專利名稱：一種制備用于快速檢測傷寒的凝集試劑的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種制備凝集試劑的方法，該凝集試劑用于快速和早期檢測血清中的傷寒沙門氏桿菌。
現(xiàn)有技術傷寒是一種由傷寒沙門氏桿菌引起的地方性發(fā)熱疾病。傷寒是一種公眾健康的主要擔心。所述生物通常通過消費污染的食物或水進入機體，并侵入腸壁。然后它增殖并在24-72小時內(nèi)進入血流，導致腸性發(fā)熱和菌血癥。經(jīng)過10至14天的培養(yǎng)期間，傷寒的早期癥狀，如頭痛、發(fā)熱、食欲喪失、心動過緩、脾腫大等出現(xiàn)。通過血液培養(yǎng)或通過檢測血液中的其抗原或通過檢測血液中的其抗體來診斷傷寒。
用于診斷傷寒熱的最適合的方法之一是進行“肥達氏試驗”，該試驗是一種基于檢測血液中抗體的血清學試驗。這種試驗基于事實針對傷寒的抗體存在于受感染的人的血液中，與所述細菌結合并導致凝塊形成，該凝塊形成被稱作“肥達氏凝集”。
肥達氏試驗的局限性之一是，試驗不是特異性的，因為它與其它發(fā)熱的生物和腸桿菌科的許多生物交叉反應。
肥達氏試驗的另一個局限性是，由于傷寒是一種地方性疾病，因此在該地方區(qū)域總是存在一些背景水平的抗體。因此它成為測定切割(cut-off)值必需的，該切割值用于各區(qū)域排除診斷為假陽性的可能性。
肥達氏試驗的還另一個局限性是，它只有在發(fā)燒開始后一周或兩周才產(chǎn)生陽性(position)結果。
肥達氏試驗的還另一個局限性是，由于單次肥達氏試驗是難以捉摸的和無確定結果的，所以要對以至少一周的間隔采取的成對血清樣品進行該試驗。
肥達氏試驗的進一步局限性是，在感染的早期階段的抗生素施用，抑制抗體的產(chǎn)生，因此試驗可產(chǎn)生假陰性結果。
肥達氏試驗的還進一步局限性是，TAB接種的正常健康人由于在人系統(tǒng)中針對疫苗的循環(huán)抗體的存在而在肥達氏試驗中產(chǎn)生現(xiàn)假陽性反應。
肥達氏試驗的另一個局限性是，它提供傷寒感染的間接證據(jù)。
肥達氏試驗的進一步局限性是，該試驗具有低靈敏度和低特異性。
已知用于診斷傷寒的其它技術是基于病原體的分離和鑒定。該方法被認為是金標準。
在這種技術中，從血液中分離并通過顯微鏡檢測和生化檢測鑒定傷寒沙門氏桿菌。然而，這種技術具有許多局限性。
上述技術的一個局限性是它耗時，因為它需要3天至14天的長培養(yǎng)期間，而且還需要精密的試驗室設施。
上述技術的另一個局限性是，為其進行需要大量的血液樣品(10毫升/患者)。
上述技術的還另一個局限性是，它需要大體積的培養(yǎng)基即100毫升(10倍于血液樣品)。
上述技術的還另一個局限性是其低靈敏度(40至60％)，由于循環(huán)系統(tǒng)中有非常少的生物，低至1/毫升，這導致假陰性結果。
上述技術的進一步局限性是，培養(yǎng)物中的細菌生長被出現(xiàn)在血液中的血清殺細菌劑抑制，這可能導致假陰性結果。
血液培養(yǎng)的還進一步局限性是，在感染的早期階段的抗生素治療可能抑制培養(yǎng)物中的細菌生長，這可能產(chǎn)生假陰性結果。
其它已知的技術如放射免疫分析(RIA)，酶聯(lián)免疫吸附分析等是基于檢測體液中的循環(huán)抗原，但是這些技術有許多局限性。
這些技術的一個局限性是它們需要復雜和精密的試驗室設施。
RIA的另一個局限性是，它需要健康危害的放射性物質(zhì)，并且還需要受培訓人員操作所述放射性物質(zhì)。
上述技術的還進一步局限性是試劑昂貴。
這些技術的進一步局限性是，進行測試需要最少4-5小時。
發(fā)明目的本發(fā)明的主要目的是提供一種制備凝集試劑的方法，該凝集試劑用于快速和早期檢測可疑傷寒患者血清樣品中的傷寒沙門氏桿菌。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備凝集試劑的方法，其中所提出的試劑使得能在收集血清樣品后3分鐘內(nèi)診斷傷寒。
本發(fā)明的還另一個目的是提供一種制備凝集試劑的方法，其中診斷傷寒疾病所需血清樣品小至20微升。
本發(fā)明的進一步目的是提供一種制備凝集試劑的方法，其中所述試劑使得能通過簡單的乳膠凝集技術檢測傷寒細菌。
本發(fā)明的還進一步目的是提供一種制備凝集試劑的方法，其中所述試劑使得能特異地鑒定可疑傷寒患者血清樣品中的傷寒沙門氏桿菌抗原。
本發(fā)明的還進一步目的是提供一種制備凝集試劑的方法，其中所述試劑使得能在感染的早期，甚至在發(fā)熱開始后的1天或2天內(nèi)診斷傷寒。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備凝集試劑的方法，其中所述試劑是高度靈敏的。
本發(fā)明的還另一目的是提供一種制備凝集試劑的方法，因為它不需任何設備或試驗室設施，該試劑使得能在野外條件下診斷所述疾病。
本發(fā)明的還進一步目的是提供一種制備凝集試劑的方法，該試劑不需任何專門受培訓的人員進行測試。
本發(fā)明的還進一步目的是提供一種制備凝集試劑的方法，該試劑使得能夠診斷被施用抗生素導致血液培養(yǎng)物分離為陰性的那些患者。
方法的描述根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，通過包括下述步驟的方法制備所述凝集試劑(a)制備抗體(免疫球蛋白)克隆并通過重組DNA技術表達對傷寒沙門氏桿菌特異的鞭毛蛋白基因序列。表達的重組蛋白通過親和層析純化。在兔中產(chǎn)生對抗該重組蛋白的超免疫血清。超免疫血清的免疫球蛋白部分通過硫酸鹽銨沉淀分離。將沉淀的免疫球蛋白懸浮在50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.2)中，透析并測定蛋白質(zhì)含量。
(b)制備乳膠顆粒懸浮液以優(yōu)選的比例1∶1取1％0.88至0.90μm大小的羧化乳膠顆粒和40mM 2-N嗎啉代乙烷磺酸(2-N Morphilinoethane sulphonic acid，MES)緩沖液(pH5.5-6.0)于管中。在旋渦混合器上將它們混合約60秒并在約4℃10000rpm下離心10-12分鐘。乳膠顆粒通過在旋渦混合器上混合約60秒，在pH5.5的20mM的MES緩沖液進一步洗滌兩次，接著在約4℃10000rpm下離心10-12分鐘。最后洗滌后，將乳膠顆粒懸浮于pH5.5的20mM的MES緩沖液中，并補足體積至與乳膠顆粒的起始體積相等。隨后懸浮液用尖頭超聲儀在約5瓦超聲60-120秒，優(yōu)選90秒。在緩慢旋渦混合所述溶液的同時，將新鮮制備的于20mM的MES緩沖液(pH5.5)中的0.1M 1-乙基-3(3-二甲基-氨基-丙基)碳二亞胺(carbodimide)鹽酸鹽(EDC)溶液，以1∶1的優(yōu)選比例取出，滴加到這種懸浮液中。在20-25℃的溫度下將的述管慢慢上下(end-over-end)翻轉(zhuǎn)約3小時。然后在約4℃的溫度10000rpm下達10-12分鐘，用20mM的MES緩沖液(pH5.5)洗滌三次。將乳膠顆粒重懸在MES緩沖液(20mM，pH5.5)中并用尖頭超聲儀在5瓦超聲60-120秒。
(c)用抗體(免疫球蛋白)包被乳膠顆粒將步驟(a)中制備的免疫球蛋白按每毫升懸浮液0.6-1.0mg，優(yōu)選0.8mg加到步驟(b)中制備的乳膠顆粒懸浮液中。然后在20-25℃的溫度下將全混合物上下翻轉(zhuǎn)18-20小時。包被反應通過加入1M甘氨酸(pH11.0)終止，以每毫升免疫球蛋白包被的乳膠顆粒0.06毫升的量取出。繼續(xù)在20-25℃的溫度下旋轉(zhuǎn)約30分鐘。包被的乳膠顆粒通過在約4℃的溫度10000rpm下離心10-12分鐘沉淀出來。沉淀塊用洗滌緩沖液(50mM甘氨酸，pH8.5；0.03％曲通(triton)X-100和0.05％疊氮化鈉)洗滌三次，在約4℃的溫度10000rpm下達10-12分鐘。最后將洗滌過的包被的乳膠顆粒重懸在儲存緩沖液中(50mM甘氨酸，pH8.5；1.0％牛血清白蛋白；0.03％曲通X-100；0.1％疊氮化鈉和0.01％硫柳汞)至終濃度1％，用尖頭超聲儀在5瓦超聲約60秒并在4℃儲存。
使用方法(a)取20-40μl(1到2滴)的測試血清，陽性和陰性對照置于載玻片上的三個不同位置(b)加10-2μl(1到2小滴)的乳膠試劑到測試血清中，陽性和陰性對照(c)用單獨的木條小心混合反應物以避免置于分開位置的反應物混雜并旋轉(zhuǎn)載玻片1-2分鐘。
用試劑與測試樣品和陽性對照混合的1-2分鐘內(nèi)出現(xiàn)凝集，清楚顯示肉眼可見的顆粒凝塊，表示陽性反應。凝集出現(xiàn)的速度和質(zhì)量取決于存在的抗原的強度，從混合幾秒種內(nèi)出現(xiàn)的大凝塊變化到相當慢形成的小凝塊。陰性反應中，試劑不凝集，渾濁性或混濁性特征在整個測試過程中本質(zhì)上仍然沒有改變。
快速檢測傷寒患者血清中傷寒沙門氏桿菌的所提出的凝集試劑的可靠性的試驗室研究，用傷寒沙門氏桿菌試驗室菌株；以及從可疑的傷寒病例中收集的被檢驗的培養(yǎng)和肥達氏陽性血清樣品；以及用明顯正常的健康個體的血清樣品進行。結果表明93.00％的靈敏度和98.00％的特異性。
本發(fā)明現(xiàn)在將用工作舉例說明，該實施例意思是作為說明性的實例，不是被限制性地采用以對本發(fā)明的范圍起任何限制作用。
工作實施例用基因特異的引物通過聚合酶鏈反應(PCR)擴增對傷寒沙門氏桿菌特異的鞭毛蛋白基因序列。將擴增的PCR產(chǎn)物克隆在谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)載體中，然后表達。表達的蛋白質(zhì)通過GST親和柱層析純化。通過Bradford方法測定純化產(chǎn)物的蛋白質(zhì)含量。在兔中產(chǎn)生對抗該蛋白質(zhì)的超免疫血清。超免疫血清的免疫球蛋白部分通過硫酸銨沉淀分離。將沉淀的免疫球蛋白懸浮在1.0毫升磷酸鹽緩沖液(50mM，pH7.2)中，透析并測定蛋白質(zhì)含量。取1.0毫升1％羧化乳膠顆粒和1.0毫升40mM MES緩沖液(pH5.5-6.5)置于2.0毫升微量離心管中。然后在旋渦混合器上混合它們60秒并在4℃的溫度10000rpm下離心10-12分鐘。乳膠顆粒通過在旋渦混合器上混合60秒并在4℃的溫度10000rpm下離心10-12分鐘，在2.0毫升20mM的MES緩沖液(pH5.5)中進一步洗滌兩次。最后洗滌后，將乳膠顆粒懸浮于1.0毫升的MES緩沖液(20mM，pH5.5)中并用尖頭超聲儀在5瓦超聲60-120秒。然后在緩慢渦旋所述溶液的同時，滴加1.0毫升新鮮制備的在MES緩沖液(20mM，pH5.5)中的0.1M 1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)溶液。然后在20-25℃溫度下慢慢上下翻轉(zhuǎn)所述管3小時，接下來在4℃的溫度10000rpm下10-12分鐘用MES緩沖液(20mM，pH5.5)洗滌三次。將乳膠顆粒重懸在0.7毫升MES緩沖液(20mM，pH5.5)中并用尖頭超聲儀在5瓦超聲60-120秒。將0.8mg免疫球蛋白加到乳膠顆粒中，并用MES緩沖液(20mM，pH5.5)將體積補足到1.0毫升。然后在20-25℃溫度下將這上下翻轉(zhuǎn)18-20小時。包被反應通過加入0.06毫升的1M甘氨酸(pH11.0)終止。繼續(xù)在20-25℃的溫度下旋轉(zhuǎn)30分鐘。包被的乳膠顆粒通過在4℃的溫度10000rpm下離心10-12分鐘沉淀出來。沉淀塊用2.0毫升洗滌緩沖液(50mM甘氨酸，pH8.5；0.03％曲通X-100和0.05％疊氮化鈉)在4℃的溫度10000rpm下10-12分鐘洗滌三次。將洗滌過的包被的乳膠顆粒重懸在儲存緩沖液(50mM甘氨酸，pH8.5，1.0％牛血清白蛋白，0.03％曲通X-100，0.1％疊氮化鈉和0.01％硫柳汞)中至終濃度1％，用尖頭超聲儀在5瓦超聲60秒并在4℃儲存。
應該理解，本發(fā)明易被本領域技術人員進行修飾、改變和適應性改變。意指這樣的修飾、改變和適應性改變同樣在本發(fā)明的范圍內(nèi)，所述范圍被進一步設定在下面權利要求下。
權利要求
1.一種制備用于快速和早期檢測傷寒的凝集試劑的方法，該方法包括步驟(a)制備傷寒沙門氏桿菌的特異抗體(b)制備乳膠顆粒懸浮液(c)用抗體包被所述乳膠顆粒。
2.根據(jù)權利要求1的方法，其中通過重組DNA技術克隆并表達對傷寒沙門氏桿菌特異的鞭毛蛋白基因序列。
3.根據(jù)權利要求2的方法，其中通過親合層析純化表達的重組蛋白。
4.根據(jù)權利要求3的方法，其中在兔中培養(yǎng)針對所述重組蛋白的超免疫血清。
5.根據(jù)權利要求4的方法，其中通過硫酸銨沉淀分離所述超免疫血清的免疫球蛋白部分。
6.根據(jù)權利要求1的方法，其中，將沉淀的免疫球蛋白懸浮在磷酸鹽緩沖液中，透析并測定蛋白質(zhì)含量。
7.根據(jù)權利要求1的制備用于快速和早期檢測傷寒的凝集試劑的方法，其中以優(yōu)選比例1∶1取1％羧化的0.88至0.90μm大小的乳膠顆粒和pH 5.6至6.0的40mM 2-N嗎啉代乙烷磺酸(MES)緩沖液。
8.根據(jù)權利要求1的制備用于快速和早期檢測傷寒的凝集試劑的方法，其中在旋渦混合器上混合MES緩沖液中的乳膠顆粒懸浮液約60秒并在約4℃10000rpm下離心10至12分鐘。
9.根據(jù)權利要求1的制備用于快速和早期檢測傷寒的凝集試劑的方法，其中所述乳膠顆粒用pH 5.5的20mM MES緩沖液在約4℃10000rpm下10至12分鐘進一步洗滌兩次。
10.根據(jù)權利要求1的制備用于快速和早期檢測傷寒的凝集試劑的方法，其中將洗滌過的乳膠顆粒懸浮于pH 5.5的20mM MES緩沖液中，并將體積補足至與乳膠顆粒的起始體積相等。
11.根據(jù)權利要求1的制備用于快速和早期檢測傷寒的凝集試劑的方法，其中懸浮的乳膠顆粒用尖頭超聲儀在約5瓦下超聲60-120秒，優(yōu)選90秒。
12.根據(jù)權利要求1的制備用于快速和早期檢測傷寒的凝集試劑的方法，其中在緩慢渦旋所述懸浮液的同時，將新鮮制備的在pH 5.5的20mM MES緩沖液中的0.1M 1-乙基-3(3-二甲基-氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)溶液，以1∶1的優(yōu)選比例滴加到乳膠顆粒懸浮液中。
13.根據(jù)權利要求1的制備用于快速和早期檢測傷寒的凝集試劑的方法，其中將EDC溶液與乳膠顆粒在20-25℃溫度下慢慢上下翻轉(zhuǎn)約3小時，并在約4℃的溫度10000rpm下10至12分鐘用20mM的MES緩沖液(pH 5.5)洗滌三次。
14.根據(jù)權利要求1的制備用于快速和早期檢測傷寒的凝集試劑的方法，其中將乳膠顆粒重懸在MES緩沖液(20mM，pH 5.5)中并用尖頭超聲儀在約5瓦下超聲60至120秒。
15.根據(jù)權利要求1的制備用于快速和早期檢測傷寒的凝集試劑的方法，其中將步驟(a)中制備的免疫球蛋白按每毫升0.6至1.0mg，優(yōu)選0.8mg，加到步驟(b)中制備的乳膠顆粒懸浮液中。
16.根據(jù)權利要求1的制備用于快速和早期檢測傷寒的凝集試劑的方法，其中將乳膠顆粒和免疫球蛋白的懸浮液在約20至25℃溫度下上下翻轉(zhuǎn)18至20小時。
17.根據(jù)權利要求1的制備用于快速和早期檢測傷寒的凝集試劑的方法，其中包被反應通過以每毫升免疫球蛋白包被的乳膠顆粒的溶液0.06毫升的量取出的1M甘氨酸(pH 11.0)終止。
18.根據(jù)權利要求1的制備用于快速和早期檢測傷寒的凝集試劑的方法，其中所述包被的乳膠顆粒通過在約4℃的溫度下10000rpm下離心10-12分鐘沉淀出來。
19.根據(jù)權利要求1的制備用于快速和早期檢測傷寒的凝集試劑的方法，其中將包被的乳膠顆粒的沉淀塊用包含50mM甘氨酸，pH 8.5；0.03％曲通X-100和0.05％疊氮化鈉的洗滌緩沖液；在約4℃的溫度下10000rpm下10-12分鐘洗滌三次。
20.根據(jù)權利要求1的制備用于快速和早期檢測傷寒的凝集試劑的方法，其中將洗滌過的包被的乳膠顆粒懸浮在包含50mM甘氨酸pH8.5；1.0％牛血清白蛋白；0.03％曲通X-100；0.1％疊氮化鈉和0.01％硫柳汞的儲存緩沖液中，至1％的終濃度。
21.根據(jù)權利要求1的制備用于快速和早期檢測傷寒的凝集試劑的方法，其中將包被的乳膠顆粒的1％懸浮液用尖頭超聲儀在約5瓦下超聲約60秒并在4℃儲存。
22.一種制備如本申請中實質(zhì)上描述并舉例說明的凝集試劑的方法。
全文摘要
一種制備用于快速和早期檢測傷寒的凝集試劑的方法，該方法包括步驟制備傷寒沙門氏桿菌的特異抗體，(b)制備乳膠顆粒懸浮液，(c)用抗體包被所述乳膠顆粒。
文檔編號G01N33/569GK1742096SQ03825732
公開日2006年3月1日 申請日期2003年9月3日 優(yōu)先權日2002年11月26日
發(fā)明者G·P·萊, G·S·阿伽瓦爾, S·K·沙爾瑪, D·K·雅斯瓦爾, K·舍克哈爾, K·阿羅拉, V·K·查伍德哈里 申請人:國防科研與發(fā)展組織