專利名稱：一種通用的食品安全快速檢測(cè)的生物芯片及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)，更具體地說(shuō)涉及一種通用的食品安全快速檢測(cè)的生物芯片及檢測(cè)方法。
核酸是生物物種的遺傳物質(zhì)，它包括核糖核酸(RNA)和脫氧核糖核酸(DNA)。核酸的基本組成是四種核苷酸(或堿基)，在DNA中它們分別由A、C、G、T代表，在RNA中它們分別由A、C、G、U代表。核苷酸(堿基)在核酸中以串聯(lián)的方式組成鏈狀結(jié)構(gòu)，DNA一般為雙鏈結(jié)構(gòu)，RNA為單鏈結(jié)構(gòu)；DNA的雙鏈結(jié)構(gòu)可以在適當(dāng)?shù)臈l件下分解成單鏈，單鏈的DNA也可以與單鏈的RNA形成雙鏈結(jié)構(gòu)。在一核酸結(jié)構(gòu)中，一部分可以是單鏈另一部分可以是雙鏈。在雙鏈的核酸結(jié)構(gòu)中堿基A與另一鏈的T(U)通過(guò)氫鍵形成堿基對(duì)，同理G與另一鏈的C形成堿基對(duì)，能形成堿基對(duì)的堿基為互補(bǔ)堿基。如一核酸鏈與另一核酸鏈有完全互補(bǔ)的堿基序列，則這兩條核酸鏈稱為互補(bǔ)核酸鏈，互補(bǔ)的核酸鏈可形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)，由互補(bǔ)的兩單鏈分子結(jié)構(gòu)形成雙鏈分子結(jié)構(gòu)的過(guò)程稱為分子雜交。非完全互補(bǔ)的核酸鏈(部分互補(bǔ))在特定條件下也會(huì)形成雙鏈分子結(jié)構(gòu)。在生物體及試管中，單鏈的核酸鏈可在酶的作用下復(fù)制出互補(bǔ)的核酸鏈，在復(fù)制過(guò)程中，被復(fù)制的核酸鏈稱為模板分子，所需的酶為聚合酶，聚合酶可分為DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶等。DNA聚合酶以DNA為模板合成DNA互補(bǔ)鏈，RNA聚合酶以DNA為模板合成RNA互補(bǔ)鏈，逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成DNA互補(bǔ)鏈。引物為核酸片段，它與模板分子互補(bǔ)并雜交形成雙鏈結(jié)構(gòu)。核酸聚合酶反應(yīng)的始點(diǎn)決定于引物的位置，DNA的聚合反應(yīng)從引物的3’末端開(kāi)始(DNA及cDNA聚合反應(yīng))。RNA聚合酶反應(yīng)需要有雙鏈的被RNA聚合酶識(shí)別的結(jié)構(gòu)，稱為驅(qū)動(dòng)子。引物核酸片段可以由幾個(gè)或幾十個(gè)堿基(核苷酸)組成，引物可以是DNA，也可以是RNA，它可以是通過(guò)降解自然核酸而取得的片段，也可以通過(guò)人工化學(xué)合成。人工合成的核酸片段可具有非自然的組成單位(結(jié)構(gòu))，非自然的組成單位(結(jié)構(gòu))包括在自然界中不是核酸組分的結(jié)構(gòu)，也包括不存在于自然界的化學(xué)結(jié)構(gòu)。通過(guò)引物與模板分子的雜交，可以控制模板分子的復(fù)制以及模板分子的擴(kuò)增。核酸序列在進(jìn)化過(guò)程中和外界條件的影響下會(huì)發(fā)生變化，最常見(jiàn)的變化為一堿基被另一堿基所取代，在同一物種中，同一核酸序列的同一位置(單堿基位置)在不同的個(gè)體之間如有不同的堿基成分，則這一種現(xiàn)象稱為單堿基(核苷酸)多態(tài)性(SNP)。在特定個(gè)體中，多態(tài)性位點(diǎn)的一種堿基組成為這一位點(diǎn)的一種基因型(基因?yàn)楹怂岬墓δ苄詤^(qū)域)，一個(gè)單倍體生物個(gè)體在一個(gè)多態(tài)點(diǎn)上只能有一個(gè)基因型，在雙倍體的生物個(gè)體中如二同源基因具有相同的基因型，這一個(gè)體為純合子，如有不同的基因型，則這一個(gè)體為雜合子?；蛐蜏y(cè)定對(duì)遺傳診斷、物種鑒定、藥物篩選等具有重大意義。DNA可以在聚合酶等的作用下被復(fù)制，即由模板鏈復(fù)制出互補(bǔ)鏈，DNA的復(fù)制需要有一引物，引物一般為一含有幾個(gè)或幾十個(gè)堿基的核酸鏈，核酸鏈具有方向性分別用5’端和3’端表示，接近5’端的序列稱為5’端部分，接近3’端的稱為3’端部分，核酸復(fù)制前引物與模板在3’端有特異性地根據(jù)堿基配對(duì)原理結(jié)合成雙鏈結(jié)構(gòu)(這一過(guò)程稱為分子雜交)，此后聚合酶可從引物的3’端開(kāi)始沿5’→3’方向合成與模板相互補(bǔ)的新鏈，新形成的雙鏈可在高溫下(＞90℃)分離成獨(dú)立的單鏈，當(dāng)溫度下降時(shí)余下的引物分子可再與相應(yīng)的模板核酸分子雜交，并可在聚合酶的作用下復(fù)制出新的核酸鏈，反復(fù)如上過(guò)程，一個(gè)核酸片段可被擴(kuò)增出千萬(wàn)個(gè)同樣的分子片段，如上過(guò)程即為聚合酶鏈反應(yīng)過(guò)程(PCR)。一核酸樣品需擴(kuò)增的部分為靶片段，進(jìn)行PCR反應(yīng)一般在靶片段兩端要有相應(yīng)的引物，對(duì)一多態(tài)位點(diǎn)附近的序列專一的引物為多態(tài)性引物，對(duì)一多態(tài)性位點(diǎn)的特定基因型有專一性的為基因型引物，多態(tài)性引物可和基因型引物結(jié)合使用對(duì)靶片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并測(cè)定基因型。用化學(xué)的方法可以人工合成核酸片段作為引物，引物的堿基序列與靶片段序列相互補(bǔ)，另外引物序列中可具有與核酸樣品中的序列非互補(bǔ)的序列，這種與樣品不具互補(bǔ)性的序列稱為外源序列，外源序列可作為引物的部分結(jié)構(gòu)?；蛐酒且环N把不同核酸分子分別排列于特定位置，并用于核酸分子雜交的裝置，固定于基因芯片上的核酸分子為探針?lè)肿樱c探針?lè)肿舆M(jìn)行特異性雜交的為靶分子，探針?lè)肿涌赏ㄟ^(guò)在芯片的位置或所帶的標(biāo)記進(jìn)行靶分子識(shí)別，標(biāo)記可有多種形式，如放射性標(biāo)記、熒光標(biāo)記、納米顆粒標(biāo)記、酶標(biāo)記、色素標(biāo)記等，用以區(qū)別不同基因型的具標(biāo)記的核酸探針?lè)肿訛榛蛐吞结?。由引物引發(fā)的聚合反應(yīng)或擴(kuò)增反應(yīng)常用于分子生物學(xué)的基礎(chǔ)研究，基因工程，以及遺傳診斷和與分子生物學(xué)相關(guān)的檢測(cè)。在這些應(yīng)用中，反應(yīng)中所需要的試劑(反應(yīng)試劑)要進(jìn)行混合然后在試管或其他反應(yīng)器中進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)試劑根據(jù)反應(yīng)性質(zhì)可分為通用試劑如水、緩沖液等；和專一試劑，專一試劑包括引物、酶等。一種反應(yīng)試劑在某個(gè)反應(yīng)中可能是專一試劑，在另一反應(yīng)中可能是通用試劑。一般來(lái)說(shuō)通用試劑指的是同一批的多個(gè)反應(yīng)中的共同試劑，專一試劑是多個(gè)反應(yīng)中，個(gè)別反應(yīng)所需的試劑。另外反應(yīng)中可以加入添加劑，添加劑在反應(yīng)中不參與反應(yīng)。常用的添加劑包括蛋白質(zhì)(如牛血清蛋白、明膠)、多糖類化合物(如淀粉、藻膠)等，另外有些人工合成的化合物也可以用作添加劑(如線形聚丙烯酰胺)。添加劑一般為水溶性的，在低溶度下(＜10％)不會(huì)影響酶反應(yīng)。添加劑的特性包括溶于水后會(huì)膨脹并可形成膠狀物態(tài)，可起到膠合劑作用；去水后會(huì)收縮、結(jié)塊，也可以固化，形成固化物。已有的食品微生物病毒檢測(cè)還是沿續(xù)傳統(tǒng)的培養(yǎng)、分離、鑒定(形態(tài)鑒定、生化鑒定、血清學(xué)鑒定)程序，這種工藝操作周期長(zhǎng)，各項(xiàng)累計(jì)費(fèi)用高，很難對(duì)食品的安全衛(wèi)生形成有效的監(jiān)督。已有的食品安全(衛(wèi)生)檢測(cè)一般是依照國(guó)家食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)食品衛(wèi)生類型比如醬鹵肉類、烤魚(yú)片、糕點(diǎn)面包、肉松、干果等等，標(biāo)準(zhǔn)眾多，但其中最主要的是不得檢出致病菌，但已有技術(shù)卻往往很難一項(xiàng)一項(xiàng)檢測(cè)致病菌。
本發(fā)明的目的是提供一種通用的食品安全快速檢測(cè)的生物芯片及檢測(cè)方法，它能克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足。
一種通用的食品安全快速檢測(cè)的生物芯片及檢測(cè)方法，包括食品樣品的采樣、培養(yǎng)、分離、鑒定，其特征是用具有固化探針的生物芯片進(jìn)行分子雜交，根據(jù)基因型探針在基因芯片上的信號(hào)判斷多態(tài)性位點(diǎn)的基因型，根據(jù)檢測(cè)數(shù)據(jù)再比照食品類型以判斷食品合格的方法。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是大大縮短了食品衛(wèi)生(安全)檢測(cè)的周期，擴(kuò)大了檢測(cè)范圍，減少了檢測(cè)費(fèi)用，縮小了檢測(cè)誤差，增強(qiáng)了食品安全指數(shù)，能對(duì)食品市場(chǎng)的安全衛(wèi)生形成有效的監(jiān)督。
下面通過(guò)實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明。
對(duì)某種食品的樣品進(jìn)行微生物(致病菌、病毒)檢驗(yàn)。制作檢測(cè)食品的基因芯片，基因芯片上的分子探針是與多態(tài)性引物的外源序列相互補(bǔ)的核酸分子，包括沙門氏菌、霍亂弧菌、副溶血性弧菌、出血性大腸桿菌、李斯特氏菌、溶血性鏈球菌、肉毒梭菌、蠟樣芽孢桿菌、志賀氏菌、空腸彎曲菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、溶藻膠弧菌、創(chuàng)傷弧菌、炭疽桿菌、糞鏈球菌、布氏桿菌、口蹄疫病毒、禽流感病毒、新城疫病毒、瘋牛病病原；大腸菌群、糞大腸菌群、大腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、金黃色葡萄球菌、霉菌、酵母菌的核酸片段(分子)。其長(zhǎng)度由10-50個(gè)核苷酸組成，用水配制10％淀粉添加劑液加熱溶解后添加到每一種探針中，每一種探針?lè)謩e用已知的方法固定于芯片的表面，形成固化探針。配制一個(gè)試劑盒，試劑盒包括用于對(duì)多態(tài)性靶片段進(jìn)行擴(kuò)增的引物，擴(kuò)增一多態(tài)性靶片段的引物包括專一的多態(tài)性引物和二個(gè)專一的基因型引物，試劑盒還包括核酸提純的試劑、PCR反應(yīng)的酶、此外試劑盒包括二個(gè)或多個(gè)分別有不同標(biāo)記的基因型探針，標(biāo)記為熒光色素或其它的可用化學(xué)或物理方法識(shí)別的納米范圍的結(jié)構(gòu)，試劑盒還包括用于分子雜交的緩沖液。在進(jìn)行基因型測(cè)定時(shí)采用如下操作程序①?gòu)倪@種食品的樣品中提取微生物的DNA，提取的DNA溶于水或適當(dāng)?shù)木彌_液；②用PCR反應(yīng)試劑對(duì)提取的DNA核酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用一多態(tài)性引物和二個(gè)專一的基因型引物對(duì)一多態(tài)性靶片段進(jìn)行擴(kuò)增，多組引物可以在同一試管中使用(復(fù)合PCR反應(yīng))，復(fù)合的程度可為二組或二組以上的引物，擴(kuò)增后的產(chǎn)物具有單鏈的多態(tài)性外源序列和單鏈的基因型外源序列，反應(yīng)的體積一般在10-100微升；③多個(gè)PCR的反應(yīng)產(chǎn)物可合并，并進(jìn)行適當(dāng)?shù)募兓?、濃縮等處理(必要時(shí)可除去未反應(yīng)的引物)，然后與雜交用的緩沖液結(jié)合，最終體積在0.1-1毫升范圍內(nèi)。雜交液中包含具有不同標(biāo)記的基因型探針；④用已知的方法和儀器進(jìn)行基因芯片雜交和清洗，并用激光掃描儀或其它相應(yīng)的儀器采集芯片上的信號(hào)；⑤根據(jù)信號(hào)在芯片上的位置、特征和信號(hào)的強(qiáng)度的比例，可測(cè)定多態(tài)性位點(diǎn)的基因型。根據(jù)以上檢測(cè)結(jié)果可以得出這種食品是否存在有以上探針設(shè)計(jì)的(27種)菌(屬)種，即進(jìn)行了菌(屬)種的定性檢測(cè)，對(duì)于致病菌沙門氏菌、霍亂弧菌、副溶血性弧菌、出血性大腸桿菌、李斯特氏菌、溶血性鏈球菌、肉毒梭菌、蠟樣芽孢桿菌、志賀氏菌、空腸彎曲菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、溶藻膠弧菌、創(chuàng)傷弧菌、炭疽桿菌、糞鏈球菌、布氏桿菌、口蹄疫病毒、禽流感病毒、新城疫病毒、瘋牛病病原只做定性檢測(cè)，即這種食品檢測(cè)中只要存在以上一種致病菌，即宣布這種食品為不合格品。如果這種食品沒(méi)有檢測(cè)出以上致病菌，對(duì)于大腸菌群、糞大腸菌群、大腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、金黃色葡萄球菌、霉菌、酵母菌再進(jìn)行定量分析，定量分析在定量PCR儀中進(jìn)行，或用其它已知技術(shù)進(jìn)行定量分析。通過(guò)以上方法得出這種食品中微生物的定性定量檢驗(yàn)結(jié)果(檢測(cè)數(shù)據(jù))。將所有食品衛(wèi)生檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)輸入到計(jì)算機(jī)中，建立一個(gè)分類別、分層次、分等級(jí)的標(biāo)準(zhǔn)庫(kù)，根據(jù)這種食品定性定量檢驗(yàn)結(jié)果(檢測(cè)數(shù)據(jù))再比照食品標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷得出這種食品檢驗(yàn)的結(jié)論。
本方法用于食品的檢測(cè)，包括所有食品衛(wèi)生檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)集合的計(jì)算機(jī)軟件，所有食品衛(wèi)生檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)包括常用食品的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)、國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、以及相關(guān)的企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，將這些標(biāo)準(zhǔn)集合成一個(gè)分類別、分層次、分等級(jí)的食品衛(wèi)生檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)軟件。食品衛(wèi)生檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)軟件是用以比照食品檢驗(yàn)結(jié)果的，做出結(jié)論性判斷。
本方法用于食品的檢驗(yàn)是通用的可適用于所有食品?；蛐酒脑O(shè)計(jì)、使用只是對(duì)所檢驗(yàn)的食品的樣品負(fù)責(zé)，不考慮食品的種類、標(biāo)準(zhǔn)，食品取樣后用生物芯片(基因芯片)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果出來(lái)后再比較某類食品的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷。
本方法所述的固化探針是專一試劑和添加劑復(fù)合物，其中添加劑的含量≤99％；或者是通用試劑和添加劑的復(fù)合物，其中添加劑的含量≤99％。固化探針基本不含水分。
本方法所述的固化探針可以制成小顆粒狀，可具有不同形狀(如圓、矩形等)。小顆粒狀的固化探針是在一個(gè)較大的容器中混合制成后，然后壓(拉)長(zhǎng)再分割或許多微小的顆粒，顆粒的形狀與大小可用機(jī)械加工；小顆粒狀的固化探針外表包裹著一層添加劑保護(hù)膜。小顆粒狀的固化探針的體積≤8mm3。
根據(jù)本發(fā)明方法可以生產(chǎn)一種新型的生物芯片，一種方法是在生物芯片的基板上制作多個(gè)小孔(不透孔)，每個(gè)小孔都是一個(gè)反應(yīng)器，在小孔內(nèi)加入專一試劑與添加劑的復(fù)合物并使之固化形成固化探針；二是將已制作好的多種(個(gè))小顆粒狀的固化探針固定在生物芯片上。
根據(jù)本方法可以生產(chǎn)試劑盒，試劑盒內(nèi)有固化探針，有用于對(duì)多態(tài)性靶片段進(jìn)行擴(kuò)增的引物，包括專一的多態(tài)性引物和基因型引物，以及核酸提純的試劑、PCR反應(yīng)的酶、緩沖液等。
用此方法進(jìn)行的聚合酶反應(yīng)是在定量PCR進(jìn)行，定量PCR儀能在PCR反應(yīng)過(guò)程中通過(guò)光學(xué)系統(tǒng)觀測(cè)反應(yīng)的進(jìn)行程度。
此方法可用于RNA靶分子，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)然后進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，用反應(yīng)結(jié)果判斷基因表達(dá)或測(cè)定RNA病毒(微生物)的種類和數(shù)量。
此方法可用于DNA靶分子進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，或由逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)、DNA聚合反應(yīng)、RNA聚合反應(yīng)等組成的恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)。通過(guò)擴(kuò)增的結(jié)果判定靶片段的存在或判斷靶片段的基因型，以及判斷相關(guān)物種的數(shù)量。
此方法可對(duì)病毒和微生物進(jìn)行檢測(cè)，用于食品衛(wèi)生、商檢、環(huán)保、醫(yī)療等。
權(quán)利要求
1.一種通用的食品安全快速檢測(cè)的生物芯片及檢測(cè)方法，包括食品樣品的采樣、培養(yǎng)、分離、鑒定，其特征是用具有固化探針的生物芯片進(jìn)行分子雜交，根據(jù)基因型探針在基因芯片上的信號(hào)判斷多態(tài)性位點(diǎn)的基因型，根據(jù)檢測(cè)數(shù)據(jù)再比照食品類型以判斷食品合格的方法。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是生物芯片探針有沙門氏菌、霍亂弧菌、副溶血性弧菌、出血性大腸桿菌、李斯特氏菌、溶血性鏈球菌、肉毒梭菌、蠟樣芽孢桿菌、志賀氏菌、空腸彎曲菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、溶藻膠弧菌、創(chuàng)傷弧菌、炭疽桿菌、糞鏈球菌、布氏桿菌、口蹄疫病毒、禽流感病毒、新城疫病毒、瘋牛病病原；大腸菌群、糞大腸菌群、大腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、金黃色葡萄球菌、霉菌、酵母菌的核酸片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是生物芯片的固化探針是專一試劑和添加劑的復(fù)合物，其中添加劑的含量≤99％。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是根據(jù)基因型探針在生物芯片上的信號(hào)判斷多態(tài)性位點(diǎn)的基因型，多態(tài)性引物和基因型引物的5’端部分分別具有專一的外源序列，多態(tài)性引物和基因型引物的3’端部分分別具有與靶序列相互補(bǔ)的序列，外源序列和互補(bǔ)序列之間有非自然性結(jié)構(gòu)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是試劑盒有固化探針有用于對(duì)多態(tài)性靶片段進(jìn)行擴(kuò)增的引物，包括專一的多態(tài)性引物和基因型引物，以及核酸提純的試劑、PCR反應(yīng)的酶、緩沖液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是對(duì)于致病菌沙門氏菌、霍亂弧菌、副溶血性弧菌、出血性大腸桿菌、李斯特氏菌、溶血性鏈球菌、肉毒梭菌、蠟樣芽孢桿菌、志賀氏菌、空腸彎曲菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、溶藻膠弧菌、創(chuàng)傷弧菌、炭疽桿菌、糞鏈球菌、布氏桿菌、口蹄疫病毒、禽流感病毒、新城疫病毒、瘋牛病病原只做定性檢測(cè)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是對(duì)于大腸菌群、糞大腸菌群、大腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、金黃色葡萄球菌、霉菌、酵母菌進(jìn)行定性定量分析，定量分析在定量PCR儀中進(jìn)行。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是一種通用的食品檢測(cè)生物芯片，將所有食品衛(wèi)生檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)輸入到計(jì)算機(jī)中，根據(jù)檢測(cè)數(shù)據(jù)再比較某類食品的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是一種成小顆粒狀的固化探針，小顆粒狀的固化探針的體積≤8mm3。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是一種裝有固化探針的生物芯片。
全文摘要
一種通用的食品安全快速檢測(cè)的生物芯片及檢測(cè)方法，其特征是用具有固化探針的生物芯片進(jìn)行分子雜交，根據(jù)基因型探針在基因芯片上的信號(hào)判斷多態(tài)性位點(diǎn)的基因型，根據(jù)檢測(cè)數(shù)據(jù)再比照食品類型以判斷食品合格的方法。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是大大縮短了食品衛(wèi)生(安全)檢測(cè)的周期，擴(kuò)大了檢測(cè)范圍，減少了檢測(cè)費(fèi)用，縮小了檢測(cè)誤差，增強(qiáng)了食品安全指數(shù)，能對(duì)食品市場(chǎng)的安全衛(wèi)生形成有效的監(jiān)督。
文檔編號(hào)G01N33/02GK1540343SQ200310105370
公開(kāi)日2004年10月27日 申請(qǐng)日期2003年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月28日
發(fā)明者吳昌, 吳 昌 申請(qǐng)人:吳昌, 吳 昌