專(zhuān)利名稱(chēng)：檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征抗體的elisa試劑盒及用法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征抗體的ELISA試劑盒及用法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。用于豬繁殖與呼吸綜合征的抗體檢測(cè)，以此對(duì)抗體水平及疫情的分布與流行情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)。
二
背景技術(shù)：
豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome；PRRS)是二十世紀(jì)八十年代出現(xiàn)的嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的一種傳染病。該病的主要特征是引起妊娠母豬的早產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎及產(chǎn)弱仔豬，仔豬主要表現(xiàn)為咳嗽、呼吸困難、呼吸急促。1987年美國(guó)首先報(bào)道了該病的發(fā)生，隨后加拿大、德國(guó)、荷蘭等國(guó)家及地區(qū)也相繼爆發(fā)了該病?，F(xiàn)在，本病在世界各養(yǎng)豬國(guó)家、地區(qū)都有發(fā)生，已越來(lái)越多地引起人們的關(guān)注。我國(guó)是世界養(yǎng)豬大國(guó)，本病在我國(guó)發(fā)生、流行的現(xiàn)狀不容樂(lè)觀。本病的病原體是豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcinereproductive and respiratory syndrome virus；PRRSV)，屬于套式病毒目動(dòng)脈炎病毒科動(dòng)脈炎病毒屬成員。根據(jù)病毒基因組核苷酸序列的差異，將其分為兩個(gè)基因型北美洲型與歐洲型。PRRSV共包括8個(gè)開(kāi)放閱讀框。
豬繁殖與呼吸綜合征自出現(xiàn)至今，關(guān)于本病診斷方法與的研究成果不斷涌現(xiàn)。應(yīng)用最為廣泛的是以全病毒作為包被抗原建立的ELISA方法，即美國(guó)IDEXX公司ELISA試劑盒。由于病毒需由細(xì)胞培養(yǎng)物中大量增殖，而真正意義上的純化病毒很難獲得，該試劑盒的檢測(cè)費(fèi)用過(guò)高使其推廣和應(yīng)用受到限制。
編碼核衣殼蛋白的N基因在兩個(gè)基因型中相當(dāng)保守，當(dāng)豬受到PRRSV侵襲后，機(jī)體最先產(chǎn)生的抗體便是針對(duì)病毒核衣殼蛋白的。現(xiàn)有技術(shù)中本發(fā)明課題組已經(jīng)以N基因?yàn)槟繕?biāo)片段進(jìn)行擴(kuò)增，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pETN，將其在大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行高效表達(dá)(相關(guān)內(nèi)容已發(fā)表于中國(guó)病毒學(xué)2003年第18卷第三期279-282頁(yè))。但是還沒(méi)有利用表達(dá)產(chǎn)物建立檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征抗體的ELISA試劑盒及其檢測(cè)方法的技術(shù)。
三

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征抗體的ELISA試劑盒及用法，用于豬繁殖與呼吸綜合征的抗體檢測(cè)，測(cè)試劑盒具有高度的特異性、敏感性，可大量生產(chǎn)，大大降低了檢測(cè)成本，檢測(cè)成本低廉，適于推廣。在本病的抗體水平檢測(cè)、流行病學(xué)調(diào)查、類(lèi)癥鑒別及采取有效防制措施方面提供重要方法。
技術(shù)方案1檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)抗體的ELISA試劑盒，包括以下組分(1)ELISA板條以豬繁殖與呼吸綜合征病毒N基因的重組N蛋白作為包被抗原，每一試劑盒裝有4塊經(jīng)1％(M/V)BSA(牛血清白蛋白)封閉的板條，以包裝袋密封包裝于4℃保存；(2)洗滌液一倍濃度的pH7.4PBS(磷酸鹽緩沖液)溶液；(3)血清稀釋液1％(M/V)BSA(牛血清白蛋白)100毫升；(4)顯色底物已加入H2O2(按每10毫升TMB中加入15μL30％濃度H2O2)的TMB(四甲基聯(lián)苯胺)溶液100毫升；(5)兔抗豬酶標(biāo)二抗已用血清稀釋液1％(M/V)BSA稀釋至工作濃度(1∶400)的兔抗豬酶標(biāo)二抗(購(gòu)自中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院)100毫升；(6)終止液HF溶液100毫升；(7)已知PRRS陽(yáng)性血清5毫升；(8)已知PRRS陰性學(xué)清5毫升。
2上述ELISA試劑盒用于檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征抗體的方法，主要操作步驟如下(1)加入血清樣品用血清稀釋液1％(M/V)BSA將被檢血清作1∶40倍稀釋后，按酶標(biāo)板樣品添加模式于每孔中加入100μL，共加兩孔，于室溫下作用45min后棄去反應(yīng)孔中的液體；將每個(gè)孔用約200μL的洗滌液充分清洗3-5次，每次持續(xù)3min，在每次洗滌后將反應(yīng)孔中的液體除去，最后一次除去洗滌液后，除去殘留的液體；(2)加入兔抗豬酶標(biāo)二抗每孔加入100μL兔抗豬酶標(biāo)二抗，室溫作用40min，洗滌3-5次；(3)加入顯色底物每孔中加入100μL已加入H2O2的TMB溶液，室溫下作用15min；(4)終止反應(yīng)；向每孔中加入100μLHF溶液終止液終止反應(yīng)；(5)用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值在630nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔吸光度OD值，隨后判定結(jié)果；(6)結(jié)果判定檢測(cè)樣品OD630/已知PRRS陰性血清OD630＞2.1且已知PRRS陽(yáng)性血清OD630＞0.25，即可判為陽(yáng)性。
四有益效果1特異性高本發(fā)明應(yīng)用重組N蛋白作為包被抗原，在材料選擇上具有新意。豬在受到PRRSV感染后，最先產(chǎn)生的抗體是針對(duì)病毒的核衣殼蛋白，且此抗體可在豬體內(nèi)持續(xù)存在6個(gè)月以上。通過(guò)Western-blot試驗(yàn)，證實(shí)重組核衣殼蛋白(重組N蛋白)具有良好的反應(yīng)原性，保證了檢測(cè)試劑盒的高度特異性。
2檢測(cè)試劑盒可大量生產(chǎn)目前，在檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征抗體方面，應(yīng)用較為廣泛的是以全病毒作為包被抗原建立的ELISA方法，即美國(guó)IDEXX公司ELISA試劑盒。由于病毒需由細(xì)胞培養(yǎng)物中大量增殖，而真正意義上的純化病毒很難獲得。本發(fā)明使用的包被抗原為豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)N基因的原核表達(dá)產(chǎn)物，其優(yōu)點(diǎn)在于重組N蛋白易于穩(wěn)定、大量獲得(用光密度掃描法測(cè)得重組N蛋白的含量占總表達(dá)產(chǎn)物的46％)，純化方法易于實(shí)現(xiàn)(應(yīng)用His-bind親和層析柱純化)，重組N蛋白的包被濃度易于確定和控制，為檢測(cè)試劑盒的大量生產(chǎn)提供有力保證。
3檢測(cè)成本低廉，適于推廣本發(fā)明與現(xiàn)有方法相比，在保證特異性、敏感性的前提下，與IDEXX公司ELISA試劑盒的檢測(cè)符合率為91％?，F(xiàn)有方法檢測(cè)每份血清樣品的費(fèi)用在50元左右，高昂的檢測(cè)費(fèi)用使許多生產(chǎn)單位難以接受。本發(fā)明的檢測(cè)費(fèi)用在30-35元左右，大大降低了檢測(cè)成本，有著良好的應(yīng)用前景。
五
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明所使用的包被抗原—豬繁殖與呼吸綜合征病毒N基因的重組N蛋白，按中國(guó)病毒學(xué)2003年第18卷3期發(fā)表論文“豬繁殖與呼吸綜合征病毒N基因的克隆及高效表達(dá)”(第279-282頁(yè))述及的方法制備。
本發(fā)明所建立的以重組N蛋白為包被抗原的間接ELISA方法通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)1檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征抗體的ELISA反應(yīng)條件的確定1.1方陣試驗(yàn)采用棋盤(pán)法測(cè)定。取96孔ELISA板，將提純的N蛋白用pH9.6的CBS自左向右依次做1∶20、1∶40至1∶1280稀釋?zhuān)靠?00μL，后于4℃過(guò)夜。次日取出后洗滌三次，每次持續(xù)3分鐘。后用1％BSA于室溫下封閉3h后洗滌同前。將陰、陽(yáng)性血清也按同樣的稀釋倍數(shù)稀釋?zhuān)陨隙路謩e加入以上的反應(yīng)孔中，每孔100μL，于37℃放置1h，取出后洗滌同前。接著每孔中加入100μL稀釋至工作濃度(1∶400)的兔抗豬酶標(biāo)二抗(購(gòu)自中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院)，于37℃作用15min，隨后洗滌同前。繼而向每孔中加入100μL OPD(鄰苯二胺，按每10毫升OPD溶液加入30％H2O28μL配制)，于37℃作用15min，最后加入50μL 2MH2SO4終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀上檢測(cè)OD值。取陽(yáng)性血清OD值1.0、陰性血清OD值0.2(OPD為底物)所在孔的抗原濃度和血清稀釋液作為最佳抗原工作濃度和血清稀釋度。確定以重組N蛋白為包被抗原的最佳工作(包被)濃度為36.5ug/ml，而待檢血清樣品最佳稀釋倍數(shù)為1∶40。
1.2抗原最佳包被時(shí)間的測(cè)定將按最佳抗原濃度包被好的ELISA反應(yīng)板分別在37℃及室溫放置1h、2h、3h后置于4℃過(guò)夜。于次日取出包被好的反應(yīng)板，用已知的陰、陽(yáng)性血清按前面述及的相關(guān)步驟操作，其它條件相同。每份血清重復(fù)五孔，觀察OD值變化及P/N變化情況。結(jié)果顯示不論是在37℃還是在室溫放置一段時(shí)間再移入4℃完成包被，對(duì)ELISA結(jié)果都不會(huì)有明顯影響。提示最終移入4℃過(guò)夜包被是保證良好包被效果的一個(gè)必需環(huán)節(jié)。
1.3封閉液的選擇分別用2％脫脂乳、1％BSA、1.5％明膠和5％犢牛血清(FCS)作為封閉液，于室溫封閉2h，在其它條件及操作方法相同的情況下，對(duì)已知的陰、陽(yáng)性血清進(jìn)行ELISA檢測(cè)，每種封閉液稀釋的血清重復(fù)五孔，通過(guò)OD值評(píng)價(jià)其封閉效果。通過(guò)試驗(yàn)確定1％BSA作為封閉液。
1.4封閉條件的確定在其它條件相同的情況下，用選定的封閉液分別在37℃及室溫封閉1h、2h、3h、4h，后應(yīng)用已知的陰、陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)封閉時(shí)間及溫度進(jìn)行確定。結(jié)果表明不論在室溫還是4℃，封閉3h就可以達(dá)到良好的效果。
1.5血清稀釋液的選擇分別以PBST、1％BSA、3％犢牛血清、6％犢牛血清作為稀釋液稀釋已知的陰、陽(yáng)性血清，每一濃度稀釋液重復(fù)五孔，在其它條件相同的情況下，進(jìn)行ELISA測(cè)定，計(jì)算各組P/N值，以該值最大且陰性血清OD值較低來(lái)選擇血清稀釋液。確定的血清稀釋液為1％BSA。
1.6血清作用時(shí)間的確定用選定的血清稀釋液將已知的陰、陽(yáng)性血清做1∶40稀釋至最佳稀釋倍數(shù)后，分別于室溫及37℃下作用15min、30min、45min、60min，在其它條件及操作方法相同的情況下，進(jìn)行ELISA檢測(cè)，取P/N最大且陰性血清本底較低的一組確定為最佳作用時(shí)間。最終確定血清作用時(shí)間為室溫及37℃下45min。
1.7酶標(biāo)二抗作用時(shí)間的選擇將兔抗豬酶標(biāo)二抗(購(gòu)自中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院)用選定的血清稀釋液即1％BSA稀釋后于37℃及室溫下分別作用10min、15min、20min、25min、30min，用已知的陰、陽(yáng)性血清進(jìn)行ELISA檢測(cè)，觀察OD值及P/N變化。確定兔抗豬酶標(biāo)二抗作用時(shí)間為37℃20min或室溫下30min。
1.8底物及終止液的選擇在其他條件相同的情況下，于室溫下及37℃下分別用TMB(OD630)、OPD(OD490)作為底物，檢測(cè)已知的陰、陽(yáng)性血清，分別加入2MH2SO4、2NHCL、0.12％HF作為終止液，于終止后30min內(nèi)每隔10min在酶標(biāo)儀上讀值，計(jì)算其P/N比值，選擇合適的底物。確定TMB為顯色底物，終止液為HF。
1.9底物作用時(shí)間的選擇采用已知的陰、陽(yáng)性血清，應(yīng)用選定的底物，分別于室溫及37℃作用10min、15min、20min、25min、30min后用確定的終止液終止反應(yīng)，于終止后30min內(nèi)在酶標(biāo)儀上讀值，以確定底物作用的時(shí)間及作用溫度。最后確定底物TMB的作用時(shí)間為37℃ 15min或室溫20min。
1.10判定標(biāo)準(zhǔn)的確定以200份經(jīng)IDEXX公司ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)的血清，按照優(yōu)化的條件進(jìn)行ELISA檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果在計(jì)算機(jī)上用Microsoft Excel軟件進(jìn)行分析，確定cut-off值，以此作為依據(jù)確定判定標(biāo)準(zhǔn)。在630nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔吸光度(OD值)，隨后判定結(jié)果S(OD630)/N(OD630)＞2.1且已知陽(yáng)性血清OD630＞0.25，即可判為陽(yáng)性。
(注S為檢測(cè)樣品；N為已知陰性血清)1.11重組N蛋白——ELISA操作程序的確定按以上各項(xiàng)所確定的優(yōu)化條件進(jìn)行操作，即得到本方法的最佳操作程序取出已包被并封閉好的ELISA板條，用樣品稀釋液將被檢血清作1∶40稀釋?zhuān)尤霕悠房字?，室溫作?5min，棄去反應(yīng)孔中的液體；將每個(gè)孔用約200μL的洗滌液充分清洗3-5次，在每次洗滌后將反應(yīng)孔中的液體除去；最后一次除去洗滌液后，在吸水紙上拍打，除去殘留的液體；每孔加入100μL兔抗豬酶標(biāo)二抗，室溫作用40min，洗滌3-5次。每孔中加入100μLTMB底物溶液，室溫避光作用15min；向每孔中加入100μL的終止液，終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀在630nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔吸光度A值，讀值計(jì)算并判定結(jié)果。
實(shí)施例一、檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征抗體的ELISA試劑盒，包括以下組分(1)ELISA板條以中國(guó)病毒學(xué)2003年第18卷3期發(fā)表論文“豬繁殖與呼吸綜合征病毒N基因的克隆及高效表達(dá)”(第279-282頁(yè))中的方法獲得的重組N蛋白作為包被抗原，每一試劑盒裝有4塊經(jīng)1％(M/V)BSA(牛血清白蛋白)封閉的板條，以包裝袋密封包裝于4℃保存；(2)洗滌液一倍濃度的pH7.4PBS(磷酸鹽緩沖液)溶液；(3)血清稀釋液1％(M/V)BSA(牛血清白蛋白)100毫升；(4)顯色底物已加入H2O2(按每10毫升TMB中加入15μL30％濃度H2O2)的TMB(四甲基聯(lián)苯胺)溶液100毫升；(5)兔抗豬酶標(biāo)二抗已稀釋至工作濃度(1∶400)的兔抗豬酶標(biāo)二抗(購(gòu)自中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院)100毫升；(6)終止液HF溶液100毫升；(7)已知PRRS陽(yáng)性血清5毫升；(8)已知PRRS陰性學(xué)清5毫升。
二、ELISA試劑盒用于檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征抗體，主要操作方法如下(1)加入血清樣品用血清稀釋液1％(M/V)BSA將被檢血清作1∶40倍稀釋后，按酶標(biāo)板樣品添加模式于每孔中加入100L，共加兩孔，于室溫下作用45min后棄去反應(yīng)孔中的液體；將每個(gè)孔用約200L的洗滌液充分清洗3-5次，每次持續(xù)3min，在每次洗滌后將反應(yīng)孔中的液體除去，最后一次除去洗滌液后，除去殘留的液體；(2)加入兔抗豬酶標(biāo)二抗每孔加入100μL兔抗豬酶標(biāo)二抗，室溫作用40min，洗滌3-5次；(3)加入顯色底物每孔中加入100μL已加入H2O2的TMB溶液，室溫下作用15min；(4)終止反應(yīng)向每孔中加入100μL HF溶液終止液終止反應(yīng)；(5)用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值在630nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔吸光度OD值，隨后判定結(jié)果；(6)結(jié)果判定檢測(cè)樣品OD630/已知PRRS陰性血清OD630＞2.1且已知PRRS陽(yáng)性血清OD630＞0.25，即可判為陽(yáng)性。
表1 酶標(biāo)板樣品添加模式12 3 4 5678 9 10 1112

ABCDEFGH注P已知PRRS陽(yáng)性血清； N已知PRRS陰性血清S1，S2，S3，S4，S5，S6......S..表示加各被檢樣品1、特異性試驗(yàn)1.1交叉試驗(yàn) 在同一條件下用本實(shí)驗(yàn)室保存的PRRS陰、陽(yáng)性血清及豬細(xì)小病毒病陽(yáng)性血清、豬圓環(huán)病毒病陽(yáng)性血清、豬乙型腦炎陽(yáng)性血清、豬瘟陽(yáng)性血清、豬布魯氏菌病陽(yáng)性血清進(jìn)行ELISA檢測(cè)，每份血清重復(fù)檢測(cè)4孔。通過(guò)OD值來(lái)判定陰陽(yáng)性結(jié)果，以此來(lái)判定是否存在交叉反應(yīng)。檢測(cè)結(jié)果顯示PRRS陽(yáng)性血清發(fā)生陽(yáng)性結(jié)果，而其它均為陰性結(jié)果。
1.2與PRRSV單克隆抗體的反應(yīng)使用農(nóng)業(yè)部動(dòng)物檢疫所提供的針對(duì)PRRSV的三株單抗，分別標(biāo)記為McAb1、McAb2、McAb3，同時(shí)設(shè)立已知的陰陽(yáng)性血清作為對(duì)照，每份樣品重復(fù)檢測(cè)4孔，按照ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)OD判定陰陽(yáng)性結(jié)果。三株單抗均為陽(yáng)性結(jié)果。
2、敏感性試驗(yàn) 取200份血清分別用本組建立的重組N蛋白-ELISA方法與IDEXX公司ELISA檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)結(jié)果統(tǒng)計(jì)二者的符合率。兩種方法的檢出符合率為91％。
3、重復(fù)性試驗(yàn)3.1批內(nèi)重復(fù) 用同一批制備的重組N蛋白包被板條，取已知的陰陽(yáng)性血清各一份，另外取三份待檢血清，在其它條件不變的情況下，應(yīng)用本方法進(jìn)行檢測(cè)，每份樣品重復(fù)四孔，根據(jù)OD值判定批內(nèi)重復(fù)性。
3.2批間重復(fù) 取不同時(shí)間制備并純化的重組N蛋白(處理方法同前所述)，用pH9.6的CBS稀釋至最佳包被濃度，經(jīng)包被、封閉(同前所述)后對(duì)已知的陰陽(yáng)性血清及另外三份待檢血清進(jìn)行檢測(cè)，每份血清檢測(cè)4孔，重復(fù)檢測(cè)五次。根據(jù)OD值判定不同時(shí)間制備的抗原建立的ELISA的可重復(fù)性。試驗(yàn)結(jié)果顯示本發(fā)明具有良好的重復(fù)性。
4、包被抗原保存期的確定 純化蛋白以最佳工作濃度包被并經(jīng)封閉后，用包裝袋封好，置于4℃保存，以后每隔1月取出用已知陰陽(yáng)性血清按所建立的方法進(jìn)行檢測(cè)。共檢測(cè)6次。結(jié)果顯示包被的重組N蛋白保存六個(gè)月仍可用于檢測(cè)。
5、重組N蛋白——ELISA田間試驗(yàn)的應(yīng)用 從江蘇、上海、山東、浙江、湖北、安徽等省市采集和收集血清樣品860份，采用本發(fā)明方法檢測(cè)PRRS抗體，結(jié)合樣品背景進(jìn)行結(jié)果分析，并對(duì)其中的400份血清分別應(yīng)用本發(fā)明方法及IDEXX公司試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示二者的檢出符合率為91％。檢測(cè)結(jié)果分別見(jiàn)表2、表3。
表2重組N蛋白-ELISA的檢測(cè)應(yīng)用


表3重組N蛋白-ELISA、IDEXX公司ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果

權(quán)利要求
1.檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)抗體的ELISA試劑盒，包括以下組分(1)ELISA板條以豬繁殖與呼吸綜合征病毒N基因的重組N蛋白作為包被抗原，每一試劑盒裝有4塊經(jīng)1％(M/V)BSA(牛血清白蛋白)封閉的板條，以包裝袋密封包裝于4℃保存；(2)洗滌液一倍濃度的pH7.4PBS(磷酸鹽緩沖液)溶液；(3)血清稀釋液1％(M/V)BSA(牛血清白蛋白)100毫升；(4)顯色底物已加入H2O2的TMB(四甲基聯(lián)苯胺)溶液100毫升，其中每10毫升溶液TMB中含有30％(M/V)濃度H2O215μL；(5)兔抗豬酶標(biāo)二抗已用血清稀釋液1％(M/V)BSA稀釋至工作濃度1∶400的兔抗豬酶標(biāo)二抗100毫升；(6)終止液HF溶液100毫升；(7)已知PRRS陽(yáng)性血清5毫升；(8)已知PRRS陰性學(xué)清5毫升。
2.權(quán)利要求1所述ELISA試劑盒用于檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征抗體的方法，主要操作步驟如下(1)加入血清樣品用血清稀釋液1％(M/V)BSA將被檢血清作1∶40倍稀釋后，按酶標(biāo)板樣品添加模式于每孔中加入100μL，每一血清樣品添加兩孔，同時(shí)設(shè)立PRRS陰、陽(yáng)性血清作為對(duì)照，各添加兩孔；隨后于室溫下作用45min，棄去反應(yīng)孔中的液體；將每個(gè)孔用約200μL的洗滌液充分清洗3-5次，每次持續(xù)3min，在每次洗滌后將反應(yīng)孔中的液體除去，最后一次除去洗滌液后，除去殘留的液體；(2)加入兔抗豬酶標(biāo)二抗每孔加入100μL兔抗豬酶標(biāo)二抗，室溫作用40min，洗滌3-5次；(3)加入顯色底物每孔中加入100μL已加入H2O2的TMB溶液，室溫下作用15min；(4)終止反應(yīng)；向每孔中加入100μL HF溶液終止液終止反應(yīng)；(5)用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值在630nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔吸光度OD值，隨后判定結(jié)果；(6)結(jié)果判定檢測(cè)樣品OD630/已知PRRS陰性血清OD630＞2.1且已知陽(yáng)性血清OD630＞0.25，即可判為陽(yáng)性。
全文摘要
本發(fā)明檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征抗體的ELISA試劑盒及其方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。試劑盒包括以重組N蛋白作為包被抗原的ELISA板條、PBS溶液、血清稀釋液、兔抗豬酶標(biāo)二抗、顯色底物、終止液、PRRS陽(yáng)性血清、PRRS陰性血清等。該方法經(jīng)特異性、敏感性、重復(fù)性等指標(biāo)的檢驗(yàn)后，將其用于血清樣品的檢測(cè)。本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在有良好的特異性、可大量生產(chǎn)以及檢測(cè)成本低廉。與IDEXX公司ELISA試劑盒的檢測(cè)符合率為91％。大大降低了檢測(cè)成本，有著良好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)G01N33/535GK1525170SQ0315821
公開(kāi)日2004年9月1日 申請(qǐng)日期2003年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月15日
發(fā)明者陳溥言, 許立華, 曹瑞兵 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)