專利名稱:一種牛支原體檢測試紙條的制作方法
【專利摘要】本實用新型公開一種牛支原體抗體檢測試紙條。本實用新型的試紙條由底板、設置于底板上依次線性排列的樣品吸收墊、包被有抗原的膠體金墊、硝酸纖維膜和吸水墊組成，在硝酸纖維素膜上包被有質控線與檢測線，其中檢測線包被的是山羊抗牛二抗IgG，質控線為兔源P48融合蛋白的多抗IgG。本實用新型的試紙條可檢測牛支原體抗體，包括血清抗體與乳清抗體，并具有成本低，操作簡單、方便快速，無需特殊設備和儀器，檢測敏感度高，特異性強，應用范圍廣等優(yōu)點。
【專利說明】一種牛支原體檢測試紙條

【技術領域】
[0001]本實用新型涉及一種生物檢測試紙條，確切講本實用新型涉及一種牛支原體抗體檢測試紙條。

【背景技術】
[0002]牛支原體是一種嚴重的致病性病原體，能夠引起牛呼吸道疾病、奶牛乳腺炎、關節(jié)炎、角膜結膜炎、生殖道炎癥以及流產與不孕等多種疾病，并且一旦感染能夠引起其它病原的繼發(fā)感染,例如化膿性隱秘桿菌,多殺性巴氏桿菌,溶血性曼氏桿菌、昏睡嗜血桿菌、牛副流感病毒3型、皰疹病毒I型、牛呼吸道合胞體病毒、牛病毒性腹瀉病毒和牛冠狀病毒等。牛支原體發(fā)病率為50%-100%，病死率高達10%-50%，給我國養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。本病在我國的實際流行情況和準確的流行病學信息仍較為匱乏，造成這種現(xiàn)象的原因，主要是我國目前缺乏有效的牛支原體檢測的相關技術。
[0003]目前存在的檢測牛支原體的技術有:1.病原分離鑒定，但是牛支原體分離往往受到臨床應用抗生素的影響，分離困難，且分離用培養(yǎng)基營養(yǎng)要求高、分離物鑒定難度大、靈敏度低，不能做為早期快速診斷牛支原體感染的方法，也難以作為常規(guī)檢測方法普及推廣(出自 Caswell J L, Archambault M.Mycoplasma bovis pneumonia in cattle);2.PCR檢測方法(出自 Thomas A, Dizier I, Linden A, et al.Conservat1n of the uvrC genesequence in Mycoplasma bovis and its use in routine PCR diagnosis),該檢測方法需要對病料樣品進行較復雜的處理(研磨、離心、提取DNA等)，檢測方法雖靈敏，但容易因污染和處理不當比較容易出現(xiàn)假陽性，影響判定結果的準確性，此外也需要一定的實驗室條件和儀器設備，以及較高成本，不適合臨床或基層使用。3.間接ELISA是目前應用最主要的血清學檢測方法，國際上先后有用全菌蛋白包被和表達蛋白作為包被抗原的方法(出自Grand D L, Calavas D, Brank M, et al.Serological prevalence of Mycoplasma bovisinfect1n in suckling beef cattle in France),全菌蛋白的方法特異性不足現(xiàn)已很少應用，表達蛋白抗原ELISA方法目前已有商業(yè)化產品，但其所用哪一個抗原蛋白并未公布。此外，ELISA方法僅適合在實驗室進行檢測，操作步驟相對復雜，需要專業(yè)人員進行操作，且需要一定的實驗室條件和儀器設備進行檢測和分析結果。4.利用P48重組表達蛋白包被綿羊紅細胞建立的間接血凝檢測方法，操作相對簡單，但也需要2~3小時才可判定結果，靈敏性弱，需要特定的恒溫培養(yǎng)箱。


【發(fā)明內容】

[0004]本實用新型提供一種可克服現(xiàn)有技術不足，能簡捷、快速、靈敏的檢測牛支原體血清抗體、乳清抗體的檢測試紙條。
[0005]本實用新型的一種檢測牛支原體抗體的試紙條由底板、設置于底板上依次線性排列的樣品吸收墊、包被有抗原的膠體金墊、硝酸纖維膜和吸水墊組成，在硝酸纖維素膜上包被有質控線與檢測線，本實用新型試紙條中的膠體金墊包被的抗原為牛支原體P48融合蛋白，檢測線包被的是山羊抗牛二抗IgG，質控線為兔源P48融合蛋白的多抗IgG。
[0006]本實用新型有如下優(yōu)點:
[0007](I)本實用新型中包被膠體金的抗原P48蛋白為牛支原體膜蛋白，具有很強的特異性，能真實地檢測牛支原體抗體，包括血清抗體與乳清抗體；
[0008](2)本實用新型中的P48蛋白為原核表達可溶性蛋白，純度高，活性高，檢測抗體敏感性高，特異性強，應用范圍廣泛；
[0009](3)成本低，操作簡單、方便快速，無需特殊設備和儀器，全程在15min內完成，比間接血凝試驗以及ELISA試驗節(jié)約成本，測試結果呈現(xiàn)肉眼可見的顏色反應，無需特殊儀器，無需特定的操作人員，可方便用于牛支原體流行病學調查以及在基層推廣使用；
[0010](4)標記物穩(wěn)定，標記樣品在4°C貯存兩年年以上，無信號衰減現(xiàn)象；
[0011](5)膠體金本身為紅色，不需要加入發(fā)色試劑，且對人體無毒害。

【附圖說明】

[0012]圖1為本實用新型的試紙條示意圖，圖中:1樣品吸收墊，2膠體金墊，3檢測線T，4質控線C，5吸水墊，6底板，7硝酸纖維膜.
[0013]圖2為本實用新型的試紙條對標準陽性血清和陰性血清檢測結果圖，其中:1為樣品稀釋液的空白對照；2為陰性血清；3為牛支原體陽性標準血清；(注:由于血清粘稠，檢測前先將陰性血清及陽性血清均稀釋10倍，再進行檢測)。
[0014]圖3為本實用新型試紙條對于不同梯度稀釋的陽性標準血清的檢測結果圖，I為樣品稀釋液的空白對照；2為陰性血清；3為牛支原體陽性標準血清1:10稀釋；4.為牛支原體陽性標準血清1:100稀釋；5為牛支原體陽性標準血清1:1000稀釋；6為牛支原體陽性標準血清1:10000稀釋；7為牛支原體陽性標準血清1:100000稀釋；8為牛支原體陽性標準血清1:200000稀釋。
[0015]圖4為本實用新型試紙條特異性試驗檢測，1.為牛支原體陽性標準血清；2.絲狀支原體山羊亞種陽性標準血清；3.豬肺炎支原體陽性標準血清；4.牛巴氏桿菌陽性標準血清；5.牛肺疫陽性標準血清；6.牛生殖道支原體陽性標準血清；7.綿羊肺炎支原體陽性標準血清；8.山羊支原體山羊肺炎亞種陽性標準血清；(血清均為1:10稀釋)。

【具體實施方式】
[0016]本實用新型以下結合實施例解說。
[0017]1.P48蛋白的表達及純化
[0018]1.1序列合成及重組質粒構建
[0019]牛支原體p48基因(Genebank: NC_014760.1)，本實用新型對該序列密碼子進行了優(yōu)化，按照密碼子在大腸桿菌的嗜好進行優(yōu)化，同時將在牛支原體該序列中的4個表達色氨酸的TGA (UGA)優(yōu)化成TGG (UGG)，因為該密碼子在大腸桿菌中為終止密碼子，同時在其兩端加上了酶切位點BamHI和Xho I ；
[0020]將優(yōu)化后的p48基因序列交由Invitrogen公司合成到pet32a表達載體質粒中，合成后，進行測序鑒定，酶切鑒定，將鑒定成功后的陽性重組質粒命名為Pet32-a (+) -p48。
[0021]1.2P48蛋白的表達
[0022]將帶有目的基因的重組質粒pet32a(+)_p48轉化到感受態(tài)細胞BL21 (DE3)，挑取2個已轉化到BL21 (DE3)的單菌落分別接種于5ml含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，放置于37°C搖床中，220rpm震蕩培養(yǎng)至OD值至0.6左右，然后吸取該1ml的菌液接種到新的IL含氨芐青霉素100ug/ml的LB液體培養(yǎng)基，在16°C，0.0lmmol/IIPTG濃度下誘導表達20h，收集菌體，用10ml的PH7.2PBS重懸，并進行冰上超聲破碎30min。然后將超聲處理的液體置于離心機中IlOOOrpm離心30min,棄去沉淀,收集上清100ml。
[0023]1.3親和層析柱純化P48蛋白及純化蛋白的透析
[0024]用鎳離子親和層析方法純化P48重組蛋白。先將5mL N1-NTA His Bind Resin(購自于南京金斯瑞生物科技公司)裝入空層析柱，讓液體靠重力作用自然滴出后，層析柱用20倍柱體積的平衡Buffer洗滌，然后將樣品上清加到層析柱中，冰上結合60min然后讓其流出；層析柱用20倍柱體積的NTA-10洗滌雜蛋白；然后分別用6個柱體積的NTA-60洗脫Buffer進行洗脫，每5ml收集一次，得到純化后蛋白。
[0025]將第一個體積純化的蛋白，第二個體積純化的蛋白，第三四個體積純化蛋白合并，第五六個體積純化蛋白合并，分別裝入透析袋，放入5L裝有透析液的大燒杯中，透析液為0.1MPB緩沖液，放入4 °C冰箱透析過夜，第二天取出，將透析好的P48蛋白裝入EP管放入_40°C冰箱保存(ImL/管)。
[0026]2.膠體金試紙條的制備過程
[0027]2.1膠體金制備過程
[0028]取1%氯金酸水溶液Iml加入10ml去離子水中，在控溫攪拌器口加熱至沸騰，再迅速一次性加入1%檸檬酸三鈉1.5ml，持續(xù)加熱煮沸15min，然后用水補齊至10ml即獲得均勻透明的膠體金溶液。
[0029]2.2膠體金標墊的制備
[0030]用上述方法得到的純化后透析的P48重組蛋白包被膠體金并制備膠體金墊，抗原結合膠體金的pH值為7.4,膠體金包被P48蛋白的最佳濃度為6ug/ml,抗原包被金顆粒的時間為30min，在抗原結合后加入20% BSA 50ul/ml進行封閉，封閉時間為30分鐘，離心后利用重懸液將膠體金顆粒重懸，制備膠體金標墊，37°C干燥3小時。其重懸液配方為:0.02M四硼酸鈉、0.5% BSA, 3%蔗糖、0.5%酪蛋白，0.5%吐溫20。
[0031]2.3硝酸纖維素膜上質控線與檢測線的包被
[0032]本實用新型試紙條硝酸纖維素膜型號為M135，購買于MILLIP0RE (美國)，包被硝酸纖維素膜檢測線的所用抗原為lOOug/ml親和純化山羊抗牛二抗IgG，包被檢測線Iul/cm,該親和純化山羊抗牛二抗購買于ImmunoReagents試劑公司。
[0033]包被硝酸纖維素膜質控線抗原為P48蛋白多抗IgG，利用其濃度為200ug/ml，包被質控線lul/cm。該IgG是用高免血清經(jīng)過純化而得。高免血清的制備方法如下:
[0034]高免血清制備中所用弗氏完全佐劑抗原和弗氏不完全佐劑抗原的配制，其中:弗氏完全佐劑抗原:弗氏完全佐劑3mL加lmg/mlP48蛋白抗原3mL ;弗氏不完全佐劑抗原:弗氏不完全佐劑3mL加lmg/mlP48蛋白3mL。
[0035]上述佐劑抗原均在免疫接種前配制，并充分混合乳化。
[0036]P48蛋白高免血清制備過程:
[0037]a.首先，選用2kg左右、12月齡的健康雄性新西蘭大白兔。
[0038]b.取上述充分乳化的弗氏完全佐劑抗原，于每只兔兩后腿足部皮下，胭淋巴結處及背部皮下多點接種，接種總量為1.5mL ；14日后仍以弗氏完全佐劑抗原1.5ml由背部皮下多點接種，進行第二次免疫；隔14日后，以上述弗氏不完全佐劑抗原，由每只兔腳掌兩點，背部皮下多點接種，接種總量為3mL，為其第三次免疫；
[0039]c.隔14日后由耳緣靜脈采血分離血清，以IHA試驗試血，免疫兔血清IHA效價達1:512,正式采血,3000rpm離心5min分離血清，即為P48蛋白高免血清。
[0040]d.用飽和硫酸銨沉淀法將分離到的血清純化獲得P48蛋白多抗IgG。
[0041]2.4試紙條組裝
[0042]操作按如下步驟進行在PVC背襯板上由上至下分別將包括檢測線和質控線的硝酸纖維素膜、膠體金墊、樣品墊、以及吸收墊按順序裝配，將PVC襯板設在最底部，襯板上部中段設有硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上部左端貼有吸收墊，硝酸纖維素膜上部右端設有金標墊，金標墊的上部右端設有樣品墊，再分別用噴槍將前述得到的親和純化山羊抗牛二抗IgG以及純化的P48多抗IgG在硝酸纖維素膜上制出檢測線和質控線，在本實用新型試紙條中檢測線與質控線兩線間距離保持在0.Smm0再將試紙切割成4_寬的條狀，即制成如附圖1的結構本實用新型的檢測牛支原體抗體的膠體金試紙條示意圖。
[0043]本實用新型的試紙條原理為雙抗原夾心法檢測抗體，其中判定標準為質控線顯色的前提下，檢測線顯色呈陽性；檢測線無顯色，呈陰性。若質控線不顯色，則失效，需要重新測定。
[0044]本實用新型膠體金試紙條分別對陽性血清和陰性血清進行檢測，結果見附圖2，由附圖2可見，陽性血清顯示檢測線和質控線兩條線均為紅色；陰性質控線顯色，檢測線不顯色；空白對照僅為樣品稀釋液結果為質控線顯色，檢測線不顯色。其中樣品稀釋液為含0.5%吐溫20的0.1MPBS緩沖液。
[0045]本實用新型膠體金試紙條對陽性血清不同稀釋度進行檢測，結果見附圖4，由附圖3可見，陰性血清、樣品稀釋液空白對照均質控線顯色，檢測線不顯色。陽性血清1:10、1:10U:1000,1:10000,1:100000均為質控線與檢測線均顯色，呈現(xiàn)陽性；而陽性血清1:200000僅質控線顯色，呈現(xiàn)陰性，因此該發(fā)明中試紙條靈敏度能夠達到，而之前建立的牛支原體間接血凝檢測方法僅能檢測到1:4096，所以該發(fā)明大大提高了檢測敏感度。
[0046]本實用新型試紙條特異性試驗檢測結果見附圖4，其中檢測了牛支原體陽性標準血清，絲狀支原體山羊亞種陽性標準血清，豬肺炎支原體陽性標準血清，牛巴氏桿菌陽性標準血清，牛肺疫陽性標準血清，牛生殖道支原體陽性標準血清，綿羊肺炎支原體陽性標準血清以及山羊支原體山羊肺炎亞種陽性標準血清，結果僅由牛支原體陽性血清呈現(xiàn)陽性，其余相似支原體以及能夠引起牛相似病癥的病原抗體均呈現(xiàn)陰性，證明該試紙條特異性好，結果可靠。
[0047]利用進口 ELISA試劑盒與本實用新型的試紙檢測進行了對比，檢測明確背景的陰性樣品(含乳清、血清)共83份，陽性樣品(含乳清、血清)共189份，其中進口 ELISA試劑盒檢測陰性血清90份，陽性血清182份，而該發(fā)明中試紙條檢測結果陰性血清86份，陽性血清186份。與進口 ELISA試劑盒檢測對比，陰性符合率為95.6%，陽性符合率為97.8%，而進口 ELISA試劑盒檢測樣品的成本高達5元/份，而且操作需要3個小時左右才能出檢測結果，而本實用新型中試紙條成本0.5元/份，僅在15min內就可以呈現(xiàn)清晰、明了的結果，大大降低了成本，提高了效率。
【權利要求】
1.一種檢測牛支原體抗體的試紙條，該試紙條由底板、設置于底板上依次線性排列的樣品吸收墊、包被有抗原的膠體金墊、硝酸纖維膜和吸水墊組成，在硝酸纖維膜上包被有質控線與檢測線，其特征在于:膠體金墊包被的抗原為牛支原體P48融合蛋白，檢測線包被的是山羊抗牛二抗IgG，質控線為兔源P48融合蛋白的多抗IgG。
【文檔編號】G01N33-68GK204287202SQ201420655524
【發(fā)明者】儲岳峰, 簡瑩娜, 趙萍, 陳勝利, 賀英, 逯忠新, 劉永生 [申請人]中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所