專利名稱:測定分析物的最少的操作步驟系統(tǒng)的制作方法
本發(fā)明涉及比色測定含水液體尤其是全血中化學(xué)和生物化學(xué)組分(分析物)的測試裝置和方法。在一個最佳實施例中，還涉及比色測定全血中葡萄糖濃度的測試裝置和方法。
定量測定有色含水液體尤其是有色生物液體如全血和尿以及生物液體衍化物如血清和血漿中化學(xué)和生物化學(xué)組分的重要性日益增加。其重要用途在于內(nèi)科診斷和治療以及定量表示接觸治療藥物、中毒劑、危險化學(xué)藥品等的數(shù)量。在某些情況下，所測物質(zhì)的量非常微小-在微克/分升或更少的范圍內(nèi)-或非常難以精密測定以至所使用的儀器是復(fù)雜的而且只有熟練的實驗室工作人員才能操作。在這種情況下，往往在抽樣后數(shù)小時或數(shù)日還不能得到結(jié)果。在其他一些情況下，往往是強(qiáng)調(diào)非專業(yè)操作者能夠在實驗室外進(jìn)行常規(guī)的、快速的和具有重現(xiàn)性的測試，而迅速或直接得到數(shù)據(jù)的能力。
一種常用的醫(yī)學(xué)檢驗是由糖尿病患者測定血糖水平。目前的學(xué)說，指導(dǎo)糖尿病患者按各自病情的性質(zhì)和嚴(yán)重程度，每天測定他們的血糖水平2至7次。根據(jù)所測葡萄糖水平的觀察模式，患者和醫(yī)生共同調(diào)整飲食、鍛煉和服用胰島素，以改善對疾病的治療。顯然，此種資料應(yīng)立即提供給患者。
最近，在美國廣泛應(yīng)用的一種方法，是采用Mast在1967年1月17日公開的美國專利第3298789號中所介紹的一種測試裝置。在該方法中，將新鮮的全血樣品(通常為20～40微升)置于涂有乙基纖維素的試劑墊上，該墊含有葡萄糖氧化酶和過氧化物酶活性的酶系統(tǒng)。此酶系統(tǒng)與葡萄糖反應(yīng)，釋放出過氧化氫。該墊還含有指示劑，此指示劑在有過氧化物酶存在的情況下與過氧化氫反應(yīng)，得到一種強(qiáng)度與血樣葡萄糖水平成正比的顏色。
另一種普及的血糖測定方法是應(yīng)用相似的化學(xué)原理，但不用涂有乙基纖維素的墊，而是采用抗水薄膜，通過該薄膜而使酶和指示劑分散。這種類型的系統(tǒng)已公開在Rey等人1971年12月28日出版的美國專利第3630957號中。
在上述兩種情況下，均使血樣與試劑墊保持接觸一段特定的時間(一般為1分鐘)。然后，將前者的血樣用水流沖洗，而后者的血樣則是從膜上擦去。然后再將試劑墊或薄膜吸干和進(jìn)行測定。測定的方法是將所顯顏色與比色圖表對比，或者將該墊或薄膜放在擴(kuò)散反射比測定儀中，讀出顯色強(qiáng)度值。
上述測定葡萄糖的方法已使用多年，確實存在一定的局限性。做一次扎手指取血試驗(finger stick test)需要的樣品量相當(dāng)大，而且對某些毛細(xì)管血液不易擠出來的人而言很難獲得成功。
此外，這些方法與其他非專業(yè)操作者進(jìn)行的簡單比色測定具有共同局限性，因為其結(jié)果是以絕對顯色讀數(shù)為基準(zhǔn)的，而此種絕對顯色讀數(shù)又與樣品和試驗試劑之間的絕對反應(yīng)程度有關(guān)。在定時反應(yīng)時間間隔后必須將樣品從試劑墊上洗去或擦去的事實，要求使用者在每次定時間隔的末尾就作好準(zhǔn)備，及時擦凈，或用水流沖洗。除去樣品后反應(yīng)即終止的事實，可導(dǎo)致結(jié)果不太準(zhǔn)確，尤其是對于家庭用戶來說。沖洗過度，結(jié)果偏低，沖洗不足，則結(jié)果偏高。
在非專業(yè)操作者進(jìn)行的簡單比色測定中經(jīng)常存在的另一個問題，是將血液涂在試劑墊上時，就需要開始計時順序。使用者一般用扎手指針取得血液樣品，然后要求在其另一只手開始計時工序的同時，將從手指上取得的血液涂到試劑墊上去，因而需要雙手同時進(jìn)行操作。由于經(jīng)常需要保證在血液剛被涂到試劑墊上時就立即開始計時，所以這是特別困難的。所有的現(xiàn)有技術(shù)方法都要求輔助操作或輔助步驟，以取得成功的結(jié)果。因此，對反射比讀數(shù)測定儀的這個方面進(jìn)行簡化是合乎需要的。
紅血細(xì)胞或其他有色組分的存在往往干擾這些絕對值的測定，因此要求從這兩個廣泛應(yīng)用的現(xiàn)有方法中，除去紅血細(xì)胞。在美國專利第3298789號所述的裝置中，所用的乙基纖維素薄膜可以防止紅血細(xì)胞進(jìn)入試劑墊。同樣地，美國專利第3630957號中所用的抗水薄膜也可以防止紅血細(xì)胞進(jìn)入試劑墊。在這兩種情況下，沖洗或擦凈都起到了測量前除去紅血細(xì)胞的這些潛在干擾的作用。
因此，仍然需要一種測定有色液體，如血液中的分析物的系統(tǒng)，該系統(tǒng)并不要求從可得到反射讀數(shù)的反射條中除去過量的液體。
本發(fā)明為診斷測定提供了新的方法、組合物和裝置，其中包括含有信號產(chǎn)生系統(tǒng)的親水多孔基體和反射測量儀器，該儀器是當(dāng)液體滲入基體時在基體的反射比改變的時候起動的。該方法包括將樣品(一般為全血)加到基體中，此基體過濾出大顆粒，如紅血細(xì)胞，通常將基體放在儀器內(nèi)。信號產(chǎn)生系統(tǒng)產(chǎn)生一種產(chǎn)物，此產(chǎn)物進(jìn)一步改變基體的反射比，這種改變可與樣品中存在分析物相關(guān)聯(lián)。
診斷測定系統(tǒng)的典型例子是全血中葡萄糖的測定，測定是在不受血液干擾而且也沒有易受操作誤差影響的復(fù)雜記錄情況下進(jìn)行的。
結(jié)合附圖并參考以下的詳細(xì)說明，很容易理解本發(fā)明的內(nèi)容。

如下圖1是一個測定裝置實施例的透視圖，該裝置包括可涂被分析液體的反應(yīng)墊。
圖2是實施本發(fā)明的儀器的方框示意圖。
圖3是實施本發(fā)明的另一種儀器的方框示意圖。
本發(fā)明提供一種應(yīng)用可靠的和容易操作的儀器的改進(jìn)的快速簡易方法來測定葡萄糖一類的被分析物，尤其是測定可導(dǎo)致產(chǎn)生作為酶產(chǎn)物的過氧化物酶的酶底物。該方法包括將足以使基體飽和的少量全血涂到多孔基體上。與基體結(jié)合的是一種或幾種試劑的信號產(chǎn)物系統(tǒng)，此種系統(tǒng)產(chǎn)生一種產(chǎn)物，促使基體反射比發(fā)生變化。測定血液時，基體通常是放在反射比測量儀器中。液體樣品滲透到基體中，可導(dǎo)致在測量表面開始發(fā)生反射比的變化。在反射比開始變化以后，然后記錄一次或幾次讀數(shù)，將測量表面或基體的反射比的進(jìn)一步的變化，作為反應(yīng)產(chǎn)物形成的結(jié)果與樣品中被分析物的量相關(guān)聯(lián)。
為了測定血液，尤其是測定葡萄糖，一般將全血用作測定介質(zhì)?；w含有產(chǎn)生過氧化氫的氧化酶?；w中還含有另一種酶，特別是過氧化物酶和染料系統(tǒng)，此染料系統(tǒng)可與過氧化物酶一起產(chǎn)生吸光產(chǎn)物。吸光產(chǎn)物改變反射信號。對全血測定來說，讀數(shù)是在二個不同的波長記錄的，將在一個波長上的讀數(shù)扣除由血細(xì)胞比容、血液氧合作用以及會影響結(jié)果的其他可變因素所引起的背景干擾。
所用試劑組分包括基體和含在基體中的信號產(chǎn)生系統(tǒng)的各個組成組分。試劑組分可以包括其他特殊用途的組成部分。本發(fā)明方法要求將很少量的血液涂到基體上，血液一般不需要進(jìn)行預(yù)處理(但可任意用抗凝血劑處理)。測量的計時是當(dāng)液體滲入基體時由自動檢測基體反射比的變化的儀器來起動的。然后在預(yù)定的時間內(nèi)，將反射比的變化作為反應(yīng)產(chǎn)物形成的結(jié)果，與樣品中被分析物的含量相關(guān)聯(lián)。
本發(fā)明所考慮的第一個部分是試劑組分，通常是一種墊的形狀，其中包括惰性多孔基體和信號產(chǎn)生系統(tǒng)的組成部分，此信號產(chǎn)生系統(tǒng)浸入多孔基體的微孔中、能與被分析物反應(yīng)，產(chǎn)生光吸收反應(yīng)產(chǎn)物。信號產(chǎn)生系統(tǒng)并不明顯地阻礙液體通過基體。
為了有助于讀取反射比，基體最好至少有一面基本上是平滑的。一般將基體制成薄片狀，至少有一面是平滑的。用時將被分析的液體樣品涂到薄片的一面，從而使任何測定化合物都可借助毛細(xì)管作用、毛細(xì)作用、重力流動作用和(或)擴(kuò)散作用通過試劑組分。在基體中信號產(chǎn)生系統(tǒng)的各個組成部分可進(jìn)行反應(yīng)產(chǎn)生光吸收反應(yīng)產(chǎn)物。入射光所照射的試劑組分部位不是涂有樣品的部位。光由試劑組分表面反射成漫反射光，這種反射光可通過反射分光光度計的檢測器來進(jìn)行會聚和測量，反射光的量可與樣品中被分析物的量相關(guān)聯(lián)，通常是與樣品中被分析物的量成反函數(shù)關(guān)系。
形成試劑組分所需的各個組成部分依次介紹如下。第一種組成部分是基體本身。
基體是一種親水多孔基體，可以共價鍵或非共價鍵與反應(yīng)物鍵合。此種基體是可以使水介質(zhì)通過的基體，也可以使蛋白質(zhì)組合物與基體結(jié)合，而對蛋白質(zhì)生物活性，例如酶的酶活性沒有明顯的有害作用。對共價鍵合的蛋白質(zhì)來說，基體具有共價鍵合的活性位，或者可用已知方法來進(jìn)行活化。基體的組合物具有反射性，其厚度足以使其空隙容積內(nèi)或在其表面上有可能形成吸光染料，而實際上影響從基體發(fā)生的反射?；w可以是由均勻的組合物組成，或者涂在底物上，以提供所需的結(jié)構(gòu)和物理特性。
基體通常不會在潤濕時變形，因此能保持其原來的構(gòu)型和大小?；w具有一定的吸收能力，所以在合理的限度內(nèi)能標(biāo)定其吸收量，變化范圍通常低于50%左右，最好是不高于10%?；w具有充分的潤濕強(qiáng)度，完全可以進(jìn)行常規(guī)制作?；w可以使非共價鍵合的試劑相當(dāng)均勻地分布在基體的表面上。
基體表面采用聚酰胺是一個典型的例子，尤其是用于全血樣品，它通常是由4～8個碳原子的單體縮合而成的縮聚物，其中單體是內(nèi)酰胺或二胺和二羧酸的化合物。具有相同性質(zhì)的其他聚合組合物也可采用?？蓪⒕埘０方M合物改性后引入其他可提供帶電結(jié)構(gòu)的官能團(tuán)，使基體表面可不帶電、帶正電或帶負(fù)電，以及呈中性、堿性或酸性。較好的表面是帶正電的表面。
當(dāng)用于測定全血時，較好的多孔基體的平均孔徑約為0.1～2.0微米，而更好的是約為0.6～1.0微米。
制備多孔材料的優(yōu)選方法是將親水聚合物澆注在非織造的纖維芯上，芯纖維可以是能產(chǎn)生所述的完整性和強(qiáng)度的任何纖維材料，例如聚酯和聚酰胺?？尚纬晌夥磻?yīng)產(chǎn)物的試劑存在于基體的孔中，但并不阻塞基體，所以要分析的測定介質(zhì)的液體部分，例如血液可流過基體的微孔，而顆粒物質(zhì)例如紅血細(xì)胞則保持在基體的表面上。關(guān)于試劑形成的吸光反應(yīng)產(chǎn)物將在后面作詳細(xì)討論。
基體實際上是具有反射能力，所以能夠不用反射背襯也能產(chǎn)生漫反射。照射在基體上的入射光較好的是至少有25%被反射，更好是至少有50%被反射，而且以漫反射光發(fā)射。通常所用的基體厚度小于0.5毫米左右，0.01～0.3毫米左右較好，0.1～0.2毫米最好，尤其對尼龍基體來說更是如此。
雖然并不一定必須將基體附著在載體上，但是為了使基體具有物理形狀和剛性，一般還是將基體附著的載體上。圖1提供本發(fā)明的一個實施例，圖中將一塊薄的親水基體墊11用粘合劑13固定在塑料載體12的一端，此粘合劑13將試劑墊直接地和牢固地粘附在把手上。在試劑墊11與塑料載體12粘附的部分上有一孔14，使樣品能夠涂在試劑墊的一面上，而光則從另一面反射。
將欲測液體樣品涂在墊11上。通常，用血作為所測樣品的實例，將試劑墊放在表面積約為10平方毫米至100平方毫米的表面上，最好是在10平方毫米至50平方毫米的表面上，通常此試劑墊的容量是5～10微升的樣品就可超過使其飽和的容量。
在現(xiàn)有技術(shù)中測量漫反射比，通常是將反射背襯粘附在或放在基體后面。實施本發(fā)明時，可以不要這種背襯，或通常是把此種背襯作為試劑組分或反射裝置的一個組成部分。
如圖1所示，載體支承著試劑墊11，使樣品能涂到試劑墊的一側(cè)而光反射比則從涂有樣品的試劑墊的反面一側(cè)進(jìn)行測量。
在圖2提供的系統(tǒng)中，試劑被涂在背面手把上帶孔的一側(cè)，而光則在試劑墊的另一側(cè)反射并對其進(jìn)行測量。除了所述結(jié)構(gòu)外，還可采用另一些結(jié)構(gòu)。以本文所提供的范圍為條件，試劑墊還可以制成各種形狀和形式。此種墊至少要有一面，通常是兩面都可以使用的。
可用任何適合的方法將親水層試劑組分附著在載體上，例如支持器、夾持器或粘結(jié)劑，但是較佳方法是將其粘合在襯墊上，這種粘合可以用不起反應(yīng)的任何粘合劑，和加熱法來進(jìn)行，此法將襯墊表面熔化到足以截留某些用于親水層的材料，或者應(yīng)用微波粘合法或超聲粘合法，這些方法同樣是將親水樣品墊熔化到襯墊上。重要的是這種粘合本身基本上不會干擾漫反射比的測量或所測量的反應(yīng)，不過，由于在測出讀數(shù)的部位不需要有粘合劑存在，所以，這種情況不大可能發(fā)生。例如，可將粘合劑13涂在襯條12上，隨后首先將孔14打在組合在一起的襯條和粘合劑上，然后再將試劑墊11鋪在孔14附近的粘合劑上，使試劑墊的外圈部分粘附在襯條上。
任何信號產(chǎn)生系統(tǒng)均可應(yīng)用，只要此種信號產(chǎn)生系統(tǒng)能與樣品中的被分析物反應(yīng)(直接或間接地)生成一種化合物，此種化合物能在某一波長上而不是在測定介質(zhì)實際上吸收的波長上具有特性吸收。
聚酰胺基體尤其適用于底物(被分析物)與利用氧的氧化酶按下述方式所進(jìn)行的反應(yīng)，即首先產(chǎn)生一種產(chǎn)物，此產(chǎn)物再進(jìn)一步與染料中間體反應(yīng)，直接或間接地生成吸收預(yù)定波長的染料。例如，一種氧化酶能夠?qū)⒌孜镅趸a(chǎn)生作為反應(yīng)產(chǎn)物的過氧化氫。然后過氧化氫可在催化反應(yīng)或非催化反應(yīng)中，與染料中間體或前體反應(yīng)，生成一種氧化態(tài)的中間體或前體。這種氧化過的物質(zhì)可以生成有色產(chǎn)物或與另一個前體反應(yīng)，生成最終染料。
被分析物和典型試劑的例子包括下表所列的物質(zhì)，但并非僅限于所列舉的例子。
被分析物和樣品類型 試劑血液、血清、尿或其他 葡萄糖氧化酶，過氧化物酶和氧受體生物液體、酒、果汁或 氧受體包括其他有色含水溶液中的 鄰聯(lián)(二)茴香胺(1)葡萄糖。全血是特別優(yōu) 鄰甲苯胺選的樣品類型。 鄰聯(lián)甲苯胺(1)聯(lián)苯胺(1)2，2′-連氮基-二(3-乙苯噻唑啉磺酸-(6))(1)3-甲基-2-苯噻唑啉酮腙+N，N-二甲基苯胺(1)酚+4-氨基非那宗(1)磺化2，4-二氯苯酚+4-氨基非那宗(2)3-甲基-2-苯噻唑啉酮腙+3-(二甲氨基)苯甲酸(3)2-甲氧基-4-烯丙酚(4)4-氨基安替比林-二甲基苯胺(5)(1)根據(jù)Richterich和Columbo的報導(dǎo)(Clinical Chemistry，P.367)及本文引用的參考文獻(xiàn)。
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(4)Anal.Biochem.，79，(1977)597～601。
(5)Clinica Chemica Acta，75(1977)387～391。
以上皆為本文的參考文獻(xiàn)。
本發(fā)明的分析方法取決于由漫反射所測得的吸光率的變化，而漫反射決定于所測樣品中被分析物的含量。這種變化可通過測量檢驗樣品在經(jīng)過一定時間的兩點或多點之間吸光度的變化來測定。
測定的第一步是將樣品涂到基體上。具體的分析步驟如下首先要取得含有被分析物的含水液體的樣品，例如可用扎手指針取得血液。在測定反射比的區(qū)域內(nèi)，將超過基體飽和量的此種液體(即約5～10微升)涂到測試裝置的試劑組分上。從下文即可清楚了解到，不需要同時啟動計時器(在現(xiàn)有技術(shù)中通常需要同時啟動計時器)?？沙ナＳ嗟囊后w，例如用薄吸墨水紙，但這種除去方法也是不需要的。測試裝置一般裝在光吸收率讀數(shù)儀中;例如在涂樣品前，通過測量反射比來測定顯色強(qiáng)度。在涂樣品后的一定的時間點，測量吸光率。此處所述吸光率，不僅是指可見光波長范圍內(nèi)的光，而且也包括可見光波長范圍以外的光，例如紅外線和紫外線。從這些吸光率的測量中，可根據(jù)被分析物的量來標(biāo)定顯色率。
合適的儀器，例如采用帶有適當(dāng)軟件的漫反射分光光度計，可以在一定時間的點自動讀取反射比，計算反射比變化率，并用校正系數(shù)計算含水液體中被分析物的含量。在圖2中示意顯示這種裝置，圖中顯示本發(fā)明的測試裝置，其中包括固定試劑墊11的襯條12。光源5，例如采用高強(qiáng)度發(fā)光二極光(LED)將光束投射到試劑墊上。從試劑墊漫反射出光的主要部分(在沒有反應(yīng)產(chǎn)物的條件下，至少為25%較好的是至少35%，最好的是至少為50%)，用光檢測器6，例如采用光電晶體管，其所產(chǎn)生的輸出電流與其所接受的光成正比，來進(jìn)行檢測。在需要時，可將光源5和/或光檢測器6進(jìn)行改裝來產(chǎn)生或響應(yīng)特定波長的光。將光檢測器6的輸出信號輸給放大器7，例如采用將光電晶體管電流轉(zhuǎn)變?yōu)殡妷旱木€性集成電路。可將放大器7的輸出信號饋給跟蹤和保持電路8。這是一種線性/數(shù)字組合集成電路，可跟蹤或追蹤放大器7的模擬電壓，在微處理機(jī)20發(fā)生指令時將電壓鎖定或保持在當(dāng)時的水平。模數(shù)變換器19從跟蹤和保持電路8中得到模擬電壓，在微處理機(jī)20發(fā)出指令時，將其變換為，例如，12位二進(jìn)制數(shù)字碼。微處理機(jī)20可以是一種數(shù)字集成電路。它具有下述各種控制功能1)為整個系統(tǒng)計時;2)讀取模數(shù)變換器19的輸出信號;3)與程序數(shù)據(jù)存儲器21一起，存儲相應(yīng)于在特定時間內(nèi)所測得的反射比的數(shù)據(jù);4)根據(jù)存儲的反射比數(shù)據(jù)計算出被分析物的含量;以及5)將被分析物的濃度數(shù)據(jù)輸送給顯示器22。存儲器21可以是存儲數(shù)據(jù)和微處理機(jī)操作程序的數(shù)字集成電路。報表裝置22可取各種硬拷貝和軟考貝形式，通常它是一種光學(xué)顯示器，例如液晶顯示器或LED顯示器，但也可采用紙帶打印機(jī)、音響信號等顯示形式。在需要時，儀器還可包括起停開關(guān)并能提供音響或目視報時輸出信號，來指示涂布樣品和讀取數(shù)據(jù)等的時間。
在本發(fā)明中，反射電路本身可通過測量反射比的下降來起動計時，這種反射比下降是在涂在試劑墊上的懸浮液中的含水部分(例如血液)遷移到測量反射比的表面時發(fā)生的。一般說來，在測量裝置接通“就緒”狀態(tài)時，在最短的時間間隔內(nèi)(一般為0.2秒左右)，從通常為灰白色的基本干燥的未經(jīng)反應(yīng)的試劑條上自動讀取反射比數(shù)據(jù)。測量一般是在被分析的液體滲透到基體之前，但也可在液體被涂到試劑組分上不是測量反射比的部位后開始進(jìn)行。用微處理機(jī)評定反射比值，一般將逐次值存儲在存儲器中，然后將各個值與未反應(yīng)的起始值進(jìn)行比較。當(dāng)水溶液滲透到試劑基體時，反射比下降發(fā)出起動測量時間間隔的信號。反射比下降5～50%時，可用來起動計時，通常下降大約10%時可起動計時。用這種簡單的方法，可使測定介質(zhì)達(dá)到進(jìn)行測量的表面與開始讀數(shù)順序完全同步，無需使用者參予活動。
盡管本申請說明書中所述的所有系統(tǒng)特別適宜使用聚酰胺基體，并且還特別適宜于將這類基體用于測定各種糖類，例如葡萄糖以及源于生物的其他物質(zhì)的濃度，但是并不需要把本發(fā)明的反射比的開關(guān)限制于這類基體。例如，用任何不溶于水的親水物質(zhì)和任何其他種類的反射比測定物都可以形成與反射比開關(guān)一起使用的基體。
提供測定紅血細(xì)胞中葡萄糖的具體例子，目的在于更詳細(xì)地說明本發(fā)明的優(yōu)點。雖然此實例是本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，但并不能將本發(fā)明局限于檢測血液中的葡萄糖。
用于組成試劑組分的聚酰胺表面提供了許多本發(fā)明所需要的特征。這些特征是試劑組分是親水的(很易吸收試劑和樣品)、不因潤濕而變形(因而為讀取反射比而提供平滑的表面)、能與酶配伍(為了提供良好的貯存穩(wěn)定性)、吸收每單位薄膜體積中有限量的樣品(為顯示擴(kuò)大的動力學(xué)測量范圍所必須的)、以及具有足夠的潤濕強(qiáng)度，因此可以按常規(guī)方法來制造。
在典型的結(jié)構(gòu)中，實施本方法可用包括塑料載體和試劑組分(基體具有浸透在其中的信號產(chǎn)生系統(tǒng))的儀器。用于制備試劑組分的優(yōu)選基體是尼龍微量過濾膜，尤其是由澆注在非織造聚酯纖維芯上的尼龍66制成的薄膜。許多這類尼龍微量過濾膜是由Pall超微過濾公司生產(chǎn)提供的，平均孔徑為0.1～3.0微米。這類材料具有機(jī)械強(qiáng)度和柔曲性、在與水接觸時的尺寸穩(wěn)定性、以及快速潤濕的性能。
尼龍的具體化學(xué)結(jié)構(gòu)可以有許多變化，其中包括未官能化的含有帶電端基的尼龍66(由Pall超微過濾公強(qiáng)出售，商標(biāo)為Ultipose;“Pall”)。正電荷為主的在pH6以下，而負(fù)電荷為主的在pH6以上。在其他些一薄膜中，在形成薄膜之前先將尼龍官能化，得到具有不同性質(zhì)的薄膜。用羧基官能化的尼龍在pH值很寬的范圍內(nèi)帶負(fù)電荷，(Pall公司以名為Carboxydyne出售)。尼龍還可在其表面上用高密度帶正電荷基團(tuán)，一般用季胺基團(tuán)進(jìn)行官能化，使其在pH值很寬的范圍內(nèi)電荷變化很小(Pall公司出售，產(chǎn)品名為Posidyne)。這種材料特別適用于實施本發(fā)明。所用的薄膜還可以具有用于蛋白質(zhì)共價固定的反應(yīng)官能團(tuán)(Pall公司出售，名為Biodyne免疫親合薄膜)。這種材料可用于共價連接用作試劑的蛋白質(zhì)，例如酶。雖然所有這些材料都可采用，但在其表面具有高密度帶正電荷基團(tuán)的尼龍，當(dāng)按配方制成干試劑墊時可提供最好的試劑穩(wěn)定性。未官能化的尼龍?zhí)峁﹥H次于最好的穩(wěn)定性，羧化尼龍也提供僅次于最好的穩(wěn)定性。
當(dāng)與全血一起使用時，能夠得到所需結(jié)果的孔徑約為0.2～2.0微米，較佳約為0.5～1.2微米，最佳約為0.8微米。
有試劑組分在其上面組合的把手的形狀是比較不重要的，只要把手能使樣品到達(dá)試劑組分的一面和使被測量其反射比的入射光到達(dá)試劑組分的另一面。把手還有助于把試劑組分放入吸光度測量裝置，使它能與光學(xué)系統(tǒng)對齊。適合用的把手的一個例子是聚酯薄膜條或其他塑料條，在該條上已涂有轉(zhuǎn)移粘合劑，例如3M 465或Y9460轉(zhuǎn)移粘合劑。在塑料條上沖一個孔，穿過轉(zhuǎn)移粘合劑。然后將含有試劑或以后再加試劑的試劑組分，一般為薄墊形狀，用轉(zhuǎn)移粘合劑貼在把手上，使其與穿過把手和轉(zhuǎn)移粘合劑的孔的周圍的把手牢固地粘結(jié)在一起。這種裝置已在圖1中說明，圖中顯示將試劑墊11用粘合劑13與聚酯薄膜把手12粘結(jié)?？?4可使樣品或入射光到達(dá)試劑墊11的一面，到達(dá)試劑墊的另一面則是不受限制的。可以選擇試劑墊和把手的尺寸，以便使試劑墊在最靠近光源和反射光檢測器位置上牢固地裝進(jìn)反射比讀數(shù)儀器。
如果選擇尼龍基體來做試劑墊，當(dāng)使用所指出的厚度時，最好是將試劑墊用夾持器來承載，承載的方法是從任何方向來測量，在涂有樣品的和測量光反射比的部位上沒有超過6微米的試劑墊是不被夾持器承載的。沒有支承的面積較大，則往往會使薄膜的尺寸穩(wěn)性較差，從而給測量表面的反射比帶來不利的影響。圖1所示試劑條上的孔14的直徑為5毫米，其操作情況令人滿意。
對此種孔的最小直徑并無特別限制，不過，為了使制造、樣品涂布和光反射比讀取容易進(jìn)行，較好的孔直徑至少是2毫米。
雖然許多染料都能用作指示劑，但其選擇仍然決定于樣品的性質(zhì)。對于全血作為測定介質(zhì)，或在被分析的溶液中有其他測定介質(zhì)和其他污染物來說，必須選擇一種染料，此種染料具有一種吸光率，此吸光率的光的波長不同于紅血細(xì)胞吸收的光的波長。MBTH-DMAB染料偶合(3-甲基-2-苯噻唑啉酮腙氫氯化物和3-二甲氨基苯甲酸)，雖然前面已經(jīng)介紹過適用于酶免疫測定中過氧化物酶標(biāo)記物的顯色，但從未用于市售的葡萄糖測量試劑中。這種染料偶合產(chǎn)生較大的動力學(xué)范圍，并且與用于葡萄糖測量的傳統(tǒng)染料，例如聯(lián)苯胺衍生物相比，酶的穩(wěn)定性提高了。此外，MBTH-DMAB染料偶合并不致癌，而是具有大多數(shù)聯(lián)苯胺衍生物的特征。
能夠用于測量葡萄糖的另一個染料偶合是AAP-CTA(4-氨基安替比林和鉻變酸)偶合。雖然此染料偶合的動力學(xué)范圍不如MBTH-DMAB的寬，但在測量葡萄糖時卻是穩(wěn)定的，適用于實施本發(fā)明。再者，AAP＝CTA染料偶合的動力學(xué)范圍擴(kuò)大了，其酶催化活性穩(wěn)定性大于較廣泛使用的聯(lián)苯胺染料。
使用MBTH-DMAB偶合可以用一個校準(zhǔn)系數(shù)來校準(zhǔn)血細(xì)胞比容和血液氧合程度。較為普遍使用的聯(lián)苯胺染料并不能作這樣的校準(zhǔn)。此染料形成的發(fā)色團(tuán)，能吸收大約635毫微米的波長，但不能有效地擴(kuò)展到700毫微米。在測量波長時容許的變動幅度很小(約±10毫微米)。在700毫微米波長處，可以通過測量血液顏色來測量血細(xì)胞比容和氧合程度。此外，市售發(fā)光二極管(LED)可在635毫微米和700毫微米兩個波長處進(jìn)行測量，從而簡化了測量裝置的大批生產(chǎn)。采用上述最佳的薄膜孔徑和本試劑配方，就可在700毫微米一個波長上進(jìn)行測量來校準(zhǔn)血細(xì)胞比容和氧合性能。
發(fā)現(xiàn)有兩個附加條件可對聚酰胺基體上的葡萄糖氧化酶和過氧化物酶的配方提供特殊的穩(wěn)定性和較長的儲存期限。這二個附加條件是應(yīng)用在3.8～5.0，較好的是大約3.8～4.3，最好的是大約4.0的pH值范圍，和使用高濃度的緩沖系統(tǒng)來將試劑涂在基體上。最有效的緩沖液為10%(重量)的檸檬酸緩沖液，有效濃度為5～15%。在使用這種重量/體積百分比的溶液中，可將試劑涂在基體上。同樣摩爾數(shù)的其他緩沖液也可使用。采用低pH值，最好pH4左右、MBTH-DMAB染料系統(tǒng)、以及大約500～1000單位/毫升的高濃度酶溶液，可以獲得最大的穩(wěn)定度。
在制備MBTH-DMAB試劑和形成信號產(chǎn)生系統(tǒng)的其余部分的酶系統(tǒng)時，不需要保持精確的體積和比值，不過，應(yīng)用下面建議的數(shù)值可得到良好的結(jié)果。當(dāng)滿足下述條件時，試劑很易被基體吸收，這些條件是葡萄糖氧化酶在溶液中有大約27～54%(體積)，過氧化物酶的濃度約為2.7～5.4毫克/毫升，MBTH的濃度約為4-8毫克/毫升以及DMAB的濃度約為8～16毫克/毫升。DMAB-MBTH的重量比較好的是保持在(1-4)∶1，更好的是在大約(1.5～2.5)∶1，最好的是在大約2∶1。
試劑組分的基本制作技術(shù)一旦建立后是很簡單的。薄膜本身是牢固和穩(wěn)定的，選用優(yōu)選實施例中的尼龍薄膜尤其如此。涂試劑只需要二種溶液，而這二種溶液都很容易配制，并且很穩(wěn)定。第一種溶液通常含有染料成分，第二個溶液通常含有酶。例如當(dāng)使用MBTH-DMAB染料偶合時，將各個染料溶于含水有機(jī)溶劑，一般使用1∶1的乙腈和水的混合物。將基體放在溶液中浸一下，吸去多余的液體，然后將基體在50～60℃下干燥10～20分鐘。再將含有染料的基體浸在含酶的水溶液中。典型的配方中含有過氧化物酶和葡萄糖氧化酶，以及任何所需的緩沖液，防腐劑、穩(wěn)定劑等。然后將基體吸干，除去多余的液體并按上述條件進(jìn)行干燥。葡萄糖試劑的典型配方如下
染料浸漬組合40毫克MBTH，80毫克DMAB，5毫升乙腈，5毫升水。
攪拌至所有固體全部溶解后，傾注在玻璃板或其他平滑表面上。浸漬一片Posidyne薄膜(Pall公司產(chǎn)品)，吸去多余液體，在56℃下干燥15分鐘。
酶液浸漬組合6毫升水，10毫克EDTA二鈉鹽，200毫克縮多氨酸，低粘度，＜Sigma′0.668克檸檬酸鈉，0.523克檸檬酸，2.0毫升6%(重量)Gantrez AN-139溶于水中，＜GAF′30毫克辣根過氧化物酶，100單位/毫克，3.0毫升葡萄糖氧化酶，2000單位/毫升。
攪拌至所有固體全都溶解后，傾注在玻璃板上或其他平滑表面上。浸漬一片預(yù)先用染料浸透過的薄膜，吸去多余的液體，在56℃下干燥15分鐘。
用于讀取反射比電子儀器至少包括光源、反射光檢測器、放大器、模數(shù)變換器、帶存儲器和程序的微處理機(jī)和顯示裝置。
光源一般由發(fā)光二極管(LED)組成。雖然可以采用多色光源和能測量兩個不同波長的光檢測器，但是優(yōu)選的儀器則包括兩個LED光源或一個能發(fā)射兩個不同波長的光的二極管。能產(chǎn)生本說明書中所述的波長的光的市售LED，包括Hewlett Packard HLMP-1340，發(fā)射的最大波長為635毫微米，和Hewlett Packard QEMT-1045，窄帶發(fā)射的最大波長為700毫微米。適用的市售光檢測器包括Hammamatsu 5874-18K和Litronix BPK-65。
雖然其他測量方法都可采用，但下述方法可提供合乎需要的結(jié)果。在開始計時后，在特定的時間間隔，用光電檢測器進(jìn)行讀數(shù)。635毫微米LED僅在很短的測量時間間隔期間開動，該測量時間間隔是在發(fā)射比開關(guān)所顯示的起動時間后大約20秒鐘開始的。如果這個讀數(shù)顯示，在樣品中葡萄糖含量很高，為了提高精度，可取30秒讀數(shù)并將其用于最后計算中。一般認(rèn)為，高含量的起點約為250毫克/分升。用測量開始后大約15秒鐘所取的700毫微米的讀數(shù)來校準(zhǔn)背景。當(dāng)適用的LED被啟動時(一般不到1秒鐘)，將光檢測器在時間間隔內(nèi)得到的讀數(shù)進(jìn)行積累。將信號放大并轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號后，然后將得到的反射比原始讀數(shù)用微處理來進(jìn)行計算。各種微處理機(jī)都可用于計算。Rockwell國際公司制造的AIM 65單板微計算機(jī)已證明是令人滿意的。
對于使用者來說，本發(fā)明的方法和儀器，程序非常簡單，操作步驟最少。使用時，將試劑條放在檢測器中，條中的孔與檢測系統(tǒng)中光學(xué)器件對齊，將可移動的蓋子或其他罩子放在光學(xué)器件和試劑條上，保護(hù)裝置使其不受環(huán)境光的影響。然后按測量儀器上的鍵鈕，開始測量順序，啟動微計算機(jī)，測量從未反應(yīng)的試劑墊上反射出的光，即所謂的空白讀數(shù)(R干)。移去蓋子，將一滴血涂在試劑墊上，一般是在試劑墊與光學(xué)器件和讀數(shù)裝置對齊時才將血涂在試劑墊上。為了減少操作步驟，較好的是將放在檢測器中的試劑條與光學(xué)器件對齊。當(dāng)樣品流過基體和在其反面?zhèn)攘糠瓷涔鈺r，由于反射比的降低，儀器能夠檢測出血液或其他樣品的涂布情況。反射比的降低啟動計時順序，并于這個問題將在本說明書的其他部分予以詳細(xì)介紹。在涂樣品的15秒鐘內(nèi)，應(yīng)再將蓋子蓋上，不過這段時間的長短取決于所測樣品的種類。當(dāng)測量血糖樣品時，一般是在涂血液后約30秒即可顯示結(jié)果，不過對于葡萄糖濃度低于250毫米/分升的葡萄糖樣品來說，20秒鐘的反應(yīng)時間也是容許的。假如測定其他樣品時，顯示結(jié)果的適宜時間可以有所不同，而且根據(jù)所選擇的試劑/樣品的特性很容易測定出來。
應(yīng)用本底電流，即，從帶電但無光從試劑墊上反射的光電檢測器發(fā)出的電流(以便對本底進(jìn)行校正)，可以對葡萄糖含量(或任何其他被測定的分析物)進(jìn)行特別準(zhǔn)確的評估。業(yè)已證明，根據(jù)本說明書的優(yōu)選實施例制作的特殊儀器，在2～3個月內(nèi)，此數(shù)值是不會變化的，而且有可能把該背景讀數(shù)作為常數(shù)編存到計算機(jī)存儲器中。但是，對于每一次的分析來說，為了取得較精確的結(jié)果，將此步驟稍加改進(jìn)，即可測出此數(shù)值。在此改進(jìn)的步驟中，在將試劑條放入之前可先將測量儀打開，蓋上蓋了，即可測出本底電流。然后再將測試條放入測量儀中，蓋上蓋子，測定R干值，然后再按上述方法繼續(xù)進(jìn)行操作。對于這種改進(jìn)方法來說，在測量儀的整個使用期內(nèi)，不需要穩(wěn)定的本底電流也可以提供較精確的結(jié)果。
計算葡萄糖測定結(jié)果所需的原始數(shù)據(jù)是上述以本底反射比(Rb)記錄的本底電流;還有上述的未反應(yīng)的測試條的讀數(shù)(R干);以及終點測定值。應(yīng)用本文中所述優(yōu)選實施例，終點并不特別穩(wěn)定，并且必須從開始涂布血液起精確計時。但是，本文中所述的測量儀可以自動進(jìn)行這種計時。對于葡萄糖濃度低于250毫克/分升時，在20秒內(nèi)可達(dá)到適宜的穩(wěn)定終點，并讀取最終反射比R20。對于葡萄糖濃度高達(dá)450毫克/分升時，讀取30秒的反射比讀數(shù)R30是合適的。雖然本文中所述的系統(tǒng)，具有高達(dá)800毫克/分鐘葡萄糖的良好辨別能力，但是有一定程度的干擾而且葡萄糖濃度高于450毫克/分升時結(jié)果就不準(zhǔn)確了，不過，還不致于大到發(fā)生嚴(yán)重問題。對于較高水平的葡萄糖濃度來說，較長的反應(yīng)時間應(yīng)可提供更為合適的讀數(shù)。
對于雙波長測量來說，700毫微米反射比讀數(shù)通常是在15秒時讀取(R15)。在15秒鐘時，血液將使試劑墊完全飽和。超過15秒鐘，染料反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行，并可檢測到一小部分700毫微米的讀數(shù)。由于染料吸收700毫微米的信號是不利的，所以在計算時可以不考慮超過15秒以上的讀數(shù)。
上述原始數(shù)據(jù)可用于計算正比于葡萄糖濃度的參數(shù)，葡萄糖濃度比反射比測量更容易目測。在需要時，可應(yīng)用反射比的對數(shù)變換，這種變換類似于在透射分光光度計中觀察到的吸收率與被分析物濃度之間的關(guān)系(比爾定律)。特別為反射比分光光度計推導(dǎo)的簡化的Kubelk-Monk方程已證明是特別有用的。在此推導(dǎo)式中，將K/S與被分析物的濃度相關(guān)聯(lián)，K/S的定義可用下列方程式1描述。
K/S-t＝(1-R＊t)/(2×R＊t) (1)R＊t是在一特定終點時間t時所取的反射比，并且是式(2)所述的入射光束的被吸收部分，在式(2)中，Rt是終點反射比R20或R30。
R＊t＝(Rt-Rb)/(R干-Rb) (2)R＊t的變化范圍是從無反射光(Rb)時為0至全反射光(R干)時為1。在計算時應(yīng)用反射率，大大簡化了測量儀的設(shè)計，因為高穩(wěn)定的光源和檢測電路都不需要了，由于這些組件是由每個R干和Rb的測量值來監(jiān)控的。
對一個波長的讀數(shù)來說，K/S可在20秒(K/S-20)或30秒(K/S-30)時進(jìn)行計算。將YSI(耶洛斯普林斯儀器公司Yellow Springs Instruments)葡萄糖測定值與這些參數(shù)聯(lián)系起來的校準(zhǔn)曲線，可用方程式(3)概括的三階多項式方程來精確地描述。
YSI＝a0+a1(K/S)+a2(K/S)2+a3(K/S)3(3)
這些多項式的系數(shù)列于表1。
表1單個波長校準(zhǔn)曲線的三階多項擬合系數(shù)K/S-20 K/S-30a0-55.75 -55.25a10.1632 0.1334a2-5.765×10-5-2.241×10-5a32.58×10-81.20×10-8在優(yōu)選實施例中所測定的單個化學(xué)物質(zhì)是MBTH-DMAB吲達(dá)染料，被分析的復(fù)合基體是分布在0.8微米Posidyne薄膜上的全血。題為“近紅外分光光度測量方法在食品非破壞性分析中的應(yīng)用實驗結(jié)果綜述”(CRC Critical Review in Food Science and Nutrition，18(3)203～30(1983))的綜述，介紹了測量光密度差△OD(λa-λb)的儀器的應(yīng)用，其中ODλa是相當(dāng)于所測成分的吸收峰值的波長的光密度，ODλb是相同成分無明顯吸收的波長的光密度。
雙波長測量的計算方法必然比單波長測量的復(fù)雜，但卻更有效。用700毫微米讀數(shù)進(jìn)行的第一次校正，是簡單地扣除血液的背景顏色。為了進(jìn)行這種校正，由于血液顏色造成的在635毫微米和700毫微米之間吸光率的關(guān)系可以并且已經(jīng)通過在很寬的血液顏色范圍內(nèi)測量含有0毫克/分升葡萄糖的血液樣品來進(jìn)行測定。顏色范圍是由改變血細(xì)胞比容來建立的，并觀察到是相當(dāng)好的線性關(guān)系。根據(jù)這些曲線，可將在700毫微米處的K/S-15進(jìn)行正規(guī)化，得到相當(dāng)于在635毫微米處的K/S-30。在方程式(4)中敘述了此種關(guān)系，式中K/S-15n是在700毫微米的正規(guī)化的K/S-15。
K/S-15n＝(K/S-15×1.54)-0.133 (4)
必須注意的是正規(guī)化的700微毫米信號和635毫微米信號只是在葡萄糖為0對才會相等。導(dǎo)出校準(zhǔn)曲線的表示式的定義可用下列方程式5和6描述。
K/S-20/15＝(K/S-20)-(K/S-15n) (5)K/S-30/15＝(K/S-30)-(K/S-15n) (6)這些曲線是用類似于方程式(3)的四階多項式方程的最好擬合，即將四階項K/S加到式(3)中去。上述方程的計算機(jī)擬合系數(shù)列于表2。
表2雙波長校準(zhǔn)曲線的四階多項式擬合系數(shù)K/S-20/15 K/S-30/15a0-0.1388 1.099a10.1064 0.05235a26.259×10-51.229×10-4a3-6.12×10-8-5.83×10-8a43.21×10-111.30×10-11還研究出應(yīng)用第二次校正來消除色譜法影響造成的誤差。低血細(xì)胞比容樣品與具有相同的635毫微米讀數(shù)的高血細(xì)胞比容樣品相比，其特征在于具有低的700毫微米讀數(shù)。當(dāng)(K/S-30)/(K/S-15)比在寬的血細(xì)胞比容和葡萄糖濃度的范圍內(nèi)對K/S-30作圖時，在圖上形成的曲線表明顯示色譜法影響(在曲線以上)和沒有色譜法影響(在曲線以下)的樣品之間的界線。曲線以上的樣品的K/S-30通過將讀數(shù)提高到對應(yīng)于在具有相同(K/S-30)/(K/S-15)的曲線上的某個點來進(jìn)行校正。
上述校正因子是專用于單架儀器和有限數(shù)量的試劑的制劑。對于各個儀器和試劑的最佳計算方法可按上述相同方法。
總之，本發(fā)明的系統(tǒng)將操作者的操作步驟減少到最少的程度，比現(xiàn)有技術(shù)的反射比讀數(shù)方法具有更多的優(yōu)點。例如，在與現(xiàn)有的測定血液中葡萄糖的方法相比，具有許多明顯的優(yōu)點。第一，使薄試劑墊飽和所需要的樣品量很少(一般為5～10微升)。第二，所需操作時間僅僅是將樣品涂到薄親水層上和蓋緊蓋子所需的時間(一般為4～7秒鐘)。第三，不需要同時開始計時。第四，可用全血。本發(fā)明方法不需要進(jìn)行分離或利用無紅細(xì)胞樣品，而且還可以應(yīng)用于其他深色樣品。
由于應(yīng)用全血實施本發(fā)明還導(dǎo)致一些不明顯的優(yōu)點。一般說來，含水溶液(如血液)會滲入親水薄膜，而在薄膜背面形成一層液體層，于是此種表面不適合于進(jìn)行反射比的測定。但是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，顯然由于血液中的紅血細(xì)胞和蛋白質(zhì)與基體發(fā)生作用，血液就會潤濕聚酰胺基體而無多余的液體滲入多孔基體，來在基體背面干擾反射比讀數(shù)。
此外，用于本發(fā)明的薄膜在潤濕時，會被認(rèn)為是能透射光的，而只有一部分微弱信號返回反射比測量裝置?，F(xiàn)有技術(shù)一般都指出，為了反射足夠的光，反射層必須在基體后面。在其他的情況下，在測量顏色前，將白色墊放在試劑墊的后面。但是在本發(fā)明的情況下，既不需要反射層，也不需要白色墊。事實上，本發(fā)明一般是當(dāng)入射光照射到基體時，在試劑組分的背面放一塊吸光表面來進(jìn)行的。應(yīng)用在試劑組分背面有一塊的吸光表面，并同時在兩個不同波長上測量反射比，就可以得到滿意的反射比測量結(jié)果，而無需從基體中除去多余的液體，從而減少了現(xiàn)有技術(shù)一般要求的步驟。
以上對本發(fā)明作了一般性介紹，參閱下述具體實施例，將會更好地理解本發(fā)明，除非另有說明，否則這些實施例只是為了說明本發(fā)明，而不能認(rèn)為是用來限制本發(fā)明。
實施例1重現(xiàn)性應(yīng)用一份男性的血液樣品(JG，血細(xì)胞比容＝45)，收集列于表3～5的重現(xiàn)性數(shù)據(jù)。
表3單波長MPX系統(tǒng)的重現(xiàn)性平均值(毫克/分升) S.D.(毫克/分升) %C.V.
YSI(毫克/分升) 20秒 30秒 20秒 30秒 20秒 30秒25 23.1 23.0 2.1 2.04 9.1 9.055 53.3 53.2 3.19 3.32 6.0 6.3101 101 101 3.0 3.3 3.0 3.3326 326.6 327 13.3 9.8 4.1 3.0501 503 17.1 3.4690 675 28 4.15810 813 37 4.5表4雙波長MPX系統(tǒng)的重現(xiàn)性平均值(毫克/分升) S.D.(毫克/分升) %C.V.
YSI(毫克/分升) 20秒 30秒 20秒 30秒 20秒 30秒25 25 27 1.34 1.55 5.4 5.755 55 57.4 2.58 2.62 4.7 4.6101 101 101.5 2.55 2.18 2.5 2.1326 332 330 15.0 7.1 4.5 2.1501 505 21.3 4.2690 687 22.8 3.3810 817 30.4 3.7
表53.0毫米直徑孔隙的重現(xiàn)性%C.V.
YSI(毫克/分升) 4.7毫米 3.0毫米55-100 4.8 4.9300 3.0 5.0600 3.8 5.5平均值 3.9 5.1將血液分成等分試樣，加入葡萄糖使其含量范圍為25～800毫克/分升。從500個樣品條(Lot FJ4-49B)中隨便取樣，測定每一條中的葡萄糖檢驗水平，共進(jìn)行了20個樣品的測定。從本研究的結(jié)果得出如下結(jié)論1)單波長與雙波長的比較30秒雙波長的結(jié)果的平均C.V.為3.7%V.S.，30秒單波長的結(jié)果的平均C.V.為4.8%，在25～810毫克/分升的葡萄糖范圍內(nèi)，平均C.V.值改進(jìn)了23%。在25～326毫克/分升的葡萄糖范圍內(nèi)，平均C.V.值改進(jìn)了33%，此時平均C.V.值從5.4%降至3.6%，在最常用的葡萄糖范圍內(nèi)有顯著的改進(jìn)。在25～325毫克/分升的葡萄糖范圍內(nèi)，與單波長的測量相比，20秒的雙波長的測量，平均C.V.值的改進(jìn)量是相同的(表3和表4)。
2)雙波長，20秒與30秒結(jié)果的比較在25～100%毫克/分升范圍內(nèi)，20秒結(jié)果的平均C.V.與30秒讀數(shù)幾乎相等，即4.2%與4.1%。但是，在326毫克/分升，30秒讀數(shù)的C.V.為2.1%，而20秒的C.V.為4.5%。正如從K/S-20響應(yīng)曲線看到的，曲線的斜率在250毫克/公升以上時明顯下降。結(jié)果異致20秒結(jié)果的葡萄糖水平高于300，再現(xiàn)性很差。根據(jù)此再現(xiàn)性數(shù)據(jù)，20秒結(jié)果的截止點，大約是在100～326毫克/分升之間。250毫克/分升的截止點可根據(jù)下面實施例2中的分離研究結(jié)果進(jìn)行確定。
3)孔徑大小研究了較小的光學(xué)部件孔徑，即3.0毫米(如上所述)5～0分鐘。應(yīng)用10個同樣的，手工浸漬的片狀樣品的初始實驗，的確證明用3.0毫米的孔徑改進(jìn)了C.V.值，顯然是因為較容易與系統(tǒng)的光學(xué)部件對齊的緣故。但是，采用機(jī)器壓制的筒形薄膜時，4.7毫米較大孔徑的平均C.V.(表5)為3.9%以(如上所述)，3.0毫米孔徑的平均C.V.為5.1%。此時C.V.增加了30%，正如下面所討論的，這很可能是由于機(jī)壓筒形薄膜的表面不均勻所造成的。
實施例2分離為了將本發(fā)明方法(MPX)與一般的現(xiàn)有方法進(jìn)行比較，采用由耶洛斯普林斯儀器公司(YSI耶洛斯普林斯，俄亥俄)制造的耶洛斯普林斯23A型葡萄糖分析儀，測定36名輸血者的血液。輸血者男女人數(shù)相等其血細(xì)胞比容范圍為3.5%至55%。所用血樣是在30小時內(nèi)收集的，用肝素鋰(lithium heparin)作為抗凝血劑。每份血液樣品分成等分部分，加入葡萄糖，得到152份0～700毫克/分升葡萄糖范圍的樣品。每份樣品都測定兩份，得到的數(shù)據(jù)點總共為304個。
根據(jù)這些數(shù)據(jù)和葡萄糖含量繪制響應(yīng)曲線，然后用適當(dāng)?shù)姆匠淌竭M(jìn)行計算(表1和2)。然后將這些MPX葡萄糖值對YSI值進(jìn)行作圖，得到點狀圖。
MPX系統(tǒng)的對比對20秒和30秒兩種測量時間來說，目視觀察發(fā)現(xiàn)，在單波長的點狀圖上的點比雙波長的點狀圖上的點更為分散。超過250毫克/分升的20秒讀數(shù)顯得非常分散，但是30秒讀數(shù)在葡萄糖水平為≥500毫克/分升時才分散得很寬。
在不同的葡萄糖范圍內(nèi)，測定偏離YSI的偏差，用數(shù)量來說明這些點狀圖。得到的結(jié)果如下
表6根據(jù)分離數(shù)據(jù)確定MPX的精度MPX 測量時間 S.D(毫克/分升) C.V.范圍＊波長 (秒) 0～50 50～250 250～450 450～70單 20 ±5.6 7.2 14.5 -單 30 ±6.9 7.1 8.8 10.2雙 20 ±2.3 5.3 12.8 -雙 30 ±2.19 5.5 5.8 8.4注這些是測定方法中的中間C.V.值。
a)雙波長系統(tǒng)得到的C.V.值低于單波長系統(tǒng)30%。
b)單波長系統(tǒng)，在0～50毫克/分升范圍內(nèi)，S.D.為±6～7毫克/分升，而雙波長的測量，S.D.只有±2.2毫克/分升。
c)30秒MPX測量的截止點為250毫克分升。對50～250毫克/分升來說，20秒和30秒測量可得到相同的測定方法中的中間C.V.值(單波長的約為7%，雙波長的約為5.5%)。但是，在250～450克/分升范圍時，測定方法中的中間C.V.值則比上述C.V.值高一倍還多，對20秒讀數(shù)來說，單波長的是14.5%，雙波長的是12.8%。
d)30秒讀數(shù)，在450毫克/分升以上，對單波長和雙波長都不適用(C.V.為10.2%和8.4%)。
結(jié)論MPX兩個系統(tǒng)的最佳量在0～450毫克/分升范圍內(nèi)。
1)MPX 30雙波長系統(tǒng)此種兩個波長系統(tǒng)可提供30稍測量時間，在50～450毫克/分升范圍內(nèi)(表7)，C.V.為11.3%，具有95%置信界限(定義是測量概率在YSI的2 S.D.內(nèi))和在0～50毫克/分升范圍內(nèi)，S.D.為±4.4毫克/分升。
2)MPX 30/20雙波長系統(tǒng)此種雙波長系統(tǒng)可提供20秒測量時間和在0～250毫克/分升范圍內(nèi)，以及30秒測量時間和在250～450毫克/分升范圍內(nèi)。其95%置信界限與MPX 30雙波長系統(tǒng)(表7)的幾乎相同，在50～450毫克/分升范圍內(nèi)，C.V.為11.1%，而在0～50毫克/分升范圍內(nèi)，C.D.為±4.6毫克/分升。
表7MPX、GlucoScan Plus和Accu-Chek bG＊試劑條95%置信界限的對比測量范圍 MPX單波長 MPX雙波長毫克/分升 20秒 30秒 20秒 30秒0～50 11.2毫克/分升 13.8毫克/公升 4.6毫克/分升 4.4毫克/分升50～250 14.4% 14.2% 10.6% 11.0%250～450 - 17.6% - 11.6%77～405 GlucoScan Plus(Drexler Clinical) 15.9%77～405 Accu-Chek bG (Drexler Clinical) 10.7%50～450 MPX 20/30 雙波長混合 11.1%50～450 MPX30 雙波長 11.3%＊MPX的置信界限根據(jù)YSI得到。GlucoScan Plus和Accu-Chek b G的置信界限由回歸方程對YSI作圖導(dǎo)出，由于校準(zhǔn)時差值較小，故除去偏倚。
實施例3穩(wěn)定性最佳穩(wěn)定性的大部分實驗室小型裝置工作都是用人工浸漬的0.8微米Posidyne膜片完成的。具體的染料/酶的配制如前所述。
1)室溫穩(wěn)定性此研究試圖用圖來說明響應(yīng)貯藏在18～20℃用硅膠干燥的0.8微米Posidyne薄膜試劑的任何變化。兩個半月后，將室溫樣品的響應(yīng)與儲存在5℃的樣品的響應(yīng)進(jìn)行比較時，并無值得注意的變化。各個點狀圖的葡萄糖含量范圍均為0～450毫克/分升。
2)37℃時的穩(wěn)定性37℃穩(wěn)定性研究所用的試劑與室溫研究所用試劑相同。把在37℃下與在室溫下，用粘合劑或不用粘合劑加應(yīng)力的試劑條的葡萄糖含量的差值對時間作圖。雖然，由于手制試劑條再現(xiàn)性很差，所以數(shù)據(jù)是離散的，但是無論是否用粘合劑加應(yīng)力的試劑條的，穩(wěn)定性都是極好的。
3)56℃時的穩(wěn)定性應(yīng)用在膜片上的相同配方的不同制劑進(jìn)行8次5至6天的穩(wěn)定性研究(表8)。對低葡萄糖(80～100毫克/分升)試驗水平來說，在加應(yīng)力時，平均葡萄糖值下降3.4%，最高下降9.55%。對于高葡萄糖(280～320毫克/分升)試驗水平的來說，葡萄糖讀數(shù)平均下降3.4%，最大下降10.0%。
表8pH＝4.0、0.8微米Posidyne膜片試劑配方在56℃加應(yīng)力5～6天的穩(wěn)定性百分差(56℃與室溫樣品比較)樣品編號 YSI(80～100毫克/分升) YSI(280～320毫克/分升)FJ22B -6.25 +5.4FJ27A -4.0 -5.14FJ28B -2.4 -5.3FJ30H -9.55 -10.0FJ31C +4.43 -1.24FJ36 -3.2 -8.5FJ48B＊ -3.0 0.0GM48A＊ -3.0 -2.5平均值 -3.4 -3.4＊這兩個樣品含有二倍標(biāo)準(zhǔn)濃度的酶和染料。
研究在56℃加應(yīng)力19天的薄膜，證明用或不用粘合劑加應(yīng)力試劑的條沒有很大差別。在二種葡萄糖值的情況下，在低檢驗水平(80～100)和300毫克/分升時，19天的葡萄糖值都下降＜15%。
另一項56℃的研究是采用人工浸漬的0.8微米Posidyne薄膜和二倍標(biāo)準(zhǔn)濃度的酶和染料來進(jìn)行的。制作相同配方的不同制劑，測定14天的穩(wěn)定性。將兩項研究的平均結(jié)果繪制成圖。高檢驗水平和低檢驗水平的葡萄糖在14天內(nèi)的變化都在±10%以內(nèi)。這些數(shù)據(jù)表明此配方特別穩(wěn)定。
實施例4樣品量表9列出MPX所需的樣品量。
表9樣品量對MPX測定的影響樣品量 雙波長 單波長(微升) 平均值 平均值低葡萄糖YSI＝563 41 50 39 31 40 31 42 30 19 304 44 49 49 49 48 41 45 44 45 445 54 48 49 51 50 50 49 48 49 4910 48 48 50 47 48 54 53 56 55 5420 49 49 49 50 49 55 57 58 60 58高葡萄糖YSI＝3603 301 260 276 286 280 274 232 244 260 2524 383 387 367 341 367 361 356 342 318 3445 398 402 382 370 388 378 387 366 351 37010 364 362 378 368 368 356 358 379 369 36620 375 370 380 378 376 380 382 389 385 384
用微量移液管將表中所示的樣品體積轉(zhuǎn)移到圖1所示的試劑墊上。當(dāng)將扎手指取得的血涂在試劑條上時，不能將全部樣品轉(zhuǎn)移，因此，上表所示的體積不代表進(jìn)行分析時從手指上擠出的所需全部血樣量。3-微升的樣品是完全覆蓋試劑墊圈所需的最低量。此量不能提供足夠的樣品來完全浸透試劑墊，并且MPX的測定結(jié)果偏低。4-微升樣品僅僅浸透試劑墊，而5微升樣品具顯然是足夠的。10微升樣品是較大的滴量，而20微升樣品是極大的滴量，很可能只是在用移液管來取血樣時才使用。
在低葡萄糖濃度時，單波長的結(jié)果與樣品量有一定的關(guān)系，而采用雙波長測定時，則完全消除了這種依賴關(guān)系。雖然單波長的這種關(guān)系也許是可接受的，但是，顯然是不理想的。
實施例5再現(xiàn)性上述實驗測定法總是重復(fù)進(jìn)行的，通常每個數(shù)據(jù)點測定2、3或4次。即使用極高血細(xì)胞比容或極高氧氣水平的樣品這些結(jié)果總是很一致的。C.V.值低于5%。因此，顯然，再現(xiàn)性是非常好至極好的。
本發(fā)明可提供許多比目前市售的或文獻(xiàn)中所介紹的系統(tǒng)好的優(yōu)點。原始記錄簡易，幾乎不需要專門的技巧，使用者比較地不容易出錯?？裳杆俚剡M(jìn)行測定，并使用便宜和比較無害的試劑，是在家中使用的設(shè)備和物質(zhì)的重要條件。使用者得到的結(jié)果是可以相信的并可與保養(yǎng)療法結(jié)合起來。此外，試劑具有較長的貯存期限，因此，得到的結(jié)果在較長的時期內(nèi)是可靠的。設(shè)備簡單可靠，基本自動化。
在本說明書中特別提到的所有專利和刊物，對本專業(yè)的普通技術(shù)人員來說是列舉性質(zhì)的，而對于與本發(fā)明有關(guān)系的那些專利和刊物來說，就象那些特別和個別地進(jìn)行參考的參考文獻(xiàn)一樣都進(jìn)行了個別地參考。
現(xiàn)已對本發(fā)明作了充分的描述，顯然，對本業(yè)業(yè)的普通技術(shù)人員來說，可在不脫離下面權(quán)利要求
書中所限定的本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)進(jìn)行各種修改和改進(jìn)。
權(quán)利要求
1.一種采用薄膜和產(chǎn)生光吸收染料產(chǎn)物的信號產(chǎn)生系統(tǒng)測定血樣中葡萄糖的方法，該系統(tǒng)與薄膜結(jié)合，通過薄膜表面反射比的測量，測定其中染料產(chǎn)物的含量，此法包括將全血涂在薄膜表面上，以及在涂有樣品的薄膜表面的另一面進(jìn)行測量。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，其中信號產(chǎn)生系統(tǒng)產(chǎn)生一種染料產(chǎn)物，此種染料產(chǎn)物吸收的光的波長不同于紅血細(xì)胞吸收的光的波長，反射比測量是在兩個不同波長上進(jìn)行的，其中一個是紅血細(xì)胞的吸收波長，另一個是染料產(chǎn)物的吸收波長。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2的方法，其中兩個波長分別約為635和700毫微米。
4.根據(jù)上述任何一項權(quán)利要求
的方法，其中信號產(chǎn)生系統(tǒng)包括葡萄糖氧化酶、過氧化物酶和MBTH-DMAB指示劑。
5.根據(jù)上述任何一項權(quán)利要求
的方法，其中薄膜的表面是聚酰胺。
6.根據(jù)權(quán)利要求
5的方法，其中聚酰胺帶正電荷，而葡萄糖氧化酶、過氧化物酶和MBTH-DMAB指示劑則在用于本方法之前先與薄膜結(jié)合。
7.一種測定葡萄糖的方法，此法包括將全血樣品涂于試劑組分上，其中試劑組分包括可與能夠生成反應(yīng)產(chǎn)物的葡萄糖氧化酶、過氧化物酶和染料指示劑結(jié)合的親水薄膜;使樣品滲入該薄膜;通過檢測樣品滲入薄膜和反射比的降低啟動預(yù)定時間的反射比讀數(shù)的計時;通過由染料產(chǎn)物的吸光率產(chǎn)生的反射比的附加變化，測定樣品中葡萄糖的含量。
8.根據(jù)權(quán)利要求
7的方法，其中染料指示劑是MBTH-DMAB指示劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求
7或8的方法，其中親水薄膜具有聚酰胺表面。
10.根據(jù)權(quán)利要求
7至9中任何一項權(quán)利要求
的方法，其中親水薄膜帶正電荷。
11.一種在反射比讀數(shù)裝置中啟動計時測量的方法，此法包括在將樣品涂在基體第二表面之前，從多孔基體的第一表面至少取得第一個反射比讀數(shù);從第一表面取得至少另一個反射比讀數(shù);將所述另一個反射比讀數(shù)與第一個反射比讀數(shù)進(jìn)行比較和當(dāng)達(dá)到第一表面的樣品導(dǎo)致預(yù)定的反射比降低時啟動計時測量;在所述另一個反射比讀數(shù)與反射比值相差達(dá)到預(yù)定差值后，在預(yù)定的時間至少取得一個測量反射比讀數(shù)。
12.根據(jù)權(quán)利要求
11的方法，其中當(dāng)液體測定介質(zhì)滲入基體的第一表面時，該表面開始變干，并且所述另一個反射比讀數(shù)不同于第一個反射比值。
13.根據(jù)權(quán)利要求
11或12的方法，其中基體具有與其結(jié)合的染料前體。
14.一種測定液體中被分析物的測量裝置，其中包括裝有不透光隔板的容器，該隔板可移動地來裝能容納被分析的吸收液體的多孔基體;照射基體表面的裝置;檢測從基體反射的兩個不同波長的光的光檢測裝置;收集反射光的讀數(shù)，以及根據(jù)被分析物的讀數(shù)或反應(yīng)產(chǎn)物對反射光的第一種波長的吸光率讀數(shù)和背景對反射光的第二種波長的吸光率讀數(shù)，計算液體中被分析物含量數(shù)值的控制裝置;以及報告該數(shù)值的裝置。
15.根據(jù)權(quán)利要求
14的裝置，進(jìn)一步包括一個在工作時與照光裝置、檢測裝置、控制裝置和報表裝置相連接的電子動力供應(yīng)裝置。
16.根據(jù)權(quán)利要求
14或15的裝置，其中照光裝置和檢測兩個不同波長的光的光檢測裝置一起構(gòu)成兩個不同波長的光源和單光檢測器，或一起構(gòu)成一個多色光源和兩個只限于檢測不同波長的光的光檢測器。
17.根據(jù)權(quán)利要求
14至16中任何一權(quán)利要求
的裝置，其中第一種波長的光為690～710毫微米，第二種波長的光為625～645毫微米。
18.根據(jù)權(quán)利要求
14至17中任何一項權(quán)利要求
的裝置，其中控制裝置根據(jù)二種波長的光中的任何一種波長的光的反射比開始下降時，使計時電路開始啟動，反射比的降低是在將液體涂在照明裝置所照的基體表面的背面后當(dāng)液體滲入基體時發(fā)生的。
19.根據(jù)權(quán)利要求
14至18中任何一項權(quán)利要求
的裝置，其中，在反射比開始降低之后，控制裝置使一個或幾個反射光的讀數(shù)可在預(yù)定的時間間隔內(nèi)取得。
20.根據(jù)權(quán)利要求
14至19中任何一項權(quán)利要求
的裝置，其中，控制裝置能夠在將液體涂到試劑墊之前，收集和儲存試劑墊的反射比讀數(shù)。
21.根據(jù)權(quán)利要求
20的裝置，其中，控制裝置還能夠在無光從試劑墊上反射的情況下收集和儲存檢測器的本底電流讀數(shù)。
22.根據(jù)權(quán)利要求
14至21中任何一項權(quán)利要求
的裝置，其中，當(dāng)向控制裝置提供動力進(jìn)行分析物檢測時，控制裝置自動收集和比較檢測器的順續(xù)反射比讀數(shù)、當(dāng)檢測到反射比下降時啟動計時電路、在反射比下降后在預(yù)定的時間間隔內(nèi)收集反應(yīng)反射比讀數(shù)、根據(jù)反應(yīng)反射比讀數(shù)計算在被分析的液體中分析物的濃度值、并將該值輸送到報表裝置。
23.按權(quán)利要求
22的裝置，其中當(dāng)向控制裝置提供動力，在進(jìn)行分析物檢測之前，進(jìn)行基本反射比測量時，在將液體涂到基體之前，控制裝置收集和儲存基體的基本反射比讀數(shù);以及其中當(dāng)接著向控制裝置提供動力進(jìn)行分析物檢測時，則在通過控制裝置計算出反射比值之前，通過控制裝置，從反應(yīng)反射比讀數(shù)中減去基本反射比讀數(shù)。
24.一種測定液體中分析物濃度的方法，其中，包括在將液體涂到試劑組分之前，定量測定試劑組分第一表面的基本反射比，此試劑組分包括一種惰性多孔基體和一能夠與分析物起反應(yīng)產(chǎn)生吸光的反應(yīng)產(chǎn)物的試劑系統(tǒng)，此試劑系統(tǒng)是浸入基體的孔隙中;在將液體涂到試劑組分的第二表面，而不是涂在測量反應(yīng)反射比的第一表面后并在液體已從第二表面通過試劑組分遷移到第一表面后，從試劑組分第一表面定量測量試劑組分的反應(yīng)反射比;在涂液體后，應(yīng)用波長不同于測量反應(yīng)反射比所用的波長的光，定量地測量試劑組分的第一表面的干擾反射比;根據(jù)反射比的測量值，計算表示濃度的數(shù)值。
25.根據(jù)權(quán)利要求
24的方法，其中基體具有用聚酰胺形成的表面。
26.根據(jù)權(quán)利要求
24或25的方法，其中基體中的平均孔徑為0.2至1.0毫米，而液體是全血。
27.根據(jù)權(quán)利要求
24至26中任何一項權(quán)利要求
的方法，其中，當(dāng)試劑與葡萄糖反應(yīng)時，產(chǎn)生一種吸光反應(yīng)產(chǎn)物。
28.一種儀器，它具有使權(quán)利要求
1至13和24至27中任何一項權(quán)利要求
的方法的各步驟進(jìn)行的裝置。
29.根據(jù)權(quán)利要求
1至13和24至27中任何一項權(quán)利要求
的方法，此法是在體外進(jìn)行的。
專利摘要
本發(fā)明公開了測定液體中分析物的方法，以及為實施該方法而專門設(shè)計的儀器的各個組成部分。本方法包括從浸有試劑的惰性多孔基體一個表面取得反射比讀數(shù)，該試劑是在將被分析的液體涂到該基體的另一表面并遷移過基體而到達(dá)所讀取讀數(shù)的表面時與分析物起反應(yīng)，產(chǎn)生吸光的反應(yīng)產(chǎn)物。為了消除干擾，反射比測量是用兩個不同的波長進(jìn)行的，計時電路是由被分析的液體通過惰性基體使測量反射比的表面潤濕，進(jìn)而使反射比開始下降來啟動的。本發(fā)明的方法和儀器特別適用于測量血糖水平。
文檔編號G01N33/66GK87106256SQ87106256
公開日1988年3月23日 申請日期1987年8月13日
發(fā)明者羅杰·菲利浦斯, 杰弗里·麥加勞, 弗蘭克·朱里克, 雷·安德伍德 申請人:生命掃描有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan