS患者細胞的生物標志組合。用這些生物標記組合的診斷法可以鑒別SARS和正常人，非SARS。本方法準確、方便且快捷。
文檔編號G01N33/569GK1595162SQ0315655
公開日2005年3月16日 申請日期2003年9月9日 優(yōu)先權日2003年9月9日
發(fā)明者吳小意, 李曉燕 申請人:北京德易信達科技開發(fā)有限公司