專利名稱：用于細胞胞外動作電位測量的單細胞傳感器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型涉及一種用于細胞胞外動作電位測量的單細胞傳感器。
背景技術(shù)：
1992年美國分子器件公司首次提出將活細胞與EIS(電解質(zhì)/絕緣層/硅)結(jié)構(gòu)的光尋址電位傳感器相結(jié)合，構(gòu)成敏感測試儀器，檢測胞外微環(huán)境酸堿度的變化，在此基礎(chǔ)上，又有研究人員改進傳感器結(jié)構(gòu)和數(shù)據(jù)處理方法，使該類傳感器可以同時檢測幾種離子的變化。但是，這些細胞傳感器檢測的都是細胞群的代謝產(chǎn)物，所以很難確定藥物對單個細胞的作用機理，同時，也難以將測量精確定位到離子通道，無法確定藥物對細胞的作用靶點，對于實現(xiàn)藥物篩選的定量化是個不可回避的難點。

發(fā)明內(nèi)容
本實用新型的目的在于提供一種用于細胞動作電位檢測及藥物分析測量的單細胞傳感器，能夠?qū)蝹€細胞外動作電位進行定性和定量檢測。
為了達到上述目的，本實用新型采用的技術(shù)方案如下在鋁板上固定敷銅板，敷銅板上粘附具有SiO2層的打磨的Si片，聚二甲基硅氧烷作的微型測量腔固定在SiO2層上，微型測量腔上覆蓋一層生物兼容性膠，與下表面鍍金膜參考電極的光學玻璃粘接，玻璃上兩個開口處分別接通藥物和培養(yǎng)液的進液乳膠管和出液乳膠管，敷銅板上引出工作電極，對電極與金膜參考電極相連。
所說的微型測量腔為1～2個。
本實用新型具有的優(yōu)點是該單細胞傳感器提高了精度和穩(wěn)定度，細胞貼附生長狀況良好，將測量定位于單個細胞，可以準確測量藥物刺激下，單細胞的胞外動作電位變化。本實用新型改善了光源設(shè)計，提高了精度和穩(wěn)定度，可以將測量定位于單個細胞甚至單個離子通道，從而將精確測量藥物對單個細胞的作用及作用靶點。這種單細胞傳感器，可以實現(xiàn)神經(jīng)細胞外動作電位的快速、實時監(jiān)測，定性分析不同濃度不同藥物對細胞的興奮和抑制作用，主要應(yīng)用于藥物篩選、分析和評價。
以下結(jié)合附圖和實施例對本實用新型作進一步的說明。


圖1是單細胞傳感器沿圖2的I-I方向剖面結(jié)構(gòu)圖；圖2是單細胞傳感器俯視圖；圖3是采用涂敷法提高器件的靈敏度；圖4是單細胞傳感器檢測實例系統(tǒng)示意圖；圖5是n型硅襯底LAPS的特性曲線示意圖；圖6是無藥物刺激時，單細胞傳感器的基線；圖7是低濃度乙酰膽堿刺激時單細胞傳感器的響應(yīng)；圖8是中濃度乙酰膽堿刺激時單細胞傳感器的響應(yīng)；圖9是高濃度乙酰膽堿刺激時單細胞傳感器的響應(yīng)。
圖中，1.鋁板，2.敷銅板，3.光可尋址電位傳感器，3.1.打磨薄后的Si片，3.2。SiO2層，4.光學玻璃，5.金膜參考電極，6.紅光激光器，7.聚二甲基硅氧烷微型腔，8.生物兼容性膠，9.多聚鳥胺酸與層粘素層，10.工作電極，11.對電極，12.進液乳膠管，13.出液乳膠管。
具體實施方式
1、傳感器的檢測結(jié)構(gòu)如圖1、圖2所示，本實用新型在鋁板1上固定敷銅板2，敷銅板2上粘附具有SiO2層3.2的打磨薄的Si片3.1，聚二甲基硅氧烷作的微型測量腔7固定在SiO2層3.2上，聚二甲基硅氧烷微型測量腔7上覆蓋一層生物兼容性膠8，與下表面鍍金膜參考電極5的光學玻璃4粘接，微型測量腔7內(nèi)涂敷一層多聚鳥胺酸與層粘素層9，玻璃上兩個開口處分別接通藥物和培養(yǎng)液的進液乳膠管12和出液乳膠管13，敷銅板上引出工作電極10，對電極11與金膜參考電極5相連。測量時，微型測量腔上面粘光學玻璃為上蓋，形成密封測量腔。紅光激光器6選擇照射某一細胞正上方，進液乳膠管與蠕動泵連接，通過泵的通斷控制藥物刺激，工作電極、參考電極、對電極與恒電位/電流儀相連，恒電位/電流儀通過鎖相放大器與數(shù)字補償電路相連，接入計算機，與計算機實現(xiàn)雙向通訊，控制溫度并實現(xiàn)數(shù)據(jù)采集處理，計算機與數(shù)字/模擬轉(zhuǎn)換器相連，控制蠕動泵通斷，檢測系統(tǒng)框圖如圖4所示。
2、傳感器的制備(1)光尋址電位傳感器的制備選用<100>n型單晶硅片作為LAPS的襯底。硅片經(jīng)拋光清洗后，放入1000℃高溫爐中進行熱氧化20分鐘，使硅片正面生長一層厚度約為30nm的SiO2薄膜，利用打磨技術(shù)從背面將硅片的厚度打磨至100μm，然后用導電膠將硅片粘在敷銅板上，160℃高溫固化2小時，通過歐姆從敷銅板上接觸引出工作電極。
(2)硅器件表面處理本實用新型設(shè)計了兩種細胞固定的方案一，涂敷法，即在芯片表面做增強貼附性的涂層；二，通過改變芯片表面的粗糙度，做誘導細胞生長的圖形。
涂敷法過程如下將100μg/ml多聚鳥氨酸的磷酸鹽緩沖液和8μg/ml層粘素的磷酸鹽緩沖液按1∶1混合，用0.22μm的微孔濾膜濾菌，將器件浸入該混合溶液(PLOL)中，37℃，5％CO2環(huán)境下，浸泡24小時，再用雙蒸水沖洗兩次，冷凍備用。實驗結(jié)果證明做了表面處理后的單細胞傳感器，斜率明顯增大，因此器件敏感性提高，從而提高了測量的靈敏度，如圖3所示，而且，細胞形態(tài)正常，突觸明顯，生長情況良好。
改變芯片表面的粗糙度的過程如下用光刻技術(shù)在LAPS表面做2×2mm2的微腔圖形，改變硅片的表面粗糙度，然后再進行涂層的處理。
(3)參考電極制備熱丙酮清洗增透光學玻璃，80℃烘干。在玻璃表面，用坐標紙做掩模，采用磁控濺射技術(shù)在玻璃表面按掩模形狀鍍金，用導電膠將導線與金膜粘接，引出參考電極。
(4)微型測量腔設(shè)計用聚二甲基硅氧烷制備一0.2×5×5cm3的薄膜結(jié)構(gòu)，用模具在上刻出與參考金電極類似的兩個測量腔，腔的尺寸為0.2×1.4×0.5cm3。用生物兼容性膠將此結(jié)構(gòu)粘著于LAPS傳感器表面，在此腔中培養(yǎng)細胞，測量時，上面粘光學玻璃為上蓋，形成密封測量腔。
傳感器的原理由于要測量的是細胞外液體環(huán)境的生理參數(shù)，所以采用的是具有EIS結(jié)構(gòu)的LAPS系統(tǒng)。它的基本原理是半導體的內(nèi)光電效應(yīng)，即當半導體受到一定波長的光照射時，半導體吸收光子，發(fā)生禁帶到導帶的躍遷，即產(chǎn)生電子空穴對。在一般情況下，電子空穴對很快復合，在外電路中是測不到電流的。如果，給LAPS外加反向偏置電壓時(n型硅加負壓，P型硅加正壓)，半導體中產(chǎn)生耗盡層，這時靠近耗盡層的電子空穴對就被耗盡層拉開。當固定光強時，就會產(chǎn)生光電壓，LAPS采用強度調(diào)制的光照射在器件的正面或背面，就可以在外電路中測量到電流。電流的大小，與光強、耗盡層的厚度(即外偏壓)等有關(guān)。
如圖5所示是n型硅襯底光尋址電位傳感器的特性曲線示意圖，該曲線可以分為截止區(qū)、過渡區(qū)(工作區(qū))和飽和區(qū)，這是由硅的特性決定的。特性曲線沿偏壓軸的平移就是膜響應(yīng)值，特性曲線決定了偏壓的選擇點、LAPS靈敏度、膜響應(yīng)與測量值的對應(yīng)關(guān)系等。
單細胞傳感器檢測細胞動作電位實施例選擇了1∶10000、1∶100000、1∶1000000(g/ml)三種濃度的乙酰膽堿(Ach)作為神經(jīng)元的刺激藥物，實驗結(jié)果表明，乙酰膽堿對于大腦皮層的神經(jīng)元是興奮作用。
如圖6所示，為未加任何藥物刺激時，細胞傳感器測得的信號，是信號分析的基線，圖中可以看出，有很小不規(guī)則的擾動，主要是由于測量系統(tǒng)同軸纜線未能起到很好的屏蔽作用以及環(huán)境的微小震動所引起的。如圖7所示，是在1∶1000000低濃度Ach作用下，細胞傳感器的響應(yīng)，圖中曲線與基線相似，幾乎沒有變化，說明在該濃度下，Ach還未能引起細胞產(chǎn)生動作電位。如圖8所示，是在1∶100000中濃度Ach作用下，細胞傳感器的響應(yīng)，由此圖可以看出，胞外的電位頻度和幅度都發(fā)生變化，檢測到有一頻率約為1Hz幅度約為1.8mV的電信號，初步判定為細胞的動作電位。如圖9所示，是在1∶10000高濃度Ach作用下，細胞傳感器的響應(yīng)，該信號頻度和幅度都有很大的變化。
該結(jié)果說明，當Ach溶液在一定濃度范圍內(nèi)變化，會引起細胞的胞外電位的改變，單細胞傳感器可以檢測到電信號頻度和幅度變化，而且，隨Ach濃度增加，電位的幅度增大。
權(quán)利要求1.一種用于細胞胞外動作電位測量的單細胞傳感器，其特征在于在鋁板(1)上固定敷銅板(2)，敷銅板(2)上粘附具有SiO2層(3.2)的打磨的Si片(3.1)，聚二甲基硅氧烷作的微型測量腔(7)固定在SiO2層(3.2)上，微型測量腔(7)上覆蓋一層生物兼容性膠(8)，與下表面鍍金膜參考電極(5)的光學玻璃(4)粘接，玻璃上兩個開口處分別接通藥物和培養(yǎng)液的進液乳膠管(12)和出液乳膠管(13)，敷銅板上引出工作電極(10)，對電極(11)與金膜參考電極(5)相連。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于細胞胞外動作電位測量的單細胞傳感器，其特征在于所說的微型測量腔(7)為1～2個。
專利摘要本實用新型公開了一種用于細胞胞外動作電位測量的單細胞傳感器。在早期多光源細胞微生理計的基礎(chǔ)上，利用光尋址電位傳感器(LAPS)技術(shù)，克服傳感器幾何特性對細胞培養(yǎng)的限制，采用光源移動尋址，對隨機培養(yǎng)的單個細胞跟蹤定位測量。本實用新型配套改進的光源系統(tǒng)，提高了精度和穩(wěn)定度，可以將測量定位于單個細胞甚至單個離子通道，從而將精確測量藥物對單個細胞的作用及作用靶點。這種單細胞傳感器，可以實現(xiàn)神經(jīng)細胞外動作電位的快速、實時監(jiān)測，定性分析不同濃度不同藥物對細胞的興奮和抑制作用，主要應(yīng)用于藥物篩選、分析和評價。
文檔編號G01N27/26GK2709979SQ20032012296
公開日2005年7月13日 申請日期2003年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月25日
發(fā)明者王平, 許改霞, 秦利鋒, 徐瑩 申請人:浙江大學