專利名稱：鑒定對用抗ErbB2抗體處理響應(yīng)的腫瘤的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鑒定對用抗HER2抗體處理響應(yīng)的腫瘤的方法，以及治療患有這種腫瘤的患者的方法。
背景技術(shù)：
受體酪氨酸激酶的ErbB家族是細胞生長、分化和存活的重要介導(dǎo)物。受體家族包括四個獨特成員，包括表皮生長因子受體(EGFR或ErbB1)、HER2(ErbB2或p185neu)、HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4或tyro2)。
由erbB1基因編碼的EGFR已被暗示與人的惡性腫瘤發(fā)生相關(guān)。特別地，已經(jīng)在乳腺、膀胱、肺、頭部、頸和胃癌癥以及惡性膠質(zhì)瘤中觀察到EGFR表達升高。在通過自分泌刺激性路徑引起受體激活的同一腫瘤細胞中，EGFR受體表達升高通常與EGFR配基——轉(zhuǎn)化生長因子α(TGF-α)——的生成增多相關(guān)。Baselga和Mendelsohn Pharmac.Ther.，64127-154(1994)。此外，表皮生長因子受體相關(guān)蛋白(ERRP)已經(jīng)被描述，其中1583bp的cDNA片段克隆與小鼠EGFR和截短的大鼠EGFR具有90-95％的序列同源性(美國專利號6,399,743；和美國公開號2003/0096373)。針對EGFR或其配基，TGF-α和EGF的單克隆抗體已經(jīng)被評價為在治療這種惡性腫瘤中作為治療劑。參見，例如Baselga和Mendelsohn.，同上文；Masui et al.，CancerResearch，441002-1007(1984)；和Wu et al.，J Clin.Invest.，951897-1905(1995)。
ErbB家族的第二個成員p185neu最早被鑒定為來自化學(xué)處理的大鼠的成神經(jīng)細胞瘤的轉(zhuǎn)化基因的產(chǎn)物。Neu原癌基因的活化形式由所編碼蛋白的跨膜區(qū)域中的點突變(纈氨酸變?yōu)楣劝彼?而產(chǎn)生。在乳腺和卵巢癌中觀察到neu的人同系物(HER2)發(fā)生擴增，這與不理想的預(yù)后相關(guān)(Slamon et al.，Science，235177-182(1987)；Slamon et al，Science，244707-712(1989)；和美國專利號4,968,603)。迄今，還沒有報道在人的腫瘤中具有與neu原癌基因中的點突變類似的點突變。ErbB2的過度表達(常常，但不是一律由于基因擴增)也在其他癌癥中觀察到，包括胃癌、子宮內(nèi)膜癌、唾液腺癌、肺癌、腎癌、結(jié)腸癌、甲狀腺癌、胰腺癌和膀胱癌。參見，以及其它文獻，King etal.，Science，229974(1985)；Yokota et al.，Lancet，1765-767(1986)；Fukushigi etal.，Mol Cell Biol.，6955-958(1986)；Geurin et al.，Oncogene Res.，321-31(1988)；Cohen et al.，Oncogene，481-88(1989)；Yonemura et al.，CancerRes.，511034(1991)；Borst et al.，Gynecol.Oncol.，38364(1990)；Weiner et al.，Cancer Res.，50421-425(1990)；Kern et al.，Cancer Res.，505184(1990)；Parket al.，Cancer Res.，496605(1989)；Zhau et al.，Mol.Carcinog.，3354-357(1990)；Aasland et al.，Br.J.Cancer，57358-363(1988)；Williams et al.，Pathiobiology，5946-52(1991)；和McCann et al.，Cancer，6588-92(1990)。ErbB2可能在前列腺癌中過度表達(Gu et al.，Cancer Lett.，99185-9(1996)；Ross et al.，Hum.Pathol.，28827-33(1997)；Ross et al.，Cancer，792162-70(1997)；和Sadasivan et al.，J.Urol.，150126-31(1993))。ErbB2的過度表達可能會通過不依賴于配基地激活ErbB2或ErbB2同型二聚體，引起腫瘤生長。
針對大鼠p185neu和人ErbB2蛋白質(zhì)產(chǎn)物的抗體已經(jīng)被描述。Drebin及其同事已經(jīng)制備出抗大鼠neu基因產(chǎn)物p185neu的抗體。參見，例如Drebinet al.，Cell，41695-706(1985)；Myers et al.，Meth.Enzym.，198277-290(1991)；和W094/22478。Drebin et al.，Oncogene，2273-277(1988)報道，與p185neu的兩個不同區(qū)域反應(yīng)的抗體的混合物對被植入裸鼠的neu轉(zhuǎn)化的NIH-3T3細胞產(chǎn)生協(xié)同的抗腫瘤作用。還參見1998年10月20日授權(quán)的美國專利5,824,311。
Hudziak等，Mol.Cell.Biol.，931165-1172(1989)描述了一系列抗ErbB2抗體的制備，采用人乳腺腫瘤細胞系SK-BR-3對其進行鑒定。通過在72小時后對單細胞層進行結(jié)晶紫染色，測定了SK-BR-3細胞在暴露于抗體后的相對細胞增殖。采用這種測定法，用稱為4D5的抗體獲得最大抑制作用，其抑制了56％的細胞增殖。在該測定中，該系列的其他抗體在較小程度降低細胞增殖。還進一步發(fā)現(xiàn)抗體4D5能夠使過度表達ErbB2的乳腺腫瘤細胞系對TNF-α的細胞毒性作用變得敏感。還參見1997年10月14日授權(quán)的美國專利號5,677,171。在Hudziak et al中被討論的抗ErbB2抗體還在Fendlyet al.，Cancer Research，501550-1558(1990)；Kotts et al.，In Vitro，26(3)59A(1990)；Sarup et al.，Growth Regulation，172-82(1991)；Shepard et al.，JClin.Immunol.，11(3)117-127(1991)；Kumar et al.，Mol.Cell Biol.，11(2)979-986(1991)；Lewis et al.，Cancer Immunol.Immunother.，37255-263(1993)；Pietras et al.，Oncogene，91829-1838(1994)；Vitetta et al.，CancerResearch，545301-5309(1994)；Sliwkowski et al.，J.Biol.Chem.，269(20)14661-14665(1994)；Scott et al.，J.Biol.Chem.，26614300-5(1991)；D′souza etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.，917202-7206(1994)；Lewis et al.，Cancer Research，561457-1465(1996)；和Schaefer et al.，Oncogene，151385-1394(1997)中被進一步表征。
重組的人源化鼠抗ErbB2抗體4D5(huMAb4D5-8，rhuMAb HER2或HERCEPTIN；美國專利號5,821,337)在過度表達ErbB2的轉(zhuǎn)移性乳腺癌的患者中具有臨床活性，這些患者接受了廣泛的預(yù)先抗癌治療(Baselga et al.，J Clin Oncol.，14737-744(1996))。1998年9月25日HERCEPTIN獲得美國食品和藥品管理局的銷售許可，用于治療患有轉(zhuǎn)移性乳腺癌的患者，其腫瘤過度表達ErbB2蛋白。但是，并不是所有的過度表達ErbB2的腫瘤都對HERCEPTIN響應(yīng)。(Brockhoffet al.，Cytometry，44338-48(2001))。此外，臨床前的數(shù)據(jù)暗示，HERCEPTIN對于治療非小細胞肺癌(NSCLC)是治療上有效的。HER2蛋白在20-66％的被切除NSCLC腫瘤中過度表達，并且被證明在多個系列中預(yù)測不理想的患者結(jié)局(Azzoli，C.G.et al.，Semin.Oncol.，29(Suppl4)59-65(2002))。
其他具有各種性質(zhì)的抗ErbB2的抗體已經(jīng)被描述在Tagliabue et al.，Int.J.Cancer，47933-937(1991)；McKenzie et al.，Oncogene，4543-548(1989)；Maier et al.，Cancer Res.，515361-5369(1991)；Bacus et al.，MolecularCarciaogenesis，3350-362(1990)；Stancovski et al.，PNAS (USA)，888691-8695(1991)；Bacus et al.，Cancer Research，522580-2589(1992)；Xu et al.，Int.J.Cancer，53401-408(1993)；W094/00136；Kasprzyk et al.，CancerResearch，522771-2776(1992)；Hancock et al.，Cancer Res.，514575-4580(1991)；Shawver et al.，Cancer Res.，541367-1373(1994)；Arteaga et al.，Cancer Res.，543758-3765(1994)；Harwerth et al.，J.Biol.Chem.，26715160-15167(1992)；美國專利號5,783,186；和Klapper et al.，Oncogene，142099-2109(1997)中。單克隆抗體2C4在WO 01/00245中描述，在此引入作為參考。已經(jīng)證明2C4破壞HER2與其他ErbB受體家族成員發(fā)生二聚化(WO 01/00245)。
同源性篩選已經(jīng)鑒定了兩種其他的ErbB受體家族成員；ErbB3(美國專利號5,183,884和5,480,968，以及Kraus et al.，PNAS(USA)，869193-9197(1989))和ErbB4(歐洲專利申請?zhí)?99,274；Plowman et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，901746-1750(1993)；和Plowman et al.，Nature，366473-475(1993))。這兩種受體在至少某些乳腺癌細胞系中均表現(xiàn)為表達增加。
ErbB受體通常以各種組合的形式存在于細胞內(nèi)，并且一般認為異二聚化增加細胞對各種ErbB配基反應(yīng)的多樣性(Earp et al.，Breast CancerResearch and Treatment，35115-132(1995))。然而，這些受體聚集以及如何作用于信號傳遞的機制還未被充分了解(Brennan，P.J.et al.，Oncogene，196093-6101(2000))。EGFR被六個不同配基結(jié)合；表皮生長因子(EGF)，轉(zhuǎn)化生長因子α(TGF-α)，雙調(diào)蛋白，肝素結(jié)合表皮生長因子(HB-EGF)，β-動物纖維素(betacellulin)和上皮調(diào)節(jié)素(epiregulin)(Groenen et al.，GrowthFactors，11235-257(1994))。由對單個基因的可變剪接得到的heregulin蛋白家族是ErbB3和ErbB4的配基。Heregulin家族包括α、β和γheregulin(Holmes et al.，Science，2561205-1210(1992)，美國專利號5,641,869；和Schaefer et al.，Oncogene，151385-1394(1997))；neu分化因子(NDF)，神經(jīng)膠質(zhì)生長因子(GGFs)；乙酰膽堿受體誘導(dǎo)活性(acetylcholine receptor inducingactivity)(ARIA)；以及感覺和運動神經(jīng)元衍生因子(sensory and motor neuronderived factor)(SMDF)。綜述參見Groenen et al.，Growth Factors，11235-257(1994)；Lemke，G.，Molec.&Cell.Neurosci.，7247-262(1996)和Lee etal.，Pharm.Rev.，4751-85(1995)。最近，三種其他的ErbB配基被鑒定；神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-2(neuregulin-2)(NRG-2)，其被報道能結(jié)合ErbB3或ErbB4(Chang etal.，Nature，387509-512(1997)；和Carraway et al.，Nature，387512-516(1997))；神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-3(neuregulin-3)，其結(jié)合ErbB4(Zhang etal.，PNAS(USA)，94(18)9562-7(1997))；和神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-4(neuregulin-4)，其結(jié)合ErbB4(Harari et al.，Oncogene，182681-89(1999))HB-EGF、β-動物纖維素和上皮調(diào)節(jié)素也結(jié)合ErbB4。
雖然EGF和TGFα不結(jié)合ErbB2，但是EGF刺激EGFR和ErbB2形成異二聚體，該異二聚體激活EGFR并導(dǎo)致ErbB2在異二聚體中發(fā)生轉(zhuǎn)磷酸作用。二聚化和/或轉(zhuǎn)磷酸作用似乎能夠激活ErbB2酪氨酸激酶。參見Earpet al.，同上文。同樣地，heregulin不與ErbB2結(jié)合，但是當(dāng)ErbB3與ErbB2共表達時，形成一種活性信號傳遞復(fù)合物(Nagy et al.，Cytometry，32120-31(1998)。針對ErbB2的抗體能夠破壞這一復(fù)合物(Sliwkowski et al.，J.Biol.Chem.，269(20)14661-14665(1994))。ErbB3是酪氨酸激酶缺陷的，因此需要異二聚化，優(yōu)選與ErbB2異二聚化，來具備信號轉(zhuǎn)換能力。(Graus-Porta et al.，EMBO J.，161647-55(1995))。此外，當(dāng)與ErbB2共表達時，ErbB3對heregulin(HRG)的親合性增加至較高的親合狀態(tài)。還參見Levi et al.，Journal of Neuroscience，151329-1340(1995)；Morrissey et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，921431-1435(1995)和Lewis et al.，Cancer Res.，561457-1465(1996)對于ErbB2-ErbB3蛋白質(zhì)復(fù)合物的描述。實際上，ErbB2是EGFR和ErbB3的優(yōu)選異二聚化伴侶。(Graus-Porta et al.，同上文)。如同ErbB3一樣，ErbB4與ErbB2形成活性信號傳遞復(fù)合物(Carraway和Cantley，Cell，785-8(1994))。ErbB2與EGFR或ErbB3的配基依賴的異二聚化可能促進表達ErbB2的腫瘤的生長。
已經(jīng)在來自原發(fā)性乳腺癌患者的腫瘤樣本中和膀胱癌中研究了ErbB受體和heregulin的表達以及HER2的磷酸化狀況(Esteva et al.，Pathol.Oncol.Res.，7171-177(2001)；Chow et al.，Clin.Cancer Res.，71957-1962(2001))。Thor et al.，J.Clin.Oncology，183230-3239(2000)，和DiGiovanna et al.，Cancer Res.，626667-6673(2002)已經(jīng)報道了在乳腺癌中，通過Her2/neu的活躍信號傳遞與臨床病理和患者結(jié)局之間的相關(guān)性。
發(fā)明概述一個方面，本發(fā)明涉及鑒定對用抗HER2抗體處理有響應(yīng)的腫瘤的方法。優(yōu)選地，該抗HER2抗體阻斷包含HER2的ErbB異二聚體的配基激活。在一個實施方案中，該抗體是單克隆抗體2C4，更加優(yōu)選為rhuMAb 2C4。
獲得腫瘤樣本，并檢測該樣本中是否存在HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4蛋白質(zhì)復(fù)合物。當(dāng)檢測到這種復(fù)合物時，腫瘤被鑒定為對用抗HER2抗體的處理有響應(yīng)。
在一個實施方案中，通過用抗HER2抗體免疫沉淀任何含有HER2的蛋白質(zhì)復(fù)合物來檢測是否存在復(fù)合物。然后被免疫沉淀的復(fù)合物與選自由抗HER3抗體、抗HER1抗體和抗HER4抗體組成的組的抗體接觸，確定任何結(jié)合。如果確定抗HER3和/或抗HER1和/或抗HER4的抗體結(jié)合到被免疫沉淀的復(fù)合物上，即檢測到HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4復(fù)合物。
在另一個實施方案中，通過將腫瘤樣本與包含第一熒光團的抗HER2的抗體接觸來檢測是否存在HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4蛋白質(zhì)復(fù)合物。然后將腫瘤樣本與選自由抗HER3和/或抗HER1和/或抗HER4抗體組成的組的抗體接觸，其中所述抗體包含第二熒光團。然后測定熒光共振能量轉(zhuǎn)移來確定第一熒光團與第二熒光團是否十分接近。如果第一熒光團與第二熒光團被確定十分接近，則檢測到存在HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4蛋白質(zhì)復(fù)合物。
在還有另一個實施方案中，通過將腫瘤樣本與第一結(jié)合化合物接觸來檢測是否存在HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4蛋白質(zhì)復(fù)合物。第一結(jié)合化合物包含特異地結(jié)合HER2的第一靶向結(jié)合部分。第一靶向結(jié)合部分優(yōu)選是抗HER2抗體或抗體片段。第一結(jié)合化合物進一步包括通過可裂解接頭連接到第一個結(jié)合結(jié)構(gòu)域的可檢測部分。
將腫瘤樣本與第二結(jié)合化合物接觸。第二結(jié)合化合物優(yōu)選包含特異地結(jié)合HER3或HER1或HER4和優(yōu)選不結(jié)合HER2的第二靶向結(jié)合部分。在另一個實施方案中，第二結(jié)合化合物結(jié)合HER3或HER1，并且不結(jié)合HER2或HER4。在另一個實施方案中，第二靶向結(jié)合部分包含抗HER3或抗HER1或抗HER4的抗體或抗體片段。第二結(jié)合化合物被激活時能夠斷裂第一結(jié)合化合物的可裂解接頭，從而當(dāng)?shù)谝唤Y(jié)合化合物與第二結(jié)合化合物十分接近時產(chǎn)生游離的可檢測部分。當(dāng)鑒定到存在游離的可檢測部分時，確定存在HER2/HER3或HER2/HER1或HER2/HER4蛋白質(zhì)復(fù)合物。在一個實施方案中，通過毛細管電泳確定是否存在游離的可檢測部分。
在另一個實施方案中，第一結(jié)合化合物包含特異地結(jié)合HER1或HER3或HER4的第一靶向結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并且第二結(jié)合化合物包含特異地結(jié)合HER2的第二靶向結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
在還有一個實施方案中，通過評價ErbB受體磷酸化，例如通過免疫沉淀HER2蛋白質(zhì)，接著通過蛋白質(zhì)印跡免疫檢測磷酸酪氨酸，檢測HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4蛋白質(zhì)復(fù)合物，以及所引起的HER2活化。
用于分析是否存在HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4蛋白質(zhì)復(fù)合物的腫瘤樣本優(yōu)選從患有該腫瘤的患者中獲得。該樣本例如可以通過活組織檢查獲得。在另一個實施方案中，該樣本通過純化來自患者的循環(huán)的腫瘤細胞來獲得。在還有另一個實施方案中，該樣本在從患者身上摘除腫瘤的手術(shù)過程中獲得。
在另一個實施方案中，腫瘤樣本是從哺乳動物而不是最先發(fā)生該腫瘤的患者之外的哺乳動物中獲得。優(yōu)選地，該樣本得自小鼠或另一種嚙齒類動物。更加優(yōu)選地，該腫瘤是異種移植的腫瘤。該異種移植的腫瘤優(yōu)選通過將人的腫瘤碎片移植到小鼠或另一種嚙齒類動物來制備。
在一個實施方案中，腫瘤是肺腫瘤，更加優(yōu)選是非小細胞肺癌腫瘤。在另一個實施方案中，腫瘤是乳腺腫瘤。
在另一個方面，本發(fā)明涉及檢測對用抑制HER2與ErbB受體家族另一成員結(jié)合的抗體的處理有響應(yīng)的腫瘤細胞的方法，包括步驟(a)提供包含HER2陽性腫瘤細胞的生物學(xué)樣本；和(b)檢測生物學(xué)樣本中的ErbB受體的磷酸化，其中所述磷酸化表明腫瘤細胞對用抗體處理有響應(yīng)。在一個實施方案中，檢測ErbB2(HER2)受體的磷酸化。
如前所述，與HER2相關(guān)的其他成員是HER3、HER1和/或HER4，例如HER2和/或HER1。該方法還可以另外包含檢測是否存在HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4蛋白質(zhì)復(fù)合物的步驟，基本上如上所述。
在另一個方面，本發(fā)明還涉及用于預(yù)測被診斷具有HER2陽性腫瘤的受檢者對用抑制HER2與ErbB受體家族的另一個成員結(jié)合的抗體處理的反應(yīng)的方法，通過檢測在得自該受檢者的包含HER2陽性腫瘤細胞的生物樣本中HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成和/或ErbB受體的磷酸化。存在這種蛋白質(zhì)復(fù)合物和/或所述磷酸化表明個體可能對用抗體處理有響應(yīng)。在一個實施方案中，檢測到ErbB2(HER2)受體的磷酸化表明受檢者可能對用該抗體處理有響應(yīng)。
在還有另一個實施方案中，本發(fā)明涉及通過檢測受檢者的循環(huán)的腫瘤細胞中的ErbB受體的磷酸化，鑒定對用抗HER2抗體處理有響應(yīng)的受檢者。存在這種磷酸化表明受檢者可能對用抗HER2抗體的處理有響應(yīng)。在一個實施方案中，檢測ErbB2(HER2)磷酸化。在另一個實施方案中，受檢者是人。在還有另一個實施方案中，該方法還包含用抗HER2抗體治療受檢者，優(yōu)選使用rhuMAb 2C4。
在另一個方面，本發(fā)明提供一種制品，其包含含有結(jié)合HER2的抗體的容器和關(guān)于將該抗體施用給患有腫瘤的患者中的說明書。優(yōu)選地，該腫瘤已經(jīng)被確定包含HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4異二聚體。
在一個實施方案中，該容器含有阻斷包含HER2的ErbB異二聚體的配基活化的抗體。在另一個實施方案中，該容器含有單克隆抗體2C4，更加優(yōu)選為rhuMAb 2C4。
在還有一個方面，本發(fā)明提供治療患者的方法，包含給患者施用治療有效量的結(jié)合HER2的抗體。優(yōu)選地，該患者患有被確定包含HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4異二聚體的腫瘤。
在一個實施方案中，抗體阻斷包含HER2的ErbB異二聚體的配基活化。在另一個實施方案中，該抗體是單克隆抗體2C4，更加優(yōu)選為rhuMAb 2C4。
在另一個方面，本發(fā)明提供治療患者的方法，包含給患者施用治療有效量的結(jié)合HER2的抗體。優(yōu)選地，該患者患有被確定具有被磷酸化的ErbB受體的腫瘤。
在一個實施方案中，被磷酸化的ErbB受體是HER2。在另一個實施方案中，抗體阻斷包含HER2的ErbB異二聚體的配基活化。在另一個實施方案中，該抗體是單克隆抗體2C3，更加優(yōu)選為rhuMAb 2C4。
附圖簡介附

圖1A和1B描述鼠單克隆抗體2C4的輕鏈可變區(qū)(VL)(附圖1A)和重鏈可變區(qū)(VH)(附圖1B)結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列比對(分別為SEQ ID No.1和2)，2C4的人源化形式574的VL和VH結(jié)構(gòu)域(分別為SEQ ID No.3和4)以及人VL和VH的共有片段(humκ1，輕鏈κ亞群I；humIII，重鏈亞群III)(分別為SEQ ID No.5和6)。星號表示在2C4的人源化形式574和鼠單克隆抗體2C4之間或者在2C4的人源化形式574和人框架之間的差異?；パa決定區(qū)(CDR)在括號內(nèi)。
附圖2A和2B表示在表達低水平/正常水平ErbB2的MCF7細胞(附圖2A)和表達高水平的ErbB2的SK-BR-3細胞(附圖2B)中，單克隆抗體2C4、HERCEPTIN抗體或抗EGFR抗體對heregulin(HRG)依賴的ErbB2與ErbB3結(jié)合的影響；參見下面的實施例2。
附圖3是表明在來自非小細胞肺癌異種移植外植體的蛋白質(zhì)提取物中存在HER1/HER2和HER2/HER3異二聚體的免疫印跡。
附圖4是表明在來自非小細胞肺癌(NSCLC)異種移植外植體的蛋白質(zhì)提取物中存在HER2磷酸化的免疫印跡。
優(yōu)選實施方案的詳述本發(fā)明部分地基于對抗HER2抗體rhuMAb 2C4的響應(yīng)與腫瘤細胞中存在HER2/HER3和/或HER2/HER1和或HER2/HER4異二聚體、和/或ErbB受體磷酸化相關(guān)的試驗發(fā)現(xiàn)。因此，基于存在HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4異二聚體、和/或ErbB受體磷酸化，腫瘤可以被鑒定為對用抗HER2抗體的處理有響應(yīng)，特別是具有抗HER2抗體2C4的一種或多種生物學(xué)活性的抗HER2抗體。HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4異二聚體，和/或ErbB受體磷酸化可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法來鑒定。通過鑒定對用抗HER2的抗體處理響應(yīng)的特定腫瘤和腫瘤類型，可以鑒定將可能會從這種處理中最獲益的患者。此外，還可以鑒定可能無法從使用單克隆抗體2C4的治療中獲益的患者。
定義“ErbB受體”是受體蛋白酪氨酸激酶，其屬于ErbB受體家族，包括EGFR(ErbB1)、ERRP、ErbB2、ErbB3和ErbB4受體以及將來將被鑒定的該家族的其他成員。ErbB受體通常包含可能結(jié)合ErbB配基的細胞外結(jié)構(gòu)域；親脂性跨膜結(jié)構(gòu)域；保守的細胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域；和具有多個可以被磷酸化的酪氨酸殘基的羧基端信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。ErbB受體可以是“天然序列”的ErbB受體或其“氨基酸序列變體”。優(yōu)選地，ErbB受體是天然序列的人ErbB受體。因此，“ErbB受體家族成員”是EGFR(ErbB1)、ErbB2、ErbB3、ErbB4或任何其他目前已知或者將來將被鑒定的ErbB受體。優(yōu)選地，該成員是EGFR(ErbB1)、ErbB2、ErbB3、或ErbB4。
術(shù)語“ErbB1”、“表皮生長因子受體”、“EGFR”和“HER1”在此被互換使用，是指被公開在如Carpenter et al.，Ann.Rev.Biochem.，56881-914(1987)中的EGFR，包括其天然存在的突變形式(例如Humphrey et al.，PNAS(USA)，874207-4211(1990)中的缺失突變EGFR)。erbB1是指編碼EGFR蛋白產(chǎn)物的基因?？笻ER1的抗體被描述在例如Murthy et al.，Arch.Biochem.Biophys.，252549-560(1987)和WO 95/25167中。
術(shù)語“ERRP”、“EGF受體相關(guān)蛋白”、“EGFR相關(guān)蛋白”和“表皮生長因子受體相關(guān)蛋白”在此被互換使用，是指公開在例如美國專利號6,399,743和美國公開號2003/0096373中的ERRP。
表達法“ErbB2”和“HER2”在此被互換使用，是指在例如Semba et al.，PNAS(USA)，826497-6501(1985)和Yamamoto et al.，Nature，319230-234(1986)(Genebank登錄號X03363)中被描述的人HER2蛋白。術(shù)語“erbB2”是指編碼人ErbB2的基因，而“neu”是指編碼大鼠p185neu的基因。優(yōu)選的ErbB2是天然序列的人ErbB2。
“ErbB3”和“HER3”是指如在美國專利號5,183,884和5,480,968以及Kraus et al.，PNAS (USA)，869193-9197(1989)中公開的受體多肽?？笶rbB3的抗體在本領(lǐng)域是已知的，被描述在例如美國專利號5,183,884、5,480,968和WO97/35885中。
術(shù)語“ErbB4”和“HER4”在此是指在如歐洲專利申請?zhí)?99,274；Plowman et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，901746-1750(1993)和Plowman et al.，Nature，366473-475(1993)中所描述的受體多肽，包括其同種型，例如被公開在1999年4月22日公開的WO 99/19488中。抗HER4的抗體被描述在例如WO 02/18444中。
ErbB受體的抗體可以從許多地方購買得到，包括例如Santa CruzBiotechnology，Inc.，California，USA有限公司。
所用“ErbB配基”是指結(jié)合和/或激活ErbB受體的多肽。ErbB配基是天然序列的人ErbB配基，例如表皮生長因子(EGF)(Savage et al.，J.Biol.Chem.，2477612-7621(1972))；轉(zhuǎn)化生長因子α(TGF-α)(Marquardt et al.，Science，2231079-1082(1984))；雙調(diào)蛋白也稱作雪旺氏瘤(schwanoma)或角質(zhì)細胞自分泌生長因子(keratinocyte autocrine growth factor)(Shoyab et al.，Science，2431074-1076(1989)；Kimura et al.，Nature，348257-260(1990)；和Cook etal.，Mol.Cell.Biol.，112547-2557(1991))；β-動物纖維素(Shing et al.，Science，2591604-1607(1993)；和Sasada et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，1901173(1993))；肝素結(jié)合表皮生長因子(HB-EGF)(Higashiyama et al.，Science，251936-939(1991))；上皮調(diào)節(jié)素(Toyoda et al.，J.Biol.Chem.，2707495-7500(1995)；和Komurasaki et al.，Oncogene，152841-2848(1997))；heregulin(參見下面)；神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-2(NRG-2)(Carraway et al.，Nature，387512-516(1997))；神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-3(NRG-3)(Zhang et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，949562-9567(1997))；神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-4(NRG-4)(Harari et al.，Oncogene，182681-89(1999))或cripto(CR-1)(Kannan et al.，J.Biol.Chem.，272(6)3330-3335(1997))。結(jié)合EGFR的ErbB配基包括EGF、TGF-α、雙調(diào)蛋白、β-動物纖維素、HB-EGF和上皮調(diào)節(jié)素。結(jié)合ErbB3的ErbB配基包括heregulin。能夠結(jié)合ErbB4的ErbB配基包括β-動物纖維素、上皮調(diào)節(jié)素、HB-EGF、NRG-2、NRG-3、NRG-4和heregulin。ErbB配基還可以是合成的ErbB配基。合成的配基可以特異于特定的ErbB受體，或者能夠識別特定的ErbB受體復(fù)合物。合成配基的一個例子是合成的heregulin/egf嵌合雙調(diào)素(biregulin)(參見，例如Jones et al.，F(xiàn)EBS Letters，447227-231(1999)，在此引入作為參考)。
在此所用的“Heregulin”(HRG)是指由在美國專利號5,641,869或Marchionni et al.，Nature，362312-318(1993)中公開的heregulin基因產(chǎn)物所編碼的多肽。Heregulin的例子包括heregulin-α、heregulin-β1、heregulin-β2和heregulin-β3(Holmes et al.，Science，2561205-1210(1992)；和美國專利號5,641,869)；neu分化因子(NDF)(Peles et al.，Cell，69205-216(1992))；乙酰膽堿受體誘導(dǎo)活性(ARIA)(Falls et al.，Cell，72801-815(1993))；神經(jīng)膠質(zhì)生長因子(GGF)(Marchionni et al.，Nature，362312-318(1993))；感覺和運動神經(jīng)元衍生因子(SMDF)(Ho et al.，J.Biol.Chem.，27014523-14532(1995))；γ-heregulin(Schaefer et al.，Oncogene，151385-1394(1997))。該術(shù)語包括天然序列的HRG多肽的生物學(xué)活性片段和/或氨基酸序列變體，例如其EGF樣結(jié)構(gòu)域片段(例如，HRGβ1177-244)。
“ErbB異低聚物”在此是包含至少兩種不同ErbB受體的非共價結(jié)合的低聚體?！癊rbB二聚體”是包含兩種不同ErbB受體的非共價結(jié)合的低聚體。當(dāng)表達兩種或更多種ErbB受體的細胞被暴露于ErbB配基時，形成這種復(fù)合物。ErbB低聚體，例如ErbB二聚體，可以通過免疫沉淀來分離并通過例如在Sliwkowski et al.，J.Biol.Chem.，269(20)14661-14665(1994)中描述的SDS-PAGE來分析。這種ErbB異低聚體的例子包括EGFR-ErbB2(也稱作為HER1/HER2)，ErbB2-ErbB3(HER2/HER3)和ErbB3-ErbB4(HER3/HER4)復(fù)合物。此外，ErbB異低聚體可以包含兩個或更多個與不同ErbB受體例如ErbB3、ErbB4或EGFR(ErbB1)結(jié)合的ErbB2受體。其他蛋白質(zhì)，例如細胞因子受體亞單位(例如gpl30)可以被包括在異低聚體中。
“ErbB受體的配基活化”是指受結(jié)合到包含目的ErbB受體的ErbB異低聚體上的ErbB配基調(diào)節(jié)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(例如由ErbB受體的細胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域磷酸化ErbB受體或底物多肽中的酪氨酸殘基所引起的)。一般地，這涉及ErbB配基結(jié)合到ErbB異低聚體上，激活異低聚體中的一個或多個ErbB受體的激酶結(jié)構(gòu)域，從而導(dǎo)致一個或多個ErbB受體的中的酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化和/或在額外的底物多肽中的酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化。可以采用各種酪氨酸磷酸化分析來量化ErbB受體活化。
“天然序列”多肽是具有與來自自然界的多肽(例如ErbB受體或ErbB配基)相同的氨基酸序列的多肽。這種天然序列多肽可以從自然界中分離或者可以通過重組或合成方法制備。因此，天然序列的多肽具有天然發(fā)生的人多肽、鼠多肽或來自任何其他哺乳動物物種的多肽的氨基酸序列。
術(shù)語“氨基酸序列變體”是指具有在一定程度上與天然序列多肽有區(qū)別的氨基酸序列的多肽。通常，氨基酸序列變體將與天然ErbB配基的至少一個受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或者與天然ErbB受體的至少一個配基結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有至少約70％同源性，和優(yōu)選地至少約80％，更加優(yōu)選地，與這種受體或配基結(jié)合結(jié)構(gòu)域至少約90％同源。氨基酸序列變體在天然氨基酸序列的氨基酸序列中的某些位點上具有取代、缺失和/或插入。
“同源性”被定義為在必要時進行序列比對和引入缺口以獲取最大的百分比同一性后氨基酸序列變體中的相同殘基的百分比。用于比對的方法和計算機程序在本領(lǐng)域是已熟知的。一種這種計算機程序是“Align 2”，由Genentech，Inc.創(chuàng)作，已經(jīng)在1991年12月10日在華盛頓，DC 20559，美國版權(quán)局與用戶文檔(user documentation)一起提交。
術(shù)語“抗體”在此以最廣泛的意義被使用，特別地涵蓋完整的單克隆抗體、多克隆抗體、由至少兩種完整抗體形成的多重特異性抗體(例如雙特異性抗體)，和抗體片段，只要其具有期望的生物學(xué)活性。
如在此所用的術(shù)語“單克隆抗體”是指從基本上同型的抗體的群體中獲得的抗體，即包含群體的各個抗體除了以少量存在的可能天然發(fā)生的突變外，是相同的。單克隆抗體是高度特異的，針對單一的抗原位點。此外，與包含針對不同抗原決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制劑形成對比的是，各個單克隆抗體針對抗原上的單一抗原決定簇。除了其特異性外，單克隆抗體的優(yōu)點在于可以不受其他抗體污染地被合成。修飾語“單克隆”表示從基本上同型的抗體群體中獲得的抗體的特征，而不被解釋為需要通過任何特定方法來生產(chǎn)抗體。例如，根據(jù)本發(fā)明將被使用的單克隆抗體可以通過最早由Kohler et al.，Nature，256495(1975)所描述的雜交瘤方法來制備，或者通過重組DNA方法(參見例如美國專利號4,816,567)來制備。還可以采用在例如Clackson et al.，Nature，352624-628(1991)和Marks et al.，J.Mol.Biol.，222581-597(1991)中描述的技術(shù)從噬菌體抗體文庫中分離“單克隆抗體”。
單克隆抗體在此特別地包括“嵌合”抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與來自特定物種或者屬于特定的抗體種類或亞類的抗體的相應(yīng)序列相同或同源，而該鏈的剩余部分與來自另一物種或者屬于另一抗體種類或亞類的抗體的相應(yīng)序列相同或相似，以及這種抗體的片段，只要這些片段展示出期望的生物學(xué)活性(美國專利號4,816,567；和Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，816851-6855(1984))。在此的目的嵌合抗體包括含有衍生自非人靈長類(例如舊大陸猴(Old World Monkey)，猿等)的可變結(jié)構(gòu)域抗原結(jié)合序列和人的恒定區(qū)序列的“靈長類化”抗體。
“抗體片段”包含完整抗體的一部分，優(yōu)選包含其抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2、和Fv片段；微型雙功能抗體(diabodies)；線性抗體；單鏈抗體分子；和由抗體片段形成的多重特異性抗體。
“完整的”抗體是包含抗原結(jié)合可變區(qū)以及輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域(CL)和重鏈恒定結(jié)構(gòu)域CH1，CH2和CH3的抗體。恒定結(jié)構(gòu)域可以是天然序列的恒定結(jié)構(gòu)域(例如人天然序列的恒定結(jié)構(gòu)域)或其氨基酸序列變體。優(yōu)選地，完整的抗體具有一種或多種效應(yīng)子功能。
抗體的“效應(yīng)子功能”是指那些可歸結(jié)于抗體的Fc區(qū)域(天然序列的Fc區(qū)域或氨基酸序列變體的Fc區(qū)域)的生物學(xué)活性。抗體效應(yīng)子功能的例子包括Clq結(jié)合；補體依賴的細胞毒性；Fc受體結(jié)合；抗體依賴的細胞介導(dǎo)的細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體；BCR)的下調(diào)等。
根據(jù)重鏈的恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，完整抗體抗原被分成不同“種類”。有五個主要的完整抗體的種類IgA、IgD、IgE、IgG、和IgM，并且這些中的部分還抗原進一步分成“亞類”(同種型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、和IgA2。對應(yīng)于不同抗體種類的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域分別被稱為α、δ、ε、γ和μ。不同種類的免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是已熟知的。
“抗體依賴的細胞介導(dǎo)的細胞毒性”和“ADCC”是指一種細胞介導(dǎo)的反應(yīng)，其中表達Fc受體(FcR)的非特異性的細胞毒性細胞(例如天然殺傷(NK)細胞，嗜中性粒細胞和巨噬細胞)識別靶細胞上結(jié)合的抗體，并隨后引起靶細胞的溶解。用于介導(dǎo)ADCC的初級細胞NK細胞僅表達FcγRIII，而單核細胞表達FcγRI，F(xiàn)cγRII和FcγRIII。造血細胞上的FcR表達被總結(jié)在Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.，9457-92(1991)的第464頁的表3中。為了評價目的分子的ADCC活性，進行例如在美國專利號5,500,362或5,821,337中描述的體外ADCC分析?？捎糜谶@種分析的有用的效應(yīng)細胞包括外周血單核細胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細胞?？蛇x擇地或者另外地，可以在體內(nèi)評價目的分子的ADCC活性，例如在如Clynes et al.，PNAS(USA)，95652-656(1998)中披露的動物模型中。
“人的效應(yīng)細胞”是白細胞，其表達一種或多種FcR并且行使效應(yīng)子功能。優(yōu)選地，該細胞至少表達FcγRIII并且行使ADCC效應(yīng)子功能。介導(dǎo)ADCC的人白細胞的例子包括外周血單核細胞(PBMC)、天然殺傷(NK)細胞、單核細胞、細胞毒性T細胞和嗜中性粒細胞；而PBMC和NK細胞是優(yōu)選的。效應(yīng)子細胞可以從其天然來源中分離，例如如在此描述地來自血液或PBMC。
術(shù)語“Fc受體”或“FcR”用于描述一種結(jié)合到抗體的Fc區(qū)域的受體。優(yōu)選的FcR是人FcR的天然序列。此外優(yōu)選的FcR是結(jié)合IgG抗體的FcR(γ受體)，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亞類的受體，包括這些受體的等位基因變體和可變剪接形式。FcγRII受體包括FcγRII A(“活化受體”)和FcγRII B(“抑制受體”)，具有相似的氨基酸序列，主要區(qū)別在于其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域?；罨荏wFcγRII A在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中含有一個以免疫受體酪氨酸為基礎(chǔ)的活化基序(an immunoreceptor tyrosine-based activationmotif)(ITAM)。抑制受體FcγRII B在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中含有一個免疫受體酪氨酸為基礎(chǔ)的抑制基序(an immunoreceptor tyrosine-based inhibitionmotif)(ITIM)。(參見綜述，M.Daeron，Annu.Rev.Immunol.，15203-234(1997))。FcR在Ravetch和Kinet，Anne.Rev.Immunol.，9457-92(1991)；Capel et al.，，Immunomethods，425-34(1994)；和de Haas et al.，J.Lab.Clin.Med.，126330-41(1995)中被評述。其他的FcR，包括將來將被鑒定的那些，都被包含在此處的術(shù)語“FcR”中。該術(shù)語還包括新生兒的受體，F(xiàn)cRn，其負責(zé)將母體的IgG轉(zhuǎn)運到胎兒(Guyer et al.，J.Immunol.，117587(1976)和Kim et al.，J.ImmunoL，24249(1994))。
“補體依賴的細胞毒性”或者“CDC”是指存在補體時，分子溶解靶點的能力。補體活化路徑由補體系統(tǒng)的第一組分(Clq)結(jié)合到與關(guān)聯(lián)抗原復(fù)合的分子(例如，一種抗體)上起始。為了評價補體活化，可進行如在Gazzano-Santoro et al.，J.Immunol.Methods，202163(1996)中描述的CDC分析。
“天然抗體”通常是約150,000道爾頓的由兩條相同的輕鏈(L)和兩條相同的重鏈(H)組成的異四聚糖蛋白。每條輕鏈通過共價二硫鍵連接到重鏈上，而且二硫鍵的數(shù)量隨著不同免疫球蛋白同種型的重鏈而變化。每條重鏈和輕鏈還具有規(guī)則的間隔的鏈內(nèi)二硫鍵。每條重鏈在其一端具有可變結(jié)構(gòu)域(VH)，隨后是大量的恒定結(jié)構(gòu)域。每條輕鏈在其一端具有可變結(jié)構(gòu)域(VL)，并在另一端具有恒定結(jié)構(gòu)域。輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域?qū)?zhǔn)(align)重鏈的第一個恒定結(jié)構(gòu)域，而輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域?qū)?zhǔn)重鏈的可變結(jié)構(gòu)域。一般認為，特定的氨基酸殘基在輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域之間形成一個界面。
術(shù)語“可變的”是指可變結(jié)構(gòu)域的某些部分在抗體的序列中廣泛地變化，被用于每一特定抗體對其特定抗原的結(jié)合和特異性。但是，可變性不是均勻地分布在抗體的可變結(jié)構(gòu)域中。其集中在輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域上的稱為高變區(qū)(hypervariable region)的三個片段上。可變結(jié)構(gòu)域的更加高度保守部分稱作骨架區(qū)(framework region)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域每個都包含四個FR，大部分采用β片層構(gòu)型，由三個高變區(qū)連接，形成環(huán)狀連接，有時形成β片層結(jié)構(gòu)的一部分。各條鏈中的高變區(qū)通過FR被緊密地固定在一起，并與其他鏈的高變區(qū)一起導(dǎo)致抗體的抗原結(jié)合位點的形成(參見Kabat et al.，具有免疫學(xué)意義的蛋白質(zhì)的序列(Sequences of Proteins ofimmunological Interest)，第5版.Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD.(1991))。恒定結(jié)構(gòu)域不直接參與將抗體與抗原的結(jié)合，但是具有各種效應(yīng)子功能，例如參與抗體在抗體依賴的細胞毒性(ADCC)中的作用。
當(dāng)用于本文時，術(shù)語“高變區(qū)”是指負責(zé)抗原結(jié)合的抗體的氨基酸殘基。高變區(qū)通常包含來自“互補決定區(qū)”或“CDR”的氨基酸殘基(例如，輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的殘基24-34(L1)，50-56(L2)和89-97(L3)，以及重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的31-35(H1)，50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat et al.，具有免疫學(xué)意義的蛋白質(zhì)的序列，第5版.Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD.(1991))和/或來自“高變區(qū)環(huán)”(“hypervariable loop”)的那些殘基(例如輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的殘基26-32(L1)，50-52(L2)，91-96(L3)和重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的26-32(H1)，53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.，196901-917(1987))?！肮羌軈^(qū)”或“FR”殘基是那些如在此所定義的高變區(qū)殘基之外的可變結(jié)構(gòu)域殘基。
木瓜蛋白酶消化抗體生成兩種相同的抗原結(jié)合片段，稱作“Fab”片段，每個片段具有一個單一的抗原結(jié)合位點和殘余的“Fc”片段，其名稱反映其很容易結(jié)晶的能力。胃蛋白酶處理生成具有兩抗原結(jié)合位點的F(ab′)2片段，并且仍能夠與抗原交聯(lián)。
“Fv”是最小的抗體片段，其含有完整的抗原識別和抗原結(jié)合位點。該區(qū)域由以緊密和非共價連接的由一條重鏈和一個輕鏈可變結(jié)構(gòu)域組成的二聚體組成。是在這一構(gòu)型中，各個可變結(jié)構(gòu)域的三個高變區(qū)相互作用來確定VH-VL二聚體表面上的抗原結(jié)合位點?？偟膩碚f，六個超變區(qū)將抗原結(jié)合特異性賦予給抗體。但是，即使是單個可變結(jié)構(gòu)域(或者僅包含三個特異于抗原的高變區(qū)的Fv的一半)也具有識別和結(jié)合抗原的能力，雖然其親合性低于完整結(jié)合位點。
Fab片段還含有輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域以及重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域(CH1)。Fab′片段與Fab片段的不同在于在重鏈CH1結(jié)構(gòu)域的羧基端增加少數(shù)殘基，包括來自抗體鉸鏈區(qū)的一個或多個半胱氨酸。Fab′-SH在此是指恒定結(jié)構(gòu)域中的半胱氨酸殘基帶有至少一個游離巰基的Fab′。F(ab′)2抗體片段最初以一對之間具有鉸鏈半胱氨酸的Fab′片段生成?？贵w片段的其他化學(xué)偶聯(lián)也是已知的。
根據(jù)恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，來自任何脊椎動物物種的抗體的“輕鏈”被劃歸入兩種明顯區(qū)別的種類之一，稱作kappa(κ)和lambda(λ)。
“單鏈Fv”或“scFv”抗體片段包含抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域在單一的多肽鏈中存在。優(yōu)選地，F(xiàn)v多肽還包含VH和VL結(jié)構(gòu)域之間的多肽接頭，使scFv形成期望的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)。對scFv的綜述，參見Plückthun在The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，vol.113中的文章，Rosenburg和Moore編輯，Springer-Verlag，New York，269-315(1994)?？笶rbB2抗體的scFv片段被描述在WO 93/16185；美國專利號5,571,894；和美國專利號5,587,458中。
術(shù)語“微型雙功能抗體”是指具有兩個抗原結(jié)合位點的小抗體片段，該片段包含在同一多肽鏈(VH-VL)上連接到可變輕鏈結(jié)構(gòu)域(VL)的可變重鏈結(jié)構(gòu)域(VH)。通過使用接頭，該接頭非常之短，以致于無法使同一鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域配對，結(jié)構(gòu)域被迫與另一條鏈的互補結(jié)構(gòu)域配對，產(chǎn)生兩個抗原結(jié)合位點。微型雙功能抗體在例如EP404，097；WO 93/11161；和Hollinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，906444-6448(1993)中被更充分地描述。
非人(例如嚙齒類動物)抗體的“人源化”形式是含有來自非人類的免疫球蛋白的最短序列的嵌合抗體。人源化抗原的大部分是人的免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體的高變區(qū)的殘基被來自具有期望特異性、親合性和能力的非人類物種的高變區(qū)(供體抗體)的殘基替代，非人類物種例如小鼠、大鼠、兔或非人類的靈長類。在某些情況下，人免疫球蛋白的骨架區(qū)(FR)殘基被相應(yīng)的非人類的殘基替代。此外，人源化抗體可能包含不存在于受體抗體或供體抗體中的殘基。進行這些修飾來進一步改善抗體性能。一般地，人源化抗體將包含至少一個，和典型地兩個可變結(jié)構(gòu)域的基本上全部，其中對應(yīng)于非人類的免疫球蛋白的高變區(qū)環(huán)的全部或基本上全部和FR的全部或基本上全部是人的免疫球蛋白序列的那些部分。人源化抗體可選擇地還包含至少免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)的一部分。更加詳細的描述，參見Jones et al.，Nature，321522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature，332323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2593-596(1992)。
人源化的抗ErbB2的抗體包括在美國專利號5,821,337的表3中描述的huMAb4D5-1，huMAb4D5-2，huMAb4D5-3，huMAb4D5-4，huMAb4D5-5，huMAb4D5-6，huMAb4D5-7和huMAb4D5-8(HERCEPTIN)，在此明確引入作為參考；在下面描述的人源化520C9(WO 93/21319)和人源化2C4抗體。
“分離的”抗體是從其天然環(huán)境的組分中鑒定和分離和/或回收的抗體。其天然環(huán)境的污染物組分是妨礙該抗體的診斷或治療用途的物質(zhì)，可能包括酶、激素和其他蛋白的或非蛋白溶解物。在優(yōu)選實施方案中，抗體被純化(1)如通過Lowry方法所測定的，至超過95％的抗體重量，最優(yōu)選重量超過99％，(2)以達到足以通過使用轉(zhuǎn)杯式測序儀獲得至少15個N-末端殘基或內(nèi)在氨基酸序列的程度，或(3)以在還原或非還原條件下采用考馬斯蘭或者優(yōu)選銀染通過SDS-PAGE測定達到均一性。被分離的抗體包括在重組細胞中的原位抗體，這是由于抗體天然環(huán)境中的至少一個組分將不存在。但是，一般地，被分離的抗體將通過至少一個純化步驟來制備。
“結(jié)合”目的抗原例如ErbB2抗原的抗體，是能夠以足夠的親合性結(jié)合該抗原使得該抗體可用于靶向表達該抗原的細胞的抗體。如果抗體是結(jié)合ErbB2的抗體，該抗體通常將優(yōu)先地結(jié)合ErbB2而不是其他ErbB受體，并且是不會顯著地與其他蛋白例如EGFR，ErbB3或ErbB4交叉反應(yīng)的抗體。在這樣的實施方案中，通過熒光激活細胞分選(FACS)分析或放射免疫沉淀(RIA)，抗體與這些非ErbB2蛋白質(zhì)的結(jié)合程度(例如與內(nèi)源受體的細胞表面結(jié)合)將小于10％。有時，抗ErbB2的抗體不會顯著地與大鼠neu蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)，例如在Schecter et al.，Nature，312513(1984)和Drebin et al.，Nature，312545-548(1984)中所描述。
阻斷ErbB受體的配基活化的抗體是降低或阻止上文定義的這種活化的抗體，其中該抗體實質(zhì)上能夠比單克隆抗體4D5更加有效地阻斷ErbB受體的配基活化，例如，與單克隆抗體7F3或2C4或其Fab片段大約一樣有效，和優(yōu)選地與單克隆抗體2C4或其Fab片段大約一樣有效。例如，阻斷ErbB受體的配基活化的抗體是在阻斷ErbB異低聚體形成上比4D5有效約50-100％的抗體。阻斷ErbB受體的配基活化可以通過任何手段發(fā)生，例如，通過干擾配基結(jié)合ErbB受體、ErbB復(fù)合物形成、ErbB復(fù)合物中ErbB受體的酪氨酸激酶活性和/或ErbB中或者通過ErbB受體的酪氨酸激酶殘基的磷酸化。阻斷ErbB受體的配基活化的抗體的例子包括單克隆抗體2C4和7F3(其阻斷ErbB2/ErbB3和ErbB2/ErbB4異低聚體的HRG活化；和EGFR/ErbB2異低聚體的EGF，TGF-α，雙調(diào)蛋白，HB-EGF和/或上皮調(diào)節(jié)素活化)；和L26，L96和L288抗體(Klapper et al.，Oncogene，142099-2109(1997))，其阻斷EGF和NDF結(jié)合到表達EGFR，ErbB2，ErbB3和ErbB4的T47D細胞上。
具有指定抗體例如稱作2C4的單克隆抗體的“生物學(xué)特征”的抗體，是具有一種或多種使其區(qū)別于結(jié)合到相同抗原(例如ErbB2)上的其它抗體的生物學(xué)特征的抗體。例如具有2C4的生物學(xué)特征的抗體，可能阻斷包含ErbB2和ErbB3，ErbB1或ErbB4的ErbB異低聚體的HRG活化；阻斷包含EGFR和ErbB2的ErbB受體的EGF，TGF-α，HB-EGF，上皮調(diào)節(jié)素和/或雙調(diào)蛋白的活化；阻斷MAPK的EGF，TGF-α和/或HRG介導(dǎo)的活化；和/或結(jié)合到ErbB2的細胞外結(jié)構(gòu)域的被2C4結(jié)合的相同表位上，(例如阻斷單克隆抗體2C4結(jié)合到ErbB2上的抗體)。
除非另外指出，用語“單克隆抗體2C4”是指具有下面的實施例的鼠2C4抗體的抗原結(jié)合殘基的或衍生自該鼠2C4抗體的抗體。例如，單克隆抗體2C4可以是鼠單克隆抗體2C4或其變體，例如人源化抗體2C4，具有鼠單克隆抗體2C4的抗原結(jié)合氨基酸殘基。人源化2C4抗體的例子在本文和WO 01/00245中提供，WO 01/00245在此全文引入作為參考。除非另外指出，在此所用的用語“rhuMAb 2C4”是指包含被融合到任選由中國倉鼠卵巢(CHO)細胞表達的人輕鏈和重鏈IgGl(非A同種異型)恒定區(qū)序列的，分別為SEQ ID No.3和4的可變輕鏈(VL)和可變重鏈(VH)序列的抗體。
除非另外指出，術(shù)語“單克隆抗體4D5”是指具有鼠4D5抗體(ATCC CRL10463)的抗原結(jié)合殘基的或者衍生自該抗體的抗體。例如，單克隆抗體4D5可以是鼠單克隆抗體4D5或其變體，例如具有鼠單克隆抗體4D5的抗原結(jié)合殘基的人源化4D5。示例性的人源化4D5抗體包括在美國專利號5,821,337中的huMAb4D5-1，huMAb4D5-2，huMAb4D5-3，huMAb4D5-4，huMAb4D5-5，huMAb4D5-6，huMAb4D5-7和huMAb4D5-8(HERCEPTIN)，huMAb4D5-8(HERCEPTIN)是優(yōu)選的人源化4D5抗體。
“生長抑制劑”用于此是指在體外或體內(nèi)抑制細胞，特別是表達ErbB的癌細胞的生長的化合物或組合物。因此，生長抑制劑是在S期顯著降低表達ErbB的細胞的比例的試劑。生長抑制劑的例子包括阻斷細胞周期行進(在S期之外的地方)的試劑，例如誘導(dǎo)G1停滯和M期停滯的試劑。經(jīng)典M期阻斷劑包括長春花堿(vincas)(長春新堿和長春堿)，紫杉烷二萜(taxane)，和II型拓撲抑制劑，例如阿霉素，表柔比星(epirubicin)，柔紅霉素，依托泊苷(etoposide)和博萊霉素。那些阻滯G1期的試劑還延伸到S期阻滯，例如DNA烷基化試劑例如三苯氧胺，強的松，氮烯米胺(dacarbazine)，雙氯乙基甲胺，順鉑，氨甲蝶呤，5-氟尿嘧啶和阿糖胞苷。更加詳細的信息可見“癌癥的分子基礎(chǔ)”，Mendelsohn和Israel編輯，第1章，由Murakami等編寫的標(biāo)題為“細胞周期調(diào)控，癌基因和抗腫瘤藥”，(WB SaundersPhiladelphia，1995)，特別是第13頁。
“生長抑制”的抗體的例子是那些結(jié)合到ErbB2并且抑制過度表達ErbB2的癌細胞生長的抗體。優(yōu)選的生長抑制抗ErbB2的抗體以大約0.5-30μg/ml的抗體濃度抑制細胞培養(yǎng)物中20％以上的SK-BR-3乳腺癌細胞的生長，優(yōu)選超過50％(例如從約50％到約100％)，其中生長抑制作用是在將SK-BR-3細胞暴露于抗體6天后測定的(參見1997年10月14日授權(quán)的美國專利號5,677,171)。SK-BR-3細胞生長抑制分析在該專利和下面中被更加詳細地描述。優(yōu)選的生長抑制抗體是單克隆抗體4D5，例如人源化的4D5。
“誘導(dǎo)細胞死亡”的抗體是使活細胞不能存活的抗體。細胞通常是表達ErbB2受體的細胞，特別地該細胞過度表達ErbB2受體。優(yōu)選地，該細胞是癌細胞，例如乳腺、卵巢、胃、子宮內(nèi)膜、唾液腺、肺、腎、大腸、甲狀腺、胰腺或膀胱細胞。在體外，細胞可以是SK-BR-3，BT474，Calu 3細胞，MDA-MB-453，MDA-MB-361或SKOV3細胞?？梢酝ㄟ^在缺乏補體和免疫效應(yīng)細胞的情況下測定體外細胞死亡，來區(qū)分由抗體依賴的細胞介導(dǎo)的細胞毒性(ADCC)或由補體依賴的細胞毒性(CDC)引起的細胞死亡。因此，可以采用加熱滅活血清(即缺乏補體)和缺乏免疫效應(yīng)細胞時進行細胞死亡的分析。為了確定抗體是否能夠誘導(dǎo)細胞死亡，可以相對于未被處理的細胞評價膜完整性的缺失，通過碘化丙錠(PI)、臺盼蘭(參見Moore et al.，Cytotechnology，171-11(1995))或7AAD的攝取來評價膜完整性的喪失。優(yōu)選的誘導(dǎo)細胞死亡的抗體是那些在BT474細胞中在PI攝取分析試驗中誘導(dǎo)PI攝取的抗體(參見下文)。
“誘導(dǎo)凋亡”的抗體是那些誘導(dǎo)細胞程序性死亡的抗體，由膜聯(lián)蛋白V結(jié)合、DNA斷裂、細胞收縮、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張、細胞破裂和/或膜泡形成(稱作凋亡小體)確定細胞程序性死亡。細胞通常是過度表達ErbB2受體的細胞。優(yōu)選地，細胞是腫瘤細胞，例如乳腺、卵巢、胃、子宮內(nèi)膜、唾液腺、肺、腎、大腸、甲狀腺、胰腺或膀胱細胞。在體外，細胞可以是SK-BR-3，BT474，Calu 3細胞，MDA-MB-453，MDA-MB-361或SKOV3細胞。有多種方法可用于評價與凋亡相關(guān)的細胞事件。例如，通過膜聯(lián)蛋白結(jié)合檢測磷脂酰絲氨酸(PS)的轉(zhuǎn)移；通過DNA梯(laddering)評價DNA斷裂；并且核/染色質(zhì)濃縮以及DNA斷裂可通過亞二倍體細胞中的任何增加來評價。優(yōu)選地，誘導(dǎo)凋亡的抗體是在BT474細胞的膜聯(lián)蛋白結(jié)合分析中，引起相對于未處理細胞約2-50倍，優(yōu)選約5-50倍，和最優(yōu)選約10-50倍的膜聯(lián)蛋白結(jié)合的誘導(dǎo)(見下文)。有時，前凋亡抗體(pro-apoptotic antibody)是還會進一步阻斷ErbB受體的ErbB配基活化的抗體(例如7F3抗體)；即與單克隆抗體2C4具有共同生物學(xué)特征的抗體。在其他情形下，抗體是不會顯著地阻斷ErbB受體的ErbB配基活化的抗體(例如7C2)。此外，抗體是如7C2的抗體，其在誘導(dǎo)凋亡時，不誘導(dǎo)在S期的細胞百分率的大量減少(例如相對于對照，僅誘導(dǎo)這些細胞的百分率的0-10％的減少)。
“表位2C4”是抗體2C4結(jié)合的ErbB2的細胞外結(jié)構(gòu)域中的區(qū)域。為了篩選結(jié)合2C4表位的抗體，可以進行常規(guī)的交叉阻斷分析，例如在“抗體，實驗室手冊，Cold Spring Harbor Laboratory，Ed Harlow和DavidLane(1988)”中描述的分析。此外，可進行表位作圖來評價抗體是否結(jié)合到ErbB2的2C4表位上(例如，ErbB2的從約殘基22到約殘基584中的任何一個或多個殘基，包括殘基22和殘基584；參見附圖1A-B)。
“表位4D5”是抗體4D5(ATCC CRL 10463)結(jié)合的ErbB2的細胞外結(jié)構(gòu)域中的區(qū)域。該表位鄰近ErbB2的跨膜結(jié)構(gòu)域。為了篩選結(jié)合4D5表位的抗體，可以進行常規(guī)的交叉阻斷分析，例如在“抗體，實驗室手冊，ColdSpring Harbor Laboratory，Ed Harlow和David Lane(1988)”中描述的分析。此外，可進行表位作圖來評價抗體是否結(jié)合到ErbB2的4D5表位上(例如，從約殘基529到約殘基625中的任何一個或多個殘基，包括殘基529和殘基625；參見附圖1A-B)。
“表位3H4”是抗體3H4結(jié)合的ErbB2的細胞外結(jié)構(gòu)域中的區(qū)域。該表位包括在ErbB2的細胞外結(jié)構(gòu)域中的氨基酸序列中的從約541到約599的殘基，包括殘基541和殘基599，參見附圖1A-B。
“表位7C2/7F3”是在ErbB2的細胞外結(jié)構(gòu)域的N末端的區(qū)域，被7C2和/或7F3抗體(都保藏在ATCC中，見下文)結(jié)合。為了篩選結(jié)合到7C2/7F3表位的抗體，可以進行常規(guī)的交叉阻斷分析，例如在“抗體，實驗室手冊，Cold Spring Harbor Laboratory，Ed Harlow和David Lane(1988)”中描述的分析。此外，可以進行表位作圖來確定該抗體是否結(jié)合到ErbB2上的7C2/7F3表位上(例如，在ErbB2的約殘基22到約殘基53的區(qū)域上的任何一個或多個殘基；參見附圖1A-B)。
用于處理目的的“哺乳動物”是指被分類為哺乳動物的任何動物，包括人，家養(yǎng)動物和役使動物，和動物園、比賽、或?qū)櫸飫游?，例如狗、馬、貓、奶牛等。優(yōu)選，該哺乳動物是人。
“對處理有響應(yīng)”的腫瘤在公認的動物模型或人臨床試驗中，表現(xiàn)出對抗ErbB的抗體處理的響應(yīng)相對于與未處理或用安慰劑處理具有統(tǒng)計學(xué)上意義的顯著改善，或者對抗ErbB的抗體的最初處理有響應(yīng)，但是繼續(xù)處理時仍然生長。
術(shù)語“處理”(treat)或“處理”(treatment)是指治療性處理和預(yù)防性(prophylactic)或預(yù)防性(preventative)措施，其中目的在于防止或減緩(減輕)不期望的生理變化或紊亂，例如癌癥發(fā)生或擴散。對于本發(fā)明的目的，有益的或期望的臨床結(jié)果包括，但是不限于，無論是可檢測的或不可檢測的，癥狀緩和，疾病程度降低，疾病狀態(tài)穩(wěn)定(即，未惡化)，延遲或減緩疾病進展，改善或減輕疾病狀態(tài)，和消除(無論部分地或完全地)。“處理”還指相對于未接受處理的預(yù)期存活時間，延長存活。那些需要處理的包括那些已經(jīng)患有病癥或者紊亂的以及那些傾向于患有病癥或者紊亂的或者那些其中這些病癥或紊亂將被預(yù)防的。
“紊亂”是將從本發(fā)明的處理中獲益的任何病癥。這包括慢性和急性的病癥或疾病，包括那些使哺乳動物傾向于所述紊亂的病理癥狀。在此將被處理的紊亂的非限制性例子包括良性和惡性腫瘤；白血病和淋巴惡性腫瘤，特別是乳腺、卵巢、胃、子宮內(nèi)膜、唾液腺、肺、腎、大腸、甲狀腺、胰腺、前列腺或膀胱癌；神經(jīng)元的、神經(jīng)膠質(zhì)的、星形膠質(zhì)的、下丘腦的和其他腺體、巨噬細胞的、上皮的、基質(zhì)的和囊胚的紊亂；和炎癥性的、血管生成的和免疫學(xué)的紊亂。按照本發(fā)明的將被處理的優(yōu)選紊亂是惡性腫瘤。
術(shù)語“治療有效量”是指足以有效治療哺乳動物中的疾病或紊亂的藥物含量。在癌癥的情況下，藥物的治療有效量可能減少癌細胞的數(shù)量；降低腫瘤的大??；抑制(即減緩到一定程度和優(yōu)選阻止)癌細胞浸潤到周圍器官中；抑制(即減緩到一定程度和優(yōu)選阻止)腫瘤轉(zhuǎn)移；在某種程度上抑制腫瘤生長；和/或在一定程度上減輕一種或多種與癌癥相關(guān)的癥狀。在藥物可能阻止生長和/或殺死存在的癌癥細胞的程度上，它可以是抑制細胞性的和/或細胞毒性的。對于癌癥治療，例如可以通過估計疾病進展時間(TTP)和/或測定反應(yīng)率(RR)來測量效率。
術(shù)語“癌癥”和“癌癥的”是指或者描述哺乳動物中的一種生理狀態(tài)，其典型特征在于不受調(diào)控的細胞生長。“腫瘤”包含一種或多種癌細胞。癌癥的例子包括，但是不限于癌、淋巴瘤、胚細胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴惡性腫瘤。這種癌癥的更加特別的例子包括鱗狀細胞癌(例如上皮鱗狀細胞癌)，肺癌包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌(“NSCLC”)，肺腺癌和肺鱗狀細胞癌，腹膜癌，肝細胞癌，胃的或胃癌包括胃腸癌，胰腺癌，惡性膠質(zhì)瘤，宮頸癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝細胞瘤，乳腺癌，結(jié)腸癌，直腸癌，結(jié)腸直腸癌，子宮內(nèi)膜癌或子宮癌，唾液腺癌，腎臟或腎的癌，前列腺癌，陰門癌，甲狀腺癌，肝癌，肛門癌，陰莖癌，以及頭部和頸部癌。
“表達ErbB的癌癥”是包含細胞表面存在ErbB蛋白的細胞的癌癥?！氨磉_ErbB2的癌癥”是在其細胞表面生成足夠水平ErbB2的癌癥，使得抗ErbB2的抗體可以結(jié)合到那里并對該癌癥具有治療作用。
“特征在于過度活化”ErbB受體的癌癥是在癌癥細胞中ErbB受體活化的程度顯著超過該受體在相同組織類型的非癌癥細胞中的活化水平的癌癥。這種過度活化可能由ErbB受體的過度表達、和/或在癌癥細胞中可用于激活ErbB受體的ErbB配基高于正常水平所導(dǎo)致的。這種過度活化可能引起癌細胞的惡性狀況和/或由癌細胞的惡性狀態(tài)引起。在一些實施方案中，對癌癥進行診斷或預(yù)測分析來確定是否發(fā)生會導(dǎo)致ErbB受體的這種過度活化的ErbB受體的增殖和/或過度表達。可選擇地，或另外地，對癌癥進行診斷或預(yù)測分析來確定癌癥中是否發(fā)生會導(dǎo)致受體過度活化的ErbB配基的擴增和/或過度表達。在這種癌癥的亞群中，受體的過度活化可能源自自分泌刺激路徑。
在“自分泌”刺激路徑中，通過既生成ErbB配基也生成其關(guān)聯(lián)ErbB受體的癌癥細胞發(fā)生自我刺激。例如，癌癥可能表達或過度表達EGFR，以及還表達或過度表達EGFR配基(例如，EGF，TGF-α或HB-EGF)。在另一個實施方案中，癌癥可能表達或過度表達ErbB2，以及表達或過度表達heregulin(例如γ-HRG)。
“過度表達”ErbB受體的癌癥是相對于相同組織類型的非癌癥細胞，在該細胞表面上具有顯著較高水平的ErbB受體，例如ErbB2。這種過度表達可能通過基因擴增或通過轉(zhuǎn)錄或翻譯增強而引起。ErbB受體過度表達可以通過評價存在于細胞表面的ErbB蛋白質(zhì)水平的升高在診斷或預(yù)測分析中被確定(例如通過免疫組織化學(xué)分析；IHC)。可選擇地或另外地，可以測量細胞中編碼ErbB的核酸的水平，例如通過熒光原位雜交(FISH；參見1998年10月公開的WO 98/45479)，DNA印跡，或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)，例如實時定量PCR(RT-PCR)。可以通過評價患者中，例如腫瘤活組織檢查中的配基水平(或者編碼其的核酸)，或通過各種診斷分析例如IHC，F(xiàn)ISH，DNA印跡，PCR或上述的體內(nèi)分析來診斷性地確定ErbB配基的過度表達。還可以檢測生物學(xué)液體例如血清中的脫落抗原(shed antigen)(例如ErbB的細胞外結(jié)構(gòu)域)來研究ErbB受體的過度表達(參見例如1990年6月12日授權(quán)的美國專利號4,933,294；1991年4月18日公開的WO 91/05264；1995年3月28日授權(quán)的美國專利號5,401,638；和Sias et al.，J.Immunol.Methods，13273-80(1990))。除了上述分析，各種其他的體內(nèi)分析對熟練技術(shù)人員來說是可獲得的。例如，可以將患者體內(nèi)的細胞暴露于抗體，該抗體可選擇地用可檢測標(biāo)記，例如放射性同位素標(biāo)記，并可以評價抗體與患者體內(nèi)細胞的結(jié)合，例如通過外部掃描放射性或者通過分析從預(yù)先暴露于抗體的患者中獲得的活組織檢查。
過度表達HER2的腫瘤可以通過對應(yīng)于每個細胞表達的HER2分子的拷貝數(shù)的免疫組織化學(xué)分值來估計，可以從生物化學(xué)上測定0＝0-10,000拷貝/細胞，1+＝至少約200,000拷貝/細胞，2+＝至少約500,000拷貝/細胞，3+＝至少約2,000,000拷貝/細胞。水平為3+的HER2的過度表達會引起酪氨酸激酶發(fā)生不依賴于配基的活化(Hudziak et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，847159-7163 )，在大約30％的乳腺癌中發(fā)生，并且在這些患者中，不復(fù)發(fā)存活和總存活下降(Slamon et al.，Science，244707-712 ；Slamonet al.，Science，235177-182 )。
相反，“不具有ErbB2受體過度表達特征”的癌癥是在診斷性分析中與相同組織類型的非癌癥細胞相比不表達高于正常ErbB2受體水平的ErbB2受體的癌癥。
“不依賴于激素”的癌癥是其增殖不依賴于與由癌癥中細胞表達的受體結(jié)合的激素存在與否。在施用降低腫瘤中或附近的激素濃度的藥物或手術(shù)方案時，這種癌癥不會發(fā)生臨床退化。不依賴于激素的癌癥的例子包括不依賴于雄激素的前列腺癌，不依賴于雌激素的乳腺癌，子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌。這種癌癥可能開始于激素依賴的腫瘤，并在抗激素治療后由激素敏感階段發(fā)展到激素難治的腫瘤。
如在此所用的術(shù)語“細胞毒性劑”是指抑制或阻止細胞功能和/或?qū)е录毎茐牡囊环N物質(zhì)。該術(shù)語想要包括放射性同位素(例如At211，I131，I125，Y90，Re186，Re188，Sm153，Bi212，P32和Lu的放射性同位素)，化學(xué)治療劑，和毒素例如細菌、真菌、植物或動物來源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或變體。
“化學(xué)治療劑”是在癌癥治療中有用的化學(xué)化合物?；瘜W(xué)治療劑的例子包括烷基化劑例如三胺磷和環(huán)磷酰胺(CYTOXANTM)；烷基磺酸鹽例如白消安，二丙胺磺酯和哌泊舒凡；氮丙啶例如芐替哌(benzodopa)，卡巴醌(carboquone)，四甲尿烷亞胺(meturedopa)，和烏瑞替哌(uredopa)；氮丙啶methylamelamine和包括六甲嘧胺(altretamine)，曲他胺(triethylenemelamine)，三亞乙基磷酰胺，塞替哌(triethylenethiophosphaoramide)和三羥甲蜜胺(trimethylolomelamine)；氮芥例如苯丁酸氮芥，萘氮芥(chlomaphazine)，cholophosphamide，雌莫司汀(estramustine)，異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)，雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)，鹽酸甲氧氮芥，苯丙氨酸氮芥，新氮芥，苯芥膽固醇，松龍苯芥(prednimustine)，三芥環(huán)磷酰胺，尿嘧啶芥；亞硝基脲(nitrosurea)例如亞硝基脲氮芥，氯脲霉素，福泰氮芥(fotemustine)，羅莫司丁(lomustine)，尼莫司啶(nimustine)，雷尼司啶(ranimustine)；抗生素例如阿克拉霉素，放射菌素，authramycin，重氮絲氨酸，博來霉素，cactinomycin，加利車霉素，carabicin，洋紅霉素，嗜癌菌素(carzinophilin)，色霉素，放線菌素D，柔紅霉素，二乙氧醋酰阿霉素，6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸，阿霉素，表柔比星，去羥阿霉素，伊達比星，麻西羅霉素，絲裂菌素，霉酚酸，諾加拉霉素，橄欖霉素，培來霉素，potfiromycin，嘌呤霉素，quelamycin，rodorubicin，鏈黑菌素，鏈脲霉素，殺結(jié)核菌素，百士欣，新制癌素，佐柔比星；抗代謝物例如氨甲蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物例如二甲葉酸，氨甲蝶呤，蝶酰三谷氨酸，曲美沙特；嘌呤類似物例如氟達拉賓(fludarabine)，6-巰基嘌呤，硫唑鳥嘌呤，硫鳥嘌呤；嘧啶類似物例如環(huán)胞苷(ancitabine)，氮雜胞苷(azacitidine)，6-氮雜尿苷，卡莫氟，阿糖胞苷(cytarabine)，雙脫氧尿苷，去氧氟尿苷，依諾他賓(enocitabine)，氟尿嘧啶脫氧核苷(floxuridine)，5-FU；雄性激素例如卡魯睪酮，羥甲雄酮丙酸酯，環(huán)硫雄醇(epitiostanol)，甲環(huán)硫甾烷，睪內(nèi)脂(testolactone)；抗腎上腺素例如氨基苯乙哌啶酮，米托坦(mitotane)，曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充物例如frolinic acid；醋葡內(nèi)酯；aldophosphamide glycoside；氨基乙酰丙酸；胺苯吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比山群(bisantrene)；依達曲沙(edatraxate)；defofamine；脫羰秋水仙堿(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfomithine；醋酸羥嗶咔唑；環(huán)氧甘醚；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖；氯尼達明(lonidamine)；丙米腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫匹達謀(mopidamol)；二胺硝吖啶；噴司他??；苯來美特(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；足葉草肼；2-足葉草肼；甲基芐肼；PSK；丙亞胺(razoxane)；西作非蘭；螺旋鍺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸；三亞胺醌；2，2′，2″-三氯乙胺；氨基甲酸乙酯(urethan)；長春地辛(vindesine)；氮烯米胺；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛(wèi)矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(“Ara-C”)；環(huán)磷酰胺；三胺硫磷；紫杉烷二萜(taxane)，例如泰素(paclitaxel)(TAXOL，Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，NJ)和多西他賽(docetaxel)(TAXOTERE，Rhone-Poulenc Rorer，Antony，F(xiàn)rance)；苯丁酸氮芥；吉西他濱；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；氨甲蝶呤；鉑類似物例如順鉑和卡鉑(carboplatin)；長春堿；鉑；依托泊甙(etoposide)(VP-16)；異環(huán)磷酰胺；絲裂菌素C；米托蒽醌；長春新堿；失碳長春堿(vinorelbine)；異長春花堿(navelbine)；鹽酸米托蒽醌；替尼泊甙(teniposide)；柔紅霉素；氨基蝶呤；希羅達(xeloda)；伊本膦酸鈉(ibandronate)；CPT-11；拓撲異構(gòu)酶抑制劑RFS2000；二氟甲基鳥氨酸(DMFO)；視黃酸；埃斯波霉素；卡培他濱(capecitabine)；以及任何上述的藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物。在該定義中還包括的是作為調(diào)節(jié)或抑制激素對腫瘤作用的抗激素試劑，例如抗雌激素，包括例如三苯氧胺，雷洛昔芬(raloxifene)，芳香酶(aromatase)抑制性4(5)-咪唑，4-羥基三苯氧胺，曲奧昔芬(trioxifene)，keoxifene，LY117018，奧那斯酮(onapristone)，和托瑞米芬(toremifene)(Fareston)；和抗雄性激素的例如氟他胺(flutamide)，尼魯米特(nilutamide)，比卡魯胺(bicalutamide)，利普安(leuprolide)和性瑞林(goserelin)及其任何上述的藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物。
如在此所用，術(shù)語“靶向EGFR的藥物”是指結(jié)合到EGFR和任選地抑制EGFR活化的治療劑。這種試劑的例子包括結(jié)合EGFR的抗體和小分子。結(jié)合到EGFR的抗體的例子包括MAb 579(ATCC CRL HB 8506)，MAb455(ATCC CRL HB8507)，MAb 225(ATCC CRL 8508)，MAb 528(ATCC CRL8509)(參見美國專利4,943,533，Mendelsohn等)及其變體，例如嵌合的225(C225或Cetuximab；ERBUTIX)和改造的人225(H225)(參見WO 96/40210，Imclone Systems Inc.)；結(jié)合II型突變EGFR的抗體(美國專利5,212,290)；結(jié)合EGFR的人源化的和嵌合的抗體被描述在美國專利5,891,996；以及結(jié)合EGFR的人抗體，例如ABX-EGF(參見WO 98/50433，Abgenix)。抗EGFR的抗體可以與細胞毒性劑偶聯(lián)，從而產(chǎn)生一種免疫偶聯(lián)物(參見，例如EP659，439A2，Merck Patent GmbH)。結(jié)合EGFR的小分子的例子包括ZD1839或Gefitinib(IRESSATM；Astra Zeneca)，CP-358774(TARCEVATM；Genentech/OSI)和AG1478，AG1571(SU 5271；Sugen)。
“酪氨酸激酶抑制劑”是在一定程度上抑制酪氨酸激酶例如ErbB受體的酪氨酸激酶活性的分子。這種抑制劑的例子包括在前面的段落中指出的靶向EGFR的藥物以及喹唑啉，例如PD153035，4-(3-氯苯胺基)喹唑啉，吡啶并嘧啶(pyridopyrimidines)，嘧啶并嘧啶(pyrimidopyrimidines)，吡咯并嘧啶(pyrrolopyrimidines)，例如CGP 59326，CGP 60261和CGP 62706，和吡唑啉酮嘧啶(pyrazolopyrimidines)，4-(苯胺)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，姜黃色素(二阿魏酰甲烷，4，5-二(4-氟苯胺基)苯鄰二甲酰亞胺)，含有硝基噻吩成分的tyrphostines；PD-0183805(Warner-Lamber)；反義分子(例如，那些結(jié)合到編碼ErbB的核酸上的分子)；喹喔啉(美國專利5,804,396)；tryphostins(美國專利5,804,396)；ZD6474(Astra Zeneca)；PTK-787(Novartis/Schering AG)；泛-ErbB抑制劑例如CI-1033(Pfizer)；Affinitac(ISIS 3521；Isis/Lilly)；Imatinibmesylate(Gleevac；Novartis)；PKI 166(Novartis)；GW2016(Glaxo SmithKline)；CI-1033(Pfizer)；EKB-569(Wyeth)；Semaxanib(Sugen)；ZD6474(AstraZeneca)；PTK-787(Novartis/Schering AG)；INC-1C11(Imclone)；或在任何下列專利申請中描述的美國專利5,804,396；WO 99/09016(AmericanCyanimid)；WO 98/43960(American Cyanamid)；WO 97/38983(WarnerLambert)；WO 99/06378(Warner Lambert)；WO 99/06396(Warner Lambert)；WO 96/30347(Pfizer，Inc)；WO 96/33978(Zeneca)；WO 96/3397(Zeneca)；和WO 96/33980(Zeneca)。
“抗血管生成劑”是指阻斷或在一定程度上干擾血管發(fā)育的化合物?？寡苌傻囊蜃永缈梢允墙Y(jié)合到參與促進血管生成的生長因子或生長因子受體上的小分子或抗體。優(yōu)選的抗血管生成的因子在此是一種結(jié)合到血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)上的抗體。
術(shù)語“細胞因子”是由一個細胞群體釋放并作為細胞間的介體作用于另一種細胞的蛋白質(zhì)的通稱。這種細胞因子的例子為淋巴因子、單核因子和傳統(tǒng)的多肽激素。在細胞因子中所包括的有生長激素例如人生長激素，N-甲硫氨酰人生長激素，和牛生長激素；甲狀旁腺素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素例如促濾泡激素(FSH)，促甲狀腺素(TSH)，和黃體生成素(LH)；肝生長因子；成纖維細胞生長因子；促乳素；胎盤催乳激素；腫瘤壞死因子-α和-β；米勒管抑制物質(zhì)；小鼠促性腺激素相關(guān)肽；抑制素；活化素；血管內(nèi)皮生長因子；整聯(lián)蛋白；血小板生成素(TPO)；神經(jīng)生長因子例如NGF-β；血小板生長因子；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)例如TGF-α和TGF-β；胰島素樣生長因子-I和-II；促紅細胞生成素(EPO)；骨誘導(dǎo)因子(osteoinductive factor)；干擾素例如干擾素-α，-β和-γ；集落刺激因子(CSF)例如巨噬細胞-CSF(M-CSF)；粒細胞-巨噬細胞-CSF(GM-CSF)；和粒細胞-CSF(G-CSF)；白介素(IL)例如IL-1，IL-1α，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12；腫瘤壞死因子例如TNF-α或TNF-β；和其他的多肽因子包括LIF和試劑盒配基(kitligand)(KL)。如在此所用，術(shù)語細胞因子包括來自天然來源或來自重組細胞培養(yǎng)物的蛋白質(zhì)和天然序列的細胞因子的生物活性等價物。
用在本申請中的術(shù)語“前體藥物”是指藥學(xué)活性物質(zhì)的前體或衍生物形式，其相對于親本藥物(parent drug)對腫瘤細胞的細胞毒性較小，能夠被酶催化激活或者被轉(zhuǎn)化為更有活性的親本藥物形式。參見，例如Wilman，“癌癥化學(xué)治療中的前體藥物”Biochemical Society Transactions，14，375-382，615th Meeting Belfast(1986)和Stella等，“前體藥物用于靶向藥物遞送的化學(xué)方法”，Directed Drug Delivery，Borchardt等編輯，247-267，Humana Press(1985)。本發(fā)明的前體藥物包括，但是不限于可以被轉(zhuǎn)化為更有活性的無細胞毒性的藥物的，含有磷酸鹽的前體藥物，含有硫代磷酸鹽的前體藥物，含有硫酸鹽的前體藥物，含有肽的前體藥物，D-氨基酸修飾的前體藥物，糖基化的前體藥物，含有β-內(nèi)酰胺的前體藥物，含有任選被取代的苯氧基乙酰胺的前體藥物或者含有可選擇地被取代的苯基乙酰胺的前體藥物，5-氟胞嘧啶以及其他的5-氟尿嘧啶藥物前體?？梢员谎苌鸀榍绑w藥物形式用于本發(fā)明的細胞毒性藥物的例子包括，但是不限于那些上面描述的化學(xué)治療劑。
“脂質(zhì)體”是由各種類型脂質(zhì)、磷脂和/或表面活性劑組成的小泡，其可被用于將藥物(例如在此公開的抗ErbB2的抗體和，任選地化學(xué)治療劑)遞送給哺乳動物。脂質(zhì)體的組分通常以雙分子層的結(jié)構(gòu)排列，類似于生物膜的脂排列。
術(shù)語“包裝插入物(package insert)”是用于指通常包括在治療性產(chǎn)品的商業(yè)包裝中的說明書，其包含關(guān)于適應(yīng)癥、用法、劑量、施用方法、禁忌征候的信息和/或關(guān)于使用該治療性產(chǎn)品的警告。
“心臟防護劑”是一種防止或減少與給患者施用藥物相關(guān)的心肌機能障礙(即心肌病和/或充血性心力衰竭)的化合物或組合物，這些藥物例如蒽環(huán)霉素抗生素和/或抗ErbB2的抗體。心臟防護劑可能例如阻斷或降低自由基介導(dǎo)的心臟毒性作用和/或防止或減少氧化應(yīng)激損傷。包括在本定義中的心臟防護劑的例子包括鐵離子螯合劑右丙亞胺(ICRF-187)(Seifert et al.，TheAnnals of Pharmacotherapy，281063-1072(1994))；降脂劑(lipid-loweringagent)和/或抗氧化劑例如丙丁酚(Singal et al.，J.Mol.Cell Cardiol.，271055-1063(1995))；阿米斯丁(氨基硫羥基2-[(3-氨丙基)氨基]乙硫醇-二氫磷酸酯，也稱作WR-2721，及其脫磷酸化的細胞攝取形式稱作WR-1065)和S-3-(3-甲氨基丙氨基)丙基硫代磷酸(WR-151327)，參見Green et al.，CancerResearch，54738-741(1994)；地高辛(Bristow，M.R.在Bristow MR，編輯.藥物誘導(dǎo)的心臟病.紐約Elsevier 191-215(1980))；β-阻斷劑例如美托洛爾(Hjalmarson et al.，Drugs47Suppl 431-9(1994)；和Shaddy et al.，Am.Heart J.，129197-9(1995))；維生素E；抗壞血酸(維生素C)；自由基清除劑例如石竹素，烏索酸和N-乙酰半胱氨酸(NAC)；自旋捕獲化合物例如α-苯基-叔-丁基硝酮(PBN)；(Paracchini et al.，Anticancer Res.，131607-1612(1993))；硒代有機化合物例如P251(Elbesen)；等。
“被分離的”核酸分子是從至少一種污染物核酸分子中鑒定和分離出的核酸分子，在該抗體核酸分子的天然來源中，該分子通常與污染物核酸分子結(jié)合在一起。被分離的核酸分子不再是其在自然界中存在的形式或狀態(tài)。因此，被分離的核酸分子區(qū)別于存在于天然細胞中的核酸分子。但是，被分離的核酸分子包括被包含在通常表達抗體的細胞中的核酸分子，在這樣的細胞中，例如，核酸分子位于與天然細胞的染色體位置不同的染色體位置上。
用語“控制序列”是指在特定宿主生物體中表達被可操作地連接的編碼序列所必需的DNA序列。適合于原核生物的調(diào)控序列，例如包括啟動子，任選地操縱子序列和核糖體結(jié)合位點。已知真核細胞利用啟動子，聚腺苷酸化信號和增強子。
當(dāng)核酸與另一種核酸序列處于一種功能性關(guān)系中時，被“可操縱地連接”。例如，如果用作前序列或分泌前導(dǎo)序列的DNA作為參與多肽分泌的蛋白前體被表達，則被可操縱地連接到表達多肽的DNA上；如果啟動子或增強子影響序列的轉(zhuǎn)錄，則被可操作地連接到編碼序列上；或者如果核糖體結(jié)合位點被放置在促進翻譯的位置上，則其被可操作地連接到編碼序列上。一般地，“被可操作地連接”是指被連接的DNA序列是連續(xù)的，并且在為分泌前導(dǎo)序列的情況下，是連續(xù)的并且處于閱讀狀態(tài)。但是，增強子不一定非得是連續(xù)的。結(jié)合是在便利的限制性位點上通過連接實現(xiàn)。如果不存在這種位點，按照常規(guī)操作，使用合成的寡核苷酸連接物或接頭。
如在此所用，用語“細胞”、“細胞系”和“細胞培養(yǎng)物”互換使用，所有這種命名都包括后代。因此，用語“轉(zhuǎn)化體”和“被轉(zhuǎn)化的細胞”包括原代主體(subject)細胞以及由此產(chǎn)生的不論傳遞多少次的培養(yǎng)物。還應(yīng)當(dāng)理解，由于有意的或無意的突變，所有的后代在DNA含量上并不是完全相同的。還包括在最初轉(zhuǎn)化細胞中被篩選的具有相同功能或生物學(xué)活性的突變后代。當(dāng)使用不同的命名時，其包括哪些內(nèi)容可以很清楚地從上下文中獲知。
鑒定對用抗HER2的抗體處理有響應(yīng)的腫瘤的方法腫瘤和腫瘤細胞的來源腫瘤可以被表征為對用2C4或者功能性等價的抗體治療響應(yīng)，功能性等價的抗體具有抗體2C4的一種或多種生物學(xué)特征，例如，基于作為活化的度量，在細胞表面上存在EGFR-ErbB2和/或ErbB2-ErbB3異二聚體。通過本領(lǐng)域知曉的任何方法分析腫瘤樣本中是否存在異二聚體。優(yōu)選地，通過下文描述的一種或多種方法來確定是否存在異二聚體。
由于HER2活化是受體異二聚化和磷酸化的結(jié)果，一種特別重要的用于鑒定對用2C4或功能性等價抗體治療響應(yīng)的腫瘤的方法是檢測ErbB受體磷酸化，例如ErbB2(HER2)受體磷酸化，如下文所述。
可被分析的腫瘤細胞的來源包括，但是不限于，腫瘤活組織檢查，循環(huán)的腫瘤細胞，循環(huán)的血漿蛋白，腹水，異種移植腫瘤以及其他腫瘤模型，原代細胞培養(yǎng)物或者從腫瘤衍生的或者展示腫瘤樣特性的細胞系，以及被保存的腫瘤樣本，例如福爾馬林固定、石蠟包埋的腫瘤樣本。本發(fā)明計劃篩選EGFR-ErbB2和/或ErbB2-ErbB3異二聚體和/或ErbB受體磷酸化的大量不同的腫瘤細胞類型。對于與被檢測為異二聚體和/或ErbB受體如ErbB2(HER2)受體磷酸化陽性的腫瘤細胞相同類型的腫瘤細胞可用2C4治療。下面描述的腫瘤模型作為實施例被提供，而不應(yīng)該被解釋為限制本發(fā)明。
在一個實施方案中，來源于正患有一種腫瘤的患者的腫瘤細胞被分析是否對用2C4治療響應(yīng)。如果基于存在HER2/HER3和/或HER2/HER1異二聚體或者通過證實ErbB受體發(fā)生了磷酸化，確定該細胞是有響應(yīng)的，那么隨后可以用具有2C4的一種或多種生物學(xué)特征的抗體處理該患者。優(yōu)選地，用rhuMAb 2C4處理該患者。
在另一個實施方案中，分析來自特定類型的腫瘤的腫瘤細胞或被認為具有特定類型腫瘤的特征的細胞中是否存在EGFR-ErbB2和/或ErbB2-ErbB3異二聚體，或者ErbB受體是否磷酸化，優(yōu)選ErbB2(HER2)受體。如果檢測到EGFR-ErbB2和/或ErbB2-ErbB3異二聚體和/或ErbB受體磷酸化，一般認為該類型的腫瘤是用具有2C4的一種或多種生物學(xué)特征的抗ErbB2的抗體處理的優(yōu)良的候選。然后可用這種抗體處理患有這種腫瘤的患者。
細胞系異種移植可以通過將細胞直接植入到目的位點上來將體外繁殖的腫瘤細胞，例如在培養(yǎng)物中生長的腫瘤細胞和腫瘤細胞系，異種移植到小鼠中。這種方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。分析細胞，以鑒定是否存在EGFR-ErbB2和/或ErbB2-ErbB3異二聚體，或者ErbB受體磷酸化，例如ErbB2(HER2)受體磷酸化。
在一個實施方案中，將腫瘤細胞皮下植入到小鼠中，優(yōu)選無胸腺的裸鼠。在另一個實施方案中，腫瘤細胞被植入到生理相關(guān)的位置上來建立一個適當(dāng)?shù)脑荒[瘤模型。例如，來自乳腺癌細胞系的細胞以不同的濃度被植入到無胸腺的裸鼠的乳腺脂肪墊中來更加精確地模擬乳腺癌的生物學(xué)?？梢栽谝浦仓盎蛑螅治瞿[瘤細胞是否存在EGFR-ErbB2或ErbB2-ErbB3異二聚體，或ErbB受體磷酸化。優(yōu)選地，在被植入的細胞已經(jīng)發(fā)育為具有預(yù)期大小的腫瘤后再分析腫瘤細胞。還用2C4或功能性等價抗體來治療小鼠，用未被處理的小鼠作為對照。
還可以給任何類型的腫瘤建立類似的模型，已經(jīng)從這些腫瘤中獲得了被培養(yǎng)的細胞或細胞系。腫瘤類型包括，但是不限于，膀胱，腦，乳腺，大腸，食道，腎，白血病，肝，肺，黑素瘤，卵巢，胰腺，前列腺，肉瘤，胃，睪丸和子宮。在一個實施方案中，過度表達ErbB2的腫瘤細胞或細胞系被用于移植，而在另一個實施方案，表達正?；虻陀谡：康腅rbB2的腫瘤細胞或細胞系被用于移植。在還有另一個實施方案中，不對HERCEPTIN響應(yīng)的腫瘤細胞或細胞系被用于移植。
在一個特定實施方案中，大約2千萬個MDA-175乳腺腫瘤細胞被植入小鼠的生殖腺的脂肪墊中。例如通過下述的方法之一，在異種移植的細胞的表面上檢測HER2/HER1和/或HER2/HER3二聚體的表達。還可用0，3mg/kg，10mg/kg，30mg/kg或100mg/kg的2C4處理被這樣移植的小鼠。其他劑量方案可以由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來確定。
雖然本發(fā)明適合于任何表達HER2的腫瘤的類型，固體瘤例如乳腺癌，卵巢癌，肺癌，前列腺癌和結(jié)直腸癌尤其適合遵循本發(fā)明來分析和處理。
腫瘤異種移植可以獲取哺乳動物腫瘤樣本，優(yōu)選人腫瘤樣本并植入到小鼠中，優(yōu)選無胸腺的裸鼠。可以通過任何本領(lǐng)域已知的方法來獲得腫瘤樣本。在一個實施方案中，手術(shù)切除腫瘤樣本，例如在活組織檢查中或者在外科手術(shù)中，以從哺乳動物摘下腫瘤。在另一個實施方案中，通過從哺乳動物血液中純化循環(huán)的腫瘤細胞來獲得腫瘤樣本。
在一個特定的實施方案中，將直徑為大約5×5×0.5-1mm的人固體腫瘤切片植入無胸腺的裸鼠的脅部中，通常為每只小鼠四個切片。當(dāng)被植入的腫瘤達到10-15mm的中值直徑時，通常通過使用較小的腫瘤碎片進行連續(xù)傳代。用于生成和研究人腫瘤異種移植的方法被描述在如下參考文獻中，在此全文引入作為參考Fiebig等，“人腫瘤異種移植新抗癌試劑的可預(yù)測性、表征和發(fā)現(xiàn)”，投稿于“腫瘤學(xué)用于抗癌藥物開發(fā)的腫瘤模型相關(guān)性”，F(xiàn)iebig和Burger編輯(Basel，Karger1999)，vol54，29-50；Berger等，“人腫瘤異種移植在胸腺發(fā)育不全的裸鼠中的建立和表征”，在“腫瘤學(xué)中的免疫缺陷小鼠”中，F(xiàn)iebig和Berger編輯(Basel，Karger 1992)，23-46；Fiebig和Burger，“人腫瘤異種移植和外植體”，在“癌癥研究模型”中，Teicher編輯(Humana Press 2002)113-137。
當(dāng)異種移植以固體瘤生長，分化，并發(fā)展出基質(zhì)、脈管系統(tǒng)和中央壞死時，人異種移植被認為對供體患者體內(nèi)的腫瘤行為具有高度預(yù)見性。在大多數(shù)情況下，異種移植物保留剛自患者獲得的腫瘤的大部分分子的、組織學(xué)的和病理生理學(xué)特征。來自含有最初或者連續(xù)傳代的腫瘤的小鼠的腫瘤細胞被分析是否存在EGFR-ErbB2和/或ErbB2-ErbB3異二聚體，或ErbB受體是否發(fā)生磷酸化。還用2C4或者功能性等價抗體來治療小鼠。
在一個實施方案中，對一組新創(chuàng)建或建立的人腫瘤異種移植進行篩選，篩選是否存在EGFR-ErbB2或ErbB2-ErbB3異二聚體，或者ErbB受體是否磷酸化。Fiebig和Burger，同上文，描述了從多種常規(guī)癌癥類型中建立的一組300個以上的人腫瘤異種移植，常規(guī)癌癥類型例如膀胱，腦，乳腺，結(jié)腸，食道，腎，白血病，肝，肺，黑素，卵巢，胰腺，前列腺，肉瘤，胃，睪丸和子宮。在一個實施方案中，全組被篩選是否具有異二聚體，或ErbB受體例如ErbB2(HER2)受體是否磷酸化。還可以篩選該組的亞群是否具有異二聚體，或ErbB受體是否磷酸化，其中該亞群是基于例如組織類型，過度、低或正常表達ErbB2，或者不對HERCEPTIN響應(yīng)。以這種方式，基于是否存在異二聚體，或者通過證實ErbB受體例如ErbB2(HER2)受體發(fā)生磷酸化，腫瘤可被分類為用2C4治療的候選腫瘤。同樣地，具有如此分類的腫瘤的患者可被更迅速地認為適合用2C4或功能性等價抗體治療。
在移植之前或之后，可分析腫瘤樣本中是否存在EGFR-ErbB2或ErbB2-ErbB3異二聚體，或ErbB受體是否磷酸化。在一個實施方案中，大約1g來自最初和/或被連續(xù)傳代的異種移植的腫瘤被從分子學(xué)上進一步表征異二聚體，或者在液氮中迅速冷凍并存儲在-80℃下，用于以后進行表征。進一步分析異種移植腫瘤還可以采用雙層軟瓊脂分析，也稱作克隆發(fā)生分析，如例如在Fiebig和Burger中，同上文中所描述。人固體腫瘤異種移植通過機械的方式和蛋白水解的方式分解為單細胞懸浮液，該細胞懸浮液被鋪板到如所述鋪了軟瓊脂的多孔平板中。腫瘤細胞體外生長導(dǎo)致集落形成，可以進一步分析該集落的分子特征，例如異二聚體，或ErbB受體磷酸化，或其他的組織化學(xué)的和形態(tài)學(xué)的特征。
B.檢測EGFR-ErbB2和ErbB2-ErbB3異二聚體本領(lǐng)域已知的任何方法可以被用于檢測腫瘤中的EGFR-ErbB2或ErbB2-ErbB3異二聚體。幾個優(yōu)選的方法在下面進行了描述。這些方法檢測非共價的蛋白-蛋白的相互作用或者另外表明目的蛋白之間的接近性。下面描述的方法作為實施例被提供，而不應(yīng)當(dāng)被解釋為限制本發(fā)明。
共免疫沉淀和免疫印跡以免疫親合為基礎(chǔ)的方法，例如免疫沉淀或ELISA，可以被用于檢測EGFR-ErbB2或ErbB2-ErbB3異二聚體。在一個實施方案中，抗ErbB2的抗體被用于免疫沉淀包含來自腫瘤細胞的ErbB2的復(fù)合物，然后通過免疫印跡檢測生成的免疫沉淀物中是否存在EGFR或ErbB3。在另一個實施方案中，EGFR或ErbB3抗體可被用于免疫沉淀步驟，然后用ErbB2抗體檢測免疫沉淀物。在另一個實施方案中，特異于HER1，HER3，HER2/HER1復(fù)合物或HER2/HER3復(fù)合物的ErbB配基被用于沉淀復(fù)合物，然后檢測復(fù)合物中是否存在HER2。例如，配基被用于與抗生物素蛋白偶聯(lián)，并在生物素柱上純化復(fù)合物。
在另一個實施方案中，例如ELISA或抗體“三明治”型分析中，針對ErbB2抗體被固定在固體支持物上，與腫瘤細胞或腫瘤細胞裂解物接觸，洗滌，然后暴露于抗EGFR或ErbB3的抗體中。后一種抗體的結(jié)合，該結(jié)合可以直接地或者通過偶聯(lián)到可檢測標(biāo)記上的第二種抗體來檢測，表明存在異二聚體。在某些實施方案中，EGFR或ErbB3的抗體被固定，而ErbB2抗體被用于檢測步驟。在另一個實施方案中，ErbB受體的配體被用于替代或者組合抗ErbB受體的抗體。
用EGFR，ErbB2，或ErbB3抗體進行免疫沉淀后，可隨后進行異二聚體的功能性分析，作為免疫印跡的替代或補充。在一個實施方案中，用ErbB3抗體進行免疫沉淀后，分析免疫沉淀物中的受體酪氨酸激酶活性。由于ErbB3不具有內(nèi)在酪氨酸激酶活性，免疫沉淀物中存在酪氨酸激酶活性表明ErbB3最有可能與ErbB2結(jié)合。Graus-Porta et al.，EMBO J.，161647-55(1997)；Klapper et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，964995-5000(1999)。該結(jié)果可通過使用ErbB2抗體的免疫印跡來證實。在另一個實施方案中，用ErbB2抗體進行免疫沉淀后，分析EGFR受體酪氨酸激酶活性。在該分析中，免疫沉淀與放射性ATP以及模擬ErbB2被EGFR轉(zhuǎn)磷酸化的體內(nèi)位點的肽底物接觸。肽發(fā)生磷酸化表示共免疫沉淀，從而EGFR與ErbB2發(fā)生異二聚化。受體酪氨酸激酶活性分析在本領(lǐng)域是熟知的，包括檢測靶點底物的磷酸化的分析，例如，通過磷酸酪氨酸抗體和活化關(guān)聯(lián)的信號傳導(dǎo)路徑，例如MAPK路徑。
對上述方法和分析進行的改變對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說是顯而易見和常規(guī)的。
化學(xué)的或UV交聯(lián)可以被用于共價連接活細胞表面的異二聚體。Hunteret al.，Biochem.J.，320847-53。化學(xué)交聯(lián)劑的例子包括二硫代雙(琥珀酰亞胺基)丙酸(DSP)和3，3′-二硫代雙(磺基琥珀酰亞胺基)丙酸(DTSSP)。在一個實施方案中，來自化學(xué)交聯(lián)的腫瘤細胞的細胞提取物通過SDS-PAGE分析并用EGFR和/或ErbB3的抗體進行免疫印跡。由于ErbB2是EGFR和ErbB3的優(yōu)選異二聚化伴侶，合適分子量的超位移條帶最有可能代表EGFR-ErbB2或ErbB2-ErbB3異二聚體。該結(jié)果可通過隨后用ErbB2抗體進行免疫印跡來證實。
FRET和以熒光為基礎(chǔ)的方法熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)也被用于檢測EGFR-ErbB2或ErbB2-ErbB3異二聚體。FRET根據(jù)能量從供體熒光團轉(zhuǎn)移到受體熒光團，在體內(nèi)和體外檢測蛋白質(zhì)構(gòu)型變化和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。Selvin，Nat.Struct.Biol.，7730-34(2000)。能量轉(zhuǎn)移僅在供體熒光團與受體熒光團足夠相近時發(fā)生。在典型的FRET實驗中，兩種蛋白或者單一蛋白上的兩個位點用不同的熒光探針標(biāo)記。探針中的一個，供體探針，用特定波長的入射光激發(fā)到較高的能量狀態(tài)。然后供體探針將其能量轉(zhuǎn)移到第二個探針上，即受體探針，導(dǎo)致供體熒光強度下降和受體熒光發(fā)射增強。為了測定能量轉(zhuǎn)移的程度，供體在用供體和受體探針標(biāo)記的樣本中的強度與其在僅用供體探針標(biāo)記的樣本中的強度比較。任選地，比較在供體/受體的樣本中和在僅含受體的樣本中的受體強度。合適的探針在本領(lǐng)域是已知的，并包括例如可透過膜的染料，例如熒光素和羅丹明，有機染料，例如花青染料，和鑭系原子。Selvin，同上文。用于檢測和測量能量轉(zhuǎn)移的方法和儀器在本領(lǐng)域也是已知的。Selvin，同上文。
適合于檢測和測量單個細胞中的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的以FRET為基礎(chǔ)的技術(shù)在本領(lǐng)域也是已知的。例如，供體光漂白熒光共振能量轉(zhuǎn)移(pbFRET)顯微鏡和熒光壽命成像顯微鏡(FLIM)可以被用于檢測細胞表面受體的二聚化。Selvin，同上文；Gadella和Jovin，J.Cell Biol.，1291543-58(1995)。在一個實施方案中，pbFRET被在“懸浮液”中或“原位”用在細胞上來檢測和測量EGFR-ErbB2或ErbB2-ErbB3異二聚體的形成，如被描述在Nagy et al.，Cytometry，32120-131(1998)中。這些技術(shù)測量由于能量轉(zhuǎn)移造成的供體熒光壽命的縮短。在一個特別的實施方案中，流式細胞計數(shù)Foerster型FRET技術(shù)(FCET)可被用于研究EGFR-ErbB2和ErbB2-ErbB3異二聚化，如在Nagy et al.，同上文，和Brockhoff et al.，Cytometry，44338-48(2001)中所描述。
FRET優(yōu)選與標(biāo)準(zhǔn)的免疫組織化學(xué)標(biāo)記技術(shù)聯(lián)合使用。Kenworthy，Methods，24289-96(2001)。例如，與合適的熒光染料偶聯(lián)的抗體可以被用作標(biāo)記兩種不同蛋白質(zhì)的探針。如果蛋白質(zhì)與另一蛋白質(zhì)接近，該熒光染料作為FRET的供體和受體。通過標(biāo)準(zhǔn)手段來檢測能量轉(zhuǎn)移?？梢酝ㄟ^流式細胞計數(shù)手段或者通過數(shù)碼顯微鏡系統(tǒng)檢測能量轉(zhuǎn)移，例如共焦顯微鏡或連接到電荷偶聯(lián)裝置(charge-coupled device)(CCD)照相機的寬視野熒光顯微鏡。
在本發(fā)明的一個實施方案中，ErbB2抗體或者EGFR或ErbB3抗體直接用兩種不同熒光團標(biāo)記，例如如在Nagy et al.，同上文中所描述。腫瘤細胞或腫瘤細胞裂解物與進行區(qū)別標(biāo)記的抗體接觸，這些抗體在檢測是否存在EGFR-ErbB2或ErbB2-ErbB3異二聚體的FRET中作為供體和受體。此外，未被標(biāo)記的抗ErbB2的和或者抗EGFR或者抗ErbB3的抗體與被區(qū)別標(biāo)記來作為供體和受體的第二抗體一起使用。參見，例如Brockhoffet al.，同上文。如果發(fā)現(xiàn)標(biāo)記非常接近，那么檢測到能量轉(zhuǎn)移，并確定存在異二聚體。
在另一個實施方案中，特異于HER2和或者特異于HER1或者特異于HER3的ErbB受體的配體被熒光標(biāo)記，并用于FRET研究。
在本發(fā)明的還有其他實施方案中，采用標(biāo)準(zhǔn)的直接或間接免疫熒光技術(shù)和共焦激光掃描顯微鏡，通過共定位(co-localization)ErbB2與或者EGFR或者ErbB3來證明在腫瘤細胞的表面上存在異二聚體。此外，激光掃描成像(LSI)被用于在高通量格式(high-throughput format)例如微孔平板中，檢測抗體結(jié)合以及ErbB2與或者EGFR或者ErbB3共定位，如被描述在Zuck etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9611122-27(1999)。
在還有一個實施方案中，通過鑒定依賴于異二聚體組分的相近性的酶活性來確定存在EGFR-ErbB2和/或ErbB2-ErbB3異二聚體。ErbB2抗體與一種酶偶聯(lián)，而EGFR或ErbB3抗體與第二種酶偶聯(lián)。加入用于第一種酶的第一種底物，該反應(yīng)產(chǎn)生用于第二種酶的第二種底物。這導(dǎo)致與另一種分子的反應(yīng)來生成可檢測的化合物，例如染料。另一個化學(xué)藥品的存在分解了第二種底物，使得與第二種酶的反應(yīng)被阻斷，除非第一種和第二種酶，因此也就是兩種抗體，十分接近。在一個特別的實施方案中，將腫瘤細胞或細胞裂解物與用葡萄糖氧化酶偶聯(lián)的ErbB2抗體，以及用辣根過氧化酶偶聯(lián)的ErbB3或ErbB1抗體接觸。將葡萄糖以及染料前體，例如DAB，和過氧化氫酶加入到反應(yīng)中。產(chǎn)生對DAB染色的顏色確定存在異二聚體。
eTagTM分析系統(tǒng)可以采用基于eTagTM分析系統(tǒng)(Aclara Bio Sciences，Mountain View，CA)的方法檢測異二聚體，如被描述在例如WO 83502和2001年12月6日公開的美國專利申請2001/0049105中，兩者都清楚地全文引入作為參考。eTagTM或“電泳標(biāo)記”包含可檢測的報道分子部分，例如熒光團。其還可以包含“遷移率調(diào)節(jié)物”，遷移率調(diào)節(jié)物基本上由具有獨特的電泳遷移率的部分組成。這些部分使得可以在限定的電泳條件下，例如毛細管電泳(CE)，從復(fù)雜的混合物中分離和檢測eTagTM。包含報道分子部分以及，任選的，遷移率調(diào)節(jié)物的eTagTM的部分通過可裂解連接基團被連接到第一個靶向結(jié)合部分上，生成第一種結(jié)合化合物。第一個靶向結(jié)合部分特異地識別特定的第一個靶點，例如核酸或蛋白質(zhì)。第一個靶向結(jié)合部分無論如何是不被限制的，并且可以是例如多核苷酸或多肽。優(yōu)選地，第一個靶向結(jié)合部分是一種抗體或抗體片段。另外，第一個靶向結(jié)合部分可以是ErbB受體的配體或其具有結(jié)合能力的片段。
連接基團優(yōu)選包含可裂解部分，例如一種酶底物或在限定條件下可以被裂解的任何化學(xué)鍵。當(dāng)?shù)谝粋€靶向結(jié)合部分結(jié)合到其靶點時，裂解劑被導(dǎo)入和/或激活，而連接基團被斷裂，從而釋放包含報道分子部分和遷移率調(diào)節(jié)物的eTagTM的部分。因此，存在“游離”的eTagTM表示靶向結(jié)合部分結(jié)合到其靶點上。
優(yōu)選地，第二種結(jié)合化合物包含裂解劑和特異地識別第二個靶點的第二個靶向結(jié)合部分。第二個靶向結(jié)合部分也是無論如何不是被限制的，并且可以是例如一種抗體或抗體片段或ErbB受體的配體或具有結(jié)合能力的配基片段。如果第一種結(jié)合化合物和第二種結(jié)合化合物十分接近，那么裂解劑將僅斷裂第一種結(jié)合化合物中的連接基團。
在本發(fā)明的一個實施方案中，第一種結(jié)合化合物包含eTagTM，在eTagTM中ErbB2抗體作為第一個靶向結(jié)合部分。第二種結(jié)合化合物包含連接到能夠斷裂eTagTM的連接基團的裂解劑上的EGFR或ErbB3的抗體。優(yōu)選地，裂解劑必須被激活以能夠斷裂連接基團。腫瘤細胞或腫瘤細胞裂解物與結(jié)合到ErbB2上的eTagTM接觸，和與結(jié)合到細胞表面上的EGFR或ErbB3的被修飾的EGFR或ErbB3抗體接觸。優(yōu)選去除未被結(jié)合的結(jié)合復(fù)合物，并在需要時激活裂解劑。如果存在EGFR-ErbB2或ErbB2-ErbB3異二聚體，由于裂解劑和連接基團相鄰近，裂解劑將會斷裂連接基團，并釋放eTagTM。然后通過本領(lǐng)域已知的任何方法，例如毛細管電泳，檢測游離的eTagTM。
在一個實施方案中，裂解劑是可激活的作用于連接基團的化學(xué)藥品種類。例如，可以通過將樣本暴露于光照下來激活裂解劑。
在另一個實施方案中，采用EGFR或ErbB3的抗體作為第一個靶向結(jié)合部分來構(gòu)建eTagTM，而用ErbB2抗體構(gòu)建第二種結(jié)合化合物。
檢測ErbB受體的磷酸化存在ErbB受體磷酸化可被用來證明HER2活化。
在一個實施方案中，通過免疫沉淀一種或多種ErbB受體例如ErbB2(HER2)受體，以及蛋白質(zhì)印跡分析來評價ErbB受體磷酸化。例如，采用抗磷酸酪氨酸抗體來檢測被免疫沉淀的ErbB受體中的被磷酸化的酪氨酸殘基，在凝膠上存在磷酸-HER2條帶確定為陽性?？沽姿崂野彼岬目贵w可以從PanVera(Madison，WI)或Upstate Biotechnology(Lake Placid，NY)購買得到，PanVera(Madison，WI)是Invitrogen，Chemicon InternationalInc.(Temecula，CA)的子公司。缺乏該條帶確定為陰性。
在另一個實施方案中，采用磷酸特異性抗HER2的抗體(克隆PN2A；Thor et al.，J.Clin.Oncol.，18(18)3230-3239(2000))，通過免疫組織化學(xué)評價ErbB2(HER2)受體磷酸化。用于檢測ErbB受體磷酸化的其他方法包括，但是不限于，KIRA ELISA(美國專利號5,766,863；5,891,650；5,914,237；6,025,145；和6,287,784)，質(zhì)譜法(比較磷酸化的和未磷酸化的HER2的大小)，和采用抗HER2的抗體進行e-tag鄰近性分析(例如采用購自AclaraBioSciences(Mountain View，CA)的eTagTM分析試劑盒)。對于eTagTM分析的詳細內(nèi)容在上文中描述。
抗體制備下面的說明是關(guān)于制備按照本發(fā)明所用的治療性和診斷性抗體的示例性技術(shù)。雖然該說明總體上針對抗ErbB2的抗體的制備，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠很容易地修改本公開來制備針對任何ErbB受體的抗體。
用于制備抗體的ErbB2抗原可以是，例如含有所需表位的ErbB2的細胞外結(jié)構(gòu)域或其部分的可溶形式?；蛘?，在細胞表面表達ErbB2的細胞(例如被轉(zhuǎn)化來過度表達ErbB2的NIH-3T3細胞；或癌細胞系例如SK-BR-3細胞，參見Stancovski et al.，PNAS(USA)，888691-8695(1991))可以被用于生產(chǎn)抗體?？捎糜谏a(chǎn)抗體的其他形式的ErbB2對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯然的。
多克隆抗體優(yōu)選地通過多次皮下(sc)或腹膜內(nèi)(ip)注射相關(guān)抗原和佐劑在動物中產(chǎn)生多克隆抗體。采用雙功能或衍生化劑，例如馬來酰亞胺苯甲酰硫代琥珀酰亞胺酯(maleimidobenzoyl sulfosuccinimide ester)(通過半胱氨酸殘基偶聯(lián))，N-羥基琥珀酰亞胺(通過賴氨酸殘基偶聯(lián))，戊二醛，琥珀酐，SOCl2，或R1N＝C＝NR，其中R和R1是不同的烷基基團，將相關(guān)抗原偶聯(lián)到在將被免疫的物種中具有免疫原性的蛋白質(zhì)上是有用的，這些蛋白例如匙孔血藍蛋白，血清白蛋白，牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑。
通過組合例如100μg或5μg蛋白質(zhì)或偶聯(lián)物(分別用于兔或小鼠)與3倍體積的弗氏完全佐劑，并在多個部位皮內(nèi)注射該溶液以針對抗原，免疫原性交聯(lián)物或衍生物來免疫動物，一個月后，1/5-1/10的最初量的溶解在弗氏完全佐劑中的肽或偶聯(lián)物在多個部位上進行皮下注射來加強免疫動物。7-14天后，給動物放血，分析血清中的抗體滴度。加強免疫動物直到該滴度達到穩(wěn)定狀態(tài)。優(yōu)選地，用相同抗原但是偶聯(lián)到不同蛋白質(zhì)上和/或通過不同交聯(lián)劑偶聯(lián)的交聯(lián)物來加強免疫動物。還可以蛋白質(zhì)融合的形式在重組細胞培養(yǎng)物中制備偶聯(lián)物。此外，凝集劑例如明礬適合被用于增強免疫反應(yīng)。
單克隆抗體單克隆抗體是從實質(zhì)上均一的抗體的群體中獲得，即包含群體的各個抗體除了可能以最小量存在的可能天然發(fā)生的突變外，是相同的。因此，修飾語“單克隆”表示抗體的特征，即不是無聯(lián)系的抗體的混合物。
例如，單克隆抗體可以通過最早在Kohler et al.，Nature，256495(1975)中描述的雜交瘤方法來制備，或者可通過重組DNA方法(如美國專利號4,816,567)來制備。
在雜交瘤方法中，小鼠或其他合適的宿主動物，例如倉鼠如上文所描述進行免疫來引發(fā)生產(chǎn)或能夠生產(chǎn)抗體的淋巴細胞的產(chǎn)生，該抗體將特異地結(jié)合用于免疫接種的蛋白質(zhì)?；蛘撸隗w外免疫淋巴細胞。然后，采用合適的融合試劑，例如聚乙二醇將淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，形成雜交瘤細胞(Goding，“單克隆抗體原理和實踐”，59-103(Academic Press，1986))。
如此制備的雜交瘤細胞被接種并生長在合適的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中優(yōu)選包含一種或多種抑制未融合的親本骨髓瘤細胞的生長或存活的物質(zhì)。例如，如果親本骨髓瘤細胞缺乏酶次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，用于雜交瘤的培養(yǎng)基通常將包括次黃嘌呤、氨蝶呤和胸苷(HAT培養(yǎng)基)，這些物質(zhì)阻止HGPRT缺陷細胞的生長。
優(yōu)選的骨髓瘤細胞是那些有效融合，通過所選擇的生產(chǎn)抗體的細胞支持穩(wěn)定高水平地生產(chǎn)抗體，并且對培養(yǎng)基例如HAT培養(yǎng)基敏感的細胞。其中，優(yōu)選的骨髓瘤細胞系是鼠骨髓瘤系，例如那些來源于從Salk Institute CellDistribution Center，San Diego，California USA獲得的MOPC-21和MPC-11小鼠腫瘤的骨髓瘤系，和得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心Rockville，MarylandUSA的SP-2或X63-Ag8-653細胞。人骨髓瘤和小鼠人異骨髓瘤細胞系也被描述用于制備人單克隆抗體(Kozbor，J.Immunol.，1333001(1984)；和Brodeur et al.，“單克隆抗體制備技術(shù)及應(yīng)用”，51-63(Marcel Dekker，Inc.，紐約，1987))。
分析其中生長了雜交瘤細胞的培養(yǎng)基中針對抗原的單克隆抗體的生產(chǎn)。優(yōu)選地，通過免疫沉淀或通過體外結(jié)合分析，例如放射免疫測定(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)，確定雜交瘤細胞制備的單克隆抗體的結(jié)合特異性。
例如，可通過Munson et al.，Anal.Biochem.，107220(1980)的斯卡查德分析來確定單克隆抗體的結(jié)合親合力。
在雜交瘤細胞被鑒定出生產(chǎn)具有所需特異性、親合力和/或活性的抗體后，通過有限稀釋操作亞克隆該克隆，并通過標(biāo)準(zhǔn)方法來生長(Goding，“單克隆抗體原理和實踐”，59-103(Academic Press，1986))。用于該目的的合適培養(yǎng)基包括，例如D-MEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。此外，雜交瘤細胞可以作為腹水腫瘤在動物中體內(nèi)生長。
亞克隆分泌的單克隆抗體采用傳統(tǒng)的抗體純化操作例如蛋白質(zhì)A-瓊脂糖、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親合層析，從培養(yǎng)基、腹水液或血清中適當(dāng)分離。
采用常規(guī)操作(例如通過采用能夠特異性地結(jié)合編碼鼠抗體的重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)容易分離和測序編碼單克隆抗體的DNA。雜交瘤細胞作為這種DNA的優(yōu)選來源。一旦被分離，DNA可被加入到表達載體中，然后將表達載體轉(zhuǎn)染到宿主細胞中，例如大腸桿菌細胞、猿猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或者不另外生產(chǎn)抗體蛋白的骨髓瘤細胞，以獲得單克隆抗體在重組的宿主細胞中的合成。關(guān)于在細菌中重組表達編碼抗體的DNA的綜述文章包括Skerra et al.，Curr.Opinion in Immunol.，5256-262(1993)和Plückthun，Immunol.Revs.，130151-188(1992)。
在另一個實施方案中，可以采用在McCafferty et al.，Nature，348552-554(1990)中描述的技術(shù)從所生成的抗體噬菌體文庫中分離單克隆抗體或抗體片段。Clackson et al.，Nature，352624-628(1991)和Marks et al.，J.Mol.Biol.，222581-597(1991)分別描述了采用噬菌體文庫分離鼠和人的抗體。隨后的出版物中描述了通過鏈改組來制備高親合性(nM范圍)的人抗體(Marks et al.，Bio/Technology，10779-783(1992))，以及組合感染和體內(nèi)重組作為構(gòu)建非常大噬菌體文庫的策略(Waterhouse et al.，Nuc.Acids.Res.，212265-2266(1993))。因此，對于用于分離單克隆抗體的傳統(tǒng)單克隆抗體雜交瘤技術(shù)來說，這些技術(shù)是可行的替代。
DNA還可以被修飾，例如通過用人重鏈和輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域的編碼序列來替代同源的鼠序列(美國專利號4,816,567；和Morrison，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，816851(1984))，或者通過將全部或部分的非免疫球蛋白多肽的編碼序列共價地連接到免疫球蛋白編碼序列上。
典型地，用這種非免疫球蛋白多肽來替代抗體的恒定結(jié)構(gòu)域，或者用它們來替代抗體的抗原結(jié)合位點的可變結(jié)構(gòu)域，以建立包含對一個抗原具有特異性的抗原結(jié)合位點以及對一個不同抗原具有特異性的另一個抗原結(jié)合位點的嵌合雙價抗體。
人源化抗體用于人源化非人類的抗體的方法已經(jīng)在本領(lǐng)域被描述。
優(yōu)選地，人源化的抗體具有從非人來源被導(dǎo)入其中的一個或多個氨基酸殘基。這些非人類的氨基酸殘基通常被稱作為“輸入”殘基，其通常來自“輸入”的可變結(jié)構(gòu)域。人源化基本上可以按照Winter及其同事的方法進行(Jones et al.，Nature，321522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature，332323-327(1988)；Verhoeyen et al.，Science，2391534-1536(1988))，通過用高變區(qū)序列取代人抗體的相應(yīng)序列。因此，這種“人源化”的抗體是嵌合抗體(美國專利號4,816,567)，其中比完整的人可變結(jié)構(gòu)域小得多的部分被來自非人類物種的相應(yīng)序列取代。實際上，人源化的抗體典型地是人的抗體，其中有些高變區(qū)殘基以及可能有些FR殘基被來自嚙齒類動物抗體的類似位點上的殘基取代。
選擇人的輕鏈和重鏈的可變結(jié)構(gòu)域，以用于制備人源化的抗體對于降低抗原性是非常重要的。按照所謂的“最佳適配(best-fit)”的方法，用已知的人的可變結(jié)構(gòu)域序列的整個文庫篩選嚙齒類動物抗體的可變結(jié)構(gòu)域的序列。然后與嚙齒類動物最接近的人序列被接受作為人源化抗體的人的骨架區(qū)(FR)(Sims et al.，J.Immunol.，1512296(1993)；Chothia et al.，J.Mol.Biol.，196901(1987))。另一種方法采用來自特定的輕鏈或重鏈亞群的所有人抗體的共有序列的特定骨架區(qū)。相同的骨架可以被用于幾種不同的人源化抗體(Carteret al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，894285(1992)；Presta et al.，J.Immunol.，1512623(1993))。
被人源化的抗體保留對抗原的高親合力以及其他有利的生物學(xué)特性也是重要的。為了達到這個目的，按照優(yōu)選的方法，通過采用親本和人源化序列的三維模型分析親本序列和各種構(gòu)想的人源化產(chǎn)物的過程來制備人源化的抗體。三維的免疫球蛋白模型是一般可獲得的，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的。計算機程序是可獲得的，其闡明和顯示被選擇的候選免疫球蛋白序列的很可能的三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)。對這些顯示的探查可以分析殘基在候選免疫球蛋白序列行使功能中的可能作用，即分析影響候選免疫球蛋白結(jié)合其抗原的能力的殘基。通過這種方式，可以從受體和輸入序列中選擇和組合FR殘基，來獲得期望的抗體特性，例如增強對目標(biāo)抗原的親合力?？傊?，高變區(qū)的殘基直接地和最實質(zhì)性地參與影響抗原結(jié)合。
結(jié)合ErbB2并阻斷ErbB受體的配基活化的示例性人源化抗ErbB2的抗體被描述在WO 01/0245，其在此引入作為參考。在此特別感興趣的人源化抗體基本上與鼠單克隆抗體2C4(或其Fab片段)一樣有效地阻斷EGF，TGF-α和/或HRG介導(dǎo)的MAPK的活化，和/或基本上與鼠單克隆抗體2C4(或其Fab片段)一樣有效地結(jié)合ErbB2。人源化抗體在此可以例如，包含被結(jié)合到人可變重鏈結(jié)構(gòu)域的非人的高變區(qū)殘基，并且可能在選自由69H，71H和73H組成的組中的一個位置上包含骨架區(qū)(FR)取代，采用的是在Kabat et al.，“具有免疫學(xué)意義的蛋白質(zhì)的序列”，第5版，Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD(1991)中給出的可變結(jié)構(gòu)域編號系統(tǒng)。在一個實施方案中，人源化的抗體在69H，71H和73H的兩個或所有位點包含F(xiàn)R取代。
示例性的目的人源化抗體在此包含可變的重鏈結(jié)構(gòu)域互補決定殘基GFTFTDYTMX，其中X優(yōu)選是D或S(SEQ ID NO7)；DVNPNSGGSIYNQRFKG(SEQ ID NO8)；和/或NLGPSFYFDY(SEQ IDNO9)，任選地包含這些CDR殘基的氨基酸修飾，例如，其中修飾基本上保持或改善抗體的親合力。例如，目的抗體變體可在上述的可變重鏈CDR序列中具有從約1個到約7個或者約5個氨基酸取代。這種抗體變體可以通過親和力成熟(affinity maturation)來制備，例如如下文所述。最優(yōu)選的人源化抗體包含SEQ ID NO4中的可變的重鏈結(jié)構(gòu)域氨基酸序列(附圖1B)。
例如，除了在前述段落中的那些可變重鏈結(jié)構(gòu)域CDR殘基之外，人源化抗體還可以包含可變的輕鏈結(jié)構(gòu)域互補決定殘基KASQDVSIGVA(SEQID NO10)；SASYX1X2X3，其中X1優(yōu)選為R或L，X2優(yōu)選為Y或E，和X3優(yōu)選為T或S(SEQ ID NO11)；和/或QQYYIYPYT(SEQ ID NO12)，這種人源化抗體任選地包含上述CDR殘基的氨基酸修飾，例如，其中修飾基本上保持或改善抗體的親合力。例如，目的抗體變體可能在上述的可變輕鏈CDR序列中具有從約1個到約7個或者約5個氨基酸取代。這種抗體變體可以通過親和力成熟來制備，例如如下文所述。最優(yōu)選的人源化抗體包含SEQ ID NO3中的可變的輕鏈結(jié)構(gòu)域氨基酸序列(附圖1A)。
本申請還考慮親合力成熟的抗體，其結(jié)合ErbB2并阻斷ErbB受體的配基活化。親本抗體可以是人抗體或人源化抗體，例如包含分別為SEQ ID No3和4的可變輕鏈和/或重鏈序列(即變體574；附圖1A和B)。親合力成熟的抗體優(yōu)選以高于鼠2C4或變體574的親合力結(jié)合到ErbB2受體上(如采用ErbB2細胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)ELISA評價，例如親合力改善從約2倍或約4倍到約100倍或約1000倍)。示例性的用于取代的可變重鏈CDR殘基包括H28，H30，H34，H35，H64，H96，H99，或者兩個或多個的組合(如這些殘基中的2，3，4，5，6或7個)。用于改變的可變輕鏈CDR殘基的例子包括L28，L50，L53，L56，L91，L92，L93，L94，L96，L97或兩個或多個的組合(如這些殘基中的2至3、4、5或直到約10個)。
還考慮了各種形式的人源化抗體或親合力成熟的抗體。例如，人源化抗體或親合力成熟的抗體可以是抗體片段，例如Fab，其任選地與一個或多個細胞毒性劑偶聯(lián)來產(chǎn)生一種免疫偶聯(lián)物?；蛘?，人源化抗體或親合力成熟的抗體可以是完整抗體，例如完整的IgGl抗體。
人抗體作為人源化的替代，可以制備人抗體。例如現(xiàn)在能夠制備轉(zhuǎn)基因動物(例如小鼠)，當(dāng)缺乏內(nèi)源性免疫球蛋白產(chǎn)物時，該轉(zhuǎn)基因動物能夠在免疫后產(chǎn)生人抗體的所有組分。例如，已經(jīng)描述，在嵌合和種系突變小鼠中純合缺失抗體重鏈連接區(qū)(heavy-chain joining region)(JH)基因?qū)е聝?nèi)源抗體生產(chǎn)的完全抑制。將人種系免疫球蛋白基因陣列轉(zhuǎn)移到這種種系突變小鼠，將會導(dǎo)致在抗原激發(fā)時產(chǎn)生人抗體。參見，如Jakobovits et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，902551(1993)；Jakobovits et al.，Nature，362255-258(1993)；Bruggennann et al.，Year in Immuno.，733(1993)；和美國專利號5,591,669；5,589,369和5,545,807。
或者，噬菌體展示技術(shù)(McCafferty et al.，Nature，348552-553(1990))可以被用于體外從來自未被免疫的供體的免疫球蛋白可變(V)結(jié)構(gòu)域基因所有組成中生產(chǎn)人抗體和抗體片段。按照這種技術(shù)，抗體V結(jié)構(gòu)域基因按照讀框被克隆到絲狀噬菌體例如M13或fd的主要或次要外殼蛋白基因中，并以功能性抗體片段展示在噬菌體顆粒的表面上。由于絲狀顆粒含有噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，基于抗體的功能性特性的選擇還會導(dǎo)致對編碼展示那些特性的抗體的基因的選擇。因此，噬菌體模擬了B細胞的一些特性。噬菌體展示可以以各種形式實現(xiàn)；對于此的綜述，參見如Johnson，Kevin S.和Chiswell，DavidJ.，Current Opinion in Structural Biology，3564-571(1993)。一些V-基因區(qū)段的來源可以被用于噬菌體展示。Clackson et al.，Nature，352624-628(1991)從來源于被免疫小鼠的脾臟的一個小的隨機組合V基因文庫中分離到一系列不同的抗唑酮抗體?；旧习凑誐arks et al.，J.Mol.Biol.，222581-597(1991)，或Griffith et al.，EMBO J.，12725-734(1993)中描述的技術(shù)可以構(gòu)建來自未被免疫的人供體的V基因的所有組成成分，并且可以分離抗一系列不同抗原(包括自體抗原)的抗體。還可以參見美國專利號5,565,332和5,573,905。
如上所討論的，還可以通過體外激活的B細胞來產(chǎn)生人抗體(參見美國專利5,567,610和5,229,275)。
人抗ErbB2的抗體被描述在1998年6月30日授權(quán)的美國專利號5,772,997和1997年1月3日公開的WO 97/00271中。
抗體片段各種技術(shù)已經(jīng)被開發(fā)來生產(chǎn)抗體片段。
傳統(tǒng)上，這些片段通過蛋白質(zhì)水解消化完整的抗體來獲得(參見，如Morimoto et al.，Journal of Biochemical and Biophysical Methods，24107-117(1992)；和Brennan et al.，Science，22981(1985))。但是，現(xiàn)在可以通過重組宿主細胞直接地制備這些片段。例如，可以從上面討論的抗體噬菌體文庫中分離抗體片段。或者，可以從大腸桿菌中直接回收Fab′-SH片段，并化學(xué)偶聯(lián)，來形成F(ab′)2片段(Carter et al.，Bio/Technology，10163-167(1992))。按照另一種方法，可以從重組宿主細胞培養(yǎng)物中直接分離F(ab′)2片段。用于生產(chǎn)抗體片段的其他技術(shù)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯然的。在其他實施方案中，所選擇的抗體是單鏈Fv片段(scFv)。參見WO93/16185；美國專利號5,571,894；和美國專利號5,587,458?？贵w片段還可以是線性抗體，如，在美國專利5,641,870中所描述的。這種線性抗體片段可以是單一特異性的或雙特異性的。
雙特異性抗體雙特異性抗體是對至少兩個不同表位具有結(jié)合特異性的抗體。示例性的雙特異性抗體可能結(jié)合到ErbB2蛋白的兩個不同的表位上。其他的這種抗體可能組合ErbB2結(jié)合位點與EGFR，ErbB3和/或ErbB4的結(jié)合位點?；蛘?，抗ErbB2的臂可能與結(jié)合白細胞上的觸發(fā)分子例如T細胞受體分子(如CD2或CD3)，或者IgG的Fc受體(FcγR)，例如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)的臂組合，來將細胞防御機制集中在表達ErbB2的細胞上。雙特異性抗體還可以被用于將細胞毒性劑定位在表達ErbB2的細胞上。這些抗體具有ErbB2結(jié)合臂，以及結(jié)合細胞毒性劑(如皂草素，抗干擾素-α，長春花生物堿，蓖麻毒蛋白A鏈，氨甲蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。雙特異性抗體可以作為全長抗體或抗體片段(例如F(ab′)2雙特異性抗體)被制備。
WO 96/16673中描述了一種雙特異性抗ErbB2/抗FcγRIII抗體，而美國專利號5,837,234公開了一種雙特異性的抗ErbB2/抗FcγRI抗體。雙特異性的抗ErbB2/Fcα抗體被示于WO 98/02463中。美國專利號5,821,337教導(dǎo)了一種雙特異性的抗ErbB2/抗CD3抗體。
用于制備雙特異性的抗體的方法在本領(lǐng)域是已知的。全長雙特異性抗體的傳統(tǒng)制備是基于共表達兩種免疫球蛋白重鏈-輕鏈對，其中這兩條鏈具有不同的特異性(Millstein et al.，Nature，305537-539(1983))。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈隨機分類，這些雜交瘤(“四鏈瘤”quadromas)生成了10種不同抗體分子的可能混合物，其中只有一種抗體分子具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。通常通過親合層析步驟來純化正確的分子，是非常繁瑣的，并且產(chǎn)量很低。類似的操作被公開在WO 93/08829，和Traunecker et al.，EMBO J.，103655-3659(1991)中。
按照不同方法，具有所需結(jié)合特異性的抗體可變結(jié)構(gòu)域(抗體-抗原結(jié)合位點)被融合到免疫球蛋白的恒定結(jié)構(gòu)域序列上。優(yōu)選與包含鉸鏈區(qū)、CH2、和CH3區(qū)域的至少一部分的免疫球蛋白重鏈恒定結(jié)構(gòu)域融合。優(yōu)選具有在至少一個融合體中出現(xiàn)的含有輕鏈結(jié)合必需位點的第一重鏈恒定區(qū)(CH1)。編碼免疫球蛋白重鏈融合體以及，如果需要，免疫球蛋白輕鏈的DNA被插入到各自獨立的表達載體中，并被共轉(zhuǎn)染到合適的宿主生物體中。當(dāng)構(gòu)建中所用的三種多肽鏈的不相等比例產(chǎn)生最佳產(chǎn)量時，這給調(diào)整實施方案中三種多肽片段相互比例提供很大的靈活性。但是，當(dāng)至少兩種多肽鏈以相等比例表達獲得了高產(chǎn)量時或者當(dāng)該比例不是特別重要時，有可能在一個表達載體中插入兩種或全部三種多肽鏈的編碼序列。
在這種方法的優(yōu)選實施方案中，雙特異性抗體由一個臂中的具有第一結(jié)合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈，以及另一個臂上的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結(jié)合特異性)組成。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，由于僅在雙特異性分子的一半中存在免疫球蛋白輕鏈提供了一種便捷的分離途經(jīng)，這種不對稱結(jié)構(gòu)便于從不期望的免疫球蛋白鏈組合中分離期望的雙特異性化合物。這種方法被公開在WO 94/04690中。生產(chǎn)雙特異性抗體的更加詳細內(nèi)容參見，例如Suresh et al.，Methods in Enzymology，121210(1986)。
按照在美國專利號5,731,168中描述的另一方法，可以工程化改造一對抗體分子之間的界面來使異二聚體的百分比最大化，該異二聚體從重組細胞培養(yǎng)物中回收。優(yōu)選的界面包含抗體恒定結(jié)構(gòu)域的CH3結(jié)構(gòu)域的至少一部分。在這種方法中，來自第一抗體分子界面的一條或多條小氨基酸側(cè)鏈用較大的側(cè)鏈(如酪氨酸或色氨酸)替代。通過用較小的側(cè)鏈(如丙氨酸或蘇氨酸)替換大氨基酸側(cè)鏈在第二抗體分子的界面上產(chǎn)生與大側(cè)鏈相同或類似大小的補償“空穴”。這提供一種機制來提高異二聚體相對于其他不需要的終產(chǎn)物，例如同型二聚體的產(chǎn)量。
雙特異性抗體包括交聯(lián)的或“異偶聯(lián)物”抗體。例如，異偶聯(lián)物中的抗體之一可以被偶聯(lián)到抗生物素蛋白上，另一個則偶聯(lián)到生物素上。這種抗體被建議用于例如將免疫系統(tǒng)細胞靶向不需要的細胞(美國專利號4,676,980)，以及用于治療HIV感染(WO 91/00360，WO 92/200373，和EP 03089)。異偶聯(lián)物抗體可以采用任何方便的交聯(lián)方法來制備。合適的交聯(lián)劑以及大量交聯(lián)技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的，被公開在美國專利號4,676,980中。
用于從抗體片段生產(chǎn)雙特異性抗體的技術(shù)也在文獻中被描述。例如，雙特異性抗體可以采用化學(xué)連接制備。Brennan et al.，Science，22981(1985)描述了一種操作，其中完整抗體被蛋白質(zhì)水解裂解產(chǎn)生F(ab′)2片段。這些片段在二硫酚絡(luò)合劑亞砷酸鈉的存在下被還原以穩(wěn)定鄰近的二硫酚，并防止分子間二硫化物的形成。生成的Fab′片段然后被轉(zhuǎn)化為硫代硝基苯甲酸鹽(TNB)衍生物。然后通過用巰基乙胺還原，F(xiàn)ab′-TNB衍生物之一被再轉(zhuǎn)化為Fab′-硫羥，與等克分子數(shù)的其他Fab′-TNB衍生物混合來形成雙特異性抗體。生成的雙特異性抗體可以被用作選擇性固定酶的試劑。
最近的進展使得從大腸桿菌中直接回收Fab′-SH片段變得更加容易，這些片段可以被化學(xué)偶聯(lián)來形成雙特異性抗體。Shalaby et al.，J.Exp.Med.，175217-225(1992)中描述了生產(chǎn)完全人源化的雙特異性抗體F(ab′)2分子。每個Fab′片段分別從E.coli中分泌，并在體外定向化學(xué)偶聯(lián)來形成雙特異性抗體。如此形成的雙特異性抗體能夠結(jié)合到過度表達ErbB2受體的細胞和正常的人T細胞上，并且觸發(fā)人細胞毒性淋巴細胞針對人乳腺腫瘤靶點的裂解活性。
各種用于直接從重組細胞培養(yǎng)物中制備和分離雙特異性抗體片段的技術(shù)也已經(jīng)被描述。例如已經(jīng)采用亮氨酸拉鏈制備了雙特異性抗體。Kostelnyet al.，J.Immunol.，148(5)1547-1553(1992)。通過基因融合，來自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽被連接到兩種不同抗體的Fab′部分上?？贵w同型二聚體的鉸鏈區(qū)被還原來形成單體，然后再次被氧化形成抗體異二聚體。這種方法還可以被用于生產(chǎn)抗體同型二聚體。被描述在Hollinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，906444-6448(1993)中的“微型雙功能”技術(shù)給制備雙特異性抗體片段提供可供選擇的機制。該片段包含通過接頭被連接到輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)上的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)，該接頭太短，以至同一條鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域之間不能配對。因此，一個片段上的VH和VL結(jié)構(gòu)域被迫與另一條片段上的互補VL和VH結(jié)構(gòu)域配對，從而形成兩個抗原結(jié)合位點。通過采用單鏈Fv(sFv)二聚體來制備雙特異性抗體片段的另一策略也已經(jīng)被報道。參見Gruber et al.，J.Immunol.，1525368(1994)。
還考慮到具有二價以上的抗體。例如，可制備三特異性抗體。Tutt et al.，J.Immunol.，14760(1991)。
其他的氨基酸序列修飾還考慮到抗ErbB2的抗體的氨基酸序列修飾。例如，有可能期望改善抗體的結(jié)合親合力和/或其他的生物學(xué)特性。通過將適當(dāng)?shù)暮塑账岣淖円肟笶rbB2的抗體的核酸中，或者通過肽合成來制備抗ErbB2的抗體的氨基酸序列變體。這種修飾包括，例如，缺失和/或插入和/或取代抗ErbB2的抗體的氨基酸序列中的殘基。進行缺失、插入和取代的任何組合來獲得最終的構(gòu)建體，只要最終的構(gòu)建體具有所需的特征。氨基酸改變也可改變抗ErbB2抗體的翻譯后加工，例如改變糖基化位點的數(shù)量或位置。
用于鑒定作為誘變優(yōu)選位置的抗ErbB2抗體的某些殘基或區(qū)域的有用方法稱作為“丙氨酸掃描誘變”，被描述在Cunningham和Wells，Science，2441081-1085(1989)中。在此，鑒定殘基或目標(biāo)殘基組(如帶電荷的殘基，例如精氨酸，天冬氨酸，組氨酸，賴氨酸，和谷氨酸)，并且用中性或帶負電荷的氨基酸(最優(yōu)選為丙氨酸或多聚丙氨酸)替換，來影響該氨基酸與ErbB2抗原的相互作用。那些表明對取代具有功能性靈敏性的氨基酸位置通過在或?qū)θ〈稽c引入更多或其他變化來改善。因此，雖然用于導(dǎo)入氨基酸序列變化的位點被預(yù)先確定，但是不必預(yù)先確定突變本身的性質(zhì)。例如，為了分析在特定位點上突變的進行，在目標(biāo)密碼子或區(qū)域上進行丙氨酸掃描或隨機誘變，用所需活性篩選被表達的抗ErbB2抗體變體。
氨基酸序列插入包括長度在一個殘基到含有上百或更多殘基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及單個或多個氨基酸殘基的序列內(nèi)插入。末端插入的例子包括具有N末端甲硫氨酰殘基的抗ErbB2抗體或者融合到細胞毒性多肽上的抗體。抗ErbB2抗體分子的其他插入變體包括抗ErbB2抗體的N-或C-末端融合到報道分子，酶(例如ADEPT)或者延長抗體的血清半衰期的多肽上。
另一種類型的變體是氨基酸取代變體。這些變體在抗ErbB2抗體中具有至少一個氨基酸殘基被不同殘基取代。對取代誘變來說最感興趣的位點包括高變區(qū)，但FR改變也被考慮在內(nèi)。保守性取代顯示在表1的“優(yōu)選取代”的標(biāo)題下。如果這種取代導(dǎo)致生物學(xué)活性的變化，那么導(dǎo)入在表1中稱作“示例性取代”或者如下文關(guān)于氨基酸分類中進一步描述的更實質(zhì)性改變，并篩選產(chǎn)物。
表1


抗體生物學(xué)特性的實質(zhì)性改變是通過選擇取代來實現(xiàn)，這些取代在其保持如下方面的效果上具有顯著區(qū)別(a)取代區(qū)域的多肽主鏈結(jié)構(gòu)，例如折疊或螺旋構(gòu)型，(b)靶位點的分子的電荷或疏水性，或(c)側(cè)鏈體積?；诠餐膫?cè)鏈特性，天然存在的殘基被分成幾組(1)疏水的正亮氨酸，甲硫氨酸，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸；(2)中性親水的半胱氨酸；絲氨酸；蘇氨酸；(3)酸性的天冬氨酸，谷氨酸；(4)堿性的天冬酰胺，谷氨酰胺，組氨酸，賴氨酸，精氨酸；(5)影響側(cè)鏈定向的殘基甘氨酸，脯氨酸；和(6)芳香族色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸。
非保守取代將要求將這些種類之一的一個成員換成另一個種類的。
任何不參與維持抗ErbB2的抗體的正確構(gòu)象的半胱氨酸殘基也可被取代，通常用絲氨酸取代，來改善該分子的氧化穩(wěn)定性，并防止異常的交聯(lián)。相反，可以在抗體中加入半胱氨酸鍵來改善其穩(wěn)定性(特別是當(dāng)抗體為抗體片段例如Fv片段時)。
特別優(yōu)選的一類取代變體涉及取代親本抗體的一個或多個高變區(qū)殘基(例如人源化的或人抗體)。一般地，被選擇用于進一步開發(fā)的生成抗體相對于產(chǎn)生其的親本抗體，將具有改善了的生物學(xué)特性。用于生產(chǎn)這種取代變體的便捷方法涉及采用噬菌體展示的親合力成熟。簡而言之，幾個高變區(qū)位點(如6-7個位點)被突變來在每一位點上產(chǎn)生所有可能的氨基酸取代。如此生產(chǎn)的抗體變體顯示為從作為融合體的絲狀噬菌體顆粒到被包裝在每一顆粒中的M13的基因III產(chǎn)物的單價形式。然后如在此所公開，篩選噬菌體展示的變體的生物學(xué)活性(如結(jié)合親合力)。為了鑒定用于修飾的候選高變區(qū)位點，可以進行丙氨酸掃描誘變來鑒定對抗原結(jié)合作出顯著貢獻的高變區(qū)殘基?？蛇x擇地或者額外地，分析抗原-抗體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)來鑒定抗體和人ErbB2的接觸點是有益的。這種接觸殘基和鄰近殘基是用于按照在此詳述的技術(shù)進行的取代的候選。一旦生成這種變體，對變體群體進行如在此所述的篩選，而一個或多個相關(guān)分析中具有優(yōu)良特性的抗體可被選擇用于進一步開發(fā)。
另一種類型的氨基酸變異改變抗體的原始糖基化模式。所謂改變是指刪除一個或多個存在于抗體中的糖類部分，和/或增加一個或多個不存在于抗體中的糖基化位點。
抗體的糖基化典型的是N-聯(lián)或0-聯(lián)的。N-聯(lián)是指糖部分附著到天冬氨酸殘基的側(cè)鏈上。三肽序列天冬氨酸-X-絲氨酸和天冬氨酸-X-蘇氨酸，其中X是除了脯氨酸外的任何氨基酸，是糖部分酶催化附著到天冬氨酸側(cè)鏈上的識別序列。因此，在多肽中這些三肽序列中任何一種的存在產(chǎn)生了潛在的糖基化位點。0-聯(lián)糖基化是指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附著到羥基氨基酸上，最通常為絲氨酸或蘇氨酸，雖然也可以采用5-羥脯氨酸或5-羥賴氨酸。
將糖基化位點添加到抗體上方便地是通過改變氨基酸序列使其含有一個或多個上述的三肽序列(用作N-聯(lián)糖基化位點)來實現(xiàn)。這種改變還可以通過增加或替換一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基到原始抗體的序列上(作為0-聯(lián)糖基化位點)。
編碼抗ErbB2抗體的氨基酸序列變體的核酸分子通過本領(lǐng)域知曉的各種方法來制備。這些方法包括，但是不限于，從天然來源中分離(在為天然存在的氨基酸序列變體的情況下)或者通過早先制備的變體或非變體形式的抗ErbB2抗體的寡核苷酸介導(dǎo)(或定點)誘變，PCR誘變和表達盒誘變來制備。
有可能期望在效應(yīng)子功能方面改變本發(fā)明的抗體，例如來增強抗體的抗原依賴的細胞介導(dǎo)的細胞毒性(ADCC)和/或補體依賴的細胞毒性(CDC)。這可以通過在抗體的Fc區(qū)導(dǎo)入一個或多個氨基酸取代來實現(xiàn)。作為選擇或者另外地，半胱氨酸殘基可以被導(dǎo)入Fc區(qū)，從而在該區(qū)域形成鏈間二硫鍵。如此生成的同型二聚抗體可能具有改進的內(nèi)在化能力和/或提高補體介導(dǎo)的細胞殺傷和抗體依賴的細胞性細胞毒性(ADCC)。參見Caron et al.，J.ExpMed.，1761191-1195(1992)和Shopes，B.，J.Immunol.，1482918-2922(1992)。具有增強的抗腫瘤活性的同型二聚體抗體還可以采用如在Wolff et al.，Cancer Research，532560-2565(1993)中描述的異型雙功能交聯(lián)劑來制備?；蛘?，可以改造抗體，使之具有雙Fc區(qū)，從而具有增強的補體溶解和ADCC能力。參見Stevenson et al，Anti-Cancer Drug Design，3219-230(1989)。
為了延長抗體的血清半衰期，可以如在美國專利5,739,277中所描述在抗體(特別是抗體片段)中摻入補救受體結(jié)合表位。如在此所用，術(shù)語“補救受體結(jié)合表位”是指IgG分子(如IgGI，IgG2，IgG3，或IgG4)的Fc區(qū)的表位，該表位負責(zé)延長IgG分子的體內(nèi)血清半衰期。
篩選具有期望特性的抗體用于生產(chǎn)抗體的技術(shù)已經(jīng)在上面被描述。如果需要，還可以進一步選擇具有某種生物學(xué)特性的抗體。
為了鑒定阻斷ErbB受體的配基活化的抗體，可測定抗體阻斷ErbB配基結(jié)合到表達ErbB受體(例如偶聯(lián)到另一種ErbB受體上，該ErbB受體與目的ErbB受體形成ErbB異寡聚物)的細胞的能力。例如，天然地表達或者被轉(zhuǎn)染來表達ErbB異寡聚物的ErbB受體的細胞可以與抗體一起孵育，然后暴露給被標(biāo)記的ErbB配基。然后可評價抗ErbB2的抗體阻斷配基結(jié)合到ErbB異寡聚物中的ErbB受體上的能力。
例如，通過抗ErbB2抗體抑制HRG結(jié)合到MCF7乳腺腫瘤細胞系上，可以基本上如WO 01/00245中所述，使用以在冰上以24孔平板的形式的單層MCF7培養(yǎng)物進行。將抗ErbB2的單克隆抗體添加到各個孔中，并孵育30分鐘。然后可加入125I-標(biāo)記的rHRGβ1177-224(25pm)，繼續(xù)孵育4-16小時。繪制劑量反應(yīng)曲線，計算目的抗體的IC50值。在一個實施方案中，阻斷ErbB受體的配基活化的抗體在本分析中抑制HRG結(jié)合到MCF7細胞的IC50為約50nM或更低，更加優(yōu)選為1OnM或更低。當(dāng)抗體是抗體片段，例如Fab片段時，在本分析中抑制HRG結(jié)合到MCF7細胞的IC50可以是，例如約100nM或更低，更優(yōu)選為50nM或更低。
可選擇地或另外地，可評定抗ErbB2抗體阻斷存在于ErbB異寡聚物中的ErbB受體的ErbB配基刺激的酪氨酸磷酸化的能力。例如，內(nèi)源性地表達或被轉(zhuǎn)染來表達ErbB受體的細胞可以與抗體一起孵育，然后使用抗磷酸酪氨酸單克隆(其任選地與可檢測的標(biāo)記偶聯(lián))來分析ErbB配基依賴的酪氨酸磷酸化活性。在美國專利5,766,863中所描述的激酶受體活化分析也可以用于測定ErbB受體活化和通過抗體對該活性的阻斷。
在一個實施方案中，可以基本上如下面實施例1中所描述篩選抑制HRG刺激MCF7細胞中的p180酪氨酸磷酸化的抗體。例如，將MCF7細胞鋪到24孔平板上，并將ErbB2的單克隆抗體加入每個孔中，在室溫下孵育30分鐘；然后可在每個孔中加入rHRGβ1177-244到0.2nM的最終濃度，繼續(xù)孵育8分鐘。從每個孔中吸走培養(yǎng)基，通過加入100μl SDS樣本緩沖液(5％SDS，25mM DTT和25mM Tris-HCl，pH 6.8)來終止反應(yīng)?？稍?-12％梯度凝膠(Novex)中對每一樣本(25μl)進行電泳，然后通過電泳轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上?？蛇M行抗磷酸酪氨酸(以1μg/ml)免疫印跡，通過反射度光密度分析法量化Mr180,000的主要反應(yīng)條帶的強度。在本分析中，被選擇的抗體優(yōu)選顯著地抑制p180酪氨酸磷酸化的HRG刺激至對照的約0-35％?？衫L制由反射度光密度分析法確定的p180酪氨酸磷酸化的HRG刺激的劑量反應(yīng)曲線，并可計算目的抗體的IC50。在一個實施方案中，阻斷ErbB受體的配基活化的抗體在本分析中抑制p180酪氨酸磷酸化的HRG刺激的IC50為約50nM或更低，更優(yōu)選為1OnM或更低。當(dāng)該抗體為抗體片段例如Fab片段時，在本分析中抑制p180酪氨酸磷酸化的HRG刺激的IC50為，例如約100nM或更低，更加優(yōu)選為50nM或更低。
還可以評價抗體對MDA-MB-175細胞的生長抑制作用，如基本上如Schaefer et al.，Oncogene，151385-1394(1997)中所述。按照本分析方法，用抗ErbB2單克隆抗體(10μg/mL)處理MDA-MB-175細胞4天，并用龍膽紫染色。用抗ErbB2的抗體孵育在這一細胞系上顯示出與使用單克隆抗體2C4類似的生長抑制作用。在還有一個實施方案中，外源的HRG對這種抑制沒有顯著的逆轉(zhuǎn)作用。優(yōu)選地，無論是否存在外源HRG，該抗體抑制MDA-MB-175細胞的細胞增殖的程度超過了單克隆抗體4D5(并且任選地超過了單克隆抗體7F3)。
在一個實施方案中，目的抗ErbB2的抗體可阻斷MCF7和SK-BR-3細胞中的heregulin依賴的ErbB2與ErbB3結(jié)合，實質(zhì)上比單克隆抗體4D5更有效，和優(yōu)選地實質(zhì)上比單克隆抗體7F3更有效，這通過例如在實施例1中所描述的共免疫沉淀實驗中確定。
為了鑒定生長抑制性抗ErbB2的抗體，可以篩選抑制過度表達ErbB2的癌癥細胞生長的抗體。在一個實施方案中，在約0.5-30μg/ml的抗體濃度下，所選擇的生長抑制抗體能夠抑制細胞培養(yǎng)物中約20-100％，優(yōu)選約50-100％的SK-BR-3細胞的生長。為了鑒定這種抗體，可以實施在美國專利號5,677,171中描述的SK-BR-3分析。按照這種分析，SK-BR-3細胞在F12和添加了10％胎牛血清、谷氨酰胺和青霉素鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基的1∶1混合物中生長。將20,000個SK-BR-3細胞鋪入35mm細胞培養(yǎng)皿中(2ml/35mm培養(yǎng)皿)。每個培養(yǎng)皿中加入0.5-30μg/ml抗ErbB2抗體。6天后，用電子COULTETRTM細胞計數(shù)器計數(shù)細胞數(shù)量，與未被處理的細胞比較。那些抑制約20-100％或約50-100％的SK-BR-3細胞生長的抗體被選擇作為生長抑制抗體。
為了選擇誘導(dǎo)細胞死亡的抗體，相對于對照可評價由例如PI，臺盼蘭或7AAD攝取指示的膜完整性的喪失。優(yōu)選分析是采用BT474細胞的PI攝取的分析。按照該分析，BT474細胞(可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Rockville，MD)獲得)被培養(yǎng)在Dulbecco′s Modified Eagle Medium(D-MEM)添加了10％熱滅活的FBS(Hyclone)和2mM L-谷氨酰胺的Ham′s F-12(50∶50)中。(因此，該分析在缺乏補體和免疫效應(yīng)細胞下進行)。BT474細胞以3×106/皿的濃度被接種到100×20mm培養(yǎng)皿中，附著過夜。然后去除培養(yǎng)基，只用新鮮培養(yǎng)基或者用含有10μg/ml合適的單克隆抗體的培養(yǎng)液替換。孵育細胞3天。在每一處理后，用PBS洗滌單細胞層，用胰蛋白酶消化分離。然后在40℃下以1200rpm離心5min，將沉淀重懸在3ml冰冷的Ca2+結(jié)合緩沖液(10mM Hepes，pH7.4，140mM NaCl，2.5mM CaCl2)中，并等分試樣到35mm的加蓋濾網(wǎng)的12×75試管中(1ml/管，3管/處理組)來去除細胞塊。然后在管中加入PI(10μg/ml)。用FACSCANTM流式細胞計數(shù)儀和FACSCONVERTTMCellQuest軟件(Becton Dickinson)來分析樣本。通過PI攝取確定的那些引起統(tǒng)計學(xué)上顯著水平的細胞死亡的抗體可被選擇作為誘導(dǎo)細胞死亡的抗體。
為了選擇誘導(dǎo)凋亡的抗體，可采用使用BT474細胞的膜聯(lián)蛋白結(jié)合分析。如前面的段落所討論培養(yǎng)BT474細胞并植入培養(yǎng)皿中。然后去除培養(yǎng)基，只用新鮮培養(yǎng)基或者含有10μg/ml單克隆抗體的培養(yǎng)基替換。在3天的孵育期后，用PBS洗滌單細胞層，用胰蛋白酶消化分離。然后如上討論離心細胞，重懸在Ca2+結(jié)合緩沖液中，并等分試樣到試管中用于細胞死亡分析。然后往試管中加入被標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白(如膜聯(lián)蛋白V-FTIC)(1μg/ml)。可用FACSCANTM流式細胞計數(shù)儀和FACSCONVERTTMCellQuest軟件(BectonDickinson)來分析樣本。那些相對于對照引起統(tǒng)計學(xué)上顯著水平的膜聯(lián)蛋白結(jié)合的抗體被選擇作為誘導(dǎo)凋亡的抗體。
除了膜聯(lián)蛋白結(jié)合分析，還可以采用BT474細胞進行DNA染色分析。為了進行該分析，已經(jīng)如前面兩段所述用目的抗體處理的BT474細胞與9μg/ml HOECHST 33342TM在37℃下孵育2小時，然后用MODFIT LTTM軟件(Verity Software House)在EPIC S ELITETM流式細胞計數(shù)儀(CoulterCorporation)中進行分析。通過該分析，誘導(dǎo)比未處理細胞高2倍或更高(優(yōu)選3倍或更高)的凋亡細胞百分比變化(達到100％凋亡細胞)的抗體被選作前凋亡(pro-apoptotic)抗體。
為了篩選結(jié)合到被目的抗體結(jié)合的ErbB2的一個表位上的抗體，可進行常規(guī)的交叉-阻斷分析，例如被描述在“抗體，實驗室手冊，Cold SpringHarbor Laboratory，Ed Harlow和David Lane(1988)”中的分析。可選擇地或另外地，可以通過本領(lǐng)域已知的方法進行表位作圖(參見，如本文的附圖1A和1B)。
免疫偶聯(lián)物(immunoconjugate)本發(fā)明還涉及包含被偶聯(lián)到細胞毒性劑的抗體的免疫偶聯(lián)物，細胞毒性劑例如化學(xué)治療劑、毒素(例如細菌、真菌、植物或動物來源的小分子毒素或經(jīng)酶催化后有活性的毒素，包括其片段和/或變體)或放射性同位素(即放射偶聯(lián)物)。
在生產(chǎn)這種免疫偶聯(lián)物中有用的化學(xué)治療劑已經(jīng)在上文被描述。本文還考慮了抗體和一種或多種小分子毒素，例如加利車霉素，美登素(maytansine)(美國專利號5,208,020)，trichothene，和CC1065的偶聯(lián)物。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，抗體被偶聯(lián)到一個或多個美登素分子上(例如每個抗體約1-約10個美坦納生分子)。美登素可以，例如被轉(zhuǎn)化為May-SS-Me，其被還原為May-SH3，并與被修飾的抗體反應(yīng)(Chari et al.，Cancer Research，52127-131(1992))來生成美登木素生物堿抗體免疫偶聯(lián)物。
另一種目的免疫偶聯(lián)物包含被偶聯(lián)到一個或多個加利車霉素分子上的抗ErbB2抗體。抗生素的加利車霉素家族能夠在亞皮摩爾濃度產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂?？梢员皇褂玫募永嚸顾氐慕Y(jié)構(gòu)類似物包括，但是不限于γ1I、α2I、α3I、N-乙酰-γ1I、PSAG和θI1(Hinman et al.，Cancer Research，533336-3342(1993)和Lode et al.，Cancer Research，582925-2928(1998))。還參見美國專利號5,714,586；5,712,374；5,264,586；和5,773,001，在此特別地引入作為參考。
可以被使用的經(jīng)酶催化有活性的毒素及其片段包括白喉A鏈，白喉毒素的非結(jié)合活性片段，外毒素A鏈(來自銅綠假單胞菌)，蓖麻蛋白A鏈，相思豆毒蛋白A鏈，莫迪素(modeccin)A鏈，α-八疊球菌，油桐蛋白，dianthin蛋白，垂序商陸(Phytolaca americana)蛋白(PAP I，PAP II，和PAP-S)，苦瓜抑制劑，瀉果素，巴豆毒素，sapaonaria officinalis抑制劑，gelonin，mitogellin，restrictocin，酚霉素，依諾霉素和tricothecene。參見，例如1993年10月28日公開的WO 93/21232。
本發(fā)明還進一步考慮在抗體和具有溶核活性的化合物(例如核糖核酸酶或DNA核酸內(nèi)切酶例如脫氧核糖核酸酶；DNase)之間形成的免疫偶聯(lián)物。
各種放射性同位素可以用于制備放射偶聯(lián)的抗ErbB2抗體。例子包括At211，I131，I125，Y90，Re186，Re188，Sm153，Bi212，P32和Lu的放射性同位素。
可以采用各種雙功能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑來制備抗體與細胞毒性劑的偶聯(lián)物，這些偶聯(lián)劑如N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫酚)丙酸鹽(SPDP)，琥珀酰亞胺基-4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸鹽，亞氨基硫雜環(huán)戊烷(iminothiolane)(IT)，亞氨酸酯的雙功能衍生物(例如dimethyl adipimidateHCL，活性酯(例如二琥珀酰亞胺基辛二酸鹽)，醛(例如戊二醛)，二-疊氮化合物(例如二(p-疊氮苯甲酰)己二胺)，二-重氮衍生物(例如二-(p-重氮鹽苯甲酰)-乙二胺，二異氰酸鹽(例如亞芐基2，6-二異氰酸鹽)，和二-活性氟化合物(例如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，蓖麻蛋白免疫毒素可以如Vitetta等，Science，2381098(1987)中所述進行制備。14碳標(biāo)記的1-異硫氰酸苯甲基-3-甲基二乙烯基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于將放射性核苷酸偶聯(lián)到抗體上的示例性螯合劑。參見WO 94/11026。該接頭可以是便于細胞毒性藥物在細胞中釋放的可裂解的接頭。例如，可以采用酸不穩(wěn)定接頭，肽酶敏感的接頭，二甲基接頭或含有二硫化物的接頭(Chari et al.，Cancer Research，52127-131(1992))。
或者，包含抗ErbB2抗體和細胞毒性劑的融合蛋白可以通過如重組技術(shù)或肽合成來制備。
在還有另一個實施方案中，抗體被偶聯(lián)到一個在腫瘤預(yù)靶向中使用的“受體”(例如鏈霉抗生物素)上，其中抗體-受體偶聯(lián)物被施用給患者，接著使用清除劑從循環(huán)中去除未被結(jié)合的偶聯(lián)物，然后施用偶聯(lián)到細胞毒性劑(例如放射性核苷酸)上的“配基”(如抗生物素蛋白)。
抗體依賴的酶介導(dǎo)的前體藥物治療(ADEPT)本發(fā)明的抗體還可以被用于ADEPT之中，通過將抗體偶聯(lián)到激活前體藥物的酶上，該酶將前體藥物(如肽基化療劑，參見WO 81/01145)轉(zhuǎn)化為活性抗癌藥物。參見，例如WO 88/07378和美國專利號4,975,278。
可用于ADEPT的免疫偶聯(lián)物的酶組分包括任何能夠以將前體藥物轉(zhuǎn)化為其更有活性、細胞毒性的形式的形式作用于前體藥物的酶。
可用于本發(fā)明的方法的酶包括，但是不限于，用于將含有磷酸的前體藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物的堿性磷酸酶；用于將含有硫酸鹽的前體藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物的芳基硫酸酯酶；用于將無毒性的5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)化為抗癌藥物5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脫氨酶；蛋白酶，例如沙雷氏菌屬蛋白酶，嗜熱菌蛋白酶，枯草桿菌蛋白酶，羧肽酶和組織蛋白酶(例如組織蛋白酶B和L)，可以用于將含肽前體藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物；D-丙氨酰羧肽酶，用于轉(zhuǎn)化含有D-氨基酸取代的前體藥物；糖裂解酶例如用于將糖基化的前體藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物的β-半乳糖苷酶和神經(jīng)氨酸苷酶；用于將用β-內(nèi)酰胺衍生化的藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物的β-內(nèi)酰胺酶；和青霉素酰胺酶，例如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶，用于將在氨基氮分別用苯氧乙酰基或苯乙?；苌乃幬镛D(zhuǎn)化為游離藥物?；蛘?，具有催化活性的抗體，在本領(lǐng)域也被稱作“抗體酶”(abzyme)，也可以被用于將本發(fā)明的前體藥物轉(zhuǎn)化為游離的活性藥物(參見，例如Massey，Nature，328457-458(1987))?？贵w-抗體酶偶聯(lián)物可以如在此所描述被制備來將抗體酶遞送到腫瘤細胞群體中。
本發(fā)明的酶可以通過本領(lǐng)域熟知的技術(shù)被共價結(jié)合到抗ErbB2抗體上，例如使用上面討論的異雙功能交聯(lián)劑?；蛘?，可以采用本領(lǐng)域熟知的重組DNA技術(shù)來構(gòu)建包含被連接到本發(fā)明的酶的至少一個功能性活性部分的至少本發(fā)明的抗體的抗原結(jié)合區(qū)的融合蛋白(參見，如Neuberger等，Nature，312604-608(1984)。
其他抗體修飾本文還考慮抗體的其他修飾。例如抗體可以被連接到各種各樣非蛋白聚合物之一上，如聚乙二醇，聚丙二醇，聚氧化烯或者聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物?？贵w還可以或者可選擇地被連接到一個和多個各種各樣的不同部分上，例如熒光標(biāo)記，具有已知電泳遷移率的部分或者能夠裂解特殊接頭分子的部分。
抗體還可以被誘捕到所制備的微囊體中，例如通過凝聚技術(shù)或者通過界面聚合(例如，分別為羥甲基纖維素或者明膠微囊體和poly-(methylmethacylate)微囊體)，在膠質(zhì)藥物遞送系統(tǒng)中(例如脂質(zhì)體，白蛋白微球體，微乳狀液，納米顆粒和納米膠囊)，或者在大分子乳液。這種技術(shù)被公開在雷明頓藥物科學(xué)(Remington′s Pharmaceutical Sciences)，第16版，Oslo，A.，編輯，(1980)中。
在此公開的抗ErbB2抗體還可以被配制成免疫脂質(zhì)體。含有抗體的脂質(zhì)體通過本領(lǐng)域已知的方法來制備，例如被描述在Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，823688(1985)；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，774030(1980)；美國專利4,485,045和4,544,545；和1997年10月23日公開的WO 97/38731中。循環(huán)時間延長的脂質(zhì)體被描述在美國專利5,013,556中。
特別有用的脂質(zhì)體可以采用包含卵磷脂、膽固醇和PEG-衍生磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂質(zhì)組合物通過反相蒸發(fā)方法生成?？梢酝ㄟ^特定孔徑的濾器擠壓來獲得具有期望直徑的脂質(zhì)體。本發(fā)明的抗體的Fab′片段可以如Martin等，J.Biol.Chem.，257286-288(1982)所描述通過二硫化物交換反應(yīng)被偶聯(lián)到脂質(zhì)體上。化學(xué)治療劑任選被包含在脂質(zhì)體中。參見Gabizon等，J.National CancerInst.，81(19)1484(1989)。
載體，宿主細胞和重組方法本發(fā)明還提供編碼抗體包括人源化的抗ErbB2抗體的分離核酸，包含核酸的載體和宿主細胞，和用于生產(chǎn)抗體的重組技術(shù)。
對于重組生產(chǎn)抗體，編碼抗體的核酸被分離和插入到可復(fù)制的載體中，用于進一步克隆(DNA擴增)或用于表達。采用常規(guī)方法(如通過采用能夠特異性地結(jié)合到編碼抗體的重鏈和輕鏈的基因上的寡核苷酸探針)可以很容易分離和測序編碼單克隆抗體的DNA。許多抗體是可以獲得的。載體組分通常包括，但是不限于，下面的一種或多種信號序列，復(fù)制起點，一種或多種標(biāo)記基因，增強子元件，啟動子和轉(zhuǎn)錄終止序列。
信號序列組分不僅可以直接地，而且還可以用具有異源多肽的融合多肽形式重組生產(chǎn)抗ErbB2抗體，異源多肽優(yōu)選為信號序列或在成熟蛋白或多肽的N末端具有特定可裂解位點的其他多肽。所選擇的異源信號序列優(yōu)選是被宿主細胞識別和加工(即被信號肽酶斷裂)的序列。對于不識別和加工天然的抗ErbB2抗體的原核宿主細胞，信號序列被選自堿性磷酸酶、青霉素酶、1pp或熱穩(wěn)定腸毒素II前導(dǎo)序列的組的原核信號序列取代。對于酵母分泌物，天然信號序列可以被如酵母轉(zhuǎn)化酶前導(dǎo)序列、α因子前導(dǎo)序列(包括酵母和克魯維氏酵母菌屬α因子前導(dǎo)序列)，或者酸性磷酸酶前導(dǎo)序列，白色假絲酵母葡糖淀粉酶前導(dǎo)序列，或者WO 90/13646中描述的信號序列取代。在哺乳動物細胞表達中，可以獲得哺乳動物信號序列以及病毒性分泌前導(dǎo)序列，例如皰疹單純gD信號序列。
這種前體區(qū)域的DNA可以讀框的形式被連接到編碼抗ErbB2抗體的DNA上。
復(fù)制起點組分表達和克隆載體都含有核酸序列，該核酸序列使得載體在一種或多種所選擇的宿主細胞中是可復(fù)制的。一般地，在克隆載體中，這種序列是使載體能夠獨立于宿主染色體DNA復(fù)制的序列，包括復(fù)制起點或者自動復(fù)制序列。這種序列在各種細菌、酵母和病毒中是已知的。質(zhì)粒pBR322的復(fù)制起點適合于大多數(shù)革蘭氏陰性細菌，2μ質(zhì)粒起點適合于酵母，而各種病毒起點(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)對于哺乳動物細胞中的克隆載體是有用的。一般地，復(fù)制組分的起點對于哺乳動物表達載體來說不是必需的(SV40起點僅僅是因為其含有早期啟動子而通常被使用)。
選擇基因組分表達和克隆載體可能含有選擇基因，也稱作選擇標(biāo)記。典型的選擇基因編碼蛋白，該蛋白(a)賦予抗生素或其他毒性，例如氨芐青霉素，新霉素，氨甲蝶呤或四環(huán)素，(b)補體營養(yǎng)缺陷，或者(c)提供不能從復(fù)合培養(yǎng)基中獲得的關(guān)鍵營養(yǎng)成分，例如為芽胞桿菌編碼D丙氨酸消旋酶的基因。
選擇方案的一個例子采用藥物來阻滯宿主細胞生長。那些成功地用異源基因轉(zhuǎn)化的細胞生產(chǎn)賦予藥物抗性的蛋白，從而在選擇方案中存活。這種顯性選擇的例子采用藥物新霉素，霉酚酸和潮霉素。
適合用于哺乳動物細胞的選擇標(biāo)記的另一個例子是那些能鑒定細胞的選擇標(biāo)記，這些細胞具有攝取抗ErbB2抗體核酸，例如DHFR、胸苷激酶、金屬硫蛋白-I和-II，優(yōu)選為靈長類金屬硫蛋白基因、腺苷脫氨酶，鳥氨酸脫羧酶等的能力。
例如，用DHFR選擇基因轉(zhuǎn)化的細胞最初通過在含有氨甲蝶呤(Mtx)、DHFR的競爭性拮抗劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所有轉(zhuǎn)化體來鑒定。當(dāng)采用野生型DHFR時，合適的宿主細胞是缺乏DHFR活性的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系。
此外，用編碼抗ErbB2的抗體的DNA序列轉(zhuǎn)化或共轉(zhuǎn)化的宿主細胞(特別是含有內(nèi)源DHFR的野生型宿主)，野生型DHFR蛋白和其他可選擇標(biāo)記，例如氨基糖苷3′-磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH)，可以通過在含有選擇試劑的培養(yǎng)基中的細胞生長來選擇可選擇標(biāo)記，例如氨基糖苷抗生素，例如卡那霉素、新霉素或G418。參見美國專利4,965,199。
用于酵母中的合適選擇基因是存在于酵母質(zhì)粒YRp7中的trp1基因(Stinchcomb等，Nature，28239(1979))。trp1基因提供一種選擇缺乏在色氨酸中生長的能力的酵母突變菌株的選擇標(biāo)記，例如，ATCC No.44076或PEP4-1。Jones，Genetics，8512(1977)。在酵母宿主細胞基因組中存在trp1損傷，提供用于通過在缺乏色氨酸時的生長來檢測轉(zhuǎn)化的有效環(huán)境。類似地，Leu2缺陷的酵母菌株(ATCC 20，622或38，626)用攜帶Leu2基因的已知質(zhì)?；パa。
此外，衍生自1.6μm環(huán)狀質(zhì)粒pKD1的載體可以被用于克魯維氏酵母的轉(zhuǎn)化?？蛇x擇地，用于大規(guī)模生產(chǎn)重組小牛凝乳酶的表達系統(tǒng)被報道用于乳克魯維氏酵母(K.lactis)。Van den Berg，Bio/Technology，8135(1990)。用于通過工業(yè)用克魯維氏酵母菌株分泌成熟重組人血清白蛋白的穩(wěn)定的多拷貝表達載體也已經(jīng)被公開。Fleer等，Bio/Technology，9968-975(1991)。
啟動子組分表達和克隆載體通常含有被宿主生物體識別的啟動子，并且啟動子被可操作地連接到抗ErbB2抗體核酸上。適合用于原核宿主的啟動子包括phoA啟動子、β-內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動子系統(tǒng)、堿性磷酸酶、色氨酸(trp)啟動子特性和雜合啟動子，例如tac啟動子。但是，其他已知細菌啟動子也是合適的。用于細菌系統(tǒng)的啟動子也將含有被可操作地連接到編碼抗ErbB2抗體的DNA上核糖體結(jié)合序列(SD序列)。
真核細胞的啟動子序列是已知的。實際上所有真核基因具有富含AT的區(qū)域，位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游約25-30個堿基處。另一種存在于許多基因的轉(zhuǎn)錄起始上游的70-80個堿基處的序列是CNCAAT區(qū)，其中N可以是任何核苷酸。在大多數(shù)真核基因的3′端為AATAAA序列，其可作為將聚腺苷酸尾加到編碼序列的3′端的信號。所有這些序列被合適地插入到真核表達載體中。
用于酵母宿主的合適起始序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶或其他糖分解酶的啟動子，例如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、磷酸葡糖異構(gòu)酶和葡糖激酶。
其他酵母啟動子，其是具有受生長條件控制的額外轉(zhuǎn)錄優(yōu)勢的可誘導(dǎo)啟動子，是醇脫氫酶2、異細胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝相關(guān)的降解酶、金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶和負責(zé)麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動子區(qū)。用于酵母表達的合適載體和啟動子進一步被描述在EP 73,657中。酵母增強子還有利地與酵母啟動子一起使用。
抗ErbB2抗體從哺乳動物宿主細胞的載體加以轉(zhuǎn)錄是受例如獲自病毒基因組的啟動子控制，這些病毒例如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、禽類肉瘤病毒、巨細胞病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙肝病毒和最優(yōu)選的猿猴病毒40(SV40)，來自異源哺乳動物的啟動子控制，例如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子，來自熱休克啟動子的控制，只要該啟動子與宿主細胞系統(tǒng)相容。
SV40病毒的早期和晚期啟動子方便地作為SV40的限制性片段獲得，該片段還含有SV40病毒的復(fù)制起點。人巨細胞病毒的即刻早期啟動子便利地作為HindIII E限制性片段獲得。采用牛乳頭瘤病毒作為載體在哺乳動物宿主中表達DNA的系統(tǒng)被公開在美國專利4,419,446中。該系統(tǒng)的改進在美國專利4,601,978中被描述。還可以參見Reyes等，Nature，297598-601(1982)關(guān)于在小鼠細胞中在來自單純皰疹病毒的胸苷激酶啟動子控制下表達人β-干擾素cDNA的描述?？蛇x擇地，勞斯肉瘤病毒長末端重復(fù)序列可以被用作啟動子。
增強子元件組分經(jīng)常通過將增強子序列插入載體來提高通過高等真核細胞轉(zhuǎn)錄編碼本發(fā)明的抗ErbB2抗體的DNA。目前已經(jīng)知曉許多來自哺乳動物基因的增強子序列(球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰島素)。然而，典型地可以使用來自真核細胞病毒的增強子。該例子包括位于復(fù)制起點的晚期側(cè)(bp 100-270)的SV40增強子、巨細胞病毒早期啟動子增強子、位于復(fù)制起點晚期側(cè)的多瘤病毒增強子，和腺病毒增強子。還可以參見Yaniv，Nature，29717-18(1982)關(guān)于激活真核啟動子的增強元件的描述。增強子還可以被剪接到載體的抗ErbB2抗體編碼序列的5′或3′位置上，但是優(yōu)選位于啟動子的5′位置上。
轉(zhuǎn)錄終止組分用于真核宿主細胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人或來自其他多細胞生物體的有核細胞)中的表達載體也含有轉(zhuǎn)錄終止和穩(wěn)定mRNA所需的序列。這種序列通常從真核或病毒DNA或cDNA的5′端和，偶爾從3′端，非翻譯區(qū)獲得。這些區(qū)域含有在編碼抗ErbB2抗體的mRNA的非翻譯部分作為多聚腺苷酸片段被轉(zhuǎn)錄的核苷酸片段。一種有用的轉(zhuǎn)錄終止組分是牛生長激素多聚腺苷酸區(qū)域。參見W094/11026以及其中描述的表達載體。
宿主細胞的選擇和轉(zhuǎn)化用于在載體中克隆或表達DNA的合適宿主細胞在此是上文描述的原核細胞、酵母或高等真核細胞。用于該目的合適原核生物包括真細菌，例如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體，例如腸細菌屬(Enterobacteriaceae)，例如埃希氏菌屬，如大腸桿菌，腸桿菌屬(Enterobacter)，歐文氏桿菌屬(Erwinia)，克雷白氏桿菌屬(Klebsiella)，變形桿菌屬(Proteus)，沙門氏菌屬(Salmonella)，例如，鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium)，沙雷氏菌屬(Serratia)，例如粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescans)，和志賀菌屬(Shigella)，以及芽胞桿菌(Bacilli)例如枯草芽孢桿菌(B.Subtilis)和地衣芽孢桿菌(B.Licheniformis)(例如1989年4月12日公開在DD 266,710中的地衣芽孢桿菌41P)，假單胞菌(Pseudomonas)例如銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)，和鏈霉菌(Streptomyces)。雖然其他菌株例如大腸桿菌B、大腸桿菌X1776(ATCC 31，537)和大腸桿菌W3110(ATCC 27，325)是合適的，優(yōu)選的大腸桿菌克隆宿主是大腸桿菌294(ATCC31，446)。這些例子是說明性的，而不是限制性的。
除了原核微生物，真核的微生物例如絲狀真菌或者酵母是抗ErbB2抗體編碼載體的合適克隆或表達宿主。釀酒酵母或者通常的面包(baker)酵母最普遍地被用于低等真核宿主微生物中。但是，大量其他屬、種和菌株也是通常獲得并在此有用的，例如粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克魯維氏酵母(Kluyveromyces)宿主例如乳克魯維氏酵母、脆壁克魯維氏酵母(ATCC 12，424)、保加利亞克魯維氏酵母(ATCC 16，045)、威克曼氏克魯維氏酵母(ATCC24，178)、K.waltii(ATCC 56，500)、果蠅克魯維氏酵母(ATCC 36，906)、耐熱克魯維氏酵母K.thermotolerans和馬克斯克魯維氏酵母；yarrowia(EP 402，226)；巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)(EP183，070)；假絲酵母屬(Candida)；Trichoderma reesia(EP 244，234)；粗糙鏈胞霉(Neurosporacrassa)；許旺氏酵母例如西方許旺氏酵母；和絲狀真菌例如脈胞菌(Neurospora)，青霉菌(Penicillium)，Tolypocladium，和曲霉菌(Aspergillus)宿主例如構(gòu)巢曲霉和黑曲霉(A.niger)。
用于表達糖基化的抗ErbB2抗體的合適宿主來自多細胞生物體。無脊椎動物細胞的例子包括植物和昆蟲細胞。許多來自例如草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)(毛蟲)、埃及伊蚊(蚊子)、白紋伊蚊(蚊子)、黑腹果蠅(果蠅)和家蠶(Bombyx mori)的桿狀病毒菌株和突變體以及相應(yīng)允許昆蟲宿主細胞已經(jīng)被確定。各種用于轉(zhuǎn)染的病毒株是公眾可以獲得的，例如苜蓿銀斜紋夜蛾(Autographa califomica)NPV的L-1變體和家蠶NPV的Bm-5株，而且這些病毒可以被用作按照本發(fā)明的病毒，特別地用于草地夜蛾細胞的轉(zhuǎn)染。
棉花、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牽?；ā⑽骷t柿和煙草的植物細胞培養(yǎng)物也可以被用作宿主。
但是，脊椎動物細胞是最令人感興趣的，在培養(yǎng)物中繁殖脊椎動物細胞(組織培養(yǎng))已經(jīng)是常規(guī)操作。有用的哺乳動物宿主細胞系的例子是用SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚胎腎系(293或在懸浮培養(yǎng)物中生長的亞克隆293細胞，Graham等，J.Gen Virol.，3659(1977))；幼倉鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，774216(1980))；小鼠滋養(yǎng)細胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.，23243-251(1980))；猴腎細胞(CV1 ATCC CCL70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宮頸癌細胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK，ATCC CCL 34)；buffalo大鼠肝細胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺細胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝細胞(Hep G2，HB8065)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI細胞(Mather等，Annals N.Y.Acad.Sci.，38344-68(1982))；MRC 5細胞；ES4細胞；和人肝細胞瘤系(Hep G2)。
宿主細胞用上面描述的用于抗ErbB2抗體生產(chǎn)的表達或克隆載體轉(zhuǎn)化，并且培養(yǎng)在常規(guī)的營養(yǎng)培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基被改進以適合誘導(dǎo)啟動子、選擇轉(zhuǎn)化體或者擴增編碼期望序列的基因。
培養(yǎng)宿主細胞用于生產(chǎn)本發(fā)明的抗ErbB2抗體的宿主細胞可以在各種培養(yǎng)基中培養(yǎng)。商業(yè)上可以購買得到的培養(yǎng)液例如Ham′s F10(Sigma)、Minimal EssentialMedium((MEM)，(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco′s Modified Eagle′sMedium((DMEM)，Sigma)都適合用于培養(yǎng)宿主細胞。此外，任何在Ham等，Meth.Enz.，5844(1979)，Barnes等，Anal.Biochem.，102255(1980)，美國專利4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美國專利Re.30,985中描述的培養(yǎng)基可以被用作宿主細胞的培養(yǎng)基。任何這些培養(yǎng)基可以必要地添加激素和/或其他生長因子(例如胰島素、運鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(例如氯化鈉、鈣、鎂和磷酸鹽)、緩沖液(例如HEPES)、核苷酸(例如腺苷和胸苷)、抗生素(例如GENTAMYCIN藥物)、微量元素(定義為通常以微摩爾范圍的最終濃度存在的無機化合物)，和葡萄糖或相當(dāng)?shù)哪芰縼碓?。還可以包括本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的合適濃度的任何其他需要的添加劑。培養(yǎng)條件，例如溫度、pH等是先前用于被選擇來表達的宿主的那些條件，并且對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯然的。
抗ErbB2抗體的純化當(dāng)采用重組技術(shù)時，抗體在細胞內(nèi)、周質(zhì)間隙中生成，或者直接分泌到培養(yǎng)基中。如果在細胞內(nèi)生成抗體，作為第一步，例如，通過離心或者超濾去除顆粒碎片，宿主細胞或者裂解碎片。Carter等，Bio/Technology，10163-167(1992)描述用于分離抗體的操作，抗體被分泌到大腸桿菌的周質(zhì)間隙。簡而言之，在存在醋酸鈉(pH3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)時，解凍細胞糊超過約30分鐘?？梢酝ㄟ^離心去除細胞碎片。當(dāng)抗體被分泌到培養(yǎng)基中時，通常首先采用商業(yè)上可購買得到的蛋白質(zhì)濃縮濾器，例如Amicon或Millipore Pellicon超濾單元，濃縮得自該表達系統(tǒng)的上清液。在任何先前的步驟中可以包括蛋白酶抑制劑例如PMSF來抑制蛋白質(zhì)水解，也可以包括抗生素來防止外來的污染物的生長。
制備自細胞的抗體組合物可以被純化，采用例如羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析和親合層析，親合層析是優(yōu)選的純化技術(shù)。蛋白A作為親合配基的合適程度取決于抗體中存在的任何免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域的種類和同種型。蛋白A可以被用于純化基于人γ1、γ2或γ4重鏈的抗體(Lindmark等，J.Immunol.Meth.，621-13(1983))。蛋白G被推薦用于所有小鼠的同種型和人γ3(Guss等，EMBO J，515671575(1986))。親合配基附著的基質(zhì)最普遍為瓊脂糖，但是也可以使用其他基質(zhì)。機械上穩(wěn)定的基質(zhì)例如控制孔的玻璃或者多聚(苯乙烯二乙烯)苯，具有比瓊脂糖所能達到的更高的流速和更短的處理時間。當(dāng)抗體包含CH3結(jié)構(gòu)域時，Bakerbond ABXTM樹脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)被用于純化。根據(jù)回收的抗體，還可以采用其他用于蛋白質(zhì)純化的技術(shù)，例如在離子交換柱上進行分餾、乙醇沉淀、反相HPLC、在硅石上進行層析，在肝素瓊脂糖上層析，在陰離子或陽離子交換樹脂(例如多聚天冬氨酸柱)上層析，色譜聚焦，SDS-PAGE，以及硫酸胺沉淀。
在初步純化步驟之后，包含目標(biāo)抗體和污染物的混合物進行低pH的疏水相互作用層析，采用pH為約2.5-4.5之間的洗脫緩沖液，優(yōu)選在低鹽濃度下進行(例如從約0-0.25M鹽)。
藥物制劑用于根據(jù)本發(fā)明的抗體的治療制劑通過將具有期望純度的抗體與任選的藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑混合被制備來用于以凍干制劑形式或者水溶液形式進行存儲。(雷明頓藥物科學(xué)(Remington′s PharmaceuticalSciences)第16版，Osol，A.編輯(1980))，可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑在所用的劑量和濃度下對于受者來說是無毒的，并且包括緩沖液，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機酸；抗氧化劑包括抗壞血酸和蛋氨酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基苯基氯化銨；氯化己烷雙胺；苯扎氯胺；芐乙胺；苯酚，丁基或苯甲醇；烷基對羥基苯甲酸酯例如甲基或丙基對羥基苯甲酸酯；兒茶酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；和間-甲苯酚)；小分子量(少于約10個殘基)多肽；蛋白質(zhì)，例如血清白蛋白，明膠或者免疫球蛋白；親水聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖，二糖和其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑例如EDTA；糖例如蔗糖，甘露糖醇，海藻糖或山梨糖醇；成鹽抗衡離子(salt-forming counter-ions)例如鈉；金屬復(fù)合物(例如Zn蛋白質(zhì)復(fù)合物)；和/或非離子表面活性劑例如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。優(yōu)選的凍干抗ErbB2抗體制劑被描述在WO 97/04801中，特別地在此引入作為參考。
本文的制劑還可以含有受處理的特定適應(yīng)癥所需的一種以上活性化合物，優(yōu)選是那些具有不會相互產(chǎn)生不利影響的互補活性的化合物。例如，期望在一個制劑中還進一步提供結(jié)合EGFR，ErbB2(例如結(jié)合到ErbB2的不同表位上的抗體)、ErbB3、ErbB4或血管上皮因子(VEGF)的抗體?？蛇x擇地或另外地，該組合物還進一步可以包含化學(xué)治療劑、細胞毒性劑、細胞因子、生長抑制劑、抗激素劑、EGFR靶向藥物、抗血管生成劑，和/或心臟保護劑。這種分子適合以有效用于所需目的的含量而結(jié)合存在。
在膠體藥物遞送系統(tǒng)(例如，脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳劑、納米顆粒和納米膠囊)或者在大分子乳劑中，活性成分還可以被包裹在例如通過凝聚技術(shù)或者通過界面聚合制備的微囊中，例如分別為羥甲基纖維素或者明膠微囊和poly-(methylmethacylate)微囊。這種技術(shù)被描述在雷明頓藥物科學(xué)第16版，Osol，A.編輯，(1980)中。
可以制備緩釋制備物。緩釋制備物的合適例子包括含有抗體的固體疏水性聚合物的半通透性基質(zhì)，這種基質(zhì)是成形物品的形式，例如，膜或者微囊。緩釋基質(zhì)的例子包括聚酯、水凝膠(例如多聚(2-羥基乙基異丁烯酸)或者多聚(乙烯醇))、聚交酯(美國專利3,773,919)、L-谷氨酸和γ乙基L-谷氨酰胺的共聚物、不可降解的乙烯乙烯基乙酸、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物例如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和leuprolide acetate組成的可注射微球)，和多聚D-(-)-3-羥基丁酸。
用于體內(nèi)施用的制劑必須被滅菌。這很容易地通過滅菌濾膜過濾來實現(xiàn)。
用抗ErbB2的抗體治療可以預(yù)期，按照本發(fā)明，抗ErbB2抗體可以被用于治療各種疾病或紊亂。示例性的癥狀或紊亂包括良性的或惡性的腫瘤；白血病和淋巴惡性腫瘤；其他的紊亂例如神經(jīng)元的、神經(jīng)膠質(zhì)的、星形膠質(zhì)細胞的、下丘腦的、腺的、巨噬細胞的、上皮的、基質(zhì)的、囊胚的、炎癥性的、血管生成的和免疫學(xué)的紊亂。優(yōu)選地，抗ErbB2的抗體被用于治療被鑒定為對用這種抗體通過本文公開的方法治療響應(yīng)的腫瘤。
一般地，將被治療的疾病或紊亂是癌癥。在此將被治療的癌癥的例子包括，但是不限于，癌、淋巴瘤、胚細胞瘤、肉瘤和白血病或者淋巴惡性腫瘤。這種癌癥的更加特別的例子包括鱗狀細胞癌(例如上皮鱗狀細胞癌)，肺癌包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌和肺鱗狀細胞癌，腹膜癌，肝細胞癌，胃的或者胃癌包括胃腸癌，胰腺癌，成膠質(zhì)細胞瘤，宮頸癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝細胞瘤，乳腺癌，結(jié)腸癌，直腸癌，結(jié)腸直腸癌，子宮內(nèi)膜或子宮癌，唾液腺癌，腎臟或腎癌，前列腺癌，陰門癌，甲狀腺癌，肝癌，肛門癌，陰莖癌，以及頭部和頸部癌。優(yōu)選地，被治療的癌癥被鑒定為對用抗ErbB2的抗體處理響應(yīng)，該響應(yīng)是基于腫瘤樣本中對HER2/HER3和/或HER2/HER1異二聚體的鑒定或者ErbB受體的磷酸化。其中HER2/HER3和/或HER2/HER1異二聚體形成和/或ErbB受體磷酸化期望被檢測的特定的一組癌癥包括，但是不限于肺乳腺癌、肺癌、卵巢癌，包括進展的、難治的或者周期性發(fā)生的卵巢癌、前列腺癌，結(jié)腸直腸癌和胰腺癌。
癌通常包含表達ErbB2的細胞，使得此處的抗ErbB2抗體能夠結(jié)合到癌上。雖然癌可以被表征為過度表達ErbB2受體，本申請進一步提供一種用于治療不被認為是過度表達ErbB2的癌癥的方法。為了確定癌中的ErbB2表達，可以采用各種診斷的/預(yù)后的分析。在一個實施方案中，可以通過IHC分析ErbB2過度表達，例如采用HERCEPTEST(Dako)。來自腫瘤活組織檢查的石蠟包埋的組織切片可以被用于IHC分析，并給予如下的ErbB2蛋白質(zhì)染色強度標(biāo)準(zhǔn)分值0沒有觀察到染色或者在少于10％的腫瘤細胞中觀察到膜染色。
分值1+在超過10％腫瘤細胞中檢測到淺的/剛剛可察覺的膜染色。該細胞僅部分膜被染色。
分值2+在超過10％的腫瘤細胞中觀察到微弱到中度的完整膜染色。
分值3+在超過10％的腫瘤細胞中觀察到中度到強烈的完整膜染色。
那些在ErbB2過度表達評價中具有0或1+分值的腫瘤可被表征為不過度表達ErbB2，而那些具有2+或3+分值的腫瘤可被表征為過度表達ErbB2。
可選擇地或者另外地，F(xiàn)ISH分析例如INFORMTM(Ventana，Arizona銷售)或PATHVISIONTM(Vysis，Illinois)可以在福爾馬林固定、石蠟包埋的腫瘤組織上進行來確定腫瘤中ErbB2的過度表達(如果有)的程度。
在一個實施方案中，該癌癥可以是表達(可能，但是不是必需，過度表達)EGFR的癌癥。表達/過度表達EGFR的癌癥的例子包括鱗狀細胞癌癥(例如上皮鱗狀細胞癌癥)，肺癌包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌(NSCLC)，肺腺癌和肺鱗狀細胞癌，腹膜癌，肝細胞癌，胃的或胃癌包括胃腸癌，胰腺癌，成膠質(zhì)細胞瘤，宮頸癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝細胞瘤，乳腺癌，結(jié)腸癌，直腸癌，結(jié)腸直腸癌，子宮內(nèi)膜或子宮癌，唾液腺癌，腎或者腎的癌，前列腺癌，陰門癌，甲狀腺癌，肝癌，肛門癌，陰莖癌以及頭部和頸部癌癥。
本發(fā)明特別適合用于鑒定乳腺癌、前列腺癌，例如閹割抗性前列腺癌(CRPC)，以及卵巢癌患者，這些患者可能對用抗HER2抗體治療產(chǎn)生良好的應(yīng)答，抗HER2抗體阻斷包含HER2的ErbB異二聚體的配基活化，例如單克隆抗體2C4或rhuMAb 2C4。
在此治療的癌癥可以是特征為ErbB受體例如EGFR過度活化的癌癥。這種過度活化可能是由于ErbB受體或ErbB配基過度表達或者產(chǎn)量升高。在本發(fā)明的一個實施方案中，可以進行診斷的或者預(yù)后的分析來確定患者的癌癥其特征是否為ErbB受體過度活化。例如，可以確定癌中ErbB基因擴增和/或ErbB受體過度表達。用于確定這種擴增/過度表達的各種分析在本領(lǐng)域是可以獲得的，并且包括上面描述的IHC、FISH和脫落抗原(shedantigen)分析?？蛇x擇地或者另外地，腫瘤中或與腫瘤相關(guān)的ErbB配基的含量，例如TGF-a，可以按照已知的操作來確定。這種分析可以檢測被檢測的樣本中的蛋白質(zhì)和/或編碼蛋白質(zhì)的核酸。在一個實施方案中，可以采用免疫組織化學(xué)(IHC)確定腫瘤中的ErbB配基水平；參見例如，Scher等，Clin.Cancer Research，1545-550(1995)?？蛇x擇的或者另外地，可以例如通過FISH、DNA印跡或PCR技術(shù)評價被檢測的樣本中的ErbB配基編碼核酸的水平。
此外ErbB受體或ErbB配基過度表達或者擴增可以采用體內(nèi)診斷分析來評價，例如通過施用結(jié)合到將被檢測的分子上并且用可檢測標(biāo)記(例如放射性同位素)標(biāo)引的分子(例如抗體)，并從外部掃描患者來對標(biāo)記定位。
當(dāng)被治療的癌癥是不依賴于激素的癌癥時，腫瘤中激素(例如雄性激素)和/或其相關(guān)受體的表達可以采用各種可以獲得的分析方法中的任何方法來評價，例如上面所描述的方法?？蛇x擇地或者另外地，患者可能被診斷為患有不依賴激素的癌癥，其中這些癌癥不再對抗雄性激素的治療有反應(yīng)。
在一些實施方案中，包含被偶聯(lián)到細胞毒性劑上的抗ErbB2抗體的免疫偶聯(lián)物被施用給患者。優(yōu)選地，免疫偶聯(lián)物和/或其所結(jié)合的ErbB2蛋白被細胞內(nèi)化，導(dǎo)致免疫偶聯(lián)物殺死其所結(jié)合的癌細胞的治療功效被提高。在優(yōu)選實施方案中，細胞毒性劑靶向或干擾癌細胞中的核酸。這種細胞毒性劑的例子包括美登木素生物堿、加利車霉素、核糖核酸酶和DNA核酸內(nèi)切酶。
在特定實施方案中，被施用的抗體是rhuMAb 2C4，或其功能性等價物。RhuMAb 2C4是基于人IgGl骨架序列的人源化的單克隆抗體，由兩條重鏈(449個殘基)和兩條輕鏈(214個殘基)組成。RhuMAb 2C4在輕鏈和重鏈的表位結(jié)合區(qū)域上顯著地區(qū)別于另一抗HER2抗體HERCEPTIN(Trastuzumab)。結(jié)果，rhuMAb 2C4結(jié)合到HER2上的完全不同的表位上。本發(fā)明提供用于檢測對用rhuMAb 2C4或其功能性等價物處理響應(yīng)的癌癥的靈敏的方法。應(yīng)當(dāng)指出，這種對rhuMAb 2C4處理響應(yīng)的癌癥不要求是過度表達HER2。
按照已知的方法，例如靜脈內(nèi)給藥，例如大藥丸或者在一段時間內(nèi)通過連續(xù)灌注，通過肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦脊髓內(nèi)(intracerobrospinal)、皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑液內(nèi)、殼膜內(nèi)、口服、局部或者吸入路徑將抗ErbB2抗體或免疫偶聯(lián)物施用給人類患者。靜脈內(nèi)或皮下施用抗體是優(yōu)選的。
其他的治療方案可以與施用抗ErbB2抗體組合。組合施用包括共施用，采用分離的制劑或者單一的藥物制劑，以及以任何順序的連續(xù)施用，其中優(yōu)選存在一段兩種(或全部)的活性試劑同時產(chǎn)生其生物學(xué)活性的時期。
在一個特定實施方案中，患者用兩種不同的抗ErbB2抗體治療。例如，患者可以用阻斷ErbB受體的配基活化的第一抗ErbB2抗體或者具有單克隆抗體2C4的生物學(xué)特征的抗體，以及抑制生長的第二抗ErbB2抗體(例如HERCEPTIN)或誘導(dǎo)過度表達ErbB2的細胞凋亡的抗ErbB2抗體(例如，7C2，7F3或其人源化變體)處理。優(yōu)選地，這種組合治療方法導(dǎo)致協(xié)同的治療作用。例如，可以用HERCEPTIN治療患者，然后用rhuMAb 2C4治療，例如當(dāng)患者對HERCEPTIN治療沒有反應(yīng)時。在另一個實施方案中，患者首先用rhuMAb 2C4治療，然后接受HERCEPTIN治療。在還有另一個實施方案中，患者可以同時用rhuMAb 2C4和HERCEPTIN治療。
還期望將施用抗ErbB2抗體或多個抗體，與施用針對另一種腫瘤相關(guān)抗原的抗體組合。在這種情況下，其他抗體可以例如結(jié)合EGFR、ErbB3、ErbB4或血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)。
在一個實施方案，本發(fā)明的處理包括組合施用抗ErbB2抗體(或者多個抗體)以及一種或多種化療劑或者生長抑制劑，包括共施用不同化學(xué)治療劑的混合物，優(yōu)選的化療劑包括優(yōu)選的化療劑包括紫杉烷二萜(taxane)(例如泰素和多西他賽)和/或蒽環(huán)霉素抗生素。這種化療劑的制備和劑量方案可以按照生產(chǎn)商推薦或者如通過熟練技術(shù)人員經(jīng)驗性確定來使用。用于這種化療劑的制備和劑量方案也被描述在Chemotherapy Service Ed.，M.C.Perry，Williams & Wilkins，Baltimore，MD(1992)中。
抗體可以以這種抗激素化合物的已知劑量與抗激素化合物組合；例如抗雌激素化合物如他莫西芬；抗孕酮如奧那斯酮(參見EP 616812)；或抗雄性激素例如氟他胺。當(dāng)被治療的癌癥是不依賴于激素的癌癥時，患者可以先進行抗激素治療，在癌癥變?yōu)榧に夭灰蕾嚭螅o患者施用抗ErbB2抗體(以及任選地在此所描述的其他試劑)。
有時，給患者共施用心臟保護劑(來防止或者降低與治療相關(guān)的心肌功能障礙)或者一種或多種細胞因子是有益的。還可以共施用EGFR靶向藥物或者抗血管生成劑。除了上述治療方案外，可以對患者手術(shù)去除癌細胞和/或放射治療。
在此抗ErbB2抗體還可以與EGFR靶向的藥物組合，這些藥物如在定義部分中討論的會產(chǎn)生互補的、和潛在的協(xié)同治療作用的那些藥物。
可以與抗體組合的其他藥物的例子包括化療劑，例如卡鉑、紫杉烷二萜(taxane)(例如泰素或多西他賽)、吉西他濱、失碳長春堿、順鉑、奧沙利鉑，或任何這些藥物的組合例如卡鉑/多西他賽；其他的抗HER2抗體(例如生長抑制性抗HER2抗體，例如HERCEPTIN，或誘導(dǎo)凋亡的抗HER2抗體，例如7C2或7F3，包括其人源化的或親合成熟的變體)；法呢基轉(zhuǎn)移酶抑制劑；抗血管生成劑(例如，抗VEGF抗體)；EGFR靶向藥物(例如，C225或ZD1839)；細胞因子(例如，IL-2、IL-12、G-CSF或GM-CSF)；或上面這些的組合。
任何上述的共施用的試劑的適合劑量是目前使用的那些，并且由于試劑和和抗ErbB2抗體的組合作用(協(xié)同作用)，可以被降低。
對于疾病的預(yù)防或治療，適合的抗體劑量將取決于如上所定義的被治療的疾病的類型，無論抗體被施用以用于預(yù)防或治療目的的疾病的嚴重程度和進程，先前的治療、患者的病史和對抗體的反應(yīng)，以及主治醫(yī)生的判斷。抗體被一次或者經(jīng)過一系列治療被合理地施用給患者。根據(jù)疾病的類型和嚴重性，約1μg/kg到15mg/kg(例如0.1-20mg/kg)抗體是施用給患者的起始候選劑量，無論是，例如，通過一次或多次分開施用，或者通過連續(xù)灌注。典型的日劑量可以在1μg/kg到100mg/kg或更高的范圍內(nèi)，取決于上面提及的因素。對于在數(shù)天或更長時間內(nèi)重復(fù)施用，根據(jù)癥狀，持續(xù)進行治療直到產(chǎn)生期望的對疾病的抑制。優(yōu)選的抗體劑量將在約0.05mg/kg到約10mg/kg范圍內(nèi)。因此，可以給患者施用一個或多個約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg的劑量(或者它們的任意組合)。這種劑量可以被間斷地施用，例如每周或每三周(例如，使得患者接受約2個到約20個，例如約6個劑量的抗ErbB2抗體)。施用起始的較高的載入劑量，接著施用一個或多個較小的劑量。示例性的劑量方案包括施用約4mg/kg的起始載入劑量，接著約2mg/kg抗ErbB2抗體的每周維持劑量。但是，其他劑量方案也是有用的。這種治療的進展很容易通過常規(guī)技術(shù)和分析方法來監(jiān)控。
在特定實施方案中，rhuMAb 2C4以420mg的固定劑量(相當(dāng)于70kg體重的個體6mg/kg的劑量)被每三周施用。治療以較高的載入劑量開始(例如840mg，相當(dāng)于12mg/kg體重)以更加迅速地達到穩(wěn)定狀態(tài)的血清濃度。特定的劑量方案也被提供在下面的實施例中。
除了將抗體蛋白施用給患者，本申請還考慮了通過基因治療來施用抗體。這種施用編碼抗體的核酸包括在“施用治療有效量的抗體”的表述中。參見，例如1996年3月14日公開的WO 96/07321，其涉及使用基因治療來產(chǎn)生細胞內(nèi)抗體。
有兩種主要方法來將核酸(優(yōu)選被含在載體中)體內(nèi)和回體(ex vivo)地導(dǎo)入患者細胞中；對于體內(nèi)遞送，核酸被直接注射給患者，通常在需要抗體的部位。對于回體治療，患者細胞被取出，將核酸導(dǎo)入到這些被分離的細胞中，被修飾的細胞被直接地或者例如被包囊在被植入患者中的多孔膜中，施用給患者，(參見例如，美國專利4,892,538和5,283,187)。有各種技術(shù)可以用于將核酸導(dǎo)入活細胞中。根據(jù)核酸被體外轉(zhuǎn)化到培養(yǎng)細胞或者體內(nèi)轉(zhuǎn)化到預(yù)期宿主的體內(nèi)細胞中，這些技術(shù)是不同的。適合用于在體外將核酸轉(zhuǎn)移到哺乳動物細胞的技術(shù)包括使用脂質(zhì)體、電穿孔、微注射、細胞融合、DEAE-葡聚糖、磷酸鈣沉淀方法等。用于基因回體遞送的常用載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒。
普遍優(yōu)選的體內(nèi)核酸轉(zhuǎn)移技術(shù)包括用病毒載體(例如腺病毒，單純皰疹I(lǐng)病毒或者腺伴隨病毒)轉(zhuǎn)染和以脂質(zhì)為基礎(chǔ)的系統(tǒng)(用于基因的脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移的有用脂質(zhì)是，例如DOTMA、DOPE和DC-Chol)。在某些情況下，期望用靶向目標(biāo)細胞的試劑提供核酸來源，例如特異于細胞表面膜蛋白或者目標(biāo)細胞的抗體，目標(biāo)細胞的受體的配基等。當(dāng)采用脂質(zhì)體時，結(jié)合到與細胞內(nèi)吞作用相關(guān)的細胞表面膜蛋白的蛋白可以被用于靶向和/或方便攝取，例如趨向(tropic)特定細胞類型的衣殼蛋白或其片段，在循環(huán)中進行內(nèi)在化的蛋白質(zhì)的抗體，和靶向細胞內(nèi)定位和增強細胞內(nèi)半衰期的蛋白質(zhì)。受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用的技術(shù)被描述，例如在Wu等，J.Biol.Chena.，2624429-4432(1987)；和Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，873410-3414(1990)中。對目前已知的基因制備和基因治療方案的評論參見Anderson等，Science，256808-813(1992)。還可以參見WO 93/25673和其中引用的參考文獻。
制品在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供了含有用于治療上面描述的紊亂的材料的制品。
制品包含一個容器和在容器上或者與容器關(guān)聯(lián)的標(biāo)簽或包裝插入物。合適的容器包括，例如瓶子、小管、注射器等。容器可以由各種材料形成，例如玻璃或塑料。容器中裝有有效治療癥狀的組合物，可能具有無菌的存取口(access port)(例如該容器是靜脈溶液袋或者具有可以被皮下注射針頭穿過的塞子的小管)。組合物中至少一種活性試劑是抗ErbB2抗體。標(biāo)簽或包裝插入物指明該組合物是用于治療特定的癥狀，例如癌癥。在一個實施方案中，標(biāo)簽或包裝插入物指明包含結(jié)合ErbB2的抗體的組合物可以被用于治療患有腫瘤的患者，該腫瘤中已經(jīng)鑒定了存在HER2/HER1和/或HER2/HER3和/或HER2/HER4復(fù)合物，和/或已經(jīng)檢測到ErbB受體的磷酸化。而且，制品可以包含(a)其中含有組合物的第一容器，其中該組合物包含結(jié)合ErbB2并抑制ErbB2過度表達的癌細胞生長的第一抗體；和(b)其中含有組合物的第二容器，其中該組合物包含結(jié)合ErbB2并阻斷ErbB受體的配基活化的第二抗體。在本發(fā)明的這個實施方案中，制品可進一步包含指明第一和第二抗體組合物可以被用于治療癌癥的包裝插入物，該癌癥的特征在于存在HER2/HER1和/或HER2/HER3和/或HER2/HER4異二聚體，和/或ErbB受體磷酸化。而且包裝插入物可能教導(dǎo)組合物(包含結(jié)合ErbB2并阻斷ErbB受體的配基活化的抗體)的使用者將用抗體治療以及任何在前面部分描述的輔助治療(例如化療劑，EGFR靶向藥物，抗血管生成劑，抗激素化合物，心臟保護劑和/或細胞因子)組合?？蛇x擇地或者另外地，制品可進一步包含第二個(第三個)容器，其包含藥學(xué)上可接受的緩沖液，例如用于注射的抑菌水(BWFI)、磷酸緩沖鹽水、林格液和葡萄糖液。還可以進一步包括商業(yè)或用戶角度期望的其他物質(zhì)，包括其他的緩沖液、稀釋劑、濾器、針頭和注射器。
抗體還可以被用于診斷分析。一般地，抗體如上面的方法所描述被標(biāo)記。為了方便，本發(fā)明的抗體可以在試劑盒中提供，即試劑以預(yù)定的含量與實施診斷分析的說明書一起包裝組合。當(dāng)抗體用酶標(biāo)記時，該試劑盒將包括底物和酶所需的輔助因子(例如提供可檢測的生色團或熒光團的底物前體)。此外，可以包括其他添加劑，例如穩(wěn)定劑、緩沖液(例如阻斷緩沖液或溶解緩沖液)等。各種試劑的相對含量可以廣泛地變化來在試劑液中提供一定濃度，該濃度充分地優(yōu)化分析的靈敏度。特別地，試劑可以以通常是凍干的粉末形式提供，包括溶解后提供具有合適濃度的試劑液的賦形劑。
材料保藏如下的雜交瘤細胞系已經(jīng)被保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心，10801Univevsity Boulevard，Manassas，VA 20110-2209，美國(ATCC)

前面所撰寫的說明書足以使本領(lǐng)域技術(shù)人員實施本發(fā)明。由于保藏的實施方案用于說明僅僅是發(fā)明的某些方面，并且任何功能相當(dāng)?shù)臉?gòu)建體屬于本發(fā)明的保護范圍，本發(fā)明將不被限制在被保藏的構(gòu)建體的范圍內(nèi)。此處的材料保藏并不是承認本文包含的所撰寫的說明書不足以實現(xiàn)本發(fā)明的任何方面，包括其最佳實施方式，也不被解釋為限制權(quán)利要求的范圍。實際上，根據(jù)前面的描述，除了本文給出和描述的那些外，本發(fā)明的各種改進對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，并且落入附隨的權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
應(yīng)當(dāng)理解，按照本文包含的教導(dǎo)，將本發(fā)明的教導(dǎo)應(yīng)用于特定問題或情形屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍內(nèi)的事。
本發(fā)明的更加詳細內(nèi)容將通過如下的非限制性實施例來闡明。所有在說明書中引用的文獻的公開在此特別地被引入作為參考。
實施例1HRG依賴的ErbB2與ErbB3的結(jié)合被單克隆抗體2C4阻斷WO 01/89566中描述了特異性地結(jié)合ErbB2的細胞外結(jié)構(gòu)域的鼠單克隆抗體2C4，該文獻公開的內(nèi)容在此特別地全文引入作為參考。
在共免疫沉淀實驗中檢測ErbB3與ErbB2的聯(lián)合能力。1.0×106MCF7或SK-BR-3細胞被植入含有10％胎牛血清(FBS)和10mM HEPES，pH 7.2的5050 DMEM/Ham′s F12培養(yǎng)基(生長培養(yǎng)基)的6孔組織培養(yǎng)平板中，并使其附著過夜。在開始實驗前，細胞在無血清的生長培養(yǎng)基中饑餓2小時。用磷酸緩沖鹽水(PBS)簡單地洗滌細胞，然后與稀釋在0.2％w/v牛血清白蛋白(BSA)、具有10mM HEPES，pH7.2的RPMI培養(yǎng)基(結(jié)合緩沖液)中100nM指定抗體，或者僅與結(jié)合緩沖液(對照)一起孵育。在室溫下1h后，HRG以5nM終濃度加到半數(shù)孔中(+)。將類似體積的結(jié)合緩沖液加到其他孔中(-)。繼續(xù)孵育約10分鐘。
吸取以去除上清液，在含有0.2mM PMSF、10μg/ml亮抑酶肽和10TU/ml抑酶肽的RPMI，10mM HEPES，pH 7.2，1.0％v/v TRITON X-100TM，1.0％w/v CHAPS(裂解緩沖液)中裂解細胞。通過離心來去除裂解液中的不溶物質(zhì)。
用共價偶聯(lián)到親合凝膠(Affi-Prep 10，Bio-Rad)上的單克隆抗體免疫沉淀ErbB2。這一抗體(Ab-3，Oncogene Sciences，USA)識別胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域表位。通過往每一裂解物中加入10μl的含有約8.5μg固定抗體的凝膠漿液來進行免疫沉淀，樣本在室溫下混合2h。然后通過離心來收集凝膠。用裂解緩沖液批量洗滌凝膠三次來去除未被結(jié)合的物質(zhì)。然后加入SDS樣本緩沖液，在沸騰的水浴中簡單地加熱樣本。
在4-12％聚丙烯酰胺凝膠上對上清液進行電泳，電印跡到硝化纖維膜上。通過用抗ErbB3的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域表位的多克隆抗體(c-17，Santa CruzBiotech)探查印跡來評價是否存在ErbB3。用化學(xué)發(fā)光底物(ECL，Amersham)來觀察印跡。
如在分別對應(yīng)于MCF7和SK-BR-3細胞的附圖2A和2B的對照泳道所示，ErbB3存在于僅當(dāng)細胞用HRG刺激的細胞時的ErbB2沉淀物中。如果細胞首先用單克隆抗體2C4溫育，ErbB3信號在MCF7細胞中消失(附圖5A，泳道2C4+)或在SK-BR-3細胞中實質(zhì)性地降低(附圖5B，泳道2C4+)。如在附圖2A-B中所示，在MCF7和SK-BR-3細胞中，單克隆抗體2C4阻斷heregulin依賴的ErbB3與ErbB2的結(jié)合顯著地比HERCEPTIN有效。用HERCEPTIN預(yù)孵育降低MCF7裂解產(chǎn)物中的ErbB3信號，但是對從SK-BR-3裂解產(chǎn)物中共沉淀的ErbB3的量的作用很小，或者不起作用。在任一細胞系中，用抗EGF受體的抗體(Ab-1，Oncogene Sciences，USA)預(yù)孵育對ErbB3共免疫沉淀ErbB2的能力沒有影響。
實施例2細胞系和人腫瘤異種移植模型對2C4的反應(yīng)性大約檢測了40個腫瘤模型對2C4的反應(yīng)性。這些模型代表了主要的癌癥，例如乳腺、肺、前列腺和大腸。50-60％的模型對2C4處理產(chǎn)生反應(yīng)。下面的表1列舉所選擇的被檢測對2C4反應(yīng)性的腫瘤模型。簡而言之，將約3mm大小的人腫瘤異種移植碎片移植到無胸腺裸鼠的皮膚下?；蛘?，從培養(yǎng)皿中分離體外生長的人腫瘤細胞，重懸在磷酸鹽緩沖鹽水中，并皮下注射到無免疫應(yīng)答的小鼠的脅部。采用電測徑器(electric caliper)每2-3天監(jiān)控腫瘤的生長。
當(dāng)腫瘤達到大約30-100mm大小時，動物隨機地分成不同的處理和對照組。每周一次通過腹膜內(nèi)注射施用2C4。對照動物按照與處理組相同的方案接受相同體積不含抗體的載體溶液。在約3-6周后，當(dāng)對照組的腫瘤達到約1000-1500mm3的大小時，結(jié)束研究。對處理有反應(yīng)被定義為腫瘤體積減小≥50％。
表1異種移植模型


該模型代表兩種主要腫瘤模型，即非小細胞肺癌(NSCLC；模型#1-13)和乳腺癌(模型#14-18)。NSCLC模型中的9種(#1-9)和所有的乳腺癌模型是通過在免疫缺陷小鼠中連續(xù)體內(nèi)傳代人腫瘤碎片得到。剩下的NSCLC模型(#10-13)是以細胞為基礎(chǔ)的模型，其中體內(nèi)腫瘤生長是通過將體外繁殖的細胞移植到無免疫應(yīng)答小鼠中來誘導(dǎo)。
Berger，D.P.，Winterhalter，B.R.，和Fiebig，H.H.(1992).在胸腺發(fā)育不全裸鼠中人腫瘤異體移植的建立和表征Immunodeficient Mice in Oncology，H.H.Fiebig和D.P.Berger，編輯(BaselKarger)，23-46.
Burger，A.M.，Hartung，G.，Stehle，G.，Sinn，H.，和Fiebig，H.H.(2001).氨甲喋呤-白蛋白偶聯(lián)物(MTX-HSA)在人腫瘤體內(nèi)異體移植中的臨床前評價int.J.Cancer，92718-24.
Fiebig，H.H.，和Burger，A.M.(2002).人腫瘤異體移植和外植體.InTumor Models in Cancer Research，B.A.Teicher，編輯(Totowa，New JerseyHumana Press)，113-137.
Fiebig，H.H.，Dengler，W.A.，和Roth，T.(1999).人腫瘤異體移植新抗癌劑的可預(yù)測性、表征和發(fā)現(xiàn)。投稿于OncologyRelevance of Tumor Modelsfor Anticancer Drug Development，H.H.Fiebig和A.M.Burger，編輯.(BaselKarger)，29-50.
Gridley，D.S.，Andres，M.L.，Garner，C.，Mao，X.W.，和Slater，J.M.(1996).TNF-α對人肺腺癌模型中放射性效率影響的評價.Oncol Res.，8485-95.
Stein，R.，Govindan，S.V.，Chen，S.，Reed，L.，Spiegelman，H.，Griffiths，G.L.，Hansen，H.J.，和Goldenberg，D.M.(2001).使用殘量放射性碘標(biāo)記的Mab RS7成功治療人肺癌異體移植Crit.Rev.Oncol.Hemato.，39173-80.
Yamori，T.，Sato，S.，Chikazawa，H.，和Kadota，T.(1997).Paclitaxel針對人肺癌異種移植的抗腫瘤有效性Jpn.J Cancer Res.，881205-10.
Zou，Y.，Wu，Q.P.，Tansey，W.，Chow，D.，Hung，M.C.，Charnsangavej，C.，Wallace，S.，和Li，C.(2001).在裸乳中水溶性聚(L-谷氨酸)-喜樹堿偶聯(lián)物針對難治性人肺癌異種移植的有效性Int.J Oncol.，18331-6.
實施例3通過免疫沉淀檢測2C4響應(yīng)的腫瘤中的異二聚體對2C4反應(yīng)和不反應(yīng)的腫瘤進行抗ErbB2抗體免疫沉淀來分析是否存在ErbB2-ErbB3和EGFR-ErbB2異二聚體。除非另外說明，該方法按照“Maniatis T.等，分子克隆實驗室手冊，冷泉港，紐約，美國，冷泉港出版社，1982”來實施。
選擇不發(fā)生交叉反應(yīng)的抗HER2、抗HER3和抗HER1的抗體。為了確定抗體是否發(fā)生交叉反應(yīng)，在人胚胎腎(HEK)293細胞中表達HER1、HER2、HER3和HER4受體。用含有HEPES緩沖液(pH 7.5)的TritonTMX100(1％w/v)裂解細胞。大約20μg來自對照細胞和表達HER1，HER2，HER3和HER4的細胞的細胞總蛋白在SDS凝膠上分離，并通過半干印跡操作被轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜上。用明膠阻斷后，檢測各種抗HER1、抗HER2和抗HER3的抗體針對其他ErbB受體的交叉反應(yīng)性。被選擇用于下面描述的實驗的抗體不表現(xiàn)出任何顯著的交叉反應(yīng)性。
在冰上機械碾碎新鮮的腫瘤樣本，并在含有50mM HEPES pH 7.5、150mMNaCl、1.5mM MgCl2、1mM EDTA、10％(w/v)甘油、1％(w/v)TritonTMX-100、1mM PMSF、10μg/ml抑酶肽和0.4mM原釩酸鹽的緩沖液中裂解。離心完全裂解的腫瘤數(shù)次，直到上清液完全清澈。通過在1.5ml Eppendorf反應(yīng)管中，結(jié)合澄清的腫瘤裂解物(5-7mg蛋白/裂解物)、5μg抗ErbB2抗體(ab-3，小鼠單克??；目錄號OP15，Oncogene Inc.，USA)和50μl蛋白G偶聯(lián)的瓊脂糖來進行免疫沉淀。在加入1-2倍體積的含有0.1％(w/v)TritonTMX-100的50mM HEPES緩沖液，pH 7.5后，在4℃下轉(zhuǎn)動試管3-4小時，接著進行離心。用500μl的含有0.1％(w/v)TritonTMX-100的50mM HEPES緩沖液pH7.5洗滌沉淀2-3次。將等量體積的2x Lammli樣本緩沖液加入到被洗滌的免疫沉淀物中，在95℃下加熱樣本5分鐘。通過SDS-PAGE分離樣本，并轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜上。通過用抗EGFR抗體(抗EGFR的兔多克隆抗體，Upstate Inc.，USA；目錄號06-847)和抗ErbB3的抗體(抗ErbB3的多克隆抗體；Santa Cruz Inc.，USA；目錄號SC-285)探測印跡來評價是否存在EGFR-ErbB2和ErbB2-ErbB3異二聚體。過氧化物酶(POD)標(biāo)記的抗兔Fc抗體(BioRad Laboratories Inc.USA)被用作第二抗體。采用化學(xué)發(fā)光底物(ECL plus，Amersham)觀察印跡。
附圖3顯示這些實驗的結(jié)果?？梢钥闯龃嬖贓rbB2-ErbB3和/或EGFR-ErbB2異二聚體。觀察到如表1所示的2C4反應(yīng)性與存在ErbB2-ErbB3和/或EGFR-ErbB2異二聚體之間的關(guān)聯(lián)。
實施例4對rhuMAb 2C4的反應(yīng)性與HER2磷酸化之間的關(guān)聯(lián)已經(jīng)在14個被植入小鼠中的人腫瘤(9個肺癌和5個乳腺癌)中研究了rhuMAb 2C4對腫瘤生長的作用。如實施例2所描述進行腫瘤外植和處理。如在實施例3中所描述檢測HER2異二聚體。
通過免疫沉淀HER2和蛋白質(zhì)印跡分析來評價HER2磷酸化。凝膠上存在磷酸HER2條帶確定為陽性。不存在該條帶確定為陰性。采用磷酸特異性抗HER2抗體(克隆PN2A，Thor等，J.Clin.Oncol.，183230-9(2000))通過免疫組織化學(xué)證實HER2磷酸化。
在被檢測的腫瘤的5種(3種肺癌和2種乳腺癌)中，觀察到腫瘤生長被顯著地抑制，這與存在可檢測的HER2與HER1或HER3的異二聚體，以及在所有情況下強烈的HER2磷酸化相關(guān)。觀察到9種腫瘤中沒有對rhuMAb 2C4處理的顯著反應(yīng)，沒有檢測到異二聚體，并且不存在HER2磷酸化。在非臨床模型中，存在HER2異二聚體化或者顯著的HER2磷酸化有力地指示對rhuMAb 2C4處理有反應(yīng)。在由腫瘤細胞系產(chǎn)生的異種移植中也獲得相似的觀察結(jié)果。
實施例5在對2C4響應(yīng)的腫瘤中檢測HER2的磷酸化在9個已經(jīng)建立的非小細胞肺癌(NSCLC)異種移植的腫瘤模型(LXFE211，LXFA 289，LXFA 297，LXFE 397，LXFA 526，LXFL 529，LXFA 629，LXFA 1041，LXFL 1071，Oncotest GmbH，F(xiàn)reiburg，Germany)中評價rhuMAb2C4的功效。由于患者的腫瘤以固體瘤生長，產(chǎn)生基質(zhì)、維管結(jié)構(gòu)、中央壞死并且表現(xiàn)為圓頂分化，人腫瘤異種移植被認為是作為抗癌藥物開發(fā)的最相關(guān)模型。此外，異種移植的腫瘤模型在組織學(xué)和化學(xué)敏感性上與原始腫瘤非常接近。
如實施例2中所描述評價生長抑制。顯著的生長抑制活性被定義為相對于對照組，抑制處理組的＞50％的生長。在NSCLC模型中的三個中(LXFA297，LXFA 629，和LXFL 1072)，觀察到顯著的對rhuMAb 2C4處理的生長抑制反應(yīng)。在蛋白質(zhì)水平上還研究了配基活化HER2的多個特征。如附圖4中所示，可以從9個NSCLC腫瘤中的8個的腫瘤提取物中免疫沉淀HER2。為了確定HER2的活化狀態(tài)，然后用抗磷酸酪氨酸(抗PY)抗體探測這些印跡。如在附圖4的下面組中所示，三個響應(yīng)腫瘤(LXFA 297，LXFA 629和1072)顯示強烈的HER2活化。
實施例6通過檢測HER2異二聚體來鑒定用rhuMAb 2C4治療的肺癌患者的臨床研究如果來自患者的腫瘤被發(fā)現(xiàn)包含HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4復(fù)合物，該患者被鑒定為患有對用rhuMAb 2C4治療響應(yīng)的非小細胞肺癌(NSCLC)。
通過活組織檢查或者在手術(shù)切除腫瘤的過程中獲得腫瘤樣本。然后分析該樣本是否存在HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4異二聚體。
腫瘤細胞或細胞裂解物與特異結(jié)合HER2的eTagTM接觸。該eTagTM包含可檢測部分和特異于HER2的第一結(jié)合部分?？蓹z測部分以可裂解接頭被連接到第一結(jié)合部分上。在足夠的結(jié)合時間后，去除多余的eTagTM。
腫瘤細胞或細胞裂解物與特異結(jié)合HER1或HER3或HER4的第二結(jié)合化合物接觸。通過洗滌來去除未被結(jié)合的化合物。然后激活第二結(jié)合化合物。如果第一結(jié)合化合物和第二結(jié)合化合物十分接近，被激活的第二結(jié)合化合物斷裂eTagTM中的可裂解接頭來產(chǎn)生游離的可檢測部分。鑒定樣本中的游離部分指示該腫瘤包含HER2/HER1或HER2/HER3或HER2/HER4異二聚體。
在確定患者患有包含HER2/HER1和/或HER2/HER3和/或HER2/HER4異二聚體的腫瘤時，每周或者每3周分別靜脈內(nèi)(IV)施用2或4mg/kgrhuMAb 2C4，直到疾病進展。抗體以多劑量液體制劑形式(以20mg/mL或更高濃度裝滿20mL)被提供。主要的功效終點包括反應(yīng)率和安全性。次要功效終點包括總存活率、疾病進展時間、生活質(zhì)量和/或反應(yīng)持續(xù)時間。
實施例7鑒定用rhuMAb 2C4治療的癌癥患者的臨床研究包含癌細胞的生物樣本從用于治療的候選者中獲得，例如通過腫瘤組織的活細胞檢查，從腹水中抽吸腫瘤細胞或者臨床實踐中知曉的任何其他方法。通過上面描述的任何技術(shù)分析生物樣本中的HER2磷酸化例如通過免疫沉淀和蛋白質(zhì)印跡分析，和/或是否存在HER2/HER3、HER2/HER1和/或HER2/HER4異二聚體。生物樣本中HER2磷酸化陽性和/或存在HER2/HER3，HER2/HER1和/或HER2/HER4異二聚體的個體對用rhuMAb2C4處理可能比腫瘤樣本中不顯示HER2磷酸化或沒有檢測到異二聚體的患者有更好的反應(yīng)。
例如，被診斷具有卵巢癌的個體將進行腫瘤組織的活組織檢查，或者從腹水液中抽吸腫瘤細胞。通過免疫沉淀和蛋白質(zhì)印跡分析來分析組織中HER2的磷酸化。這需要最少約250mg腫瘤組織。
一旦確定患者患有為HER2磷酸化陽性的腫瘤(例如，閹割抗性的前列腺癌CRPC或卵巢癌)，在循環(huán)1(第一個21天的治療階段)的第一天，該患者將接受840mg載入劑量的rhuMAb 2C4，接著在每個后續(xù)的21天循環(huán)的第一天以持續(xù)的靜脈灌注的形式接受420mg對于不表現(xiàn)疾病進展跡象的患者，通過每3周的靜脈灌注繼續(xù)治療，直到1年(17個循環(huán))。根據(jù)醫(yī)生的判斷，治療可以在任何較早時期由于缺乏反應(yīng)、副作用或者其他原因被停止。
在本公開中引用的全部參考文獻，以及其中引用的參考文獻在此特別地引入作為參考。
雖然本發(fā)明以某些實施方案被描述，本發(fā)明不是如此被限定。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到，各種改進是可能的，而不從實質(zhì)上改變本發(fā)明。不需要過度的實驗而進行的所有這些改進被包含在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
序列表<110>健泰科生物技術(shù)公司(Genentech，Inc.)(F.HOFFMANN-LA ROCHE AG)Koll，HansBossenmaier，BirgitMuller，Hans-JoachimSliwkowski，MarkKelsey，Stephen<120>鑒定對用抗ErbB2抗體處理響應(yīng)的腫瘤的方法<130>39766-0114PC<150>US 60/396,290<151>2002-07-15<150>US 60/480,043<151>2003-06-20<160>6<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>107<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>1Asp Thr Val Met Thr Gln Ser His Lys Ile Met Ser Thr Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly20 25 30Val Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala65 70 75 80Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr
85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105<210>2<211>119<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>2Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr1 5 10 15Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr20 25 30Thr Met Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe50 55 60Lys Gly Lys Ala Ser Leu Thr Val Asp Arg Ser Ser Arg Ile Val Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Phe Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser115<210>3<211>107<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>3Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly20 25 30Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105<210>4<211>119<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>4Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr20 25 30Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115<210>5<211>107<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>5Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Leu Pro Trp85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105<210>6<211>119<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>6Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Val Ile Ser Gly Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Gly Arg Val Gly Tyr Ser Leu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110Thr Leu Val Thr Val Ser Ser11權(quán)利要求
1.鑒定對用抗HER2抗體處理響應(yīng)的腫瘤的方法，包含a)檢測所述腫瘤的樣本中HER2/HER3和/或HER2/HER1蛋白質(zhì)復(fù)合物的存在；c)當(dāng)檢測到復(fù)合物時，則將腫瘤鑒定為對用抗HER2抗體處理響應(yīng)的腫瘤。
2.權(quán)利要求1的方法，其中抗HER2抗體阻斷包含HER2的ErbB異二聚體的配基活化。
3.權(quán)利要求1的方法，其中抗HER2抗體是單克隆抗體2C4。
4.權(quán)利要求1的方法，其中抗HER2抗體是rhuMAb 2C4。
5.權(quán)利要求1的方法，其中HER2/HER3和/或HER2/HER1蛋白質(zhì)復(fù)合物的存在通過如下步驟檢測a)用抗HER2抗體免疫沉淀任何包含HER2的蛋白質(zhì)復(fù)合物；b)用選自由抗HER3抗體和抗HER1抗體組成的組中的抗體與被免疫沉淀的復(fù)合物接觸；和c)確定抗HER3和/或抗HER1抗體是否與被免疫沉淀的復(fù)合物結(jié)合，其中如果確定抗HER3和/或抗HER1抗體與被免疫沉淀的復(fù)合物結(jié)合，則檢測到HER2/HER3和/或HER2/HER1復(fù)合物。
6.權(quán)利要求1的方法，其中HER2/HER3和/或HER2/HER1蛋白質(zhì)復(fù)合物的存在通過如下步驟檢測a)將腫瘤樣本與包含熒光團的抗HER2抗體接觸；b)將腫瘤樣本與選自由抗HER3和抗HER1抗體組成的組中的抗體接觸，其中所述抗體包含第二熒光團；c)通過測量熒光共振能量轉(zhuǎn)移確定第一熒光團和第二熒光團是否十分接近，其中如果第一和第二熒光團被確定十分接近，則檢測到HER2/HER3和/或HER2/HER1蛋白質(zhì)復(fù)合物的存在。
7.權(quán)利要求1的方法，其中HER2/HER3和/或HER2/HER1蛋白質(zhì)復(fù)合物的存在是通過如下步驟檢測的a)將腫瘤樣本與第一結(jié)合化合物接觸，其中所述第一結(jié)合化合物包含特異結(jié)合HER2的第一靶向結(jié)合部分，并且還進一步包含通過可裂解接頭連接到第一靶向結(jié)合部分的可檢測部分；b)將腫瘤樣本與第二結(jié)合化合物接觸，其中該第二結(jié)合化合物包含特異結(jié)合HER3或HER1的第二靶向結(jié)合部分和可活化的裂解劑；c)激活裂解劑，使得如果第一結(jié)合化合物和第二結(jié)合化合物十分接近，第二結(jié)合化合物斷裂第一結(jié)合化合物中的可裂解接頭來產(chǎn)生游離的可檢測部分；和d)鑒定游離的可檢測部分的存在，其中當(dāng)鑒定到游離的可檢測部分時，檢測到HER2/HER3或HER2/HER1蛋白質(zhì)復(fù)合物的存在。
8.權(quán)利要求7的方法，其中第一靶向結(jié)合部分包含抗HER2抗體或者抗體片段。
9.權(quán)利要求7的方法，其中第一靶向結(jié)合部分包含HER2受體的配體。
10.權(quán)利要求7的方法，其中第二靶向結(jié)合部分包含抗HER3抗體或者抗體片段。
11.權(quán)利要求7的方法，其中第二靶向結(jié)合部分包含HER3受體的配體。
12.權(quán)利要求7的方法，其中第二靶向結(jié)合部分包含抗HER1抗體或者抗體片段。
13.權(quán)利要求7的方法，其中第二靶向結(jié)合部分包含HER1受體的配體。
14.權(quán)利要求7的方法，其中樣本從患有該腫瘤的患者中獲得。
15.權(quán)利要求14的方法，其中樣本通過腫瘤的活組織檢查獲得。
16.權(quán)利要求14的方法，其中樣本通過純化來自患者血液的循環(huán)的腫瘤細胞來獲得。
17.權(quán)利要求14的方法，其中樣本是在手術(shù)從患者中去除腫瘤的過程中獲得。
18.權(quán)利要求1的方法，其中腫瘤樣本從小鼠中獲得。
19.權(quán)利要求18的方法，其中腫瘤是異種移植的腫瘤。
20.權(quán)利要求19的方法，其中異種移植的腫瘤是通過將人腫瘤碎片移植到小鼠中來制備。
21.權(quán)利要求1的方法，其中腫瘤是肺腫瘤。
22.權(quán)利要求1的方法，其中腫瘤是乳腺腫瘤。
23.鑒定對用抑制HER2與ErbB受體家族的另一成員結(jié)合的抗體處理響應(yīng)的腫瘤細胞的方法，包含a)提供包含HER2陽性的腫瘤細胞的生物學(xué)樣本；和b)檢測在所述生物學(xué)樣本中的ErbB受體的磷酸化，其中所述磷酸化指示所述腫瘤細胞對用所述抗體處理響應(yīng)。
24.權(quán)利要求23的方法，其中ErbB2(HER2)受體磷酸化被檢測。
25.權(quán)利要求23的方法，其中其他成員選自由HER3、HER1和HER4組成的組。
26.權(quán)利要求23的方法，其中抗體結(jié)合HER2。
27.權(quán)利要求26的方法，其中抗HER2抗體阻斷包含HER2的ErbB異二聚體的配基活化。
28.權(quán)利要求27的方法，其中抗體是rhuMAb 2C4。
29.權(quán)利要求25的方法，其中抗體結(jié)合HER3。
30.權(quán)利要求25的方法，其中抗體結(jié)合HER1。
31.權(quán)利要求25的方法，其中抗體結(jié)合HER4。
32.權(quán)利要求23的方法，另外還包含檢測樣本中至少一種選自由HER2/HER3、HER2/HER1和HER2/HER4組成的組中的蛋白質(zhì)復(fù)合物的存在。
33.權(quán)利要求32的方法，其中通過如下來檢測所述蛋白質(zhì)復(fù)合物或多個蛋白質(zhì)復(fù)合物的存在a)用抗HER2抗體免疫沉淀任何包含HER2的蛋白質(zhì)復(fù)合物；b)將被免疫沉淀的復(fù)合物與選自由抗HER3、抗HER1和抗HER4抗體組成的組中的至少一種抗體接觸；和c)確定所述抗HER3和/或抗HER1和/或抗HER4抗體是否與被免疫沉淀的復(fù)合物結(jié)合，其中如果確定抗HER3和/或抗HER1和/或抗HER4抗體與被免疫沉淀的復(fù)合物結(jié)合，則檢測到HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4復(fù)合物。
34.權(quán)利要求32的方法，其中通過如下檢測所述蛋白質(zhì)復(fù)合物或多個蛋白質(zhì)復(fù)合物的存在a)將腫瘤樣本與包含熒光團的抗HER2抗體接觸；b)將腫瘤樣本與選自由抗HER3、抗HER1和抗HER4抗體組成的組中的抗體接觸，其中所述抗體包含第二熒光團；c)通過測量熒光共振能量轉(zhuǎn)移確定第一熒光團與第二熒光團是否十分接近，其中如果第一與第二熒光團被確定十分接近，則檢測到存在HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4蛋白質(zhì)復(fù)合物。
35.權(quán)利要求32的方法，其中通過如下檢測所述蛋白質(zhì)復(fù)合物或多個蛋白質(zhì)復(fù)合物的存在a)將腫瘤樣本與第一結(jié)合化合物接觸，其中所述第一結(jié)合化合物包含特異結(jié)合HER2的第一靶向結(jié)合部分，還進一步包含通過可裂解接頭被連接到第一靶向結(jié)合部分的可檢測部分；b)將腫瘤樣本與第二結(jié)合化合物接觸，其中第二結(jié)合化合物包含特異結(jié)合HER3或HER1或HER4的第二靶向結(jié)合部分和可活化的裂解劑；c)激活裂解劑，使得如果第一結(jié)合化合物和第二結(jié)合化合物十分接近，則第二結(jié)合化合物斷裂第一結(jié)合化合物的可裂解接頭來產(chǎn)生游離的可檢測部分；和d)鑒定游離的可檢測部分的存在，其中當(dāng)游離的可檢測部分被鑒定時，檢測到HER2/HER3或HER2/HER1或HER2/HER4蛋白質(zhì)復(fù)合物的存在。
36.權(quán)利要求35的方法，其中第一靶向結(jié)合部分包含抗HER2抗體或抗體片段，或HER2受體的配體。
37.權(quán)利要求35的方法，其中第二靶向結(jié)合部分包含抗HER3抗體或抗體片段，或HER3受體的配體。
38.權(quán)利要求35的方法，其中第二靶向結(jié)合部分包含抗HER1抗體或抗體片段，或HER1受體的配體。
39.權(quán)利要求35的方法，其中第二靶向結(jié)合部分包含抗HER4抗體或抗體片段，或HER4受體的配體。
40.權(quán)利要求23的方法，其中生物學(xué)樣本是從腫瘤活組織檢查中獲得的組織。
41.權(quán)利要求23的方法，其中生物學(xué)樣本是包含循環(huán)的腫瘤細胞和/或循環(huán)的血漿蛋白的生物學(xué)液體。
42.權(quán)利要求23的方法，其中該腫瘤選自由乳腺癌、前列腺癌、肺癌、結(jié)腸直腸癌和卵巢癌組成的組。
43.權(quán)利要求23的方法，其中ErbB受體磷酸化通過ErbB受體的免疫沉淀和蛋白質(zhì)印跡分析來確定。
44.權(quán)利要求43的方法，其中ErbB受體磷酸化通過凝膠上的磷酸ErbB受體條帶的存在來指示。
45.權(quán)利要求43的方法，還進一步包含用磷酸特異的抗ErbB受體抗體通過免疫組織化學(xué)來證實ErbB受體磷酸化的步驟。
46.權(quán)利要求23的方法，其中通過免疫組織化學(xué)確定ErbB受體磷酸化。
47.用于預(yù)測個體對用抑制HER2與ErbB受體家族的另一成員聯(lián)合的抗體處理的反應(yīng)的方法，所述個體被診斷患有HER2陽性腫瘤，該方法包含a)提供從所述個體獲得的生物學(xué)樣本，包含HER2陽性腫瘤細胞；和b)檢測所述生物學(xué)樣本中的ErbB受體的磷酸化，其中所述磷酸化指示所述患者可能對用所述抗體處理有反應(yīng)。
48.權(quán)利要求47的方法，其中所述ErbB受體是ErbB2(HER2)。
49.權(quán)利要求47的方法，其中其他成員選自由HER3、HER1和HER4組成的組。
50.權(quán)利要求47的方法，其中抗體結(jié)合HER2。
51.權(quán)利要求50的方法，其中抗HER2抗體阻斷包含HER2的ErbB異二聚體的配基活化。
52.權(quán)利要求51的方法，其中抗體是rhuMAb 2C4。
53.權(quán)利要求49的方法，其中抗體結(jié)合HER3。
54.權(quán)利要求49的方法，其中抗體結(jié)合HER1。
55.權(quán)利要求49的方法，其中抗體結(jié)合HER4。
56.權(quán)利要求47的方法，另外還包含檢測在樣本中至少一種選自由HER2/HER3、HER2/HER1和HER2/HER4組成的組中的蛋白質(zhì)復(fù)合物的存在。
57.權(quán)利要求56的方法，其中通過如下檢測所述蛋白質(zhì)復(fù)合物的存在a)用抗HER2抗體免疫沉淀任何包含HER2的蛋白質(zhì)復(fù)合物；b)將被免疫沉淀的復(fù)合物與選自由抗HER3、抗HER1和抗HER4抗體組成的組中的抗體接觸；和c)確定抗HER3和/或抗HER1和/或抗HER4抗體是否與被免疫沉淀的復(fù)合物結(jié)合，其中如果確定抗HER3和/或抗HER1和/或抗HER4抗體與被免疫沉淀的復(fù)合物結(jié)合，則檢測到HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4復(fù)合物。
58.權(quán)利要求56的方法，其中通過如下檢測HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4蛋白質(zhì)復(fù)合物的存在a)將腫瘤樣本與包含熒光團的抗HER2抗體接觸；b)將腫瘤樣本與選自由抗HER3、抗HER1和抗HER4抗體組成的組中的抗體接觸，其中所述抗體包含第二熒光團；c)通過測量熒光共振能量轉(zhuǎn)移確定第一熒光團與第二熒光團是否十分接近，其中如果第一熒光團和第二熒光團被確定十分接近，則檢測到HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4蛋白質(zhì)復(fù)合物的存在。
59.權(quán)利要求56的方法，其通過如下檢測HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4蛋白質(zhì)復(fù)合物的存在a)將腫瘤樣本與第一結(jié)合化合物接觸，其中所述第一結(jié)合化合物包含特異結(jié)合HER2的第一靶向結(jié)合部分，還進一步包含通過可裂解接頭連接到第一靶向結(jié)合部分的可檢測部分；b)將腫瘤樣本與第二結(jié)合化合物接觸，其中第二結(jié)合化合物包含特異結(jié)合HER3、HER1或HER4的第二靶向結(jié)合部分和可活化的裂解劑；c)激活裂解劑使得如果第一結(jié)合化合物與第二結(jié)合化合物十分接近，第二結(jié)合化合物斷裂第一結(jié)合化合物中的可裂解接頭來產(chǎn)生游離的可檢測部分；和d)鑒定游離的可檢測部分的存在，其中當(dāng)鑒定到游離的可檢測部分時，則檢測到HER2/HER3或HER2/HER1或HER2/HER4蛋白質(zhì)復(fù)合物的存在。
60.權(quán)利要求59的方法，其中第一靶向結(jié)合部分包含抗HER2抗體或抗體片段，或HER2受體的配體。
61.權(quán)利要求59的方法，其中第二靶向結(jié)合部分包含抗HER3抗體或抗體片段，或HER3受體的配體。
62.權(quán)利要求59的方法，其中第二靶向結(jié)合部分包含抗HER1抗體或抗體片段，或HER1受體的配體。
63.權(quán)利要求59的方法，其中第二靶向結(jié)合部分包含抗HER4抗體或抗體片段，或HER4受體的配體。
64.權(quán)利要求47的方法，其中生物學(xué)樣本是從腫瘤活組織檢查中獲得的組織。
65.權(quán)利要求47的方法，其中生物學(xué)樣本是包含循環(huán)的腫瘤細胞和/或循環(huán)的血漿蛋白的生物學(xué)液體。
66.權(quán)利要求47的方法，其中腫瘤選自由乳腺癌、前列腺癌、肺癌、結(jié)腸直腸癌和卵巢癌組成的組。
67.權(quán)利要求47的方法，其中ErbB受體磷酸化通過ErbB受體的免疫沉淀和蛋白質(zhì)印跡分析來確定。
68.權(quán)利要求67的方法，其中ErbB受體磷酸化通過凝膠上存在磷酸ErbB受體條帶來指示。
69.權(quán)利要求67的方法，還進一步包含采用磷酸特異性抗ErbB受體抗體通過免疫組織化學(xué)來證實ErbB受體磷酸化的步驟。
70.權(quán)利要求47的方法，其中ErbB受體磷酸化通過免疫組織化學(xué)確定。
71.用于鑒定對用抗HER2抗體處理響應(yīng)的個體的方法，包含a)檢測所述個體的循環(huán)的腫瘤細胞中的ErbB受體磷酸化，和b)如果檢測到所述磷酸化，則確定所述個體可能對用抗HER2抗體處理有反應(yīng)。
72.權(quán)利要求71的方法，其中ErbB2(HER2)磷酸化被檢測。
73.權(quán)利要求72，其中所述個體是人。
74.權(quán)利要求73的方法，還進一步包含用抗HER2抗體處理所述個體。
75.權(quán)利要求74的方法，其中所述抗HER2抗體是rhuMAb 2C4。
76.一種治療患者的方法，包含給患者施用治療有效量的結(jié)合HER2的抗體，其中該患者患有已被確定包含HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4異二聚體的腫瘤。
77.權(quán)利要求76的方法，其中抗體阻斷包含HER2的ErbB異二聚體的配基活化。
78.權(quán)利要求77的方法，其中抗體是單克隆抗體2C4。
79.權(quán)利要求77的方法，其中抗體是rhuMAb 2C4。
80.一種制品，包含含有結(jié)合HER2的抗體的容器和用于施用抗體給患有腫瘤的患者的說明書，其中腫瘤已被確定包含HER2/HER3和/或HER2/HER1和/或HER2/HER4異二聚體。
81.權(quán)利要求80的制品，其中抗體阻斷包含HER2的ErbB異二聚體的配基活化。
82.權(quán)利要求81的制品，其中容器包含單克隆抗體2C4。
83.權(quán)利要求81的制品，其中容器包含rhuMAb 2C4。
84.治療患者的方法，包含給患者施用治療有效量的結(jié)合HER2的抗體，其中患者患有已被確定具有磷酸化ErbB受體的腫瘤。
85.權(quán)利要求84的方法，其中ErbB受體是HER2。
86.權(quán)利要求84的方法，其中抗體阻斷包含HER2的ErbB異二聚體的配基活化。
87.權(quán)利要求84方法，其中抗體是單克隆抗體2C4。
88.權(quán)利要求87的方法，其中抗體是rhuMAb 2C4。
全文摘要
通過在腫瘤細胞樣品中檢測HER2/HER3和/或HER2/HER1蛋白質(zhì)復(fù)合物或者HER2磷酸化的存在來鑒定對用抗HER2抗體處理響應(yīng)的腫瘤。用抗HER2抗體，例如rhuMAb 2C4治療患有包含HER/2/HER1和/或HER2/HER3異二聚體和/或HER2磷酸化的腫瘤的患者。
文檔編號G01N33/48GK1835768SQ03821625
公開日2006年9月20日 申請日期2003年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月15日
發(fā)明者漢斯·科爾, 伯吉特·博森梅爾, 漢斯-喬基姆·米勒, 馬克·X·斯利科夫斯基, 斯蒂芬·M·凱爾西 申請人:健泰科生物技術(shù)公司, 霍夫曼-拉羅奇有限公司