專利名稱：色譜雙層顆粒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用作色譜基質(zhì)的多孔聚合物顆粒的生產(chǎn)方法，該顆粒包含具有不同性質(zhì)的兩層。本發(fā)明還涉及上述顆粒以及使用了上述顆粒的色譜方法。
背景技術(shù)：
術(shù)語(yǔ)色譜法包含了一系列密切相關(guān)的分離方法。上述方法均是基于將互不混溶的兩相接觸的特征，其中一相是固定的而另一相是流動(dòng)的。色譜法可用于從污染化合物中純化液體或者從液體中回收一種或多種產(chǎn)物。
近年來(lái)，其中色譜法引起巨大興趣的一個(gè)領(lǐng)域是生物技術(shù)領(lǐng)域，例如用于新藥大規(guī)模且經(jīng)濟(jì)的生產(chǎn)和診斷。而且，近年來(lái)蛋白質(zhì)的純化變得越加重要，這是由于蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域的開發(fā)，其中研究了由人類基因組表達(dá)的蛋白質(zhì)的功能。一般地，蛋白質(zhì)是通過細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)的，其要么在細(xì)胞內(nèi)要么被分泌到周圍介質(zhì)中。因?yàn)樗玫募?xì)胞系是活的機(jī)體，所以必須向它們供給包含糖類、氨基酸、生長(zhǎng)因子等的復(fù)雜的生長(zhǎng)介質(zhì)。要從供給細(xì)胞的化合物混合物中和從細(xì)胞自身的副產(chǎn)物中分離所需的蛋白質(zhì)使其達(dá)到足夠的純度，例如用作人類的治療劑，這給人們提出了一個(gè)艱巨的挑戰(zhàn)。
通常，細(xì)胞和/或細(xì)胞碎片已經(jīng)通過過濾去除。一旦已經(jīng)獲得含有所需蛋白質(zhì)的澄清溶液，通常利用不同色譜技術(shù)的組合進(jìn)行該蛋白質(zhì)與該溶液的其它組分的分離。這些技術(shù)基于蛋白質(zhì)的電荷、疏水性程度、親和性、大小等來(lái)分離蛋白質(zhì)混合物。對(duì)于這些技術(shù)的每一種，可獲得多種不同的色譜基質(zhì)，從而允許針對(duì)所涉及的特定蛋白質(zhì)來(lái)設(shè)計(jì)純化方案。
為了減少?gòu)募?xì)胞培養(yǎng)物或裂解物中獲得產(chǎn)物所需步驟的數(shù)目，已經(jīng)提出了改進(jìn)的色譜技術(shù)。例如，在已知的膨脹床色譜技術(shù)中已經(jīng)進(jìn)行了避免去除細(xì)胞和/或細(xì)胞碎片步驟的嘗試。膨脹床色譜是非填充床技術(shù)，其中基質(zhì)優(yōu)選呈顆粒形狀，通過供應(yīng)向上流動(dòng)的流體使得基質(zhì)呈流化或膨脹狀態(tài)。隨后將包含待分離化合物的溶液引入該流體中。(對(duì)于膨脹床色譜的舉例說(shuō)明性用途，參見例如國(guó)際專利申請(qǐng)WO98/33572(Amersham Pharmacia Biotech AB))。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在上述膨脹床中，原則上允許細(xì)胞通過該床，同時(shí)所需的化合物被吸附到該顆粒適當(dāng)?shù)呐潴w上。但是，在離子色譜中會(huì)出現(xiàn)問題，在這種情況下細(xì)胞表面和基質(zhì)的結(jié)合基團(tuán)帶有相反的電荷。隨后產(chǎn)生聚集，這可以導(dǎo)致膨脹床的塌陷以及誘導(dǎo)蛋白質(zhì)產(chǎn)量的減少。
用于分離蛋白質(zhì)和相似化合物的改進(jìn)的可利用方法的另一種選擇是通過改善基質(zhì)材料的方法。為此，已經(jīng)建議了具有一種以上官能團(tuán)及由此可以選擇性地吸附一種以上化合物的基質(zhì)。
因此，美國(guó)專利第5,522,994號(hào)公開了一種從樣品中分離兩種不同大小分子的方法，其中使用的分離介質(zhì)具有至少兩種不同類型的官能團(tuán)。這種介質(zhì)可以通過用大小改性劑處理孔中具有反應(yīng)性基團(tuán)的多孔材料而制得，該大小改性劑僅滲入該多孔材料的某些孔中。從而，該改性劑將僅僅化學(xué)改性滲入孔中的反應(yīng)性基團(tuán)。
為了提供具有不同性質(zhì)的分離介質(zhì)，WO 98/39094公開了位阻效應(yīng)的另一種用途。在該種情況下，多孔基質(zhì)的表面覆蓋有聚合物，該聚合物所具有的分子量足以使其不能滲入基質(zhì)的微孔體系。優(yōu)選地，孔中的基質(zhì)本身為用葡聚糖衍生的瓊脂糖并且任選地被官能化。覆蓋表面的聚合物的例子還可以是具有更大分子量的葡聚糖、纖維素等。在一些情況下，覆蓋表面的聚合物在附著于基質(zhì)上之前已經(jīng)被官能化。因而，聚合物表層的目的是為了在空間上阻止大于某一大小的化合物穿過內(nèi)部的微孔。通過提供所具有的官能團(tuán)不同于微孔體系中存在的官能團(tuán)的聚合物，可以建立一種體系，其中吸入微孔中的較小化合物避免了被吸附在表面上的聚合物上。所公開的基質(zhì)可用于分離核酸、蛋白質(zhì)和其它有機(jī)的和無(wú)機(jī)的化合物。
WO 98/39364描述了一種在多孔的基質(zhì)層上引入第二種官能團(tuán)的方法。該方法的實(shí)現(xiàn)是通過將所述基質(zhì)與一種試劑接觸，該試劑以比其擴(kuò)散入所述基質(zhì)更高的反應(yīng)速率與基質(zhì)表面上的配體反應(yīng)。反應(yīng)性通常受溶劑、pH等的影響，并且向基質(zhì)的擴(kuò)散作用取決于基質(zhì)和試劑的化學(xué)性質(zhì)。因此，該方法得到了一種基質(zhì)，其中原始的配體仍然存在于內(nèi)孔體系中，而加入的試劑則在外層上提供了另一種官能團(tuán)。從而，外層的厚度將取決于加入的試劑的數(shù)量。優(yōu)選的基質(zhì)是瓊脂糖，并且該試劑可以是根據(jù)常規(guī)方法的溴。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)目的是提供生產(chǎn)用于色譜基質(zhì)的顆粒的選擇性的方法，其中該顆粒包含具有不同性質(zhì)的明確的兩層。該方法可以利用一種兩相體系來(lái)實(shí)施，其中僅在其中一相中反應(yīng)的試劑被用于改性該色譜基質(zhì)的外層。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種生產(chǎn)包括兩層的色譜顆粒的方法，該方法避免了將涂敷聚合物施加到該顆粒表面的需要。這可以通過一種方法實(shí)現(xiàn)，即其中兩層均由一種相同的材料制備并且利用兩相體系，該兩相體系在化學(xué)改性內(nèi)孔體系期間保護(hù)外層或者在化學(xué)改性外層期間保護(hù)內(nèi)孔體系。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種生產(chǎn)包括具有不同性質(zhì)的兩層的色譜顆粒的方法，所述層由一種相同的材料制備，并且不需要添加臨界量的試劑和不需要確定該試劑的擴(kuò)散和反應(yīng)速率。這可以通過一種方法實(shí)現(xiàn)，即其中該顆粒的外層通過與一種試劑反應(yīng)而被保護(hù)，該試劑在該顆粒的內(nèi)相不具有化學(xué)反應(yīng)活性。因而，可以在不影響保護(hù)的表面外層的情況下，進(jìn)行官能團(tuán)與內(nèi)層的連接。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供適于用作色譜基質(zhì)的顆粒，該顆粒易于制備并且在吸附過程中，該顆粒能選擇性地吸附一種需要的化合物到結(jié)合基團(tuán)上，從而在空間上阻止了與大分子如細(xì)胞或細(xì)胞碎片的接觸。這可以通過提供包含具有不同性質(zhì)的兩層的顆粒而實(shí)現(xiàn)，其中整個(gè)顆粒由一種材料構(gòu)成并且在外層存在非官能化的表面。本發(fā)明的具體目的是提供如上所述的顆粒，在色譜吸附過程中該顆粒能排斥大分子。這可以通過包括明確的兩層顆粒來(lái)實(shí)現(xiàn)，其中該顆粒的外層已經(jīng)被改性并且具有能化學(xué)排斥大分子的基團(tuán)，例如帶負(fù)電荷的基團(tuán)。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種膨脹床吸附(EBA)方法，其中減少或甚至消除了細(xì)胞和細(xì)胞碎片的聚集作用。這可以通過利用本發(fā)明的顆粒而實(shí)現(xiàn)，該顆粒的外層上具有帶負(fù)電荷的基團(tuán)，從而可排斥細(xì)胞、細(xì)胞碎片和核酸。
本發(fā)明的上述以及其它目的在所附的權(quán)利要求書中會(huì)獲得更加具體的限定。通過下面詳細(xì)的描述將清楚地說(shuō)明本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方式和優(yōu)點(diǎn)。
附圖簡(jiǎn)介

圖1是根據(jù)本發(fā)明的兩相體系的示意圖，該兩相體系用于氧化顆粒表面上的烯丙基。
圖2是顆粒的示意圖，該顆粒具有中性的，即非官能的外層和由本發(fā)明方法制備的配體-官能化的內(nèi)部或內(nèi)層。
發(fā)明詳述本發(fā)明的第一方面是一種色譜分離基質(zhì)的生產(chǎn)方法，其中在兩相體系中制備包含具有不同性質(zhì)的兩層的多孔聚合物顆粒，包括(a)提供至少一種多孔聚合物顆粒，在該顆粒的孔表面和外表面上存在反應(yīng)性基團(tuán)；(b)用第一種溶劑洗滌所述的顆粒并瀝干顆粒，從而密封第一相；(c)通過加入基本上不溶于第一種溶劑的第二種溶劑來(lái)潤(rùn)濕密封的顆粒外層，獲得在外層中的第二相；(d)通過加入一種基本上在第一種溶劑中是非反應(yīng)活性的試劑，使外層上的反應(yīng)性基團(tuán)反應(yīng)；和(e)使色譜結(jié)合基團(tuán)偶聯(lián)到內(nèi)層的反應(yīng)性基團(tuán)上。
在本文中，在步驟(b)密封的顆粒部分被命名為該顆粒的“內(nèi)層”，而“外層”是指該顆粒的剩余部分。當(dāng)在本文中討論到外層表面時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解為包括了外表面以及其孔體系的表面。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，反應(yīng)性基團(tuán)是碳-碳雙鍵，例如烯丙基、乙烯基等，在該種情況下，所述試劑可以是氧化劑。但是，可以設(shè)想的其它反應(yīng)性基團(tuán)是羥基、氨基、羧基、巰基等。
實(shí)施步驟(b)中的瀝干是為了除去足夠量的第一種溶劑，使得第二種溶劑可潤(rùn)濕該顆粒。如果需要，可以重復(fù)進(jìn)行步驟(c)的潤(rùn)濕。步驟(d)的反應(yīng)產(chǎn)生了一個(gè)外層，該外層的表面可不帶電荷或帶電荷，這將在下面進(jìn)行更詳細(xì)的討論。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明方法還包括在步驟(d)之后洗滌顆粒的步驟，從而產(chǎn)生一個(gè)可在其中進(jìn)行結(jié)合基團(tuán)的常規(guī)連接的相。在本文中，應(yīng)理解的是第一種和第二種溶劑應(yīng)充分地不相互溶解，以阻止步驟(d)中使用的試劑在未加入該試劑的相中反應(yīng)。
在一個(gè)有利的實(shí)施方案中，該顆粒由包含側(cè)鏈羥基(-OH)的聚合物如瓊脂糖制成。根據(jù)眾所周知的方法，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可容易地制備出多孔的且化學(xué)交聯(lián)的瓊脂糖顆粒。但是，另選地，可使用其它的材料，例如二氧化硅、苯乙烯、二乙烯基苯等。正如本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到的，如果使用了合成聚合物如上述最后提到的兩種，則會(huì)需要使顆粒表面具有親水性的步驟，例如通過常規(guī)方法添加OH-基。
另外，使用商業(yè)產(chǎn)品，例如StreamlineTMA 300或SepharoseTM6FF(它們均來(lái)自阿默森生物科學(xué)有限公司，烏普薩拉，瑞典)作為起始原料。
天然聚合物如瓊脂糖的烯丙基化在本領(lǐng)域中是眾所周知的，并且可由本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員容易地實(shí)施。在本發(fā)明方法的有利實(shí)施方案中，通過使羥基與烯丙基縮水甘油醚(AGE)反應(yīng)而獲得烯丙基化。該實(shí)施方案將在下面的實(shí)驗(yàn)部分介紹。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑在水相中是反應(yīng)性的。該實(shí)施方案中的一種有利的試劑是氧化劑高錳酸鉀(KMnO4)，但是另選地，可使用其它的氧化劑，例如氫化硼、氧化鉻、四氧化鋨、氧化硒。
在另選的實(shí)施方案中，所述試劑在有機(jī)相中是反應(yīng)性的。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可選擇一種適合的試劑，例如上述提到的，但這需要對(duì)該溶液進(jìn)行改性。例如，可以通過KMnO4的鉀離子與冠醚絡(luò)合或用季銨或磷鎓離子替代該鉀離子，在非極性溶劑例如苯和二氯甲烷中通過KMnO4進(jìn)行相轉(zhuǎn)移輔助的烯丙基的氧化反應(yīng)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(b)中密封的第一種溶劑是有機(jī)溶劑。該有機(jī)溶劑可以是甲苯、己烷、二氯甲烷或任何其它公知的不溶于或基本上不溶于水相的有機(jī)溶劑。在該實(shí)施方案中，優(yōu)選地，用醇例如乙醇洗滌烯丙基化的顆粒，然后瀝干，例如在玻璃過濾器上瀝干。由此，在該實(shí)施方案中，通過將該顆粒加入含水溶液中來(lái)實(shí)施步驟(c)的潤(rùn)濕。
在另選的實(shí)施方案中，在步驟(b)中密封的第一種溶劑是含水溶劑，例如水溶液。由此，在該實(shí)施方案中，通過將該顆粒加入如上舉例的有機(jī)溶劑中來(lái)實(shí)施步驟(c)的潤(rùn)濕。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，水相包含乳化劑，例如DextranTMT500(阿默森生物科學(xué)有限公司，烏普薩拉，瑞典)。正如本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到的，該乳化劑的作用是從外層中除去甲苯。由此，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，對(duì)于每種情況應(yīng)小心地決定乳化劑的量，這是由于除去的甲苯以及乳化劑的量會(huì)間接地決定外層的厚度。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，乳化劑在水中的濃度為約10％。
在具體的實(shí)施方案中，最多原始存在于該顆粒中的反應(yīng)性基團(tuán)總數(shù)的約30％在步驟(d)中進(jìn)行了反應(yīng)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，反應(yīng)性基團(tuán)的3-20％如4-10％進(jìn)行了反應(yīng)。該外層可以被認(rèn)為是一種罩子，它圍繞著具有常規(guī)組成的色譜顆粒，因此“罩珠(lid beads)”這一名稱有時(shí)用來(lái)表示這類顆粒。通常，對(duì)于大小約160μm的顆粒，第二層，即由本發(fā)明方法制得的該罩子大約有3μm。
根據(jù)任何適合的熟知的技術(shù)，可容易地完成步驟(e)-使色譜結(jié)合基團(tuán)偶聯(lián)到存在于該顆粒內(nèi)層上的反應(yīng)性基團(tuán)上。如上所述，如果第一種溶劑是有機(jī)溶劑，則在步驟(e)之前，要洗滌該顆粒，例如用含水乙醇和水的溶液洗滌，從而為偶聯(lián)提供一個(gè)含水的環(huán)境。
通常要進(jìn)行活化，即引入官能化所必需的其它反應(yīng)性基團(tuán)。常見的活化試劑可選自親電試劑、親核試劑和經(jīng)自由基化學(xué)活化的試劑。(參見例如WO 98/39364，對(duì)各種可利用的活化體系的更詳細(xì)的綜述。)在反應(yīng)性基團(tuán)是烯丙基的實(shí)施方案中，根據(jù)步驟(e)的偶聯(lián)可以通過自由基活化來(lái)進(jìn)行。在一個(gè)有利的實(shí)施方案中，所述活化使用溴進(jìn)行，這將在下面的實(shí)驗(yàn)部分示例說(shuō)明。
偶聯(lián)在活化的內(nèi)孔體系表面上的結(jié)合基團(tuán)可以是色譜中常規(guī)用作配體的任何公知的基團(tuán)，例如親和基團(tuán)、疏水性相互作用基團(tuán)、離子交換基團(tuán)如帶負(fù)電荷的陽(yáng)離子交換基團(tuán)或帶正電荷的陰離子交換基團(tuán)等。因而，在本文中，術(shù)語(yǔ)“結(jié)合”是指任何一種吸附或偶聯(lián)。由此，在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案中，該結(jié)合基團(tuán)是離子交換基團(tuán)。在具體的實(shí)施方案中，該陰離子交換劑是二乙胺(ANX)或乙二胺(EDA)，如下面的實(shí)驗(yàn)部分中的示例說(shuō)明。
如上所述，步驟(d)中的反應(yīng)產(chǎn)生了一個(gè)外層，該外層存在一個(gè)可不帶電荷或帶電荷的表面。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員將容易地選擇合適的起始原料和試劑，以在該表面上提供所需的性質(zhì)。例如，如果反應(yīng)性基團(tuán)是烯丙基，那么可在該外層的表面提供羧基(-COOH)和/或羥基(-OH)。眾所周知，存在許多將結(jié)合基團(tuán)偶聯(lián)于OH基上的常規(guī)方法。包含COOH基的表面將帶有弱負(fù)電荷。另外，如果需要進(jìn)一步改性表面的話，則結(jié)合基團(tuán)還可以與COOH基連接。
因而，本發(fā)明的另一方面是一種生產(chǎn)二官能的或雙官能的色譜分離基質(zhì)的方法，該方法是如上所定義的方法加上改性外層上的基團(tuán)和/或?qū)⑸V結(jié)合基團(tuán)偶聯(lián)在外層上的另一步驟。在最有利的實(shí)施方案中，外層上的基團(tuán)具有與色譜方法中不希望的化合物相同的電荷，例如帶負(fù)電荷的基團(tuán)，從而在從細(xì)胞裂解物中分離蛋白質(zhì)的方法中排斥細(xì)胞和細(xì)胞碎片。
本發(fā)明的第二方面是一種適合用作色譜分離基質(zhì)的多孔聚合物顆粒，該顆粒包含具有不同性質(zhì)的兩層，其中整個(gè)顆粒是由一種材料制成的。在具體的實(shí)施方案中，該顆粒存在一個(gè)中性的、即不帶電荷或非官能的外層。由此，該實(shí)施方案不同于上述討論的WO 98/39094中描述的顆粒，這是由于本發(fā)明的顆粒不存在不同于該顆粒材料的聚合物涂層。由于在上述討論的WO 98/39364中描述的方法得到的顆粒的表面不是中性的，所以本發(fā)明的顆粒也不同于從上述WO 98/39364中的方法得到的顆粒。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的顆粒是根據(jù)上述方法生產(chǎn)的。
本發(fā)明的第三方面是將所需化合物與溶液中的其它組分分離的方法，這是一種色譜分離方法，其中使用了根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的基質(zhì)或包含本發(fā)明顆粒的基質(zhì)。
在一個(gè)有利的實(shí)施方案中，所述方法是膨脹床吸附法(EBA)。在本文中，應(yīng)理解的是該方法可以另選地是另一種非填充床，例如攪拌的懸浮液，它基于與膨脹床吸附法相似的原理。
在最有利的實(shí)施方案中，所需的化合物是蛋白質(zhì)并且所述的溶液是細(xì)胞裂解液。在該實(shí)施方案中，外層或罩子會(huì)阻止細(xì)胞吸附到該顆粒上。
在本發(fā)明方法的具體實(shí)施方案中，基質(zhì)是陰離子交換劑。由于需要將陽(yáng)離子交換劑的帶負(fù)電荷的結(jié)合基團(tuán)與帶負(fù)電荷的細(xì)胞和細(xì)胞碎片隔離，這一實(shí)施方案變得尤其有利。
本發(fā)明的最后一個(gè)方面是由本發(fā)明方法生產(chǎn)的基質(zhì)或包含上述顆粒的基質(zhì)在膨脹床吸附法中的用途。
附圖的詳細(xì)描述圖1是根據(jù)本發(fā)明的兩相體系的示意圖，該兩相體系用于氧化顆粒表面上的烯丙基。更具體地，具有包含甲苯的第一內(nèi)相和被氧化的表面的烯丙基化的顆粒顯示于包含DextranTMT500(阿默森生物科學(xué)有限公司，烏普薩拉，瑞典)、KMnO4、NaOH和H2O2的水相中。
圖2是顆粒的示意圖，該顆粒具有中性的，即非官能的外表面和由本發(fā)明方法制備的配體-官能化的內(nèi)部或內(nèi)層。外層包含-COOH和/或-OH基，而內(nèi)層可包含任何配體，例如乙二胺(EDA)、二乙胺(ANX)等。
實(shí)驗(yàn)部分下面將通過實(shí)施例的方式描述本發(fā)明。但是，僅是出于說(shuō)明的目的提供了本發(fā)明的實(shí)施例，它們不應(yīng)被理解為限定了由所附的權(quán)利要求書限定的本發(fā)明。下面以及本說(shuō)明書的其它部分給出的所有參考文獻(xiàn)均包括在本文中作為參考。
實(shí)施例1用烯丙基縮水甘油醚(AGE)烯丙基化StreamlineTMA 300的通用程序在常規(guī)的合成中，將NaOH(50％)(200g)水溶液、NaBH4(0.2g)和Na2SO4(8g)加入裝備有機(jī)械攪拌器的1L三頸圓底燒瓶中。將StreamlineTMA 300凝膠(阿默森生物科學(xué)有限公司，烏普薩拉，瑞典)(200g)用蒸餾水洗滌并在玻璃過濾器上瀝干。隨后在攪拌下將該膠珠加入三頸圓底燒瓶中；將反應(yīng)混合物加熱到50℃，并在該溫度下連續(xù)攪拌1小時(shí)。然后將烯丙基縮水甘油醚(AGE)(300mL)加入到該反應(yīng)混合物中，并在50℃下連續(xù)攪拌18小時(shí)。然后將反應(yīng)混合物冷卻到室溫并通過加入濃醋酸使pH達(dá)到6-7。然后在玻璃過濾器上過濾該凝膠，并依次用蒸餾水(5*200mL)、EtOH(99.5％)(5*200mL)以及最后用蒸餾水(5*200mL)洗滌凝膠。通過首先將1mL烯丙基化的膠珠與溴反應(yīng)，然后用硝酸銀滴定所得的膠珠來(lái)測(cè)定烯丙基的含量。一般地，烯丙基的含量在200μmol/mL凝膠至250μmol/mL凝膠的范圍內(nèi)。
實(shí)施例2實(shí)施例1中制備的膠珠的部分氧化的通用程序在玻璃過濾器上，首先用EtOH(99.5％)(4*50mL)洗滌烯丙基化的StreamlineTMA 300(阿默森生物科學(xué)有限公司，烏普薩拉，瑞典)(50mL)，然后用甲苯(99％)(4*50mL)洗滌。在最后用甲苯洗滌后，將膠珠部分瀝干。將蒸餾水(100mL)和Dextran T500(阿默森生物科學(xué)有限公司，烏普薩拉，瑞典)溶液(10％，水中，100mL)加入1L三頸圓底燒瓶中。機(jī)械攪拌該溶液。將部分瀝干的凝膠加入到該燒瓶中，并向該燒瓶中加入蒸餾水(50mL)和Dextran T500溶液(10％，水中，50mL)。得到顆粒在溶液中的均勻懸浮液，并且連續(xù)攪拌15分鐘。在連續(xù)攪拌下將高錳酸鉀(KMnO4)(0.81g，5.12mmol，初始烯丙基的0.5倍當(dāng)量)加入該燒瓶中。反應(yīng)混合物變成紫色并且使反應(yīng)進(jìn)行15分鐘。然后將NaOH(50％，水中，20mL)加入該燒瓶中，并且該反應(yīng)混合物同時(shí)變?yōu)樽厣?，這提示形成了高錳酸鹽二氧化物聚集體。在室溫下反應(yīng)1小時(shí)。然后將濃醋酸(大約10mL)加入混合物中直至pH值等于5。將H2O2水溶液(30％，水中)(2mL)小心地加入該混合物中，混合物變?yōu)榛野咨Ｈ缓笤诓Ａн^濾器上過濾該凝膠，并用蒸餾水(5*50mL)、EtOH(99.5％)(5*50mL)以及最后用蒸餾水(5*50mL)洗滌凝膠。根據(jù)實(shí)施例1中描述的方法測(cè)定烯丙基的含量。一般地，與初始的烯丙基含量相比，烯丙基的含量下降了5-20％(表1)。
實(shí)施例3實(shí)施例2中制備的膠珠的溴化的通用程序部分氧化的StreamlineTMA 300(阿默森生物科學(xué)有限公司，烏普薩拉，瑞典)的殘余烯丙基的溴化進(jìn)行如下。在裝備有機(jī)械攪拌器的250mL三頸圓底燒瓶中，將醋酸鈉(0.1g)溶于蒸餾水(10mL)中。然后將部分氧化的凝膠(40mL，瀝干的)和蒸餾水(40mL)加入該燒瓶中，在室溫下快速攪拌該混合物15分鐘。然后將溴逐滴加入反應(yīng)容器中直到獲得持久的黃色為止(大約2mLBr2)。連續(xù)攪拌15分鐘。然后加入甲酸鈉直到黃色消失。隨后在玻璃過濾器上用蒸餾水(5*50mL)洗滌該凝膠。該溴化的凝膠被直接用于加工成陰離子交換劑。
實(shí)施例4加工成陰離子交換劑的通用程序?qū)嵤├?-1二乙胺(ANX)的偶聯(lián) 通常，將實(shí)施例3制備的溴化凝膠(50mL，瀝干)、二乙胺(20mL)和蒸餾水(20mL)加入一個(gè)500mL的三頸圓底燒瓶中，并在室溫下機(jī)械攪拌該混合物約15分鐘。然后用濃HCl將pH調(diào)到11.5。再將NaBH4(0.13g)加入燒瓶中，在室溫下反應(yīng)18小時(shí)。然后通過加入濃醋酸終止該反應(yīng)。最后，在玻璃過濾器上用蒸餾水(10*50mL)洗滌該凝膠。一般地，該ANX凝膠離子交換劑的產(chǎn)量在78μmol/mL凝膠至141μmol/mL凝膠的范圍內(nèi)。
實(shí)施例4-2乙二胺(EDA)的偶聯(lián) 通常，將實(shí)施例3制備的溴化凝膠(50mL，瀝干的)、乙二胺(75mL)和蒸餾水(30mL)加入一個(gè)500mL的三頸圓底燒瓶中，并在室溫下機(jī)械攪拌該混合物約15分鐘。然后在60℃下攪拌反應(yīng)18小時(shí)。將反應(yīng)混合物冷卻到室溫，并且在燒瓶放置于冰浴中的情況下用濃醋酸中和該反應(yīng)混合物。最后，在玻璃過濾器上用蒸餾水(10*50mL)洗滌該凝膠。一般地，該EDA凝膠離子交換劑的產(chǎn)量在166μmol/mL凝膠至224μmol/mL凝膠的范圍內(nèi)。
表1

實(shí)施例5細(xì)胞吸附測(cè)試在不同樣品上實(shí)施了細(xì)胞吸附測(cè)試。其結(jié)果記錄在表2中。該結(jié)果是以不同NaCl濃度下的流通部分(FT)中和洗脫部分(E)中的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)給出的。稱為REF.ANX和REF.EDA的凝膠相當(dāng)于根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法制備的凝膠，該標(biāo)準(zhǔn)方法包括烯丙基化StreamlineTMA 300(阿默森生物科學(xué)有限公司，烏普薩拉，瑞典)、溴化和連接相應(yīng)的陰離子交換劑，即是按照上述原理但不用部分氧化外層。
表2

權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)色譜分離基質(zhì)的方法，其中在兩相體系中制備包含具有不同性質(zhì)的兩層的多孔聚合物顆粒，包括(a)提供至少一種多孔的聚合物顆粒，在該顆粒的孔表面和外表面上存在反應(yīng)性基團(tuán)；(b)用第一種溶劑洗滌所述顆粒并瀝干顆粒，從而密封第一相；(c)通過加入基本上不溶于第一種溶劑的第二種溶劑潤(rùn)濕密封的顆粒外層，獲得在外層的第二相；(d)通過加入一種基本上在第一種溶劑中是非反應(yīng)活性的試劑，使外層上的反應(yīng)性基團(tuán)反應(yīng)；和(e)使色譜結(jié)合基團(tuán)偶聯(lián)到內(nèi)層中的反應(yīng)性基團(tuán)上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的反應(yīng)性基團(tuán)是碳-碳雙鍵。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述顆粒由包含側(cè)鏈羥基的聚合物如瓊脂糖制成。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中步驟(a)中顆粒是通過用烯丙基縮水甘油醚(AGE)烯丙基化所述羥基而得到反應(yīng)性的烯丙基而獲得的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)的方法，其中步驟(d)中加入的試劑是在水相中具有反應(yīng)性的氧化劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)的方法，其中步驟(d)中加入的試劑是在有機(jī)相中具有反應(yīng)性的氧化劑。
7.根據(jù)上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的方法，其中密封在所述顆粒中的第一種溶劑是有機(jī)溶劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)的方法，其中密封在所述顆粒中的第一種溶劑是水溶液。
9.根據(jù)上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的方法，其中所述的水溶液包含乳化劑。
10.根據(jù)上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的方法，其中在原始存在于所述顆粒中的反應(yīng)性基團(tuán)總數(shù)中至多約30％在步驟(b)中進(jìn)行了反應(yīng)。
11.根據(jù)上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的方法，其中根據(jù)步驟(e)的偶聯(lián)是通過烯丙基的自由基活化，從而允許偶聯(lián)結(jié)合基團(tuán)而進(jìn)行的。
12.根據(jù)上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的方法，其中步驟(e)中的結(jié)合基團(tuán)是離子交換基團(tuán)。
13.一種生產(chǎn)雙官能的色譜分離基質(zhì)的方法，該方法包括根據(jù)上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的方法，和改性外層上的基團(tuán)以及將色譜結(jié)合基團(tuán)偶聯(lián)在外層上的另一個(gè)步驟。
14.一種適于用作色譜分離基質(zhì)的多孔聚合物顆粒，其包含具有不同性質(zhì)的兩層，其中整個(gè)顆粒是由一種材料制成的，并且該顆粒存在一個(gè)非官能化的外層。
15.一種適于用作色譜分離基質(zhì)的多孔聚合物顆粒，其包含具有不同性質(zhì)的兩層，并且它是根據(jù)權(quán)利要求1-13中的任意一項(xiàng)制備的。
16.一種將所需化合物與溶液中的其它組分分離的方法，它是一種色譜分離方法，其中使用了根據(jù)權(quán)利要求1-13中任意一項(xiàng)生產(chǎn)的基質(zhì)或包含根據(jù)權(quán)利要求14或15的顆粒的基質(zhì)。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，它是膨脹床吸附(EBA)方法。
18.根據(jù)權(quán)利要求16或17的方法，其中所需的化合物是蛋白質(zhì)并且所述溶液是細(xì)胞裂解液。
19.根據(jù)權(quán)利要求16-18中任意一項(xiàng)的方法，其中所述的色譜分離基質(zhì)是陰離子交換劑。
20.由根據(jù)權(quán)利要求1-13中任意一項(xiàng)的方法生產(chǎn)的色譜分離基質(zhì)或包含根據(jù)權(quán)利要求14或15的顆粒的基質(zhì)在膨脹床吸附法中的用途。
全文摘要
本發(fā)明是一種生產(chǎn)色譜分離基質(zhì)的方法，其中在兩相體系中制備包含具有不同性質(zhì)的兩層的多孔聚合物顆粒，包括(a)提供表面上具有反應(yīng)性基團(tuán)的多孔聚合物顆粒；(b)用第一種溶劑洗滌所述顆粒并瀝干顆粒，從而密封第一相；(c)通過加入基本上不溶于第一種溶劑的第二種溶劑來(lái)潤(rùn)濕密封的顆粒外層；(d)通過加入一種基本上在第一種溶劑中是非反應(yīng)活性的試劑，使外層上的反應(yīng)性基團(tuán)反應(yīng)；和(e)使色譜結(jié)合基團(tuán)偶聯(lián)到內(nèi)層的反應(yīng)性基團(tuán)上。本發(fā)明還包含適合用作色譜分離基質(zhì)的多孔聚合物顆粒，以及一種分離方法，其中使用了根據(jù)本發(fā)明的基質(zhì)。
文檔編號(hào)G01N30/00GK1678903SQ03820292
公開日2005年10月5日 申請(qǐng)日期2003年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月27日
發(fā)明者H·貝里, P·布松, M·卡爾松 申請(qǐng)人:阿默森生物科學(xué)有限公司