專利名稱：：彈狀病毒的重組突變體及其應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及除了表達(dá)其基因組內(nèi)包含的至少一種外源核酸之外還表達(dá)包括一種突變的基質(zhì)蛋白(M)和/或一種突變的糖蛋白(G)的彈狀病毒蛋白的重組彈狀病毒科病毒。本發(fā)明還涉及其應(yīng)用方法，包括其在體內(nèi)的應(yīng)用、抗癌應(yīng)用如治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤。本發(fā)明的重組彈狀病毒科病毒還用于基因治療和疫苗應(yīng)用中。
背景技術(shù)：
：盡管在治療應(yīng)用中針對基因輸送的合適載體的研發(fā)取得了巨大進(jìn)展，但仍存在許多障礙，特別是在針對基因治療的有效輸送系統(tǒng)的研發(fā)和疫苗研發(fā)及其對抗癌治療的影響中存在許多障礙?；蛑委煹牟《据d體典型地不裂解其靶向的細(xì)胞。用于基因治療的病毒載體被工程化以輸送相對安全的治療有效的DNA，如藥物(見例如D.T.Curiel等的美國專利No.5,547,932)。這些載體中有一些能在感染基礎(chǔ)上復(fù)制，但僅在靶細(xì)胞內(nèi)(F.McConnick，美國專利No.5,677,178)。其它基因治療載體被工程化以便其不能復(fù)制。非復(fù)制的基因治療載體通常使用輔助質(zhì)粒產(chǎn)生(見例如G.Natsoulis，美國專利No.5,622,856；M.Mamounas，美國專利No.5,646,034)或使用授予病毒基因組中缺少的遺傳元件的包裝細(xì)胞。病毒基因治療載體的廣泛應(yīng)用受到這樣的事實(shí)的限制，即利用的病毒載體自然的野生型向性通常不易于克服。近年來，已經(jīng)授予了許多基因治療專利，這些專利描述了腺病毒載體(M.Cotton等，美國專利No.5,693,509)、腺伴隨病毒載體(J.S.Lebkowski等，美國專利No.5,589,377)、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(B.O.Palsson等，美國專利No.5,616,487)、含有嵌合融合糖蛋白的載體(S.Kayman等，美國專利No.5,643,756)、含有病毒外殼蛋白的抗體的載體(cotton等)、工程化的以允許在猴(通常不能被HIV-1感染的物種)中用人免疫缺陷型1病毒(HIV-1)感染的雜種病毒(J.Sodroski等，美國專利No.5,654,195)、及含有皰疹性口腔炎病毒(VSV)的G蛋白的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(J.C.Bums等，美國專利No.5,512,421和5,670,354)。對基因治療載體加以一些修飾以嘗試克服各個載體固有的向性限制，同時保持用于基因治療中的載體的效力。也已經(jīng)產(chǎn)生了病毒輸送載體以進(jìn)行瞬時基因治療，其中輸送于細(xì)胞的基因的表達(dá)不是持久的(I.H.Maxwell等，美國專利No.5,585,254)。疫苗研發(fā)和促進(jìn)有效的免疫應(yīng)答是生物醫(yī)學(xué)研究中的另一個領(lǐng)域，這將有益于更好地設(shè)計(jì)合適的基因輸送系統(tǒng)，尤其是病毒輸送載體。已經(jīng)充分證明了在對侵入的病原或疫苗制劑的免疫應(yīng)答的初級階段期間產(chǎn)生的細(xì)胞因子在抗原特異性Th細(xì)胞的產(chǎn)生中起關(guān)鍵作用。一些跡象表明T輔助細(xì)胞分化為與保護(hù)作用相關(guān)的表型的“決定(decision)”受到細(xì)胞因子環(huán)境的強(qiáng)烈影響，在其中發(fā)現(xiàn)了T輔助細(xì)胞(1)。另外，許多不同的細(xì)胞因子當(dāng)作為治療或作為佐劑成分給予時，已經(jīng)示出具有免疫調(diào)節(jié)作用，能促進(jìn)細(xì)胞介導(dǎo)的、抗原特異性免疫應(yīng)答的產(chǎn)生。為了充分利用這種細(xì)胞因子的免疫調(diào)節(jié)和佐劑性質(zhì)，許多研究人員已經(jīng)開始評價使用載體如質(zhì)粒DNA(2)、工程化細(xì)胞(3，4)或重組病毒(5)在體內(nèi)輸送大量的這些細(xì)胞因子。在其它領(lǐng)域中已經(jīng)示出病毒載體用于治療腫瘤，尤其是治療腦部腫瘤。在癌癥基因治療中取得的快速進(jìn)展重申了這樣的希望，即這種技術(shù)可為外科手術(shù)提供一種成功的輔助手段。已經(jīng)揭示了用這些工具治療癌癥的兩種治療策略。一種策略稱為病毒治療(virotherapy)或腫瘤消解治療，利用溶細(xì)胞的病毒的固有破壞能力殺死腫瘤細(xì)胞。將這些所謂的腫瘤消解病毒加以遺傳修飾以便它們特異性靶向腫瘤細(xì)胞或者在正常組織中復(fù)制受限，從而優(yōu)先破壞腫瘤細(xì)胞。復(fù)制受限的腫瘤消解病毒的一個實(shí)例是ONYX-015。ONYX-015是一種腺病毒，其E1B基因缺失并且在具有野生型p53基因的正常細(xì)胞中復(fù)制受限，但在缺少功能性p53的腫瘤細(xì)胞中復(fù)制并殺死其(6)。另一種策略包括將治療性或胞毒性基因輸送至腫瘤細(xì)胞。這些基因的產(chǎn)物直接或間接抑制腫瘤生長。在臨床前和臨床研究中已經(jīng)測試了許多不同的基因，包括人細(xì)胞因子基因，腫瘤抑制基因，細(xì)菌或病毒前體藥物激活酶編碼基因(自殺基因)和使實(shí)體瘤對放療和化療更敏感的基因。彈狀病毒科病毒是包膜(membrane-enveloped)病毒，其廣泛分布于自然界，感染脊椎動物、無脊椎動物和植物。皰疹性口腔炎病毒(VSV)是彈狀病毒科病毒家族的一部分，其分為6個屬，VSV是其中之一。彈狀病毒科病毒具有11-12,000個核苷酸的單負(fù)鏈RNA基因組(RoseandWhitt，2001，Chapter38，RhabdoviridaeThevirusesandtheirreplication，inFieldsVirology，4thedition，pp.1221-1244)。病毒顆粒含有由基因組RNA和蛋白質(zhì)組成的一個螺旋狀核殼核心。通常地，發(fā)現(xiàn)三種稱為N(核殼，其緊緊地包住基因組)、P(先前稱為NS，最初表示非結(jié)構(gòu)的)和L(大型)的蛋白質(zhì)與核殼相關(guān)。一個額外的基質(zhì)(M)蛋白位于包膜中，也許與膜和核殼核心均相互作用。一個糖蛋白(G)物種跨越膜并在病毒顆粒的表面形成突起。G負(fù)責(zé)與細(xì)胞和膜融合體結(jié)合。由于基因組是負(fù)義的(即與發(fā)揮mRNA功能以直接產(chǎn)生編碼的蛋白質(zhì)的RNA序列(正義)互補(bǔ))，因此彈狀病毒科病毒必須在病毒體中編碼和包裝RNA依賴性RNA聚合酶(Baltimore等，1970，Proc.Natl.Acad.Sci.USA66572-576)，其由P和L蛋白組成。這種酶轉(zhuǎn)錄基因組RNA產(chǎn)生編碼5-6個病毒蛋白的亞基因組mRNA，并且還復(fù)制全長正義和負(fù)義RNA?；蛟诨蚪M的3’末端開始相繼被轉(zhuǎn)錄。VSV的基質(zhì)蛋白在病毒的生活周期中起兩種關(guān)鍵作用。首先，其對病毒裝配和病毒顆粒從感染的細(xì)胞中釋放是必需的。其次，其負(fù)責(zé)抑制宿主細(xì)胞基因表達(dá)，這允許病毒利用所有宿主細(xì)胞翻譯機(jī)制合成病毒蛋白。M蛋白對宿主基因表達(dá)的抑制被認(rèn)為是造成VSV感染相關(guān)的嚴(yán)重和快速致細(xì)胞病變作用的原因。M蛋白誘導(dǎo)的致細(xì)胞病變作用導(dǎo)致編程性細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)并典型地導(dǎo)致細(xì)胞在感染后12-16小時內(nèi)死亡。M蛋白單獨(dú)從真核表達(dá)載體中瞬時表達(dá)足以誘導(dǎo)典型的VSV致細(xì)胞病變作用，包括宿主細(xì)胞的細(xì)胞骨架的解體和細(xì)胞成為圓形(rounding)，表明VSV誘導(dǎo)的致細(xì)胞病變作用不需要其它的VSV蛋白。VSVG蛋白介導(dǎo)病毒附著于宿主細(xì)胞以及在胞吞后病毒包膜與內(nèi)體膜的融合。G蛋白胞外域的第118-136位殘基的突變分析結(jié)果以及VSV的疏水性光標(biāo)記實(shí)驗(yàn)結(jié)果提供了這樣的證據(jù)，即這個區(qū)域是內(nèi)在的融合肽并且其在酸性pH插入靶膜中(9-14)。也已經(jīng)示出在第395-418位殘基之間區(qū)域的插入或取代影響G蛋白的膜融合活性(15，16)。在融合肽和第395-418位殘基中均有取代的雙突變體對融合抑制具有加性效應(yīng)(17)，表明胞外域的C末端區(qū)域在G的融合活性中特異性起重要作用。因此意識到需要開發(fā)病毒載體以用于基因輸送，疫苗研發(fā)和抗癌治療。研發(fā)基于VSV的載體，特別是不具有致細(xì)胞病變作用的那些載體，不經(jīng)歷廣泛的細(xì)胞-細(xì)胞播散，并且專門在胞質(zhì)中復(fù)制的那些載體消除了與病毒載體治療相關(guān)的許多問題，包括關(guān)于在靶細(xì)胞染色體中的插入誘變的問題。發(fā)明概述本發(fā)明在一個實(shí)施方案中揭示了重組彈狀病毒科病毒，其中基質(zhì)蛋白M和/或彈狀病毒糖蛋白(G)的近膜(membrane-proximal)胞外域被突變或部分缺失。本發(fā)明在其它實(shí)施方案中進(jìn)一步提供了這種重組彈狀病毒科病毒在基因轉(zhuǎn)移方案中，作為疫苗和抗癌治療中的應(yīng)用。在一個實(shí)施方案中，重組彈狀病毒是非致細(xì)胞病變的并進(jìn)一步包含插入編碼第二種多肽的一個異源核酸序列。第二種多肽在一個實(shí)施方案中可以是治療性多肽，或者在另一個實(shí)施方案中可以是免疫原性的。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)非致細(xì)胞病變的重組彈狀病毒的方法，所述重組彈狀病毒包含編碼彈狀病毒蛋白的遺傳修飾的核酸，所述彈狀病毒蛋白包括在基質(zhì)蛋白(M)內(nèi)的突變或缺失，所述方法包括如下步驟(A)在合適的細(xì)胞中插入編碼彈狀病毒蛋白的多核苷酸序列，所述彈狀病毒蛋白包括在基質(zhì)蛋白(M)內(nèi)的突變或缺失，插入編碼標(biāo)記多肽的多核苷酸序列及包含含有彈狀病毒復(fù)制的順式作用信號的至少3’和5’彈狀病毒前導(dǎo)和非轉(zhuǎn)錄尾區(qū)(trailerregion)的多順反子cDNA；(B)在選擇所述細(xì)胞的非致細(xì)胞病變表型的條件下培養(yǎng)細(xì)胞；(C)在允許重組彈狀病毒產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞；及(D)分離所述非致細(xì)胞病變的重組彈狀病毒。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種分離的核酸分子，其包含編碼非致細(xì)胞病變的彈狀病毒的基因組的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列在編碼基質(zhì)蛋白(M)的基因中具有突變或缺失。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種重組彈狀病毒，其包含彈狀病毒基因組的核酸，其中彈狀病毒基因組在編碼彈狀病毒糖蛋白(G)的近膜胞外域的區(qū)域內(nèi)包含缺失或突變。在另一個實(shí)施方案中，彈狀病毒基因組進(jìn)一步包含在基質(zhì)蛋白(M)中的突變或缺失。在一個實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的這個方面，彈狀病毒基因組進(jìn)一步包含插入編碼第二種多肽的異源核酸序列。在一個實(shí)施方案中，所述第二種多肽是治療性多肽。在其它實(shí)施方案中，所述第二種多肽是免疫原性的，是一種自殺基因或者是一種標(biāo)記多肽。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)重組彈狀病毒的方法，所述重組彈狀病毒包含編碼彈狀病毒蛋白的遺傳修飾的核酸，所述彈狀病毒蛋白包括在糖蛋白(G)的近膜胞外域內(nèi)的缺失或突變，所述方法包括如下步驟(A)在合適的細(xì)胞中插入編碼彈狀病毒蛋白的多核苷酸序列，所述彈狀病毒蛋白包括糖蛋白(G)的近膜胞外域內(nèi)的缺失或突變，插入編碼標(biāo)記多肽的多核苷酸序列及包含含有彈狀病毒復(fù)制的順式作用信號的至少3’和5’彈狀病毒前導(dǎo)和非轉(zhuǎn)錄尾區(qū)的多順反子cDNA；(B)在允許重組彈狀病毒產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)細(xì)胞；及(C)分離所述重組彈狀病毒。根據(jù)本發(fā)明的這個方面，在一個實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括將編碼第二種多肽的異源核酸插入所述細(xì)胞的步驟。在其它的實(shí)施方案中，所述第二種多肽是治療性多肽，或者是免疫原性的。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種分離的核酸分子，其包含編碼彈狀病毒基因組的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列在編碼糖蛋白(G)的近膜胞外域的基因中具有缺失或突變。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療患有與缺陷的基因相關(guān)的疾病的個體的方法，所述方法包括將所述個體的靶細(xì)胞與治療有效量的重組非致細(xì)胞病變的彈狀病毒接觸的步驟，其中所述彈狀病毒的基因組包括在編碼基質(zhì)蛋白(M)的區(qū)域內(nèi)的突變或缺失和/或糖蛋白(G)的近膜胞外域中的突變或缺失及能在靶細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的異源基因，從而治療疾病。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種使免疫個體抗一種疾病的方法，所述方法包括將所述個體的靶細(xì)胞與治療有效量的重組病毒接觸的步驟，其中所述病毒包含彈狀病毒基因或其片段，所述彈狀病毒基因組或其片段包括在編碼基質(zhì)蛋白(M)的區(qū)域內(nèi)的缺失或突變和/或在糖蛋白(G)的近膜胞外域中的缺失或突變及編碼能在靶細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的免疫原性蛋白質(zhì)或肽片段的異源基因，從而使得對疾病免疫。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種癌細(xì)胞裂解的方法，包括將癌細(xì)胞與重組彈狀病毒接觸的步驟，其中所述彈狀病毒包含(a)包含彈狀病毒基因組或其片段的核酸，其中所述彈狀病毒基因組或其片段包含在編碼基質(zhì)蛋白(M)的區(qū)域內(nèi)的缺失或突變和/或在編碼彈狀病毒糖蛋白(G)的近膜胞外域的區(qū)域內(nèi)的缺失或突變；及(b)非彈狀病毒核酸。在其它實(shí)施方案中，所述非彈狀病毒核酸編碼細(xì)胞因子或自殺基因。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種治療癌癥的方法，包括將癌細(xì)胞與重組病毒接觸的步驟，其中所述病毒包含(a)包含彈狀病毒基因組或其片段的核酸，所述彈狀病毒基因組或其片段包含在編碼基質(zhì)蛋白(M)的區(qū)域內(nèi)的缺失或突變和/或編碼糖蛋白(G)的近膜胞外域的區(qū)域內(nèi)的缺失或突變；及(b)非彈狀病毒核酸。在其它實(shí)施方案中，所述非彈狀病毒核酸編碼細(xì)胞因子或自殺基因。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種鑒別具有腫瘤消解活性的試劑的方法，包括如下步驟獲得冠(corona)、黑質(zhì)和皮層組織的旋轉(zhuǎn)振動(vibrotome)切片，在保持存活力和抑制有絲分裂的條件下在蓋玻片上培養(yǎng)所述切片，用標(biāo)記的癌細(xì)胞接種所述切片培養(yǎng)物，將所述接種的培養(yǎng)物與一種候選試劑培養(yǎng)，確定癌細(xì)胞存活力，其中癌細(xì)胞存活力降低表明該候選試劑是腫瘤消解的，從而鑒別具有腫瘤消解活性的試劑。在一個實(shí)施方案中，癌細(xì)胞是神經(jīng)元來源的。在另一個實(shí)施方案中，癌細(xì)胞是用熒光的、發(fā)光的、生色或電子致密材料(electrondensematerial)標(biāo)記的。在另一個實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括用標(biāo)記的重組彈狀病毒接種所述切片，和/或?qū)⒔臃N的切片培養(yǎng)物與細(xì)胞因子培養(yǎng)的步驟。附圖簡述圖1是用于分離非致細(xì)胞病變的VSV突變體的方法的示意圖。圖2A-D示出用野生型(wt)VSV感染的細(xì)胞的相差圖像(A)；VSV的溫度敏感性突變體(tsO82)，其在M基因中含有突變(B)；用于選擇NCP突變體的M33；51A重組病毒(C)；及噬斑純化的NCP變體之一(NCP-12)(D)。圖2a-d示出用野生型(wt)VSV感染的細(xì)胞的相差圖像(A)；VSV的溫度敏感性突變體(tsO82)，其在M基因中含有突變(B)；用于選擇NCP突變體的M33；51A重組病毒(C)；及噬斑純化的NCP變體之一(NCP-12)(D)。注意NCP-12感染的細(xì)胞已經(jīng)生長鋪滿并具有不能與未感染的BHK細(xì)胞區(qū)別的形態(tài)學(xué)(未示出)。圖3是用于克隆和測序NCP突變體之一(NCP-12)的方法的示意圖。圖4是用于回收編碼NCP變體的重組病毒的示意圖。圖5A-E示出wt-VSV(A-B)和rVSV/MNCP12.1(C-E)突變體感染的BHK-21細(xì)胞的免疫熒光和相差圖像。圖5E是細(xì)胞單層的放大圖。圖6示出來自真核表達(dá)載體的MNCP12.1突變體蛋白的表達(dá)水平分析。將BHK-21細(xì)胞用2μg的pCAGGS-Mwt(左側(cè))，pCAGGS-NCP-12.1(中間兩組)，或pCAGGS-MCS質(zhì)粒(右側(cè))瞬時轉(zhuǎn)染。使用M特異性單克隆抗體(23H12)和羅丹明綴合的山羊抗小鼠二級抗體分析。圖7A-H示出由rVSV/MNCP12.1感染的不同類型細(xì)胞的相差(A-D)和熒光(E-H)分析。圖8是用于回收缺少M(fèi)蛋白的原型VSV基因輸送/基因治療載體的方法的示意圖。圖9示出回收和傳代rVSV-ΔM(VSV復(fù)制子)的方法和分析使用N特異性單克隆抗體和羅丹明綴合的山羊抗小鼠二級抗體進(jìn)行分析。圖10示出用缺失M蛋白及缺失G和M蛋白的VSV在MOI為5的情況下感染胰島細(xì)胞樣品176的熒光(上部)和相差(下部)圖像。圖11示出用缺失M蛋白及缺失G和M蛋白的VSV在MOI為5的情況下感染胰島細(xì)胞樣品163的熒光(上部)和相差(下部)圖像。圖12示出用MOI為25感染胰島細(xì)胞樣品176，在感染后3天的熒光(上部)和相差(下部)圖像。圖13示出用MOI為25感染胰島細(xì)胞樣品163，在感染后3天的熒光(上部)和相差(下部)顯微圖像。圖14示出用MOI為5感染胰島細(xì)胞樣品176，在感染后8天的熒光(上部)和相差(下部)顯微圖像。圖15示出用MOI為25感染胰島細(xì)胞樣品176，在感染后8的熒光(上部)和相差(下部)圖像。圖16示出用MOI為5感染胰島細(xì)胞樣品163，在感染后8天的熒光(上部)和相差(下部)顯微圖像。圖17示出用MOI為25感染胰島細(xì)胞樣品163，在感染后8天的熒光(上部)和相差(下部)顯微圖像。圖18示出用MOI為5或25感染胰島細(xì)胞樣品176在感染后3天的熒光分析(分別為上部和下部)。圖19示出用MOI為5或25感染胰島細(xì)胞樣品163在感染后3天的熒光分析(分別為上部和下部)。圖20示出水泡性病毒糖蛋白的近膜結(jié)構(gòu)域的序列對比。所示序列來自VSVIndiana的SanJuan(37)和Orsay毒株(19)，VSVNewJersey(18)，Cocal病毒(2)，Chandipura病毒(28)，Piry病毒(4)及鯉魚病毒的春季病毒血癥病毒(SVCV)(3)。淡灰色背景中的黑色字體殘基在所有水泡性病毒中是保守的。黑色背景中的白色字體殘基是在測試的病毒序列中相同的殘基。深灰色背景中的黑色字體殘基表示具有相似性質(zhì)的殘基。在序列底部的星號表示在測試的序列中不變的殘基。圖21是VSVG的近膜“主干(stem)”區(qū)域中突變的示意圖。在上部示出了具有分界的胞外域、近膜G-主干(GS)區(qū)域、跨膜(TM)和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的全長G蛋白的線性圖。還示出了42個氨基酸的主干區(qū)域的序列。在序列的開始和末端的數(shù)字表示VSVGIND(SanJuan毒株)的N末端氨基酸殘基的位置。氨基酸K462是TM結(jié)構(gòu)域和胞外域之間的界限。示出了保守的色氨酸(W)殘基(第457和461位)，谷氨酸(E452)，甘氨酸(G456)和苯丙氨酸(F458)中的突變。還示出了插入、缺失和反向序列突變體的序列。蛋白質(zhì)G(AXB)在胞外域TM結(jié)合處導(dǎo)入兩個額外的絲氨酸。圖22表明了突變的蛋白質(zhì)的表達(dá)和穩(wěn)定性。將COS-1細(xì)胞用編碼指定的G蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，將該蛋白質(zhì)用[35S]-甲硫氨酸標(biāo)記然后用多克隆抗G抗體免疫沉淀隨后通過SDS-PAGE分析。(A)取代突變體和野生型G蛋白(WT-G)。(B)缺失和插入突變體。泳道標(biāo)記的VSV是從用野生型VSV感染的細(xì)胞中免疫沉淀的蛋白質(zhì)并用[35S]-甲硫氨酸標(biāo)記。標(biāo)示了G和N蛋白的位置。圖23示出野生型和突變體G蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)動力學(xué)。將表達(dá)野生型G或突變體蛋白的BHK-21細(xì)胞用35S-甲硫氨酸標(biāo)記15分鐘。除去培養(yǎng)基并加入含有過量的未標(biāo)記的甲硫氨酸的培養(yǎng)基0，10，30或60分鐘。將G蛋白使用抗G尾肽抗體從細(xì)胞裂解物中免疫沉淀出。將一半免疫沉淀物用內(nèi)切糖苷酶H消化。將蛋白質(zhì)在10％SDS-PAGE凝膠上解離并通過熒光自顯影觀測。蛋白質(zhì)的EndoH抗性和敏感性形式的量使用ImageQuant軟件(MolecularDynamics，Co)量化。(A)檢測野生型(WT)；GΔ13和Gsrev11的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。(B)對比WT，G10DAF，ΔF440-N449和GΔ9-10DAF的單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖24示出WT和突變體病毒感染的細(xì)胞合胞體形成。將大約5×105個BHK-21細(xì)胞在感染復(fù)數(shù)為10在37℃感染1小時。在感染后6小時，將細(xì)胞用緩沖為pH5.9、5.5或5.2的融合培養(yǎng)基在室溫處理1分鐘。將培養(yǎng)基用DMEM+5％FBS替換并將培養(yǎng)物在37℃保溫20分鐘至1小時。然后將細(xì)胞固定并加工以使用G-特異性mAb(I1)進(jìn)行間接免疫熒光檢驗(yàn)。羅丹明綴合的山羊抗小鼠抗體用作二級Ab。使用具有10倍可浸入水中的陶瓷物鏡的ZeissAxiophot顯微鏡上裝配的ZeissAxiocam數(shù)字化捕捉熒光和相差圖像。然后將圖像使用AdobePhotoshop處理以調(diào)節(jié)亮度和相差。(A)在用緩沖為pH5.9的融合培養(yǎng)基處理后，用rVSV-wt，-GΔ9，-GΔ13和-GΔ9-10DAF感染的細(xì)胞中誘導(dǎo)的合胞體形成。箭頭指向突變體感染的細(xì)胞中的小合胞體。(B)在pH5.2處理后，用rVSV-ΔF440-N449，-G10DAF和-G(+9)gBG感染的細(xì)胞。圖25示出WT和突變體病毒感染性。將BHK-21細(xì)胞用WT或G補(bǔ)足的突變體病毒在感染復(fù)數(shù)10感染1小時，然后將細(xì)胞用生長培養(yǎng)基洗3次。在感染后16小時，取等份上清并使用噬斑分析在BHK-21細(xì)胞上測定病毒效價。感染后36小時，計(jì)數(shù)噬斑數(shù)目并在至少兩個稀釋液之間取平均值以確定效價。示出的病毒效價是至少三個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。圖26示出在病毒體中摻入WT和突變體G蛋白。將BHK-21細(xì)胞用編碼野生型或突變體蛋白的病毒在感染復(fù)數(shù)10進(jìn)行感染，如圖5所述。感染16小時后，釋放入上清中的病毒通過20％蔗糖墊(sucrosecushion)粒狀沉淀。將病毒沉淀重懸于樣品緩沖液中，并將1/5的病毒沉淀通過SDS-PAGE解離。蛋白質(zhì)通過用考馬斯藍(lán)染色而觀測。凝膠的數(shù)字圖像使用具有35-80mm的Nikkor鏡頭的Nikon照相機(jī)獲得。蛋白質(zhì)量通過光密度測定法使用ImageQuant軟件(MolecularDynamics，Co.)確定。摻入病毒體中的G蛋白的相對量通過計(jì)算G蛋白與N蛋白的比率而確定。結(jié)果以相對于在野生型VSV對照中發(fā)現(xiàn)的G∶N比率的百分比表示。圖27示出WT和突變體病毒結(jié)合。將放射標(biāo)記的病毒體(～80,000cpm)重懸于緩沖為pH7.0或5.9的結(jié)合培養(yǎng)基中并在室溫保溫30分鐘。然后將懸浮液在冰上冷卻10分鐘，隨后加入預(yù)冷的鋪滿單層的BHK-21細(xì)胞中。在冰上進(jìn)行病毒結(jié)合3小時。除去培養(yǎng)基并確定放射性量。這表示未結(jié)合的病毒級分。然后將細(xì)胞用冰冷的結(jié)合緩沖液在與結(jié)合相同的pH下洗滌3次，收集洗滌物并量化。將細(xì)胞在含有1％TX-100的PBS中裂解，并確定裂解物(結(jié)合的級分)中放射性量。病毒結(jié)合以結(jié)合的病毒與全部病毒的百分比表示。圖28示出表達(dá)IL-12融合蛋白的重組復(fù)制受限的VSV的構(gòu)建。生物活性的小鼠IL-12融合構(gòu)建體通過除去p40亞基的終止密碼子，除去p35亞基上前22個密碼子，并插入編碼Gly-Ser接頭區(qū)域的序列而產(chǎn)生，如A圖所示。VSVΔG-IL12F的重組反基因組的示意圖示于B圖。所述反基因組編碼VSV的核殼(N)，聚合酶(P和L)和基質(zhì)(M)蛋白。另外，代替編碼包膜糖蛋白(G)，完整的G編碼區(qū)已經(jīng)除去并用多克隆位點(diǎn)(MCS)替代。將編碼IL-12融合構(gòu)建體的cDNA插入這個MCS中。為生產(chǎn)精確的VSV反基因組RNA的3’末端，將來自丁型肝炎病毒的核酶(RBZ)置入緊鄰VSV尾部之后。這個反基因組RNA從pBluescript背景中表達(dá)，其轉(zhuǎn)錄由T7啟動子驅(qū)動。圖29示出在VSVΔG-IL12F感染的細(xì)胞中vIL-12F的產(chǎn)生和分泌。將BHK-21細(xì)胞用VSVΔG-IL12F感染(MOI＝5)，并在無血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)17小時。收獲上清并將已經(jīng)與平板分開的BHK細(xì)胞通過低速離心除去(預(yù)澄清的上清)。病毒體通過在100,000×g經(jīng)過20％蔗糖墊沉淀而從預(yù)澄清的上清中除去(澄清的上清)。為評估vIL-12F的產(chǎn)生，將預(yù)澄清的和澄清的上清樣品以及沉淀的病毒體在10％凝膠上進(jìn)行SDS-PAGE。解離的蛋白質(zhì)通過考馬斯藍(lán)染色而觀測(A)。樣品組分如下泳道1)100μl預(yù)澄清的上清，泳道2)50μl澄清的上清，泳道3)100μl澄清的上清，及泳道4)從500μl上清中沉淀的病毒。并行地，將一種相似的凝膠移至硝酸纖維素上用IL-12-p40-特異性單克隆抗體制品進(jìn)行Western印跡(B)。樣品組分如下泳道1)100μl預(yù)澄清的上清，泳道2)100μl澄清的上清，及泳道3)從500μl上清中沉淀的病毒。標(biāo)示了每個病毒表達(dá)的蛋白質(zhì)的相同性。圖30示出抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答利斯特菌屬(listerial)抗原的vIL-12F增強(qiáng)作用。將C3HeB/FeJ小鼠(5只/組)在第0、5和15天用PBS(運(yùn)載體)，LMAg(109HKLM+8μg可溶的利斯特菌屬蛋白)+PBS，LMAg+0.5μgrIL-12，LMAg+0.5μgvIL-12F或LMAg+5.0μgvIL-12F免疫。在第20天，處死小鼠并通過灌洗收集腹膜溢泌物細(xì)胞，集合并制備未貼壁于塑料的細(xì)胞群(PNA)。將PNA(1.5×106/ml)在體外用預(yù)先確定的最佳濃度的培養(yǎng)基(未刺激)，ConA(2μg/ml；多克隆刺激物)，HKLM(107/ml)或SLP(8μg/ml)再刺激(在37℃，24小時)。無細(xì)胞上清中IL-2(A)和IFN-□(B)以測定抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答而量化。所有分析均一式三份進(jìn)行，結(jié)果以平均值±SD表示。圖31示出當(dāng)共同給予利斯特菌屬抗原和vIL-12F時獨(dú)特固有細(xì)胞群的誘導(dǎo)。將C3HeB/FeJ小鼠(5只/組)在第0、5和15天用PBS(運(yùn)載體)，LMAg(109HKLM+8μg可溶的利斯特菌屬蛋白)+PBS，LMAg+0.5μgrIL-12，LMAg+0.5μgvIL-12F或LMAg+5.0μgvIL-12F免疫。在第20天，處死小鼠并通過灌洗收集腹膜溢泌物細(xì)胞，集合并制備未貼壁塑料的細(xì)胞群(PNA)。將PNA(5×105/ml)用指定的熒光染料綴合的抗體制品染色；也進(jìn)行用同種型對照抗體制品染色，以評估非特異性抗體結(jié)合。對每個樣品的淋巴細(xì)胞群(通過前向散射(forwardscatter)/側(cè)向散射(sidescatter)門控選擇)進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)。(A)將細(xì)胞用抗CD5PE和抗CD45R/B220FITC(或用大鼠IgG2aPE和大鼠IgG2aFITC作為同種型對照)雙染，并進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)分析。淋巴細(xì)胞群內(nèi)T細(xì)胞的出現(xiàn)次數(shù)針對每個測試組標(biāo)示。(B)將細(xì)胞用抗-CD3PE和抗-αβTCRFITC，抗-γδTCRFITC，抗-CD4FITC，或者抗-CD8FITC雙染并進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)分析。為定性TCR或CD4/CD8在CD3+細(xì)胞上的表達(dá)，將樣品在CD3+群上進(jìn)一步進(jìn)行門控。在淋巴細(xì)胞群內(nèi)指定細(xì)胞類型的出現(xiàn)頻率如下圖示示出(C)T細(xì)胞，常規(guī)B細(xì)胞，及B1B細(xì)胞，(D)CD3+細(xì)胞。在CD3+群內(nèi)αβ和γδTCR表達(dá)(E)以及CD4和CD8表達(dá)(F)的頻率也以圖示示出。圖32示出在共同給予利斯特菌屬抗原和vIL-12F后，保護(hù)性利斯特菌屬免疫性的激發(fā)。將C3HeB/FeJ小鼠(5只/組)在第0、5和15天用PBS(運(yùn)載體)，LMAg(109HKLM+8μg可溶的利斯特菌屬蛋白)+PBS，5.0μgvIL-12F+PBS，LMAg+0.5μgvIL-12F或者LMAg+5.0μgvIL-12P免疫。將5只小鼠的另外一組在第0天經(jīng)i.p.接種次致死劑量的存活的利斯特菌屬(6×103/小鼠或0.12×LD50)。在第45天，每只小鼠均接受(i.p.)攻擊劑量的存活的利斯特菌屬(6.4×105或者12.9×LD50)。4天后處死小鼠(第49天)，并定量每只小鼠的脾(A)和肝(B)中荷載的細(xì)菌。圖33示出用利斯特菌屬抗原和IL-12F免疫授予的長期活性的保護(hù)性免疫性。將C3HeB/FeJ小鼠(5只/組)在第0，5和15天用PBS(運(yùn)載體)，5.0μgvIL-12F+PBS，LMAg(109HKLM+8μg可溶的利斯特菌屬蛋白)+PBS或者LMAg+5.0μgvIL-12F免疫。將5只小鼠的另外一組在第0天經(jīng)i.p.接種次致死劑量的存活的利斯特菌屬(6×103/小鼠或0.12×LD50)。在第120天，每只小鼠接受(i.p.)攻擊劑量的存活的利斯特菌屬(3.8×105或7.6×LD50)。4天后(第124天)處死小鼠，并定量每只小鼠的脾(A)和肝(B)中荷載的細(xì)菌。圖34示出C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤的VSV-wt感染。將生長于6孔板中的C6-GFP細(xì)胞用105pfu的rVSV-DsRed感染。示出了在(A)時間0點(diǎn)，(B)感染后10小時，(C)感染后24小時及(D)感染后48小時的細(xì)胞的相差圖像。圖像使用安裝在具有10倍物鏡的ZeissAxioskop顯微鏡上的ZeissAxiocam數(shù)碼相機(jī)收集。圖35示出rVSV-DsRed對C6-GFP神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的胞毒性。將C6-GFP神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞以90％鋪滿鋪板于96孔平板中，并用10、1,000或10,000pfu的rVSV-DsRed感染。使用CellTiterMTS分析監(jiān)測培養(yǎng)物的細(xì)胞存活力，直至96小時。不論使用的病毒劑量如何，在感染后30小時，細(xì)胞存活力降低到50％，在感染后72小時，檢測到很低的代謝活性至無代謝活性。圖36示出大鼠器官型腦切片培養(yǎng)物和腦切片-C6-GFP神經(jīng)膠質(zhì)瘤共培養(yǎng)物。培養(yǎng)物使用大鼠腦的三部分(黑質(zhì)，紋狀體和皮質(zhì))確定，如(A)所示。培養(yǎng)2周后切片的TH和MAP-2免疫反應(yīng)性分別示于B和C。(D)示出了使用熒光顯微鏡的C6-GFP細(xì)胞的低倍(4×)顯微照片，(E)示出了高倍(40×)細(xì)胞圖像。圖37示出了在經(jīng)過3天保溫期后，正常的和切片-神經(jīng)膠質(zhì)瘤共培養(yǎng)物的rVSV-DsRed感染。(A)在用104pfu的rVSV-DsRed接種后正常切片組織的感染。(B)在與IFN-β預(yù)保溫切片培養(yǎng)物后用104pfu的rVSV-DsRed對正常切片組織的感染。(C)在與IFN-β預(yù)保溫切片-神經(jīng)膠質(zhì)瘤共培養(yǎng)物之后用104pfurVSV-DsRed接種對C6-GFP神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的破壞。(D)在與IFN-β預(yù)保溫切片-神經(jīng)膠質(zhì)瘤共培養(yǎng)物之后用104pfu的rVSV-DsRed接種，在切片組織中觀測到的紅色熒光(例如rVSV-DsRed感染)。這些數(shù)據(jù)表明正常切片組織的野生型VSV感染明顯由IFN-β阻斷，rVSV-DsRed能有效破壞切片培養(yǎng)物中生長的C6-GFP神經(jīng)膠質(zhì)瘤。圖38示出在感染后3天用rVSV-DsRed接種的切片的MAP-2免疫反應(yīng)性。(A)在用rVSV-DsRed感染3天后正常切片培養(yǎng)物的MAP-2免疫反應(yīng)性。(B)在與1,000U的IFN-β保溫后24小時用rVSV-DsRed接種染后3天，正常切片培養(yǎng)物的MAP-2免疫反應(yīng)性。(C)在用IFN-β預(yù)處理后用rVSV-DsRed感染后，切片-神經(jīng)膠質(zhì)瘤共培養(yǎng)物的MAP-2免疫反應(yīng)性。紅色染色鑒別感染的細(xì)胞，綠色染色鑒別C6-GFP細(xì)胞，藍(lán)色代表MAP-2染色。(D)在與IFN-β保溫3天后正常切片培養(yǎng)物的MAP-2免疫反應(yīng)性。這些數(shù)據(jù)表明與IFN-β預(yù)保溫可降低單獨(dú)使用rVSV-DsRed可見的毒性作用，但在切片-神經(jīng)膠質(zhì)瘤共培養(yǎng)物中則否。這些數(shù)據(jù)還示出單獨(dú)的IFN-β對切片組織不表現(xiàn)出直接毒性。圖39示出在3天的保溫期之后，正常的和切片-神經(jīng)膠質(zhì)瘤共培養(yǎng)物的rVSV-ΔG感染。(A)在用106感染單位的感染性ΔG-DsRed接種后正常切片組織中病毒復(fù)制的時程，如通過Ds-Red的表達(dá)示出(例如紅色熒光)。(B)與IFN-β預(yù)保溫的切片培養(yǎng)物在用106感染單位的ΔG-DsRed接種后防止正常細(xì)胞的感染。(C)在用1000U的IFN-β預(yù)處理后，用106感染單位的ΔG-DsRed接種對C6-GFP神經(jīng)膠質(zhì)瘤的破壞。(D)用IFN-β預(yù)處理切片-神經(jīng)膠質(zhì)瘤共培養(yǎng)物在用106感染單位的ΔG-DsRed接種后防止正常細(xì)胞感染。這些數(shù)據(jù)表明正常切片組織的ΔG-DsRed感染明顯由IFN-β阻斷，ΔG-DsRed可有效破壞在切片培養(yǎng)物中生長的C6-GFP神經(jīng)膠質(zhì)瘤。圖40示出在用ΔG-DsRed接種后，正常切片培養(yǎng)物和切片-神經(jīng)膠質(zhì)瘤共培養(yǎng)物的MAP-2免疫反應(yīng)性。(A)在用ΔG-DsRed接種3天后，正常切片培養(yǎng)物的MAP-2免疫反應(yīng)性。(B)在用1,000UIFN-β預(yù)處理后用ΔG-DsRed接種后正常切片培養(yǎng)物的MAP-2免疫反應(yīng)性。(C)在用IFN-β預(yù)處理后用ΔG-DsRed接種后，切片-神經(jīng)膠質(zhì)瘤共培養(yǎng)物的MAP-2免疫反應(yīng)性。這些數(shù)據(jù)表明VSV-ΔG比VSV-wt的毒性低，而且VSV-ΔG的整體毒性通過與IFN-β預(yù)保溫而降低。圖41示出體內(nèi)大鼠腦腫瘤模型的顯微照片。將大鼠注射C6-GFP腫瘤細(xì)胞并在兩周后處死。A.對冷凍的大鼠腦冠狀切片進(jìn)行H&E染色表明在右半球中有中央壞死的大腫瘤。B.使用熒光顯微鏡觀測GFP表達(dá)的相鄰切片，分別在4×(C)和10×(D)觀測的GFP熒光腫瘤細(xì)胞。圖42示出取自體內(nèi)大鼠C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤的中央(A)和周圍(B)的冷凍切片的ITGA-3(611045，BDTransductionLaboratories)免疫反應(yīng)性的顯微照片。將GFPC6細(xì)胞用紅色的神經(jīng)膠質(zhì)瘤標(biāo)記ITGA-3復(fù)染。如期望的，使用熒光聚焦顯微鏡示出腫瘤細(xì)胞是免疫反應(yīng)性的(分別在10×，40×)。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了重組病毒，重組彈狀病毒科病毒，包含其的載體和組合物。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的彈狀病毒核酸序列包含被突變或部分缺失的基質(zhì)蛋白(M)和/或糖蛋白(G)，并因此可用于生產(chǎn)基于彈狀病毒的基因治療載體，疫苗和/或抗癌治療。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了重組彈狀病毒科病毒，載體和組合物的生產(chǎn)和治療應(yīng)用的方法。在一個實(shí)施方案中，重組彈狀病毒科病毒提供了一種非常通用的外源基因輸送的方式，因?yàn)樗鼈兏腥救梭w內(nèi)的許多不同類型的細(xì)胞。在另一個實(shí)施方案中，對其操縱以表達(dá)異源蛋白質(zhì)提供了將外源基因輸送至廣泛細(xì)胞類型的系統(tǒng)，這是在用于基因輸送的許多先前的具有更狹窄的細(xì)胞向性的載體中缺少的一種應(yīng)用。重組彈狀病毒科病毒的先前的應(yīng)用導(dǎo)致致細(xì)胞病變作用同時由于彈狀病毒感染的副產(chǎn)物一細(xì)胞蛋白合成的降低而具有最小的外源蛋白表達(dá)。然而在本發(fā)明中，在一個實(shí)施方案中，M蛋白突變或缺失的重組彈狀病毒科病毒感染細(xì)胞，但不是致細(xì)胞病變的(實(shí)施例1)。異源蛋白質(zhì)表達(dá)易于實(shí)現(xiàn)，同時突變的病毒中蛋白質(zhì)表達(dá)增強(qiáng)。M蛋白的突變不改變細(xì)胞向性，因此感染多重的細(xì)胞類型(實(shí)施例2)，并易于回收(實(shí)施例3)。用突變的病毒感染胰島細(xì)胞導(dǎo)致高水平的外源基因表達(dá)，同時致細(xì)胞病變作用最小(實(shí)施例4)。另外，用缺失M和G糖蛋白的毒株感染導(dǎo)致高水平的感染和表達(dá)，甚至在培養(yǎng)8天后也如此。因此突變或缺失M蛋白同時有或無G蛋白突變或缺失的重組彈狀病毒科病毒提供了一種非致細(xì)胞病變的基因輸送/基因治療載體。在一個實(shí)施方案中，提供了一種包含彈狀病毒基因組核酸的重組彈狀病毒，其中所述彈狀病毒基因組在編碼基質(zhì)蛋白(M)的區(qū)域內(nèi)包含缺失或突變。根據(jù)本發(fā)明的這個方面，在一個實(shí)施方案中，重組彈狀病毒是非致細(xì)胞病變的。如本文所用，術(shù)語“重組彈狀病毒”和“重組彈狀病毒科病毒”是指遺傳工程化的以表達(dá)在彈狀病毒科病毒中不天然表達(dá)的蛋白質(zhì)的病毒。病毒以這種方式工程化因此產(chǎn)生隨后可被分離的“假型”或“嵌合”病毒。如本文所用，術(shù)語“非致細(xì)胞病變的彈狀病毒”是指彈狀病毒的非致細(xì)胞病變變體，其在病毒裝配中仍起作用但對感染的細(xì)胞無致細(xì)胞病變作用。如本文所用，術(shù)語“基質(zhì)蛋白(M)”是指在彈狀病毒基因組中編碼的蛋白質(zhì)?；|(zhì)蛋白位于膜包膜內(nèi)，也許與膜和核殼核心均相互作用。彈狀病毒的基質(zhì)蛋白在病毒的生活周期中起兩種關(guān)鍵作用。首先，其是病毒裝配及病毒顆粒從感染的細(xì)胞中釋放所必需的。其次，其負(fù)責(zé)抑制宿主細(xì)胞基因表達(dá)，這使得病毒可以利用所有宿主細(xì)胞翻譯機(jī)制合成病毒蛋白。M蛋白對宿主基因表達(dá)的抑制被認(rèn)為負(fù)責(zé)與彈狀病毒感染相關(guān)的嚴(yán)重和快速致細(xì)胞病變作用。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組非致細(xì)胞病變的彈狀病毒包含在基質(zhì)蛋白M中的一個突變或缺失。在另一個實(shí)施方案中，突變在編碼基質(zhì)蛋白N末端部分(half)的區(qū)域中，其可以包含編碼核定位信號(NLS)的區(qū)域。如本文所用，術(shù)語“核定位序列”或“NLS”是指一種肽或其衍生物，其指導(dǎo)與NLS相關(guān)的表達(dá)的肽、蛋白質(zhì)或分子的轉(zhuǎn)運(yùn)，跨過核膜從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核。在一個實(shí)施方案中，突變編碼代替例如在基質(zhì)蛋白(M)的第33或51位的甲硫氨酸殘基的丙氨酸殘基。在另一個實(shí)施方案中，突變編碼例如在第226位用甘氨酸殘基取代絲氨酸殘基。在另一個實(shí)施方案中，突變編碼例如在第133位用丙氨酸殘基取代蘇氨酸殘基。在另一個實(shí)施方案中，突變還可以包含在完整M蛋白編碼區(qū)內(nèi)的一個缺失。導(dǎo)致彈狀病毒科病毒的致細(xì)胞病變作用降低的M蛋白表達(dá)中的任何改變均被認(rèn)為是本發(fā)明的一部分。在另一個實(shí)施方案中，M蛋白突變體具有相應(yīng)于SEQIDNO1、2、3、4或5的氨基酸序列。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，重組非致細(xì)胞病變的彈狀病毒可進(jìn)一步包含在編碼糖蛋白(G)的區(qū)域內(nèi)的一個突變。由彈狀病毒科病毒編碼的糖蛋白(G)有助于病毒融合，病毒出芽過程的感染性和全部效力(WhittM.A.，(1998)TheJournalofMicrobiology361-8)。彈狀病毒G蛋白的片段，G主干多肽，參與膜融合。如本文所用，短語“G主干多肽”是指彈狀病毒G蛋白的片段，其包含一個42個氨基酸的近膜胞外域，一個跨膜錨結(jié)構(gòu)域和一個成熟G蛋白的胞質(zhì)尾結(jié)構(gòu)域。由于G糖蛋白參與膜融合，因此其在彈狀病毒感染中促進(jìn)細(xì)胞-細(xì)胞的播散。本發(fā)明示出G的近膜胞外域是膜融合所必需的(實(shí)施例6-7)。編碼G的近膜胞外域的區(qū)域的取代、缺失或插入突變不導(dǎo)致G表達(dá)降低(實(shí)施例5)。同時近膜區(qū)域中的突變無一影響全長G蛋白的穩(wěn)定性，寡聚化或轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面，該區(qū)域中的缺失導(dǎo)致極度抑制的融合，如同在膜錨結(jié)構(gòu)域的邊界和G蛋白之間插入9或10個氨基酸一樣。然而，在G的近膜胞外域取代特異性殘基不降低融合。只有在F440和N449之間的區(qū)域包括保守的FFGDTG基序的缺失才完全消除融合活性，示出這個亞結(jié)構(gòu)域?qū)的融合活性非常重要。融合伴隨著病毒生長，缺失突變體需要功能性G補(bǔ)足以促進(jìn)病毒生長(實(shí)施例8)。近膜胞外域氨基酸殘基的缺失，例如N449-K462，也導(dǎo)致感染性降低。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，提供了一種重組彈狀病毒，其包含彈狀病毒基因組的核酸，其中彈狀病毒基因組包含在編碼彈狀病毒糖蛋白(G)的近膜胞外域的區(qū)域內(nèi)的缺失或突變。在一個實(shí)施方案中，編碼彈狀病毒糖蛋白(G)的近膜胞外域區(qū)域中的突變編碼用丙氨酸殘基取代色氨酸殘基(SEQIDNO8、10、11、12、13或14)。在另一個實(shí)施方案中，突變編碼丙氨酸殘基取代谷氨酸(SEQIDNO6)，甘氨酸(SEQIDNO7)和/或苯丙氨酸殘基(SEQIDNO9)。在另一個實(shí)施方案中，突變編碼天冬氨酸和丙氨酸殘基取代谷氨酸，甘氨酸和/或苯丙氨酸殘基。在另一個實(shí)施方案中，突變是編碼在此列出的氨基酸置換的突變的任何組合。在另一個實(shí)施方案中，編碼彈狀病毒糖蛋白(G)的近膜胞外域的區(qū)域中的突變編碼該胞外域核苷酸的缺失。在一個實(shí)施方案中，突變是編碼彈狀病毒G糖蛋白的第449-461位氨基酸殘基(SEQIDNO20)或其片段的核苷酸的缺失。在另一個實(shí)施方案中，突變是編碼第440-449位氨基酸殘基(SEQIDNO16)或其片段的核苷酸的缺失。在另一個實(shí)施方案中，編碼彈狀病毒糖蛋白(G)的近膜胞外域的區(qū)域中的突變編碼在該胞外域中的插入核苷酸。在一個實(shí)施方案中，突變是插入編碼衰變促進(jìn)因子(decayaccelerationfactor，DAF)的第311-319位氨基酸殘基的核苷酸，所述衰變促進(jìn)因子插入在彈狀病毒糖蛋白近膜胞外域的絲氨酸殘基之間(SEQIDNO22)。在另一個實(shí)施方案中，彈狀病毒糖蛋白的近膜胞外域的編碼區(qū)中的突變導(dǎo)致具有相應(yīng)于SEQIDNO15、19、20或22的氨基酸序列的突變體。在另一個實(shí)施方案中，彈狀病毒基因組可進(jìn)一步包含在基質(zhì)蛋白(M)中的突變或缺失。應(yīng)理解在彈狀病毒G蛋白的近膜胞外域中的突變，如在彈狀病毒M蛋白中的一樣，可導(dǎo)致G近膜胞外域/M蛋白編碼區(qū)的部分缺失或完全缺失，這被認(rèn)為是本發(fā)明的一部分。相似地，G近膜胞外域/M蛋白編碼區(qū)內(nèi)的插入突變也是本發(fā)明的一部分。本發(fā)明也涵蓋了導(dǎo)致喪失彈狀病毒G近膜胞外域/M蛋白的功能或改變其表達(dá)的突變，并包含本發(fā)明的額外的實(shí)施方案。在一個實(shí)施方案中，盡管本發(fā)明提供了水泡性病毒和狂犬病毒屬的任何病毒的應(yīng)用，但本發(fā)明利用的重組彈狀病毒衍生自皰疹性口腔炎病毒(VSV)。水泡性病毒屬病毒包括皰疹性口腔炎病毒(VSV)NewJersey血清型(VSVNJ)，Indiana血清型(VSVInd)，VSV-Alagoas毒株，Cocal病毒，Jurona病毒，Carajas病毒，Maraba病毒，Piry病毒，Calchaquivirus，YugBogdanovac病毒，Isfahan病毒，Chandipura病毒，Perinet病毒和Porton-Svirus(RoseandWhitt.INB.N.FIELDS′VIROLOGY4thED.VOL.1(2001))?？袢《緦俨《景袢《?RV)，Lagosbat病毒，Mokola病毒，Duvenhagevirus，Obodhiang病毒和Kotonkan病毒(ID.)。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了如上述重組彈狀病毒科病毒，其進(jìn)一步包含編碼異源融合促進(jìn)多肽(fusion-facilitatingpolypeptide)的核酸序列。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，編碼融合促進(jìn)多肽的核酸序列可以從獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄單位中表達(dá)。如本文所用，術(shù)語“融合促進(jìn)多肽”是指在液胞膜的表面上表達(dá)后促進(jìn)液胞膜與包圍靶小泡或細(xì)胞的脂雙層融合的任何蛋白質(zhì)(或其融合促進(jìn)多肽片段)。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，融合促進(jìn)多肽是(1)衍生自特征在于具有脂質(zhì)包膜的病毒；及(2)當(dāng)在遺傳工程化的病毒中表達(dá)作異源蛋白質(zhì)時，促進(jìn)病毒包膜與細(xì)胞膜的融合，導(dǎo)致在參與膜之間的完整雙層融合。因此期望本發(fā)明的融合促進(jìn)多肽可以非特異性方式促進(jìn)除了天然病毒附著蛋白質(zhì)之外的病毒包膜上的附著蛋白質(zhì)的締合。如本發(fā)明所預(yù)期的，融合促進(jìn)多肽的一個實(shí)例是在文獻(xiàn)中已知是副粘病毒SV5毒株的“F蛋白”的病毒包膜融合蛋白，在本文其被特異性稱作“F蛋白”而不是更普通的“融合蛋白”。除了猿猴病毒5(SV5)-衍生的F蛋白之外，融合促進(jìn)多肽可選自HIV包膜蛋白，以及VSVGNJ(NewJersy血清型)或VSVGIND(Indiana血清型)蛋白。融合促進(jìn)多肽還包括與上述融合多肽呈現(xiàn)至少70％氨基酸序列同源性的多肽，以及在刺激靶細(xì)胞與重組彈狀病毒科病毒融合及表達(dá)本發(fā)明的核酸序列方面呈現(xiàn)顯著功能同源性的多肽。應(yīng)理解刺激膜融合的任何蛋白質(zhì)或其片段以及這些蛋白質(zhì)及其片段的同源物的用途均被認(rèn)為在本發(fā)明范圍內(nèi)，而且這些蛋白質(zhì)可以是原核或真核來源的。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的蛋白質(zhì)進(jìn)化技術(shù)衍生的蛋白質(zhì)和多肽在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在一個實(shí)施方案中，重組彈狀病毒科病毒可進(jìn)一步表達(dá)至少一個異源(即另一種非彈狀病毒)蛋白質(zhì)。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組彈狀病毒科病毒可進(jìn)一步包含一個調(diào)節(jié)元件。在一個實(shí)施方案中，基于其中表達(dá)基因產(chǎn)物的細(xì)胞類型，或者在另一個實(shí)施方案中，基于所需要的基因產(chǎn)物表達(dá)水平，在用本發(fā)明的重組彈狀病毒科病毒肝的細(xì)胞中選擇調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物表達(dá)的核苷酸序列(其在本文中稱作“調(diào)節(jié)元件”，例如啟動子和增強(qiáng)子序列)。根據(jù)本發(fā)明的這個方面，基因產(chǎn)物相應(yīng)于如本文所述的異源蛋白質(zhì)。在一個實(shí)施方案中因此可實(shí)現(xiàn)對這種異源蛋白質(zhì)的表達(dá)加以調(diào)節(jié)。例如，可以使用已知授予與該啟動子連接的基因的細(xì)胞類型特異性表達(dá)的啟動子。特異于成肌細(xì)胞基因表達(dá)的啟動子可以與授予基因產(chǎn)物肌特異性表達(dá)的感興趣基因連接。本領(lǐng)域已知的肌特異性調(diào)節(jié)元件包括來自如下基因的上游區(qū)域肌營養(yǎng)不良蛋白基因(Klamutetal.，(1989)Mol.CellBiol.92396)，肌酸激酶基因(BuskinandHauschka，(1989)Mol.CellBiol.92627)和肌鈣蛋白基因(MarandOrdahl，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.856404)。本領(lǐng)域已知特異于其它細(xì)胞類型的調(diào)節(jié)元件(例如針對肝特異性表達(dá)的白蛋白增強(qiáng)子；針對胰島細(xì)胞特異性表達(dá)的胰島素調(diào)節(jié)元件；多種神經(jīng)細(xì)胞特異性調(diào)節(jié)元件，包括神經(jīng)肌營養(yǎng)不良蛋白，神經(jīng)烯醇化酶和A4淀粉狀蛋白啟動子)。在另一個實(shí)施方案中，可以使用可指導(dǎo)基因在多種不同細(xì)胞類型中組成型表達(dá)的調(diào)節(jié)元件，如病毒調(diào)節(jié)元件。通常用于驅(qū)動基因表達(dá)的病毒啟動子的例子包括衍生自多形瘤病毒，腺病毒2，巨細(xì)胞病毒和猿猴病毒40及逆轉(zhuǎn)錄病毒LTRs的那些。在另一個實(shí)施方案中，可以使用提供了與其連接的基因可誘導(dǎo)表達(dá)的調(diào)節(jié)元件?？烧T導(dǎo)的調(diào)節(jié)元件(例如可誘導(dǎo)啟動子)的應(yīng)用使得可以調(diào)節(jié)細(xì)胞中基因產(chǎn)物的產(chǎn)生。用于真核細(xì)胞中的潛在的有效可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)系統(tǒng)的例子包括激素調(diào)節(jié)的元件(例如見Mader，S.andWhite，J.H.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA905603-5607)，合成的配體調(diào)節(jié)的元件(見例如，Spencer，D.M.etal1993)Science2621019-1024)和電離輻射調(diào)節(jié)的元件(例如見Manome，Y.Etal.(1993)Biochemistry3210607-10613；Datta，R.etal.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA891014-10153)?？梢越沂玖硗獾慕M織特異性或可誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)系統(tǒng)以根據(jù)本發(fā)明加以應(yīng)用。在一個實(shí)施方案中，異源蛋白質(zhì)可用作治療性蛋白質(zhì)。術(shù)語“治療性”是指異源蛋白質(zhì)當(dāng)在需要其的個體中表達(dá)時，其表達(dá)提供了一種有益作用。在一些情況中，蛋白質(zhì)是治療性的，其中其發(fā)揮代替這種蛋白質(zhì)在個體中缺乏表達(dá)或缺乏合適的表達(dá)的功能。一些實(shí)例包括其中該蛋白質(zhì)的表達(dá)不存在的情況，如在通過外源蛋白質(zhì)的表達(dá)補(bǔ)償內(nèi)源無效突變體的情況中。在其它實(shí)施方案中，內(nèi)源蛋白質(zhì)被突變，并產(chǎn)生一種非功能性蛋白質(zhì)，通過異源功能性蛋白的表達(dá)而補(bǔ)償。在其它實(shí)施方案中，將異源蛋白質(zhì)的表達(dá)加上低內(nèi)源水平，導(dǎo)致給定的蛋白質(zhì)的表達(dá)累加增強(qiáng)。在一個實(shí)施方案中，表達(dá)的治療性蛋白質(zhì)可包括細(xì)胞因子，如干擾素或白細(xì)胞介素，或其受體。細(xì)胞因子的表達(dá)缺乏與疾病的易感性相關(guān)，增強(qiáng)的表達(dá)可導(dǎo)致對許多感染的抗性。細(xì)胞因子的表達(dá)模式可以被改變以產(chǎn)生有益作用，如針對Th1類型表達(dá)模式，或者在感染或自身免疫疾病中Th2模式的免疫應(yīng)答偏差，其中改變的表達(dá)模式可為宿主提供益處。將缺失糖蛋白(G)的重組VSV工程化以表達(dá)和分泌單鏈IL-12F，其產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子(實(shí)施例9)。共同給予VSVΔG-IL-12F與利斯特菌屬抗原產(chǎn)生強(qiáng)力的利斯特菌屬特異性T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，授予與在用LMAg+rIL-12免疫的小鼠中觀測的結(jié)果相似的長期活性、保護(hù)性利斯特菌屬免疫性(實(shí)施例10和11)。在一個實(shí)施方案中，提供了一種缺失G糖蛋白的重組彈狀病毒，并工程化表達(dá)細(xì)胞因子。細(xì)胞因子可以是白細(xì)胞介素或干擾素或化學(xué)引誘物。在一個實(shí)施方案中，細(xì)胞因子是白細(xì)胞介素2，白細(xì)胞介素4，白細(xì)胞介素12或干擾素-γ。在另一個實(shí)施方案中，工程化表達(dá)細(xì)胞因子的重組彈狀病毒被突變或缺失基質(zhì)蛋白。在另一個實(shí)施方案中，工程化表達(dá)細(xì)胞因子的重組彈狀病毒被突變或缺失糖蛋白(G)的近膜胞外域。應(yīng)理解本發(fā)明的任何重組彈狀病毒可進(jìn)一步工程化表達(dá)細(xì)胞因子，這些被認(rèn)為是本發(fā)明的一部分。在另一個實(shí)施方案中，表達(dá)的治療性蛋白質(zhì)可包括酶，如參與糖原貯存或分解的酶。在另一個實(shí)施方案中，表達(dá)的治療性蛋白質(zhì)可包括轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，如離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白例如CFTR，或者葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，或者其缺陷或不適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)導(dǎo)致多種疾病的其它轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。在另一個實(shí)施方案中，表達(dá)的治療性蛋白質(zhì)可包括一種受體，如參與細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的受體。一些實(shí)例包括如上述細(xì)胞因子受體leptin受體，轉(zhuǎn)移受體等，或者在細(xì)胞中其表達(dá)缺乏或表達(dá)改變導(dǎo)致不適當(dāng)?shù)幕虿怀浞值男盘栟D(zhuǎn)導(dǎo)的任何受體。在另一個實(shí)施方案中，表達(dá)的治療性蛋白質(zhì)可包括一種腫瘤抑制基因或者原編程性細(xì)胞死亡(proapoptotic)基因，其表達(dá)改變胞內(nèi)癌癥相關(guān)事件的進(jìn)展。例如，p53可在細(xì)胞中表達(dá)，表明早期腫瘤轉(zhuǎn)化事件，從而抑制癌癥進(jìn)展。在另一個實(shí)施方案中，表達(dá)的治療性蛋白質(zhì)可選自天然或非天然的胰島素，淀粉酶，蛋白酶，脂肪酶，激酶，磷酸酶，糖基轉(zhuǎn)移酶，胰蛋白酶原，糜蛋白酶原，羧肽酶，激素，核糖核酸酶，脫氧核糖核酸酶，三酰甘油脂肪酶，磷脂酶A2，彈性蛋白酶，淀粉酶，凝血因子，UDP葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶，鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶，細(xì)胞色素p450酶，腺苷脫氨酶，血清胸腺因子，胸腺體液因子，胸腺生成素，生長素，生長調(diào)節(jié)素，共同刺激因子，抗體，集落刺激因子，紅細(xì)胞生成素，上皮生長因子，肝紅細(xì)胞生成因子(hepatopoietin)，肝細(xì)胞生長因子，白細(xì)胞介素，干擾素，反生長因子(negativegrowthfactors)，成纖維細(xì)胞生長因子，α家族的轉(zhuǎn)化生長因子，β家族的轉(zhuǎn)化生長因子，胃泌素，胰泌素，縮膽囊素，促生長素抑制素，5-羥色胺，P物質(zhì)和轉(zhuǎn)錄因子。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組彈狀病毒科病毒進(jìn)一步包含插入編碼標(biāo)記多肽的一個異源核酸序列。標(biāo)記多肽可包含例如綠色熒光蛋白(GFP)，DS-Red(紅色熒光蛋白)，分泌型堿性磷酸酶(SEAP)，β-半乳糖苷酶，螢光素酶，或者本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其它報(bào)道蛋白。將治療性蛋白質(zhì)特異靶向于特定的細(xì)胞是希望的。在另一個實(shí)施方案中，除了治療性蛋白質(zhì)的表達(dá)之外，一種靶蛋白質(zhì)被表達(dá)，由此本發(fā)明的重組彈狀病毒科病毒被定向于其中發(fā)生治療性蛋白質(zhì)表達(dá)的特異性位點(diǎn)。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組彈狀病毒科病毒靶向于腫瘤細(xì)胞，其表達(dá)例如表面標(biāo)記erbB。這種erbB+細(xì)胞反過來被稱作“靶細(xì)胞”，因?yàn)檫@些細(xì)胞是重組彈狀病毒科病毒最后與之融合的細(xì)胞群。靶細(xì)胞通常表達(dá)一個表面標(biāo)記(本文稱作“靶抗原”)，其可被用于將重組彈狀病毒科病毒定向于所述細(xì)胞，與相鄰細(xì)胞相反，其不是腫瘤細(xì)胞源的并因此不表達(dá)erbB。靶抗原可以是受體，因此“反受體(antireceptor)”也是指“附著蛋白質(zhì)”，意味著如上述在重組彈狀病毒包膜或者細(xì)胞表面上展示的蛋白質(zhì)，負(fù)責(zé)病毒顆粒/修飾的細(xì)胞附著于其在靶細(xì)胞膜上的相應(yīng)“受體”。例如，副粘病毒SV5的天然反受體是病毒HN蛋白，其結(jié)合宿主細(xì)胞膜上的唾液酸。因此實(shí)現(xiàn)的融合是通過病毒包膜上的附著蛋白質(zhì)(或反受體)與細(xì)胞膜上相關(guān)受體的結(jié)合而介導(dǎo)的。如本文所用，術(shù)語“附著”是指在感染期間反受體(在病毒顆粒脂質(zhì)包膜或工程化細(xì)胞表面表達(dá))識別并結(jié)合靶細(xì)胞表面“受體”的作用。本領(lǐng)域技術(shù)人員意識到附著在附著膜與靶細(xì)胞質(zhì)膜融合之前發(fā)生。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組彈狀病毒科病毒表達(dá)反受體，其通過反受體與在感染的細(xì)胞表面表達(dá)的病毒蛋白質(zhì)結(jié)合而將重組物定向于病毒感染的細(xì)胞。在這種情況中，促進(jìn)重組彈狀病毒科病毒與病毒感染的細(xì)胞融合的反受體將識別并結(jié)合病毒表達(dá)的表面蛋白。例如，HIV-1感染的細(xì)胞可表達(dá)HIV-相關(guān)蛋白質(zhì)，如gp120，并因此重組彈狀病毒科病毒表達(dá)CD4通過CD4-gp120相互作用而促進(jìn)靶向于HIV感染的細(xì)胞。反受體蛋白質(zhì)或其多肽片段可以設(shè)計(jì)成增強(qiáng)與如下病毒家族的成員感染的細(xì)胞融合沙粒病毒科病毒，布尼亞病毒科病毒(Bunyaviridae)，冠形病毒科病毒，線狀病毒科病毒，黃病毒科病毒，皰疹病毒科病毒，嗜肝DNA病毒科病毒，正粘病毒科病毒，副粘病毒科病毒，痘病毒科病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒科病毒和彈狀病毒科病毒。另外的病毒靶向試劑可衍生自如下非洲豬熱病病毒，Borna病病毒，X肝炎病毒，HIV-1，I型人T淋巴細(xì)胞病毒(HTLV-1)，HTLV-2，15慢病毒，Epstein-Barr病毒，乳頭瘤病毒，單純皰疹病毒，乙型肝炎和丙型肝炎病毒。在另一個實(shí)施方案中，靶向病毒感染的細(xì)胞可以通過重組彈狀病毒科病毒/重組病毒包膜上病毒共同受體的額外表達(dá)以增強(qiáng)與感染的細(xì)胞的融合促進(jìn)而實(shí)現(xiàn)。在一個實(shí)施方案中，將重組彈狀病毒科病毒/重組病毒工程化以進(jìn)一步表達(dá)HIV共同受體，如CXCR4或CCR5。在胞內(nèi)感染期間表達(dá)的細(xì)菌蛋白質(zhì)預(yù)期也是通過本發(fā)明的重組彈狀病毒科病毒/重組病毒而進(jìn)行治療性干涉的潛在靶位。所述胞內(nèi)細(xì)菌可包括志賀氏菌(Shigella)，沙門氏菌(Salmonella)，軍團(tuán)菌(Legionella)，鏈球菌(Streptococci)，分枝桿菌(Mycobacteria)，弗朗西絲氏菌(Francisella)和衣原體(Chlamydiae)(見G.L.Mandell，″IntroductiontoBacterialDisease″INCECILTEXTBOOKOFMEDICINE，(W.B.SaundersCo.，1996)1556-7)。這些細(xì)菌期望在重組彈狀病毒科病毒/重組病毒附著的感染細(xì)胞的表面上表達(dá)細(xì)菌相關(guān)的蛋白質(zhì)。在另一個實(shí)施方案中，所述靶向部分可包括整聯(lián)蛋白或MHC的II型分子，其可以在感染的細(xì)胞如專門的抗原呈遞細(xì)胞上被上調(diào)。存在于細(xì)胞內(nèi)的寄生物的蛋白質(zhì)也預(yù)期是所述重組彈狀病毒科病毒/重組病毒感染的靶位。預(yù)期的胞內(nèi)寄生物包括例如原生動物。感染細(xì)胞的原生動物包括瘧原蟲(Plasmodium)屬的寄生物(例如惡性瘧原蟲(Plasmodiumfalciparum)，間日瘧原蟲(P.Vivax)，卵型瘧原蟲(P.ovale)和三日瘧原蟲(P.malariae))，錐蟲(Trypanosoma)，弓形蟲(Toxoplasma)，利什曼原蟲(Leishmania)和隱孢子蟲(Cryptosporidium)。發(fā)生病變的和/或異常的細(xì)胞可通過上述方法使用本發(fā)明的重組彈狀病毒科病毒靶向。預(yù)期的發(fā)生病變的或異常的細(xì)胞包括感染的細(xì)胞，贅生性細(xì)胞，前贅生性細(xì)胞，炎癥病灶，良性腫瘤或息肉，褐斑(cafeaulaitspots)，粘膜白斑病或其它皮膚痣。本發(fā)明的重組彈狀病毒科病毒可以使用反受體靶向，其將識別并結(jié)合其在病變的或異常細(xì)胞上表達(dá)的相關(guān)受體或配體。在另一個實(shí)施方案中，作為結(jié)果，病變的和/或異常細(xì)胞可以獨(dú)特地易受重組彈狀病毒侵入和細(xì)胞裂解的影響。在一個實(shí)施方案中，非致細(xì)胞病變的重組彈狀病毒科病毒只單獨(dú)對病變的和/或異常細(xì)胞是致細(xì)胞病變的。在一個實(shí)施方案中，將非致細(xì)胞病變的重組彈狀病毒科病毒進(jìn)一步工程化以表達(dá)一種異源蛋白質(zhì)。在一個實(shí)施方案中，異源蛋白質(zhì)可包含上述所有的實(shí)施方案。在另一個實(shí)施方案中，非致細(xì)胞病變的重組彈狀病毒科病毒可包含本文所示所有實(shí)施方案，包括進(jìn)一步弱化，如在彈狀病毒糖蛋白表達(dá)中摻入并發(fā)缺失或其片段，如G的近膜胞外域。相似地，可以通過本領(lǐng)域熟知的方法將細(xì)胞工程化以表達(dá)彈狀病毒基因組組分。在一個實(shí)施方案中，包含缺失的或突變的彈狀病毒M蛋白的核酸載體進(jìn)一步包含在G的近膜胞外域中的缺失，或者在另一個實(shí)施方案中進(jìn)一步缺失G。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組彈狀病毒科病毒可以工程化為表達(dá)一種抗體或其多肽片段，一種雙重功能抗體，F(xiàn)ab，F(xiàn)c，F(xiàn)v，或單鏈Fv(scFv)作為其附著蛋白質(zhì)?？梢詷?gòu)建這種抗體片段以鑒別和結(jié)合一種特異性受體。這些抗體可以是人源化的，人或嵌合抗體(討論和附加參考見S.L.Morrison″AntibodyMolecules，GeneticEngineeringof，″inMOLECULARBIOLOGYANDBIOTECHNOLOGYACOMPREHENSIVEDESKREFERENCE1995；S.D.Gilliesetal，(1990)Hum.Antibod.Hybridomas1(1)47-54；E.HARLOWANDD.LANE，ANTIBODIESALABORATORYMANUAL(1988)ColdSpringHarborPress，NY)。已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了使用痘苗病毒在病毒表面上表達(dá)功能性單鏈抗體(M.C.Galmicheetal，(1997)J.Gen.Virol.783019-3027)。利用相似的方法產(chǎn)生表達(dá)融合促進(jìn)蛋白和抗體或抗體片段的重組彈狀病毒。編碼定向例如在細(xì)胞表面表達(dá)的腫瘤相關(guān)抗原(TAA)(例如前列腺特異性抗原(PSA))的單克隆抗體的基因，可以分離并用于生產(chǎn)希望的重組彈狀病毒，或者亞克隆入一個合適的表達(dá)載體中并在細(xì)胞表面表達(dá)，通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法進(jìn)行?？贵w的實(shí)例包括與惡性前列腺上皮反應(yīng)但與良性前列腺組織不反應(yīng)的那些抗體(例如ATCCNo.HB-9119；ATCCHB-9120和ATCCNo.HB-11430)，或者與惡性乳腺癌細(xì)胞反應(yīng)但與正常乳腺組織不反應(yīng)的那些抗體(例如ATCCNo.HB-8691；ATCCNo.HB-10807和21HB-108011)。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知與病變組織反應(yīng)而與正常組織不反應(yīng)的其它抗體或其片段。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明預(yù)期的重組彈狀病毒科病毒可以表達(dá)至少一種免疫原性的蛋白質(zhì)。如本文所用，術(shù)語“免疫原性”是指激發(fā)免疫應(yīng)答的能力。本發(fā)明的重組彈狀病毒科病毒可以激發(fā)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，或者激發(fā)傳統(tǒng)上被稱為“體液免疫應(yīng)答”的抗體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，或者這兩者。在一個實(shí)施方案中，進(jìn)一步編碼免疫原性蛋白質(zhì)或肽的本發(fā)明的重組彈狀病毒可用于生產(chǎn)疫苗，作為預(yù)防感染的一個手段。重組彈狀病毒科病毒，VSV僅是一個實(shí)例，是作為疫苗載體的最有希望的候選物。VSV具有僅含有5個基因的一個簡單的基因組。隨著反向遺傳學(xué)(reversegenetics)的出現(xiàn)，有可能產(chǎn)生編碼異源抗原性蛋白質(zhì)以及免疫調(diào)節(jié)性蛋白質(zhì)的重組彈狀病毒科病毒。VSV基因組可以適應(yīng)相對大的插入而不影響病毒復(fù)制或裝配的能力。由于VSV的棒狀形態(tài)，因此核糖核殼核心和病毒顆粒自身是可伸展的。例如，在基因組中加入額外的基因，則顆?？珊啽愕丶娱L(18)。第三，插入VSV中的外源基因中突變的累積十分低，以允許在無數(shù)的病毒傳代后外源基因仍長期表達(dá)(19)。第四，由于VSV具有一個非片段化的負(fù)鏈RNA基因組，而且病毒的復(fù)制只在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)生并只涉及RNA中間物，因此病毒基因組不可能整合入宿主細(xì)胞DNA中。因此，消除了其它基于DNA的載體的插入誘變。另外，VSV可以有效地感染多種不同的細(xì)胞類型并具有在其正常復(fù)制周期期間有效停止宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的能力，同時表達(dá)大量的病毒編碼的蛋白質(zhì)(18-20)。在動物中，VSV感染示出激發(fā)特異于由重組病毒編碼的蛋白質(zhì)的強(qiáng)免疫應(yīng)答(21)。另外，在世界的大部分地區(qū)罕見VSV感染人(22)，因此現(xiàn)有的免疫性罕見干涉基于VSV的疫苗。非致細(xì)胞病變的彈狀病毒科病毒和細(xì)胞至細(xì)胞播散能力降低的彈狀病毒科病毒是用作疫苗輸送載體的非常有吸引力的候選物。例如后者的彈狀病毒科病毒產(chǎn)生從感染的細(xì)胞中釋放的子代病毒體，其不能再感染鄰近的細(xì)胞。包含彈狀病毒M蛋白和G蛋白或其片段和/或G的近膜胞外域中突變或缺失的本發(fā)明的重組彈狀病毒科病毒是弱化的病毒。因此摻入這樣突變或缺失的彈狀病毒科病毒例如提供了安全性因素增強(qiáng)的一種病毒載體，在一個實(shí)施方案中，其用于無免疫應(yīng)答的個體，用于利用所述載體作為基因輸送運(yùn)載體或疫苗的應(yīng)用中。在另一個實(shí)施方案中，進(jìn)一步編碼一種免疫原性蛋白質(zhì)或肽的本發(fā)明的重組彈狀病毒可用作治療劑，作為中斷疾病進(jìn)展或消除疾病嚴(yán)重性的手段。可以在本發(fā)明的構(gòu)建體中摻入額外的弱化分子。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組彈狀病毒科病毒可以在包含所述產(chǎn)物的細(xì)胞中表達(dá)一種自殺基因，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。如本文所用，術(shù)語“自殺基因”是指編碼一種產(chǎn)物的核酸，其中所述產(chǎn)物通過自身或者在存在其它化合物的情況中導(dǎo)致細(xì)胞死亡。自殺基因的一個代表性實(shí)例是編碼單純皰疹病毒的胸苷激酶的基因。額外的實(shí)例是水痘帶狀皰疹病毒的胸苷激酶和細(xì)菌基因胞嘧啶脫氨酶，其以將5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)楦甙拘缘幕衔?-氟尿嘧啶。自殺基因可通過將前體藥物轉(zhuǎn)變?yōu)榘拘缘漠a(chǎn)物而產(chǎn)生胞毒性。如本文所用，術(shù)語“前體藥物”是指可以轉(zhuǎn)變?yōu)閷?xì)胞是毒性產(chǎn)物的任何化合物。這種前體藥物的代表性實(shí)例是丙氧鳥苷(gancyclovir)，其在體內(nèi)通過HSV胸苷激酶而被轉(zhuǎn)變?yōu)槎拘曰衔?。隨后丙氧鳥苷衍生物對細(xì)胞是毒性的。前體藥物的其它代表性實(shí)例包括無環(huán)鳥苷(acyclovir)，F(xiàn)IAU[1-(2-脫氧-2-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-碘尿嘧啶]，針對VZV-TK的6-甲氧基嘌呤阿拉伯糖苷和針對胞嘧啶脫氨酶的5-氟胞嘧啶。在一個實(shí)施方案中，通過在本發(fā)明的構(gòu)建體內(nèi)摻入一個自殺基因提供了一種額外的安全因素。在另一個實(shí)施方案中，在細(xì)胞內(nèi)摻入自殺基因?qū)е掳邢虻陌拘裕?dāng)需要靶細(xì)胞裂解時則其提供了一種治療方案。在另一個實(shí)施方案中，這種摻入可用于抗癌應(yīng)用，由此通過本發(fā)明的重組彈狀病毒科病毒特異性靶向癌細(xì)胞，并且癌細(xì)胞特異性裂解可以通過摻入自殺基因而受影響。在另一個實(shí)施方案中，利用本發(fā)明的重組彈狀病毒科病毒，其中當(dāng)產(chǎn)生所謂的“Th1”型應(yīng)答對個體有益時，重組物在已經(jīng)產(chǎn)生所謂的“Th2”型應(yīng)答的疾病中進(jìn)一步表達(dá)激發(fā)“Th1”應(yīng)答的免疫原性蛋白質(zhì)或多肽。免疫原性蛋白質(zhì)或多肽的導(dǎo)入導(dǎo)致Th1型應(yīng)答的轉(zhuǎn)變。如本文所用，術(shù)語“Th2型應(yīng)答”是指通過T輔助細(xì)胞激發(fā)的一種細(xì)胞因子表達(dá)的模式，作為獲得性免疫應(yīng)答的一部分，支持強(qiáng)壯的抗體應(yīng)答的產(chǎn)生。典型地，Th2型應(yīng)答例如在個體中對蠕蟲感染是有益的。典型地，Th2型應(yīng)答是例如通過白細(xì)胞介素-4或白細(xì)胞介素10的產(chǎn)生而識別的。如本文所用，術(shù)語“Th1型應(yīng)答”是指通過T輔助細(xì)胞激發(fā)的一種細(xì)胞因子表達(dá)模式，作為獲得性免疫應(yīng)答的一部分，支持強(qiáng)細(xì)胞介導(dǎo)免疫的產(chǎn)生。典型地，Th1型應(yīng)答例如在個體中對胞內(nèi)感染是有益的。典型地，Th1型應(yīng)答例如是通過白細(xì)胞介素-2或干擾素-γ的產(chǎn)生而識別的。在另一個實(shí)施方案中，出現(xiàn)相反現(xiàn)象(reverseoccurs)，在已經(jīng)產(chǎn)生Th1型應(yīng)答時，當(dāng)Th2型應(yīng)答為個體提供了一種更有益的結(jié)果時，通過本發(fā)明的重組病毒/彈狀病毒科病毒，核酸，載體或組合物導(dǎo)入免疫原性蛋白質(zhì)或多肽使得轉(zhuǎn)向更有益的細(xì)胞因子分布圖。一個實(shí)例是在麻風(fēng)病中，其中本發(fā)明的重組病毒/彈狀病毒科病毒，核酸，載體或組合物表達(dá)來自麻風(fēng)分枝桿菌(M.leprae)的一個抗原，其中該抗原刺激Th1細(xì)胞因子轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致結(jié)核樣型麻風(fēng)，與瘤型麻風(fēng)相反，這是與Th2型應(yīng)答相關(guān)的一種更嚴(yán)重的疾病形式。應(yīng)理解表達(dá)免疫原性蛋白質(zhì)的本發(fā)明的重組彈狀病毒科病毒在免疫個體以預(yù)防疾病和/或減輕疾病和/或改變疾病進(jìn)展方面的任何應(yīng)用都被認(rèn)為是本發(fā)明的一部分。刺激希望的保護(hù)性免疫應(yīng)答的感染性病毒的實(shí)例包括逆轉(zhuǎn)錄病毒科(例如人免疫缺陷病毒，如HIV-1(也稱作HTLV-III，LAV或HTLV-III/LAV或HIV-III；及其它分離株，如HIV-LP；微小RNA病毒科(Picomaviridae)(例如脊髓灰質(zhì)炎病毒，甲型肝炎病毒；腸道病毒，人柯薩奇病毒，鼻病毒，艾可病毒群)；Calciviridae(例如導(dǎo)致胃腸炎的毒株)；披蓋病毒科(例如馬腦炎病毒，風(fēng)疹病毒)黃病毒科(例如登革病毒，腦炎病毒，黃熱病毒)；冠形病毒科(例如冠形病毒)；彈狀病毒科(例如皰疹性口腔炎病毒，狂犬病毒)；線狀病毒科(例如埃博拉(ebola)病毒)；副粘病毒科(例如副流感病毒，腮腺炎病毒，麻疹病毒，呼吸道合胞病毒)；正粘病毒科(例如流感病毒)；Bungaviridae(例如Hantaan病毒，bunga病毒，白蛉病毒和Nairo病毒)；沙粒病毒科(出血熱病毒)；呼腸病毒科(例如呼腸病毒，環(huán)狀病毒和輪狀病毒)；雙RNA病毒科；嗜肝DNA病毒科(乙型肝炎病毒)；細(xì)小病毒科(細(xì)小病毒)；乳多空病毒科(乳頭瘤病毒，多瘤病毒)；腺病毒科(主要為腺病毒)；皰疹病毒科(單純皰疹病毒(HSV)1和2，水痘帶狀皰疹病毒，巨細(xì)胞病毒(CMV)，皰疹病毒)；痘病毒科(天花病毒，痘苗病毒，痘病毒)及虹彩病毒科(例如非洲豬熱病毒)，及未分類的病毒(例如海綿性腦病的致病因素，丁型肝炎的致病因素(被認(rèn)為是乙型肝炎病毒的缺陷衛(wèi)星)，非甲、非乙型肝炎的致病因素(類別1＝內(nèi)在傳播的；類別2＝非腸道傳播的(即丙型肝炎)；諾沃克及相關(guān)病毒，及星狀病毒)。刺激希望的保護(hù)性免疫應(yīng)答的感染性細(xì)菌的實(shí)例包括幽門螺桿菌(Helicobacterpylori)，布氏疏螺旋體(Borelliaburgdorferi)，侵肺軍團(tuán)菌(Legionellapneumophilia)，分枝桿菌屬(Mycobacteriasps)(例如結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)，鳥分枝桿菌(M.avium)，胞內(nèi)分枝桿菌(M.intracellulare)，堪薩斯分枝桿菌(M.kansaii)，戈登分枝桿菌(M.gordonae))，金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoeae)，腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)，單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)，釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)(GroupAStreptococcus)，無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)(GroupBStreptococcus)，鏈球菌(Streptococcus)(viridansgroup)，糞腸球菌(Streptococcusfaecalis)，牛鏈球菌(Streptococcusbovis)，鏈球菌(Streptococcus)(厭氧屬(anaerobicsps.))，肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)，致病性彎曲菌屬(pathogenicCampylobactersp.)，腸球菌屬(Enterococcussp.)，衣原體屬(Chlamidiasp.)，流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)，炭疽芽孢桿菌(Bacillusantracis)，白喉棒桿菌(corynebacteriumdiphtheriae)，棒桿菌屬(corynebacteriumsp.)，豬紅斑丹毒絲菌(Erysipelothrixrhusiopathiae)，產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringers)，破傷風(fēng)梭菌(Clostridiumtetani)，產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes)，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)，多殺巴斯德氏菌(Pasturellamultocida)，擬桿菌屬(Bacteroidessp.)，具核梭桿菌(Fusobacteriumnucleatum)，念珠狀鏈桿菌(Streptobacillusmoniliformis)，蒼白密螺旋體(Treponemapallidum)，極細(xì)密螺旋體(Treponemapertenue)，鉤端螺旋體屬(Leptospira)，衣氏放線菌(Actinomycesisraelli)和土拉熱弗朗西絲氏菌(Francisellatularensis)。刺激希望的保護(hù)性免疫應(yīng)答的感染性真菌的實(shí)例包括新型隱球酵母(Cryptococcusneoformans)，莢膜組織胞漿菌(Histoplasmacapsulatum)，粗球孢菌(Coccidioidesimmitis)，皮炎芽生菌(Blastomycesdermatitidis)，砂眼披衣菌(Chlamydiatrachomatis)，白色假絲酵母(Candidaalbicans)。其它感染性生物體(即原生生物)包括瘧原蟲屬(Plasmodiumsp.)，利什曼原蟲屬(Leishmaniasp.)，血吸蟲屬(Schistosomasp.)和弓形蟲屬(Toxoplasmasp.)。在另一個實(shí)施方案中，表達(dá)免疫原性蛋白質(zhì)的本發(fā)明的重組彈狀病毒科病毒進(jìn)一步表達(dá)額外的免疫調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)。有用的免疫調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的實(shí)例包括細(xì)胞因子，趨化因子，補(bǔ)體成分，免疫系統(tǒng)輔助和粘著分子及其人或非人動物特異性的受體。有用的實(shí)例包括GM-CSF，IL-2，IL-12，OX40，OX40L(gp34)，淋巴細(xì)胞趨化因子(lymphotactin)，CD40和CD40L。進(jìn)一步的有用實(shí)例包括白細(xì)胞介素，例如白細(xì)胞介素1-15，干擾素-α、β或γ，腫瘤壞死因子，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)，粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，趨化因子如中性粒細(xì)胞激活蛋白(NAP)，巨噬細(xì)胞化學(xué)引誘物和激活因子(MCAF)，RANTES，巨噬細(xì)胞炎癥肽MIP-1a和MIP-1b，補(bǔ)體成分及其受體，或者輔助分子如B7.1，B7.2，TRAP，ICAM-1、2或3及細(xì)胞因子受體。OX40和OX40-配體(gp34)是免疫調(diào)節(jié)蛋白的進(jìn)一步的有用實(shí)例。在另一個實(shí)施方案中，免疫調(diào)節(jié)蛋白可以是人或非人動物特異性的，并可包含與天然發(fā)生的蛋白質(zhì)有相似結(jié)合活性的胞外結(jié)構(gòu)域和/或其它片段。在另一個實(shí)施方案中，免疫調(diào)節(jié)蛋白可包含上述實(shí)施方案的突變形式，或者包含具有多肽序列如免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的融合蛋白。在一個構(gòu)建體內(nèi)可摻入多個免疫調(diào)節(jié)蛋白，這也代表了本發(fā)明的一個額外的實(shí)施方案。應(yīng)理解本發(fā)明的重組彈狀病毒科病毒可表達(dá)多個免疫原性蛋白質(zhì)。在一個實(shí)施方案中，免疫原性蛋白質(zhì)或肽衍生自相同或相關(guān)的物種。摻入多個抗原的疫苗已經(jīng)示出提供了增強(qiáng)的免疫原性。表達(dá)免疫原性蛋白質(zhì)或肽片段的本發(fā)明的重組彈狀病毒科病毒可以產(chǎn)生可由所述構(gòu)建體刺激的多種類型的免疫應(yīng)答，包括對抗異源表達(dá)的蛋白質(zhì)或肽，目前通過“旁觀(by-stander)”作用而是免疫原性的其它抗原，對抗宿主抗原及其它抗原的應(yīng)答，這也代表了本發(fā)明的另外的實(shí)施方案。預(yù)期本發(fā)明的方法可用于預(yù)防或治療個體的細(xì)菌性、病毒性、寄生物性或其它疾病狀態(tài)，包括腫瘤。組合疫苗已經(jīng)示出提供了增強(qiáng)的免疫原性和保護(hù)性，同樣地，在另一個實(shí)施方案中，免疫原性蛋白質(zhì)或肽衍生自不同的物種。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含彈狀病毒基因組的核酸或其片段的重組病毒，其中所述彈狀病毒基因組或其片段包含在編碼基質(zhì)蛋白(M)的區(qū)域內(nèi)的缺失或突變。重組病毒中的彈狀病毒基因組或其片段，及缺失或突變的彈狀病毒基質(zhì)蛋白可包含本文所列出的所有實(shí)施方案。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含彈狀病毒基因組的核酸或其片段的重組病毒，其中所述彈狀病毒基因組或其片段除了彈狀病毒M蛋白內(nèi)的突變之外，還包含在編碼糖蛋白(G)的區(qū)域內(nèi)的缺失或突變。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含彈狀病毒基因組的核酸的重組病毒，其中所述彈狀病毒基因組包含在編碼糖蛋白(G)的近膜胞外域的區(qū)域內(nèi)的缺失或突變。在另一個實(shí)施方案中，重組彈狀病毒除了在彈狀病毒M蛋白中的突變之外，還包含在編碼糖蛋白(G)的近膜胞外域的區(qū)域內(nèi)的缺失或突變。本文所述的重組病毒可包含關(guān)于本發(fā)明的重組彈狀病毒科病毒所列出的所有實(shí)施方案，這代表了本發(fā)明的另外的實(shí)施方案。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含編碼非致細(xì)胞病變的彈狀病毒的基因組的多核苷酸序列的一種分離的核酸分子，該多核苷酸序列包含在編碼基質(zhì)蛋白(M)的基因中的缺失或突變。應(yīng)理解所述分離的核酸分子可包含本文所列出的所有實(shí)施方案，包括編碼異源蛋白質(zhì)表達(dá)、G主干多肽和融合促進(jìn)多肽表達(dá)的序列，及G糖蛋白表達(dá)中缺失和糖蛋白的近膜胞外域中的缺失的序列，每個分子均代表本發(fā)明的另外的實(shí)施方案。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明所述分離的核酸分子的載體。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含編碼彈狀病毒基因組的多核苷酸序列的一種分離的核酸分子，其中所述多核苷酸序列在編碼糖蛋白(G)的近膜胞外域的基因中有缺失或突變。根據(jù)本發(fā)明這個方面的分離的核酸分子可包含本文所列出的實(shí)施方案，包括編碼異源蛋白表達(dá)、融合促進(jìn)多肽表達(dá)的序列，及基質(zhì)蛋白表達(dá)中突變或缺失的序列，每個分子均代表本發(fā)明的另外的實(shí)施方案。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含這種分離的核酸分子的載體。如本文所用，術(shù)語“核酸”分子包括但非限于原核序列，真核mRNA，來自真核mRNA的cDNA，來自真核(例如哺乳動物)DNA的基因組DNA序列，及甚至合成的DNA序列。該術(shù)語還指包括DNA和RNA的任何已知的堿基類似物的序列。本文所述的核酸序列可以在一個特定載體內(nèi)亞克隆，根據(jù)在細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入序列的方法進(jìn)行。一旦核酸片段被亞克隆入特定的載體中，則該載體成為重組載體。為產(chǎn)生本發(fā)明的核酸構(gòu)建體，編碼感興趣的序列的多核苷酸片段可以連接入適于轉(zhuǎn)導(dǎo)/轉(zhuǎn)化哺乳動物細(xì)胞及適于指導(dǎo)所轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)重組產(chǎn)物表達(dá)的可商購的表達(dá)載體中。應(yīng)意識到這種可商購的載體系統(tǒng)可通過常用的重組技術(shù)修飾以置換，復(fù)制或突變現(xiàn)有的啟動子或增強(qiáng)子序列和/或?qū)肴魏胃郊拥亩嗪塑账嵝蛄校缇幋a附加的選擇標(biāo)記的序列或編碼報(bào)道多肽的序列。本領(lǐng)域有許多技術(shù)將上述重組載體導(dǎo)入本發(fā)明的細(xì)胞中，例如但非限于直接的DNA吸收技術(shù)，及病毒、質(zhì)粒、線性DNA或脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，利用磷酸鈣介導(dǎo)的和DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的導(dǎo)入方法的磁穿孔方法，電穿孔，脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，直接注射，及受體介導(dǎo)的吸收(詳見例如″MethodsinEnzymology″Vol.1-317，AcademicPress，CurrentProtocolsinMolecularBiology，AusubelF.M.etal.(eds.)GreenePublishingAssociates，(1989)andinMolecularCloningALaboratoryManual，2ndEdition，Sambrooketal.ColdSpringHarborLaboratoryPress，(1989)，或者其它標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)手冊)。也可以用核酸包被的粒子轟擊。特定的表達(dá)載體系統(tǒng)的效力及將核酸導(dǎo)入細(xì)胞的方法可以通過本領(lǐng)域中常用的標(biāo)準(zhǔn)方法評估。例如，導(dǎo)入細(xì)胞中的DNA可以通過濾膜雜交技術(shù)(例如Southern印跡)檢測，由導(dǎo)入的DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA可以例如通過Northern印跡、RNase保護(hù)或逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測?；虍a(chǎn)物可以通過合適的分析檢測，例如通過例如用特異性抗體對產(chǎn)生的蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫學(xué)檢測，或者通過功能性分析以檢測基因產(chǎn)物的功能活性，如酶學(xué)分析。如果細(xì)胞表達(dá)的感興趣的基因產(chǎn)物不易分析，表達(dá)系統(tǒng)首先可使用與所用的調(diào)節(jié)元件和載體連接的報(bào)道基因最佳化。報(bào)道基因編碼可易于檢測的一種基因產(chǎn)物，因此可用于評價該系統(tǒng)的效力。本領(lǐng)域中使用的標(biāo)準(zhǔn)報(bào)道基因包括編碼β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、螢光素酶和人生長激素或者本文列出的任何標(biāo)記蛋白的基因。在另一個實(shí)施方案中，構(gòu)建了一個包裝系統(tǒng)，其包含在彈狀病毒M蛋白中包含突變或缺失的cDNA，其可作為弱化的另一種方式。包裝系統(tǒng)是一個載體，或多個載體，其共同提供產(chǎn)生病毒體所需要的可表達(dá)形式的所有遺傳信息，其可以殼體化(encapsidate)核酸，將其從產(chǎn)生病毒體的細(xì)胞中轉(zhuǎn)運(yùn)，傳輸至靶細(xì)胞，并且在靶細(xì)胞中促進(jìn)轉(zhuǎn)基因表達(dá)。然而，包裝系統(tǒng)必須基本上不能包裝其自身，因此提供一種弱化方式，因此在導(dǎo)入靶細(xì)胞中后預(yù)防病毒體產(chǎn)生。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含本文所述重組彈狀病毒科病毒，病毒，載體或核酸的細(xì)胞。在一個實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是原核細(xì)胞，或者在另一個實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是真核細(xì)胞。應(yīng)理解本文針對重組彈狀病毒科病毒，病毒，載體和/或核酸所列出的每個實(shí)施方案均可以在細(xì)胞內(nèi)摻入，并且均代表了本發(fā)明的一部分。重組彈狀病毒或病毒顆粒是本發(fā)明的相似的另外的實(shí)施方案，并可以包含本文所列出的任何改變。因此，可以制備、裝配和分離重組彈狀病毒科病毒和/或顆粒。在一個實(shí)施方案中，由此制備的重組彈狀病毒科病毒和/或顆粒不是致細(xì)胞病變的。在另一個實(shí)施方案中，彈狀病毒M蛋白中的突變或缺失產(chǎn)生一種僅在高度惡性的細(xì)胞中具有致細(xì)胞病變作用的病毒。這種彈狀病毒株的應(yīng)用可提供一種優(yōu)選的特異性惡性細(xì)胞裂解的方式，而對相鄰細(xì)胞無作用。在另一個實(shí)施方案中，在彈狀病毒M蛋白中摻入突變或缺失是進(jìn)一步弱化摻入彈狀病毒基因組的任何構(gòu)建體的一種方式，因?yàn)槠浒拘宰饔脙H限于高度惡性的細(xì)胞。產(chǎn)生重組彈狀病毒的方法可限定利用cDNA和小病毒(Minivirus)或輔助細(xì)胞系。在這種情況中，“小病毒”和“輔助細(xì)胞”(也稱作輔助細(xì)胞系)提供了進(jìn)行彈狀病毒病毒體裝配的彈狀病毒蛋白質(zhì)的來源，其不從編碼彈狀病毒蛋白質(zhì)的基因的轉(zhuǎn)染的DNA中產(chǎn)生。重組彈狀病毒的產(chǎn)生可如下完成(1)單獨(dú)的cDNA；(2)組合轉(zhuǎn)染入輔助細(xì)胞中的cDNA；或者(3)轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中的cDNA，將其進(jìn)一步用小病毒感染，提供產(chǎn)生感染性或非感染性重組彈狀病毒需要的剩余成分或活性。使用任何這些方法(例如小病毒，輔助細(xì)胞系或僅用cDNA轉(zhuǎn)染)，所需要的最基本的成分是含有順式激活信號的RNA分子，以(1)通過彈狀病毒N蛋白殼體化基因組(或反基因組)RNA，及(2)復(fù)制基因組或反基因組(復(fù)制中間物)RNA等價物。需要DNA以產(chǎn)生重組彈狀病毒短語產(chǎn)生感染性彈狀病毒“所必需的cDNA”是指產(chǎn)生表達(dá)突變的基質(zhì)蛋白(M)的感染性重組彈狀病毒顆粒所需要的核酸分子。術(shù)語“小病毒”是指包括不完整病毒顆粒，其含有編碼N-P-M-L，N-P-L，N-P-G-L，M-G，僅僅G，僅僅M或者四或更少的彈狀病毒基因的任意組合的一種多順反子核酸分子。這種不完整的病毒顆粒不能進(jìn)行病毒復(fù)制，復(fù)制是包含其基因組完整拷貝的彈狀病毒生命周期的一個過程。稱作“彈狀病毒復(fù)制”的彈狀病毒基因組的拷貝需要存在復(fù)制元件或復(fù)制子，其在此意味著在5’和3’末端最少含有彈狀病毒的前導(dǎo)序列和非轉(zhuǎn)錄尾區(qū)序列的一個RNA鏈。在基因組意義中，前導(dǎo)序列在3’末端，非轉(zhuǎn)錄尾區(qū)在5’末端。位于這兩個復(fù)制信號之間的任何RNA將依次被復(fù)制。前導(dǎo)序列和非轉(zhuǎn)錄尾區(qū)另外必須含有最小的順式激活元件，以進(jìn)行由N蛋白的殼體化和聚合酶結(jié)合，這是開始彈狀病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制所必需的。已經(jīng)產(chǎn)生了一些不同的VSV衍生的復(fù)制子，并已經(jīng)示出在培養(yǎng)的細(xì)胞中延長時間地復(fù)制并表達(dá)異源(非VSV)蛋白質(zhì)。這種復(fù)制子是基因治療載體的理想候選物，因?yàn)樗鼈冎辉诩?xì)胞質(zhì)中復(fù)制，這樣消除了由其它基因治療載體引起的靶細(xì)胞染色體中插入誘變。另外，盡管在感染的細(xì)胞中嘗試證明任何類型的重組，但沒有跡象表明基于VSV的復(fù)制子可經(jīng)歷同源(或異源)重組。不能重組的能力消除了復(fù)制和感染性能力由其它負(fù)鏈RNA病毒對含有復(fù)制子的細(xì)胞感染而重建的問題。為產(chǎn)生本發(fā)明的重組彈狀病毒，上述編碼修飾的彈狀病毒基因組的cDNA必須與細(xì)胞在促進(jìn)所用載體表達(dá)的條件下接觸，使得重組彈狀病毒產(chǎn)生。應(yīng)理解利用上述三種方法任一種允許重組彈狀病毒裝配的任何細(xì)胞都包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生病毒將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞通常在希望的溫度(一般為37℃)保溫至少24小時。為產(chǎn)生感染性病毒顆粒，收獲含有重組病毒的上清并移至新鮮的細(xì)胞中。將表達(dá)G蛋白(通過瞬時或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染)的新鮮細(xì)胞保溫大約48小時，收集上清。重組彈狀病毒的純化術(shù)語“分離”彈狀病毒是指培養(yǎng)并純化病毒顆粒由此剩余非常少的細(xì)胞碎片的過程。一個實(shí)例是收集含有病毒體的上清并過濾(0.2μ孔徑)(例如Millex-GS，Millipore)上清，由此除去痘苗病毒和細(xì)胞碎片?；蛘撸《倔w可使用梯度如蔗糖梯度純化。重組彈狀病毒顆粒然后可被沉淀并重懸于希望的賦形劑或載體中。病毒效價可通過用于感染細(xì)胞的上清系列稀釋液測定，因此在病毒蛋白質(zhì)表達(dá)之后，感染的細(xì)胞通過使用例如抗M(23H12)或抗N(10G4)蛋白特異性抗體(L.Lefrancoisetal.，(1982)Virology121157-67)進(jìn)行間接免疫熒光測定而量化。因此應(yīng)理解重組彈狀病毒顆粒是本發(fā)明的一部分。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)非致細(xì)胞病變的重組彈狀病毒的方法，所述重組彈狀病毒包含編碼彈狀病毒蛋白的經(jīng)遺傳修飾的核酸，所述彈狀病毒蛋白包括基質(zhì)蛋白(M)內(nèi)的突變或缺失，所述方法包括如下步驟(A)在合適的細(xì)胞中插入一個編碼彈狀病毒蛋白的多核苷酸序列，所述彈狀病毒蛋白包括基質(zhì)蛋白(M)內(nèi)的突變或缺失，插入一個編碼標(biāo)記多肽的多核苷酸序列及一個含有彈狀病毒復(fù)制的順式激活信號的至少3’和5’彈狀病毒前導(dǎo)序列和非轉(zhuǎn)錄尾區(qū)的多順反子cDNA；(B)在選擇所述細(xì)胞的非致細(xì)胞病變表型的條件下培養(yǎng)細(xì)胞；(C)在允許重組彈狀病毒產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞；及(D)分離所述非致細(xì)胞病變的重組彈狀病毒。在一個實(shí)施方案中，所述方法包括從本發(fā)明的分離的重組彈狀病毒科病毒中分離基因組RNA的步驟。在另一個實(shí)施方案中，分離基因組RNA的步驟是通過RT-PCR進(jìn)行的。在另一個實(shí)施方案中，用于進(jìn)行生產(chǎn)方法的細(xì)胞選自嚙齒類動物，靈長類動物和人體細(xì)胞。在另一個實(shí)施方案中，通過本發(fā)明所述方法產(chǎn)生了具有G糖蛋白中突變或缺失的非致細(xì)胞病變的重組彈狀病毒科病毒。根據(jù)本發(fā)明的這個方面，如述將編碼彈狀病毒蛋白的一個多核苷酸序列插入細(xì)胞中，所述彈狀病毒蛋白包括糖蛋白(G)內(nèi)的突變或缺失。在一個實(shí)施方案中，糖蛋白中的突變或缺失是在糖蛋白的近膜胞外域中。在另一個實(shí)施方案中，通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生了進(jìn)一步表達(dá)編碼第二種多肽的一個異源核酸序列的非致細(xì)胞病變的重組彈狀病毒科病毒。根據(jù)本發(fā)明的這個方面，如述將編碼至少一個異源多肽的一個多核苷酸序列插入細(xì)胞中。在一個實(shí)施方案中，所述第二種多肽是治療性多肽。在另一個實(shí)施方案中，所述第二種肽是免疫原性的。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)重組彈狀病毒的方法，所述重組彈狀病毒包含編碼在糖蛋白(G)的近膜胞外域內(nèi)包含缺失或突變的彈狀病毒蛋白的遺傳修飾的核酸，所述方法包括如下步驟(A)在合適的細(xì)胞內(nèi)插入一個編碼彈狀病毒蛋白的多核苷酸序列，所述彈狀病毒蛋白包括糖蛋白(G)的近膜胞外域內(nèi)的缺失或突變，插入一個編碼標(biāo)記多肽的多核苷酸序列及一個包含含有彈狀病毒復(fù)制的順式作用信號的至少3’和5’彈狀病毒前導(dǎo)和非轉(zhuǎn)錄尾區(qū)的多順反子cDNA；(B)在允許重組彈狀病毒產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)細(xì)胞；及(C)分離所述重組彈狀病毒。為感染細(xì)胞(如組織培養(yǎng)細(xì)胞或來自組織樣品如活檢組織的細(xì)胞)，使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)將分離的重組彈狀病毒與細(xì)胞保溫。對重組彈狀病毒的感染的檢測可通過確定報(bào)道基因如綠色熒光蛋白(GFP)的存在而進(jìn)行，或者通過評估病毒蛋白表達(dá)，如通過上述間接免疫熒光測定方法進(jìn)行。為制備感染性病毒顆粒，首先將一種合適的細(xì)胞系(例如BHK細(xì)胞)用痘苗病毒vTF7-3感染(T.R.Fuerstetal.，(1986)Proc.NatlAcad.Sci.USA3.8122-26)，或者用編碼T7RNA聚合酶或其它合適的噬菌體聚合酶如T3或SP6聚合酶的等價物感染(見Usdinetal.，(1993)BioTechniques14222-224或Rodriguezetal.(1990)J.Virol.644851-4857)?；蛘呖梢岳脽o痘苗病毒系統(tǒng)，其提供了一種RNA聚合酶。然后將細(xì)胞用含有編碼N，P，G和L彈狀病毒蛋白的基因的各個cDNA轉(zhuǎn)染。這些cDNA提供了建立重組彈狀病毒顆粒的蛋白質(zhì)。細(xì)胞可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法轉(zhuǎn)染(例如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，電穿孔等)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含一或多個容器的診斷和藥物包裝和試劑盒，所述容器中充填了一或多種本發(fā)明的上述載體、病毒或組合物的成分。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含本文所述的重組病毒，彈狀病毒科病毒，核酸或載體的組合物，以給予細(xì)胞或多細(xì)胞生物體。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的載體可以與未滅菌或滅菌的一或多個載體組合應(yīng)用，以給予細(xì)胞，組織或生物體，如與適于給藥的藥物載體組合給予個體。這種組合物包含例如一種介質(zhì)添加劑或一種治療有效量的本發(fā)明的重組病毒及一種藥物可接受的載體或賦形劑。這種載體可包括但非限于鹽水，緩沖鹽水，葡萄糖，水，甘油，及其組合物。制劑應(yīng)適于給藥模式。本發(fā)明的重組病毒，載體或組合物可單獨(dú)應(yīng)用，或者與其它化合物如額外的治療性化合物聯(lián)合應(yīng)用。所述藥物組合物可以任何有效的常規(guī)的方式給予，包括例如通過靜脈內(nèi)給藥(i.v.)、肌內(nèi)給藥(i.m.)、鼻內(nèi)給藥(i.n.)、皮下給藥(s.c.)、口服給藥、直腸給藥、陰道內(nèi)輸送，或者通過其中重組病毒/組合物可輸送至組織的任何方式給予(例如通過針或?qū)Ч芙o藥)?；蛘撸槍Σ迦肷掀ぜ?xì)胞可選用局部給藥。另一種給藥方法是通過吸入或氣霧劑給藥。為給予哺乳動物特別是人，期望醫(yī)生來確定實(shí)際劑量和治療持續(xù)時間，這樣將最適于個體并可以隨著年齡，體重及特殊個體的應(yīng)答而變化。應(yīng)用的重組彈狀病毒的給予途徑促進(jìn)病毒循環(huán)，附著和感染，從而使得病毒表達(dá)編碼的蛋白質(zhì)，這可以通過在重組彈狀病毒內(nèi)摻入報(bào)道蛋白而分析。期望在給予彈狀病毒后，病毒蛋白表達(dá)應(yīng)在24小時內(nèi)發(fā)生并確定在36小時內(nèi)發(fā)生(例如通過報(bào)道蛋白檢測而確定)。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種免疫個體抗一種疾病的方法，包括將所述個體的靶細(xì)胞與治療有效量的重組病毒接觸，從而對疾病產(chǎn)生免疫，其中所述病毒包含彈狀病毒基因組或其片段，所述彈狀病毒基因組或其片段包括在編碼基質(zhì)蛋白(M)的區(qū)域內(nèi)的缺失或突變，及編碼能在靶細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的一種免疫原性蛋白質(zhì)或肽片段的異源基因。如本文所用，術(shù)語“接觸靶細(xì)胞”是指直接和間接將靶細(xì)胞暴露于本發(fā)明的病毒，核酸，載體或組合物。在一個實(shí)施方案中，接觸細(xì)胞可包括通過本領(lǐng)域熟知的任何方式直接注射細(xì)胞，如顯微注射。在另一個實(shí)施方案中，間接提供給細(xì)胞，如通過在細(xì)胞周圍的培養(yǎng)基中提供。將本發(fā)明的病毒，核酸或載體導(dǎo)入靶細(xì)胞的方案可包括例如直接DNA吸收技術(shù)，病毒、質(zhì)粒、線性DNA或脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，或轉(zhuǎn)染，應(yīng)用磷酸鈣介導(dǎo)的和DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的導(dǎo)入方法的磁穿孔方法，電穿孔，直接注射，及受體介導(dǎo)的吸收(進(jìn)一步詳見例如″MethodsinEnzymology″Vol.1-317，AcademicPress，CurrentProtocolsinMolecularBiology，AusubelF.M.etal.(eds.)GreenePublishingAssociates，(1989)andinMolecularCloningALaboratoryManual，2ndEdition，Sambrooketal.ColdSpringHarborLaboratoryPress，(1989)，或者其它標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)手冊)。應(yīng)理解本發(fā)明涵蓋了本發(fā)明的病毒，核酸或載體浸入細(xì)胞內(nèi)的任何直接或間接方式，并均代表了本發(fā)明的一個實(shí)施方案。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種治療患有疾病的個體的方法，所述方法包括將個體的靶細(xì)胞與治療有效量的重組病毒接觸的步驟，從而治療疾病，其中所述病毒包含彈狀病毒基因組或其片段，所述彈狀病毒基因組或其片段包括編碼基質(zhì)蛋白(M)的區(qū)域內(nèi)的缺失或突變及編碼能在靶細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的免疫原性蛋白質(zhì)或肽片段的一個異源基因。根據(jù)本發(fā)明的這個方面，在另外的實(shí)施方案中，靶細(xì)胞是上皮細(xì)胞、肺細(xì)胞、腎細(xì)胞、肝細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、前列腺細(xì)胞、專門的抗原呈遞細(xì)胞、淋巴細(xì)胞或M細(xì)胞。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種治療患有與缺陷基因相關(guān)的疾病的個體的方法，所述方法包括將個體的靶細(xì)胞與治療有效量的本發(fā)明的重組非致細(xì)胞病變的彈狀病毒，或包含彈狀病毒基因組的重組病毒，載體或細(xì)胞或編碼彈狀病毒基因組的核酸序列接觸的步驟，從而治療疾病，其中彈狀病毒的基因組包括在編碼基質(zhì)蛋白(M)的區(qū)域內(nèi)的缺失或突變及能在靶細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的一個異源基因。根據(jù)本發(fā)明的這個方面，在另一個實(shí)施方案中，重組非致細(xì)胞病變的彈狀病毒可進(jìn)一步包含在彈狀病毒糖蛋白的近膜胞外域中的突變或缺失。應(yīng)理解由此所用的重組彈狀病毒科病毒，病毒，載體或細(xì)胞可包含本文所列出的任何實(shí)施方案或其組合。根據(jù)本發(fā)明的這個方面，因此可治療的疾病可包括但非限于肌營養(yǎng)不良，癌癥，心血管疾病，高血壓，感染，腎病，神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默氏病，帕金森病，亨廷頓舞蹈癥，克雅氏病，自身免疫疾病如狼瘡，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，心內(nèi)膜炎，葛雷夫斯氏病或ALD，呼吸系統(tǒng)疾病如哮喘或囊性纖維化，骨病如骨質(zhì)疏松癥，關(guān)節(jié)疾病，肝病，皮膚病如銀屑病或濕疹，眼病，耳鼻喉科疾病，其它神經(jīng)系統(tǒng)疾病如Turret綜合征，精神分裂癥，抑郁癥，孤獨(dú)癥或中風(fēng)，或者代謝疾病如糖元累積癥(glycogenstoragedisease)或糖尿病。應(yīng)理解其中尋求通過應(yīng)用本發(fā)明的重組彈狀病毒科病毒，病毒，載體或細(xì)胞或組合物可實(shí)現(xiàn)特定蛋白質(zhì)表達(dá)的任何疾病均被認(rèn)為是本發(fā)明的一部分。在一個實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的這個方面，靶細(xì)胞是上皮細(xì)胞，肺細(xì)胞，腎細(xì)胞，肝細(xì)胞，星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或前列腺細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明這個方面的方法可提供上述任何的治療應(yīng)用，每種方法均代表本發(fā)明的另一個實(shí)施方案。應(yīng)理解本發(fā)明的重組病毒，細(xì)胞，載體，核酸或組合物的任何治療性應(yīng)用均被認(rèn)為是本發(fā)明的一部分并且是本發(fā)明的實(shí)施方案。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種免疫個體抗一種疾病的方法，包括將所述個體的靶細(xì)胞與治療有效量的重組病毒接觸的步驟，從而對疾病產(chǎn)生免疫，其中所述病毒包含彈狀病毒基因組或其片段，所述彈狀病毒基因組或其片段包括在編碼基質(zhì)蛋白(M)的區(qū)域中的缺失或突變和/或在糖蛋白(G)的近膜胞外域中的突變或缺失及一個編碼能在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的免疫原性蛋白質(zhì)或肽片段的異源基因。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組彈狀病毒科病毒，及病毒，載體，細(xì)胞和組合物可作為有效的抗癌治療劑。用不同量rVSV感染的癌細(xì)胞如C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞導(dǎo)致在72小時內(nèi)大約90％的細(xì)胞死亡(實(shí)施例12)。然而，由于VSV感染的結(jié)果，在培養(yǎng)物中對健康細(xì)胞的損害顯而易見。在這方面，缺失G的重組VSV則對鄰近的健康細(xì)胞無作用，該病毒裂解作用特異性于神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的這個方面，在另一個實(shí)施方案中，提供了一種癌細(xì)胞裂解的方法，包括將癌細(xì)胞與本發(fā)明的重組彈狀病毒接觸的步驟，其中彈狀病毒包含(a)包含彈狀病毒基因組的核酸，其中彈狀病毒基因組包含在編碼基質(zhì)蛋白(M)的區(qū)域內(nèi)的缺失或突變和/或在編碼彈狀病毒糖蛋白(G)的近膜胞外域的區(qū)域內(nèi)的缺失或突變；及(b)一個非彈狀病毒核酸。在用VSV感染后，經(jīng)干擾素-β預(yù)處理導(dǎo)致特異性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞裂解(圖36)，對其自身切片中的正常神經(jīng)元細(xì)胞的感染非常少。因此，在其它實(shí)施方案中，非彈狀病毒核酸編碼一種細(xì)胞因子或自殺基因。在另一個實(shí)施方案中，在用本發(fā)明的重組彈狀病毒科病毒感染之前、期間或之后將一種另外的治療化合物與細(xì)胞接觸。在一個實(shí)施方案中，治療化合物是核苷類似物。在另一個實(shí)施方案中，治療化合物是細(xì)胞骨架抑制劑，如微管抑制劑。在一個實(shí)施方案中，癌細(xì)胞包含彌漫的癌細(xì)胞，或者在另一個實(shí)施方案中，癌細(xì)胞是實(shí)體瘤組織細(xì)胞類型。在另一個實(shí)施方案中，癌細(xì)胞可以是在腫瘤發(fā)生的任何階段及任何來源的。另外，缺失G表達(dá)(ΔG)的VSV毒株表明在經(jīng)該病毒感染后顯著縮小在體內(nèi)的腫瘤負(fù)載(load)，而且如果在其自身的切片培養(yǎng)物中發(fā)生對正常細(xì)胞感染也是非常少的(實(shí)施例13，圖39D)。因此，在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種治療癌癥的方法，包括將癌細(xì)胞與重組病毒接觸的步驟，其中所述病毒包含(a)包含彈狀病毒基因組或其片段的核酸，所述彈狀病毒基因組或其片段包含在編碼基質(zhì)蛋白(M)的區(qū)域內(nèi)的缺失或突變和/或在編碼糖蛋白(G)的近膜胞外域的區(qū)域內(nèi)的缺失或突變；及(b)一個非彈狀病毒核酸。在其它的實(shí)施方案中，非彈狀病毒核酸編碼一種細(xì)胞因子或自殺基因。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種研究神經(jīng)組織中腫瘤發(fā)生的模型，包括如下步驟獲得冠(corona)、黑質(zhì)和皮層組織的旋轉(zhuǎn)振動切片，將所述切片在保持存活力和抑制有絲分裂的條件下在蓋玻片上培養(yǎng)，用標(biāo)記的癌細(xì)胞接種所述切片培養(yǎng)物并確定標(biāo)記的癌細(xì)胞的死亡情況。在一個實(shí)施方案中，所述模型進(jìn)一步包括用重組彈狀病毒接種切片培養(yǎng)物的步驟。在另一個實(shí)施方案中，重組彈狀病毒針對彈狀病毒M蛋白被突變或缺失。在另一個實(shí)施方案中，編碼彈狀病毒M蛋白的核苷酸序列突變或缺失的重組彈狀病毒針對編碼彈狀病毒G蛋白的核苷酸序列進(jìn)一步被突變或缺失。在另一個實(shí)施方案中，重組彈狀病毒針對彈狀病毒G蛋白的近膜胞外域被突變。在另一個實(shí)施方案中，所述模型利用經(jīng)熒光、發(fā)光、生色或電子致密材料標(biāo)記的癌細(xì)胞。在另一個實(shí)施方案中，所述模型利用標(biāo)記的重組彈狀病毒。在另一個實(shí)施方案中，將被認(rèn)為增強(qiáng)或抑制腫瘤發(fā)生的試劑供給培養(yǎng)物，并確定對標(biāo)記的癌細(xì)胞的作用。在一個實(shí)施方案中，所述試劑是細(xì)胞因子，趨化因子，促炎分子，血管生成因子，血管生成抑制因子，離子載體，微管抑制劑或細(xì)胞周期抑制劑。在另一個實(shí)施方案中，在本發(fā)明提供的模型中評估改變腫瘤發(fā)生或疑似改變腫瘤發(fā)生的試劑。根據(jù)本發(fā)明的這個方面，在加入癌細(xì)胞之后或同時將該試劑供給切片培養(yǎng)物。在一個實(shí)施方案中，確定對癌細(xì)胞存活性的作用。在另一個實(shí)施方案中，確定對癌細(xì)胞增殖的作用。在另一個實(shí)施方案中，確定對癌細(xì)胞表面標(biāo)記表達(dá)或細(xì)胞周期階段的作用。這種作用易于通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法測定，包括但非限于測定染料的吸收作為存活力的測定，例如錐蟲藍(lán)排除，細(xì)胞增殖的測定可通過例如測定3H-胸苷的吸收而確定，細(xì)胞表面標(biāo)記表達(dá)和細(xì)胞周期階段可通過FACS確定，及其它本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法。根據(jù)本發(fā)明的這個方面，在另一個實(shí)施方案中，將切片在包含Gey′s/右旋糖溶液，血漿，凝血酶，Eagle′s基礎(chǔ)培養(yǎng)基，Hanks′平衡鹽溶液，L-谷氨酰胺，或其任何組合的培養(yǎng)基中在保持存活力的條件下在蓋玻片上培養(yǎng)。根據(jù)本發(fā)明的這個方面，在另一個實(shí)施方案中，將切片在包含胞嘧啶-α-D-阿拉伯呋喃糖苷，尿苷，5-氟-2′-脫氧尿苷，Gey′s/右旋糖溶液，血漿，凝血酶，Eagle′s基礎(chǔ)培養(yǎng)基，Hanks′平衡鹽溶液，L-谷氨酰胺或其任意組合的培養(yǎng)基中在抑制有絲分裂的條件下在蓋玻片上培養(yǎng)。在一個實(shí)施方案中，所述模型使得可以分析對正常組織的毒性及潛在的腫瘤治療效力，這可以同進(jìn)行研究，在另一個實(shí)施方案中，可以進(jìn)行實(shí)時研究。在一個實(shí)施方案中，器官型切片培養(yǎng)使得在利用該模型的任何給定研究期間可以保持在體內(nèi)正常存在的解剖學(xué)連接方面適當(dāng)?shù)纳窠?jīng)元結(jié)構(gòu)，并因此實(shí)際上接近在體內(nèi)腦的細(xì)胞，結(jié)構(gòu)和生理學(xué)狀況(23-32)。在其它實(shí)施方案中，所述模型可用于進(jìn)行所需的腦組織的藥理學(xué)，生理學(xué)和結(jié)構(gòu)學(xué)研究，并可在另一個實(shí)施方案中，在體內(nèi)進(jìn)行相似的研究中用作對比的來源，。在另一個實(shí)施方案中，所述模型的培養(yǎng)系統(tǒng)可用于短期研究，或者在另一個實(shí)施方案中，所述模型系統(tǒng)可用于長期研究，而不喪失細(xì)胞完整性或電生理學(xué)應(yīng)答。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種鑒別具有腫瘤消解活性的試劑的方法，包括如下步驟獲得冠(corona)、黑質(zhì)和皮層組織的旋轉(zhuǎn)振動切片，在保持存活力和抑制有絲分裂的條件下在蓋玻片上培養(yǎng)所述切片，用標(biāo)記的癌細(xì)胞接種所述切片培養(yǎng)物，將所述接種的培養(yǎng)物與候選試劑培養(yǎng)，并確定癌細(xì)胞存活力，其中癌細(xì)胞存活力降低表明該候選試劑具有腫瘤消解活性，從而鑒別具有腫瘤消解活性的試劑。在一個實(shí)施方案中，癌細(xì)胞是神經(jīng)元來源的，例如神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的這個方面，在另一個實(shí)施方案中，癌細(xì)胞可用熒光、發(fā)光、生色或電子致密標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記。在另一個實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括用標(biāo)記的重組彈狀病毒接種切片培養(yǎng)物的步驟。在另一個實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的這個方法進(jìn)一步包括將接種切片培養(yǎng)物與一種細(xì)胞因子一起培養(yǎng)的步驟。在一個實(shí)施方案中，所述細(xì)胞因子是干擾素，白細(xì)胞介素，化學(xué)引誘物，如腫瘤壞死因子，或移動抑制因子或巨噬細(xì)胞炎癥蛋白。應(yīng)理解本文所列出的關(guān)于重組彈狀病毒科病毒、切片模型的任何實(shí)施方案均代表了鑒別具有腫瘤消解活性的試劑的方法的另外的實(shí)施方案。在另一個實(shí)施方案中，表達(dá)一種異源蛋白的本發(fā)明的重組病毒，核酸或載體可用作蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)。將該構(gòu)建體穩(wěn)定導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)可提供一種高產(chǎn)量生產(chǎn)表達(dá)的蛋白質(zhì)的手段。以下實(shí)施例是為了更充分地例證本發(fā)明的一些實(shí)施方案。然而這些實(shí)施例無限制本發(fā)明范圍之意。實(shí)施例實(shí)施例1VSV的M蛋白中的突變產(chǎn)生感染性、非致細(xì)胞病變的病毒材料和方法進(jìn)行表達(dá)GFP基因的VSV的定點(diǎn)誘變。然后將BHK-21細(xì)胞用突變的VSV感染。通過超速離心從細(xì)胞培養(yǎng)上清中濃縮病毒顆粒并分離病毒RNA。使用反轉(zhuǎn)錄-PCR獲得NCP-12變體的全長cDNA。將M基因和cDNA進(jìn)行自動序列分析。在指定時間通過熒光顯微術(shù)確定培養(yǎng)的感染的BHK-21(MOI為10)細(xì)胞和細(xì)胞感染性及形態(tài)學(xué)。將圓形的細(xì)胞從培養(yǎng)物中吸出并將培養(yǎng)物用輕輕抽吸洗滌若干次，然后保溫并周期性檢測。7天后，檢測到培養(yǎng)物中存在GFP陽性細(xì)胞，表明感染，收獲培養(yǎng)上清，等份用于感染新鮮細(xì)胞。用培養(yǎng)上清感染24小時后，檢測細(xì)胞的GFP表達(dá)情況。將細(xì)胞還用3％低聚甲醛固定，用1％TritonX-100透化，隨后用與Alexa568染料(MolecularProbes)綴合的N蛋白特異性單克隆抗體(10G4，LefrancoisandLyles，(1982)wereVirology121157-167)探查感染跡象。將BHK-21細(xì)胞也在蓋玻片上生長并用2μg的pCAGGS-Mwt，pCAGGS-NCP-12.1或pCAGGS-MCS質(zhì)粒，使用于Optimem(GibcoBRL)中的10μllipofectamine(GibcoBRL)進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染后24小時，將細(xì)胞用3％低聚甲醛固定，用1％TritonX-100透化并用經(jīng)羅丹明綴合的山羊抗小鼠二級抗體標(biāo)記的M特異性單克隆抗體(23H12)探查M蛋白的表達(dá)。將MNCP12.1cDNA針對含有4個鑒別的突變的M基因進(jìn)行克隆，將突變的基因用野生型M基因置換以通過標(biāo)準(zhǔn)方法確定重組病毒回收，經(jīng)顯微鏡檢測回收的病毒的表型。結(jié)果先前的跡象提示兩種N末端截短的M蛋白(稱為M2和M3)引起在VSV感染的細(xì)胞中見到的致細(xì)胞病變作用(CPE)。根據(jù)圖1所示進(jìn)行VSVM蛋白突變體的分離。通過消除兩個翻譯起始密碼子，不再產(chǎn)生M2和M3蛋白，并且用突變的病毒感染的細(xì)胞示出細(xì)胞變圓延遲，這是VSVCPE的一個特點(diǎn)(圖2)。分離的重組病毒進(jìn)一步編碼綠色熒光蛋白(GFP)，這表明了用復(fù)制病毒感染的細(xì)胞。在24小時后，大約30％的細(xì)胞未示出明顯的VSVCPE跡象。然而，將其余的大約70％的圓形細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)，達(dá)到鋪滿為GFP陽性的，表明細(xì)胞含有復(fù)制病毒，其仍未被感染殺死并持續(xù)生長。為確定細(xì)胞是否產(chǎn)生感染性病毒，收獲培養(yǎng)上清并將等份用于感染新鮮細(xì)胞。24小時后，新感染的細(xì)胞表明無CPE跡象，但均表達(dá)GFP，表明感染性病毒產(chǎn)生并可以移至初次用于實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞。另外，這些細(xì)胞也產(chǎn)生感染性病毒并保持非致細(xì)胞病變(NCP)表型。為鑒別哪些結(jié)構(gòu)域參與M蛋白誘導(dǎo)的致細(xì)胞病變作用，產(chǎn)生一些不同的M蛋白突變體。在獲得的6個單獨(dú)的分離株中，所有均具有相同突變。突變導(dǎo)致在第33位甲硫氨酸殘基取代丙氨酸殘基(SEQIDNO1)，在第51位甲硫氨酸取代丙氨酸殘基(SEQIDNO2)。進(jìn)一步的取代包括在第133位用蘇氨酸殘基置換丙氨酸殘基(SEQIDNO3)，及在第226位用絲氨酸殘基置換甘氨酸殘基(SEQIDNO4)(圖3)。為確定NCP表型只是由于M蛋白中的突變導(dǎo)致的(不是NCP病毒基因組中其它突變所致)，將cDNA針對含有4個鑒別的突變(SEQIDNO5)的M基因通過用突變基因代替野生型M基因而克隆，這稱為MNCP12.1。使用標(biāo)準(zhǔn)方法回收重組病毒并檢測回收的病毒的表型(圖4)。重組病毒是感染性的，但在感染的BHK-21細(xì)胞中不介導(dǎo)細(xì)胞致細(xì)胞病變作用(圖5，B和D)。盡管用復(fù)制突變病毒感染，但細(xì)胞仍保持典型的形態(tài)學(xué)(圖5C)。相反，用wt-VSV感染的細(xì)胞表明與致死的VSV感染相關(guān)的典型的細(xì)胞變圓(圖5A)。將BHK-21細(xì)胞也用具有野生型M蛋白的VSV，或者wt，NCP-12.1突變體的VSV瞬時轉(zhuǎn)染。與野生型M相比(圖6E)，突變的M蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)(圖6F和G)，這是由于M蛋白干擾RNA聚合酶II依賴性表達(dá)對野生型M蛋白合成抑制所致。通過野生型M蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞致細(xì)胞病變作用在變圓后的細(xì)胞中很明顯(圖6A)，而表達(dá)NCP突變體的細(xì)胞看起來保持扁平和正常(圖6B和C)。實(shí)施例2VSV的M蛋白中的突變不影響細(xì)胞向性材料和方法將如下細(xì)胞類型在感染復(fù)數(shù)為10用rVSV/MNCP12.1感染BHK，CV-1，Vero或HeLa細(xì)胞。將細(xì)胞在37℃保溫12或24小時，在3％低聚甲醛中固定并用含有50mM甘氨酸磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中洗滌兩次。然后通過熒光顯微鏡(ZeissAxiophot，WestGermany)檢測細(xì)胞的GFP表達(dá)情況，并通過相差顯微鏡評估形態(tài)學(xué)。結(jié)果為確定非致細(xì)胞病變的rVSV/MNCP12.1是否改變細(xì)胞向性，在感染復(fù)數(shù)為10感染BHK，CV-1，Vero和HeLa細(xì)胞(圖7)，感染作為GFP表達(dá)的一個函數(shù)加以確定。不管細(xì)胞類型如何，rVSV/MNCP12.1均能在細(xì)胞內(nèi)感染和復(fù)制，而無任何致細(xì)胞病變作用的跡象。實(shí)施例3高級載體的研發(fā)以進(jìn)行基因治療應(yīng)用材料和方法如上述產(chǎn)生重組VSVM突變體。生長突變的病毒并在BHK-21細(xì)胞感染期間通過與表達(dá)N，P和L蛋白的質(zhì)粒共表達(dá)而回收。將突變的病毒在表達(dá)MNCP12.1的細(xì)胞中增殖。來自用rVSV-ΔM(VSV復(fù)制子)感染的細(xì)胞的上清應(yīng)用于24小時前預(yù)先用5μg的pc-MNCP12.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。將細(xì)胞在感染后24小時固定并用經(jīng)羅丹明綴合的山羊抗小鼠二級抗體(JacksonImmunoResearchLaboratories，Inc.)標(biāo)記的N特異性單克隆抗體探查。結(jié)果先前嘗試回收突變或缺失M蛋白的VSV(ΔM-VSV)失敗了，大概是由于M蛋白毒性作用殺死細(xì)胞從而限制了表達(dá)的M蛋白的量。為確定上述方法和毒株是否提供了一種易于可回收的載體，利用與用于回收重組VSV的標(biāo)準(zhǔn)方法相似的一種回收方案，例外的是在開始病毒回收期間將MNCP12.1與N，P和L支持質(zhì)粒共表達(dá)，隨后從表達(dá)MNCP12.1的細(xì)胞(或細(xì)胞系)中增殖病毒。ΔM-VSV在這些條件下是易于可回收的(圖9)，并因此是一種良好的基因輸送/基因治療載體候選物。ΔM-VSV只在細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制，消除了潛在的插入誘變和轉(zhuǎn)基因沉默，這通常是應(yīng)用其它典型的基因輸送載體如逆轉(zhuǎn)錄病毒基因治療載體的副產(chǎn)物。實(shí)施例4缺失M和G蛋白的重組VSV感染胰島細(xì)胞但不是致細(xì)胞病變的材料和方法征得了在UniversityofTennessee的胰島實(shí)驗(yàn)室的參與患者的同意。制備胰島細(xì)胞制品，用有復(fù)制能力的缺失M蛋白的VSV(NCP12)或用復(fù)制受限的缺失M和G蛋白的VSV(ΔG-NCP12)感染。將細(xì)胞保持在于12孔平板中的750μl體積的培養(yǎng)基中。在感染后，不除去病毒接種物并在感染后第3天和第8天收獲胰島進(jìn)行成像以及流式細(xì)胞計(jì)量分析。將小體積的胰島細(xì)胞從平板中除去并在1500rpm旋轉(zhuǎn)5分鐘。將沉淀重懸于100μlPBS中并作為懸浮液加入玻璃平板上，用玻璃蓋玻片覆蓋，并在40×物鏡下觀測。剩余物用AnnexinV染色以確定編程性細(xì)胞死亡的胰島細(xì)胞的百分比。結(jié)果對兩個樣品加以研究，樣品號為176和163。在這兩個樣品中，用缺失M蛋白的重組VSV在MOI為5進(jìn)行感染，導(dǎo)致在感染的細(xì)胞中高水平的表達(dá)(分別為圖10和11)，同時致細(xì)胞病變作用最小。G糖蛋白的缺失對感染的水平無明顯作用，然而，在一般樣品176中更有效地感染。用MOI為25時感染，在感染后3天，在感染速度或致細(xì)胞病變作用方面不產(chǎn)生可辨別的提高(分別為圖12和13)。不管MOI如何，在培養(yǎng)物中持續(xù)8天的感染，表達(dá)無可辨別的降低(圖14-17)。不管MOI如何，在感染后3天和8天檢測到高水平的表達(dá)(圖18-19)。因此，胰島細(xì)胞被VSV構(gòu)建體有效感染，感染導(dǎo)致無可辨別的致細(xì)胞病變作用，進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了這種構(gòu)建體作為基因輸送運(yùn)載體的用途。實(shí)施例5VSVG胞外域的近膜區(qū)域中的突變不影響G蛋白表達(dá)或穩(wěn)定性材料和方法質(zhì)粒和寡核苷酸定向誘變?nèi)缦惹八觯瑢⒕幋aVSV，血清型Indiana、毒株SanJuan的G蛋白的基因克隆入真核表達(dá)載體pXM中以產(chǎn)生質(zhì)粒pXM-G(14)。通過寡核苷酸定向誘變構(gòu)建突變體E452A(SEQIDNO6)，G456D(SEQIDNO7)，W457A(SEQIDNO8)，F(xiàn)458A(SEQIDNO9)和W461A(SEQIDNO10)(14)，并將突變的區(qū)域克隆入pXMG(AXB)(32)中。使用QuickChange定點(diǎn)誘變試劑盒根據(jù)廠商指導(dǎo)(Stratagene，Canada)產(chǎn)生雙重和三重突變體，G456DW457A(DA)(SEQIDNO11)，W457AW461A(WW-AA)(SEQIDNO12)，W457AF458AW461A(AAA)(SEQIDNO13)和G456DW457DW461A(DAA)(SEQIDNO14)。pXM-G(AXB)質(zhì)粒用作模板。含有希望突變的兩個互補(bǔ)合成的寡核苷酸引物(來自McMasterUniversityCentralFacilities)使用turboPfuDNA聚合酶用于進(jìn)行誘變。如先前所述構(gòu)建缺失和插入突變體(32)。構(gòu)建體GD9和DF440-N449通過缺失VSVG胞外域的第453-461位氨基酸(SEQIDNO15)和第440-449位氨基酸(SEQIDNO16)而產(chǎn)生。構(gòu)建體G10DAF和GD9-10DAF通過分別在VSVG(AXB)(SEQIDNO17)和GD9(SEQIDNO18)的第464和465位氨基酸之間之間插入來自衰變促進(jìn)因子(DAF)(7)的近膜區(qū)域的9個氨基酸(殘基311-319)而產(chǎn)生。我們稱這些構(gòu)建體為“10-DAF”的原因是因?yàn)檩d體G(AXB)在TM結(jié)合處由于插入一個限制位點(diǎn)而含有額外的絲氨酸。嵌合的G(+9)gBG通過在VSVG的胞外域的第464位氨基酸與VSVG的細(xì)胞質(zhì)尾部的第483位氨基酸之間插入單純皰疹病毒類型1(HSV1)糖蛋白gB的721-726和773-795氨基酸而構(gòu)建，由此VSVG的膜錨定(TM)結(jié)構(gòu)域(殘基465-482)由HSV1gB蛋白的第三個TM結(jié)構(gòu)域置換(38)。這個嵌合體在ecto-TM結(jié)構(gòu)域結(jié)合處含有一個額外的絲氨酸殘基，以保持VSVG蛋白的讀框。構(gòu)建體W457-A(W1A)，W461-A(W2A)，W457W461-AA(WW-AA)，GΔ13，GSrev11，GSrev11-AA使用重疊PCR方法產(chǎn)生，使用質(zhì)粒pVSV9.1(+)(34)作為模板。所用引物的序列在請求時可獲得。然后將重疊PCR產(chǎn)物在6％聚丙烯酰胺凝膠上純化，電洗脫，用獨(dú)特的限制酶KpnI和NheI消化，并用于亞克隆入預(yù)先用同樣的酶消化的pVSV-FL(+)2(34)中。然后將序列通過雙脫氧核苷酸測序證實(shí)。另外將具有希望的突變的G基因作為MluI和NheI的片段亞克隆入修飾形式的真核表達(dá)載體pCAGGS-MCS中。構(gòu)建體pVSV-DAA，-AAA，-G10DAF，-G(+9)gBG，-GΔ9，-GΔ9-10DAF和-DF440-N449通過擴(kuò)增KpnI位點(diǎn)和3’末端之間的G基因的區(qū)域而產(chǎn)生，使用含有突變的G基因的相應(yīng)pXM質(zhì)粒作為模板，并將該區(qū)域亞克隆入pVSV-FL(+)2中。如述(33-35)僅作少量修飾進(jìn)行回收病毒。簡而言之，將于35mm平板中的鋪滿單層BHK-21細(xì)胞用編碼T7RNA聚合酶的重組痘苗病毒(vTF7-3)(36)在感染復(fù)數(shù)為5，在31℃感染1小時。然后將細(xì)胞用DNA脂質(zhì)體懸浮液轉(zhuǎn)染，所述懸浮液由5mg的pVSV(+)-G*(*表示具有突變的G基因)，3mg、5mg、1mg和8mg的分別含有來自VSVIND的N、P、L和G基因的質(zhì)粒，及90ml的TransfectACE組成(36，37)。3小時后，將轉(zhuǎn)染混合物用DMEM+10％FBS置換，并將細(xì)胞在37℃保溫。保溫48小時后收集上清，通過0.2μm濾膜(Millipore，Millex-GS)過濾以除去痘苗病毒。將濾物用于先前已經(jīng)用2mg的pCAGGS-GIND轉(zhuǎn)染24小時的BHK-21細(xì)胞。通過檢測細(xì)胞在VSV感染24-36小時后典型的致細(xì)胞病變作用評估病毒的回收。然后將回收的病毒經(jīng)噬斑純化，傳代并分離其RNA。G基因中的突變通過RT-PCR測序證實(shí)。結(jié)果為確定VSVG的近膜區(qū)域中哪個殘基對膜融合活性是重要的，進(jìn)行來自不同水泡性病毒的近膜結(jié)構(gòu)域的序列對比(圖20)。序列對比示出這個區(qū)域在密切相關(guān)的水泡性病毒中是非常保守的，并且限定了基于這些亞結(jié)構(gòu)域中保守的殘基數(shù)標(biāo)記為A和B的兩個獨(dú)特結(jié)構(gòu)域。最大的保守(＞90％)在殘基E437和W461之間區(qū)域中(結(jié)構(gòu)域B)。殘基F421和D436之間的氨基酸序列(結(jié)構(gòu)域A)在VSVIndiana血清型的兩個毒株(SanJuan和Orsay)中是相同的，同時與Cocal病毒有＞80％的保守，這是分類為Indiana-2血清型及另外兩種Indiana血清型病毒的更不密切相關(guān)的病毒。然而，結(jié)構(gòu)域A在檢測的其它病毒中不是非常保守的。位于第457和461位的色氨酸(W)殘基在所有檢測的水泡性病毒中均是保守的。除了色氨酸殘基之外，一些其它的氨基酸(H423，P424，T444，G445，N449和P450)在檢測的水泡性病毒序列中也是保守的。在結(jié)構(gòu)域B的起始處附近并從殘基440擴(kuò)展至殘基445的FFGDTG(SEQIDNO19)基序在大多數(shù)密切相關(guān)的成員中是保守的，TG殘基在所有檢測的水泡性病毒中是不變的。為確定這些保守區(qū)域在G蛋白的膜融合活性中的作用，我們在這個區(qū)域中產(chǎn)生了取代，缺失和插入(圖21)。在第457和461位的兩個不變的色氨酸(W)殘基用丙氨酸置換。相似地，保守的谷氨酸(E452)，甘氨酸(G456)和苯丙氨酸(F458)獨(dú)立地用丙氨酸或天冬氨酸和丙氨酸置換。通過分別用丙氨酸置換W457和W461以及用天冬氨酸和丙氨酸置換G456和W457而構(gòu)建兩個雙重突變體。另外，通過分別用丙氨酸置換W457，F(xiàn)458和W461以及通過用天冬氨酸和丙氨酸取代G455，W457和W461而產(chǎn)生兩個三重突變體。突變體E452A，G456D，W457A，F(xiàn)458A，W461A，W457W-461-AA；G456D-W457A；G456D-W457A-W461A和W457A-F456A-W461A也分別稱作E-A，G-D，W1A，F(xiàn)-A，W2A，WW-AA，DA，DAA和AAA。除了上述點(diǎn)突變之外，制備缺失突變體(GΔ9，其缺失氨基酸453-461(SEQIDNO15)；GΔ13，其缺失殘基449-461(SEQIDNO20)；及ΔF440-N449，其缺失氨基酸440-449)(SEQIDNO16)及一些插入突變體。構(gòu)建體G(AXB)在K462和S463之間導(dǎo)入兩個額外的絲氨酸{如先前在(38)中所述}，而G10DAF和GΔ9-10DAF含有分別插入在G(AXB)和GΔ9的S464和S465之間的來自衰變促進(jìn)因子(DAF)的9個氨基酸(殘基311-319)。突變體G(+9)gBG在G(AXB)的胞外域和GgB3G的跨膜域之間有一個9個殘基的插入(39)(SEQIDNO21)。剩余的經(jīng)檢測的突變體在鄰近跨膜結(jié)構(gòu)域具有反向的11個氨基酸的序列(Gsrev11)(SEQIDNO22)。突變體GSrev11-AA具有相同的反向的11個氨基酸并還具有兩個W殘基變?yōu)楸彼?SEQIDNO23)。使用pXM載體(11)在COS-1細(xì)胞中表達(dá)突變基因，將蛋白質(zhì)用[35S]-甲硫氨酸標(biāo)記，然后通過用多克隆抗G抗體免疫沉淀隨后進(jìn)行SDS-PAGE加以分析(圖23)。所有取代突變體均與野生型G蛋白共同遷移，及相應(yīng)于野生型和突變體的條帶的密度相似，提示G蛋白中保守殘基的取代及額外殘基的缺失或插入不影響蛋白質(zhì)的表達(dá)或穩(wěn)定性。編碼突變的G蛋白的重組病毒的回收是在開始回收及隨后的擴(kuò)增步驟期間通過WTG蛋白的共表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。這保證了所有病毒均可被回收，不管G蛋白突變體是否是膜融合缺陷的。實(shí)施例6突變的G蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)及細(xì)胞表面表達(dá)材料和方法使用間接免疫熒光測定檢測多種G蛋白的表面表達(dá)。將細(xì)胞轉(zhuǎn)染，用3％低聚甲醛固定并用G特異性單克隆抗體(mAbI1)(40)探查，隨后用羅丹明綴合的山羊抗小鼠(或抗兔)二級抗體(JacksonImmunoresearchLaboratories，Inc.)探查。為量化G蛋白的表面表達(dá)，對病毒感染的細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)量分析或者對轉(zhuǎn)染的COS-1細(xì)胞進(jìn)行乳過氧化物酶催化的碘化(15)。為進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)，將于35mm平板中的BHK-21細(xì)胞(5×105)用野生型VSV或者合適的G補(bǔ)足的突變體病毒感染，感染復(fù)數(shù)為10。感染后6小時，將細(xì)胞使用含有50mMEDTA的PBS從平板中移出，并通過在1250×g離心5分鐘沉淀。然后在室溫使用3％低聚甲醛將細(xì)胞在懸浮液中固定20分鐘。將細(xì)胞用PBS-甘氨酸洗滌兩次以除去固定劑。然后將細(xì)胞在室溫在PBS-甘氨酸+0.5％牛血清白蛋白(BSA)(Sigma-Aldrich)中保溫30分鐘。在用BSA封閉后，用初級抗體I1mAb及羅丹明綴合的山羊抗小鼠抗體探查細(xì)胞。然后通過流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)分析細(xì)胞以量化多種突變體G蛋白的表面表達(dá)水平。結(jié)果細(xì)胞-細(xì)胞融合及病毒出芽均需要病毒蛋白定位于質(zhì)膜。為確定病毒蛋白是否被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面，進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)和乳過氧化物酶催化的細(xì)胞表面碘化。突變的G蛋白在細(xì)胞表面的表達(dá)水平在野生型G蛋白表達(dá)水平的80％至＞100％之間(表1)。表1突變的G蛋白的表面表達(dá)及膜融合活件aCOS細(xì)胞用編碼指定的G蛋白的pXM載體轉(zhuǎn)染，將細(xì)胞進(jìn)行表面碘化并如先前所述計(jì)算表面表達(dá)的相對量(15)。bBHK-21細(xì)胞用G補(bǔ)足的病毒感染，并在感染后6小時固定。然后將細(xì)胞用G特異性單克隆抗體I1和羅丹明標(biāo)記的二級抗體染色，隨后通過流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)分析。使用下式計(jì)算相對表面表達(dá)(％突變?nèi)后w中陽性細(xì)胞×突變體的平均熒光密度)/(％WT陽性細(xì)胞×WT的平均熒光密度)。c轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞在緩沖為pH5.6的融合培養(yǎng)基中水浴，并如材料和方法章節(jié)中所述確定細(xì)胞-細(xì)胞的融合。dBHK-21細(xì)胞用各個病毒突變體感染并如述在緩沖為pH5.9的融合培養(yǎng)基中保溫。數(shù)值是以與WT融合活性(設(shè)為100％)的百分比表示。N.D.＝未進(jìn)行。為確定近膜區(qū)域中的突變是否影響G蛋白的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)或者細(xì)胞表面定位，將野生型和突變的G蛋白均在COS-1和BHK-21兩種細(xì)胞中表達(dá)。通過檢測endoH抗性的獲得來評估從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)至高爾基復(fù)合體的轉(zhuǎn)運(yùn)。在15分鐘脈沖后，所有突變體均對endoH敏感，表明它們被用N末端連接的寡糖糖基化。在追加1小時后，突變體對endoH消化抗性，表明所有突變的G蛋白均以相似的動力學(xué)從ER轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基復(fù)合體。在BHK-21細(xì)胞中表達(dá)的一些突變體的代表性實(shí)例示于圖24。實(shí)施例7G蛋白缺失突變體促進(jìn)膜融合的能力降低材料和方法利用病毒感染的BHK-21細(xì)胞和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的COS-1細(xì)胞分析合胞體的形成。感染6小時后除去病毒感染的細(xì)胞中的培養(yǎng)基，然后將細(xì)胞用經(jīng)HCl滴定為指定pH(5.9，5.5或5.2)的融合培養(yǎng)基[10mMNa2HPO4，10mMN-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸(HEPES)，10mM2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)]漂洗一次，并在室溫在新鮮的融合培養(yǎng)基中水浴1分鐘。1分鐘后，將融合培養(yǎng)基用新鮮的含有5％胎牛血清(FBS)的Dulbecco′smodifiedEagle′s培養(yǎng)基(DMEM)置換，并將細(xì)胞在37℃保溫30分鐘。然后將細(xì)胞用3％低聚甲醛固定并如上述進(jìn)行免疫熒光測定。轉(zhuǎn)染的COS-1細(xì)胞如前述進(jìn)行處理(11)。結(jié)果為檢測突變對膜融合活性的作用，進(jìn)行細(xì)胞-細(xì)胞融合分析，其中將表達(dá)WT或各個G突變體的細(xì)胞用緩沖為pH5.9-4.8的融合培養(yǎng)基處理。當(dāng)在瞬時轉(zhuǎn)染的COS-1細(xì)胞中分析時，所有取代突變體均示出膜融合活性均降低至野生型活性的70％-5％范圍(表1)。然而，當(dāng)在病毒感染的BHK細(xì)胞中分析時，許多這些突變體(W1A，W2A，WW-AA，DAA和AAA)產(chǎn)生與在野生型VSV感染的細(xì)胞中見到的大小和程度相似的廣泛合胞體。這種差異的基本原理還未充分了解，但其可能簡單地是在病毒感染的細(xì)胞對瞬時轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中G蛋白表達(dá)水平的一個函數(shù)。與取代突變體相反，缺失和插入突變體在COS和病毒感染的BHK細(xì)胞中均只具有非常低直至不可檢測的膜融合活性。突變體GΔ9，GΔ13和GΔ9-10DAF產(chǎn)生非常少的合胞體，當(dāng)細(xì)胞暴露于pH5.9時，其僅具有3-4個核(圖25A，箭頭所示)。當(dāng)表達(dá)這些蛋白質(zhì)的細(xì)胞在緩沖為pH5.5，5.2或4.8的培養(yǎng)基中水浴時，合胞體的大小和數(shù)目均不增加(數(shù)據(jù)未示出)，表明合胞體形成中的缺陷不是由于pH閾值的改變所致。另外，在暴露于低pH觸發(fā)點(diǎn)之后延長時間保溫不增加可見的合胞體的數(shù)目或大小(數(shù)據(jù)未示出)。當(dāng)將9或10個氨基酸插入在膜錨定結(jié)構(gòu)域和胞外域的邊界之間時{突變體G(+9)gB和G10DAF}，及當(dāng)缺失殘基F440-N449時，完全喪失膜融合活性(圖25B)。這些數(shù)據(jù)提示近膜區(qū)域的序列對融合活性是關(guān)鍵的。在所有這些情況中，增加暴露于酸性pH的時間或者減少融合培養(yǎng)基的pH不增強(qiáng)膜融合活性。保守的近膜芳族殘基(色氨酸和苯丙氨酸)及甘氨酸殘基因此在病毒感染的細(xì)胞中對VSVG誘導(dǎo)的膜融合不是關(guān)鍵的，但當(dāng)在COS-1細(xì)胞中瞬時表達(dá)時，可見活性有一些降低。倒置11個近膜殘基序列對融合活性無顯著影響。同時9個近膜氨基酸的線性順序似乎不影響膜融合活性，這些殘基是關(guān)鍵的，因?yàn)槠淙笔Ы档腿诤匣钚裕?9％。另外，缺失13個氨基酸對由G蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞融合具有相似的作用。然而，缺失F440和N449之間的區(qū)域，包括保守的FFGDTG(SEQIDNO)基序，完全消除了融合活性，示出這個亞結(jié)構(gòu)域?qū)的融合活性是重要的。插入突變體G10DAF和G(+9)gBG的結(jié)果示出盡管這些插入不影響表面表達(dá)，但它們完全消除融合活性，表明近膜結(jié)構(gòu)域與跨膜結(jié)構(gòu)域的間距對膜融合活性非常重要。根據(jù)這個觀點(diǎn)，G10DAF中近膜區(qū)域的長度通過缺失9個近膜殘基而減少時(GD9-10DAF)，膜融合活性被部分恢復(fù)。綜合這些結(jié)果，表明與膜錨定結(jié)構(gòu)域緊鄰的區(qū)域?qū)SVG蛋白的膜融合活性是必需的，而不同的是例如在HIV-1gp41(41)中，VSVG中保守的近膜W殘基對G蛋白摻入病毒中或者對膜融合活性不是關(guān)鍵的。實(shí)施例8突變的G蛋白的穩(wěn)定性材料和方法表達(dá)的G蛋白的寡聚狀態(tài)通過如述(15，17)的蔗糖密度梯度離心而確定。如述作少量修改，對轉(zhuǎn)染的細(xì)胞裂解物(15)及病毒感染的細(xì)胞裂解物(10)進(jìn)行內(nèi)切糖苷酶H分析。生長于35mm平板中的BHK-21細(xì)胞用合適的G補(bǔ)足的突變體病毒感染，感染復(fù)數(shù)為10。感染后6小時，將細(xì)胞用無甲硫氨酸的DMEM(無Met的DMEM)漂洗一次，然后在2ml無Met的DMEM中保溫20分鐘。在指定時間將培養(yǎng)基用含有55mCi的[35S]-甲硫氨酸(Translabelproteinlabelingmix，NewEnglandNuclear)的2ml無Met的DMEM更換。在脈沖時期后，將細(xì)胞立即用1ml去污劑裂解緩沖液[10mMTris(pH7.4)，66mMEDTA，1％TX-100，0.4％脫氧膽酸，0.02％疊氮化鈉]裂解，或者追加含有2mM過量的非放射性甲硫氨酸的DMEM+10％FBS培養(yǎng)基。核和細(xì)胞碎片通過在臺式微離心機(jī)(IECCentra)上以14,000rpm離心1分鐘而除去。基本如前所述(42)用抗G尾部兔多克隆抗體(肽Ab#3226)進(jìn)行免疫沉淀，除了核后(post-nuclear)上清是用0.3％十二烷基硫酸鈉(SDS)產(chǎn)生的，及抗原-抗體復(fù)合物是在37℃進(jìn)行1小時形成的之外。將一半的免疫沉淀物用EndoH(NewEnglandBiolabs)根據(jù)廠商指導(dǎo)進(jìn)行消化。如述確定野生型和突變的蛋白質(zhì)的胰蛋白酶敏感性(38，43)。簡而言之，將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用[35S]甲硫氨酸標(biāo)記并用于2XMNT[40mM2-(N-嗎啉)乙磺酸，60mMTris，200mMNaCl，2.5mMEDTA]緩沖液中的1％TritonX-100在指定pH進(jìn)行裂解。裂解物在14,000g離心5分鐘，并將等體積的上清在37℃在有或無10mgTPCK-胰蛋白酶的情況中保溫30分鐘。通過加入抑酶肽(100單位)終止消化，將混合物在14,000rpm再次離心2-5分鐘以除去任何不溶物。將上清用抗G(Indiana)抗體免疫沉淀并通過SDS-PAGE分析。回收的病毒的效價通過噬斑分析確定。將于6孔平板中的BHK-21細(xì)胞(5×105)用病毒的10倍系列稀釋液感染。感染后1小時，除去接種物并將細(xì)胞用含有0.9％瓊脂和5％FBS的DMEM覆蓋，在37℃保溫36小時。在保溫期間之后，計(jì)數(shù)噬斑數(shù)目并取至少兩個稀釋液之間的平均值。病毒效價以噬斑形成單位(PFU)/ml表示。噬斑利用Nikon數(shù)碼相機(jī)使用75-200Nikorr鏡頭照相。然后將數(shù)碼圖像放大并在4×8英寸Kodak相紙上印刷。確定每個病毒至少15個噬斑的大小并加以平均。結(jié)果盡管所有突變的蛋白質(zhì)均在細(xì)胞表面表達(dá)，表明它們在ER中能充分折疊并寡聚化以被轉(zhuǎn)運(yùn)至質(zhì)膜，但我們先前已經(jīng)示出一些突變在蔗糖密度梯度中可影響三聚體穩(wěn)定性而不影響轉(zhuǎn)運(yùn)(43，44)。為確定降低膜融合活性的近膜區(qū)域中的突變是否影響三聚體穩(wěn)定性，我們在酸性和中性pH進(jìn)行蔗糖密度梯度離心。就檢測的突變體而言，所有均示出與野生型G相似的沉降模式，除外的是G(+9)gBG，其在緩沖為pH5.6的梯度中對離心的穩(wěn)定性略差(表2)。表2G蛋白突變體的寡聚化和胰蛋白酶敏感性將鋪滿單層的BHK-21細(xì)胞用WT或突變體病毒感染，感染復(fù)數(shù)為10。感染后6小時，將細(xì)胞放射性標(biāo)記并如材料和方法章節(jié)所述追加。為進(jìn)行三聚體分析，將細(xì)胞在緩沖為pH5.6的2×MNT中裂解。然后將裂解物通過緩沖為相同pH的5-20％蔗糖密度梯度離心。從底部收集級分并將G蛋白用多克隆抗VSV抗血清免疫沉淀。為進(jìn)行胰蛋白酶敏感性分析，將細(xì)胞在緩沖為指定pH的1×MNT中裂解。裂解物通過離心澄清以除去細(xì)胞碎片和核。然后將上清用或不用TPCK-胰蛋白酶處理，并將G蛋白用多克隆抗VSV抗體免疫沉淀。免疫沉淀的蛋白通過SDS-PAGE解離，通過熒光照相觀測并通過掃描密度計(jì)量術(shù)定量。(+++)＝95％-100％抗性；(++)＝50％-95％抗性；(+)＝10％-50％抗性；(-)＝＜10％抗性。由于G蛋白在低pH對胰蛋白酶消化變得抗性，大概是由于通過酸性pH誘導(dǎo)的構(gòu)象變化所致(42)，因此這對確定近膜突變體的融合活性的變化是否由低pH誘導(dǎo)的構(gòu)象變化所致很重要。我們檢測了突變的和野生型G蛋白對胰蛋白酶消化的pH依賴性抗性(表2)。大多數(shù)突變體示出與野生型G蛋白觀測的結(jié)果相似的胰蛋白酶抗性圖譜。例如，在pH6.5，大約75-80％的突變體和野生型G蛋白對胰蛋白酶消化抗性。有兩個突變體，GD9和G10DAF在pH6.5對胰蛋白酶消化抗性略低(分別為48％和40％)，而突變體G(+9)gBG示出抗性模式中明顯改變，其在pH6.5對消化完全敏感而在pH5.6僅部分抗性。基于細(xì)胞-細(xì)胞融合分析的結(jié)果，我們預(yù)期編碼呈現(xiàn)野生型G融合活性的突變體的重組病毒與野生型VSV相似生長，而具有不可檢測的膜融合活性的那些病毒不用野生型G補(bǔ)足則不能生長。如所期望，所有點(diǎn)突變體，插入突變體G(AXB)，及序列反向突變體GSrev11和GSrev11-AA當(dāng)在BHK-21細(xì)胞上生長時產(chǎn)生與野生型VSV相似的效價。然而，令人驚奇地是示出細(xì)胞-細(xì)胞融合活性＞99％降低的一些病毒(例如GΔ9，GΔ13和GΔ9-10DAF)能在BHK-21細(xì)胞上生長和傳播，而不需要G蛋白的表達(dá)補(bǔ)足，但效價降低(圖26)。缺失突變體GΔ9提供的效價始終低于野生型病毒10倍，而缺失突變體GΔ13的效價低大約100倍。GΔ9-10DAF的效價低于野生型VSV效價的大約10,000倍。根據(jù)降低的病毒效價，由這些突變體形成噬斑需要48-60小時，而野生型VSV及其它突變體在感染后24-30小時產(chǎn)生噬斑(表3)。表3.突變體G病毒的生長特性為確定在GΔ9，GΔ13或GΔ9-10DAF的G基因中發(fā)生的任何補(bǔ)足突變在回收或隨后的擴(kuò)增期間是否可解釋在顯然無可檢測的膜融合活性情況中的生長能力，對這些病毒的完整G基因進(jìn)行RT-PCR測序。除了那些特異性導(dǎo)入的突變之外，未檢測到其它突變，這表明病毒的表型是由于設(shè)計(jì)的突變所致。剩余的突變體，包括G10DAF，G(+9)gBG和ΔF440-N449，是無感染性的及若不與野生型G蛋白共表達(dá)則不能在BHK-21細(xì)胞中生長，這與其缺少細(xì)胞-細(xì)胞融合活性一致。感染性的缺乏不是由于摻入病毒體中G蛋白量的差異所致，因?yàn)樗型蛔兊腉蛋白均在與WT蛋白相似的水平摻入(圖27)。實(shí)施例8與細(xì)胞結(jié)合的病毒材料和方法基本如述進(jìn)行出芽分析(46)。將于35mm平板中鋪滿的BHK-21細(xì)胞用各個突變體病毒感染，感染復(fù)數(shù)為10。在吸附后，用無血清的DMEM(SF-DMEM)漂洗平板兩次并在SF-DMEM中搖動洗滌兩次除去剩余接種物，每次洗滌均在37℃進(jìn)行5分鐘。然后將細(xì)胞在37℃于2ml的SF-DMEM中保溫。保溫16小時后，收獲上清并通過在1,250×g離心10分鐘而澄清。使用等份上清通過噬斑分析確定病毒效價。通過20％蔗糖墊在45,000rpm離心35分鐘從剩余的1.5ml上清中沉淀病毒體。將病毒沉淀重懸于50ml還原樣品緩沖液中。將每個樣品的1/5(10ml)通過在10％聚丙烯酰胺凝膠上電泳而解離。將凝膠用考馬斯(GELCODE-blue，PIERCECo.)根據(jù)廠商指導(dǎo)染色。將凝膠脫色并使用Nikon數(shù)碼相機(jī)用35-80mmNikkor鏡頭照相。使用ImageQuant分析軟件(MolecularDynamics)進(jìn)行病毒蛋白質(zhì)量化。病毒產(chǎn)量通過測定N蛋白條帶的密度測定。結(jié)果一些突變體中膜融合活性的降低或缺乏以及病毒感染性的喪失的一個解釋是突變對G蛋白與細(xì)胞結(jié)合的能力有影響。為確定突變是否影響病毒結(jié)合，將放射標(biāo)記的病毒體與BHK-21細(xì)胞在緩沖為pH7.0或pH5.9的結(jié)合培養(yǎng)基中保溫。在冰上進(jìn)行結(jié)合以防止病毒體的胞吞以及在暴露于低pH后防止病毒包膜與細(xì)胞膜的融合。VSV結(jié)合在酸性pH下增強(qiáng)(8，47)。檢測的所有突變體，除了GΔ13和ΔF440-N449之外，在pH7.0和pH5.9均與野生型VSV相似地與細(xì)胞結(jié)合(圖28)。與WT相比，GΔ13和ΔF440-N449在pH7.0一致地提供提高2倍的結(jié)合；然而，在pH5.9，GΔ13結(jié)合比野生型VSV低大約10％，而ΔF440-N449結(jié)合與野生型病毒相比降低50％(圖28)。這些數(shù)據(jù)表明在F440和V454之間的區(qū)域中的殘基引起病毒結(jié)合，結(jié)合量降低也許部分是由于這些突變體的膜融合活性缺陷所致。插入來自DAF(G10DAF，GΔ9-10DAF)的10個氨基酸或者來自HSVgB的9個氨基酸不影響結(jié)合，表明TM和胞外域之間的殘基間隔對結(jié)合不重要。基于這些結(jié)果，看來G10DAF，G(+9)gBG和GΔ9-10DAF的融合活性和病毒感染性的缺陷很可能在結(jié)合后步驟。除了影響膜融合活性之外，突變還減少從細(xì)胞中釋放的病毒量。為確定GΔ9，GΔ13或GΔ9-10DAF所觀測的病毒效價降低是否由于病毒出芽減少所致，我們確定了每個病毒的特異性感染性，這以病毒效價和與WT病毒相比釋放的病毒相對量的比率計(jì)算。病毒效價降低的所有這三種突變體從WT感染的細(xì)胞中均產(chǎn)生60-90％的病毒量。因此，這些突變體在培養(yǎng)物中傳播的能力缺陷主要是由于膜融合活性而不是病毒出芽的缺陷所致。實(shí)施例9表達(dá)IL-12F的重組VSV-ΔG材料和方法使用如下質(zhì)粒通過反向遺傳學(xué)產(chǎn)生重組VSV-ΔGpBS-N，pBS-P，pBS-L和pBS-G(編碼指定的VSV蛋白的基于pBluescipt的質(zhì)粒(48))。質(zhì)粒pVSVΔG-PL是基于Bluescript的表達(dá)VSV-ΔG的反基因組RNA的質(zhì)粒，其中G蛋白的編碼區(qū)已經(jīng)用一個多接頭置換(49)。質(zhì)粒pCAGGS-GIND是編碼VSVG蛋白的Indiana血清型(GIND)的基于pCAGGS的質(zhì)粒。IL-12F構(gòu)建體得自Dr.RichardMulligan(HarvardUniversity)，作為pSFG-mIL12.p40.L.Δ.p35的一個成分(50)。將IL-12F構(gòu)建體從親代質(zhì)粒中除去并以SmaI/SmaI片段克隆入BluescriptSK(Strategene，LaJolla，CA)中，隨后以XhoI/EagI片段克隆入pVSVΔG-PL中以產(chǎn)生pVSVΔG-IL12F。使用前述反向遺傳學(xué)策略回收表達(dá)IL-12F蛋白的重組VSV-ΔG[Takada，1997#1055；Robison，2000#1057]。這個回收系統(tǒng)基于在合適的宿主細(xì)胞中重組反基因組RNA的合成與VSV的結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)的聯(lián)合。編碼每個需要的VSV的結(jié)構(gòu)蛋白(N，P，L和G)和重組反基因組序列的基因在T7啟動子的控制下在單獨(dú)的基于Bluescript的質(zhì)粒上編碼；重組反基因組質(zhì)粒稱為pVSVΔG-IL12F。簡而言之，將BHK-21細(xì)胞(預(yù)先用表達(dá)T7聚合酶的重組痘苗病毒感染，vTF7-3)分別與編碼VSV的N，P，L和G蛋白的基于Bluescript的質(zhì)粒以及編碼反基因組的質(zhì)粒(pVSVΔG-IL12F)共轉(zhuǎn)染，比率為3∶5∶1∶8∶5。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在無血清的DMEM(DMEM-0)中保溫5小時，然后在補(bǔ)加10％FCS的DMEM(DMEM-10)中保溫48小時。收集培養(yǎng)上清，過濾(0.2μm)以除去痘苗病毒體，然后覆蓋在已經(jīng)用pCAGGS-GIND轉(zhuǎn)染的新鮮BHK-21細(xì)胞上。由于重組病毒不產(chǎn)生G蛋白，因此必須補(bǔ)給以便新出芽的病毒體是感染性的。然后將重組病毒進(jìn)行噬斑純化，擴(kuò)增及在G補(bǔ)足的BHK-21細(xì)胞上滴定。BHK-21細(xì)胞用G補(bǔ)足的VSVΔG-IL12F感染(MOI＝5)并在37℃在DMEM-0中培養(yǎng)17小時。收集含有IL-12F蛋白的培養(yǎng)上清并在100,000×g在20％以上的蔗糖離心以除去ΔG病毒體。澄清的上清用三種改變的無菌PBS透析，過濾滅菌并在-85℃貯存。VSVΔG-IL-12F感染的BHK細(xì)胞培養(yǎng)上清的蛋白質(zhì)成分以及純化的病毒制品通過SDS-PAGE(10％)分離，使用如前述但加以修改的程序進(jìn)行(51)。分離的蛋白質(zhì)通過用考馬斯亮藍(lán)(SigmaChemicalCo.，St.Louis，MO)染色進(jìn)行觀測。使用如前所述(52)并加以修改的方法進(jìn)行Western分析。簡而言之，將通過10％SDS-PAGE分離的蛋白質(zhì)經(jīng)電泳移至硝酸纖維膜，然后用IL-12-特異性mAb(C17.8.20.15)探查。在用TBST洗滌幾次后，將膜用抗大鼠Ig過氧化物酶(SigmaChemicalCo)探查。未結(jié)合的二級Ab通過用TBST洗滌而除去，與膜結(jié)合的二級抗體使用RenaissanceWesternBlotChemiluminescence試劑系統(tǒng)(NENLifeScienceProducts，Inc.Boston，MA)檢測。結(jié)果使用反向遺傳學(xué)方法，我們構(gòu)建了一種復(fù)制受限的皰疹性口腔炎病毒(VSV-ΔG)，其在復(fù)制周期期間表達(dá)大量的vIL-12F。編碼IL-12F的cDNA最初由Dr.RichardMulligan及其同事構(gòu)建(50)，如圖28A所示。重組VSVΔG-IL12F的生產(chǎn)通過重組痘苗病毒(表達(dá)T7)感染的BHK細(xì)胞與編碼VSVN，P，G和L蛋白的質(zhì)粒(均在T7啟動子控制下)以及編碼重組VSV反基因組的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染而實(shí)現(xiàn)。圖28B示出重組VSVΔG-IL12F的組構(gòu)(organization)，其中反基因組質(zhì)粒的G編碼區(qū)已經(jīng)用IL-12F編碼區(qū)置換。將回收自共轉(zhuǎn)染的BHK細(xì)胞的重組VSVΔG-IL12F進(jìn)行噬斑純化，擴(kuò)增并在表達(dá)G蛋白的BHK細(xì)胞上滴定。所得G補(bǔ)足的病毒可感染細(xì)胞并復(fù)制，但當(dāng)未提供G蛋白時則產(chǎn)生無感染性的“裸(bald)”病毒體。為產(chǎn)生vIL-12F，將BHK細(xì)胞用VSVΔG-IL12F感染(MOI-5)并在無蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)17小時，然后收集培養(yǎng)上清并通過離心澄清(病毒體通過20％蔗糖墊沉淀)。為評價感染的BHK細(xì)胞中vIL-12F的分泌，將澄清前和澄清后的上清及病毒沉淀樣品通過SDS-PAGE分析，隨后用考馬斯藍(lán)染色(圖29A)及用IL-12p40-特異性mAb進(jìn)行Western印跡分析(圖29B)。來自用VSVΔG-IL-12F感染的細(xì)胞的澄清前的上清(圖29A，泳道1)表明存在除了G蛋白之外的所有VSV蛋白，以及相應(yīng)于期望大小的vIL-12F(大約70kDa)的一個額外條帶(一對)。Western分析證實(shí)這個顯著的70kDa條帶確實(shí)是vIL-12F(圖29B，泳道1)。一旦上清中清除了病毒(圖29A，泳道2和3；圖29B，泳道2)，則澄清的上清中剩余的唯一的可檢測的蛋白質(zhì)是IL-12F。對病毒沉淀進(jìn)行分析表明由重組VSVΔG-IL12F基因組編碼的病毒蛋白(L，N和P，及M)是易于可檢測的(圖2A，泳道4)，但無可檢測數(shù)量的vIL-12F(圖29A，泳道4；圖29B，泳道3)。還應(yīng)指出的是如所期望的，不可檢測到相應(yīng)于VSVG蛋白(病毒感染性所需的表面糖蛋白)的條帶。這些結(jié)果清楚地表明從VSVΔG-IL12F感染的BHK細(xì)胞中產(chǎn)生并分泌出了大量的vIL-12F，并且澄清的培養(yǎng)上清的蛋白質(zhì)含量中＞95％的是vIL-12F。實(shí)施例10表達(dá)IL-12F的重組VSV-ΔG增強(qiáng)對利斯特菌感染的抗原特異性應(yīng)答材料和方法雌性C3HeB/FeJ小鼠得自Jackson實(shí)驗(yàn)室(BarHarbour，ME)。為進(jìn)行每個實(shí)驗(yàn)，使小鼠的年齡匹配，使用8-16周齡的小鼠。將小鼠圈養(yǎng)在小隔離(micro-isolator)籠子中，隨意供給實(shí)驗(yàn)室食品和水。抗體的特異性和來源如下PE-綴合的抗-CD5抗體(克隆53.7.3，參見(53))和抗-CD3抗體(克隆145-2C11，參見(54))；FITC-綴合的抗CD45R/B220抗體(克隆RA3-6B2，參見(55))，抗TCRβ鏈抗體(克隆H57-597，參見(56))，抗γ6TCR抗體(克隆GL3，參見(57，58))，抗CD4抗體(克隆RM4-5，參見59)及抗CD8抗體(克隆53-6.7，參見60)，所有同種型對照抗體均是商購的(Pharmingen，SanDiego，CA)；抗-IFN-γ雜交瘤R4-6A2抗體(AmericanTypeCultureCollection或ATCC，Rockville，MD，ATCC#HB170)Rockville，MD(61)和XMG1.2(62)由DNAX公司(PaloAlto，CA)提供；抗小鼠IL-12雜交瘤C17.8.20.15由Dr.G.Trinchieri提供(WistarInstitute，Philadelphia，PA)。將從實(shí)驗(yàn)室中細(xì)胞系產(chǎn)生的mAb通過蛋白A或蛋白G親和層析從培養(yǎng)上清中純化(63)。純化的抗體直接與生物素綴合以用于ELISA分析中，使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行(63)。各個抗原/細(xì)胞因子混合物的組分及應(yīng)用的免疫方案如結(jié)果章節(jié)所述。所有注射劑量均用無內(nèi)毒素的PBS制備成總體積1ml，經(jīng)腹膜內(nèi)給予。這些研究中使用的鼠rIL-12由GeneticsInstitute(Andover，MA)友好提供。實(shí)驗(yàn)性單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)感染通過經(jīng)i.p.注射亞致死劑量(靶劑量6×103)的活單核細(xì)胞增生利斯特氏菌菌株43251(ATCC)。將小鼠通過i.p.注射大劑量的活單核細(xì)胞增生利斯特氏菌進(jìn)行攻擊(針對C3HeB/FeJ小鼠靶劑量4-6×105，大約10×LD50)。將用于注射的利斯特氏菌在腦心浸液(BHI)肉湯(DifcoLaboratories，Detroit，MI)中在37℃通風(fēng)生長過夜。將細(xì)菌在PBS中洗滌3次，通過光密度確定濃度，經(jīng)在BHI瓊脂平板上集落計(jì)數(shù)證實(shí)。熱滅活的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(HKLM)通過將細(xì)菌在80℃保溫1小時而制備。測試熱滅活的細(xì)菌制品在BHI瓊脂平板上的存活力。在滅活之前，將細(xì)菌洗滌三次并重懸于無LPS的PBS中?？扇艿睦固厥暇鞍?SLP)如前所述制備(64)。簡而言之，將單核細(xì)胞增生利斯特氏菌在BHI肉湯中在37℃生長過夜。細(xì)菌通過離心沉淀，在PBS中洗滌，并重懸于小體積的PBS中。然后將該懸浮液進(jìn)行超聲處理，通過離心沉淀顆粒并丟棄，將上清用PBS透析。然后將上清利用等密度梯度離心在氯化銫上成條帶狀，鑒別含有蛋白質(zhì)的級分，收集并用PBS透析。腹膜溢泌物細(xì)胞(PEC)通過用補(bǔ)加0.06％BSA，10mMHepes緩沖液(IrvineScientific，SantaAnna，CA)，50U/ml青霉素，50μg/ml鏈霉素和10U/ml肝素的HBSS進(jìn)行腹膜灌洗得自小鼠。集合免疫組所有小鼠的細(xì)胞。巨噬細(xì)胞通過在37℃保溫于100mm組織培養(yǎng)物處理的平板(CorningInc.，Corning，NY)中的PEC(4×106/ml/孔)而分離。去除未吸附的細(xì)胞并集合，產(chǎn)生稱作塑料未吸附的腹膜溢泌物細(xì)胞(PNA)的細(xì)胞群。在腹膜灌洗后，通過無菌解剖取出脾。將PNA懸浮于(1.5×106/ml)培養(yǎng)基中(補(bǔ)加了10％FCS，5×10-5M2-ME，0.5mM丙酮酸鈉，10mMHepes緩沖液，50U/ml青霉素，50μg/ml鏈霉素和2mML-谷氨酰胺的RPMI1640)并在24孔平板(CorningInc.，Corning，NY)中加入預(yù)先測定的最佳劑量(如圖所示)的多種體外刺激物。用作體外刺激物的試劑如下ConA(2μg/ml)，購自SigmaChemicalCo.(St.Louis，MO)；HKLM(107/ml)及SLP(8μg/ml)。細(xì)胞培養(yǎng)物在37℃保溫24小時，然后將上清冷凍(-20℃)并保存以用于IL-2和INF-γ量化分析。使用前述的生物分析(65，66)，在PNA培養(yǎng)上清中定量IL-2。簡而言之，將PNA培養(yǎng)物的上清連同于總體積為200μl的培養(yǎng)基中的1×104HT-2細(xì)胞(IL-2依賴性T細(xì)胞系)一起移至96孔組織培養(yǎng)平板中，并在37℃保溫。培養(yǎng)24小時后加入[3H]胸苷(1μCi/孔)，6-18小時后收獲細(xì)胞至玻璃纖維濾膜上，使用FiltermateCellHarvester(PackardInstrumentCo.，Inc.，DownersGrove，IL)收獲，并使用Matrix9600DirectBeta計(jì)數(shù)儀(PackardInstrumentCo.)計(jì)數(shù)。上清中IL-2濃度與得自含有不同濃度IL-2的孔的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)。IL-2標(biāo)準(zhǔn)的來源是來自P815-IL-2(67)培養(yǎng)上清；這個上清的IL-2濃度使用所述分析與人rIL-2(得自ImmunexCorp.；Seattle，WA)的已知濃度相對比而測定。典型地，這個分析線性為大約500U/ml，低檢測限度為大約5U/ml。所有分析均一式三份進(jìn)行，結(jié)果以一式三份樣品的平均值(±SD)表示。如Cherwinski等所述(62)，使用夾心(sandwich)ELISA分析于PNA培養(yǎng)物中測定IFN-γ。R4-6A2作為捕捉抗體，生物素?；腦MG1.2作為檢測抗體。使用鏈親和素-過氧化物酶(SigmaChemicalCo.)擴(kuò)增生物素信號，顯影緩沖液(于50mM檸檬酸鹽緩沖液中600μgABTS和0.02％過氧化氫)用于進(jìn)行分析。在405nm的吸光度使用SpectraMax340自動平板讀數(shù)器(MolecularDevices，Sunnyvale，CA)讀數(shù)。上清中IFN-γ的濃度與得自其中不同濃度的小鼠rIFN-γ(GenzymeCorp.，Cambridge，MA)被捕捉的孔的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)。典型地，該分析線性為大約120U/ml，低檢測限度為8U/ml。所有分析均一式三份進(jìn)行，結(jié)果以一式三份樣品的平均值(±SD)表示。如前述進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)(68，69)。簡而言之，將PNA(1-5×105)與25μl預(yù)先確定的最佳濃度的熒光染料綴合的mAb一起在冰上保溫30分鐘，用含有3％FCS和0.1％疊氮化鈉的PBS洗滌兩次，并用于PBS中的1％低聚甲醛固定。將樣品在FACScan(BectonDickinson&Co.，MountainView，CA)上分析，使用前向散射/側(cè)向散射門控以選擇進(jìn)行分析的淋巴細(xì)胞群。同種型匹配的對照Ig用于確定每個測試抗體的背景免疫熒光水平。結(jié)果已經(jīng)完好地建立了利斯特菌病(listeriosis)的鼠模型，是研究細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的最流行的系統(tǒng)。已經(jīng)充分證明了用亞致死劑量的活利斯特菌感染的小鼠迅速清除感染并留有長期的保護(hù)性利斯特菌免疫性(70-72)。相反，用高劑量的活利斯特菌接種小鼠導(dǎo)致全身性感染，特征在于細(xì)菌在脾和肝臟內(nèi)2-4天的未受控制的復(fù)制，最后在感染后4-10天之間死亡(71，73)。因?yàn)槠⒑透闻K內(nèi)細(xì)菌的數(shù)目與小鼠的免疫狀況負(fù)相關(guān)，因此在感染后2-4天這些器官中利斯特氏菌的計(jì)數(shù)是確定小鼠對利斯特氏菌感染的易感性的一種公認(rèn)的方法(74)。對利斯特氏菌的特異性獲得性免疫的特征在于脾和肝臟中的細(xì)菌負(fù)載與在易感小鼠中觀測的細(xì)菌負(fù)載相比呈2-4log10降低。還要注意到盡管已知HKLM(及其它利斯特氏菌亞基制品)當(dāng)單獨(dú)給予時免疫原性較差(75，76)，但這種抗原與一種有效的佐劑共同給予可導(dǎo)致保護(hù)性免疫應(yīng)答產(chǎn)生(68，69，77)。因此，除了作為研究細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性的模型之外，利斯特菌病的鼠模型也是評價疫苗配制品和免疫治療策略的效力的一種極佳模型。為評估vIL-12F的佐劑性，我們用PBS，109HKLM/10μgSLP(LMAg)+PBS，LMAg+0.5μgrIL-12，LMAg+0.5μgvIL-12F或LMAg+5.0μgvIL-12F在第0，5和15天對C3HeB/FeJ小鼠(5只/組)進(jìn)行免疫。在第20天處死小鼠并收集組織進(jìn)行分析。PEC通過灌洗收集并集合，制備PNA群，并將PNA在體外用一系列刺激物(培養(yǎng)基未進(jìn)一步刺激；ConA一種多克隆T細(xì)胞刺激物；及HKLM或SLP利斯特菌抗原制品)在預(yù)先確定的最佳劑量在37℃再刺激24小時。為測定免疫應(yīng)答性，分析來自這些培養(yǎng)物的無細(xì)胞上清以確定應(yīng)答指定的體外刺激物而由T細(xì)胞產(chǎn)生的IL-2(圖30A)和IFN-γ(圖30B)的量。如在先前的研究中所觀測的結(jié)果所示(68，69，77)，用LMAg+rIL-12(陽性對照)免疫的小鼠產(chǎn)生與用次致死“免疫”劑量的活利斯特菌感染的小鼠產(chǎn)生的相似的利斯特菌抗原特異性T細(xì)胞。也如所期望的，用單獨(dú)的PBS或用LMAg+PBS(陰性對照)免疫的小鼠不能產(chǎn)生任何可檢測的利斯特菌特異性T細(xì)胞應(yīng)答。來自接受LMAg+0.5μgvIL-12F或5.0μgvIL-12F疫苗制劑的小鼠T細(xì)胞反應(yīng)性的模式與LMAg+rIL-12(陽性對照)組的T細(xì)胞產(chǎn)生的模式非常相似。另外，由這兩個測試組產(chǎn)生的應(yīng)答呈現(xiàn)略微有些vIL-12F劑量依賴性；來自接受LMAg組合較高劑量vIL-12F的小鼠的T細(xì)胞在體外用利斯特菌抗原刺激后產(chǎn)生較大數(shù)量的IL-2和IFN-γ。與免疫刺激的一般狀況相關(guān)的這些發(fā)現(xiàn)是由來自每個免疫組的小鼠的脾的相對大小提示的。與兩個陰性對照處理組(PBS，LMAg+PBS)相比，在每個陽性對照組(LMAg+rIL-12)小鼠以及每個用LMAg和vIL-12F免疫的小鼠中觀測到脾的大小明顯增加(數(shù)據(jù)未示出)。另外，vIL-12F依賴性劑量應(yīng)答是明顯的，因?yàn)樵诮邮躄MAg+5.0μgvIL-12F的小鼠中觀測到的脾大比在接受較低劑量vIL-12F(LMAg+0.5μgIL-12F)的小鼠中觀測到的結(jié)果更明顯。這些結(jié)果表明vIL-12F在促進(jìn)對非免疫原性抗原混合物的免疫應(yīng)答的能力方面與天然的rIL-12相似。另一種測定用LMAg和vIL-12F免疫的小鼠的免疫狀況的方法是進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)，以鑒定每個免疫動物的腹膜腔中存在的細(xì)胞群(PNA)。對用抗CD5和抗CD45R/B220雙重染色的PNA進(jìn)行分析表明在用LMAg和rIL-12或vIL-12F免疫的小鼠中CD5+細(xì)胞(T細(xì)胞)的頻度明顯增加(3-4倍)伴隨CD45R/B220+(B細(xì)胞)和CD5lo/B220lo(B1B細(xì)胞)降低(與在陰性對照免疫組的小鼠中觀測的頻度相比；圖31A和31C)。為進(jìn)一步鑒定這些動物的CD3+腹膜細(xì)胞群，將PNA用抗CD3和抗αβTCR，抗γδTCR，抗CD4或者抗CD8雙重染色并進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)分析(圖31B)。如針對CD5染色模式所觀測到的結(jié)果，CD3染色模式表明腹膜淋巴細(xì)胞群內(nèi)CD3+細(xì)胞的頻度在接受LMAg和rIL-12或vIL-12F的動物中與接受陰性對照制劑的小鼠相比明顯較高(3-4fold)(圖31B和31D)。另外，接受LMAg和rIL-12或vIL-12F的小鼠表現(xiàn)為腹膜αβTCR+/CD4+細(xì)胞的頻度的選擇性增加(分別為圖31E和31F)。所報(bào)道的結(jié)果表明由共同給予LMAg和vIL-12F激發(fā)的腹膜細(xì)胞頻度中的改變與經(jīng)LMAg+rIL-12處理激發(fā)的改變非常相似。另外，本文中報(bào)道的接受LMAg+rIL-12(陽性對照)的小鼠表現(xiàn)的腹膜細(xì)胞頻度中的改變與先前的觀測和報(bào)道一致(68，69，77)。實(shí)施例11給予LMAg+vIL-12F授予長期的保護(hù)性利斯特菌免疫性材料和方法在從免疫/攻擊受體中無菌取出后，將每個脾/肝臟使用玻璃勻漿器(groundglasshomogenizer)勻漿。細(xì)胞通過用于總體積為10ml的PBS中的0.5％TritonX-100(SigmaChemicalCo.，St.Louis，MO)處理而破壞以釋放細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌。產(chǎn)生每個樣品的10倍系列稀釋液并將100μl每種稀釋液均勻涂布于BHI平板上，以確定這些器官中活利斯特菌的數(shù)量。結(jié)果為確定共同給予vIL-12F和典型的非免疫原性抗原是否授予一種保護(hù)性免疫應(yīng)答，將C3HeB/FeJ小鼠(5/組)用單獨(dú)的PBS，LMAg+PBS，5.0μgvIL-12F+PBS，LMAg+0.5μgvIL-12F或者LMAg+5.0μgvIL-12F在第0，5和15天免疫。另外一組小鼠在第0天接受一次次致死劑量的(6×103/小鼠或者0.12×LD50)活利斯特菌(利斯特菌感染的，陽性對照)；這組小鼠用作在從利斯特菌病回收后的典型獲得性免疫的基準(zhǔn)。在第45天，將小鼠用致死劑量(6.4×105或12.9×LD50)的活利斯特菌攻擊(i.p.)。在第49天處死小鼠，確定每只小鼠的脾(圖32A)和肝(圖32B)中的細(xì)菌負(fù)載。在接受LMAg+5.0μgvIL-12F的小鼠器官中觀測到的細(xì)菌負(fù)載與PBS對照組相比明顯減少(在脾和肝臟中分別減少2.72和4.12log10)。事實(shí)上，這些結(jié)果與在接受免疫劑量的活利斯特菌的動物(陽性對照組)中觀測的結(jié)果相似，其中動物表現(xiàn)為其脾和肝臟中的細(xì)菌負(fù)載分別減少3.98和2.93log10。這些結(jié)果表明用LMAg+5.0μgvIL-12F免疫的小鼠產(chǎn)生一種保護(hù)性利斯特菌特異性免疫應(yīng)答。用LMAg+0.5μgvIL-12F免疫表現(xiàn)為促進(jìn)部分保護(hù)性免疫應(yīng)答，這通過每只動物的脾和肝臟中的細(xì)菌負(fù)載的適度減少(分別減少1.41和2.90log10)證實(shí)。如所期望的，在用LMAg+PBS(分別減少0.37和0.45log10)或vIL-12F+PBS(分別減少0.08和0.56log10)免疫的小鼠的脾和肝臟中觀測到細(xì)菌負(fù)載減少很少或不減少。這個實(shí)驗(yàn)中觀測到的保護(hù)性免疫性(和vIL-12F依賴性劑量應(yīng)答)與在用LMAg+vIL-12F免疫的小鼠中利斯特菌特異性T細(xì)胞的存在(通過體外再刺激的腹膜淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的IL-2和IFN-γ而表明)非常相關(guān)。為確定用LMAg+vIL-12F免疫授予的保護(hù)性免疫性是否是長期的，將C3Heb/FeJ小鼠(5只/組)用LMAg+5.0μgvIL-12F或者合適的對照制劑在第0，5和15天免疫。另一組小鼠在第0天接受單一免疫劑量(6×103/小鼠或0.12×LD50)的活單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(利斯特菌感染的，陽性對照)。在給予最后的加強(qiáng)免疫之后3個月(第120天)，每只小鼠接受(i.p.)大攻擊劑量(3.8×105或7.6×LD50)的活利斯特氏菌。4天后(第124天)，處死小鼠并定量每只小鼠的脾和肝臟中的細(xì)菌負(fù)載以測定對單核細(xì)胞增生利斯特氏菌的易感性。與在上述短期保護(hù)性免疫性試驗(yàn)中觀測到的結(jié)果(圖33)相似，在用LMAg+vIL-12F(分別減少1.84和2.23log10)或免疫劑量的活利斯特菌(分別減少2.55和1.61log10)免疫的小鼠的脾和肝臟中觀測到的細(xì)菌負(fù)載明顯減少(與PBS處理組相比)，但在單獨(dú)用LMAg或vIL-12F免疫的那些小鼠中則否(圖33)。這些結(jié)果表明用LMAg+vIL-12F免疫授予與用次致死劑量活利斯特菌感染激發(fā)相似的長期保護(hù)性免疫性。實(shí)施例12rVSV-DsRed呈現(xiàn)在體外抗C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤的強(qiáng)胞毒性活性材料與方法將C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(AmercianTypeCultureCollection，Manassas，VA)在37℃，5％CO2條件下，于補(bǔ)加了15％熱滅活的馬血清，2.5％熱滅活的胎牛血清，100i.u./ml青霉素和1D0μg/ml鏈霉素的Hams/F12中保持單層培養(yǎng)。將C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系用表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的pFB逆轉(zhuǎn)錄病毒(Stratagene，LaJolla，CA)穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)，以進(jìn)行增強(qiáng)的視分析(visualanalysis)。將用GFP穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)分選以產(chǎn)生均勻表達(dá)高水平GFP的細(xì)胞群。為制備種植于切片培養(yǎng)物上的細(xì)胞，將指數(shù)生長的細(xì)胞通過EDTA/胰蛋白酶在37℃處理5分鐘而收獲。胰蛋白酶消化通過用上述完全培養(yǎng)基終止并將細(xì)胞在1000RPM離心5分鐘。將沉淀重懸于無菌磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中，并使用錐蟲藍(lán)染色方法計(jì)數(shù)。然后將沉淀重懸于PBS中，濃度為3×104細(xì)胞/μl，并置于冰上直至種植于切片培養(yǎng)物上。為跟蹤實(shí)時病毒感染，我們構(gòu)建了表達(dá)紅色熒光蛋白DsRed的cDNA的rVSV，DsRed是衍生自有色的海葵(seaanemone)-Discosomasp.的一種可商購的色蛋白(BDBiosciences-Clontech)。將DsRed蛋白的cDNA從親代質(zhì)粒中切下并亞克隆入pVSV-MCS2.6的多克隆位點(diǎn)中，pVSV-MCS2.6是前述pVSV-ΔG-GSHA/GFP的親代載體(3)?；厥账弥亟M病毒rVSV-DsRed并使用我們實(shí)驗(yàn)室中預(yù)先確定的及別處所述的標(biāo)準(zhǔn)方案鑒定(78)。為構(gòu)建rVSV-ΔG-DsRed，我們將DsRed的cDNA亞克隆入位于L基因上游的pVSV-ΔG-PL31的多克隆位點(diǎn)中。然后使用前述方法回收重組病毒rVSV-ΔG-DsRed(3)。由于ΔG-DsRed不編碼病毒糖蛋白，因此將病毒在瞬時表達(dá)VSVG蛋白的細(xì)胞中增殖。因此，細(xì)胞的感染利用VSVG蛋白補(bǔ)足的病毒。將于補(bǔ)加了100U/ml青霉素和100μg鏈霉素，15％馬血清和2.5％胎牛血清的總體積為100μl的Hams/F12培養(yǎng)基中C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞以30％，60％和90％鋪滿率一式三份鋪板于96孔平底平板中。將細(xì)胞在37℃保溫過夜以進(jìn)行吸附。將培養(yǎng)物用不同量(101-105pfu)的rVSV-DsRed接種。加入病毒接種物后，在感染后4，8，24，36，48，72和96小時使用CeilTiter96R非放射性細(xì)胞增殖分析(G5421，Promega，Madison，WI)分析細(xì)胞死亡情況。在這個分析中，將化合物MTS[(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基(sulfonphenyl))2H四氮唑(Tetrozolium)]與電子耦合試劑吩嗪硫酸甲酯以20∶1的比率混和，并加入96孔平板培養(yǎng)物中。MTS試劑通過活細(xì)胞被轉(zhuǎn)變?yōu)樵诖x活性的細(xì)胞中通過脫氫酶作用而水溶性的甲。因此活細(xì)胞的數(shù)目與產(chǎn)生的甲量直接成比例，在490nm讀數(shù)。在每個時間點(diǎn)培養(yǎng)物中存在的活細(xì)胞的百分比通過在每種條件下得自MTS分析的490nm吸光度數(shù)值與未處理的對照細(xì)胞對比而計(jì)算，使用LabSystemsMultiskanBiochromaticElisa平板讀數(shù)器(Vienna，Virginia)進(jìn)行。所有描述的數(shù)值代表的是三個數(shù)據(jù)點(diǎn)的平均值。結(jié)果為證實(shí)C6-GFP神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對編碼DsRed的rVSV-wt感染易感，我們用101-105pfu量的病毒感染于6孔平皿中生長的細(xì)胞。圖33示出在105pfu的情況中C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤的感染時程。大多數(shù)細(xì)胞示出VSV感染的特征性致細(xì)胞病變作用，即細(xì)胞變圓及細(xì)胞在感染后24小時死亡。大于95％的細(xì)胞在48小時在平皿中浮起(liftoff)。用較低的病毒接種體感染產(chǎn)生相似的致細(xì)胞病變作用，但具有較低的動力學(xué)(數(shù)據(jù)未示出)。這些結(jié)果表明C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對rVSV-DsRed感染敏感。為更好地量化VSV對C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤的胞毒性程度及更特異性闡述時程，我們使用體外胞毒性分析。將C6-GFP神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞在30％，60％和90％鋪滿率鋪板于96孔平底平板上，并用101-105pfu范圍內(nèi)不同量的rVSV-DsRed感染。在接種后4，8，24，36，48，72和96小時使用CellTiter非放射性細(xì)胞增殖測定分析細(xì)胞死亡情況。如圖33所示，不管病毒效價如何，rVSV-DsRed導(dǎo)致在72小時內(nèi)大約90％細(xì)胞死亡。這個結(jié)果與當(dāng)細(xì)胞在30％和60％鋪滿率鋪板時的結(jié)果相似(數(shù)據(jù)未示出)。概括而言，rVSV-DsRed示出對大鼠C6-GFP神經(jīng)膠質(zhì)瘤極佳的體外胞毒性活性，不管細(xì)胞密度和病毒接種體的量如何。實(shí)施例13研究基于VSV的抗神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療的效力和毒性的一種器官型切片-C6-GFP共培養(yǎng)物系統(tǒng)材料和方法器官型腦切片培養(yǎng)方法根據(jù)PlenzandKitai(79)介紹的方法加以改進(jìn)。將1-2日齡Sprague-Dawley大鼠仔斬首，迅速取出腦，在4℃下保存在含有0.5％右旋糖的Gey′s平衡鹽溶液(G9779，Sigma-AldrichCorp.，St.Louis，MO)中。在Gey′s/右旋糖溶液中于振動切片機(jī)上制備冠狀(coronal)切片，其中紋狀體和黑質(zhì)切片厚度為500微米，皮層為400微米。在解剖顯微鏡下切割具有感興趣區(qū)域的切片。將皮層、紋狀體以及黑質(zhì)密部切成0.5-1mm大小，隨后置于Millicellcultureinsert(PICM03050，MilliporeCorp.，Billerica，MA)上并浸入在蓋玻片上的10微升雞血漿(P3266，Sigma-AldrichCorp.，St.Louis，MO)中。在將組織小心排列在insert上之后，加入于10微升Gey′s/右旋糖溶液中的0.5單位牛凝血酶(T6634，Sigma-AldrichCorp.，St.Louis，MO)并與蓋玻片上的雞血漿混合。然后將具有組織的蓋玻片放進(jìn)培養(yǎng)試管(156758，NalgeNuncInternational，Rochester，NY)中，向每一試管中加入750微升保溫培養(yǎng)基，其具有如下成分(全部來自InvitrogenCorp.，Carlsbad，CA)50％基礎(chǔ)培養(yǎng)基Eagle(BME)(21010-046)，25％Hanks′平衡鹽溶液(HBSS)(24020-125)，25％馬血清(26050-070)，1mML-谷氨酰胺(25030-081)和0.5％右旋糖(15023-021)。然后將試管在以0.5RPM速度旋轉(zhuǎn)的傳送帶上于35℃保溫。培養(yǎng)72小時后，向培養(yǎng)基中加入有絲分裂抑制劑混合物，其由各4.4μM的胞嘧啶-α-D-阿拉伯呋喃糖苷、尿苷和5-氟-2′-脫氧尿苷組成。24小時后除去該混合物，并用750微升新鮮培養(yǎng)基更換。之后一周完全更換培養(yǎng)基兩次。培養(yǎng)3周后將切片用于實(shí)驗(yàn)。為了產(chǎn)生切片-C6-GFP神經(jīng)膠質(zhì)瘤共培養(yǎng)物，將5微升體積中的150,000個GFP-陽性C6大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞在無菌條件下接種到切片上。將培養(yǎng)試管不加培養(yǎng)基水平放置在溫箱中30分鐘。然后更換培養(yǎng)基，將試管繼續(xù)放置在水平位置2小時，之后重新在傳送帶上旋轉(zhuǎn)。用Olympus熒光顯微鏡觀察培養(yǎng)中的GFP陽性C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長并用數(shù)碼相機(jī)收集圖像。用104噬斑形成單位(pfu)的rVSV-DsRed或106感染單位(IU)的感染性ΔG-DsRed病毒感染已經(jīng)在培養(yǎng)物中生長至少3周的具有或不具有C6-GFP神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的腦切片培養(yǎng)物。在傳送帶上于37℃使病毒吸附在切片上5小時。然后除去接種物，在培養(yǎng)基中洗切片，并將新鮮培養(yǎng)基加至切片。然后繼續(xù)保溫切片3天。對于接受IFN-β的切片，在病毒感染前18-20小時用1000U大鼠IFN-β預(yù)處理切片。然后在INF-β存在下如上所述吸附病毒。5小時后接種物用含有1000UIFN-β的新鮮培養(yǎng)基更換。切片在于磷酸緩沖液中的4％低聚甲醛中固定2小時并用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗3次，之后將組織固定在玻片上。培養(yǎng)的組織在熱平板上短暫地干燥，并儲存于4℃?zhèn)溆谩８鶕?jù)如下程序進(jìn)行免疫組織化學(xué)。玻片短暫地在PBS中洗滌；用3％氫過氧化物酶和10％甲醇處理20分鐘，隨后用PBS洗3次；在于PBS中的2％脫脂牛奶和0.3％Triton-X中保溫1小時；在含有3％驢血清和0.1％Triton-X的小鼠抗微管相關(guān)蛋白2(MAP-2，1∶500，M-4403，Sigma-AldrichCorp.，St.Louis，MO)或小鼠抗酪氨酸羥化酶(TH，1∶1,000，MAB318，ChemiconInternational，Temecula，CA)中于室溫保溫過夜；用PBS洗3次；在含有2％驢血清和0.1％Triton-X的CyTM2或CyTM3-綴合的AffiniPure驢抗小鼠IgG(1∶250，JacksonImmunoResearchLaboratories，Inc.，WestGrove，PA)中于室溫黑暗下保溫4小時；用PBS洗3次；通過分級乙醇脫水，用二甲苯脫色，并在DPX固定介質(zhì)(44581，F(xiàn)lukaBiochemika)中固定于蓋玻片上。用Bio-Rad共聚焦顯微鏡觀察MAP-2和TH免疫反應(yīng)性并用相關(guān)的共聚焦軟件收集數(shù)字圖像。切片中病毒感染程度用熒光顯微鏡通過跟蹤DsRed表達(dá)而進(jìn)行觀察。結(jié)果建立3周的器官型腦切片-神經(jīng)膠質(zhì)瘤共培養(yǎng)物(圖34)存活直至鋪板后6-8周，其呈現(xiàn)作為切片中成熟黑質(zhì)神經(jīng)元指征的可證實(shí)的TH免疫染色(圖34B)。圖35C證實(shí)這一器官型切片培養(yǎng)模型中的基礎(chǔ)MAP-2免疫反應(yīng)性，并作為非特異性神經(jīng)元標(biāo)記，其是神經(jīng)元完整性的靈敏的指示(80)。穩(wěn)定表達(dá)GFP的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞在切片組織之上自然生長并貫穿組織，這些細(xì)胞用熒光顯微鏡術(shù)實(shí)時跟蹤(圖34D和E)，其中在3-4天后，根據(jù)C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤接種物大小和腫瘤細(xì)胞生長速率，可以研究切片-神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)的多個方面，包括治療劑對于腫瘤消退和切片完整性的作用。野生型VSV對于切片培養(yǎng)系統(tǒng)中的正常組織是有毒性的。rVSV-DsRed表達(dá)一種紅色熒光蛋白，因此提供了一種區(qū)別于來自C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的GFP(綠色)熒光的信號，這個信號在病毒感染切片培養(yǎng)物期間被實(shí)時跟蹤。DsRed的基因被導(dǎo)入VSV基因組的G和L基因之間。在G和L基因之間插入一額外的外源基因?qū)τ诓《镜募?xì)胞溶解性質(zhì)或者復(fù)制效率沒有影響(81)。在感染后，通過免疫組織化學(xué)染色檢測切片培養(yǎng)物的MAP-2表達(dá)。rVSV-DsRed易于感染切片，并且到第3天，切片中的大多數(shù)細(xì)胞均被感染，這可以從組織中可見到紅色熒光而示出(圖35A)。不出所料，感染的切片的MAP-2免疫染色較弱，表示喪失了神經(jīng)元組織完整性(圖36A)。因此可復(fù)制的野生型VSV對于神經(jīng)元組織的細(xì)胞致病性非常強(qiáng)，其用作腫瘤消解劑將需要應(yīng)用抗病毒劑來保護(hù)正常組織對抗其毒性。已知VSV對于IFN-β的抗病毒作用非常敏感。多種譜系的惡性細(xì)胞在IFN信號傳導(dǎo)途徑中均有一或多項(xiàng)缺陷(82，83)，該信號傳導(dǎo)途徑最近用來開發(fā)VSV介導(dǎo)的細(xì)胞溶解活性的特異性腫瘤細(xì)胞靶向，同時正常組織不被影響(84，85)。因此，器官型切片共培養(yǎng)系統(tǒng)被用于確定IFN-β是否會保護(hù)正常神經(jīng)組織免于VSV感染，且同時對于培養(yǎng)物中的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞是毒性的。在VSV感染之前用2種不同濃度的IFN-β(100U或1000U)預(yù)處理切片培養(yǎng)物24小時。用1000UIFN-β預(yù)處理的培養(yǎng)物被保護(hù)而未被rVSV-DsRed感染(圖36)。在感染前用IFN-β處理后也顯著改善了MAP-2染色模式，表明VSV介導(dǎo)的對正常組織的細(xì)胞毒性顯著降低(圖37B)，并與IFN-β的抗細(xì)胞凋亡功能一致(86)。用100UIFN-β預(yù)處理是有利的，但是更高劑量會更具保護(hù)作用(數(shù)據(jù)未示出)。IFN-β單獨(dú)對于切片不是毒性的，由此提供了一種有吸引力的預(yù)處理策略與可復(fù)制野生型VSV聯(lián)合(圖37D)。神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長在成熟切片培養(yǎng)物上，發(fā)育成可測量腫瘤塊。用1000UIFN-β預(yù)處理24小時，隨后用rVSV-DsRed感染，導(dǎo)致C6-GFP神經(jīng)膠質(zhì)瘤腫瘤負(fù)載降低，同時不發(fā)生rVSV-DsRed對正常組織的感染(圖36)。因此，看起來rVSV-DsRed選擇性摧毀C6-GFP腫瘤。令人感興趣地，盡管在IFN-β預(yù)處理的共培養(yǎng)物中基本上未觀察到VSV對切片的明顯感染，但是切片仍然顯著地被損傷，這一點(diǎn)由異常MAP-2染色模式而指示(圖37C)。這表明盡管rVSV-DsRed能有效消除腫瘤細(xì)胞，仍然存在由不同于與病毒感染典型相關(guān)的機(jī)制介導(dǎo)的對切片組織的足夠的損傷。復(fù)制受限型(Replication-restricted)VSV-ΔG在腫瘤細(xì)胞溶解活性方面與野生型VSV類似，但是在對器官型切片-神經(jīng)膠質(zhì)瘤共培養(yǎng)系統(tǒng)的毒性方面比野生型VSV優(yōu)越。rVSV-ΔG是第二代復(fù)制受限型VSV。rVSV-ΔG缺少編碼病毒包膜蛋白的糖蛋白(G)基因。VSV的糖蛋白(G蛋白)介導(dǎo)病毒附著于細(xì)胞并在病毒內(nèi)吞作用后介導(dǎo)病毒包膜與內(nèi)體膜融合，因此是VSV感染性所需的。因此，為繁殖rVSV-ΔG載體，病毒必須生長在瞬時表達(dá)野生型G蛋白的細(xì)胞中。所產(chǎn)生的子代病毒在病毒包膜中含有瞬時表達(dá)的G蛋白(感染性ΔG病毒)并可以正常感染細(xì)胞；但是由于這些病毒的基因組缺乏G蛋白編碼區(qū)，從細(xì)胞釋放的不表達(dá)G蛋白的子代病毒體是非感染性的并且不能再感染相鄰細(xì)胞。因此，rVSV-ΔG載體僅經(jīng)歷一輪復(fù)制(例如復(fù)制受限型)。使用rVSV-ΔG的優(yōu)點(diǎn)是避免了復(fù)制型病毒如rVSV-DsRed那樣在一段時間產(chǎn)生的病毒顆粒的指數(shù)增加。為測試復(fù)制受限型VSV-ΔG在切片培養(yǎng)系統(tǒng)中的毒性，我們用編碼DsRed的修飾的ΔG病毒(ΔG-DsRed)接種培養(yǎng)物并在3天后檢查切片培養(yǎng)物。固定培養(yǎng)物并染色檢測MAP-2以確定感染后神經(jīng)元完整性。我們發(fā)現(xiàn)感染性ΔG-DsRed在第2天以與在rVSV-DsRed中所見相類似方式易于感染切片(圖39A)。令人感興趣地，盡管由ΔG-DsRed產(chǎn)生顯著感染，但是MAP-2免疫反應(yīng)性仍保持相對完整(圖40A)。如所預(yù)測的，當(dāng)切片用IFN-β預(yù)處理時極少或未觀察到ΔG-DsRed所致感染(圖39B)，并且MAP-2染色與未感染培養(yǎng)物中所見(圖40B)類似。在成熟切片上生長4天的C6-GFP神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞產(chǎn)生可測量大小的腫瘤塊，但是證實(shí)用IFN-β以1000U濃度預(yù)處理24小時隨后接種106IU感染性ΔG-DsRed病毒在與ΔG-DsRed病毒保溫3天后腫瘤負(fù)載顯著降低(圖39)。盡管由非常優(yōu)異的抗腫瘤的細(xì)胞溶解活性，但是切片培養(yǎng)物本身的正常細(xì)胞幾乎不發(fā)生感染(圖39D)。因此，IFN-β預(yù)處理隨后用感染性ΔG-DsRed感染選擇性摧毀C6-GFP神經(jīng)膠質(zhì)瘤而不感染正常組織，這一點(diǎn)進(jìn)一步由MAP-2免疫反應(yīng)性結(jié)果證實(shí)(圖39C)。因此，使用復(fù)制受限型ΔG-VSV聯(lián)合IFN-β預(yù)處理是治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的一種有吸引力的聯(lián)合療法。實(shí)施例14基于VSV的抗神經(jīng)膠質(zhì)瘤療法的功效材料和方法用可植入導(dǎo)螺桿系統(tǒng)(implatableguide-screwsystem)(87)將細(xì)胞和病毒注射進(jìn)合適的解剖學(xué)顱內(nèi)區(qū)域。使用5-7周齡、體重為250-350克的成年雌性Sprague-Dawley大鼠。用氯胺酮/甲苯噻嗪溶液(200mg氯胺酮、20mg甲苯噻嗪于17ml鹽水中)以0.15mg/10g體重的劑量腹膜內(nèi)麻醉動物。將每只大鼠的顱區(qū)域剃除毛發(fā)并用povidine-iodine清潔。動物固定在立體定位框架中。產(chǎn)生一約5mm長的中線切口，移動顱外組織以定位矢狀縫和前囟縫。用鉆頭距離中線3mm沿前囟縫產(chǎn)生一個毛邊小洞。將一個小導(dǎo)管(PlasticsOne)插進(jìn)該毛邊小洞。用Hamilton注射器在5分鐘時間內(nèi)將10微升體積的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)單獨(dú)或者重懸于PBS中的1×105個GFP陽性C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞注射進(jìn)5mm深度。當(dāng)?shù)竭_(dá)位置后，插入導(dǎo)管塞子以塞住小洞。每日觀察動物的感染跡象或者由腫瘤生長所致的神經(jīng)功能障礙。在10天間隔后，大鼠用一劑無菌PBS或用rVSV-RFP處理?；陲B內(nèi)腫瘤的預(yù)計(jì)大小選擇給予rVSV-RFP的時間點(diǎn)。這一時間點(diǎn)應(yīng)該是通過神經(jīng)成像可以檢測到腫瘤但還沒有發(fā)生顯著的神經(jīng)功能障礙的時間點(diǎn)。在顱內(nèi)給予病毒之前麻醉大鼠。先前的切口被重新切開，移動顱外組織以便放置導(dǎo)管。除去塞子，以10微升體積給予PBS或VSV。這使得病毒直接進(jìn)入瘤床。還就固有毒性和減弱VSV毒性方面評價了體內(nèi)IFN-β預(yù)處理。結(jié)果GFP陽性C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞通過預(yù)先植入的導(dǎo)管被輸送到大鼠的額葉。在保溫一段規(guī)定時間后，用導(dǎo)管將病毒輸送至瘤床(tumorbed)。在處理后選定時間點(diǎn)處死動物進(jìn)行分析。組織病理學(xué)研究確定細(xì)胞減滅程度和由病毒導(dǎo)致的CNS毒性。另外，使用如神經(jīng)功能障礙和存活率等參數(shù)作為評判結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)。因此，證實(shí)了VSV在活CNS背景下摧毀癌細(xì)胞且不顯著損傷正常組織的能力。因?yàn)槭褂昧丝蓮?fù)制病毒，這種病毒在腫瘤細(xì)胞被感染后會產(chǎn)生病毒負(fù)載的指數(shù)增加并釋放子代病毒，所以一次劑量足以治療腫瘤。這一周期可以持續(xù)進(jìn)行直至大多數(shù)腫瘤被摧毀，此時免疫系統(tǒng)會清除剩余的病毒。但是，導(dǎo)管系統(tǒng)使得可以在一段時間內(nèi)給予多次劑量，因此再次給予劑量是根除腫瘤的另一種可能做法。大鼠顱內(nèi)神經(jīng)膠質(zhì)瘤模型可能會提供有變化的結(jié)果，因?yàn)閳?bào)道了80％的成功率，在不同組之間在60-100％范圍內(nèi)變化。使用免疫缺陷動物(即裸大鼠)可以增加“腫瘤攜帶(rumortake)”成功率至接近100％并因此可以采用，但是應(yīng)注意到免疫系統(tǒng)是這些研究的重要部分，因此它們單獨(dú)不是用于研究的合適模型。使用免疫活性Sprague-Dawley大鼠的顱內(nèi)神經(jīng)膠質(zhì)瘤模型的大量樣本可以對結(jié)果有正確解讀。動物根據(jù)表4被分配至各組。表4*劑量或時間點(diǎn)將被確定，＝是指從初次接種腫瘤細(xì)胞開始的歷時時間，是指進(jìn)行分析時的時間點(diǎn)，H腫瘤細(xì)胞、對照Rx和VSVRx將以10微升的體積經(jīng)顱內(nèi)給予，Φ評價使用IFNα/β預(yù)處理的VSV保護(hù)(即給予劑量和時間點(diǎn))，劑量和時間點(diǎn)作為獲得的結(jié)果的函數(shù)。X代表處理對照組的天數(shù)并取決于動物展現(xiàn)的疾病癥狀。將直接注射進(jìn)腦中的VSV效果與僅用PBS的對照進(jìn)行了比較。觀察動物的腦炎跡象(嗜睡、進(jìn)食差、體重減輕等)并在根據(jù)試驗(yàn)性研究結(jié)果確定的規(guī)定時間后處死動物。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案制備組織。在深度麻醉下用肝素化鹽水、之后用4％低聚甲醛對大鼠進(jìn)行穿心灌流。取腦，于4℃在4％低聚甲醛中固定2小時。在低溫恒溫器中將腦切成20微米的切片。使用不同的技術(shù)檢查腦切片以尋找毒性跡象，檢查包括直接熒光顯微鏡術(shù)檢查VSV感染(監(jiān)測RFP熒光或用N蛋白特異性抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色)、蘇木精-伊紅染色觀察基礎(chǔ)神經(jīng)病理學(xué)、以及腫瘤和周圍實(shí)質(zhì)中細(xì)胞死亡的細(xì)胞凋亡研究。圖41示出了從含有顯著腫瘤負(fù)荷(burden)的對照大鼠獲得的數(shù)據(jù)。在初次腫瘤接種(給予病毒后7天)17天后，處死每個研究組的動物并分析腫瘤和周圍組織的組織病理學(xué)特征。對諸如腫瘤大小、是否存在中線移動(midlineshift)以及瘤床是否存在壞死等重要參數(shù)進(jìn)行了分析。另外，仔細(xì)觀察周圍正常組織以尋找與病毒相關(guān)的毒性跡象。進(jìn)行腦切片檢查以發(fā)現(xiàn)腫瘤生長證據(jù)，包括針對GFP的直接熒光顯微術(shù)、蘇木精-伊紅染色觀察基礎(chǔ)神經(jīng)病理學(xué)、針對特異腫瘤抗原的免疫細(xì)胞化學(xué)以及腫瘤和周圍實(shí)質(zhì)中細(xì)胞死亡的細(xì)胞凋亡研究。C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的GFP標(biāo)記使得可以非常靈敏地檢測和分析腫瘤塊和從初始接種位點(diǎn)離開的細(xì)胞微群體(圖42)。這一研究的一個重要方面是VSV能到達(dá)并靶向從腫瘤的原發(fā)部位逃離的細(xì)胞微群體的能力(圖42)。用于此研究的由C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞攜帶的GFP標(biāo)記使得能夠通過組織切片用激光掃描共聚焦顯微術(shù)檢測甚至非常小的細(xì)胞群體，從而在大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤模型中提供了給予rVSV的效果的全面圖畫。給予rVSV后的大鼠存活率也進(jìn)行了測定。大鼠根據(jù)表5用PBS或VSV進(jìn)行處理。表5*劑量或時間點(diǎn)根據(jù)試驗(yàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定，＝是指從初次接種腫瘤細(xì)胞開始的歷時時間，是指進(jìn)行分析時的時間點(diǎn)，H腫瘤細(xì)胞、對照Rx和VSVRx將以10微升的體積經(jīng)顱內(nèi)給予，Φ為基于試驗(yàn)結(jié)果開發(fā)使用IFNα/β預(yù)處理的VSV保護(hù)的方案動物無限期培養(yǎng)直至腫瘤戰(zhàn)勝了動物或者很明顯動物會存活。這時處死動物并如上分析是否存在任何腫瘤殘留。用VSV處理的動物的整體存活率與對照相比顯著增加。權(quán)利要求1.一種重組非致細(xì)胞病變的彈狀病毒，其包含彈狀病毒基因組的核酸，其中所述彈狀病毒基因組在編碼一種基質(zhì)蛋白(M)的區(qū)域內(nèi)包含一個缺失或突變。2.權(quán)利要求1的重組非致細(xì)胞病變的彈狀病毒，其在編碼糖蛋白(G)的一個區(qū)域內(nèi)進(jìn)一步包含一個缺失或突變。3.權(quán)利要求1的重組非致細(xì)胞病變的彈狀病毒，其進(jìn)一步包含一個調(diào)節(jié)元件。4.權(quán)利要求1的重組非致細(xì)胞病變的彈狀病毒，其中所述缺失或突變是在編碼所述基質(zhì)蛋白的N末端部分的區(qū)域內(nèi)。5.權(quán)利要求4的重組非致細(xì)胞病變的彈狀病毒，其中所述缺失或突變是在編碼所述基質(zhì)蛋白的N末端部分的區(qū)域內(nèi)，該區(qū)域編碼核定位序列(NLS)。6.權(quán)利要求5的重組非致細(xì)胞病變的彈狀病毒，其中所述突變編碼如下取代(a)在第33或51位用丙氨酸殘基取代甲硫氨酸殘基；或(b)在第226位用甘氨酸殘基取代絲氨酸殘基。7.權(quán)利要求1的重組非致細(xì)胞病變的彈狀病毒，其進(jìn)一步包含插入的編碼第二種多肽的一種異源核酸。8.權(quán)利要求7的重組非致細(xì)胞病變的彈狀病毒，其中所述第二種多肽是治療性多肽。9.權(quán)利要求7的重組非致細(xì)胞病變的彈狀病毒，其中所述第二種多肽是免疫原性的。10.權(quán)利要求1的重組非致細(xì)胞病變的彈狀病毒，其進(jìn)一步包含插入的編碼標(biāo)記多肽的一種異源核酸。11.權(quán)利要求10的重組非致細(xì)胞病變的彈狀病毒，其中所述標(biāo)記多肽是綠色熒光蛋白(GFP)，分泌型堿性磷酸酶，DS-紅色熒光蛋白，β-半乳糖苷酶或螢光素酶。12.權(quán)利要求1的重組非致細(xì)胞病變的彈狀病毒，其進(jìn)一步包含插入的編碼自殺基因的一種異源核酸。13.權(quán)利要求1的重組非致細(xì)胞病變的彈狀病毒，其進(jìn)一步包含插入的編碼細(xì)胞因子基因的一種異源核酸。14.權(quán)利要求13的重組非致細(xì)胞病變的彈狀病毒，其中所述細(xì)胞因子是白細(xì)胞介素2，白細(xì)胞介素4，白細(xì)胞介素12或γ-干擾素。15.權(quán)利要求1的重組非致細(xì)胞病變的彈狀病毒，其進(jìn)一步包含一種彈狀病毒G主干多肽。16.權(quán)利要求1的重組非致細(xì)胞病變的彈狀病毒，其中所述重組非致細(xì)胞病變的彈狀病毒被用作基因輸送載體或疫苗。17.權(quán)利要求1的重組非致細(xì)胞病變的彈狀病毒，其中所述彈狀病毒優(yōu)選對贅生性細(xì)胞具有致細(xì)胞病變性。18.權(quán)利要求1的重組非致細(xì)胞病變的彈狀病毒，其中所述彈狀病毒基因組是皰疹性口腔炎病毒(VSV)基因組。19.一種生產(chǎn)非致細(xì)胞病變的重組彈狀病毒的方法，所述重組彈狀病毒包含編碼在基質(zhì)蛋白(M)內(nèi)包括一個缺失或突變的彈狀病毒蛋白的遺傳修飾的核酸，所述方法包括如下步驟(A)在合適的細(xì)胞中插入一個編碼在基質(zhì)蛋白內(nèi)包括一個缺失或突變的彈狀病毒蛋白的多核苷酸序列，一個編碼標(biāo)記多肽的多核苷酸序列及一個至少包含含有彈狀病毒復(fù)制的順式作用信號的3’和5’彈狀病毒前導(dǎo)和尾隨區(qū)域的多順反子cDNA；(B)在選擇所述細(xì)胞的非致細(xì)胞病變表型的條件下培養(yǎng)細(xì)胞；(C)在允許重組彈狀病毒產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞；及(D)分離所述非致細(xì)胞病變的重組彈狀病毒。20.權(quán)利要求19的方法，其中所述非致細(xì)胞病變的重組彈狀病毒進(jìn)一步包含編碼第二種多肽的一種異源核酸序列。21.權(quán)利要求20的方法，其中所述第二種多肽是治療性多肽。22.權(quán)利要求21的方法，其中所述第二種多肽是免疫原性的。23.權(quán)利要求19的方法，其進(jìn)一步包括從所述分離的非致細(xì)胞病變的重組彈狀病毒中分離基因組RNA的步驟。24.權(quán)利要求23的方法，其中所述分離基因組RNA的步驟是使用RT-PCR進(jìn)行的。25.權(quán)利要求19的方法，其中所述合適的細(xì)胞選自嚙齒類動物細(xì)胞、靈長類動物細(xì)胞和人細(xì)胞。26.權(quán)利要求19的方法，其中所述缺失或突變位于所述基質(zhì)蛋白的N末端區(qū)域內(nèi)。27.權(quán)利要求26的方法，其中位于所述基質(zhì)蛋白的所述N末端區(qū)域內(nèi)的所述缺失或突變是核定位序列(NLS)的一部分。28.權(quán)利要求19的方法，其中所述突變是如下氨基酸取代(a)在第33或51位用丙氨酸殘基取代甲硫氨酸殘基；或者(b)在第226位用甘氨酸殘基取代絲氨酸殘基。29.權(quán)利要求19的方法，其中非致細(xì)胞病變的重組彈狀病毒是皰疹性口腔炎病毒(VSV)。30.一種分離的核酸分子，其包含編碼非致細(xì)胞病變的彈狀病毒的基因組的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列在編碼基質(zhì)蛋白(M)的基因內(nèi)具有一個缺失或突變。31.權(quán)利要求30的分離的核酸分子，其中所述非致細(xì)胞病變的彈狀病毒的基因組進(jìn)一步包含一個遺傳修飾的糖蛋白(G)。32.權(quán)利要求30的分離的核酸分子，其進(jìn)一步包含一個調(diào)節(jié)元件。33.權(quán)利要求30的分離的核酸分子，其中所述缺失或突變位于編碼所述基質(zhì)蛋白的N末端區(qū)域的區(qū)域內(nèi)。34.權(quán)利要求33的分離的核酸分子，其中所述缺失或突變位于編碼所述基質(zhì)蛋白的N末端區(qū)域的區(qū)域內(nèi)，該區(qū)域編碼核定位序列(NLS)。35.權(quán)利要求30的分離的核酸分子，其中所述突變編碼(a)在第33或51位取代甲硫氨酸殘基的丙氨酸殘基；或者(b)在第226位取代絲氨酸殘基的甘氨酸殘基。36.權(quán)利要求30的分離的核酸分子，進(jìn)一步包含插入編碼第二種多肽的一個異源核酸序列。37.權(quán)利要求36的分離的核酸分子，其中所述第二種多肽是治療性多肽。38.權(quán)利要求36的分離的核酸分子，其中所述第二種多肽是免疫原性的。39.權(quán)利要求30的分離的核酸分子，其進(jìn)一步包含插入編碼標(biāo)記多肽的一個異源核酸序列。40.權(quán)利要求39的分離的核酸分子，其中所述標(biāo)記多肽是綠色熒光蛋白，分泌型堿性磷酸酶，DS-紅色熒光蛋白，β-半乳糖苷酶或螢光素酶。41.權(quán)利要求30的分離的核酸分子，其進(jìn)一步包含插入編碼自殺基因的一個核酸序列。42.權(quán)利要求30的分離的核酸分子，其進(jìn)一步包含彈狀病毒G多肽。43.權(quán)利要求30的分離的核酸分子，其中所述基因組是皰疹性口腔炎病毒(VSV)基因組。44.一種包含權(quán)利要求30的分離的核酸分子的載體。45.一種重組彈狀病毒，其包含彈狀病毒基因組的核酸，其中所述彈狀病毒基因組在編碼彈狀病毒糖蛋白(G)的近膜胞外結(jié)構(gòu)域的區(qū)域內(nèi)包含一個缺失或突變。46.權(quán)利要求45的重組彈狀病毒，其中所述突變編碼如下取代(a)用丙氨酸殘基取代色氨酸殘基；(b)用丙氨酸殘基取代谷氨酸、甘氨酸和/或苯丙氨酸殘基；或者(c)用天冬氨酸和丙氨酸殘基取代谷氨酸、甘氨酸或苯丙氨酸殘基或其組合；或者(d)(a)-(c)中取代的任何組合。47.權(quán)利要求45的重組彈狀病毒，其中所述突變編碼如下缺失(a)編碼第449-461位氨基酸殘基的核苷酸或其片段；或(b)編碼第440-449位氨基酸殘基的核苷酸或其片段。48.權(quán)利要求45的重組彈狀病毒，其中所述突變是插入編碼衰變加速因子(DAF)的311-319位氨基酸殘基的核苷酸，其在彈狀病毒糖蛋白近膜胞外結(jié)構(gòu)域的絲氨酸殘基之間插入。49.權(quán)利要求45的重組彈狀病毒，其進(jìn)一步包含插入的編碼第二種多肽的一個異源核酸序列。50.權(quán)利要求49的重組彈狀病毒，其中所述第二種多肽是治療性多肽。51.權(quán)利要求49的重組彈狀病毒，其中所述第二種多肽是免疫原性的。52.權(quán)利要求45的重組彈狀病毒，其進(jìn)一步包含插入的編碼標(biāo)記多肽的一個異源核酸序列。53.權(quán)利要求52的重組彈狀病毒，其中所述標(biāo)記多肽是綠色熒光蛋白(GFP)，分泌型堿性磷酸酶，DS-紅色熒光蛋白，β-半乳糖苷酶或螢光素酶。54.權(quán)利要求45的重組彈狀病毒，其進(jìn)一步包含插入的編碼自殺基因的一個異源核酸序列。55.權(quán)利要求45的重組彈狀病毒，其進(jìn)一步包含插入的編碼細(xì)胞因子基因的一個異源核酸序列。56.權(quán)利要求55的重組彈狀病毒，其中所述細(xì)胞因子是白細(xì)胞介素2，白細(xì)胞介素4，白細(xì)胞介素12或γ-干擾素。57.權(quán)利要求45的重組彈狀病毒，其進(jìn)一步包含位于編碼基質(zhì)蛋白(M)的區(qū)域內(nèi)的一個缺失或突變。58.權(quán)利要求57的重組彈狀病毒，其中所述遺傳修飾的基質(zhì)蛋白在所述基質(zhì)蛋白的N末端區(qū)域內(nèi)包含一個突變。59.權(quán)利要求58的重組彈狀病毒，其中所述基質(zhì)蛋白的N末端區(qū)域內(nèi)的缺失或突變是核定位序列(NLS)的一部分。60.權(quán)利要求45的重組彈狀病毒，其進(jìn)一步包含一個調(diào)節(jié)元件。61.權(quán)利要求45的重組彈狀病毒，其中所述重組彈狀病毒用作基因輸送載體。62.權(quán)利要求45的重組彈狀病毒，所述重組彈狀病毒用作疫苗。63.權(quán)利要求56的重組彈狀病毒，其中所述彈狀病毒基因組是皰疹性口腔炎病毒(VSV)基因組。64.一種生產(chǎn)重組彈狀病毒的方法，所述重組彈狀病毒包含遺傳修飾的編碼在糖蛋白(G)的近膜胞外域內(nèi)包括一個缺失或突變的彈狀病毒蛋白的核酸，所述方法包括如下步驟(A)在合適的細(xì)胞內(nèi)插入編碼在糖蛋白(G)的近膜胞外域內(nèi)包括一個缺失或突變的彈狀病毒蛋白的一個多核苷酸序列，編碼標(biāo)記多肽的一個多核苷酸序列及至少包含含有彈狀病毒復(fù)制的順式作用信號的3’和5’彈狀病毒前導(dǎo)和尾隨區(qū)域的多順反子cDNA；(B)在允許重組彈狀病毒產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)細(xì)胞；及(C)分離所述重組彈狀病毒。65.權(quán)利要求64的方法，其進(jìn)一步包括在所述細(xì)胞中插入編碼第二種多肽的一個異源核酸序列。66.權(quán)利要求64的方法，其中所述第二種多肽是治療性多肽。67.權(quán)利要求64的方法，其中所述第二種多肽是免疫原性的。68.權(quán)利要求64的方法，其進(jìn)一步包括從分離的非致細(xì)胞病變的重組彈狀病毒中分離基因組RNA的步驟。69.權(quán)利要求68的方法，其中所述分離基因組RNA的步驟通過使用RT-PCR進(jìn)行。70.權(quán)利要求64的方法，其中所述合適的細(xì)胞選自嚙齒類動物細(xì)胞、靈長類動物細(xì)胞和人細(xì)胞。71.權(quán)利要求64的方法，其中所述糖蛋白(G)的近膜胞外域的突變編碼如下取代(a)用丙氨酸殘基取代色氨酸殘基；(b)用丙氨酸殘基取代谷氨酸、甘氨酸和/或苯丙氨酸殘基；或(c)用天冬氨酸和丙氨酸殘基取代谷氨酸、甘氨酸或苯丙氨酸殘基，或其組合；或(d)(a)-(c)中的取代的任何組合。72.權(quán)利要求64的方法，其中所述突變是如下的缺失(a)編碼第449-461位氨基酸殘基的核苷酸，或其片段；或(b)編碼第440-449位氨基酸殘基的核苷酸，或其片段。73.權(quán)利要求64的方法，其中所述突變是插入編碼衰變促進(jìn)因子(DAF)的第311-319位氨基酸殘基的核苷酸，其在彈狀病毒糖蛋白近膜胞外域的絲氨酸殘基之間插入。74.權(quán)利要求64的方法，其中非致細(xì)胞病變的重組彈狀病毒是皰疹性口腔炎病毒(VSV)。75.一種分離的核酸分子，其包含編碼彈狀病毒基因組的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列在編碼糖蛋白(G)的近膜胞外域的基因內(nèi)有一個缺失或突變。76.權(quán)利要求75的分離的核酸分子，其中所述糖蛋白(G)的近膜胞外域的突變包含如下取代(a)用丙氨酸殘基取代色氨酸殘基；(b)用丙氨酸殘基取代谷氨酸、甘氨酸和/或苯丙氨酸殘基；或者(c)用天冬氨酸和丙氨酸殘基取代谷氨酸、甘氨酸或苯丙氨酸殘基，或其組合；或者(d)(a)-(c)中的取代的任何組合。77.權(quán)利要求75的分離的核酸分子，其中所述突變是如下的缺失(a)編碼第449-461位氨基酸殘基的核苷酸，或其片段；或(b)編碼第440-449位氨基酸殘基的核苷酸，或其片段。78.權(quán)利要求75的分離的核酸分子，其中所述突變是插入編碼衰變促進(jìn)因子(DAF)的第311-319位氨基酸殘基的核苷酸，其在彈狀病毒糖蛋白近膜胞外域的絲氨酸殘基之間插入。79.權(quán)利要求75的分離的核酸分子，其中所述非致細(xì)胞病變的彈狀病毒的基因組進(jìn)一步包含一個遺傳修飾的基質(zhì)蛋白(M)。80.權(quán)利要求75的分離的核酸分子，其中所述缺失或突變位于編碼所述基質(zhì)蛋白的N末端的區(qū)域內(nèi)。81.權(quán)利要求80的分離的核酸分子，其中所述缺失或突變位于編碼核定位序列(NLS)的區(qū)域內(nèi)。82.權(quán)利要求75的分離的核酸分子，其中所述突變編碼如下取代(a)在第33或51位用丙氨酸殘基取代甲硫氨酸殘基；或者(b)在第226位用甘氨酸殘基取代絲氨酸殘基。83.權(quán)利要求75的分離的核酸分子，其進(jìn)一步包含一個調(diào)節(jié)元件。84.權(quán)利要求75的分離的核酸分子，其進(jìn)一步包含插入的編碼第二種多肽的一個異源核酸序列。85.權(quán)利要求84的分離的核酸分子，其中所述第二種多肽是治療性多肽或是免疫原性的。86.權(quán)利要求75的分離的核酸分子，其進(jìn)一步包含插入的編碼標(biāo)記多肽的一個異源核酸序列。87.權(quán)利要求86的分離的核酸分子，其中所述標(biāo)記多肽是綠色熒光蛋白，分泌型堿性磷酸酶，DS-紅色熒光蛋白，β-半乳糖苷酶或螢光素酶。88.權(quán)利要求75的分離的核酸分子，其進(jìn)一步包含插入的編碼自殺基因的一個核酸序列。89.權(quán)利要求75的分離的核酸分子，其進(jìn)一步包含一個融合促進(jìn)多肽或反受體。90.權(quán)利要求75的分離的核酸分子，其中所述基因組是皰疹性口腔炎病毒(VSV)基因組。91.一種包含權(quán)利要求75的分離的核酸分子的載體。92.一種治療患有與缺陷基因相關(guān)的疾病的個體的方法，包括給予所述個體的靶細(xì)胞一種治療有效量的重組非致細(xì)胞病變的彈狀病毒的步驟，其中所述彈狀病毒的基因組包括位于編碼基質(zhì)蛋白(M)的區(qū)域內(nèi)的一個缺失或突變和/或能在靶細(xì)胞內(nèi)部表達(dá)的一個異源基因，從而治療疾病。93.權(quán)利要求92的方法，其中所述靶細(xì)胞是上皮細(xì)胞，肺細(xì)胞，腎細(xì)胞，肝細(xì)胞，星形膠質(zhì)細(xì)胞，免疫細(xì)胞，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，前列腺細(xì)胞，或者α、β、或δ胰島細(xì)胞，或者腺泡細(xì)胞。94.一種免疫個體抗一種疾病的方法，包括將所述個體的靶細(xì)胞與治療有效量的重組病毒接觸的步驟，其中所述病毒包含彈狀病毒基因組或其片段，所述彈狀病毒基因組或其片段包括位于編碼基質(zhì)蛋白(M)的區(qū)域內(nèi)的一個缺失或突變，和/或位于編碼糖蛋白(G)的近膜胞外域的區(qū)域內(nèi)的一個缺失或突變，及編碼能在靶細(xì)胞的內(nèi)部表達(dá)的免疫原性蛋白或肽片段的一個異源基因，從而免疫個體抗一種疾病。95.權(quán)利要求94的方法，其中所述靶細(xì)胞是上皮細(xì)胞，肺細(xì)胞，腎細(xì)胞，肝細(xì)胞，星形膠質(zhì)細(xì)胞，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，前列腺細(xì)胞，專職抗原呈遞細(xì)胞，淋巴細(xì)胞或M細(xì)胞。96.一種治療患有一種疾病的個體的方法，包括將所述個體的靶細(xì)胞與治療有效量的重組病毒接觸的步驟，其中所述病毒包含彈狀病毒基因組或其片段，所述彈狀病毒基因組或其片段包括位于編碼基質(zhì)蛋白(M)的區(qū)域內(nèi)的一個缺失或突變，和/或位于編碼糖蛋白(G)的近膜胞外域的區(qū)域內(nèi)的一個缺失或突變，及編碼能在靶細(xì)胞內(nèi)部表達(dá)的免疫原性蛋白或肽片段的一個異源基因，從而治療疾病。97.權(quán)利要求96的方法，其中所述靶細(xì)胞是上皮細(xì)胞，肺細(xì)胞，腎細(xì)胞，肝細(xì)胞，星形膠質(zhì)細(xì)胞，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，前列腺細(xì)胞，專職抗原呈遞細(xì)胞，淋巴細(xì)胞或M細(xì)胞。98.一種治療患有與缺陷基因相關(guān)的疾病的個體的方法，包括將所述個體的靶細(xì)胞與治療有效量的重組病毒接觸的步驟，其中所述病毒包含彈狀病毒基因組或其片段，所述彈狀病毒基因組或其片段包括位于編碼基質(zhì)蛋白(M)的區(qū)域內(nèi)的一個缺失或突變，和/或位于編碼糖蛋白(G)的近膜胞外域的區(qū)域內(nèi)的一個缺失或突變，及能在靶細(xì)胞內(nèi)部表達(dá)的一個異源基因，從而治療疾病。99.權(quán)利要求98的方法，其中所述靶細(xì)胞是上皮細(xì)胞，肺細(xì)胞，腎細(xì)胞，肝細(xì)胞，星形膠質(zhì)細(xì)胞，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或前列腺細(xì)胞。100.一種癌細(xì)胞溶解的方法，包括將癌細(xì)胞與一種重組彈狀病毒接觸的步驟，其中所述彈狀病毒包含(a)包含彈狀病毒基因組或其片段的一個核酸，其中所述彈狀病毒基因組或其片段包含位于編碼基質(zhì)蛋白(M)的區(qū)域內(nèi)的一個缺失或突變，和/或位于編碼彈狀病毒糖蛋白(G)的近膜胞外域的區(qū)域內(nèi)的一個缺失或突變；及(b)一種非彈狀病毒核酸。101.權(quán)利要求100的方法，其中所述非彈狀病毒核酸編碼細(xì)胞因子或自殺基因。102.一種治療癌癥的方法，包括將癌細(xì)胞與重組病毒接觸的步驟，其中所述病毒包含(a)一種包含彈狀病毒基因組或其片段的核酸，所述彈狀病毒基因組或其片段包含位于編碼基質(zhì)蛋白(M)的區(qū)域內(nèi)的一個缺失或突變，和/或位于編碼糖蛋白(G)的近膜胞外域的區(qū)域內(nèi)的一個缺失或突變；及(b)一個非彈狀病毒核酸。103.權(quán)利要求102的方法，其中所述非彈狀病毒核酸編碼細(xì)胞因子或自殺基因。104.一種鑒別具有腫瘤消解活性的藥劑的方法，包括如下步驟獲得冠(corona)、黑質(zhì)和皮層組織的旋轉(zhuǎn)振動切片，在保持存活力和抑制有絲分裂的條件下在蓋玻片上培養(yǎng)所述切片，用標(biāo)記的癌細(xì)胞接種所述切片培養(yǎng)物，將所述接種的培養(yǎng)物與候選藥劑培養(yǎng)，并確定癌細(xì)胞存活力，其中癌細(xì)胞存活力降低表明該候選藥劑具有腫瘤消解活性，從而鑒別具有腫瘤消解活性的藥劑。105.權(quán)利要求104的方法，其中所述癌細(xì)胞是神經(jīng)元來源的。106.權(quán)利要求105的方法，其中所述神經(jīng)元來源的癌細(xì)胞是神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞。107.權(quán)利要求104的方法，其中所述癌細(xì)胞是用熒光、發(fā)光、生色或電子致密標(biāo)記而標(biāo)記的。108.權(quán)利要求104的方法，進(jìn)一步包括用標(biāo)記的重組彈狀病毒接種所述切片培養(yǎng)物的步驟。109.權(quán)利要求104的方法，進(jìn)一步包括將所述接種的切片培養(yǎng)物與細(xì)胞因子一起培養(yǎng)的步驟。110.權(quán)利要求109的方法，其中所述細(xì)胞因子是干擾素。111.權(quán)利要求104的方法，其中在保持存活力的條件下在蓋玻片上培養(yǎng)所述切片是在包含Gey′s/右旋糖溶液、血漿、凝血酶、Eagle′s基本培養(yǎng)基、Hanks′平衡鹽溶液、L-谷氨酰胺或其任何組合的培養(yǎng)基中進(jìn)行的。112.權(quán)利要求104的方法，其中在抑制有絲分裂的條件下在蓋玻片上培養(yǎng)所述切片是在包含胞嘧啶-α-D-阿拉伯呋喃糖苷、尿苷、5-氟-2′-脫氧尿苷、Gey′s/右旋糖溶液、血漿、凝血酶、Eagle′s基本培養(yǎng)基、Hanks′平衡鹽溶液、L-谷氨酰胺或其任何組合的培養(yǎng)基中進(jìn)行的。全文摘要本發(fā)明涉及重組彈狀病毒科病毒，包含其的分離的核酸，載體，細(xì)胞和組合物。重組彈狀病毒科病毒，分離的核酸，載體，細(xì)胞和組合物除了表達(dá)至少一種外源核酸之外，還表達(dá)彈狀病毒蛋白，該蛋白包括一種突變的基質(zhì)蛋白(M)和/或一種突變的糖蛋白(G)。本發(fā)明還涉及其應(yīng)用方法，包括在體內(nèi)的應(yīng)用，抗癌應(yīng)用，如治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤。本發(fā)明的重組彈狀病毒科病毒還用于基因治療和疫苗應(yīng)用中。文檔編號G01N33/50GK1820078SQ03824944公開日2006年8月16日申請日期2003年9月8日優(yōu)先權(quán)日2002年9月9日發(fā)明者邁克爾·A.·惠特,克林頓·S.·羅比森,希曼吉·R.·賈亞卡,馬克·A.·米勒申請人:田納西大學(xué)研究基金會