專利名稱：用于循環(huán)性巨噬細胞的性質確定和/或分類的方法以及施行該方法的分析安排的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及通過非細胞自身抗原的用于循環(huán)性巨噬細胞的性質確定和/或分類的方法，以及施行這樣的方法的分析安排。
從Sinha，Wilson，GleasonImmunoelectron microscopiclocation of prostatic-specific antigen in human prostate by theprotein A-gold complex，Cancer，1987，60，1288-91中已知，來自前列腺組織的細胞的電子顯微鏡檢查的實施，其中根據(jù)所引用的文獻將前列腺的正常組織、前列腺癌組織和前列腺增生組織與金標記的PSA抗體進行溫育。檢查表明金顆粒存在于細胞質、細胞內顆粒、RES和溶酶體中。隨著增加的腫瘤的終末分化，更多的金顆粒出現(xiàn)在膜結構中。這認為是下列情況的標志，即PSA(前列腺特異性抗原)隨著增加的腫瘤細胞的終末分化而存留于膜結構中。該檢查的另一個方面為在粒細胞和巨噬細胞中同樣檢測出金顆粒。
在流式細胞計量術檢查中，在循環(huán)血中發(fā)現(xiàn)PSA陽性的細胞。但是在之前已知的檢查中，只有巨噬細胞的表面因PSA而被染上顏色。
在巨噬細胞中沒有發(fā)現(xiàn)PSA分子的mRNA這一事實導致這樣的單一結論，即只吸收了PSA分子，而不涉及消除微轉移。參見Brandt，Griwatz，BrinkmannCirculating prostate-Specific antigen/CD14-double-positive cells；a biomarker indicating low risk for hematogeneousmetastasis of prostate cancer，J.Natl.Cancer Inst.1997；89，174。
眾所周知，聚集在較有序或較無序的細胞群中的組織組成細胞的惡性變化稱為腫瘤。這些腫瘤細胞無視組織的排列，無限制地生長，和通過大小的增加以及浸潤入其他的周圍組織、器官中而擴張，或者跨越組織界限而進入血管系統(tǒng)或淋巴系統(tǒng)中。
一旦腫瘤到達血管系統(tǒng)或淋巴系統(tǒng)，那么此處的單個細胞或細胞群會通過這些系統(tǒng)游離開，并作為子腫瘤即轉移灶而在身體的其他部位附著。在此存在這樣的危險，即轉移灶繼續(xù)生長并掠奪身體的能量，直至身體衰亡和被其疾病所擊倒。
在這種腫瘤的形成期間，腫瘤細胞產生用于促進其生長的物質。另外，可作為腫瘤生長指示物的物質可被釋放出來。后者稱為腫瘤標記。但是這些標記對于腫瘤不是特異的，而只有血液中所測量的濃度的數(shù)量，因為健康的細胞也能夠釋放這些物質。因此，腫瘤標記不能用于檢測腫瘤，而只能用于疾病或治療過程的監(jiān)測。腫瘤的一個特殊標記為前列腺特異性抗原(PSA)，從血液中的一定濃度開始其就表明有前列腺癌。但是，前列腺的良性增大也可以引起血液中PSA值的升高。
迄今，腫瘤疾病主要通過給出圖像的方法來診斷，例如超聲波或計算機斷層攝影術、乳腺造影法等等?？墒牵挥懈鶕?jù)含有腫瘤的組織樣品才能作出最終的確定，并確定治療過程。
腫瘤疾病引起人體自身的免疫系統(tǒng)的對抗。這種免疫系統(tǒng)由一系列執(zhí)行不同任務的不同細胞類型組成。其中，巨噬細胞具有這樣的任務，即識別某些病樣物質，吞噬之，并將其分解成其組分。隨后，將被吞噬的細胞的片段呈遞在其他免疫細胞的表面上，因此這使得能夠識別應當進攻的結構。
存在迫切的需求以在早期階段施行循環(huán)性巨噬細胞的性質確定，而無須進行人體的直接檢查。
本發(fā)明的任務在于提供使得能夠施行循環(huán)性巨噬細胞(PBMC)的性質確定和/或分類的方法以及分析安排。
根據(jù)本發(fā)明，由于能夠在循環(huán)性巨噬細胞中檢測被吞噬的腫瘤細胞的抗原或片段，因此能夠施行直接和特異的腫瘤檢測。
根據(jù)本發(fā)明，抽取全血樣品，隨后進行梯度離心以分離巨噬細胞。然后將巨噬細胞穿孔，并施行使用至少一種經(jīng)挑選的抗體的細胞內染色。
隨后，使用本身已知的流式細胞計量術以在單一水平上記錄細胞性質。
流式細胞計量術使得能夠在液體流中進行細胞計數(shù)和分析細胞的物理和分子性質。具體地而言，借助于熒光染料標記的試樣如抗體而在單一水平上測定細胞或細胞群體的性質并記錄。
在此，使用熒光染料標記的抗體的抗原-抗體反應是基礎。為了分析，將單個懸浮液的細胞通過流體動力聚焦(hydrodynamischeFokussierung)導向具有合適波長的激光束。在通過單色激光束相應地激發(fā)熒光染料的電子時，這些電子躍遷至較高的能量水平。在激光脈沖之后，電子返回其初始水平，同時以光子的形式釋放出能量。用光檢測器記錄下的所述發(fā)射出的光子密度與每個細胞所結合的抗體數(shù)量成比例。另外，通過光衍射和散射可進一步獲得關于細胞大小和內部結構即細胞質的顆粒性以及細胞核大小的信息。
使用前列腺特異性抗原、細胞角蛋白抗體和/或上皮膜抗原作為經(jīng)挑選的抗體。
然后根據(jù)本發(fā)明，通過在巨噬細胞中進行PSA抗體染色就能夠確定被吞噬的物質是否與前列腺相關。
用于施行該方法的分析安排包括用于肝素化所抽取的血液的試劑、用于分離巨噬細胞的梯度離心機、用于細胞穿孔的試劑、用于使用熒光染料標記的抗體對經(jīng)預處理的細胞進行細胞內染色的裝置和用于測定各自分離并經(jīng)預處理的細胞的細胞內結構并且具有計算機支持的評價單元的流式細胞計量儀，該分析安排用于早期發(fā)現(xiàn)腫瘤的目的。
在下文中將依靠實施例更詳細地解釋本發(fā)明。
在血液抽取和染色的步驟中，從例如6ml全血開始進行肝素化。借助于梯度離心分離單核細胞、巨噬細胞和淋巴細胞。
在下一步驟中，進行細胞的甲醛固定和皂草苷處理以達到穿孔的目的。
隨后是使用例如下表中的經(jīng)挑選的抗體進行細胞內染色的步驟。
PSA抗體Ab-1(Clone ER-PRS)全細胞角蛋白-FITC
上皮膜抗原(Clone E 29)同型對照IgG1(Clone DAK-GO1)第二抗體FITC山羊抗小鼠(DAKO)然后，將相應的直到分析才再次固定的細胞通過流式細胞計量術進行更詳細的檢查。選通單核細胞和巨噬細胞，即只有一部分測量結果用于評價，并進行預選擇。
然后，通過柱狀圖分析來評價同型對照和染色，并給出例如以百分比表示的陽性細胞數(shù)量。
其表明，對于患有擴散型前列腺瘤的患者，當用細胞角蛋白進行巨噬細胞的染色時，在相應的人的循環(huán)免疫細胞中發(fā)現(xiàn)組織細胞的組成結構部分。因為這些組成成分不是免疫細胞的原始內容物，所以他們一定是通過吞噬作用而被納入的。由于細胞角蛋白的納入曲線過程明顯與同型的不同，因此可以排除非特異的作用。
巨噬細胞中的PSA染色證明，經(jīng)吞噬的物質一定與前列腺組織相關，因為該特異性標記也是可檢測的。
總之，通過使用所述的方法和附屬的分析安排，能夠得到用于循環(huán)性巨噬細胞的性質確定和分類的新型方法，其中分類使得能夠指出可能的前列腺相關內容物。
權利要求
1.用于循環(huán)性巨噬細胞和/或外周血液單核細胞的性質確定和/或分類的方法，其具有下列步驟-抽取全血以及進行梯度離心以分離巨噬細胞，-將巨噬細胞穿孔，-用至少一種經(jīng)挑選的抗體進行所述細胞的細胞內染色，以及-進行所述經(jīng)預處理的細胞的流式細胞計量分析，并隨后對于更多的細胞進行統(tǒng)計學評價，
2.根據(jù)權利要求1的方法，其特征在于，使用前列腺特異性抗原(PSA)、細胞角蛋白和/或上皮膜抗原作為所述經(jīng)挑選的抗體。
3.根據(jù)權利要求1或2的方法，其特征在于，在施行流式細胞計量術之后進行同型對照和染色的柱狀圖分析。
4.根據(jù)前述權利要求中任何一項所述的方法，其用于在人體外檢測通過吞噬作用而納入的擴散型前列腺瘤的組織細胞部分。
5.根據(jù)權利要求4的方法，其特征在于，通過所述巨噬細胞中的所述PSA染色確定被吞噬的物質是否與前列腺相關。
6.用于施行根據(jù)前述權利要求中任何一項所述的方法的分析安排，其包括用于肝素化所抽取的血液的試劑、用于分離巨噬細胞的梯度離心機、用于細胞穿孔的試劑、用于使用熒光染料標記的抗體對所述經(jīng)預處理的細胞進行細胞內染色的裝置和用于測定各自分離并經(jīng)預處理的細胞的細胞內結構并且具有計算機支持的評價單元的流式細胞計量儀，該分析安排用于早期發(fā)現(xiàn)腫瘤的目的。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于循環(huán)性巨噬細胞的性質確定和/或分類的方法以及分析安排。將抽取的全血進行梯度離心以分離巨噬細胞。然后將巨噬細胞穿孔，并施行使用至少一種經(jīng)挑選的抗體的細胞內染色。然后，經(jīng)預處理的細胞的流式細胞計量術分析使得能夠進行隨后的細胞內容物的統(tǒng)計學評價。選擇PSA、細胞角蛋白和/或上皮膜抗原作為抗體。
文檔編號G01N33/48GK1668922SQ03816702
公開日2005年9月14日 申請日期2003年6月2日 優(yōu)先權日2002年6月26日
發(fā)明者拉爾夫·赫維希 申請人:拉爾夫·赫維希