專利名稱：細(xì)胞分析分離裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明申請涉及在不對細(xì)胞試料產(chǎn)生損傷的情況下，能夠簡便地進(jìn)行細(xì)胞的分析分離的新型細(xì)胞分析分離裝置。
背景技術(shù)：
將培養(yǎng)液中的特定的細(xì)胞分離、回收在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)分析上是重要的技術(shù)。當(dāng)因細(xì)胞的比重不同而分離細(xì)胞時(shí)，可以采用速度沉降法進(jìn)行分離。但是，當(dāng)如辨別未致敏細(xì)胞和致敏細(xì)胞這樣，細(xì)胞幾乎無差異時(shí)，必須以用熒光抗體染色的信息或目視的信息為基礎(chǔ)將細(xì)胞一個(gè)個(gè)地分離。對于該技術(shù)，例如包括細(xì)胞分類器(cell sorter)。細(xì)胞分類器是通過將熒光染色處理后的細(xì)胞以1細(xì)胞單位分離滴入具有電荷的液滴中，以該液滴中的細(xì)胞有無熒光、光散射量的大小為基礎(chǔ)，在液滴下落的過程中在相對于下落方向的法平面方向上以任意方向外加高電場，從而控制液滴的下落方向，分級到置于下部的多個(gè)容器中進(jìn)行回收的技術(shù)。對于該技術(shù)，Kamarck，M.E.在Methods Enzymol.第151卷第150頁～165頁(1987年)中報(bào)告。
但是，該技術(shù)存在價(jià)格高，裝置大型，需要數(shù)千伏的高電場，大量需要試料，在制作液滴的階段有可能損傷細(xì)胞，不能直接觀察試料等問題，因此近年來，發(fā)明了細(xì)胞分類器，其邊直接對使用微加工技術(shù)制作的微細(xì)流路中形成的層流中流動的微粒進(jìn)行顯微鏡觀察邊進(jìn)行分級，例如，在Micro Total Analysis’98，pp.77-80(KluwerAcademic Publishers，1998)或Analytical Chemistry.70，pp.1909-1915(1998)等中有報(bào)告，但相對于觀察裝置試料分離的應(yīng)答速度慢，為了實(shí)用化，需要不對試料產(chǎn)生損傷并且應(yīng)答更快的處理方法。此外，本申請的發(fā)明者們也進(jìn)行了解決以往問題的嘗試。
發(fā)明者們所進(jìn)行的嘗試是要利用熒光觀察進(jìn)行分離，與以往方法相比具有突出的優(yōu)點(diǎn)，但實(shí)際情況是對于光學(xué)計(jì)測裝置、試料的導(dǎo)入裝置、分離方法等尚未進(jìn)行詳細(xì)的研究。因此，例如，只進(jìn)行熒光觀察就可以識別發(fā)出熒光的試料，但不能認(rèn)識不發(fā)出熒光的試料通過，當(dāng)只回收熒光標(biāo)識的試料時(shí)，有可能錯(cuò)誤地將沒有發(fā)出熒光的試料回收。
因此，本發(fā)明申請的課題在于消除以上所述的目前為止存在的問題，提供新型細(xì)胞分析分離裝置，其以試料的微細(xì)結(jié)構(gòu)和試料中的熒光分布為基礎(chǔ)將試料分級，在不對回收的試料產(chǎn)生損傷的情況下可以簡便地對細(xì)胞試料進(jìn)行分析分離。

發(fā)明內(nèi)容
作為解決上述課題的發(fā)明，本發(fā)明申請第1，提供細(xì)胞分析分離裝置，其具有將以層流導(dǎo)入的含有試料的流體導(dǎo)入試料分級部的流路；在其兩側(cè)對稱配置的將在試料分級部合流的1對流體導(dǎo)入的流路；只當(dāng)在試料分級部將觀察試料排出時(shí)向試料分級部導(dǎo)入外力的裝置；配置在導(dǎo)入上述試料的流路的下游的試料回收流路，用于將從試料分級部選擇的含有試料的流體以層流流出；在其兩側(cè)對稱配置的排出不必要試料的1對流體的流路，這樣不會對回收的細(xì)胞試料產(chǎn)生損傷。
此外，本發(fā)明申請第2，為了以試料的微細(xì)結(jié)構(gòu)和試料中的熒光分布為基礎(chǔ)將試料分級，具有如下裝置在用光學(xué)顯微鏡觀察裝置中的試料時(shí)，能夠參照相互的位置關(guān)系同時(shí)應(yīng)對至少1個(gè)實(shí)體顯微鏡像和1個(gè)熒光顯微鏡像，第3，為了提供在不使用泵等儀器的情況下的裝置內(nèi)產(chǎn)生沒有發(fā)生脈動的流速慢的流動的裝置，具有利用流體的流速，利用導(dǎo)入裝置的液滴的高度差、重力產(chǎn)生的流動的裝置。


圖1為表示本發(fā)明的細(xì)胞分析分離裝置的系統(tǒng)構(gòu)成的1例的模式圖。
圖2為表示本發(fā)明的細(xì)胞分析分離裝置的光學(xué)系統(tǒng)的構(gòu)成的1例的模式圖。
圖3為表示本發(fā)明的細(xì)胞分析分離裝置的試料分離部的構(gòu)成的1例的模式圖。
圖4為表示本發(fā)明的細(xì)胞分析分離裝置的試料分離部的構(gòu)成的1例的模式圖。
圖5為本發(fā)明的細(xì)胞分析分離芯片的實(shí)施例的1個(gè)的截面圖。
圖6說明本發(fā)明的細(xì)胞分析分離順序。
圖7為使用本發(fā)明的細(xì)胞分析分離裝置進(jìn)行細(xì)胞分離的1例的顯微鏡照片。
圖中的符號表示如下內(nèi)容。
100細(xì)胞分析分離芯片101、108光源102、109、112、114、231、232、233帶通濾光器103集光透鏡104平臺105、504物鏡106、110、211、212、262、263分色鏡111、213、261鏡113、115、272照相機(jī)116圖像處理解析部117驅(qū)動裝置200、201、202、203、506光的行進(jìn)方向221、222、223狹縫241、242、243減光濾光器251、252、253光閘(Shutter)271透鏡301、302、303、304、305、306、401、402、403、404、405、406流路311、411試料321、322超聲波源421、422、423、424電極
501、503芯片截面502液層505流體的流507密封508針509芯片開口部端510試料液具體實(shí)施方式
本發(fā)明申請具有如上所述的特征，以下對其實(shí)施方式進(jìn)行說明。
圖1模式地表示本發(fā)明申請的細(xì)胞分析分離裝置的系統(tǒng)構(gòu)成的1例。101為實(shí)體顯微鏡的光源，一般使用鹵素系的燈。102為只使位相差等實(shí)體顯微鏡觀察的光源的光中特定波長的光透過的帶通濾光器。103為集光透鏡，當(dāng)進(jìn)行位相差觀察時(shí)，導(dǎo)入位相差環(huán)，當(dāng)進(jìn)行微分干涉觀察時(shí)，導(dǎo)入偏振器。在104的平臺上放置的是100細(xì)胞分析分離芯片，通過117的驅(qū)動裝置使上述平臺移動，從而對上述芯片的最佳位置進(jìn)行觀察。上述芯片內(nèi)的流路內(nèi)的狀態(tài)用105物鏡進(jìn)行觀察。此時(shí)從物鏡觀察的是從光源101透過的光產(chǎn)生的流路內(nèi)試料的實(shí)體像和、來自108光源的光在109帶通濾光器中只有激發(fā)光波長的光，通過106分色鏡從物鏡照射的激發(fā)光使試料產(chǎn)生的熒光像。此時(shí)，優(yōu)選用于實(shí)體顯微鏡像觀察的光的波長為比觀察的熒光波長范圍足夠短或足夠長的波長，并且如果可能，與激發(fā)光波長范圍不同。通過反射與透過上述102帶通濾光器的光同波長的光的110分色鏡、和112帶通濾光器，用113照相機(jī)只觀察到流路內(nèi)的實(shí)體顯微鏡像。另一方面，熒光像通過111鏡和114帶通濾光器在通過物鏡的光中只選擇性地透過熒光觀察的波長帶，用115照相機(jī)進(jìn)行觀察。用2個(gè)照相機(jī)113和115拍攝的像在116圖像處理部被解析，通過比較2個(gè)像的相對位置關(guān)系，可以比較鑒定試料的微細(xì)結(jié)構(gòu)和熒光的發(fā)光位置。在該實(shí)施例中，對1個(gè)波長帶域的實(shí)體像和1個(gè)波長帶域的熒光像進(jìn)行觀察并比較解析，同樣地，可以比較2個(gè)以上的波長帶域的實(shí)體像，也可以比較解析2個(gè)以上的熒光像。此外，為此可以在光路中與上述實(shí)施例同樣地進(jìn)一步配置1個(gè)以上的分色鏡和光源、或照相機(jī)觀測系統(tǒng)。
圖2為表示進(jìn)一步使用1個(gè)觀測照相機(jī)的受光面同時(shí)計(jì)測多個(gè)不同波長的像，本發(fā)明申請的細(xì)胞分析分離裝置的光學(xué)體系的構(gòu)成的1例的模式圖。多個(gè)分色鏡211、212和213鏡配置在含有從物鏡送來的不同波長的光201、202、203的200光的行進(jìn)方向上。對通過配置在處于各自相同的光路長的位置的合焦點(diǎn)面上的狹縫221、222、223觀察以各自的波長分離的光的視野范圍進(jìn)行選擇。然后，通過帶通濾光器231、232、233和減光濾光器241、242、243調(diào)整具有同程度的強(qiáng)度且要觀察的特定波長的光。然后，當(dāng)想要對特定波長的光進(jìn)行遮光時(shí)，可以通過光閘251、252、253進(jìn)行遮擋。通過該光閘的光再次通過261鏡和分色鏡262、263后，通過271透鏡結(jié)像于272照相機(jī)的受光面。這里，各鏡261、262、263為可動，可以任意選擇在照相機(jī)的受光面的哪個(gè)區(qū)域結(jié)像。這里，在以上的實(shí)施例中，敘述了3個(gè)不同波長的光的分析手法，同樣對于4個(gè)以上不同波長的光也可以使用。此外，如該實(shí)施例所示，通過使用1個(gè)照相機(jī)的受光面，沒有必要準(zhǔn)備多個(gè)高價(jià)的高靈敏度照相機(jī)。此外，如高速照相機(jī)那樣，當(dāng)多個(gè)照相機(jī)的同期難時(shí)，通過只對在1個(gè)受光面獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行解析，可以同時(shí)解析實(shí)態(tài)顯微鏡像和熒光顯微鏡像等多個(gè)在不同波長下的圖像。
圖3為表示本發(fā)明的細(xì)胞分析分離裝置的試料分級部的構(gòu)成的1例的模式圖。302為含有試料的流體流入試料分級部的流路，流路301和303為沒有含試料的流體流入試料分級部的流路，321、322為用于對3個(gè)流路合流的試料分級部照射超聲波，使超聲波產(chǎn)生的外力作用于上述試料分級部內(nèi)的試料311的超聲波源。從流路301、302、303導(dǎo)入的流體無脈動，調(diào)整為流速一致，因此在試料分級部保持層流，從流路302導(dǎo)入試料分級部的試料311只要不受外力，向流路305行進(jìn)。相反，當(dāng)作用超聲波產(chǎn)生的外力時(shí)，廢棄到流路304或流路305。此時(shí)，導(dǎo)入試料的流路302和回收試料的流路305相對于流動的方向配置在一直線上，以關(guān)于該流路的軸對稱的形式，配置1對只將流體導(dǎo)入試料分級部的流路301和303，同樣地，以相對于流路305軸對稱的形式配置將不要的試料廢棄的1對的流路304和306。這里，至少相對于流路301和303的流的截面積相等，而且相對于流路304和306的流的截面積相等。
圖4為與圖3同樣地表示試料分級部的構(gòu)成的1例的模式圖。這里，列示了對代替超聲波而使用靜電力對試料施加外力的誘導(dǎo)手法的實(shí)施例。含有從流路402導(dǎo)入的試料411的流體同樣導(dǎo)入試料分級部，以采用光學(xué)計(jì)測手法得到的計(jì)測結(jié)果為基礎(chǔ)判斷是回收還是廢棄?；厥盏那闆r下，沒有加入外力而直接使其在流路405上行進(jìn)，進(jìn)行回收。此外，廢棄的情況下，對于電極421和電極422外加電場，將試料誘導(dǎo)到流路404或406。此時(shí)，電極423和424被接地以成為參照電極。一般地，在水溶液中物質(zhì)在與其水溶液的界面處保持Z(ゼ-タ)電位，具有來自其的電荷。因此，通過使電場作用，可以對廢棄的試料施加外力。特別在該場合下，也可以使用具有正電荷和具有負(fù)電荷的物質(zhì)各自分離到流路404或406中。此外，當(dāng)氣泡等混在試料中而導(dǎo)入時(shí)，由于氣泡不具有表面電荷，因此雖然不受電場產(chǎn)生的作用，但常常在光學(xué)上與核蛋白體等識別困難。但是，通過使用該手法，也可以識別氣泡和試料微粒。
圖5為本發(fā)明申請的細(xì)胞分析分離芯片的實(shí)施例的1個(gè)截面圖。501、503為芯片截面，均對于進(jìn)行觀察的波長的光有足夠的透過性。為了維持結(jié)構(gòu)，上述501的厚度可以為mm量級的厚度，對于與物鏡504連接，對液層502中的流體的流505進(jìn)行觀察的芯片截面503，根據(jù)物鏡的倍率，限制最大厚度。例如，當(dāng)將開口數(shù)1.35、100倍的物鏡用于物鏡504時(shí)，優(yōu)選使截面的厚度為0.2mm以下。試料液的導(dǎo)入部和回收部的芯片開口部端509進(jìn)行防水處理，進(jìn)行處理以使開口部的液體不擴(kuò)散。在試料導(dǎo)入部載置試料液510，用針508刺密封507，使密封破裂，以對應(yīng)于試料液510的液面的高度的流速使試料液開始流動。此時(shí)，通過嚴(yán)密地控制試料液的量，可以作出流速得以嚴(yán)密控制的無脈動的流。此外，在該手法中，不必特別使用泵等裝置。
圖6說明本發(fā)明申請的細(xì)胞分析分離順序。與前面的實(shí)施例中所述那樣，對導(dǎo)入流路的試料進(jìn)行顯微鏡觀察，選擇分級回收的試料和廢棄的試料。然后，對于回收的試料，不使外力作用而直接進(jìn)行到回收流路中進(jìn)行回收。此時(shí)，試料在層流中行進(jìn)，由于沒有外加一切外力，因此認(rèn)為可以盡可能無損傷的試料回收。其次，當(dāng)廢棄時(shí)，由于對細(xì)胞產(chǎn)生損傷并不特別成為問題，因此可以使任意的外力作用于試料進(jìn)行排除。
圖7為使用本發(fā)明申請的細(xì)胞分析分離裝置對實(shí)際上具有不同的熒光的試料進(jìn)行圖像解析、分離的例子的顯微鏡照片。各個(gè)流路的尺寸，作為其截面，為寬20μm×高(深)20μm，各個(gè)的流量比為1∶1∶1。此外，細(xì)胞的種類為馬紅血球，使用生理用食鹽水(0.9％NaCl、pH7.4)作為流體。此外，使用電場(介電電泳動力)作為外力。在照片1到4中，表示將以發(fā)紅色熒光的大小3微米的細(xì)胞回收的過程。同樣地，在照片5到8中，表示將以發(fā)綠色熒光的大小3微米的細(xì)胞廢棄的過程。
如以上詳述的那樣，根據(jù)本發(fā)明申請，可以以不受損傷的形式，識別微小的試料，進(jìn)行分級回收。
權(quán)利要求
1.細(xì)胞分析分離裝置，其特征在于具有將以層流導(dǎo)入的含有試料的流體導(dǎo)入試料分級部的流路；在其兩側(cè)對稱配置的1對導(dǎo)入在試料分級部合流的流體的流路；只當(dāng)在試料分級部將觀察試料排出時(shí)向試料分級部導(dǎo)入外力的裝置；配置在導(dǎo)入上述試料的流路的下游的試料回收流路，其是用于將從試料分級部選擇的含有試料的流體以層流流出；在其兩側(cè)對稱配置的1對排出不必要試料的流體的流路。
2.權(quán)利要求1所述的細(xì)胞分析分離裝置，其特征在于，具有如下裝置在用光學(xué)顯微鏡觀察試料時(shí)，能夠參照相互的位置關(guān)系同時(shí)應(yīng)對至少1個(gè)實(shí)體顯微鏡像和1個(gè)熒光顯微鏡像。
3.權(quán)利要求1所述的細(xì)胞分析分離裝置，其特征在于，具有利用流體的流速，利用由導(dǎo)入的液滴的高度差、重力產(chǎn)生的流動的裝置。
全文摘要
細(xì)胞分析分離裝置，其具有將以層流導(dǎo)入的含有試料的流體導(dǎo)入試料分級部的流路；在其兩側(cè)以對稱形式配置的1對只導(dǎo)入流體的流路；只當(dāng)在試料分級部將觀察試料排出時(shí)向試料分級部導(dǎo)入外力的裝置；配置在導(dǎo)入上述試料的流路的下游的試料回收流路，用于將含有試料的流體流出，以層流只將從試料分級部選擇的試料回收；在其兩側(cè)以對稱形式配置的1對排出不必要的試料的流體的流路，其以試料的微細(xì)結(jié)構(gòu)和試料中的熒光分布為基礎(chǔ)對試料進(jìn)行分級，對回收的試料不產(chǎn)生損傷。
文檔編號G01N15/14GK1678908SQ0382019
公開日2005年10月5日 申請日期2003年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月26日
發(fā)明者一木隆范, 安田賢二 申請人:獨(dú)立行政法人科學(xué)技術(shù)振興機(jī)構(gòu)