專利名稱：用于抗－ingap抗體的測定的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及抗體測定領域。具體地講，本發(fā)明涉及抗施用的治療劑的在哺乳動物中產(chǎn)生的抗體。
背景技術：
胰島是在體內(nèi)產(chǎn)生胰島素的唯一器官。然而，它們具有有限的再生能力。這種有限的再生能力使得哺乳動物容易患有糖尿病。胰島新生相關蛋白(INGAP，SEQ ID NO2)在刺激胰島新生，特別是β細胞從導管細胞中再生方面起重要作用。INGAP104-118肽(IGLHDPSHGTLPNGS，SEQ ID NO1)是包含INGAP蛋白的氨基酸104-118的15-氨基酸肽，其具有生物活性，并且能夠在動物模型中誘導胰島細胞再生。包含哺乳動物INGAP104-118肽的藥物組合物可用于治療可由糖尿病導致的內(nèi)分泌性胰腺機能不全。
抗INGAP104-118肽的抗體可在反復施用INGAP104-118肽之后產(chǎn)生，或者可作為抗內(nèi)源性蛋白的自身抗體產(chǎn)生，它們可減輕INGAP的作用或者用作糖尿病的診斷標記物。因此，本領域需要用于檢測可在用INGAP104-118肽治療后在個體中產(chǎn)生的抗體的方便測定。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個實施方案是檢測試驗樣本中的抗INGAP104-118肽的抗體的方法。該方法包括將包含哺乳動物血清的試驗樣本與結(jié)合在固體載體上的INGAP104-118肽接觸。這種接觸是在足以讓抗-INGAP104-118抗體與INGAP104-118肽接觸的條件下進行的。將固體載體與能特異性地結(jié)合哺乳動物的所有同種型的抗體分子的檢測抗體接觸。測定結(jié)合在固體載體上的檢測抗體。結(jié)合在固體載體上的檢測抗體指示試驗樣本含有抗I NGAP104-118肽的抗體。
本發(fā)明的另一個實施方案是檢測試驗樣本中抗INGAP104-118肽的抗體，并確定所述抗體的同種型的方法。該方法包括將包含哺乳動物血清的試驗樣本與結(jié)合在固體載體上的INGAP104-118接觸。這種接觸是在足以讓抗-INGAP104-118抗體與INGAP104-118肽接觸的條件下進行的。將固體載體與能特異性地結(jié)合哺乳動物的一種同種型的抗體分子的同種型特異性抗體接觸。測定結(jié)合在固體載體上的同種型特異性抗體。結(jié)合在固體載體上的檢測抗體指示試驗樣本含有抗INGAP104-118肽的抗體，以及抗INGAP104-118肽的抗體是一種同種型的抗體。
本發(fā)明的再一個實施方案是用于檢測哺乳動物血清中的抗-INGAP104-118抗體的試劑盒。所述試劑盒包含INGAP104-118肽和檢測抗體。
本發(fā)明的這些和其它實施方案給本領域提供了檢測能與INGAP104-118肽結(jié)合的抗體的工具和方法，這些工具和方法可用于在用INGAP104-118肽治療期間檢測個體以及用于鑒定具有INGAP自身抗體的個體。
附圖概述

圖1直接檢測抗-INGAP104-118的測定的示例性示意圖。將肽不可逆地包被到微量滴定孔(1)的底部后，把試驗樣本加到孔(2)中。如果試驗樣本中存在對該肽有特異性的抗體，它們就會與肽結(jié)合，并且在洗滌步驟之后保留在孔中。通過隨后加到孔(3)中的標記次級抗體來檢測與該肽接觸的抗體。洗滌步驟將沒有與抗體-肽復合物接觸的標記抗體除去。通過讀取孔(4)中的標記信號來確定與肽結(jié)合的抗體的存在。
圖2所產(chǎn)生的抗INGAP104-118肽的兔子抗體的特異性。將兔子抗-INGAP104-118肽在預先用INGAP104-118肽(SEQ ID NO1)、牛血清白蛋白(BSA)、INGAP151-164(Cter SEQ ID NO3)或INGAP139-152(Cseq SEQ ID NO4)包被的微量滴定孔中培養(yǎng)。所有孔都是用相同濃度的蛋白包被。使用與堿性磷酸酶綴合的抗兔子IgG，并且使用磷酸對硝基苯酯，在405nm光檢測對硝基苯酚，來檢測抗-INGAP104-118抗體。水平線指示測定的背景信號限度。
圖3所產(chǎn)生的抗INGAP104-118肽的兔子抗體的特異性。將兔子抗-INGAP104-118抗體在預先用不同濃度的INGAP104-118u肽包被的微量滴定孔中培養(yǎng)。使用與堿性磷酸酶綴合的抗兔子IgG，并且使用磷酸對硝基苯酯，在405nm光檢測對硝基苯酚，來監(jiān)測結(jié)合的兔子抗-INGAP104-118抗體的檢測。EC50是150pg，并且顯著不同于零的最低檢測量是18pg。
圖4人血清對抗-INGAP104-118肽抗體的影響。(A)每個數(shù)據(jù)點代表微量滴定孔中的2-1000ng/mL抗-INGAP104-118抗體和0(◆)、5()、10()、15(X)、30(·)或50(●)％標準人血清。使用與堿性磷酸酶綴合的抗兔子IgG，并且使用磷酸對硝基苯酯，在405nm光檢測對硝基苯酚，來監(jiān)測結(jié)合的兔子抗-INGAP104-118抗體的檢測。(B)反應是如(A)所述進行的，但是沒有加入兔子抗-INGAP104-118抗體。數(shù)據(jù)點相當于0(◆)、5()、10(·)、15(+)、30(-)和50％ ()標準人血清。
圖5抗-INGAP104-118抗體測定樣本平板布置圖。(1)患者血清樣本的稀釋物。(2)標準人血清的稀釋物。(3)兔子抗-INGAP104-118抗體標準曲線。(4)在未用INGAP104-118肽包被的孔上使用最高濃度的抗-INGAP104-118抗體制備的平板空白。
發(fā)明詳述本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)是，可在固相測定中靈敏且特異性地檢測體內(nèi)產(chǎn)生的抗-INGAP抗體?？稍诓槐徊溉閯游镅褰M分干擾的情況下檢測抗-INGAP104-118抗體。標準人血清不含有導致假正信號的因子，也不抑制抗-INGAP104-118抗體與INGAP104-118肽的相互作用。
測定哺乳動物樣本中的抗-INGAP104-118抗體可用于監(jiān)測在治療性施用INGAP104-118肽期間中和抗體的生成。中和抗體可以是內(nèi)源性自身抗體或者在單次或反復施用INGAP104-118肽之后在個體中產(chǎn)生的抗體?？伸`敏且特異性地檢測抗-INGAP104-118抗體。
在固相測定中，可將純化的INGAP104-118肽固定在固體載體上。因為易于將結(jié)合的組分與未結(jié)合的組分分離，固相免疫測定是方便的。連續(xù)的免疫測定步驟，包括步驟之間的洗滌以及檢測抗體的結(jié)合與指示劑反應的展開可容易地進行，而無需昂貴的自動化操作和技術。
可使用任何樣本，包括但不限于血液、血漿或血清。本發(fā)明特別涉及含有血清的試驗樣本。血清可得自任何哺乳動物，包括例如小鼠、大鼠、兔子、豚鼠、猴子、狗、貓、牛、山羊、豬和人。
可以在一個血清濃度或可通過將血清系列稀釋而獲得的多個濃度下測定試驗樣本。血清稀釋劑可源自是試驗樣本來源的同一物種。也可以使用其它稀釋劑例如緩沖劑和標準鹽水。還可以使用能夠檢測到信號的最高系列稀釋度來表征試驗樣本。例如，可將關于第一種哺乳動物的能夠檢測到信號的最高系列稀釋度與關于第二種哺乳動物的能夠檢測到信號的最高系列稀釋度進行比較，以獲得在第一種與第二種哺乳動物中的抗體效價的相對量度。
可使用任何免疫反應性形式的INGAP104-118、INGAP或其衍生物?？墒褂锰烊?、合成或重組形式的INGAP肽，或者能夠與抗INGAP104-118肽的抗體發(fā)生免疫反應的含有或經(jīng)過修飾而含有INGAP104-118序列或部分的相關蛋白。因此，可使用INGAP104-118肽的部分或含有這樣的部分和其它殘基或部分的肽。衍生物包括但不限于對肽的C-末端、N-末端和/或氨基酸側(cè)鏈進行修飾而獲得的衍生物。C-末端羧化物修飾的實例包括酯化(例如芐基、甲基或乙基酯)和酰胺化。N-末端修飾的實例包括乙酰化和烷氧基羰基化。氨基酸側(cè)鏈修飾包括甲基化、芐基化、叔丁基化、甲苯磺?；?、烷氧基羰基化等。
INGAP104-118肽、INGAP或其衍生物可通過本領域已知的任何方法制得。這些方法包括但不限于通過玻璃紙包裹來誘導哺乳動物胰腺細胞表達INGAP蛋白(Rosenberg，L.，Brown，R.A.和Duguid，W.P.(1982).Surg.Forum 33，227-230)。還可以使用在原核或真核宿主細胞中進行的標準重組技術來制備全長或部分INGAP或INGAP104-118肽。合適的宿主細胞包括細菌、酵母、昆蟲或哺乳動物細胞。可使用本領域已知的任何表達載體?？墒褂妹福ㄟ^讓全長或部分蛋白發(fā)生蛋白酶解來產(chǎn)生小于全長的蛋白?？墒褂煤铣苫瘜W方法例如固相肽合成法來合成蛋白和多肽?？稍谟糜诒景l(fā)明免疫測定的固體載體上直接合成多肽。
INGAP104-118肽、INGAP蛋白或其部分可通過蛋白純化領域已知的任何技術來純化。技術的實例包括離子交換色譜法、疏水相互作用色譜法和免疫親和方法。
將INGAP104-118肽與固體載體結(jié)合?？蓪⑵湮交蚧瘜W偶聯(lián)到固相載體上。可使用本領域已知的用于將蛋白或肽固定在固體載體上的任何方法?？赏ㄟ^技術例如經(jīng)由酰胺或酯鍵的共價鍵合或吸附將INGAP104-118肽共價或非共價結(jié)合到固相載體上。可使用結(jié)合對例如生物素與抗生物素蛋白或抗體與抗原來將其結(jié)合。將INGAP104-118肽與固相結(jié)合，可將固相載體與阻斷溶液(含有阻斷蛋白例如牛血清白蛋白)培養(yǎng)，以降低試驗樣本中抗體與載體表面的非特異性吸附。
可使用各種固相載體，包括但不限于玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、硝化纖維、葡聚糖或其它材料。合適的固相載體的形式包括由這些材料形成的或包被這些材料的小珠、微粒、管、織物或平板。在優(yōu)選的實施方案中，固體載體包含微量滴定孔，例如96孔微量滴定板。
使用檢測抗體來評價結(jié)合在固相載體上的抗-INGAP104-118抗體。可將檢測抗體標記。標記物可以是能夠被檢測到的任何組合物?？墒褂帽绢I域已知的任何分析方法來測定或檢測該檢測抗體。這些方法包括使用光譜學、化學、光化學、生物化學、免疫化學或光學。標記物可以是例如酶(例如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和ELISA中常用的其它酶)、放射標記物(例如，3H、125I、35S、14C或32P)、化學發(fā)光化合物(例如熒光素和2，3-二氫酞嗪二酮、魯米諾等)、熒光染料(例如異硫氰酸熒光素、Texas red、羅丹明等)或本領域已知的任何其它染料。
可根據(jù)本領域眾所周知的方法將標記物直接或間接(例如經(jīng)由結(jié)合對如生物素與抗生物素蛋白)與檢測抗體偶聯(lián)。如上所述，可使用多種標記物。標記物的選擇可根據(jù)所需的靈敏度、與化合物綴合的容易程度、穩(wěn)定性要求、可采用的裝置或處理條件等。關于可使用的各種標記或信號產(chǎn)生系統(tǒng)的綜述可參見美國專利4,391,904。
可通過本領域已知的任何適當方法來檢測或測定檢測抗體。如果標記物是具有放射性的γ發(fā)射體，可通過γ計數(shù)器來檢測抗體上的標記物，如果標記物是熒光物質(zhì)，可通過熒光計來檢測抗體上的標記物。對于酶，可使用酶的底物來比色檢測標記物。在優(yōu)選的實施方案中，檢測抗體可使用與堿性磷酸酶綴合的物種特異性免疫球蛋白來檢測?？墒褂脡A性硫酸鎂的任何底物。例如，磷酸對硝基苯酯(pNPP)可以是底物，并且可光檢測反應產(chǎn)物對硝基苯酚。
測定結(jié)果可以是定性或定量結(jié)果?？蓪⑴c載體結(jié)合的標記物的量與陽性和陰性對照比較，以確定抗-INGAP104-118抗體的存在。通?？蓪φ张c試驗樣本平行進行檢測。陽性對照可以是含有能與INGAP104-118肽發(fā)生免疫反應的抗體的血清。陰性對照可以是不含有能與INGAP104-118肽發(fā)生免疫反應的抗體的血清。對于定量測定，可產(chǎn)生和/或使用采用已知量的抗-INGAP104-118抗體的標準曲線。
用作陽性對照的抗體可使用INGAP蛋白的所有氨基酸序列或INGAP蛋白的氨基酸序列的片段來產(chǎn)生。本文所用的“抗體”包括能夠結(jié)合INGAP104-118肽的表位的完整的免疫球蛋白分子及其片段例如Fab、F(ab’)2和Fv。可產(chǎn)生本領域已知的任何類型的抗體以與INGAP104-118肽的表位特異性地結(jié)合。可按照本領域眾所周知的方法來產(chǎn)生單克隆或多克隆抗體。
可使用本領域能夠采用的任何純化抗-INGAP104-118抗體的技術。例如，可通過已知方法例如使用蛋白A的親和分離、在反相烷化硅膠上進行的高壓液相色譜法或凝膠過濾來純化抗體。還可以讓抗體通過其上結(jié)合有INGAP104-118肽的固相?？?INGAP抗體將與結(jié)合在固體載體上的INGAP104-118結(jié)合，并且可將污染物洗去?？捎美缇哂懈啕}濃度的緩沖液將結(jié)合的抗體洗脫下來。
在本發(fā)明測定中使用的具體參數(shù)可根據(jù)多種不同因素例如樣本中的抗體濃度、樣本性質(zhì)、所用的免疫測定類型等而在寬范圍內(nèi)改變。本領域技術人員易于確立最佳條件。典型的測定條件包括約4℃至約45℃的溫度范圍和約5至9的pH范圍。根據(jù)測定的性質(zhì)，培養(yǎng)時間可在寬范圍內(nèi)改變，并且通常為約0.1分鐘至約24小時?？刹捎枚喾N緩沖液，例如TRIS緩沖的鹽水，并且還可以包括其它試劑例如用以提高離子強度的鹽、蛋白例如血清白蛋白、穩(wěn)定劑和非離子洗滌劑。實施例2中給出了示例性條件。
可測定抗-INGAP104-118抗體的同種型例如IgG、IgD、IgE、IgA或IgM。同種型的生物功能和生化特征不同，并且試驗樣本中存在的抗體同種型可表征個體中的免疫反應類型。因此，區(qū)別樣本中存在的免疫球蛋白分子的同種型可能是有用的?？刹捎帽绢I域已知的任何方法來確定抗體同種型。例如，同種型確定可在與INGAP104-118肽結(jié)合的固體載體上進行。可將試驗樣本與結(jié)合肽的固體載體接觸，并且可使用檢測抗體。出于該目的而使用的檢測抗體可以是同種型特異性的?？蓪⑼N型特異性檢測抗體標記，并如上所述進行檢測。還可以通過本領域已知的任何方法來確定抗體亞同種型。
本發(fā)明的另一個實施方案是用于檢測哺乳動物血清中的抗-INGAP104-118抗體的試劑盒。所述試劑盒可特別用于檢測自然存在的或者在涉及給個體單次或反復施用INGAP104-118的治療期間產(chǎn)生的抗-INGAP104-118抗體。試劑盒通常含有在分開或未分開的容器中的可特別用于包被固體載體的INGAP104-118肽?；蛘?，試劑盒可含有已經(jīng)用INGAP104-118肽包被的固體載體。試劑盒還可以含有用作陽性對照和用于標準曲線的抗-INGAP104-118抗體。還可以包括是物種特異性的但是是同種型一般性的檢測抗體?？梢砸钥蓹z測的方式將檢測抗體標記。試劑盒還可以含有用于確定抗體同種型的同種型特異性檢測抗體。試劑盒中可任選包含使用說明書、標準曲線和緩沖液。
下列實施例僅是舉例說明，而不是限制本發(fā)明的范圍。
實施例1抗-INGAP104-118抗體的特異性為了確定兔子抗-INGAP104-118抗體的特異性，將兔子抗-INGAP104-118抗體在預先用INGAP104-118、牛血清白蛋白(BSA)、INGAP151-164(Cterm)或INGAP139- 152(Cseq)包被的微量滴定孔中培養(yǎng)。所有肽包被的孔都是用相同濃度的肽包被。使用抗兔子IgG堿性磷酸酶(AP)綴合物檢測抗體來評價抗-INGAP104- 118抗體結(jié)合。將樣本與pNPP培養(yǎng)，并在405nm監(jiān)測光密度(OD)。圖2表明了兔子抗-INGAP104-118抗體與INGAP104-118特異性地結(jié)合，因為在與pNNP培養(yǎng)后，只有含有抗-INGAP104-118抗體的孔才表現(xiàn)出顯著的OD405。從中推斷，該抗體特異性地與INGAP104-118肽結(jié)合，使得其能夠用于測定開發(fā)。
抗-INGAP104-118抗體的敏感性通過將兔子抗-INGAP104-118抗體與不同濃度的INGAP104-118肽在預先用不同濃度的INGAP104-118肽包被的微量滴定孔中培養(yǎng)來測定兔子抗-INGAP104-118抗體的敏感性。數(shù)據(jù)如圖3所示。在該測定中，測定的關于INGAP104-118肽的EC50是150pg/孔，顯著大于零的最小量為18pg/孔。
發(fā)現(xiàn)標準人血清不影響抗-INGAP104-118抗體檢測分析。向預先用INGAP104-118肽包被的微量滴定板的孔中加入不同濃度的兔子抗-INGAP104-118抗體。將抗-INGAP104-118抗體在含有標準人血清的緩沖液中系列稀釋，所述緩沖液的人血清濃度分別為0％(對照)、5％、10％、15％、30％或50％。參見圖4A。用與堿性磷酸酶(AP)綴合的抗-兔子IgG檢測兔子抗體的結(jié)合。在5-10％血清之間沒有觀察到測定靈敏度的任何下降。然而，以大于50％的濃度存在的人血清可將測定靈敏度降低最高達3倍。從該數(shù)據(jù)中可以推斷出，在標準人血清中不存在能顯著干擾抗-INGAP104-118抗體與INGAP104-118肽的相互作用的因素。
還確定在標準人血清中不存在與INGAP104-118肽相互作用的抗體。進行與上述相同的實驗方案以后，用與AP綴合的抗-人免疫球蛋白篩選標準人血清。沒有檢測到抗體，這表明標準人血清中不存在能結(jié)合INGAP104-118肽的抗體。參見圖4B。
根據(jù)數(shù)據(jù)，測定成功地檢測了INGAP104-118肽特異性抗體。此外，測定在標準人血清存在下能實現(xiàn)其功能。因此，本發(fā)明測定適于篩選患者血清中抗-INGAP104-118抗體的存在。該測定是簡單的，并且易于流線化，以提高中到高效率的樣本篩選。
實施例2-用于檢測人血清中的抗-INGAP104-118的免疫測定方案在該實施例中使用的試劑如下TBS(0.05M TRIS，0.138M NaCl，0.0027KCl，pH8.0，25℃)，TBS-TW(TBS，含有0.05％Tween-20(聚氧乙烯-脫水山梨醇一月桂酸酯))，用于基質(zhì)稀釋緩沖液的阻斷溶液(TBS-TW，含有1％w/v牛血清白蛋白)，用于檢測人血清的次級抗體(與AP綴合的抗-人IGg(Sigma A-1543)在阻斷溶液中的1∶5000稀釋液)，用于檢測兔子抗體的次級抗體(與AP綴合的抗-兔子IGg(Sigma A-2556)在阻斷溶液中的1∶5000稀釋液)，基質(zhì)稀釋緩沖液(1∶25人血清阻斷溶液，v/v)，和pNPP底物緩沖液(在5mL去離子水中的一組磷酸對硝基苯酯片劑(Sigma N-1891))。
兔子抗-INGAP104-118抗體由Strelitz Diabetes Institute提供。
標準曲線-依據(jù)下表制作標準曲線
測定是在96孔微量滴定板中進行的。如上表所示制備標準物，獲得足夠多的標準物，將100μL以一式兩份加到所需的平板孔中。通過用基質(zhì)稀釋緩沖液將兔子抗-INGAP104-118抗體標準物系列稀釋來獲得所需的標準物濃度。
采取與制備樣本相同的稀釋范圍由空白人血清制備對照血清樣本。沒有產(chǎn)生由于將與INGAP104-118肽交叉反應的血清或標準人血清中的任何蛋白濃度所致的假正性結(jié)果。
通過將100μL最高濃度的標準物加到每個隨后平板的孔H1和H2中來制備平板空白。這些孔未用INGAP104-118肽包被。應當向這些樣本中加入所有試劑。對于在該批中使用的所有孔，平板設計所指明的孔作為空白值以被減去。當由于在相同平板上分析的第二批而不能獲得平板空白時，則使用對照空白。圖6圖示說明了代表性的樣本測定平板布置圖。
所有質(zhì)量控制樣本都是一式兩份制備。所有未知的樣本都是一式兩份制備，并且在微量滴定板分析之前，將100μL各樣本用2400μL基質(zhì)稀釋緩沖液稀釋。
如下所述進行微量滴定板分析將100μL標準物、對照空白、質(zhì)量控制樣本或未知樣本加到各個平板孔中。將孔用聚酯薄膜蓋子覆蓋，在室溫培養(yǎng)至少1小時或者在4℃培養(yǎng)過夜。通過向每個孔中填充TBS-TW來將孔洗滌3次，在洗滌之間保證除去所有過量液體。僅向血清樣本和對照血清中加入100μL抗-人IgG AP綴合的抗體。向校準標準物和質(zhì)量控制標準物中加入100μL抗-兔子IgG AP-綴合的抗體。將這些混合物在室溫培養(yǎng)1-2小時。將每個孔用TBS-TW洗滌1次，然后用TBS洗滌2次，同樣在洗滌之間保證除去過量液體。向每個孔中加入100μL pNPP底物緩沖液。顯色約30分鐘或顯色至所需的顏色強度。對于最高校準標準物，最大顯色的目標值是2.5OD，因此頻繁地監(jiān)測顯色。獲得多個平板讀數(shù)以監(jiān)測顯色。在約30分鐘讀取顯色(顯色將隨條件而變)。當高標準超過儀器的線性范圍時，就發(fā)生過度顯色。
根據(jù)在405nm的OD，使用點到點擬合來計算標準曲線。當OD超過標準曲線的最高點時，以適當?shù)南♂尪戎匦轮苽渌袠颖?。對照所得點到點曲線來計算樣本結(jié)果。根據(jù)明顯的分析誤差或非典型的顯色，從曲線中可掉下最多2個不連續(xù)的點。
如果它們在理論值的20％內(nèi)，則認為質(zhì)量控制樣本是可接受的。
陽性血清定義為，在1∶25的稀釋度OD405大于0.800的樣本。根據(jù)給出標準信號讀數(shù)(即0.800 OD405單位)所需的效價(血清稀釋度)來進行陽性患者樣本之間的血清比較。
序列表<110>GMP內(nèi)治療學股份有限公司(GMP Endotherapeutics，Inc.)A.I.維尼克(Vinik，Aaron I.)D.A.泰勒-費斯克維克(Taylor-Fishwick，David A.)<120>用于抗-INGAP抗體的測定<130>9057#L$<140>未授權<141>2003-02-27<150>U.S.60/361,040<151>2002-03-01<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>15<212>PRT<213>倉鼠屬(hamster sp.)<400>1Ile Gly Leu His Asp Pro Ser His Gly Thr Leu Pro Asn Gly Ser1 5 10 15<210>2<211>175<212>PRT<213>倉鼠屬(hamster sp.)<400>2Met Met Leu Pro Met Thr Leu Cys Arg Met Ser Trp Met Leu Leu Ser1 5 10 15Cys Leu Met Phe Leu Ser Trp Val Glu Gly Glu Glu Ser Gln Lys Lys20 25 30Leu Pro Ser Ser Arg Ile Thr Cys Pro Gln Gly Ser Val Ala Tyr Gly35 40 45Ser Tyr Cys Tyr Ser Leu Ile Leu Ile Pro Gln Thr Trp Ser Asn Ala50 55 60
Glu Leu Ser Cys Gln Met His Phe Ser Gly His Leu Ala Phe Leu Leu65 70 75 80Ser Thr Gly Glu Ile Thr Phe Val Ser Ser Leu Val Lys Asn Ser Leu85 90 95Thr Ala Tyr Gln Tyr Ile Trp Ile Gly Leu His Asp Pro Ser His Gly100 105 110Thr Leu Pro Asn Gly Ser Gly Trp Lys Trp Ser Ser Ser Asn Val Leu115 120 125Thr Phe Tyr Asn Trp Glu Arg Asn Pro Ser Ile Ala Ala Asp Arg Gly130 135 140Tyr Cys Ala Val Leu Ser Gln Lys Ser Gly Phe Gln Lys Trp Arg Asp145 150 155 160Phe Asn Cys Glu Asn Glu Leu Pro Tyr Ile Cys Lys Phe Lys Val165 170 175<210>3<211>14<212>PRT<213>倉鼠屬(hamster sp.)<400>3Gln Lys Ser Gly Phe Gln Lys Trp Arg Asp Phe Asn Cys Glu1 5 10<210>4<211>14<212>PRT<213>倉鼠屬(hampter sp.)<400>4Ile Ala Ala Asp Arg Gly Tyr Cys Ala Val Leu Ser Gln Lys1 5 10
權利要求
1.檢測試驗樣本中的抗INGAP104-118肽的抗體的方法，所述方法包括將得自哺乳動物的試驗樣本與結(jié)合在固體載體上的INGAP104-118肽接觸，其中所述接觸是在足以讓抗-INGAP104-118抗體與所述肽結(jié)合的條件下進行的；將所述固體載體與能夠特異性地結(jié)合哺乳動物的所有同種型的抗體分子的檢測抗體接觸；和確定結(jié)合在所述固體載體上的檢測抗體，其中結(jié)合在所述固體載體上的檢測抗體指示所述試驗樣本含有抗INGAP104-118肽的抗體。
2.權利要求1的方法，其中將所結(jié)合的檢測抗體的量與使用已知量的抗-INGAP104-118肽抗體產(chǎn)生的標準曲線進行比較。
3.權利要求1的方法，其中所述檢測抗體包含可檢測到的標記物。
4.權利要求3的方法，其中所述可檢測到的標記物選自熒光分子、化學發(fā)光分子、放射性分子和染料分子。
5.用于檢測試驗樣本中的抗INGAP104-118肽的抗體并確定所述抗體的同種型的方法，所述方法包括將得自哺乳動物的試驗樣本與結(jié)合在固體載體上的INGAP104-118肽接觸，其中所述接觸是在足以讓抗-INGAP104-118抗體與所述INGAP104-118肽結(jié)合的條件下進行的；將所述固體載體與能夠特異性地結(jié)合哺乳動物的一種同種型的抗體分子的同種型特異性檢測抗體接觸；和確定結(jié)合在所述固體載體上的同種型特異性檢測抗體，其中；結(jié)合在所述固體載體上的同種型特異性檢測抗體指示所述試驗樣本含有抗INGAP104-118肽的抗體并且所述抗INGAP104-118肽的抗體是所述檢測到的同種型的抗體。
6.權利要求5的方法，其中所述可檢測到的標記物選自熒光分子、化學發(fā)光分子、放射性分子和染料分子。
7.用于檢測哺乳動物試驗樣本中的抗-INGAP104-118抗體的試劑盒，所述試劑盒包含INGAP104-118肽；和檢測抗體。
8.權利要求7的試劑盒，其中所述INGAP104-118肽結(jié)合在固體載體上。
9.權利要求7的試劑盒，所述試劑盒還包含抗-INGAP104-118抗體。
10.權利要求7的試劑盒，所述試劑盒還包含用于計算試驗樣本中的抗-INGAP104-118抗體的量的標準曲線。
全文摘要
使用固相測定來檢測抗INGAP
文檔編號G01N33/537GK1639572SQ03804851
公開日2005年7月13日 申請日期2003年2月28日 優(yōu)先權日2002年3月1日
發(fā)明者A·I·維尼克, D·A·素勒·費斯克維克 申請人:Gmp內(nèi)治療學股份有限公司