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      速滅威人工抗原合成方法

      文檔序號:5906896閱讀:424來源:國知局
      專利名稱:速滅威人工抗原合成方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明速滅威人工抗原合成方法,屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。專用于制備特異性識別化學(xué)農(nóng)藥速滅威的抗體和研制高效、快速檢測速滅威微含量的免疫速測。
      背景技術(shù)
      速滅威(metolcarb)屬于氨基甲酸酯類化學(xué)殺蟲劑,是我國大噸位生產(chǎn)的農(nóng)藥品種之一。速滅威制劑毒性中等,主要用于防治棉花、水稻、茶樹、柑橘等作物的害蟲,具有殺蟲譜廣、殘效長、殺死率高等特點(diǎn)。目前國內(nèi)許有廠家進(jìn)行原藥或其復(fù)配制劑的大規(guī)模生產(chǎn)并得到很好的推廣。
      自20世紀(jì)70年代以來,由于有機(jī)氯農(nóng)藥受到禁用或限用,以及抗有機(jī)磷殺蟲劑的昆蟲品種日益增多,現(xiàn)在國家已經(jīng)對一些高毒性如克百威等農(nóng)藥進(jìn)行禁用,因而速滅威等氨基甲酸酯類農(nóng)藥的用量必然逐年增加,這就使得這類農(nóng)藥殘留量的檢測倍受關(guān)注。速滅威雖然相對已經(jīng)被禁用的農(nóng)藥來說優(yōu)點(diǎn)明顯,但速滅威的大量使用及其具有的殘留期較長、毒性較高等特點(diǎn),都使得速滅威殘留量的檢測監(jiān)控顯得十分迫切和必要。
      文獻(xiàn)報(bào)道的對速滅威有效成分檢測方法有分光光度法、氣相色譜法、高效液相色譜法、薄層層析法等。但只靠這些常規(guī)的檢測方法已經(jīng)越來越不能滿足農(nóng)藥殘留大批量、快速檢測工作的需求。
      1971年Ercegovich等首次用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法對DDT和馬拉硫磷進(jìn)行了殘留分析,這是免疫化學(xué)技術(shù)首次用于農(nóng)藥殘留分析。20世紀(jì)80年代后,免疫化學(xué)分析技術(shù)已成為優(yōu)先研究、開發(fā)和利用的農(nóng)藥殘留快速檢測技術(shù),美國化學(xué)學(xué)會將免疫分析方法與GC、HPLC方法一起列為化學(xué)農(nóng)藥殘留分析的三大支柱技術(shù),是21世紀(jì)最具競爭性和挑戰(zhàn)性的超微量檢測技術(shù)。利用ELISA(酶聯(lián)免疫吸附分析)方法不僅可以定性而且可以定量檢測樣品中的農(nóng)藥殘留,這種分析方法對儀器設(shè)備要求不高,快速簡便,一般無需對樣品進(jìn)行復(fù)雜的預(yù)處理,靈敏度高,特異性強(qiáng)。而且價(jià)格便宜,易于標(biāo)準(zhǔn)化、自動(dòng)化和適于大容量樣本分析等優(yōu)點(diǎn)。已有文獻(xiàn)報(bào)道了60多種殺菌劑、殺蟲劑、除草劑等的ELISA檢測方法的建立,其檢測水平可達(dá)納克(ng)甚至皮克(pg)。國外一些公司已開發(fā)出商品化的農(nóng)藥殘留檢測試劑盒,如Immunosystems Inc.的Res-I-Mune試劑盒,NeoGen公司的Agriscreen Tickets試劑盒,Millipore公司的EnviroGard試劑盒,Environmental Diagnostics公司的EZ-Screen試劑盒等。我國在這方面起步較晚,只是90年代后才有越來越多的單位和研究人員重視并從事農(nóng)藥免疫速測技術(shù)研究,如劉曙照等已經(jīng)先后報(bào)道了氨基甲酸酯類殺蟲劑克百威和甲萘威的免疫檢測技術(shù)研究等等。
      氨基甲酸酯類殺蟲劑免疫速測國外報(bào)道的除了克百威和甲萘威外,1998年,Antonio Abad等人制備出了甲硫威(methiocarb)抗原與單克隆抗體;2001年,Maria J.Moreno等人報(bào)道了識別殘殺威(propoxur)的單克隆抗體的制備。速滅威抗原與抗體的制備目前在國內(nèi)外還未見報(bào)道,半抗原結(jié)構(gòu)改造與抗原制備是免疫速測研究技術(shù)的難點(diǎn)和關(guān)鍵所在。

      發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問題正在使用的化學(xué)農(nóng)藥速滅威無法與蛋白質(zhì)(如牛血清白蛋白等)分子直接偶聯(lián),而速滅威自身又無法制備出特異性識別速滅威的抗體(化學(xué)小分子物質(zhì)不具有免疫原性),本發(fā)明的目的就是解決這樣的問題。提供速滅威人工抗原合成方法,能合成有效的速滅威抗原,并經(jīng)對動(dòng)物的免疫可生產(chǎn)出特異性識別速滅威農(nóng)藥的抗體。
      技術(shù)方案速滅威抗原合成,包括以下1)間-甲基苯氧甲酰氯(分子式C8H7O2Cl,結(jié)構(gòu)式 )的合成稱取雙光氣28g,小心加入0.135g活性碳,36℃水浴加熱,用51.5g甲苯收集光氣,甲苯液在23℃水浴中磁力攪拌,尾氣通入堿液(注意光氣劇毒,且氣味難聞,應(yīng)在通風(fēng)櫥中進(jìn)行)。至雙光氣反應(yīng)完,甲苯相增重16.5g,得24%光氣/甲苯溶液。稱取間-甲基苯酚7.7g,溶進(jìn)100ml 10%的NaOH水溶液,40℃水浴加熱磁力攪拌1小時(shí),冷卻到室溫后緩慢加入上光氣/甲苯溶液,40分鐘加完,開始計(jì)時(shí),4小時(shí)后結(jié)束反應(yīng)。取有機(jī)相減壓蒸餾得9.012g黃色油狀物。GC法測定目標(biāo)物的含量,5℃冰箱存放備用。
      2)β-(間-甲基苯氧甲酰)氨基丙酸(H速)(分子式C11H13O4N,結(jié)構(gòu)式 )的合成稱取間-甲基苯氧甲酰氯3.275g(約12.1mmol),溶進(jìn)4ml 4M NaOH溶液,置5℃冰箱冷卻,得A液;稱取β-丙胺酸1.989g(約22.3mmol),溶進(jìn)4ml 4M NaOH溶液,置5℃冰箱冷卻,得B液;另取3ml 4M NaOH溶液,置5℃冰箱冷卻,得C液。將A液與C液均分成5等份,每間隔5~10分鐘向B液中同時(shí)各加入1份,整個(gè)反應(yīng)置冰水中,磁力攪拌下進(jìn)行。加樣全部完成開始記時(shí),2小時(shí)后結(jié)束反應(yīng)。用濃鹽酸調(diào)節(jié)反應(yīng)終液的pH值為4,目標(biāo)產(chǎn)物用乙酸乙酯(3個(gè)50ml份)抽提;乙酸乙酯相用稀HCl洗滌數(shù)次,用1M NaHCO3溶液(2個(gè)50ml份)抽提;水相再用濃鹽酸酸化,乙酸乙酯再抽提;無水Na2SO4干燥,所得物減壓蒸餾濃縮至13.8ml,向濃縮液中逐漸加入31ml正己烷,白色結(jié)晶物析出,過濾。結(jié)晶物經(jīng)低溫干燥得3.898g;再經(jīng)過甲苯與去離子水5℃下洗滌,低溫干燥后稱重得到H速較純品1.871g,回收率為48%。
      3)速滅威人工抗原(H速-OVA、H速-BSA)的合成稱取H速結(jié)晶物223mg和NHS130mg,用1000μl DMF溶解于反應(yīng)裝置中;稱取300mg DCC,用500μl DMF溶解;將DCC/DMF溶液滴加到上反應(yīng)裝置中。反應(yīng)在磁力攪拌下室內(nèi)溫度進(jìn)行7小時(shí)(過夜)。反應(yīng)終液置5℃冰箱冷卻2小時(shí)以上,經(jīng)1.2萬rpm離心5分鐘,取上清活潑酯液并將其均分為2等份,分別緩慢滴加到2.5ml 12mg/ml的BSA溶液與2.5ml 12mg/ml的OVA溶液中反應(yīng),反應(yīng)緩沖液為0.2M pH8.0的PB液。反應(yīng)在磁力攪拌下室內(nèi)溫度進(jìn)行4小時(shí)(從加樣結(jié)束開始記時(shí))。將反應(yīng)液置透析袋內(nèi),于0.2M pH6.8的PB中4℃攪拌透析,每4小時(shí)換一次透析液,共透析60小時(shí)。透析結(jié)束后將透析袋中的白色乳狀液裝于若干1ml離心管中,于-20℃冰箱中存放備用。所合成的速滅威保存期限為3年。
      上述抗原用常規(guī)免疫方案即可制備得到特異性識別速滅威的抗體。
      有益效果 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比,其優(yōu)點(diǎn)和積極效果表現(xiàn)在(1)抗原實(shí)用性強(qiáng)速滅威抗原合成與抗體制備技術(shù)具有重要的使用價(jià)值和實(shí)際意義。用上述方法能夠合成具有活性基團(tuán)的速滅威農(nóng)藥類似結(jié)構(gòu),有效地制備出速滅威抗原,并用此抗原生產(chǎn)出高特異性識別速滅威農(nóng)藥的抗體,為速滅威農(nóng)藥免疫速測試劑盒的研制解決了一個(gè)技術(shù)難點(diǎn),為速滅威農(nóng)藥高效快速簡便的殘留量分析開山辟路,必將推動(dòng)速滅威免疫速測試劑盒的問世。
      (2)抗原穩(wěn)定性好此法合成的速滅威抗原具有較好的穩(wěn)定性,5℃環(huán)境下4個(gè)月不影響其免疫原性。-20℃冰箱至少可以存放3年。
      (3)抗原制備技術(shù)簡便可行抗原的整個(gè)制備過程無需要特別的儀器設(shè)備,成本低廉,容易工廠化規(guī)模生產(chǎn)。
      具體實(shí)施例方式
      實(shí)施例1速滅威抗原免疫新西蘭白兔將制備好的抗原H速-OVA、H速-BSA分別用來免疫2kg以上的新西蘭白兔。平均每次抗原用量約3mg(以蛋白質(zhì)的量計(jì))。首次免疫采用由等體積的弗氏完全佐劑乳化的免疫原,于兔皮下多點(diǎn)注射;首免后間隔3周、以后每隔2周用由等體積的弗氏不完全佐劑乳化的免疫原,于兔背部皮下或皮內(nèi)多點(diǎn)以及后腿肌肉注射。從第四次開始,每次免疫后一周,兔耳緣靜脈采血測效價(jià)(瓊脂糖雙擴(kuò)散法或間接競爭ELISA法)。待效價(jià)達(dá)到一定程度(以陽性結(jié)果所用抗血清的最大稀釋倍數(shù)表示,瓊脂糖雙擴(kuò)散法效價(jià)達(dá)32以上,間接非競爭ELISA法效價(jià)達(dá)104以上)后,兔心臟采血至其死亡。以此方法制備得高效價(jià)的速滅威抗體。
      實(shí)施例2速滅威農(nóng)藥競爭性與速滅威抗體結(jié)合采用間接競爭ELISA方法,對檢測曲線進(jìn)行初步探索。方法如下包被用碳酸鹽緩沖液將包被抗原稀釋一定的倍數(shù),每孔加100μl到96孔酶聯(lián)微量分析板上,至5℃環(huán)境放置過夜。
      洗滌PBS洗滌3次封閉PBS稀釋OVA至1%,200μl/孔,37℃1小時(shí)。
      洗滌PBS洗滌3次加樣將農(nóng)藥以10倍逐級稀釋(速滅威原藥先用丙酮助溶后再用PBS稀釋),與含0.5%OVA的PBS稀釋到一定倍數(shù)的相應(yīng)抗血清溶液等體積(斡旋震蕩30秒,充分混勻)室溫(36℃)反應(yīng)0.5小時(shí)后,加入到酶聯(lián)板上100μl/孔(相當(dāng)于農(nóng)藥與抗血清溶液各50μl/孔),371小時(shí)。
      洗滌PBS洗滌4次加酶標(biāo)二抗含1%OVA的PBS溶液稀釋HRP-羊抗兔IgG,100μl/孔,37℃1小時(shí)。
      洗滌PBS洗滌8次顯色TMB底物溶液100μl/孔,室溫(36℃左右)10分鐘終止反應(yīng)加2M的硫酸,50μl/孔酶聯(lián)儀上450nm處讀數(shù),并計(jì)算抑制率。當(dāng)速滅威原藥濃度為10-12g/ml時(shí)仍有10%的抑制率。結(jié)果表明,制備的抗體對速滅威農(nóng)藥具有識別作用??捎糜谘兄扑贉缤庖咚贉y試劑盒。
      權(quán)利要求
      1.速滅威抗原合成方法,包括1)間-甲基苯甲酰氯的合成稱取雙光氣28g,小心加入0.135g活性碳,36℃水浴加熱,用51.5g甲苯收集光氣,甲苯液在23℃水浴中磁力攪拌,尾氣通入堿液,光氣劇毒,且氣味難聞,應(yīng)在通風(fēng)櫥中進(jìn)行;至雙光氣反應(yīng)完,甲苯相增重16.5g,得24%光氣/甲苯溶液,稱取間-甲基苯酚7.7g,溶進(jìn)100ml 10%的NaOH水溶液,40℃水浴加熱磁力攪拌1小時(shí),冷卻到室溫后緩慢加入上光氣/甲苯溶液,40分鐘加完,開始計(jì)時(shí),4小時(shí)后結(jié)束反應(yīng);取有機(jī)相減壓蒸餾得9.012g黃色油狀物,GC法測定目標(biāo)物的含量,5℃冰箱存放備用;2)β-(間-甲基苯甲酰)氨基丙酸(H速)的合成稱取間-甲基苯甲酰氯3.275g,溶進(jìn)4ml 4M NaOH溶液,置5℃冰箱冷卻,得A液;稱取β-丙胺酸1.989g,溶進(jìn)4ml 4M NaOH溶液,置5℃冰箱冷卻,得B液;另取3ml 4M NaOH溶液,置5℃冰箱冷卻,得C液。將A液與C液均分成5等份,每間隔5~10分鐘向B液中同時(shí)各加入1份,整個(gè)反應(yīng)置冰水中,磁力攪拌下進(jìn)行;加樣全部完成開始記時(shí),2小時(shí)后結(jié)束反應(yīng)。用濃鹽酸調(diào)節(jié)反應(yīng)終液的pH值為4,目標(biāo)產(chǎn)物用乙酸乙酯3個(gè)50ml份抽提;乙酸乙酯相用稀HCl洗滌數(shù)次,用1MNaHCO3溶液2個(gè)50ml份抽提;水相再用濃鹽酸酸化,乙酸乙酯再抽提;無水Na2SO4干燥,所得物減壓蒸餾濃縮至13.8ml,向濃縮液中逐漸加入31ml正己烷,白色結(jié)晶物析出,過濾。結(jié)晶物經(jīng)低溫干燥得3.898g;再經(jīng)過甲苯與去離子水5℃下洗滌,低溫干燥后稱重得到H速結(jié)晶物1.871g;3)速滅威人工抗原的合成稱取H速結(jié)晶物223mg和NHS 130mg,用1000μl DMF溶解于反應(yīng)裝置中;稱取300mg DCC,用500μl DMF溶解;將DCC/DMF溶液滴加到上反應(yīng)裝置中,反應(yīng)在磁力攪拌下室內(nèi)溫度進(jìn)行7小時(shí);反應(yīng)終液置5℃冰箱冷卻2小時(shí)以上,經(jīng)1.2萬rpm離心5分鐘,取上清活潑酯液并將其均分為2等份,分別緩慢滴加到2.5ml 12mg/ml的BSA溶液與2.5ml 12mg/ml的OVA溶液中反應(yīng),反應(yīng)緩沖液為0.2M pH8.0的PB液;反應(yīng)在磁力攪拌下室內(nèi)溫度進(jìn)行4小時(shí);將反應(yīng)液置透析袋內(nèi),于0.2M pH6.8的PB中4℃攪拌透析,每4小時(shí)換一次透析液,共透析60小時(shí);透析結(jié)束后將透析袋中的速滅威人工抗原白色乳狀液裝于若干1ml離心管中,于-20℃冰箱中存放備用。
      全文摘要
      本發(fā)明速滅威人工抗原合成技術(shù)屬于有機(jī)化學(xué)及免疫學(xué)技術(shù)范疇。根據(jù)有機(jī)化學(xué)反應(yīng)的一般原理,合成速滅威半抗原及抗原(包括包被抗原與免疫原),包括間-甲基苯甲酰氯的合成,β-(間-甲基苯甲酰)氨基丙酸(H
      文檔編號G01N33/53GK1616481SQ20031010627
      公開日2005年5月18日 申請日期2003年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月13日
      發(fā)明者劉鳳權(quán), 張奇 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
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