專利名稱：檢測環(huán)丙沙星的免疫膠體金試劑及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測抗體的免疫膠體金試劑，還涉及該試劑的制備方法。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有用于檢測環(huán)丙沙星的方法主要有薄層色譜法、高效液相色譜法、色/質(zhì)聯(lián)用分析法、酶聯(lián)免疫吸附法。薄層色譜法的缺陷是操作過程復(fù)雜，時(shí)間長；操作人員需要經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)；影響分析的干擾因素比較多，結(jié)果重復(fù)性較差。高效液相色譜法和色/質(zhì)聯(lián)用分析法的缺陷是需要專業(yè)的儀器設(shè)備輔助；樣品的預(yù)處理程序繁瑣，要求高；操作過程復(fù)雜，時(shí)間長；需要經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的技術(shù)人員操作，操作人員要有豐富的相關(guān)經(jīng)驗(yàn)；操作人員必須了解影響色譜分析的各種干擾因素，了解所使用的預(yù)處理方法的優(yōu)缺點(diǎn)，才能獲得可靠的分析結(jié)果；需要的儀器設(shè)備昂貴，因而難以在城市及中小企業(yè)中普及；檢測費(fèi)用高。酶聯(lián)免疫吸附(EIA)方法的缺陷是需要專門的儀器設(shè)備來配合使用；檢測操作人員需要經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)；操作過程相對比較復(fù)雜，檢測所需時(shí)間比較長；檢測所需費(fèi)用較高，不能實(shí)現(xiàn)單人份檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了克服當(dāng)前技術(shù)在推廣使用中存在的缺陷，提供一種不需要特定儀器設(shè)備輔助的檢測試劑，并且能有效地降低檢測成本，減輕需檢測單位的負(fù)擔(dān)。同時(shí)提供該試劑的制備方法。
檢測環(huán)丙沙星的免疫膠體金試劑及制備方法，該試劑包括樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和PVC背襯，PVC背襯一端依次粘附樣品墊、結(jié)合墊，中間粘附硝酸纖維素膜，另一端粘附吸水墊。結(jié)合墊上包被了抗環(huán)丙沙星特異性單克隆抗體--膠體金標(biāo)記物。硝酸纖維素膜上包被了環(huán)丙沙星-BSA偶聯(lián)物和羊(兔)抗鼠IgG。
該試劑的制備方法包括以下步驟(1)制備環(huán)丙沙星-BSA偶聯(lián)物將環(huán)丙沙星與BSA按1∶5～50(mol/mol)比例混勻，使環(huán)丙沙星與BSA形成穩(wěn)定的顆粒，通過純化形成環(huán)丙沙星-BSA偶聯(lián)物；(2)制備抗環(huán)丙沙星特異性單克隆抗體用環(huán)丙沙星-BSA偶聯(lián)物多次免疫Balb/c純系小鼠，取小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞在體外融合形成雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)選擇性培養(yǎng)基篩選可得陽性雜交瘤細(xì)胞株。通過將雜交瘤注入小鼠腹腔獲取腹水或體外細(xì)胞培養(yǎng)收集培養(yǎng)上清液等方式，大量制備抗環(huán)丙沙星特異性單克隆抗體；(3)制備羊(兔)抗鼠IgG用環(huán)丙沙星-BSA多次免疫小鼠，提取抗血清免疫山羊或家兔，純化后得羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG。(4)制備膠體金用檸檬酸三鈉等還原劑將氯金酸還原成20nm～40nm的膠體金顆粒；(5)制備單克隆抗體膠體金標(biāo)記將膠體金與抗環(huán)丙沙星特異性單克隆抗體按1∶0.005～0.015(ml/mg)比例混勻，使膠體金與抗環(huán)丙沙星特異性單克隆抗體形成穩(wěn)定的膠體顆粒，通過純化、濃縮形成抗環(huán)丙沙星特異性單克隆抗體—膠體金標(biāo)記物；(6)將抗環(huán)丙沙星特異性單克隆抗體--膠體金標(biāo)記物包被在膠體金結(jié)合墊上，將環(huán)丙沙星-BSA偶聯(lián)物和羊(兔)抗鼠IgG包被在硝酸纖維素膜的檢測區(qū)和控制區(qū)，充分干燥。
本發(fā)明的積極效果在于價(jià)格低廉，生產(chǎn)流程簡單，成本低，檢測的費(fèi)用比使用其它檢測方法都要便宜得多；檢測速度快，全過程只需15-30分鐘，可以實(shí)現(xiàn)自我檢測；可以現(xiàn)場檢測；特異性好、靈敏度高、重復(fù)性好；操作簡便，快速定性，結(jié)果準(zhǔn)確、快速，操作簡便，無需沖洗過程和標(biāo)準(zhǔn)對照，可分批或單個(gè)樣品及時(shí)檢測；易于推廣使用，操作人員無需專業(yè)培訓(xùn)，按說明書即可完成操作。
具體實(shí)施例方式
將PVC背襯一端依次粘附樣品墊、結(jié)合墊，中間粘附硝酸纖維素膜，另一端粘附吸水墊。結(jié)合墊上包被了抗環(huán)丙沙星特異性單克隆抗體--膠體金標(biāo)記物。硝酸纖維素膜上包被了環(huán)丙沙星-BSA偶聯(lián)物和羊(兔)抗鼠IgG。
按以下步驟制備(1)制備環(huán)丙沙星-BSA偶聯(lián)物將環(huán)丙沙星與BSA按1∶5～50(mol/mol)比例混勻，使環(huán)丙沙星與BSA形成穩(wěn)定的顆粒，通過純化形成環(huán)丙沙星-BSA偶聯(lián)物；(2)制備抗環(huán)丙沙星特異性單克隆抗體用環(huán)丙沙星-BSA偶聯(lián)物多次免疫Balb/c純系小鼠，取小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞在體外融合形成雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)選擇性培養(yǎng)基篩選可得陽性雜交瘤細(xì)胞株。通過將雜交瘤注入小鼠腹腔獲取腹水或體外細(xì)胞培養(yǎng)收集培養(yǎng)上清液等方式，大量制備抗環(huán)丙沙星特異性單克隆抗體；(3)制備羊(兔)抗鼠IgG用環(huán)丙沙星-BSA多次免疫小鼠，提取抗血清免疫山羊或家兔，純化后得羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG。(4)制備膠體金將100ml 0.01％氯化金用0.9ml 1％檸檬酸三鈉還原成40nm大小的顆粒；(5)制備單克隆抗體膠體金標(biāo)記用0.1mol/L K2CO3將膠體金溶液的pH值調(diào)至8.1左右，將膠體金溶液與單克隆抗體按100ml膠體金溶液中加入1mg單克隆抗體的比例混合均勻，使膠體金與抗體形成穩(wěn)定的膠體金復(fù)合物，再通過多次離心、棄上清、清洗，通過純化、濃縮形成抗環(huán)丙沙星特異性單克隆抗體—膠體金標(biāo)記物，冷藏備用；(6)用Biodot點(diǎn)膜機(jī)將抗環(huán)丙沙星特異性單克隆抗體--膠體金標(biāo)記物包被在膠體金結(jié)合墊上，將環(huán)丙沙星-BSA偶聯(lián)物和羊(兔)抗鼠IgG包被在硝酸纖維素膜的檢測區(qū)和控制區(qū)，充分干燥。(7)將硝酸纖維素膜、膠體金結(jié)合墊、樣品墊、吸水墊等依次粘在PVC背襯上；(8)將粘好的PVC材料切成一定寬度的試劑條，即制成檢測環(huán)丙沙星的免疫膠體金試劑。
在檢測前先將樣本和試劑條(板)放在室溫條件下放置一段時(shí)間(約10分鐘)，使其恢復(fù)至室溫；從鋁箔袋中取出檢測試劑條，按MARK線下箭頭所示的方向?qū)⒃噭l浸入樣本溶液中，液面不得超過MARK線，5-8秒后取出，平放在操作臺上；如果是試劑板從鋁箔袋中取出檢測試劑板，平放在操作臺上，往加樣孔中滴加3滴(約120ul)樣品溶液；3-15分鐘內(nèi)即可判斷結(jié)果，30分鐘后判斷的結(jié)果為無效。結(jié)果判斷如果樣品中有要檢測的“環(huán)丙沙星”存在，則檢測線處不出現(xiàn)條帶，而質(zhì)控線上出現(xiàn)紅色條帶，此時(shí)結(jié)果為陽性；如果樣品中沒有要檢測的“環(huán)丙沙星”存在，則檢測線處有紅色條帶出現(xiàn)，同時(shí)質(zhì)控線上也出現(xiàn)紅色條帶，此時(shí)結(jié)果為陰性。如果質(zhì)控線上沒有紅色條帶出現(xiàn)，則該產(chǎn)品無效。
權(quán)利要求
1.檢測環(huán)丙沙星的免疫膠體金試劑及制備方法，該試劑包括樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和PVC背襯，PVC背襯一端依次粘附樣品墊、結(jié)合墊，中間粘附硝酸纖維素膜，另一端粘附吸水墊，其特征在于結(jié)合墊上包被了抗環(huán)丙沙星特異性單克隆抗體—膠體金標(biāo)記物，硝酸纖維素膜上包被了環(huán)丙沙星-BSA偶聯(lián)物和羊(兔)抗鼠IgG。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測環(huán)丙沙星的免疫膠體金試劑及制備方法，其特征在于該試劑的制備方法包括以下步驟(1)制備環(huán)丙沙星-BSA偶聯(lián)物將環(huán)丙沙星與BSA按1∶5～50(mol/mol)比例混勻，使環(huán)丙沙星與BSA形成穩(wěn)定的顆粒，通過純化形成環(huán)丙沙星-BSA偶聯(lián)物；(2)制備抗環(huán)丙沙星特異性單克隆抗體；用環(huán)丙沙星-BSA偶聯(lián)物多次免疫Balb/c純系小鼠，取小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞在體外融合形成雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)選擇性培養(yǎng)基篩選可得陽性雜交瘤細(xì)胞株。通過將雜交瘤注入小鼠腹腔獲取腹水或體外細(xì)胞培養(yǎng)收集培養(yǎng)上清液等方式，大量制備抗環(huán)丙沙星特異性單克隆抗體；(3)制備羊(兔)抗鼠IgG用環(huán)丙沙星-BSA多次免疫小鼠，提取抗血清免疫山羊或家兔，純化后得羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG。(4)制備膠體金用檸檬酸三鈉等還原劑將氯金酸還原成20nm～40nm的膠體金顆粒；(5)制備單克隆抗體膠體金標(biāo)記將膠體金與抗環(huán)丙沙星特異性單克隆抗體按1∶0.005～0.015(ml/mg)比例混勻，使膠體金與抗環(huán)丙沙星特異性單克隆抗體形成穩(wěn)定的膠體顆粒，通過純化、濃縮形成抗環(huán)丙沙星特異性單克隆抗體—膠體金標(biāo)記物；(6)將抗環(huán)丙沙星特異性單克隆抗體—膠體金標(biāo)記物包被在膠體金結(jié)合墊上，將環(huán)丙沙星-BSA偶聯(lián)物和羊(兔)抗鼠IgG包被在硝酸纖維素膜的檢測區(qū)和控制區(qū)，充分干燥。
全文摘要
檢測環(huán)丙沙星的免疫膠體金試劑及制備方法，該試劑包括樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和PVC背襯，PVC背襯一端依次粘附樣品墊、結(jié)合墊，中間粘附硝酸纖維素膜，另一端粘附吸水墊，其特征在于結(jié)合墊上包被了抗環(huán)丙沙星特異性單克隆抗體—膠體金標(biāo)記物，硝酸纖維素膜上包被了環(huán)丙沙星－BSA偶聯(lián)物和羊(兔)抗鼠IgG。該試劑是一種特異性強(qiáng)、敏感性高、簡易快速、費(fèi)用低廉、能現(xiàn)場檢測，全過程只需30分鐘，操作人員無需專業(yè)培訓(xùn)，按說明書即可完成操作。
文檔編號G01N33/558GK1547015SQ20031010946
公開日2004年11月17日 申請日期2003年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月16日
發(fā)明者張少恩 申請人:博頓生物檢驗(yàn)技術(shù)(杭州)有限公司