專利名稱：用于測(cè)定復(fù)合生物介質(zhì)中瞬時(shí)蛋白水解活性濃度的診斷測(cè)試的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于診斷領(lǐng)域，更具體而言，涉及一種實(shí)時(shí)測(cè)定在血液或其它體液中瞬時(shí)存在的生物活性酶的濃度進(jìn)程的方法，還涉及一種實(shí)施該方法的測(cè)試試劑盒。
背景技術(shù)：
a.引言在諸如消化、發(fā)炎、血凝和血栓形成的許多過程中，蛋白水解酶在體液中的產(chǎn)生和分解是一個(gè)關(guān)鍵因素。給出一個(gè)例子凝血酶是一種瞬時(shí)存在于凝血中的酶，是止血和形成血栓的關(guān)鍵酶。在半數(shù)以上的致殘和致命的疾病中，止血血栓形成系統(tǒng)(HTS)紊亂是關(guān)鍵的。從數(shù)量上較不重要的那些病，血友病和肺栓塞，易于引起注意。未被廣泛地認(rèn)識(shí)到的是，動(dòng)脈血栓引起冠狀動(dòng)脈梗塞或十分之一的老年人可能由于阻塞腦動(dòng)脈的凝塊(基于心房纖顫和頸動(dòng)脈栓塞的栓塞)而喪失腦功能，或病情嚴(yán)重的病人可能會(huì)由于凝血系統(tǒng)的紊亂而出血死亡(事故的受害者和具有致命的血管內(nèi)凝血的患有膿毒病的病人)。還未被充分認(rèn)識(shí)到如下事實(shí)，更多人死于動(dòng)脈血栓而非惡意行為，更多人死于靜脈血栓而非事故。考慮到這種醫(yī)學(xué)上的重要性，令人吃驚的是目前臨床醫(yī)生竟然對(duì)HTS沒有有效的功能檢測(cè)。
在體液中存在著若干在生理學(xué)上更為重要的生化系統(tǒng)，其通過蛋白水解酶的激活及隨后的失活而起作用，例如，血液中的凝固系統(tǒng)、溶血纖系統(tǒng)和補(bǔ)體系統(tǒng)和腸胃液中的消化酶。為了評(píng)估這些系統(tǒng)的生物功能，重要的是能夠及時(shí)跟蹤該蛋白水解活性在體外的體液樣品中被觸發(fā)后發(fā)展的過程。這種功能評(píng)估具有極其重要的診斷重要性，因?yàn)檫@些系統(tǒng)的失調(diào)可導(dǎo)致致命疾病如冠狀動(dòng)脈梗塞、中風(fēng)或致命的出血(血凝固和纖維蛋白溶解)、全身感染和自體免疫性疾病(補(bǔ)體系統(tǒng))或擾亂食物吸收(腸胃液)。
在止血和形成血栓中，凝固時(shí)間是目前可利用的最好評(píng)估方法，它們對(duì)輕微止血障礙(例如，血友病攜帶者、輕度肝病)、或?qū)?dǎo)致血栓癥風(fēng)險(xiǎn)提高的升高的凝固力不敏感。凝固試驗(yàn)常常需要適應(yīng)于特定的用途。例如，可將促凝血酶原激酶時(shí)間(＝凝血酶原時(shí)間(PT)，＝快速時(shí)間)用于診斷嚴(yán)重的肝病、或使用抗凝血?jiǎng)┑珱]有血友病延遲的治療、或肝素治療。臨床凝固實(shí)驗(yàn)室的許多科學(xué)技術(shù)停留于知道如何解釋由不同類型的凝固時(shí)間、血小板凝聚、出血時(shí)間等獲得的分散信息。
綜合檢測(cè)的不足可通過對(duì)凝固系統(tǒng)的單組分的許多復(fù)雜檢測(cè)得到部分補(bǔ)償，檢測(cè)之多使得在每種特定情況下都應(yīng)進(jìn)行明智的選擇，這是臨床止血實(shí)驗(yàn)室特定知識(shí)的另一半。
b.凝血酶產(chǎn)生的機(jī)理在血漿中凝血酶產(chǎn)生的機(jī)理可以示例如下。組織因子(TF)豐富地，但不是唯一地存在于管壁上。當(dāng)血管損傷時(shí)，血液進(jìn)入組織，血漿蛋白因子VIIa(VIIa)可與TF互相作用。這在血漿蛋白和血小板之間觸發(fā)了一套極其復(fù)雜的交互作用，其導(dǎo)致了在時(shí)間和空間上留存有限的凝血酶的瞬時(shí)暴發(fā)，結(jié)果傷口停止流血而凝固不會(huì)擴(kuò)展到身體的其它部分。
該機(jī)理看起來可能是如此復(fù)雜，充滿了正負(fù)反饋的反應(yīng)，使得其作用不能通過各部分的知識(shí)進(jìn)行預(yù)測(cè)(不能分解的復(fù)雜性)。因而，如果一個(gè)人想評(píng)估止血系統(tǒng)的功能，就必須像在體內(nèi)、或身體的隔離部分，即血液或富含血小板的血漿那樣探查凝血酶的產(chǎn)生。血小板和血漿因子之間的相互作用具有特殊的重要性，由貧血小板的血漿獲得的信息本質(zhì)上是有缺陷的。參見，例如Béguin S.，R.Kumar，I.Keularts，U.Seligsohn，B.C.Coller and H.C.Hemker，F(xiàn)ibrin-Dependent PlateletProcoagulant Activity Requires GPIb Receptors and Von WillebrandFactor，Blood(1999)93564-570；Béguin，S.and R.Kumar，supra(1997)]。
凝固血漿中形成的所有凝血酶的一個(gè)重要部分(≈30％)附著于血纖維蛋白凝塊上。附著于凝塊中的凝血酶仍保留其血栓形成性能，它可以使纖維蛋白原、激活因子V，VIII和XI、及血小板凝固[Béguin，S.and R.Kumar，Thromb.Haemost.(1997)78590-594；Kumar，R.，S.Béguin，and H.C.Hemker，Thromb.Haemost.(1994)72713-721，and(1995)74962-968]。它只是部分地被抗凝血酶抑制。因此，重要的是當(dāng)探查凝固系統(tǒng)的功能時(shí)，纖維蛋白是存在的。
為了評(píng)估這種系統(tǒng)的功能以用于診斷目的和抗血栓藥物的安全使用，已經(jīng)開發(fā)出了對(duì)該凝固系統(tǒng)中的單個(gè)組分進(jìn)行檢測(cè)的許多方法，以下將對(duì)其作進(jìn)一步的說明。
如前面所述，在損傷部位產(chǎn)生的凝血酶活性對(duì)于繼而發(fā)生的止血-血栓形成反應(yīng)的程度是一個(gè)重要的決定因素。大部分凝血酶(＞95％)是在凝固后產(chǎn)生的，因此凝固時(shí)間并不是自然而然的有效指標(biāo)。凝血中的凝血酶活性是一種瞬時(shí)現(xiàn)象，因此應(yīng)該在凝固過程中進(jìn)行測(cè)定。
在凝血或血漿中凝血酶形成的典型進(jìn)程，也叫作凝血酶產(chǎn)生曲線，示于表1中。在沒有可觀察到的凝血酶形成的時(shí)期之后，其濃度陡然上升，達(dá)到頂峰然后再下降。參數(shù)是滯后時(shí)間、曲線下的面積(AUC)，也叫作內(nèi)生凝血酶勢(shì)(ETP，參見下面)、峰高、和達(dá)到峰值所需的時(shí)間。
c.相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)

圖1所示的凝血酶產(chǎn)生曲線是典型地通過對(duì)從凝固血液或血漿中短時(shí)間內(nèi)取出的少量次級(jí)樣品中的凝血酶含量進(jìn)行測(cè)定獲得的。參見，例如R.Biggs and R.G.Macfarlane，Human Blood Coagulation and itsDisorders，Blackwell Scientific Publications，Oxford 1953；W.Seegers，Prothombin，Harvard University Press，Cambridge Mass.1962。該方法通常需要對(duì)次級(jí)樣品的獨(dú)立分析，使得僅3-5個(gè)曲線的同時(shí)測(cè)定就要連續(xù)地占用一個(gè)熟練的實(shí)驗(yàn)工。它是如此地勞動(dòng)密集，以至于使之不能應(yīng)用于臨床或藥學(xué)的常規(guī)程序。
EP-A-0 420 332(等同于US 5,192,689)披露了一種通過測(cè)定由人造底物在凝固期間生成的產(chǎn)物的量，來測(cè)定已存在于凝固血液或血漿樣品中的凝血酶量的方法。該量與凝血酶產(chǎn)生曲線下的面積，也叫作內(nèi)生凝血酶勢(shì)ETP成正比。該方法包括將凝血酶形成激活物同凝血酶底物一起加入到凝固血液或血漿樣品中，其中對(duì)凝血酶底物的用量和動(dòng)力學(xué)特性進(jìn)行選擇，使得樣品中產(chǎn)生的凝血酶量不能把所述凝血酶底物消耗完，從而生成一種轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，測(cè)定所生成的所述轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的量，并由此確定樣品中的內(nèi)生凝血酶勢(shì)。可用以下反應(yīng)說明這種ETP-法 3)凝血酶+抗血栓藥→非活性復(fù)合物 所有反應(yīng)均不可逆，因此凝血酶只是暫時(shí)地存在于反應(yīng)混合物中。當(dāng)凝血酶存在時(shí)，其參與反應(yīng)4，結(jié)果，底物的轉(zhuǎn)化度指示了凝血酶催化該反應(yīng)所經(jīng)過的時(shí)間和達(dá)到的時(shí)間。
重要的是底物量不能在凝血酶消失前耗盡。為了將底物的量轉(zhuǎn)化為所產(chǎn)生的凝血酶活性總量的精確代表，在任意時(shí)刻反應(yīng)速率應(yīng)與凝血酶濃度成正比。這種ETP法的本質(zhì)是作為終點(diǎn)法來測(cè)定凝血酶勢(shì)，而沒有同樣地測(cè)定凝血酶/時(shí)間曲線。如果短促地測(cè)定底物，終點(diǎn)就只是所形成產(chǎn)物的最大量，這種數(shù)據(jù)是沒有任何意義的。
另外，在實(shí)際操作中該ETP-法的實(shí)施采用了可通過光密度測(cè)定檢測(cè)出的發(fā)色性底物，即帶有發(fā)色性離去基團(tuán)的底物。纖維蛋白原，和相應(yīng)的血小板必須從血漿中除去，因?yàn)槟笇?dǎo)致的纖維蛋白原-纖維蛋白轉(zhuǎn)化所引起的混亂使得進(jìn)一步的測(cè)定成為不可能。但是，纖維蛋白原和血小板是凝固系統(tǒng)的重要組分，對(duì)凝血酶的形成進(jìn)程有影響。這對(duì)應(yīng)用光密度作為檢測(cè)方式形成了嚴(yán)重的限制。因此，評(píng)估含血小板和/或纖維蛋白原的血漿的ETP是不可能的。
已經(jīng)嘗試了通過以下方法對(duì)凝血酶濃度進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測(cè)在凝固樣品中加入適當(dāng)?shù)哪傅孜?，然后監(jiān)測(cè)酰胺水解分裂產(chǎn)物。例如，采用發(fā)色性底物并檢測(cè)光密度，以監(jiān)測(cè)對(duì)硝基苯胺的發(fā)展(Hemker HC，S.Wielders，H.Kessels，S.BéguinThromb Haemost.(1993)70(4)617-24；Hemker HC，and S.BéguinThromb Haemost.(1995)74(1)134-8)。如果該測(cè)試中的反應(yīng)速率僅取決于凝血酶濃度，且信號(hào)與產(chǎn)物的量成正比，那么產(chǎn)物曲線的斜率就正比于存在的凝血酶量，結(jié)果，若比例常數(shù)(Kc)是已知的，就可以從產(chǎn)物曲線的一階導(dǎo)數(shù)獲得凝血酶產(chǎn)生曲線。
但是，實(shí)際上反應(yīng)速率并不僅僅取決于凝血酶濃度，信號(hào)并不一定與產(chǎn)物量成正比，且Kc是未知的。原因如下A底物消耗信號(hào)不但取決于樣品中凝血酶的活性，還取決于底物的量，該量恰由于酶活性本身而及時(shí)降低。這種效應(yīng)通過加入過量的底物而削弱，但僅削弱到一定限度。底物可逆地結(jié)合到凝血酶的活性中心上，從而使凝血酶不被天然的抗凝血酶鈍化。消除底物消耗效應(yīng)至可接受的程度，其代價(jià)是延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)，使之持續(xù)約兩小時(shí)。(所加底物越多，被占用而不能用于天然鈍化過程的酶分子就越多。這延長(zhǎng)了實(shí)驗(yàn)的持續(xù)時(shí)間。在1×Km時(shí)反應(yīng)在30min后結(jié)束，在5Km時(shí)獲得了對(duì)底物消耗的實(shí)際獨(dú)立性，但反應(yīng)持續(xù)90min)。另外，在這種底物濃度下，凝血酶抑制會(huì)干擾反饋反應(yīng)，不再能保證天然過程的測(cè)定。這也是下述情況的原因在打算從底物的轉(zhuǎn)化總量評(píng)估曲線下面積的方法中，必須加入過量的底物，這使得需要加入額外的抗凝血酶以使實(shí)驗(yàn)可行(參見以上討論過的EP-A-0 420 332)。
B血漿樣品凝固時(shí)光密度的改變。使用發(fā)色性底物意味著除去纖維蛋白原，結(jié)果即除去了血小板，這導(dǎo)致在凝固時(shí)光散射出現(xiàn)欺騙性的OD升高。但是，纖維蛋白原和血小板是對(duì)凝血酶的形成過程產(chǎn)生影響的凝固系統(tǒng)的重要成分(參見以上內(nèi)容)。這對(duì)于將光密度法作為檢測(cè)方法形成了嚴(yán)重的限制?？赏ㄟ^使用產(chǎn)生熒光產(chǎn)物的底物繞過這個(gè)問題[H.C.Hemker et al.The thrombogrammonitoring thrombingeneration in platelet rich plasma.Thromb Haemost.83589-91(2000)]。但是，這又引起了下一個(gè)問題C在熒光測(cè)量中，信號(hào)并不與產(chǎn)物的量線性相關(guān)。特別是熒光信號(hào)并不線性地取決于熒光產(chǎn)物的濃度，因?yàn)闊晒夥肿游掌渌a(chǎn)物分子的光，即所謂的“內(nèi)濾波效應(yīng)”。對(duì)于熒光產(chǎn)物，為了限制底物消耗效應(yīng)，而根據(jù)需要將底物的濃度提高到數(shù)倍于Km時(shí)，也自然地提高了內(nèi)濾波效應(yīng)。
問題A對(duì)所有連續(xù)方法是普遍的。問題B可通過采用熒光底物繞過，但它引起了C問題。
D即使不存在A、B和C問題，還有將反應(yīng)速率關(guān)聯(lián)到凝血酶濃度的難題，即，確定校準(zhǔn)常數(shù)Kc。這種關(guān)系隨實(shí)驗(yàn)設(shè)置的不同而變化(例如對(duì)于不同的熒光計(jì)是不同的)、隨樣品的不同(例如，由于血漿顏色的變化)而變化。在樣品中添加已知的標(biāo)準(zhǔn)量的凝血酶是不可能的，因?yàn)樗砑拥拿笗?huì)干擾生理反應(yīng)。也不可能在非凝固的平行樣品中加入凝血酶，因?yàn)樗鼤?huì)在血漿中鈍化。
本發(fā)明的目的是通過提供一種涉及測(cè)定血液或血漿樣品中凝血酶的方法來消除這些缺點(diǎn)，該方法與上述的ETP-法有本質(zhì)的不同，因?yàn)樗皇菍?duì)產(chǎn)物的量進(jìn)行終點(diǎn)測(cè)定，而是實(shí)時(shí)地測(cè)定凝血酶濃度曲線的進(jìn)程并提供連續(xù)的信號(hào)，從而給出諸如滯后時(shí)間和峰高的有關(guān)參數(shù)的更有價(jià)值和更精確的信息。后者對(duì)于測(cè)定凝固機(jī)構(gòu)活性(將在下面說明)的微妙差異更為重要。換句話說，這種新方法并不像ETP-法那樣提供樣品中已存在的凝血酶量的單一值，而是實(shí)時(shí)提供瞬時(shí)存在于樣品中的凝血酶濃度的進(jìn)程。
發(fā)明概述現(xiàn)在已令人吃驚地發(fā)現(xiàn)，上述缺點(diǎn)可通過測(cè)定帶有或不帶有血小板的凝固血漿中的凝血酶濃度來方便地消除，所述測(cè)定通過如下方法進(jìn)行監(jiān)測(cè)適當(dāng)?shù)男盘?hào)底物的分裂，并將其與平行樣品中恒定已知的凝血酶活性進(jìn)行比較。
因此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種實(shí)時(shí)測(cè)定在第一生物樣品中蛋白水解活性從樣品中出現(xiàn)和消失的進(jìn)程的方法，該方法包括下列步驟a)向所述第一樣品中加入蛋白酶激活物以產(chǎn)生蛋白水解活性；b)向步驟a)中加入信號(hào)底物，所述信號(hào)底物引起與產(chǎn)生的蛋白水解活性導(dǎo)致的反應(yīng)所形成的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物量相關(guān)的可檢測(cè)信號(hào)；c)加入一種工具(means)，該工具對(duì)于步驟b)中定義的信號(hào)底物具有恒定已知的穩(wěn)定蛋白水解活性，而對(duì)于其中蛋白水解活性未被觸發(fā)的第二平行樣品是惰性的；d)向步驟c)中加入與步驟b)中定義相同的信號(hào)底物，所述信號(hào)底物通過具有已知的穩(wěn)定蛋白水解活性的工具導(dǎo)致的反應(yīng)引起可檢測(cè)信號(hào)；e)測(cè)定在所述第一樣品和所述第二平行樣品中信號(hào)發(fā)展的時(shí)間進(jìn)程，以提供它們各自的曲線；f)比較所述曲線以及時(shí)導(dǎo)出在第一樣品中蛋白水解活性的進(jìn)程。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，提供了一種在第一血液或血漿樣品中實(shí)時(shí)測(cè)定蛋白水解活性從樣品中出現(xiàn)和消失的進(jìn)程的方法，所述蛋白水解活性主要是溶解血栓活性，所述方法包括下列步驟a)向所述第一樣品中加入凝血酶形成激活物以形成凝血酶；b)向步驟a)中加入信號(hào)底物，所述信號(hào)底物引起與形成的凝血酶導(dǎo)致的反應(yīng)所形成的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物量相關(guān)的可檢測(cè)信號(hào)；c)加入一種工具，該工具對(duì)于步驟b)中定義的信號(hào)底物具有恒定已知的穩(wěn)定凝血酶活性，而對(duì)于其中凝血酶活性未被觸發(fā)的第二平行樣品是惰性的；d)向步驟c)中加入與步驟b)中定義相同的信號(hào)底物，所述信號(hào)底物通過具有已知的穩(wěn)定凝血酶活性的工具導(dǎo)致的反應(yīng)引起可檢測(cè)信號(hào)；e)測(cè)定在所述第一樣品和所述第二平行樣品中信號(hào)發(fā)展的時(shí)間進(jìn)程，以提供它們各自的曲線；f)比較所述曲線以及時(shí)導(dǎo)出在第一樣品中凝血酶活性的進(jìn)程。
第一生物樣品通常選自血液，包括富血小板血漿、貧血小板血漿、或無血小板血漿在內(nèi)的血漿，唾液，血清，尿，腦脊髓液，精液，和糞便。
當(dāng)在血液樣品上實(shí)施本發(fā)明的方法時(shí)，血液通常是收集在裝有檸檬酸鈉或EDTA等的管中，使得血液中的游離鈣離子被束縛，阻止了凝血酶的形成和凝固。因此，為了啟動(dòng)凝血酶的產(chǎn)生，應(yīng)該在測(cè)定開始之前立刻加入鈣。但是，如果血液不是收集在檸檬酸鈉等中，就不需要這樣添加鈣。例如在以如下方式使用該方法時(shí)使得可以在取得血液后的幾分鐘內(nèi)開始實(shí)驗(yàn)。
所要測(cè)定的蛋白水解活性通常選自激活的凝固因子活性，包括凝血酶、激活的溶血纖因子活性、和補(bǔ)體系統(tǒng)活性的激活組分。按照本發(fā)明的方法從血液或血漿樣品中實(shí)時(shí)測(cè)定凝血酶活性的進(jìn)程是優(yōu)選的本發(fā)明方法中所用的信號(hào)底物優(yōu)選選自含有離去基團(tuán)的化合物，所述離去基團(tuán)通過形成的蛋白水解酶導(dǎo)致的反應(yīng)產(chǎn)生可檢測(cè)的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。該轉(zhuǎn)化產(chǎn)物通常通過光譜學(xué)測(cè)定，特別是通過熒光(優(yōu)選)、光密度和NMR等測(cè)定。因此，所述離去基團(tuán)通常為熒光基團(tuán)、發(fā)色基團(tuán)、釋放氫離子的基團(tuán)等。用于實(shí)施本發(fā)明方法的一種適宜和優(yōu)選的信號(hào)底物是Z-Gly-Gly-Arg-AMC。另外，適宜的可檢測(cè)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物包括對(duì)硝基苯胺和7-氨基-4-甲基-香豆素。
如上定義的、用于實(shí)施本發(fā)明方法的具有恒定已知的穩(wěn)定蛋白水解活性的合適工具包括α2-巨球蛋白-凝血酶復(fù)合物(優(yōu)選)、葡萄球菌凝固酶-凝血酶原復(fù)合物、和γ凝血酶。另外，可以使用在次級(jí)識(shí)別部位進(jìn)行改性的任何蛋白水解酶，因?yàn)槠浠钚灾行谋３滞暾渑c反應(yīng)混合物中的蛋白質(zhì)的功能性相互作用已被消除。
用于實(shí)施本發(fā)明方法的有用蛋白酶激活物包括鈣離子、磷脂、組織因子、可溶性組織因子、促凝血酶原激酶、高嶺土和鞣花酸(elagicacid)。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，所述第一生物樣品還包括一種藥劑，該藥劑將被測(cè)試其對(duì)正在研究的蛋白水解系統(tǒng)，如止血-血栓形成系統(tǒng)的影響?？稍诒景l(fā)明的方法中測(cè)試的適宜藥劑是抗血栓劑，如抗血小板劑和抗凝血?jiǎng)?，例如肝素、硫酸皮膚素、直接凝血酶抑制劑，例如水蛭素、阿加曲班(argatroban)或美加拉群(melagatran)、和Xa因子抑制劑，例如稠抗凝血蛋白。
根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供了一種試劑盒來實(shí)施本發(fā)明方法，用于如上所定義的實(shí)時(shí)測(cè)定蛋白水解活性，尤其是溶解血栓活性的進(jìn)程。該試劑盒方便地包括在合適的容器或其它常規(guī)包裝裝置中的一種或多種下列組分-一種已知濃度的α2M-凝血酶復(fù)合物；-一種用于富血小板血漿以啟動(dòng)凝固反應(yīng)的PRP試劑；-一種用于貧血小板血漿或無血小板血漿以啟動(dòng)凝固反應(yīng)的PPP試劑；-一種添加劑，該添加劑有助于診斷溶解血栓活性進(jìn)程，特別是在遇到或預(yù)期有止血-血栓形成系統(tǒng)的特定的反常情況下。適宜的添加劑為例如凝血調(diào)節(jié)蛋白或激活的蛋白質(zhì)C，其在診斷V Leiden因子或特定的抗血栓藥或抗血小板藥上特別有用。
-一種含有信號(hào)底物的試劑；-一種有助于計(jì)算凝血酶活性曲線的軟件程序；-一份使用手冊(cè)。
該試劑盒可適當(dāng)?shù)匕▋龈稍噭?br> 下面將對(duì)本發(fā)明的這些及其它目的進(jìn)行更詳細(xì)的說明。
附圖簡(jiǎn)述圖1為凝血酶產(chǎn)生曲線，顯示了在凝固血液或血漿中凝血酶形成的典型進(jìn)程，通過二次采樣測(cè)定。
圖2顯示了在加熱的含有熒光底物的血漿或緩沖劑(上部符號(hào)線)中添加凝血酶(下部符號(hào)線)和α2-巨球蛋白-凝血酶(粗線)后熒光信號(hào)的產(chǎn)生。
圖3顯示了在兩份加入了相同濃度的熒光底物的相同血漿樣品中的原始熒光信號(hào)。在一個(gè)樣品中加入了凝血酶產(chǎn)生激活物，導(dǎo)致凝血酶的產(chǎn)生。在另一個(gè)樣品中加入了導(dǎo)致穩(wěn)定的酰胺水解活性的已知濃度的α2-巨球蛋白-凝血酶復(fù)合物。
粗線凝血酶產(chǎn)生已被激活的樣品中產(chǎn)生的信號(hào)細(xì)線已加入了α2-巨球蛋白-凝血酶復(fù)合物的樣品中產(chǎn)生的信號(hào)圖4顯示了圖1中信號(hào)的一階導(dǎo)數(shù)。
粗線出現(xiàn)凝血酶產(chǎn)生的樣品的dFU/dt細(xì)線已加入了已知濃度的α2-巨球蛋白-凝血酶復(fù)合物的樣品的dFU/dt圖5顯示了兩個(gè)在血漿中的凝血酶產(chǎn)生曲線。粗線未對(duì)底物消耗或內(nèi)濾波效應(yīng)進(jìn)行校正的實(shí)時(shí)凝血酶濃度；細(xì)線對(duì)底物消耗或內(nèi)濾波效應(yīng)進(jìn)行校正后的實(shí)時(shí)凝血酶濃度。在這兩種情況下，凝血酶濃度都是通過血漿中α2-巨球蛋白-凝血酶復(fù)合物的已知活性，從熒光底物的初始轉(zhuǎn)化速率進(jìn)行測(cè)定的。
圖6顯示了同時(shí)測(cè)定的來自24個(gè)凝血酶產(chǎn)生的平均值和置信界限。曲線A描述了正常血漿，曲線B描述了除去纖維蛋白原的正常血漿。
圖7顯示了對(duì)由各重復(fù)四次的三個(gè)個(gè)體進(jìn)行同時(shí)測(cè)定得到的凝血酶曲線。
圖8顯示了在不同的六天內(nèi)、從重復(fù)四次的一個(gè)個(gè)體的PRP得到的曲線。
圖9分別顯示了健康供體的富血小板血漿和用血小板激活抑制劑處理的相同血漿中凝血酶的產(chǎn)生曲線。
定義本文使用的與血液或血漿樣品中產(chǎn)生的蛋白水解酶有關(guān)的術(shù)語“瞬時(shí)活性”是指一旦生理進(jìn)程通過本領(lǐng)域熟知的方法啟動(dòng)，酶活性首先升高，然后再降低到最終的(接近)零活性。
本文使用的術(shù)語“復(fù)合生物介質(zhì)”是指血漿、帶有血細(xì)胞或整個(gè)血液或任何其它源自身體的流體或其它成分的血漿，其中會(huì)發(fā)生酶活化和酶失活的生理過程。
本文使用的術(shù)語“實(shí)時(shí)”是指在樣品于反應(yīng)容器中活化和失活的同時(shí)，顯示介質(zhì)中酶濃度的進(jìn)程。
本文使用的術(shù)語“滯后時(shí)間”是指在凝血酶的形成真正開始之前所經(jīng)過的時(shí)間。
本文使用的術(shù)語“峰高”是指所達(dá)到的最大凝血酶活性。
本文使用的術(shù)語“上升坡的陡度”是指凝血酶濃度達(dá)到峰值前的升高速率。
本文使用的術(shù)語“達(dá)到峰值的時(shí)間”是指從反應(yīng)開始至達(dá)到峰值的時(shí)間。
本文使用的術(shù)語“ETP”是指直到凝血酶活性達(dá)到(接近)零時(shí)的曲線的時(shí)間積分。
本文使用的術(shù)語“信號(hào)底物”指可被介質(zhì)中的蛋白水解酶分裂的底物，從其上分裂出可通過光學(xué)、NMR或其它方法檢測(cè)出的離去基團(tuán)?？晒鈱W(xué)檢測(cè)出的離去基團(tuán)為例如對(duì)硝基苯胺和7-酰氨基-4-甲基-香豆素。對(duì)硝基苯胺在405nm產(chǎn)生吸收，7-酰氨基-4-甲基-香豆素是熒光性的(在390nm處激發(fā)，在460nm處發(fā)射)。NMR-活性離去基團(tuán)的例子是那些含有31P、13C、或任何其它可被NMR或相似技術(shù)檢測(cè)出的原子的基團(tuán)。另外，H+離子可以用作離去基團(tuán)，它可以通過測(cè)定pH值的變化檢測(cè)出來。
發(fā)明詳述為了實(shí)施本發(fā)明，下面將給出對(duì)止血和血栓形成系統(tǒng)(HTS)的典型描述，重點(diǎn)在于其最重要的酶，凝血酶。但應(yīng)該注意的是，本發(fā)明也涉及其它酶和其它生理系統(tǒng)，如血液和血漿中凝固系統(tǒng)的其它激活的蛋白水解酶(因子)、在血液和血漿中溶血纖系統(tǒng)的胞漿素和其它激活的成分、在血液和血漿中激活的補(bǔ)體因子、胃液中的胃蛋白酶、十二指腸液中的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶等。
如上所述，通常瞬時(shí)酶活性可通過添加一種在轉(zhuǎn)變時(shí)產(chǎn)生信號(hào)的底物來測(cè)定。采用本領(lǐng)域中的熒光底物時(shí)，該方法典型地包括將熒光底物添加到凝血酶的產(chǎn)生已經(jīng)被觸發(fā)(使用本領(lǐng)域熟知的方法)的血液(或另一種生物樣品)中。底物分裂后，就形成了可在適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)上可測(cè)定的熒光產(chǎn)物。
通常，在相似的情況下，可通過以下方法達(dá)到該目的向第二個(gè)可完全比較的樣品中添加固定量的具有已知活性的相同底物酶，也叫“校準(zhǔn)物”，然后將所探測(cè)樣品的活性與該已知活性進(jìn)行實(shí)時(shí)比較。但是，在現(xiàn)在的情況下，因?yàn)槠洳环€(wěn)定且繼而會(huì)從血漿中消失，就不可能將凝血酶本身用作校準(zhǔn)物。另外，在添加凝血酶后的即刻，凝塊隨之形成，這保證可阻止試劑的適當(dāng)混合并導(dǎo)致不規(guī)律的結(jié)果。
但是，除了上述問題，在Y軸上的單位會(huì)是不定的，隨實(shí)驗(yàn)的進(jìn)展而變化，因?yàn)橛捎谒^的內(nèi)濾波效應(yīng)及伴隨的可用底物的減少，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物濃度的提高會(huì)改變凝血酶濃度與信號(hào)產(chǎn)生速率之間的關(guān)系。并且，實(shí)驗(yàn)的實(shí)施是在血液或血漿中，具有供體依賴性，會(huì)通過光吸收和熒光淬滅對(duì)信號(hào)產(chǎn)生影響。
因此應(yīng)該采取某種方法對(duì)每一供體的每一樣品進(jìn)行測(cè)定，使得Y軸上的任意單位可實(shí)時(shí)地歸因于凝血酶活性的有效量，表示為摩爾單位的凝血酶濃度。
本發(fā)明基于以下令人吃驚的發(fā)現(xiàn)某種底物表現(xiàn)出恒定的類似凝血酶的活性，這可被適當(dāng)?shù)赜糜趯⒔^對(duì)值(nM)分配到由分子所獲得的信號(hào)的一階導(dǎo)數(shù)上，凝血酶在凝固血漿中出現(xiàn)和消失時(shí)將所述分子分裂。一種適宜的特別優(yōu)選的物質(zhì)是α2-巨球蛋白(本文也稱為α2-M或α2M)與凝血酶的不可逆復(fù)合物、或可替代地為葡萄球菌凝固酶-凝血酶原復(fù)合物。
如果凝血酶在樣品中的活性是通過例如其產(chǎn)生熒光性分子的酰胺水解行為進(jìn)行監(jiān)測(cè)，由于多種原因所獲得的信號(hào)不能與凝血酶活性直接相關(guān)。每單位時(shí)間里所形成的熒光產(chǎn)物量與熒光信號(hào)的升高之間的關(guān)系取決于儀器、樣品的光吸收性能和樣品中已有的產(chǎn)物量(所謂的內(nèi)濾波效應(yīng))。凝血酶量與熒光產(chǎn)物量之間的關(guān)系取決于已經(jīng)消耗的底物量。即使在某一時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物的形成(dP/dt)與凝血酶活性之間存在有直接關(guān)系，它也具有儀器和樣品依賴性，且在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)生改變。
凝血酶在系統(tǒng)觸發(fā)后的出現(xiàn)和消失正是凝固系統(tǒng)的特性。出現(xiàn)和消失速率的病理學(xué)變化導(dǎo)致嚴(yán)重的疾病。因此，凝血酶在樣品中的消失速率是一個(gè)重要的生物學(xué)變量，必須在待測(cè)的樣品中保持原樣。該相同特性使得不可能得到一種在血漿中具有恒定活性的凝血酶制劑，該制劑可用作校準(zhǔn)物而給凝血酶活性分配絕對(duì)值。
本發(fā)明的重要因素是，通過將凝固血漿中的信號(hào)與具有恒定的類似凝血酶活性的工具相比較，消除儀器、樣品和時(shí)間信賴性。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，α2-巨球蛋白-凝血酶復(fù)合物具有所期望的特性，可作為這種提供恒定的類似凝血酶活性的極好工具，這種活性可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員方便地測(cè)定。將凝血酶附著在α2-巨球蛋白上使其能夠?qū)Υ嬖谟谘獫{中的天然滅活劑免疫，但又保留其分裂小底物的能力，該小底物在分裂后可釋放出具有光吸收性、熒光性或其它信號(hào)性的分子。由于α2-巨球蛋白能夠結(jié)合很多種蛋白水解酶，可以將其用于制備其它蛋白水解酶(例如，激活的凝固因子X、血纖蛋白溶酶、胰蛋白酶(trypsis)、胃蛋白酶、補(bǔ)體因子3)的校準(zhǔn)物。如上所述，發(fā)現(xiàn)葡萄球菌凝固酶和凝血酶原的復(fù)合物具有相似的特性，因?yàn)樗部梢蕴峁┖愣ǖ念愃颇傅幕钚?，該活性?duì)血漿抑制劑不敏感，從而可以作為替代的校準(zhǔn)系統(tǒng)用于其它的蛋白水解酶。
本發(fā)明的方法包括將血液或血漿樣品分成兩份，或僅僅使用兩份基本相同的樣品，向這兩份樣品中均加入一種在單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生一定量的可檢測(cè)信號(hào)的底物，信號(hào)的量與存在的凝血酶的活性相關(guān)。在一份樣品中，凝血酶的產(chǎn)生(即凝血)通過本領(lǐng)域熟知的方法觸發(fā)。向另一份樣品中加入一種具有獨(dú)立測(cè)定的恒定的凝血酶活性的制劑，優(yōu)選加入上述的α2-巨球蛋白-凝血酶復(fù)合物。優(yōu)選同時(shí)在這兩份樣品中測(cè)量產(chǎn)物形成。在凝固樣品中任意時(shí)刻存在的凝血酶的精確摩爾量是通過如下方法得到的將該樣品中產(chǎn)生的信號(hào)與同時(shí)測(cè)得的來自已加入具有已知的恒定凝血酶活性的制劑但凝血酶的形成未被觸發(fā)的樣品的信號(hào)進(jìn)行比較。
除了α2-巨球蛋白-凝血酶復(fù)合物之外，具有酰胺水解性但沒有凝血酶生物活性的替代性酶是葡萄球菌凝固酶，其由金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)產(chǎn)生。這種酶能夠結(jié)合到血漿中存在的凝血酶原上。葡萄球菌凝固酶-凝血酶原復(fù)合物能夠不被AT抑制地轉(zhuǎn)化少量凝血酶底物。例如，葡萄球菌凝固酶、葡萄球菌凝固酶-凝血酶原或α2M-凝血酶復(fù)合物以一定量加入到測(cè)試樣品中，用量通常為5至1000毫微摩/升、優(yōu)選約100毫微摩/升。
由本發(fā)明的方法得到的曲線的特征在于諸如滯后時(shí)間、曲線下的面積、峰高、上升斜率的陡度、達(dá)到峰值的時(shí)間的參數(shù)及其它的類似于數(shù)學(xué)函數(shù)T＝a.t^b.exp-ct(在滯后時(shí)間后開始)的曲線的所有參數(shù)。凝血酶的濃度通常開始于零，升高到通常為50-500毫微摩值的峰高，然后再回到零。滯后時(shí)間通常為0-20分鐘，在凝血酶濃度約高于10毫微摩時(shí)馬上結(jié)束。此時(shí)，也出現(xiàn)凝固的形成，而峰值發(fā)生在幾分鐘后。在此描述的凝血酶產(chǎn)生曲線的參數(shù)(也稱Thrombogram，是Synapse B.V.的注冊(cè)商標(biāo))為復(fù)合參數(shù)，其受到一大組濃度及相互作用的凝固因子的反應(yīng)常數(shù)的影響。它們反映了這些變量的所有變化，所述變量就像在臨床、治療學(xué)或其它設(shè)置中那樣影響止血血栓形成系統(tǒng)的功能。因此與測(cè)量的止血血栓形成系統(tǒng)有關(guān)的所有抗血栓藥和所有疾病會(huì)影響這些參數(shù)。在任何類型的抗血栓形成處理或止血凝固紊亂期間，滯后時(shí)間及達(dá)到峰值的時(shí)間通常會(huì)升高，峰高及曲線下的面積通常會(huì)降低。另一方面，在高凝血狀態(tài)下，這些參數(shù)向相反的方向移動(dòng)。Thrombogram以這種方式真實(shí)地反映了血液的凝固性，并給出血栓形成或止血風(fēng)險(xiǎn)的指示。
本發(fā)明還涉及如本文所述用于實(shí)施本發(fā)明方法的試劑盒，以及涉及用于常規(guī)地實(shí)施本發(fā)明方法的測(cè)定的設(shè)備、和涉及批量的測(cè)試元件源，以利于操作可處理大量測(cè)試樣品的自動(dòng)化設(shè)備。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，測(cè)試試劑盒適當(dāng)?shù)匕?.一種由已知濃度的α2-巨球蛋白-凝血酶復(fù)合物組成的凝血酶“校準(zhǔn)物”，所述復(fù)合物任選地為凍干形式。
2.一種PRP-試劑，用于富血小板血漿，且含有觸發(fā)劑以啟動(dòng)凝固反應(yīng)，通常為促凝血酶原激酶或重組再脂質(zhì)化(relipidated)組織因子或可溶性組織因子，任選地為凍干形式?？商娲?，它可含有激活固有系統(tǒng)如鞣花酸或高嶺土的觸發(fā)劑。
3.一種PPP-試劑，用于貧血小板血漿或無血小板血漿，含有與促凝血酶原激酶或重組再脂質(zhì)化組織因子或可溶性組織因子組合的磷脂囊，任選地為凍干形式?？商娲兀珊屑せ罟逃邢到y(tǒng)如鞣花酸或高嶺土的觸發(fā)劑。
4.含有來自PPP或PRP試劑的化合物加上特定化合物的試劑，使Thrombogram對(duì)凝固系統(tǒng)的特定異常更為敏感。例如，沒有磷脂的PPP-試劑會(huì)使Thrombogram對(duì)血漿中存在的微粒敏感。添加了凝血調(diào)節(jié)蛋白或激活的蛋白質(zhì)C(APC)的PPP或PRP試劑使得Thrombogram對(duì)天然抗凝固系統(tǒng)即已知的蛋白質(zhì)C系統(tǒng)的所有紊亂更為敏感。添加了激活的蛋白質(zhì)C(APC)的PPP或PRP試劑使得Thrombogram對(duì)V Leiden因子及V因子和/或VIII因子的所謂APC抗性的其它的先天或獲得形式很敏感。沒有組織因子的PRP-或PPP-試劑使Thrombogram對(duì)樣品中內(nèi)源性組織因子活性的存在敏感(參見Giesen et al.，Proc NatlAcad Sci USA 1999 96(5)2311-5.)。
5.含有信號(hào)底物如Z-Gly-Gly-Arg-AMC并通常還含有鈣離子的試劑。
6.一種有利于本方法中包括的校準(zhǔn)計(jì)算，以及時(shí)獲得凝血酶濃度的軟件程序。專門設(shè)計(jì)用來實(shí)施本發(fā)明方法、且注冊(cè)商標(biāo)為Thrombinoscope的適宜軟件程序可從申請(qǐng)人Synapse B.V.獲得，可通過其網(wǎng)址www.thrombin.com或通過電子郵件info@thrombin.com與其聯(lián)系。
7.一份指導(dǎo)如何使用試劑盒的手冊(cè)也可以成為測(cè)試試劑盒的一部分。
PPP和PRP試劑的不同在于磷脂的含量，為了能夠測(cè)定凝血酶形成中血小板的貢獻(xiàn)，在PRP情況下該含量應(yīng)該是低的。
測(cè)試試劑盒方便地以下面的方式使用向80微升PPP中加入20BL的PPP試劑，并向另外80μL相同血漿的樣品中加入20μL凝血酶校準(zhǔn)劑。然后向兩種樣品中加入熒光底物和鈣的混合物20μL，反應(yīng)開始在熒光計(jì)中進(jìn)行。通常在每種條件下要再測(cè)定80μL樣品，可通過專用的軟件程序計(jì)算每種條件下的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。
對(duì)于本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員可以理解的是，本發(fā)明的方法和試劑盒并不局限于使用熒光底物，而可以潛在地用于發(fā)色性、NMR、化學(xué)發(fā)光及其它類似的檢驗(yàn)方法。但是，目前的熒光底物是優(yōu)選的選擇，因?yàn)橄鄬?duì)于任何其它可利用的方法，其可以在纖維蛋白的存在下進(jìn)行評(píng)估，因而也可以測(cè)定纖維蛋白上的凝血酶。并且，可以避免通常很麻煩的脫纖維蛋白，成為在臨床上易于操作的更簡(jiǎn)單和更可靠的方法。另外，本方法中使用熒光底物，這允許在血小板的存在的情況下評(píng)估凝血酶(正如本領(lǐng)域所熟知的，血小板的激活需要纖維蛋白)，因而可以測(cè)定抗血小板藥物，可以測(cè)定血小板病理學(xué)，從而可進(jìn)行更適當(dāng)?shù)闹委煛?br> 圖9是一個(gè)實(shí)驗(yàn)實(shí)施例，其中對(duì)健康供體的富血小板血漿及用已知血小板激活抑制劑(ReoPro)處理過的相同血漿進(jìn)行測(cè)定。兩條曲線形狀不同，差異在于更長(zhǎng)的TTP和更低的峰高，但這兩條曲線下的面積在3％以內(nèi)是相同的。這種對(duì)峰高和TTP有影響、對(duì)ETP沒有明顯影響的情況也見于許多輕微的凝固因子缺陷中，如von Willebrand病、VII因子或V因子缺陷、及VIII或IX因子缺陷(血友病)。在許多情況下，峰高和TTP已被證明是凝血酶產(chǎn)生曲線上比ETP自身敏感得多的參數(shù)。
本發(fā)明的方法可以適當(dāng)?shù)乇挥糜谠\斷人和動(dòng)物天生的、獲得的或藥物引起的高凝血或低凝血狀態(tài)，從而監(jiān)測(cè)預(yù)防性治療或治療性治療，其中采用了抗血栓藥，和通常可影響凝固系統(tǒng)功能和以該系統(tǒng)障礙為特征的所有疾病狀態(tài)的所有藥物。
現(xiàn)在將通過下列實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地說明，這些實(shí)施例絕不能被當(dāng)作是對(duì)本發(fā)明范圍的限定。
實(shí)驗(yàn)1、凝血酶校準(zhǔn)物的制備α2-巨球蛋白的分離按照Barrett，A.J.，Alpha 2-macroglobulin，Methods Enzvmol，(1981)80(PtC)p.737-54.制備粗α2-巨球蛋白(α2M)。將該材料從檸檬酸化的牛血漿中分離。進(jìn)行該過程，直到α2M在12％(w/v)的PEG-20000中沉淀出。將小丸溶解在100mM NaCl、20mM HEPES(pH7.9)中，用來制備α2M-凝血酶復(fù)合物(α2M-T)。
α2-巨球蛋白-凝血酶復(fù)合物的制備向α2M中加入12μM牛凝血酶原、6mM CaCl2、50μM磷脂囊(20％的腦磷脂酰絲氨酸，80％的蛋黃磷脂酰膽堿)、5nM牛Xa因子和0.78nM牛Va因子。室溫下攪拌該混合物30min，然后在4℃下保存過夜。除去形成的凝塊，并將制劑分成適當(dāng)?shù)牧恳酝ㄟ^凝膠過濾(尺寸排阻色譜法)進(jìn)行凈化；即，在這種情況下中按40ml的量使用。現(xiàn)在可將制劑在-80℃下冷凍，直到進(jìn)行進(jìn)一步處理。
將40ml的α2M-T加到用100mM檸檬酸鈉、20mM HEPES(pH7.4)、0.02％NaN3平衡的Sephacryl柱(20cm2×90cm)中。在該柱的運(yùn)行中，平衡緩沖劑以0.7ml/min的速率添加700ml，然后以3ml/min的速率添加。保留體積為774-846ml的部分含有α2M-T。材料的洗提形成尖峰。
α2M-T的濃度可通過其水解發(fā)色性底物82238的能力進(jìn)行測(cè)定。水解發(fā)色性底物的能力被稱為酰胺水解活性。將制劑的酰胺水解活性調(diào)整到與600nM人凝血酶相同的活性，然后加入100nM的?？鼓负?U/ml肝素(LEO)?，F(xiàn)在該材料已準(zhǔn)備好用作凝血酶校準(zhǔn)物。如需要，可將該材料按適當(dāng)?shù)牧績(jī)龈伞?br> 2、向血漿中添加凝血酶或α2M-凝血酶當(dāng)凝血酶加入到血漿中時(shí)，由于血漿中存在的凝血酶的天然抑制劑，其活性會(huì)立即降低。另一方面，相同活性的α2M-凝血酶導(dǎo)致直線彎曲，這僅僅是由于底物消耗和內(nèi)濾波效應(yīng)。圖1顯示了在96-井板的井中測(cè)定的熒光信號(hào)，向井中加入了凝血酶(100nM)或α2M-凝血酶復(fù)合物，以及熒光底物Z-Gly-Gly-Arg-AMC(0.417μM，可從BACHEM獲得，商品目錄號(hào)#1-1140)。可以看到相對(duì)于α2M-凝血酶復(fù)合物(粗線)，凝血酶曲線(符號(hào))的活性下降很快。在緩沖劑(20mMHepes，140mM NaCl，5g/l牛血清白蛋白(BSA)，pH7.35)中，這兩種制劑具有相同的活性(細(xì)線和符號(hào))，并且也可觀察到緩沖劑中的熒光產(chǎn)量比血漿中的高。這是由于血漿的顏色與緩沖劑有顯著的差異。甚至由于在血漿顏色中供體對(duì)供體的不同也能產(chǎn)生信號(hào)量的顯著不同。這就強(qiáng)調(diào)了始終需要將特定供體血漿中的凝血酶活性與相同供體的血漿中已知校準(zhǔn)物的活性進(jìn)行比較。
3、α2M-凝血酶復(fù)合物活性的評(píng)價(jià)校準(zhǔn)物的酰胺分解活性是通過將其活性與已知量的人凝血酶進(jìn)行比較而測(cè)定的。該人凝血酶濃度通過活性部位滴定來測(cè)定，使凝血酶與在催化反應(yīng)的第一部分反應(yīng)非常迅速的底物進(jìn)行相互作用，以釋放發(fā)色性產(chǎn)物，例如，酶迅速?；尫懦隹蓽y(cè)定的產(chǎn)物(如，對(duì)硝基苯胺)，然后由一種慢得多的反應(yīng)結(jié)束該轉(zhuǎn)換反應(yīng)。因此，產(chǎn)物的釋放正比與活性部位的數(shù)目。通過該凝血酶，可以精確地得知以單位時(shí)間內(nèi)單位酶分子的轉(zhuǎn)化分子數(shù)目計(jì)的活性。比較是在以下條件下和在一種介質(zhì)中進(jìn)行的溫度、pH和底物濃度與實(shí)際實(shí)驗(yàn)中的相同，在所述介質(zhì)中凝血酶在實(shí)驗(yàn)的時(shí)間界限(＜30min)內(nèi)穩(wěn)定的。這可以是緩沖劑(見上述內(nèi)容和圖2)或加熱的血漿，即其中的凝血酶天然抑制劑已被加熱滅活(70℃下10分鐘)的血漿。
4、凝血酶產(chǎn)生的自動(dòng)熒光測(cè)定首先說明一個(gè)實(shí)驗(yàn)，在該實(shí)驗(yàn)中對(duì)富血小板血漿樣品中的凝血酶產(chǎn)生進(jìn)行測(cè)定。所用溶液富血小板的人血漿，根據(jù)Beguin，S.，T.Lindhout，and H.C.Hemker，The effect of trace amounts of tissue factoron thrombin generation in platelet rich plasma，its inhibition by heparin.Thromb Haemost，1989.61(1)p.25-9.獲得。緩沖劑A20mM Hepes，140mM NaCl，5g/l牛血清白蛋白(BSA)，pH7.35；緩沖劑C20mMHepes，140mM NaCl，BSA 60mg/mL，pH7.35，以0.02％的疊氮化鈉作為防腐劑。
FluCa溶液向1750μL緩沖劑C中加入200μL的1M CaCl2。將混合物加熱到37℃。然后噴入50μL的100mmol/l底物的DMSO溶液，并立即旋轉(zhuǎn)試管，獲得極清澈的溶液，其中底物為2.5mM，CaCl2為100mM，DMSO為2.5％。
將微量滴定板熒光計(jì)(Fluoroscan Ascent，Thermolab Systems，Helsinki，F(xiàn)inland)恒溫至37℃。在96-井圓底板中，向一個(gè)井加入20μL預(yù)熱的由濃度為30皮摩的重組組織因子的緩沖劑A溶液組成的觸發(fā)溶液，向另一個(gè)井中加入20μL預(yù)熱的由濃度為600毫微摩的α2M-凝血酶復(fù)合物組成的校準(zhǔn)物；向這些井中的每一個(gè)加入80μL血漿。向熒光計(jì)的分配器中充入FluCa溶液，開始實(shí)驗(yàn)。圖3顯示了產(chǎn)生的熒光信號(hào)。所獲得的熒光信號(hào)的一階導(dǎo)數(shù)示于圖4。
圖3所示的一階導(dǎo)數(shù)并未真實(shí)地代表凝血酶-時(shí)間曲線，原因有三個(gè)a)產(chǎn)物-熒光關(guān)系不是線性的，因?yàn)闊晒夥肿釉跍y(cè)量波長(zhǎng)下也吸收光(內(nèi)濾波效應(yīng))，b)底物有消耗，c)α2-巨球蛋白-凝血酶由實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生的凝血酶而形成，α-巨球蛋白一般存在于任何血漿中。
實(shí)驗(yàn)中α2M-凝血酶的形成效應(yīng)是所有凝血酶產(chǎn)生測(cè)定的共有特征，其中通過其對(duì)少量信號(hào)底物的酰胺水解活性評(píng)價(jià)凝血酶，二次采樣和連續(xù)方法相似。校準(zhǔn)該效應(yīng)的方法已經(jīng)被公布，是所屬領(lǐng)域人員已知的[Hemker，H.C.and S.Beguin，Thrombin generation in plasmaitsassessment via the endogenous thrombin potential.Thromb Haemost，1995.74(1)p.134-8]。
干擾效應(yīng)a和b的校準(zhǔn)可通過以下方式進(jìn)行在線地連續(xù)由該樣品中產(chǎn)生的凝血酶所得信號(hào)的一階導(dǎo)數(shù)(O＝f(t))與另一樣品中校準(zhǔn)物所產(chǎn)生信號(hào)的一階導(dǎo)數(shù)(S＝f(t))進(jìn)行比較。后者很接近于與公式S＝B-A*t吻合的直線。A和B是在實(shí)驗(yàn)中通過S＝f(t)由最吻合的直線連續(xù)算出的。校準(zhǔn)值(R)通過下式得到R(t)＝B*SQRT(((B^2-4*A)*O(t))/(2*A))-(B^2/(2*A))實(shí)驗(yàn)期間，在實(shí)施這些實(shí)驗(yàn)的計(jì)算機(jī)的屏幕上連續(xù)地顯示所得到的曲線R＝f(t)(圖5A和B)。
5、同時(shí)實(shí)驗(yàn)序號(hào)4所描述的實(shí)驗(yàn)需要96井板中的兩個(gè)井。也可以在任何數(shù)量的可用井中同時(shí)進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)或不同的實(shí)驗(yàn)。唯一的要求是給定血漿中的實(shí)驗(yàn)總是伴有來自相同血漿的另一樣品中校準(zhǔn)物信號(hào)的記錄。圖6顯示了24個(gè)同時(shí)實(shí)驗(yàn)的信號(hào)的平均值和置信界限。可看出，存在纖維蛋白(原)時(shí)產(chǎn)生的凝血酶量更高，這表明該方法確實(shí)得到了凝塊束縛的凝血酶的活性。
圖7顯示了對(duì)三個(gè)不同個(gè)體進(jìn)行各重復(fù)四次的同時(shí)測(cè)定得到的曲線。圖8顯示了由在不同的6天中測(cè)定的重復(fù)四次的一個(gè)個(gè)體的PRP得到的曲線。
本發(fā)明提供了一種實(shí)時(shí)地測(cè)定生物樣品中蛋白水解活性、特別是血液或血漿中凝血酶活性的進(jìn)程的簡(jiǎn)便試驗(yàn)方法，該方法將其作為連續(xù)的信號(hào)提供出來，從而，與屬于本領(lǐng)域技術(shù)的方法如ETP-法相比，本方法給出了有關(guān)諸如滯后時(shí)間和峰高的參數(shù)的更有價(jià)值和更為精確的信息，像ETP-法這樣的方法只能對(duì)產(chǎn)物量進(jìn)行終點(diǎn)測(cè)定。
無論從哪方面來看，本發(fā)明的公開內(nèi)容都應(yīng)被認(rèn)為是說明性的而非限定性的，通過權(quán)利要求指定的本發(fā)明的范圍、及任何落在等同物的主旨和范圍內(nèi)的改變都包含在內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種實(shí)時(shí)測(cè)定在第一生物樣品中蛋白水解活性從樣品中出現(xiàn)和消失的進(jìn)程的方法，該方法包括下列步驟a)向所述第一樣品中加入蛋白酶激活物以產(chǎn)生蛋白水解活性；b)向步驟a)中加入信號(hào)底物，所述信號(hào)底物引起與產(chǎn)生的蛋白水解活性導(dǎo)致的反應(yīng)所形成的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物量相關(guān)的可檢測(cè)信號(hào)；c)加入一種工具，該工具對(duì)于步驟b)中定義的信號(hào)底物具有恒定已知的穩(wěn)定蛋白水解活性，而對(duì)于其中蛋白水解活性未被觸發(fā)的第二平行樣品是惰性的；d)向步驟c)中加入與步驟b)中定義相同的信號(hào)底物，所述信號(hào)底物通過具有已知的穩(wěn)定蛋白水解活性的工具導(dǎo)致的反應(yīng)引起可檢測(cè)信號(hào)；e)測(cè)定在所述第一樣品和所述第二平行樣品中信號(hào)發(fā)展的時(shí)間進(jìn)程，以提供它們各自的曲線；f)比較所述曲線以及時(shí)導(dǎo)出在第一樣品中蛋白水解活性的進(jìn)程。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，用于實(shí)時(shí)測(cè)定蛋白水解活性在第一血液或血漿樣品中從樣品中出現(xiàn)和消失的進(jìn)程，所述蛋白水解活性主要是凝血酶活性，該方法包括下列步驟a)向所述第一樣品中加入凝血酶形成激活物以形成凝血酶；b)向步驟a)中加入信號(hào)底物，所述信號(hào)底物引起與形成的凝血酶導(dǎo)致的反應(yīng)所形成的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物量相關(guān)的可檢測(cè)信號(hào)；c)加入一種工具，該工具對(duì)于步驟b)中定義的信號(hào)底物具有恒定已知的穩(wěn)定蛋白水解活性，而對(duì)于其中凝血酶活性未被觸發(fā)的第二平行樣品是惰性的；d)向步驟c)中加入與步驟b)中定義相同的信號(hào)底物，所述信號(hào)底物通過具有已知的穩(wěn)定凝血酶活性的工具導(dǎo)致的反應(yīng)引起可檢測(cè)信號(hào)；e)測(cè)定在所述第一樣品和所述第二平行樣品中信號(hào)發(fā)展的時(shí)間進(jìn)程，以提供它們各自的曲線；f)比較所述曲線以及時(shí)導(dǎo)出在第一樣品中凝血酶活性的進(jìn)程。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中第一生物樣品選自血液，包括富血小板血漿、貧血小板血漿或無血小板血漿在內(nèi)的血漿，唾液，血清，尿，腦脊髓液，精液，和糞便。
4.如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其中蛋白水解活性選自激活的凝固因子活性，包括凝血酶、激活的溶血纖因子活性、和補(bǔ)體系統(tǒng)活性的激活組分。
5.如權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中信號(hào)底物選自含有離去基團(tuán)的化合物，所述離去基團(tuán)通過形成的蛋白水解酶導(dǎo)致的反應(yīng)產(chǎn)生可檢測(cè)的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中信號(hào)底物為Z-Gly-Gly-Arg-AMC。
7.如權(quán)利要求5或6所述的方法，其中可檢測(cè)的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物通過光譜學(xué)，特別是熒光、光密度和NMR測(cè)定。
8.如權(quán)利要求5至7中任一項(xiàng)所述的方法，其中離去基團(tuán)為熒光基團(tuán)、發(fā)色基團(tuán)或釋放氫離子的基團(tuán)。
9.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中可檢測(cè)的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物是對(duì)硝基苯胺或7-氨基-4-甲基-香豆素。
10.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中具有恒定已知的穩(wěn)定蛋白水解活性的工具選自α2-巨球蛋白-凝血酶復(fù)合物、葡萄球菌凝固酶-凝血酶原復(fù)合物和γ凝血酶。
11.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中蛋白酶激活物選自鈣離子、磷脂、組織因子、可溶性組織因子、促凝血酶原激酶、高嶺土和鞣花酸。
12.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一生物樣品還包括一種藥劑，該藥劑將被測(cè)試其對(duì)正在研究的蛋白水解系統(tǒng)的影響。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述蛋白水解系統(tǒng)是止血-血栓形成系統(tǒng)。
14.如權(quán)利要求12或13所述的方法，其中藥劑是抗血栓劑，如抗血小板劑或抗凝血?jiǎng)?br> 15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中抗血栓劑選自肝素、硫酸皮膚素、直接凝血酶抑制劑，例如水蛭素、阿加曲班或美加拉群、和Xa因子抑制劑，例如稠抗凝血蛋白。
16.用于實(shí)施權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)所述的方法的試劑盒，該試劑盒包括以下組件中的一種或多種-一種已知濃度的α2M-凝血酶復(fù)合物；-一種用于富血小板血漿以啟動(dòng)凝固反應(yīng)的PRP試劑；-一種用于貧血小板血漿或無血小板血漿以啟動(dòng)凝固反應(yīng)的PPP試劑；-一種有助于診斷溶解血栓活性進(jìn)程的添加劑；-一種含有信號(hào)底物的試劑；-一種有助于計(jì)算凝血酶活性曲線的軟件程序；-一份使用手冊(cè)。
17.如權(quán)利要求16所述的試劑盒，該試劑盒含有凍干試劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種實(shí)時(shí)測(cè)定在血液或血漿樣品中凝血酶活性從樣品中出現(xiàn)和消失的進(jìn)程的方法，該方法包括向樣品中加入可在每個(gè)單位時(shí)間發(fā)出一定量可檢測(cè)信號(hào)的凝血酶底物，信號(hào)的量與存在的凝血酶量相關(guān)。同時(shí)，在凝血酶的產(chǎn)生未被觸發(fā)的相同血液或血漿的對(duì)照樣品中，測(cè)定具有恒定凝血酶活性的標(biāo)準(zhǔn)制劑的活性。通過將在凝血中測(cè)得的活性與同時(shí)測(cè)得的校準(zhǔn)物進(jìn)行比較，獲得在任意時(shí)刻存在的凝血酶的精確摩爾量。該方法尤其適用于診斷人和動(dòng)物天生的、獲得的或藥物引起的高凝血狀態(tài)和低凝血狀態(tài)。本發(fā)明還提供了一種用于該方法的試劑盒。
文檔編號(hào)G01R33/465GK1650170SQ03809938
公開日2005年8月3日 申請(qǐng)日期2003年5月1日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月1日
發(fā)明者彼得·吉森, 亨德里克·C·赫姆克爾, 雷德·奧·迪耶里, 敘澤特·L·貝甘, 羅伯特·瓦根伍爾德 申請(qǐng)人:瑟納普斯有限責(zé)任公司