專利名稱：作為肝癌標志物的腫瘤相關分泌蛋白及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術和醫(yī)學領域，具體地說，本發(fā)明涉及一種新的肝癌標志物-腫瘤相關分泌蛋白1(Melanoma antigen gene，family D，1，簡稱為MAGED1蛋白)。本發(fā)明還公開了MAGED1蛋白及其編碼序列的用途，如用于診斷腫瘤，以及含MAGED1蛋白拮抗劑(如抗體和反義核酸)的藥物組合物。
背景技術：
二十世紀50年代以來醫(yī)學科學有了飛躍的發(fā)展，癌癥治療的進展也是卓有成效的，并發(fā)現(xiàn)了不少直接與癌癥發(fā)生相關的癌基因與抑癌基因。
迄今為止，已在黑色素瘤及包括前列腺癌、胸腺癌、卵巢癌、腸胃癌在內的各種腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)了不少腫瘤抗原。目前已發(fā)現(xiàn)的人類腫瘤免疫排斥抗原可分為四種類型。第一類抗原來自于正常基因產物的體細胞突變，第二類抗原來自于和致癌過程相關的基因突變。這兩類抗原均為患者特異性抗原，不適合普遍性治療。第三類抗原為那種在正常組織中也有表達，但在腫瘤中表達量升高的基因的產物。如果不涉及突變，這類抗原在各種癌癥病人中是具有普遍性的，但它們通常是組織特異的，且并非為腫瘤所特有，在臨床應用上意義不大。第四類抗原具有嚴格的腫瘤特異性，和一般的致癌過程相關。因此，這類抗原在人類腫瘤中廣泛的表達，最適合于作為腫瘤標志物以及抗腫瘤免疫攻擊的靶點。此外，特別適合用于診斷的腫瘤標志物是那些分泌性的蛋白。然而，目前已發(fā)現(xiàn)的抗原中很少是屬于這一類的。
MAGED1基因是MAGE家族的一員。其登錄號為AF258554，核苷酸序列如SEQ IDNO1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。與其它MAGE家族基因不同，MAGED1基因在正常成人組織中都表達，缺乏腫瘤特異性(Genomics 1999 Jul15；59(2)161-7)。
有文獻(Neuro 2000 Aug；27(2)279-88)報道，MAGED1基因與神經細胞的凋亡有關。但在本發(fā)明之前沒有該基因與肝癌發(fā)生發(fā)展相關的任何報道。
為了治療和診斷目的開發(fā)腫瘤相關的分泌蛋白具有十分重要意義。因此，本領域迫切需要開發(fā)新的分泌性的腫瘤標志物，用于腫瘤的診斷和治療。
發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供一種新的人肝癌標志物MAGED1蛋白以及其片段、類似物和衍生物。
本發(fā)明的另一目的是提供編碼這些多肽的多核苷酸。
本發(fā)明的另一目的是提供生產這些多肽的方法以及該多肽和編碼序列的用途。
本發(fā)明經過廣泛而深入的研究，首次發(fā)現(xiàn)MAGED1可作為肝癌標志物。該基因的表達產物在很多肝癌病人的血清中可以檢測到，但是在正常人和其他非肝癌患者中的血清缺檢測不到。這表明，MAGED1是一特異的分泌性的肝癌標志物。在此基礎上完成了本發(fā)明。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種檢測腫瘤(尤其是肝癌)的試劑盒，它含有它含有與MAGED1蛋白特異性結合的抗體和說明書。較佳地，所述的MAGED1含有SEQ ID NO2的氨基酸序列。
在另一優(yōu)選例中，所述的抗體的單克隆抗體。
在另一優(yōu)選例中，所述的抗體的多克隆抗體。
在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還含有陽性對照和陰性對照。
在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還含有采樣裝置，如采集血樣的裝置。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種檢測癌癥的蛋白質芯片，它包括基片和點樣在基片上的癌癥相關蛋白的特異性抗體，其中，所述的癌癥相關蛋白的特異性抗體包括抗MAGED1的特異性抗體。
在另一優(yōu)選例中，所述的癌癥相關蛋白的特異性抗體還包括其他已知的肝癌相關蛋白的抗體，如抗以下抗原的抗體pTEN、p21、p27、p73、p15、p53、RB1、APC、nm23、P16、MXR7、IGF-II、TGFα、HGF-R、c-erbB-1、Ras、Raf、c-myc、c-ets-2。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種檢測樣品中是否存在MAGED1蛋白的方法，它包括步驟將樣品與MAGED1蛋白特異性結合的抗體接觸，觀察是否形成抗體復合物，形成了抗體復合物就表示樣品中存在MAGED1蛋白，其中，所述的樣品是血液樣品。
在另一優(yōu)選例中，所述的血液樣品是人的血液樣品。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的MAGED1拮抗劑和藥學上可接受的載體。優(yōu)選的MAGED1拮抗劑是抗MAGED1的抗體和MAGED1反義序列。這些藥物組合物可治療腫瘤。
在本發(fā)明的第五方面，提供了與人MAGED1蛋白特異性結合的抗體。
在本發(fā)明的第六方面，提供了模擬、促進、拮抗人MAGED1蛋白活性的化合物，以及抑制人MAGED1蛋白的表達的化合物。還提供了篩選和/或制備這些化合物的方法。較佳地，該化合物是人MAGED1蛋白的編碼序列或其片段的反義序列。
在本發(fā)明的第九方面，提供了本發(fā)明多肽和編碼序列的用途。例如本發(fā)明多肽可被用于篩選促進人MAGED1蛋白活性的激動劑，或者抑制人MAGED1蛋白活性的拮抗劑、或者被用于肽指紋圖譜鑒定。本發(fā)明的人MAGED1蛋白的編碼序列或其片段，可被作為引物用于PCR擴增反應，或者作為探針用于雜交反應，或者用于制造基因芯片或微陣列。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術的公開，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


圖1顯示了MAGED1蛋白的表達。
其中，圖A是誘導前后的表達情況，泳道1.標準蛋白分子量；2.pT7470-MAGED1-HMS174(DE3)誘導后；2.pT7470-MAGED1-HMS174(DE3)誘導前。
圖B為Western印跡檢測結果(1∶10000)，泳道1.MAGED1蛋白樣品；2.pT7470-MAGED1-HMS174(DE3)誘導前菌體。
圖2顯示了對部分病人血清的Western Blot結果。各泳道如下N正常人；K肝癌病人；大肝炎大三陽；小肝炎小三陽。
圖3顯示了載體pT7470的結構圖。
發(fā)明詳述在本發(fā)明中，“本發(fā)明蛋白”、“本發(fā)明多肽”指MAGED1蛋白，或其活性片段和衍生物。
在本發(fā)明中，“本發(fā)明基因”、“本發(fā)明多核苷酸”指編碼MAGED1蛋白或其活性片段和衍生物的核苷酸序列，包括正義和反義核酸。
在本發(fā)明中，術語“MAGED1蛋白”、“MAGED1蛋白”或“肝癌標志物MAGED1”可互換使用，都指具有人肝癌標志物MAGED1氨基酸序列(SEQ ID NO2)的蛋白或多肽。
如本文所用，“分離的”是指物質從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細胞內的天然狀態(tài)下的多核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。
如本文所用，“分離的MAGED1蛋白或多肽”是指MAGED1蛋白基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質。本領域的技術人員能用標準的蛋白質純化技術純化MAGED1蛋白?；旧霞兊亩嚯脑诜沁€原聚丙烯酰胺凝膠上能產生單一的主帶。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。根據(jù)重組生產方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明還包括人MAGED1蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然人MAGED1蛋白相同的生物學功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據(jù)本文的教導，這些片段、衍生物和類似物屬于本領域熟練技術人員公知的范圍。
在本發(fā)明中，術語“人MAGED1蛋白”指具有人MAGED1蛋白活性的SEQ ID NO2序列的全長多肽或成熟多肽。該術語還包括具有與人MAGED1蛋白相同功能(如促進肝癌細胞生長的功能)的、SEQ ID NO.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)一個或多個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括人MAGED1蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與人MAGED1 DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人MAGED1蛋白的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含人MAGED1蛋白或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了人MAGED1蛋白的可溶性片段。通常，該片段具有人MAGED1蛋白序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供人MAGED1蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人MAGED1蛋白的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸類似物。應理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，“人MAGED1蛋白保守性變異多肽”指與SEQ ID NO2的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。
本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID NO2的蛋白質，但與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
編碼MAGED1的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。術語“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上改變其編碼多肽的功能。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段，包括正義和反義的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴增技術(如PCR)以確定和/或分離編碼MAGED1蛋白的多核苷酸。
本發(fā)明的人MAGED1核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)已公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經可以完全通過化學合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
應用PCR技術擴增DNA/RNA的方法被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開的本發(fā)明的序列信息適當?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成?？捎贸Ｒ?guī)方法如通過凝膠電泳分離和純化擴增的DNA/RNA片段。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或MAGED1蛋白編碼序列經基因工程產生的宿主細胞，以及經重組技術產生本發(fā)明所述多肽的方法。
通過常規(guī)的重組DNA技術，可利用本發(fā)明的多核苷酸序列可用來表達或生產重組的MAGED1蛋白。一般來說有以下步驟
(1).用本發(fā)明的編碼人MAGED1蛋白的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細胞；(3).從培養(yǎng)基或細胞中分離、純化蛋白質。
本發(fā)明中，人MAGED1多核苷酸序列可插入到重組表達載體中?？傊灰茉谒拗黧w內復制和穩(wěn)定，任何質粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特征是通常含有復制起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。
本領域的技術人員熟知的方法能用于構建含人MAGED1編碼DNA序列和合適的轉錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。
此外，表達載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉化適當?shù)乃拗骷毎允蛊淠軌虮磉_蛋白質。
宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬的細菌細胞；真菌細胞如酵母；植物細胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；CHO、COS、或293細胞的動物細胞等。
用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規(guī)技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。
獲得的轉化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養(yǎng)。當宿主細胞生長到適當?shù)募毎芏群螅煤线m的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養(yǎng)一段時間。
在上面的方法中的重組多肽可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。
重組的人MAGED1蛋白或多肽有多方面的用途。這些用途包括(但不限于)用于篩選對抗MAGED1蛋白功能的抗體、多肽或其它物質。
另一方面，本發(fā)明還包括對人MAGED1 DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結合于人MAGED1基因產物或片段。較佳地，指那些能與人MAGED1基因產物或片段結合但不識別和結合于其它非相關抗原分子的抗體。本發(fā)明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行制備。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體。
抗人MAGED1蛋白的抗體可用于免疫組織化學技術中，檢測活檢標本中的人MAGED1蛋白。
利用本發(fā)明蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與MAGED1蛋白發(fā)生相互作用的物質，如受體、抑制劑、激動劑或拮抗劑等。
本發(fā)明蛋白及其抗體、抑制劑、激動劑、拮抗劑或受體等，當在治療上進行施用(給藥)時，可提供不同的效果。通常，可將這些物質配制于無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質的性質以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進行給藥，其中包括(但并不限于)肌內、腹膜內、靜脈內、皮下、皮內、或局部給藥。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明MAGED1拮抗劑(如抗體和反義序列)以及藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約1微克-10毫克/千克體重。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測人MAGED1蛋白水平的診斷試驗方法。這些試驗是本領域所熟知的。試驗中所檢測的人MAGED1蛋白水平，可以用于診斷腫瘤。
一種檢測樣品中是否存在MAGED1蛋白的方法是利用MAGED1蛋白的特異性抗體進行檢測，它包括將樣品與MAGED1蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復合物，形成了抗體復合物就表示樣品中存在MAGED1蛋白。
MAGED1蛋白或其多核苷酸可用于MAGED1蛋白相關疾病的診斷和治療。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列或DNA芯片上，用于分析組織中基因的差異表達分析和基因診斷?？筂AGED1的抗體可以固定在蛋白質芯片上，用于檢測樣品中的MAGED1蛋白。
本發(fā)明還提供了一種檢測肝癌的試劑盒，它含有特異性擴增MAGED1的引物對和/或MAGED1特異性抗體。
此外，鑒于MAGED1是一個腫瘤細胞特有的免疫性抗原，分泌到體液中。因此，血樣或尿液中的MAGED1的直接測定除了可以作為腫瘤的輔助診斷和預后的觀察指標之外，也可作為腫瘤早期診斷的依據(jù)。
本發(fā)明的主要優(yōu)點在于(1)MAGED1僅存在于肝癌病人血清中，而在正常人或非肝癌患者的血清中不能檢測到。因此，假陽性率低。
(2)MAGED1是一分泌性蛋白，便于應用于肝癌的血清學診斷、預后監(jiān)測，并且可作為基因治療、研制基因工程藥物或作為設計抗癌新藥的靶分子。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1MAGED1的cDNA的獲得取人胎盤組織，用Trizol試劑(GIBCO BRL公司)按廠方說明書提取總RNA，用mRNA提純試劑盒(Pharmacia公司)提取mRNA。利用引物linker-primer(Stratgene)5’-GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’(SEQ ID NO3)，用MMLV-RT-Superscript II(GIBCO BRL公司)，反轉錄酶在42℃進行反轉錄反應，獲得胎盤cDNA。
實施例2 MAGED1蛋白重組表達和純化在該實施例中，以實施例1中的反轉錄的cDNA為模板，用序列如下的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物進行擴增，獲得人MAGED1 DNA作為插入片段。
5’端寡核苷酸引物序列為5’-CAGGAGCTCGCTCAGAAAATGGAC-3’(SEQ ID NO4)。該引物含有SacI限制性內切酶的酶切位點，在該酶切位點之后是不含信號肽序列的部分編碼序列；3’端引物序列為5’-TCCCTCGAGTCACTCAACCCAGAA-3’(SEQ ID NO5)。該引物含有XhoI限制性內切酶的酶切位點、翻譯終止子和人MAGED1的部分編碼序列。
在pET21a+載體(購自Novagen公司)N端加入了6His tag序列，形成pT7470載體(結構見圖3)。
人MAGED1蛋白cDNA PCR產物純化后經SacI/XhoI雙酶切，與雙酶切的pT7470載體連接形成載體pT7470-MAGED1并轉化至感受態(tài)大腸桿菌HMS174(DE3)(Novagen公司)，挑取陽性克隆鑒定后純化并測序(ABI公司的377型測序儀，BigDye Terminator試劑盒，PE公司)。測序證實插入完整的MAGED1編碼序列。
挑表達MAGED1的陽性大腸桿菌克隆接種于10ml LB培養(yǎng)基中，37℃300rpm振蕩培養(yǎng)過夜，1∶100稀釋于接種于LB培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)2.5hr，加100mM IPTG至0.1mM后37℃誘導2-3hr，5,000g 4℃離心10min去上清，置冰上用50ml上樣緩沖液(0.5M NaCl，20mM咪唑2.7mM KCl，10.1mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH8.0)重懸，超聲(B.Braun Labsonic U)破碎，然后12,000g 4℃離心10min，上清用0.8μm濾膜過濾后，過1ml Ni2+金屬螯合Sepharose 4B層析柱，上樣緩沖液充分洗滌后，加入500ul咪唑洗脫緩沖液(0.5M NaCl，500mM咪唑2.7 mM KCl，10.1mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH8.0)室溫靜置30分鐘后收集洗脫液，重復洗脫2-3次，得到人MAGED1蛋白。
結果如圖1A所示，MAGED1蛋白的分子量約為86.2Kda，與預測值相符。
實施例3抗MAGED1蛋白抗體的產生將實施例2中獲得的重組人MAGED1蛋白用來免疫動物以產生抗體，具體方法如下。重組分子用層析法進行分離后備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。用150μg/0.2ml乳化過的蛋白，對兔子(新西蘭兔)進行腹膜內注射。14天后，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原，對兔子(新西蘭兔)以50-100μg/0.2ml的劑量進行腹膜內注射以加強免疫。每隔14天進行一次加強免疫，至少進行三次。獲得的抗血清的特異反應活性用它在體外沉淀人MAGED1蛋白基因翻譯產物的能力加以評估。
結果發(fā)現(xiàn)，抗體可特異性地與MAGED1蛋白發(fā)生結合(圖1B)。
實施例4MAGED1在肝炎、肝癌病人血清中的檢測用Wester Blot檢測病人血清中MAGED1蛋白。
樣品處理血清樣品2ul，6×樣品處理液1.67ul，H2O 6.33ul。100℃，3分鐘。高速離心(13,000rpm，3min)。取上清上樣。
SDS-PAGE電泳分析12％分離膠，4％濃縮膠。
電轉移(濕式)到protran膜(Schleicher & Schuell)400mA 3小時。
膜用PBST漂洗后，在室溫下用含有5％脫脂奶粉的PBST封閉4小時。加兔抗MAGED1多克隆抗體(1∶500稀釋)，4℃16小時。加入帶有辣根過氧化物酶的鼠抗兔抗體(Invitrogen，1∶2000稀釋)，室溫放置1小時。用Super Signal West FemtoMaximum Sensitivity Substrate(PIERCE，辣根過氧化物酶底物)處理后，壓X光片。
結果如圖2所示。共檢測了肝癌病人血清21例，其中11例檢測到MAGED1蛋白(陽性率52％)；正常人血清12例、HBV陽性的肝炎病人血清22例，MAGED1蛋白檢測均為陰性。這表明MAGED1是一種特異的分泌性的肝癌標志物。
實施例5檢測試劑盒在本實施例中，制備檢測MAGED1的診斷試劑盒，該試劑盒含有200微升實施例3制備的抗MAGED1的特異性抗血清以及描述如何使用試劑盒來檢測MAGED1的說明材料。試劑盒還可含有下組中的一種或多種用于協(xié)助檢測的各種標記物或標記試劑；用于雜交的試劑(包括緩沖液等)；采樣裝置，包括細針頭等；以及陽性和陰性雜交對照等。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
序列表<110>上海新世界基因技術開發(fā)有限公司<120>作為肝癌標志物的腫瘤相關分泌蛋白及其用途<130>035647<160>5<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2745<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(165)..(2498)<223>
<400>1gccgcgctgg cattttctcc tggacaagga gagagtgcgg ctgctgagag ccgagcccag 60caatcccgat cctctgagtc gtgaagaagg gaggcagcga gggggttggg gttggggcct120gaggcaagcc cccaggctcc gctcttgcca gagggacagg agcc atg gct cag aaa 176Met Ala Gln Lys1atg gac tgt ggt gcg ggc ctc ctc ggc ttc cag gct gag gcc tcc gta 224Met Asp Cys Gly Ala Gly Leu Leu Gly Phe Gln Ala Glu Ala Ser Val5 10 15 20gaa gac agc gcc ttg ctt atg cag acc ttg atg gag gcc atc cag atc 272Glu Asp Ser Ala Leu Leu Met Gln Thr Leu Met Glu Ala Ile Gln Ile25 30 35tca gag gct cca cct act aac cag gcc acc gca gct gct agt ccc cag 320Ser Glu Ala Pro Pro Thr Asn Gln Ala Thr Ala Ala Ala Ser Pro Gln40 45 50agt tca cag ccc cca act gcc aat gag atg gct gac att cag gtt tca 368Ser Ser Gln Pro Pro Thr Ala Asn Glu Met Ala Asp Ile Gln Val Ser55 60 65gca gct gcc gct agg cct aag tca gcc ttt aaa gtc cag aat gcc acc 416Ala Ala Ala Ala Arg Pro Lys Ser Ala Phe Lys Val Gln Asn Ala Thr70 75 80aca aaa ggc cca aat ggt gtc tat gat ttc tct cag gct cat aat gcc 464Thr Lys Gly Pro Asn Gly Val Tyr Asp Phe Ser Gln Ala His Asn Ala85 90 95 100aag gat gtg ccc aac acg cag ccc aag gca gcc ttt aag tcc caa aat 512Lys Asp Val Pro Asn Thr Gln Pro Lys Ala Ala Phe Lys Ser Gln Asn105 110 115
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<221>misc_feature<223>引物<400>5tccctcgagt cactcaaccc agaa2權利要求
1.一種檢測肝癌的試劑盒，其特征在于，它含有與MAGED1蛋白特異性結合的抗體和說明書。
2.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的抗體的單克隆抗體。
3.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的抗體的多克隆抗體。
4.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還含有陽性對照和陰性對照。
5.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還含有采樣裝置。
6.一種檢測癌癥的蛋白質芯片，它包括基片和點樣在基片上的癌癥相關蛋白的特異性抗體，其特征在于，所述的癌癥相關蛋白的特異性抗體包括抗MAGED1的特異性抗體。
7.如權利要求6所述的蛋白質芯片，其特征在于，所述的癌癥相關蛋白的特異性抗體還包括抗以下抗原的抗體pTEN、p21、p27、p73、p15、p53、RB1、APC、nm23、P16、MXR7、IGF-II、TGFα、HGF-R、c-erbB-1、Ras、Raf、c-myc、c-ets-2。
8.一種檢測樣品中是否存在MAGED1蛋白的方法，其特征在于，包括步驟將樣品與MAGED1蛋白特異性結合的抗體接觸，觀察是否形成抗體復合物，形成了抗體復合物就表示樣品中存在MAGED1蛋白，其中，所述的樣品是血液樣品。
9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述的血液樣品是人的血液樣品。
10.一種藥物組合物，其特征在于，它含有安全有效量的MAGED1拮抗劑和藥學上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的肝癌標志物——MAGED1蛋白。本發(fā)明還公開了MAGED1蛋白及其編碼序列的用途，如用于診斷肝癌。本發(fā)明還提供了檢測肝癌的試劑盒。
文檔編號G01N33/574GK1629637SQ200310109398
公開日2005年6月22日 申請日期2003年12月15日 優(yōu)先權日2003年12月15日
發(fā)明者萬大方, 顧健人, 楊勝利 申請人:上海新世界基因技術開發(fā)有限公司