專利名稱：牛奶中體細(xì)胞含量的檢測(cè)方法及其檢測(cè)樣品采集器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種牛奶中體細(xì)胞含量的檢測(cè)方法及其檢測(cè)樣品采集器。
背景技術(shù)：
奶牛乳房炎會(huì)引起牛奶產(chǎn)量和質(zhì)量下降，是奶牛的常見病，給養(yǎng)牛者造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。該病通常分為臨床型和隱性型兩類。臨床型乳房炎能被肉眼覺察，可引起人們的重視；而隱性型則不易被肉眼覺察，容易被忽視。牛群中的乳房炎主要以隱性乳房炎的形式存在。隱性乳房炎雖無臨床癥狀，但可導(dǎo)致產(chǎn)奶量下降，引起經(jīng)濟(jì)損失；此外，如不妥善處理，隱性乳房炎會(huì)發(fā)展成臨床型乳房炎，造成更大的損失。因此，及時(shí)而準(zhǔn)確地檢出奶牛隱性乳房炎，采取適當(dāng)措施防止病情進(jìn)一步惡化，可使養(yǎng)牛者挽回經(jīng)濟(jì)損失。
乳房炎主要由細(xì)菌感染乳腺組織引起。乳腺發(fā)生炎癥時(shí)，體內(nèi)白細(xì)胞向炎癥部位聚集，導(dǎo)致牛奶中體細(xì)胞數(shù)量升高。因此，牛奶中的體細(xì)胞數(shù)是乳腺是否發(fā)生炎癥的一個(gè)重要指標(biāo)。為了準(zhǔn)確診斷奶牛隱性乳房炎，通常需要綜合乳汁體細(xì)胞數(shù)和細(xì)菌學(xué)檢查兩方面的結(jié)果。乳汁體細(xì)胞數(shù)超過20萬/毫升表示乳腺有炎癥。細(xì)菌學(xué)檢查結(jié)果可揭示引起乳房炎的病原，使臨床獸醫(yī)在治療疾病中準(zhǔn)確用藥，并采取相應(yīng)預(yù)防措施。一般直接計(jì)數(shù)牛奶中的體細(xì)胞數(shù)需要昂貴的儀器，不適宜牛場(chǎng)使用。間接計(jì)數(shù)法雖然簡(jiǎn)單，但結(jié)果比較粗放，不夠準(zhǔn)確。乳汁細(xì)菌學(xué)檢查過程比較復(fù)雜，并需要專門實(shí)驗(yàn)室和專業(yè)人員，基層單位很難做到。解決的方法之一是采集牛奶樣品，然后將奶樣寄往有關(guān)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。但液體牛奶樣品郵寄不方便，若郵寄時(shí)間過長(zhǎng)并在郵寄過程中保存不當(dāng)，奶樣容易腐敗變質(zhì)，失去了檢驗(yàn)價(jià)值。因此，采用適當(dāng)方法采集和保存奶樣，將奶樣從奶牛場(chǎng)安全郵寄到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行診斷就顯得十分重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種牛奶中體細(xì)胞含量的檢測(cè)方法及其檢測(cè)樣品采集器。
牛奶中體細(xì)胞含量的檢測(cè)方法采集樣品時(shí)，將牛奶擠滴在濾紙片上，濾紙片含乙二胺四乙酸ethylene-diaminetetraacetic acid，EDTA)以絡(luò)合二價(jià)離子，降低牛奶中有關(guān)酶的活性，使樣品在較長(zhǎng)時(shí)間保存。檢測(cè)時(shí)，將含牛奶的濾紙片置蒸餾水中，并振搖以釋出細(xì)胞中的脫氧核糖核酸，用熒光染料(二苯甲亞胺，bis-benzimide，代號(hào)Hoechest 33258)對(duì)溶液中的DNA進(jìn)行染色，用熒光光度計(jì)檢測(cè)溶液的熒光強(qiáng)度，進(jìn)而推算體細(xì)胞含量。
牛奶樣品采集器具有采集桿和桿套兩部分，采集桿的內(nèi)腔裝有變色硅膠干燥劑，采集桿的一端封閉，采集另一端是開有小孔的圓形濾片，在濾片中央向外垂直有一細(xì)桿，細(xì)桿的遠(yuǎn)端設(shè)有兩個(gè)圓形濾紙片，桿套一端封閉，另一端開口，桿套腔之間由一開有小孔的圓形濾片隔成兩部分，濾片至封閉端部分內(nèi)裝干燥劑，另一部分為空腔。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是(1)由于濾紙片含EDTA，可以絡(luò)合牛奶中的二價(jià)離子，降低有關(guān)酶活性，濾紙片上的水分可以被干燥劑吸收，從而使濾紙片上的被檢測(cè)成分可以保存較長(zhǎng)時(shí)間，使樣品從奶牛場(chǎng)郵寄到實(shí)驗(yàn)室的過程中不變質(zhì)；(2)采集器做成筆狀，便于奶牛場(chǎng)獸醫(yī)使用，也有利于樣品從偏遠(yuǎn)的奶牛場(chǎng)通過郵局寄往乳房炎診斷市進(jìn)行診斷；(3)本發(fā)明所用的熒光染料可特異性和DNA結(jié)合，不受牛奶中蛋白質(zhì)的干擾，從而保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。


附圖是牛奶中體細(xì)胞含量的檢測(cè)樣品采集器結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施例方式
如附圖所示，采集器由采集桿1和桿套5兩部分組成。采集桿的內(nèi)腔裝有干燥劑(如變色硅膠)2，桿的一端封閉，一端是開有小孔的圓形濾片6。在濾片中央向外垂直有一細(xì)桿，細(xì)桿的遠(yuǎn)端設(shè)有兩個(gè)圓形濾紙片3，每個(gè)濾紙片含乙二氨四乙酸(EDTA)。桿套一端封閉，一端開口，兩端之間由一開有小孔的圓形濾片6隔成兩部分。濾片至封閉端部分的腔內(nèi)裝有干燥劑2，另一部分為空腔。采集桿與桿套之間設(shè)有密封件4。
每片檢測(cè)紙片上含適量EDTA，以絡(luò)合二價(jià)離子，降低牛奶中有關(guān)酶的活性，從而使牛奶中的DNA和細(xì)菌可在干燥的紙片上保存較長(zhǎng)的時(shí)間。
本發(fā)明通過檢測(cè)奶樣采集器紙片上牛奶DNA含量來診斷奶牛乳房炎。乳房發(fā)生炎癥時(shí)，牛奶中的體細(xì)胞含量升高，DNA含量隨之增加。因此，通過檢測(cè)紙片上DNA含量來間接判斷牛奶中的體細(xì)胞含量。具體方法是將含牛奶的紙片置蒸餾水中，并振搖一定時(shí)間以釋出細(xì)胞核物質(zhì)，用熒光染料對(duì)溶液中的DNA進(jìn)行染色，然后檢測(cè)熒光強(qiáng)度，推算出細(xì)胞含量。
使用時(shí)，將牛奶擠在兩個(gè)紙片上，然后套緊筆套。干燥劑吸收紙片上的水分使其容易干燥。
擰開采集器筆套，將患乳房炎奶牛的病奶擠在筆桿的兩個(gè)紙片上，輕輕甩動(dòng)以除去多余牛奶，套上筆套，擰緊，標(biāo)上奶牛的牛號(hào)和采樣時(shí)間后即可放入信封郵寄往乳房炎實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行診斷。
在實(shí)驗(yàn)室以無菌操作，將采集器上的兩個(gè)濾紙片分別放入兩個(gè)已滅菌的試管。
細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)在其中一個(gè)試管中加入2毫升營(yíng)養(yǎng)肉燙培養(yǎng)基，置37C進(jìn)行增菌培養(yǎng)18小時(shí)。將培養(yǎng)液接種到血平皿，置37C培養(yǎng)18-24小時(shí)后，進(jìn)行細(xì)菌學(xué)鑒定。
牛奶體細(xì)胞估算在另一個(gè)含濾紙片的試管中加入3毫升蒸餾水，震蕩10分鐘以釋出DNA，然后加入熒光染料，震蕩10分鐘使DNA充分染色，用熒光光度計(jì)檢測(cè)液體熒光強(qiáng)度。熒光值越大，表示牛奶中的DNA含量越高，體細(xì)胞含量越多，奶牛乳房的炎癥越嚴(yán)重。
權(quán)利要求
1.一種牛奶中體細(xì)胞含量的檢測(cè)方法，其特征在于采集樣品時(shí)，將牛奶擠滴在濾紙片上，濾紙片含乙二胺四乙酸，以絡(luò)合二價(jià)離子，降低牛奶中有關(guān)酶的活性，使樣品在較長(zhǎng)時(shí)間保存。檢測(cè)時(shí)，將含牛奶的濾紙片置蒸餾水中，并振搖以釋出細(xì)胞中的脫氧核糖核酸，用熒光染料對(duì)溶液中的DNA進(jìn)行染色，用熒光光度計(jì)檢測(cè)溶液的熒光強(qiáng)度，進(jìn)而推算體細(xì)胞含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種牛奶中體細(xì)胞含量的檢測(cè)方法，其特征在于所說的熒光染料為二苯甲亞胺。
3.一種牛奶樣品采集器，其特征在于，它具有采集桿(1)和桿套(5)兩部分，采集桿的內(nèi)腔裝有變色硅膠干燥劑(2)，采集桿的一端封閉，采集另一端是開有小孔的圓形濾片(6)，在濾片中央向外垂直有一細(xì)桿，細(xì)桿的遠(yuǎn)端設(shè)有兩個(gè)圓形濾紙片(3)，桿套一端封閉，另一端開口，桿套腔之間由一開有小孔的圓形濾片(6)隔成兩部分，濾片至封閉端部分內(nèi)裝干燥劑，另一部分為空腔，采集桿與桿套之間設(shè)有密封件(4)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種牛奶樣品采集器，其特征在于所說的細(xì)桿上的圓形濾紙片上含有乙二胺四乙酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種牛奶體細(xì)胞含量的檢測(cè)方法及其被檢樣品的采集器。方法采樣時(shí)將牛奶擠滴在濾紙片上，濾紙片含乙二胺四乙酸以絡(luò)合二價(jià)離子，降低牛奶中有關(guān)酶的活性。檢測(cè)時(shí)，將含牛奶的濾紙片置蒸餾水中，并振搖以釋出細(xì)胞中的脫氧核糖核酸，然后用一種熒光染料對(duì)溶液中的DNA進(jìn)行染色，再用熒光光度計(jì)檢測(cè)熒光強(qiáng)度，從熒光強(qiáng)度推算牛奶中的體細(xì)胞含量。采集器由采集桿和桿套兩部分組成。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是(1)由于濾紙片含EDTA，可以絡(luò)合牛奶中的二價(jià)離子，降低有關(guān)酶活性，濾紙片上的水分可以被干燥劑吸收，從而使濾紙片上的被檢測(cè)成分可以保存較長(zhǎng)時(shí)間；(2)本發(fā)明所用的熒光染料可特異性和DNA結(jié)合，不受牛奶中蛋白質(zhì)的干擾，從而保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
文檔編號(hào)G01N33/04GK1544941SQ20031010894
公開日2004年11月10日 申請(qǐng)日期2003年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月25日
發(fā)明者胡松華 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)