專利名稱：在用于全血的層析裝置中對聚陽離子的中和作用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于檢測全血樣品中待分析物的層析測定裝置和測定方法，更具體地說，是關(guān)于一種裝置和方法，它應(yīng)用紅細(xì)胞分離劑聚集紅細(xì)胞，并應(yīng)用中和劑消除紅細(xì)胞分離劑對測定系統(tǒng)可能存在的不利作用。
背景技術(shù)：
現(xiàn)代臨床診斷方法通常是對血液樣品進(jìn)行。不幸的是，紅細(xì)胞對許多診斷測定有干擾作用。在對待分析物的檢測中，紅細(xì)胞可能會抑制特異性結(jié)合的配對成分之間的結(jié)合。而且，紅細(xì)胞具有酶活性，取決于所采用的測定方法，這種酶活性可能干擾產(chǎn)生的信號。另一方面，在應(yīng)用層析測定裝置，特別是層析免疫測定裝置的快速檢測方式中，紅細(xì)胞可能會阻止液體流動，液體流動對于在這種裝置上發(fā)生反應(yīng)是必不可少的。鑒這種原因和其它一些原因，許多檢測法都用血漿或血清進(jìn)行，這就首先必須從全血中分離出血漿或血清。
有許多已知的技術(shù)可用于在全血樣品中使紅細(xì)胞與血漿分離。離心是本領(lǐng)域熟知的一種方法，通過離心可從全血中分離出血漿(凝血之前)和血清(凝血之后)。在此過程中，紅細(xì)胞沉淀于試管底部，可通過緩慢傾倒分離出血清。但是，通過離心使全血分層有許多缺點。通常離心需要抽取大量的血液樣品。另外，此方法費時，并需要笨重的實驗室設(shè)備，通常不能安裝在醫(yī)生的診室內(nèi)。最后，對血液額外的操作會增加暴露于血液-攜帶病原體的潛在危險。
為了減少或消除對離心的需要，已發(fā)展了應(yīng)用梯度膜或捕集膜從血液的液體部分分離紅細(xì)胞的測定裝置。還使用了固相化的抗紅細(xì)胞抗體。
另一些已知的用于使紅細(xì)胞與血漿或血清分離的技術(shù)包括，(1)使全血樣品與紅細(xì)胞結(jié)合劑相結(jié)合，然后使此混合物通過一種固體的吸水性成分過濾，其特異性結(jié)合的配對組分中的至少一種與此吸水成分結(jié)合，而除去了凝集的紅細(xì)胞；(2)使全血通過一種玻璃微纖維濾器，此濾器可能具有或不具有與之結(jié)合的凝集劑；(3)應(yīng)用一種多糖材料的阻擋層或隔離層，以便阻止紅細(xì)胞通過，從而防止它干擾對干測試條上信號的檢測或目視觀察；以及(4)應(yīng)用一種具有聚陽離子表面的支持物，它結(jié)合紅細(xì)胞而不結(jié)合血漿。
這些用于使紅細(xì)胞與血漿分離的技術(shù)許多都是昂貴、復(fù)雜的，可能導(dǎo)致對紅細(xì)胞的分離不完全，并可能引起溶血。溶血會引起非特異性結(jié)合或很高的背景干擾，導(dǎo)致喪失檢測的靈敏度。這可以是游離血紅蛋白所致，它可使檢測區(qū)染色，以使此檢測區(qū)可在粉紅至暗褐紅色的范圍內(nèi)顯示顏色。結(jié)果，由于檢測區(qū)內(nèi)存在血紅蛋白的顏色，可全部或部分地掩蓋所產(chǎn)生的可視性化學(xué)信號。另外，在檢測系統(tǒng)中應(yīng)用分離劑如聚陽離子，有可能對系統(tǒng)產(chǎn)生干擾，常常是通過除了使紅細(xì)胞聚集之外，還使其它一些試劑或結(jié)合成分聚集。
因此，需要有一種裝置和方法，用于檢測血樣品中的待分析物，而對檢測系統(tǒng)沒有不利的影響。這種裝置和方法應(yīng)該適合于包括小量樣品在內(nèi)的多種體積的全血樣品。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種層析裝置，它包含一種可限定液流路徑、能夠支持毛細(xì)管流的層析載體，一個與層析載體保持液流接觸的血液樣品加樣部位，一個與此加樣部位分隔開的在層析載體上部的檢測部位，一種位于加樣部位下游的可擴(kuò)散結(jié)合的被標(biāo)記物，一種在檢測部位上游，用于從血液樣品中分離血漿或血清的可擴(kuò)散結(jié)合的紅細(xì)胞分離劑，以及一種在此結(jié)合分離劑下游，在檢測部位上游，能夠與該分離劑結(jié)合的可擴(kuò)散結(jié)合的中和劑，借此可中和分離劑的正電荷。優(yōu)選的情況是，此紅細(xì)胞分離劑是位于加樣部位，以致可在血清或血漿沿層析載體移動之前使紅細(xì)胞與血清或血漿分離。
本發(fā)明還涉及一種方法，用于檢測樣品中，優(yōu)選地是血樣品中是否存在某待測物，此方法包括，提供一種能夠支持毛細(xì)管流、可限定液流路徑的層析載體，沿著此載體有(a)一個與層析載體保持液流接觸的血液樣品加樣部位，(b)一個在層析載體上與加樣部位分隔開的檢測部位，(c)一種位于加樣部位下游的可擴(kuò)散結(jié)合的被標(biāo)記物，(d)一種在檢測部位上游，用于從血液樣品中分離血漿或血清的可擴(kuò)散結(jié)合的紅細(xì)胞分離劑，以及(e)一種位于此結(jié)合分離劑下游和檢測部位上游的，能夠與該分離劑結(jié)合的可擴(kuò)散結(jié)合的中和劑，借此可中和分離劑的正電荷；此方法還包括使加樣部位與血液樣品接觸，以使紅細(xì)胞分離劑可從血液樣品中分離出血漿或血清，并且使中和劑在樣品沿液流路徑流動時可中和分離劑的正電荷；以及還包括檢測血液樣品中是否存在待分析物。
附圖簡述

圖1顯示本發(fā)明層析測定裝置的優(yōu)選實施方案。
發(fā)明詳述本發(fā)明是基于如下的觀測，全血樣品中的紅細(xì)胞對測定血液樣品中待分析物的存在或含量有干擾作用，在不存在此干擾作用時，這種檢測可以通過多種測定系統(tǒng)方便地完成。例如在免疫測定法中，與加樣部位接觸的全血樣品，由于存在紅細(xì)胞的阻礙或干擾，不大可能借助于毛細(xì)作用沿測試條移動。本發(fā)明克服了這個問題，而不影響測定系統(tǒng)的靈敏度。
在對本發(fā)明實施方案的理解中可應(yīng)用下面的一些定義。
“待分析物”或“待研究的分析物”指的是將被檢測或測定的，具有至少一個抗原表位或結(jié)合位點的化合物或組合物。這種待分析物可以是具有天然存在的待分析物-特異性結(jié)合成分的，或者是可以制備一個待分析物-特異性結(jié)合成分的任何一種物質(zhì)，待分析物包括但不局限于如下物質(zhì)毒素，有機化合物，蛋白質(zhì)，肽，微生物，氨基酸，核酸，激素，類固醇，維生素，藥物(包括為治療目的給予的藥物以及為不正當(dāng)目的給予的藥物)，以及上述任何一種物質(zhì)的代謝物，或者針對它們的抗體。名詞“待分析物”還包括任何一種抗原物質(zhì)，半抗原，抗體，大分子和它們的組合。
“層析載體”指的是任何適合的多孔性，有吸收能力，吸水性，各向同性的材料，或者是毛細(xì)材料。它包含該裝置的檢測部位，通過此裝置，借助于毛細(xì)作用或弱作用力，待分析物或待測樣品可以被轉(zhuǎn)移。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解到，層析載體可以由單一材料構(gòu)成，或者由一種以上材料構(gòu)成(例如，可以由不同的材料構(gòu)成不同的區(qū)帶、部份、層、區(qū)域或部位)，只要這種多層次結(jié)構(gòu)處于液流相互接觸的狀態(tài)，從而使待測樣品能夠在材料之間通過。液流接觸允許樣品中的至少某些成分，即待分析物，在多孔材料的區(qū)帶之間通過，優(yōu)選的情況是，沿不同區(qū)帶之間的接觸界面這種液流接觸是均勻一致的。天然的或合成的材料，或者經(jīng)合成修飾的天然存在的材料都可用作層析載體，包括但不局限于如下種類紙(纖維狀的)，或纖維素材料的膜(微孔的)例如濾紙；纖維素和纖維素衍生物如醋酸纖維素和硝酸纖維素；玻璃纖維；織物；包括天然原料(如棉花)織物和合成原料(如尼龍)織物；以及多孔凝膠等。
“標(biāo)記”指的是能夠產(chǎn)生目視或儀器可檢測信號的任何一種物質(zhì)。適合用于本發(fā)明的各種標(biāo)記包括通過化學(xué)或物理方式產(chǎn)生信號的標(biāo)記物。例如包括酶和底物，色原物質(zhì)，熒光化合物，化學(xué)反光化合物，有色的或可著色的有機聚合物膠乳微粒，以及含有直接可視物質(zhì)的脂質(zhì)體或其它微泡。在本發(fā)明中優(yōu)選地可使用放射標(biāo)記，膠體金屬微?；蚰z體非金屬微粒。優(yōu)選的標(biāo)記物包括膠體金和膠乳微粒。
“被標(biāo)記物”或“綴合物”指的是含有附著于特異性結(jié)合成分的可檢測標(biāo)記的物質(zhì)。這種附著可能是共價的或非共價的結(jié)合，還可能包括核酸雜交。這種標(biāo)記可使被標(biāo)記物產(chǎn)生可檢測的信號此信號直接或間接地與待測樣品中待分析物的含量有關(guān)?？蛇x擇被標(biāo)記物的特異性結(jié)合成分，使之直接或間接與待分析物結(jié)合。
“特異性結(jié)合成分”指的是特異性結(jié)合對中的一種成分，即二種不同的分子，其中一種分子通過化學(xué)或物理方式特異性地結(jié)合于第二種分子。如果這種特異性結(jié)合成分是免疫反應(yīng)物，那末它可以是例如抗體，抗原，半抗原，或它們的復(fù)合物，而如果使用抗體，則可以是單克隆抗體或多克隆抗體，重組的蛋白質(zhì)或抗體，嵌合抗體，它們的混合物或片段，以及抗體和其它特異性結(jié)合成分的混合物。特異性結(jié)合成分的特定實例包括，生物素和親合素，抗體和與之相對應(yīng)的抗原(二者都與待測定的樣品無關(guān))，以及單鏈核酸和其互補鏈等。
“捕集物”指的是一種或幾種特異性結(jié)合成分，它們附著在一部分層析載體的內(nèi)部或表面，形成一個或幾個“捕集部位”，其中，待分析物，標(biāo)記的試劑和/或?qū)φ赵噭⒈还潭ㄔ诖藢游鲚d體上。附著的方法對于本發(fā)明不是關(guān)鍵性的。捕集物通過從未結(jié)合的檢測試劑和待測樣品的剩余成分中基本分離出待分析物和/或被標(biāo)記物，而有助于對可檢測信號的觀測?？梢栽趯嵤z測之前或者檢測過程中，通過任何適合的附著方法將捕集物固定在層析載體上。進(jìn)而，可以在層析載體表面或其內(nèi)部提供單一的檢測部位或多個檢測部位。還可以使捕集物配置成多種構(gòu)型，以便產(chǎn)生不同的檢測或測定模式。例如，可使捕集物形成字母，數(shù)字，圖標(biāo)或符號，或者成為它們的任何組合形式。
特別是，本發(fā)明提供了一種層析檢測裝置，用于檢測樣品中，優(yōu)選地是血液樣品中是否存在某種待分析物。此裝置優(yōu)選地是構(gòu)成層析測試條的形式，它具有可限定液流路徑，并能夠支持毛細(xì)管流的層析載體，血液樣品加樣部位，以及與加樣部位分隔開的檢測部位，用于檢測血液樣品中待分析物的存在或含量。優(yōu)選地，此裝置還包括可擴(kuò)散地結(jié)合于層析載體的被標(biāo)記物(或綴合物)。在優(yōu)選的實施方案中，此被標(biāo)記物將與待分析物結(jié)合，或者與待分析物在檢測部位競爭結(jié)合。此裝置優(yōu)選地還包含可擴(kuò)散地結(jié)合于層析載體的另外二種試劑(1)在檢測部位上游的紅細(xì)胞分離劑(此后，把通過毛細(xì)作用引起的樣品運動方向稱為“下游”，其相反的方向稱為“上游”)，它能夠從血液樣品中分離出血漿或血清，以及(2)在紅細(xì)胞分離劑下游，檢測部位上游的中和劑，用于消除紅細(xì)胞分離劑對層析系統(tǒng)的任何影響，特別是不利的作用。
對于本發(fā)明，被用于某一給定試劑的術(shù)語“可擴(kuò)散地結(jié)合”可被規(guī)定為用于本發(fā)明的任何試劑，包括但不局限于被標(biāo)記物，特異性結(jié)合成分，紅細(xì)胞分離劑或中和劑，該術(shù)語表示該試劑是以允許被結(jié)合的試劑可沿液流路徑流動的方式被結(jié)合。
任何一種檢測系統(tǒng)都可能用于本發(fā)明的目的。優(yōu)選的是免疫檢測系統(tǒng)，包括但不局限于水平液流系統(tǒng)，垂直液流系統(tǒng)，浸漬系統(tǒng)和檢測小棒。下面將概述一些已知的檢測系統(tǒng)。
一般來說，對于層析測試條至少在層析載體上安排了一個樣品加樣部位和一個檢測部位。當(dāng)將被懷疑含有所需分析物即待分析物的樣品液施加于加樣部位時，借助于毛細(xì)作用它將沿層析載體移動，并且在檢測部位通過結(jié)合反應(yīng)(如免疫學(xué)反應(yīng))的作用，積累預(yù)先安排在層析載體上的標(biāo)記裝置包含的被標(biāo)記物或綴合物，這種積累作用與樣品液中待檢測物的存在或含量成正比例或反比例，這樣，通過測定如此積累的被標(biāo)記或綴合物的存在或含量，就可以檢測出樣品液中待檢測物的存在或含量。已知有多種類型的層析測試條，所有這些已知的層析測試條，包括下面將要描述的，都可用于本發(fā)明。如在此所使用的術(shù)語“層析檢測裝置”意指一種層析測試條，它是以可被用于檢測和能夠貯存和運輸?shù)倪@樣一種方式制備的。
下面描述層析測試條的一種典型實例。可使加樣部位處在與被標(biāo)記物相同的位置，優(yōu)選地是在被標(biāo)記物的上游位置。當(dāng)使被懷疑含有待檢測分析物的樣品液與加樣部位接觸時，樣品液借助于毛細(xì)作用，沿層析載體連同待分析物一起向下游方向移動。通常待分析物是一種化合物，它以特異性方式結(jié)合于固定在檢測部位的捕集物，或者是一種可以特異性方式結(jié)合于一種綴合物的化合物，在檢測部位，此綴合物已特異性地結(jié)合于捕集物。例如，當(dāng)此捕集物是一種抗原或者此綴合物含有一種抗原時，待分析物是一種抗體，當(dāng)此捕集物是一種抗體，或者此綴合物含有一種抗體時，待分析物是一種抗原。作為另一種例子，待分析物還可能是可結(jié)合于互補綴合物和捕集物的核酸。
當(dāng)使加樣部位處于被標(biāo)記物上游位置時，可安排此被標(biāo)記物靠近加樣部位，或者在與加樣部位分開的位置。
可通過多種方式實現(xiàn)加入被標(biāo)記物的目的，例如通過在加入樣品液之后將它加到層析測定條檢測部位之外的某一位置。
因為是以這樣一種方式安排被標(biāo)記物，以使它可借助于樣品液的毛細(xì)作用移動，所以，當(dāng)將樣品液加入樣品添加裝置時，被標(biāo)記物可向下游方向移動。
通常使檢測部位處于被標(biāo)記物的下游位置，并且與被標(biāo)記物間隔一定距離。在檢測部位，有一種捕集物固定于層析載體，此捕集物僅以特異性方式結(jié)合待分析物或綴合物，或者特異性地結(jié)合待檢測的每種物質(zhì)和被標(biāo)記物。因此，在一個實施方案中，借助于樣品液的毛細(xì)作用移動的待分析物(有時是連接于一種被標(biāo)記物的)結(jié)合于捕集物，或者結(jié)合于一種綴合物，此綴合物本身又結(jié)合于此捕集物。被標(biāo)記物結(jié)合于這種被結(jié)合的待檢測物，從而導(dǎo)致被標(biāo)記物以響應(yīng)待分析物的存在或含量的方式在檢測裝置中積累。另一種方式是，被標(biāo)記物和待分析物借助于毛細(xì)作用移動，競爭性結(jié)合于捕集物，或者結(jié)合于綴合物，此綴合物本身又結(jié)合于捕集物，從而導(dǎo)致被標(biāo)記物與待檢測物含量成反比例地積累。
有一種情況是，其中的某一被標(biāo)記物既可結(jié)合捕集物(或一種綴合物，它本身又結(jié)合于捕集物)，又可結(jié)合待分析物，但不是同時結(jié)合，在這種情況下，待分析物首先結(jié)合于被標(biāo)記物，未結(jié)合于待檢測物的剩余被標(biāo)記物結(jié)合于捕集物。因此，通過測定在檢測裝置中積累的被標(biāo)記物，可以分析待分析物的存在和含量。
在偶爾需要時，可將不同的物質(zhì)定位在檢測部位的上游。例如，可以使綴合物以可移動的方式這樣定位。
在某些情況下，可以在第一檢測部位的下游安排一個或幾個補充檢測部位。在檢測部位的下游，層析載體還可進(jìn)一步延伸，這樣使樣品液可被完全釋放，或者此載體可能裝配有用于吸收樣品液的材料。
因此，通過測定在檢測部位積累的被標(biāo)記物的存在或含量，可以檢測樣品液中所需待分析物的存在或含量。在一種情況下，這可以通過目測來完成。
本發(fā)明試圖用于任何血液樣品，包括血清和血漿，但是優(yōu)選地是用于含有紅細(xì)胞的血液樣品，例如全血樣品。
如果希望以理想的靈敏度進(jìn)行檢測，優(yōu)選地是在對血液樣品中所需待分析物進(jìn)行檢測之前將紅細(xì)胞除去。因此，根據(jù)本發(fā)明將一種紅細(xì)胞分離劑結(jié)合于層析載體。優(yōu)選地是使紅細(xì)胞分離劑可擴(kuò)散地結(jié)合于層析載體?？稍谌魏螌⒛馨l(fā)揮使紅細(xì)胞與血漿或血清分離功能的位置，將紅細(xì)胞分離劑結(jié)合于層析載體。優(yōu)選地是在檢測部位的上游使它可擴(kuò)散地結(jié)合于層析載體。最優(yōu)選地是將紅細(xì)胞分離劑可擴(kuò)散地結(jié)合在樣品施加部位。此位置之所以是優(yōu)選的，是因為將它們用于層析載體后就立即可導(dǎo)致紅細(xì)胞聚集，如果有的話，它僅對血清或血漿通過毛細(xì)作用沿載體的液流產(chǎn)生最小的干擾。
本發(fā)明的紅細(xì)胞分離劑可以是能夠聚集紅細(xì)胞的任何一種物質(zhì)。優(yōu)選的試劑是帶正電荷的物質(zhì)如聚陽離子，包括例如，聚-氫溴酸L-賴氨酸；聚(二甲基二烯丙基銨)氯化物(Merquat-100，Merquat-280，Merquat-550)；聚-鹽酸L-精氨酸；聚-L-組氨酸；聚(4-乙烯吡啶)，聚(4-乙基吡啶)氫氯化物；交聯(lián)的聚(4-乙烯吡啶)，氯代甲烷季鹽；(4-乙烯吡啶-苯乙烯)共聚物；聚(4-乙烯吡啶聚(氟化氫))；聚(4-乙烯吡啶 -對-甲苯磺酸鹽)；聚(4-乙烯吡啶-三溴化物)；聚(4-乙烯吡咯烷酮-共-2-二甲氨基乙基異丁烯酸鹽)；交聯(lián)的聚乙烯吡咯烷酮；聚乙烯吡咯烷酮；聚(蜜胺-共-甲醛)；部分甲基化的；hexadimethrine溴化物；聚(谷氨酸，賴氨酸)1∶4氫溴化物；聚(賴氨酸，丙氨酸)3∶1氫溴化物；聚(賴氨酸，丙氨酸)2∶1氫溴化酸；聚琥珀?；腖-賴氨酸，聚(賴氨酸，丙氨酸)1∶1氫溴化物；以及聚(賴氨酸，色氨酸)1∶4氫溴化物。最優(yōu)選的聚陽離子是聚(二甲基二烯丙基銨)氯化物(Merquat-100))。
可以按能從其余的樣品中有效地分離紅細(xì)胞的任何適合的用量使用本發(fā)明的紅細(xì)胞分離劑。優(yōu)選地，紅細(xì)胞分離劑是以大約0.04％-1.3％(每單位體積中的重量)的濃度存在，更優(yōu)選的是大約0.13％-0.33％(每單位體積中的重量)，而最優(yōu)選的是大約0.20％-0.33％(每單位體積中的重量)。
紅細(xì)胞分離劑上的正電荷具有使存在于測試條上任何帶負(fù)電荷的試劑聚集的傾向。例如，結(jié)合于層析載體的被標(biāo)記物或綴合物也可能被紅細(xì)胞分離劑聚集，而干擾待分析物與綴合物的結(jié)合，或者在競爭性檢測中，干擾被標(biāo)記物和待分析物在檢測部位與捕集物的結(jié)合或者與綴合物的結(jié)合。最終有可能損害此免疫檢測系統(tǒng)的靈敏度和準(zhǔn)確性。
因此，當(dāng)紅細(xì)胞分離劑是帶正電荷的物質(zhì)時，本發(fā)明優(yōu)選地應(yīng)用了一種中和劑。此中和劑能夠中和紅細(xì)胞分離劑的正電荷，從而可消除由紅細(xì)胞分離劑引起的對檢測系統(tǒng)的任何干擾，或者至少使之減到最小程度。優(yōu)選地，此中和劑是可擴(kuò)散地結(jié)合于層析載體?？蓪⒅泻蛣┛蓴U(kuò)散地結(jié)合在層析載體上能有效地中和紅細(xì)胞分離劑的任何位置，但是，優(yōu)選地是定位在紅細(xì)胞分離劑的下游，檢測部位的上游，而更優(yōu)選地是定位于層析載體上與可擴(kuò)散結(jié)合的被標(biāo)記物相同的位置。
中和劑可以是能夠中和紅細(xì)胞分離劑正電荷的任何一種聚陰離子。優(yōu)選的聚陰離子包括，聚(丙烯酸)，聚(丙烯酸，Na鹽)，聚(甲基異丁烯酸)，聚(Na-4-苯乙烯磺酸鹽)，聚(乙烯基磺酸)，聚-L-天冬氨酸，以及羧甲基纖維素，而最優(yōu)選的是硫酸葡聚糖。
可以使中和劑以能有效地中和紅細(xì)胞分離劑正電荷的任何含量存在。一般來說，中和劑的濃度取決于所使用紅細(xì)胞分離劑的濃度。優(yōu)選地，中和劑是以大約0.33％-20％(單位體積的重量)的濃度存在，更優(yōu)選的是大約0.34％-10％(單位體積重量)，而0.34％-10％(單位體積重量)是最優(yōu)選的。
圖1描繪了本發(fā)明免疫層析檢測裝置的一種實施方案。裝置10包括層析載體20。血液樣品加樣部位30位于層析載體20上。在此優(yōu)選的實施方案中，紅細(xì)胞分離劑即Merquat100是定位于加樣部位30。鄰接加樣部位30有綴合物墊片40，它含有綴合物即硒標(biāo)記的結(jié)合物，以及中和劑即硫酸葡聚糖。更下游是檢測部位50，在檢測進(jìn)行之后，它將顯示出對照色帶60，并且如果存在待檢測物，還將顯示出檢測帶70。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，優(yōu)選地在加樣部位與樣品接觸之后，可用一個緩沖液與加樣部位接觸。緩沖液有助于在層析載體上保持沿液流路徑有可接受的液流速度。此緩沖液可以是任何能夠借助于毛細(xì)作用沿液流路徑流動的物質(zhì)，包括但不局限于磷酸緩沖液，磷酸緩沖鹽水，Tris-HCl緩沖液，碳酸緩沖液，檸檬酸緩沖液，HEPES(2-羥基哌嗪-N′-2-乙磺酸)緩沖液，MOPS(3-(N-嗎啉)丙磺酸)緩沖液，以及MES(2-(N-嗎啉)乙磺酸)緩沖液等。雖然其濃度和pH可以是能在所需檢測裝置中起作用的任何濃度和pH，但優(yōu)選的摩爾濃度是在大約10mM-100mM之內(nèi)，pH是大約5-9，更優(yōu)選的是大約6-8。所使用的緩沖液最優(yōu)選地是50mM磷酸緩沖液，pH7.4。
本發(fā)明所使用液體的體積取決于裝置的大小。理想的情況是，使用足夠的液體體積，以便使液流能通過裝置到達(dá)檢測部位。液體體積優(yōu)選地是大約25μl-100μl，更優(yōu)選地是大約40μl-60μl。因此，在需要時可按大約10μl-40μl的體積范圍加入緩沖液，而更優(yōu)選地是大約20μl-30μl。
本發(fā)明還涉及一種用于檢測血液樣品中是否存在某種待分析物的方法。此方法優(yōu)選地應(yīng)用本發(fā)明的層析免疫檢測裝置。具體地說，此方法包括(1)提供一種能夠支持毛細(xì)管流，可限定液流路徑的層析載體，沿著此載體有一個與層析載體保持液流接觸的血液樣品加樣部位，一個在層析載體上與加樣部位分隔開的檢測部位，一種結(jié)合于待分析物或者在檢測部位與待分析物競爭結(jié)合的可擴(kuò)散地被標(biāo)記物(或綴合物)，一種在檢測部位上游用于從血液樣品中分離血漿或血清的可擴(kuò)散結(jié)合的紅細(xì)胞分離劑，以及一種結(jié)合于層析載體的綴合物；(2)使加樣部位與血液樣品接觸，以使紅細(xì)胞分離劑能將血液樣品中的紅細(xì)胞與血漿或血清分離，并且使中和劑能中和此分離劑的正電荷，以及(3)檢測血液樣品中是否存在待分析物。
優(yōu)選地，此紅細(xì)胞分離劑是一種帶正電荷的物質(zhì)，并且液流路徑上含有可擴(kuò)散結(jié)合的中和劑，中和劑優(yōu)選地能夠與紅細(xì)胞分離劑結(jié)合，并且是位于紅細(xì)胞分離劑的下游和檢測部位的上游，從而可中和此分離劑的正電荷。
因此，在圖1的優(yōu)選實施方案中，將血液樣品施加于加樣部位30，紅細(xì)胞分離劑通過使紅細(xì)胞聚集而將它們分離，并允許血漿或血清借助于毛細(xì)作用沿層析載體20移動。綴合物墊片40中的中和劑中和紅細(xì)胞分離劑對裝置10和綴合物的影響，待分析物與存在于綴合物墊片40中的綴合物結(jié)合。結(jié)合于此綴合物的待分析物繼續(xù)向下游移動至檢測部位50。如果存在所研究的待測物，將顯示檢測色帶70。為了指示測試工作正常，將顯示對照色帶60，指示是否存在所研究的待分析物。
本發(fā)明可優(yōu)選地包括一個非反應(yīng)性覆蓋層或環(huán)繞檢測裝置的外套。優(yōu)選地此覆蓋層至少封裝層析載體，避免接觸和污染捕集部位。此覆蓋層還可能包括一個突出區(qū)，鄰接加樣部位，有助于接納和/或包含一定體積的樣品。此外，此覆蓋層還可能包括一個或幾個切開區(qū)，構(gòu)成字母，數(shù)字，圖標(biāo)或符號，或者其任何組合物形式。在此實施方案中，當(dāng)測試條被完全包裝時，此切開區(qū)構(gòu)成特定的檢測部位圖形。優(yōu)選的是使測試條的足夠部分被封裝，以便防止施加的樣品與檢測部位接觸，而不首先通過測試條部分。
可將本發(fā)明的裝置和方法用于任何一種其中的血液樣品包含所需待分析物的檢測系統(tǒng)。優(yōu)選的檢測系統(tǒng)實例包括，但不局限于，丙肝病毒(“HCV”)，甲肝病毒(“HAV”)，人免疫缺損病毒(“HIV”)，乙肝表面抗體(“HBsAb”)，乙肝表面抗原(“HBsAg”)，乙肝核心抗體(“HBcAb”)，乙肝核心抗原(“HBcAg”)，癌胚抗原(“CEA”)，甲胎蛋白(“AFP”)，胰腺癌標(biāo)志物(“CA19-9”)，梅毒，結(jié)核病，瘧疾，利什曼病和登革熱。
下面的實施例將進(jìn)一步說明本發(fā)明，但無論如何不應(yīng)認(rèn)為是對本發(fā)明范圍的限制。
實施例實施例1由聚陽離子引起的紅細(xì)胞聚集作用與硒綴合物聚集作用的比較為本發(fā)明的目的，要求全血中的紅細(xì)胞(rbc′s)聚集而不希望硒綴合物聚集。試驗了多種聚陽離子，觀察它們能否引起rbc′s充分地聚集，而同時僅最少地聚集硒-綴合物。
按如下方法制備了HIV-1重組蛋白的硒綴合物首先使32mM氧化硒與91ml L-抗壞血酸在水溶液中42℃反應(yīng)72小時制備硒膠體。將此硒膠體稀釋成在波長550nm時的光密度為30，然后在pH7.4的30mMTris緩沖液中與40μg/ml的重組HIV-1外膜蛋白室溫下反應(yīng)20分鐘。將此硒膠體標(biāo)記的HIV-1蛋白綴合物，在含有0.1％酪蛋白的pH 7.410mM Tris緩沖液中，再次稀釋成在波長550nm時的光密度為30，并在室溫下溫育20分鐘。然后在4℃以1970xg將此綴合物溶液離心20分鐘，取出上清液，棄去沉淀。再對此上清液加入相當(dāng)于上清液十分之一體積的含有2％酪蛋白的pH7.4，30mM Tris緩沖液。最后，在含有1％酪蛋白，2％蔗糖和2％乳糖的pH7.4，50mM Tris緩沖液中，將此綴合物溶液稀釋成在波長550nm時光密度為10。
配制0.25％(w/v)的如下聚陽離子水溶液聚-L-賴氨酸氫溴化物，分子量(mw)37000；聚-L-鹽酸精氨酸；mw12100，42400和92000；聚-L-組氨酸，mw18400；Hexadimethrine溴化物，聚(賴氨酸，丙氨酸)3∶1氫溴化物，mw35000；聚(賴氨酸，丙氨酸)2∶1氫溴化物，mw49300；聚(賴氨酸，丙氨酸)1∶1氫溴化物，mw41600；聚(賴氨酸，色氨酸)1∶4氫溴化物，mw 38000(所有上述聚陽離子均購自Sigma，St.Louis，MO)；聚(二烯丙基二甲基銨氯化物)，mw105-106(Merquat-100，Calgon，Pittsburgh，PA)。
通過將350μl 0.25％的不同聚陽離子溶液加入等體積全血或硒綴合物中，觀察這些聚陽離子在各自的反應(yīng)中聚集全血中rbc′s或硒綴合物的能力。將二種溶液混合，在室溫下放置10分鐘，然后目視評估聚集作用。結(jié)果概括在表1中。1個加號(+)表示弱聚集作用，2+表示中度聚集作用，3+和4+表示強聚集作用。
表1

能引起rbc′s聚集(2+或更強)，而同時引起硒綴合物最小聚集(2+或更小)的聚陽離子是良好的選擇。那些對二者具有2+聚集作用的聚陽離子符合此標(biāo)準(zhǔn)。對聚-L-賴氨酸HBr和Merquat-100作進(jìn)一步選擇試驗，Merquat-100具有最佳成本效果。
實施例2以聚陰離子的中和作用防止綴合物聚集A.應(yīng)用硫酸葡聚糖防止綴合物流動和聚集用聚-L-賴氨酸作聚陽離子rbc聚集劑，試驗不同濃度的硫酸葡聚糖聚陰離子，觀察硫酸葡聚糖是否能中和聚陽離子的正電荷，從而防止由聚陽離子引起的硒綴合物的聚集。在聚陽離子已經(jīng)引起rbc′s發(fā)生聚集之后，但在聚陽離子與硒綴合物相互作用之前加入硫酸葡聚糖。用如下實驗評價了此聚陽離子和硫酸葡聚糖對硒綴合物的聚集作用，以及隨之發(fā)生的對其沿免疫層析測試條流動能力的影響。
裝配了一種免疫層析測試條，由樣品墊片，中和墊片，綴合物墊片和檢測片組成。樣品墊片的制備在0.33％聚-L-賴氨酸氫溴化物，mw37000(Sigma，St.Louis，MO)水溶液中，浸泡4mm寬，20mm長的玻璃纖維濾紙(Lypore9524，Lydall，Rochester，NH)，然后真空干燥。
含有不同濃度硫酸葡聚糖的中和墊片的制備在含有0％，1.1％3.3％或10％硫酸葡聚糖，mw5000(Sigma，St.Louis，MO)的水溶液中，浸泡由木漿和聚酯(Sontara 8801，Du pont，Wilmington，Delaware)制成的4mm寬，13mm長的濾紙。浸泡之后，真空干燥此墊片。
綴合物墊片的制備在如實施例1中配制和稀釋的硒膠體標(biāo)記的HIV-1重組蛋白綴合物中，浸泡4mm寬，4.3mm長的玻璃纖維濾紙(Lypore9524，Lydall，Rochester，NH)。浸泡之后，將此綴合物墊片真空干燥。
檢測片是4mm寬，40mm長的硝酸纖維素濾膜(產(chǎn)品目錄號#H9643G1，Millipore，Bedford，MA)。將在含有1％蔗糖的pH7.4 100mMTris緩沖液中配制成5mg/ml濃度的HIV-1包膜抗原加到此硝酸纖維素濾膜上，使之形成一條線，在距濾膜末端約1cm的位置跨越此檢測片的寬度。用聚酯薄片(代碼#7733)，粘合劑研究公司，Glen Rock，PA)對此劃線區(qū)襯底。使此檢測片充分干燥，致使抗原固定于硝酸纖維素濾膜上。
用上述組成部分裝配成4mm寬的免疫層析測試條，頭尾相連地縱向排列，每部分之間重疊1mm，20mm長的樣品墊片位于一端，接著放置一片13mm長的中和墊片，隨之是4.3mm長的綴合物墊片，最后是40mm長的檢測片。然后用聚酯薄片(代碼#8648，粘合劑研究公司，Glen Rock，PA)，從檢測片的頂端至距組裝的測試條底部10mm覆蓋此測試條，遺留下約10mm暴露的樣品墊片。然后將80μl血漿施加于每種免疫層析測試條的樣品墊片，這些測試條包含帶有0％，1.1％，3.3％或10％硫酸葡聚糖的中和墊片。目視觀測紅色硒綴合物的聚集作用和此綴合物沿測試條流動的能力。
結(jié)果顯示在下面表2中，表明不存在硫酸葡聚糖中和來自聚陽離子溶液的電荷時，硒綴合物聚集，不能夠沿測試條流動。綴合物的聚集和流動之間存在反比關(guān)系，3.3％或更高的硫酸葡聚糖濃度足以防止綴合物聚集并允許綴合物沿測試條流動。
表2

B.硫酸葡聚糖存在時rbc的聚集為了測定硫酸葡聚糖對rbc聚集的影響，用全血作樣品，以10％硫酸葡聚糖在4.3mm長×4mm寬的中和墊片上重復(fù)上述實驗。在用這種中和墊片如上裝配免疫層析測試條之后，對樣品墊片施加80μl全血。15分鐘后，目視觀測rbc聚集的結(jié)果，測量所形成的血漿沿測試條流動的能力。rbc′s被聚集，滯留在樣品墊片上，未沿測試條向上流動，而血漿在1 5分鐘內(nèi)沿測試條流動了33mm。這表明，在樣品墊片中的聚陽離子仍能夠?qū)е氯獦悠分衦bc′s聚集，并且，在中和墊片中存在聚陰離子硫酸葡聚糖不會干擾這種rbc的聚集作用。
C.用聚陰離子防止綴合物聚集如實施例2.A實驗了其它幾種聚陰離子，以便評價它們防止硒綴合物聚集的能力。將15.5mm長×4mm寬的樣品墊片浸泡于含有0.26％Merquat-100的水溶液中，然后在55℃下干燥。不使用中和墊片，而是在含有1％酪蛋白，2％蔗糖，2％乳糖，以及含有0％，1.1％或3.3％聚陰離子硫酸葡聚糖mw5000(Sigma，St.Louis，MO)，或者0％，0.5％，1％或2％的如下一種聚陰離子(全部購自Aldrich化學(xué)公司，Milwaukee，WI)的pH7.4，10mM Tris緩沖液中稀釋硒綴合物聚(丙烯酸)，mw5000；聚(鈉-4-苯乙烯磺酸鹽)，mw70000；聚(乙烯基磺酸，鈉鹽)；聚(甲基異丁烯酸)，mw9500；聚(丙烯酸，鈉鹽)，mw2100。將綴合物墊片浸泡于不同的硒綴合物溶液中，并真空干燥。如實施例2.A制備檢測片，并裝配成免疫層析測試條。然后將50μl血漿施加于每種免疫層析測試條的樣品墊片，這些免疫層析測試條具有含不同聚陰離子的綴合物墊片。目視觀察紅色硒綴合物的聚集。表3顯示以所試驗的不同濃度聚陰離子觀察到的綴合物聚集的相對量。
表3

nt＝未試驗如上面所述，如果沒有聚陰離子存在來中和來自樣品墊片的聚陽離子的正電荷(在試驗全血時，聚陽離子對rbc的聚集是必不可少的)，硒綴合物被聚集了。用于綴合墊片中的所有聚陰離子，至少有一種所試驗的濃度可防止綴合物發(fā)生聚集。此實驗還表明，不必將聚陰離子施加于單獨的墊片，而可以同硒綴合物組合施加在綴合墊片上。
實施例3在HIV-1抗體檢測試驗中將硫酸葡聚糖用于中和墊片與用于綴合墊片的比較按實施例2.A制備免疫層析測試條，帶有或不帶有4mm寬×4.3mm長的玻璃纖維濾紙(Lypore 9524，Lydall，Rochester，NH)中和墊片。當(dāng)使用中和墊片時，將此墊片浸泡于含有3.3％硫酸葡聚糖的水溶液中，然后真空干燥。對于沒有中和墊片的測試條，將硒綴合物用含有1％酪蛋白，2％蔗糖，2％乳糖和3.3％硫酸葡聚糖的pH7.4，10mM Tris緩沖液稀釋，并在此溶液中浸泡綴合物墊片，然后真空干燥。所使用的樣品墊片與實施例2.A中的相同，不同的是將它浸泡在0.2％Merquat-100水溶液中。
以50％的血細(xì)胞比容值在HIV陰性的人全血內(nèi)(根據(jù)血漿體積)，或者在HIV陰性的人血漿內(nèi)，按1∶2048稀釋含有HIV-1抗體的人血清。再次用全血或血漿作稀釋劑，進(jìn)一步作3次1∶2連續(xù)稀釋。將80μl陰性的全血或來自HIV-1陽性的全血系列稀釋液樣品加到免疫層析測試條的樣品墊片上，此測試條被制備成在單獨的中和墊片中含有硫酸葡聚糖，或者在綴合物墊片上，硫酸葡聚糖在硒綴合物溶液中。80μl陰性血漿或來自HIV-1陽性的血漿系列稀釋液樣品，只在綴合物墊片上帶有硫酸葡聚糖的免疫層析測試條上測試。加樣后15分鐘觀測結(jié)果(表4)。陽性結(jié)果在檢測片上顯示出紅色，在此紅色的硒標(biāo)記HIV-1抗原綴合物-HIV-1抗體復(fù)合物，被結(jié)合于此檢測片劃線區(qū)上的HIV-1抗原。陰性結(jié)果在檢測片上的此區(qū)域沒有顏色。
表4

nt＝未試驗表4中的結(jié)果說明，借助于一種免疫層析測試條，可檢測全血中的HIV-1抗體，此測試條應(yīng)用聚陽離子Merquat-100聚集rbc′s，使樣品能沿測試條流動，并且應(yīng)用聚陰離子硫酸葡聚糖作中和劑，防止聚陽離子使硒綴合物聚集，使此綴合物能夠與陽性樣品結(jié)合，形成復(fù)合物并能沿測試條流動至檢測區(qū)。已顯示，此聚陰離子不論是分開用于中和墊片中或者與硒綴合物組合用于綴合物墊片上都是有效的。在此試驗中，當(dāng)將聚陰離子(硫酸葡聚糖)用于綴合物墊片，而不是在單獨的中和墊片上時，顯示出對檢測HIV-1抗體的靈敏度提高了二倍。
此外，表4中的結(jié)果還表明聚陽離子能有效地聚集全血中的rbc′s，并且不論在全血或血漿中都顯示對HIV-1抗體有同樣的檢測靈敏度，在全血中為了樣品流動必須使rbc′s聚集，而在血漿中沒有rbc′s妨礙樣品流動。結(jié)果還表明，聚陰離子的存在，不論單獨在中和墊片中或者在綴合物墊片中，都不會干擾聚陽離子有效地引起全血中rbc′s聚集的能力。
實施例4在HBsAg檢測中使用Merquat和不同的聚陰離子制備了用于檢測全血樣品中乙肝表面抗原(HBsAg)的免疫層析測試條。用Merquat-100作為聚集樣品墊片中rbc′s的聚陽離子，評價不同聚陰離子在綴合物墊片中作為聚陽離子中和劑防止硒綴合物聚集的效果。
裝配由樣品墊片，綴合物墊片和檢測片組成的免疫層析測試條。通過在0.26％Merquat-100水溶液中浸泡4mm寬×15.5mm長的玻璃纖維濾紙，然后在55℃干燥，而制成樣品墊片。
如實施例1，用硒膠體和12μg/ml的抗HBsAg小鼠單克隆抗體(抗-HBs)制備硒綴合物，然后在含有如下聚陰離子之一的Tris緩沖液中，將此硒膠體標(biāo)記的抗-HBs綴合物稀釋成在波長550nm時的光密度為2.60.5％聚(丙烯酸)，mw2000(PAA-2000)；0.5％聚(丙烯酸)，mw240000(PAA-240000)，0.5％硫酸葡聚糖，mw5000；0.8％聚-L-天冬氨酸，mw36,300；0.5％羧甲基纖維素，mw90000(CMC)。硫酸葡聚糖和聚-L-天冬氨酸購自Sigma，St.Louis，MO，其余的聚陰離子購自Aldrich化學(xué)公司，Milwaukee.WI。
制備綴合物墊片在上述制備的，并用上述聚陰離子之一稀釋的硒膠體標(biāo)記的抗-HBs綴合物中浸泡4mm寬×4.3mm長的玻璃纖維濾紙。浸泡之后，真空干燥此綴合物墊片。
檢測片是如實施例2中制備的4mm寬×40mm長的硝酸纖維素濾膜，使用3mg/ml濃度的抗-HBs小鼠單克隆抗體，將它加到此硝酸纖維素濾膜上，使之形成一條線，在距濾膜末端約1cm的位置跨越此檢測片的寬度。用聚酯薄片對此劃線區(qū)襯底。使此檢測片充分干燥，致使抗體固定于硝酸纖維素濾膜。
用上述組成部分裝配免疫層析測試條，將它們頭尾相連，1mm重疊地縱向排列，樣品墊片位于一端，與它鄰接的是綴合物墊片，最后是檢測片。然后用聚酯薄層覆蓋此組裝的測試條，留下約10mm樣品墊片暴露在外。
以50％血細(xì)胞比容值將重組HBsAg加到HBsAg陰性的人全血中，達(dá)到12.5ng/ml的濃度。在全血中進(jìn)一步作3次1∶2系列稀釋。將50μl陰性全血或來自HBsAg陽性的全血系列稀釋樣品加到免疫層析測試條的樣品墊片上，這些測試條被制備成在其綴合物墊片中含有不同的聚陰離子。施加樣品后15分鐘觀測結(jié)果(表5)。陽性結(jié)果在檢測片上顯示出紅色，在此紅色的硒標(biāo)記抗-HBs綴合物-HBsAg復(fù)合物被結(jié)合于檢測片劃線區(qū)上的抗HBs。陰性結(jié)果在檢測片的此區(qū)域內(nèi)不顯示出顏色?？稍谶M(jìn)入檢測片的入口處目視觀測到紅色硒綴合物的聚集。
表5

盡管所有的聚陰離子都能用于檢測HBsAg，但是那些能防止綴合物聚集的聚陰離子，PAA2000，硫酸葡聚糖和聚-L-天冬氨酸，對全血樣品中的HBsAg表現(xiàn)出高2-4倍的檢測靈敏度。
應(yīng)用在含有PAA-2000作聚陰離子的Tris緩沖液中稀釋的硒膠體標(biāo)記的綴合物重復(fù)了上述實驗，不同的是，在加入HBsAg全血樣品之后1分鐘，再對樣品墊片加入pH7.4，50mM磷酸緩沖液25μl。在施加樣品之后再加入緩沖液，應(yīng)用這種程序得到的結(jié)果與不用此步驟的結(jié)果相同。因此，對于這些檢測，在施加樣品之后可以加緩沖液或不加緩沖液。
實施例5在檢測結(jié)核病中使用Merquat和硫酸葡聚糖制備免疫層析測試條，用于檢測全血樣品中抗結(jié)核分枝桿菌抗體(抗-Mtb)。用Merquat-100作聚陽離子，用于在樣品墊片中聚集rbc′s，評價不同濃度的聚陰離子硫酸葡聚糖在綴合物墊片中作為聚陽離子中和劑防止硒綴合物聚集的效果。
裝配由樣品墊片，綴合物墊片和檢測片組成的免疫層析測試條。樣品墊片的制備在0.26％Merquat-100水溶液中浸泡4mm寬×15.5mm長的玻璃纖維濾紙，然后真空干燥。
同實施例1，用硒膠體和來自E.Coli的3.5μg/ml重組Mtb抗原制備硒綴合物。然后在含有0％，0.34％，1.1％或者3.3％硫酸葡聚糖的Tris緩沖液中，將此硒膠體標(biāo)記的Mtb綴合物稀釋成在波長550nm時的光密度為2.5。
綴合物墊片的制備在如上述制備和用一種硫酸葡聚糖濃度稀釋的硒膠體標(biāo)記的Mtb綴合物中，浸泡4mm寬×4.3mm長的玻璃纖維濾紙。浸泡之后真空干燥此綴合物墊片。
檢測片是4mm寬×40mm長的硝酸纖維素濾膜，如在實施例2中，用0.15mg/ml濃度的重組Mtb抗原，將它加到硝酸纖維素濾膜上，使之形成一條線，在距濾膜末端大約1cm的位置跨越此檢測片的寬度。用聚酯薄片襯托在劃線區(qū)的背面。使此檢測片充分干燥，致使抗原能固定于硝酸纖維素。
用上述組成部分裝配免疫層析測試條，將它們頭尾連接，重疊1mm縱向排列，樣品墊片在一端，與其鄰接的是綴合物墊片，最后是檢測片。然后用聚酯薄片覆蓋裝配的測試條，遺留大約10mm樣品墊片暴露在外。
以50％的血細(xì)胞比容值在陰性的人全血內(nèi)按1∶100稀釋抗-Mtb陽性血清。進(jìn)一步在全血內(nèi)作二次1∶2系列稀釋。將50μl陰性全血或來自抗-Mtb陽性全血系列稀釋液的樣品加到免疫層析測試條的樣品墊片上，此測試條被制備成在其綴合物墊片含有不同濃度的硫酸葡聚糖。施加樣品后15分鐘觀測結(jié)果(表6)。陽性結(jié)果在檢測片上顯示出紅色，在此，紅色的硒標(biāo)記Mtb綴合物-抗-Mtb復(fù)合物結(jié)合于檢測片劃線區(qū)上的Mtb。陰性結(jié)果在檢測片上的此區(qū)域不顯示顏色?？稍谶M(jìn)入檢測片的入口處目視觀測紅色硒綴合物的聚集。
表6

表6中的資料顯示，在不存在聚陰離子防止綴合物聚集時不能進(jìn)行檢測，在此聚陰離子是硫酸葡聚糖。綴合物聚集與檢測靈敏度之間有反比例關(guān)系。在3.3％的硫酸葡聚糖濃度時，不發(fā)生綴合物聚集，顯示出對抗-Mtb的最高靈敏度的檢測。
實施例6在梅毒檢測中使用Merquat和硫酸葡聚糖制備免疫層析測試條用于檢測全血或血漿樣品中的抗梅毒密螺旋體抗體(抗-TP)。通過對血漿比較在全血中檢測的靈敏度，可確定是否借助于聚陽離子有效地聚集全血中的rbc′s，使之不干擾檢測，從而可提高此測定法的檢測靈敏度。用Merquat-100作聚陽離子，用于在樣品墊片中聚集rbc′s，用聚陰離子硫酸葡聚糖在綴合物墊片中作聚陽離子中和劑，防止硒綴合物聚集。
裝配由樣品墊片，綴合物墊片和檢測片組成的免疫層析測試條。樣品墊片的制備在0.2％Merquat-100水溶液中浸泡4mm寬×15.5mm長的玻璃纖維濾紙，然后在55℃使它干燥。
如實施例1，使用硒膠體和7.5μg/ml的梅毒密螺旋體的溶菌產(chǎn)物(TP)制備硒綴合物。然后在含有3.3％硫酸葡聚糖的Tris緩沖液中，將此硒膠體標(biāo)記的TP綴合物稀釋成在波長550nm時的光密度為2.8。
綴合物墊片的制備在上面制備的硒膠體標(biāo)記的TP綴合物中浸泡4mm寬×4.3mm長的玻璃纖維濾紙。浸泡之后真空干燥此綴合物墊片。
檢測片是4mm寬×40mm長的硝酸纖維素濾膜，如實施例2用44μg/ml濃度的梅毒密螺旋體溶菌產(chǎn)物制備，將它加到此硝酸纖維素濾膜上，使之形成一條線，在濾膜末端大約1cm的位置跨越檢測片的寬度。用聚酯薄片襯托在劃線區(qū)的背面。使此檢測片充分干燥，致使TP溶菌產(chǎn)物固定在硝酸纖維素上。
用上面的組成部分裝配免疫層析測試條，將它們頭尾相連，重疊1mm縱向排列，樣品墊片在一端，與其鄰接的是綴合物墊片，最后是檢測片。然后用聚酯薄片覆蓋此裝配的測試條，遺留大約10mm樣品墊片暴露在外。
以50％的血細(xì)胞比容值，在陰性的人全血中或陰性的人血漿中1∶10.8稀釋抗-TP陽性的人血清。再次用全血或血漿作稀釋劑，進(jìn)一步作4次1∶2系列稀釋。將60μl陰性的全血或血漿，或者來自抗-TP陽性全血或血漿系列稀釋液的樣品加到此免疫層析測試條的樣品墊片中。施加樣品之后15分鐘觀測結(jié)果(表7)。陽性結(jié)果在檢測片上顯示出紅色，在此，紅色的硒標(biāo)TP綴合物-抗-TP復(fù)合物結(jié)合于檢測片劃線區(qū)上的TP溶菌產(chǎn)物。陰性結(jié)果在檢測片的此區(qū)域不顯示出顏色。
表7顯示，在全血和血漿中，對抗-TP的檢測靈敏度相同，表明聚陽離子Merquat-100有效地聚集了全血中的rbc′s。
表7

特將在此所引證的所有出版物，專利和專利申請引入作為參考，如同每篇單獨的文獻(xiàn)各自特定地被指明引入作為參考，并且各文獻(xiàn)全文引用。
盡管已經(jīng)側(cè)重于優(yōu)選的實施方案對本發(fā)明進(jìn)行了描述，但是顯然，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，這些優(yōu)選的實施方案都是可改變的。有可能通過與在此特定描述的不同方式實踐本發(fā)明。因此，本發(fā)明包括如在詳述和所附權(quán)利要求書中所陳述的，包含在本發(fā)明精髓和范圍內(nèi)的所有改進(jìn)形式。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測血液樣品中是否存在某種待分析物的層析測定裝置，它包括一種能夠支持毛細(xì)管流的可限定液流路徑的層析載體，一個與層析載體保持液流接觸的血液樣品加樣部位，一在層析載體上與加樣部位分隔開的檢測部位，一種位于加樣部位下游的可擴(kuò)散結(jié)合的被標(biāo)記物，一種在檢測部位上游，用于從血液樣品中分離血漿或血清的可擴(kuò)散結(jié)合的紅細(xì)胞分離劑，以及一種在此結(jié)合分離劑下游，在檢測部位上游的可擴(kuò)散結(jié)合的中和劑。
2.權(quán)利要求1的層析測定裝置，其中該裝置是一種免疫測定裝置。
3.權(quán)利要求1的層析測定裝置，其中是將紅細(xì)胞分離劑結(jié)合在用于施加血液樣品的部位。
4.權(quán)利要求1的層析裝置，其中的紅細(xì)胞分離劑是一種帶正電荷的物質(zhì)。
5.權(quán)利要求4的層析測定裝置，其中的帶正電荷物質(zhì)是選自如下的聚陽離子聚-L-賴氨酸氫溴化物，聚-L-精氨酸氫氯化物，聚-L-組氨酸，聚(賴氨酸，丙氨酸)3∶1氫溴化物，聚(賴氨酸，丙氨酸)2∶1氫溴化物，聚(賴氨酸，丙氨酸)1∶1氫溴化物，聚(賴氨酸，色氨酸)1∶4氫溴化物，以及聚(二烯丙基二甲基銨氯化物)。
6.權(quán)利要求4的層析測定裝置，其中的帶正電荷物質(zhì)是聚(二烯丙基二甲基銨氯化物)。
7.權(quán)利要求1的層析測定裝置，其中的中和劑是帶負(fù)電荷的物質(zhì)。
8.權(quán)利要求7的層析測定裝置，其中的帶負(fù)電荷物質(zhì)是選自如下的聚陰離子硫酸葡聚糖，聚(丙烯酸)，聚(鈉-4-苯乙烯磺酸鹽)，聚(乙烯基磺酸)，聚(甲基異丁烯酸)，聚-L-天冬氨酸，以及羧甲基纖維素。
9.權(quán)利要求7的層析測定裝置，其中的帶負(fù)電荷物質(zhì)是硫酸葡聚糖。
10.權(quán)利要求1的層析測定裝置，其中是將所述的中和劑，在與被標(biāo)記物相同的位置可擴(kuò)散地結(jié)合于層析載體。
11.權(quán)利要求1的層析測定裝置，其中的被標(biāo)記物是硒標(biāo)記的物質(zhì)。
12.一種用于檢測血液樣品中是否存在待分析物的方法，包括如下步驟提供一種能夠支持毛細(xì)管流，可限定液流路徑的層析載體，沿著此載體有(a)一個與層析載體保持液流接觸的血液樣品加樣部位，(b)一個在層析載體上與加樣部位分隔開的檢測部位，(c)一種位于加樣部位下游的被標(biāo)記物，(d)一種在檢測部位上游用于從血液樣品中分離血漿或血清的可擴(kuò)散結(jié)合的紅細(xì)胞分離劑，以及(e)一種位于此結(jié)合分離劑下游和檢測部位上游的可擴(kuò)散結(jié)合的中和劑；使加樣部位與血液樣品接觸；以及檢測此血液樣品中是否存在待分析物。
13.權(quán)利要求12的方法，其中的被標(biāo)記物包括硒標(biāo)記的物質(zhì)。
14.權(quán)利要求12的方法，其中是將中和劑在與被標(biāo)記物相同的位置可擴(kuò)散地結(jié)合于層析載體。
15.權(quán)利要求12的方法，其中的紅細(xì)胞分離劑是帶正電荷的物質(zhì)。
16.權(quán)利要求15的方法，其中帶正電荷的物質(zhì)是選自如下的聚陽離子聚-L-賴氨酸氫溴化物，聚-L-精氨酸氫氯化物，聚-L-組氨酸，聚(賴氨酸，丙氨酸)3∶1氫溴化物，聚(賴氨酸，丙氨酸)2∶1氫溴化物，聚(賴氨酸，丙氨酸)1∶1氫溴化物，聚(賴氨酸，色氨酸)1∶4氫溴化物，以及聚(二烯丙基二甲基銨氯化物)。
17.權(quán)利要求12的方法，其中的中和劑是帶負(fù)電荷的物質(zhì)。
18.權(quán)利要求17的方法，其中的帶負(fù)電荷物質(zhì)是選自如下的聚陰離子硫酸葡聚糖，聚(丙烯酸)，聚(鈉-4-苯乙烯磺酸鹽)，聚(乙烯基磺酸)，聚(甲基異丁烯酸)，聚-L-天冬氨酸，以及羧甲基纖維素。
全文摘要
一種用于全血樣品的層析測定裝置和方法，它使用紅細(xì)胞分離劑聚集紅細(xì)胞，使血漿或血清能借助于毛細(xì)作用流動，并且使用中和劑中和紅細(xì)胞分離劑對此裝置和方法可能具有的不利影響。
文檔編號G01N33/576GK1495428SQ0315791
公開日2004年5月12日 申請日期1998年12月29日 優(yōu)先權(quán)日1998年1月15日
發(fā)明者吉村徹, 俊博, 小笠原俊博, 弘, 齊藤道弘, J·P·格洛夫, 格洛夫 申請人:艾博特公司