專利名稱：用質(zhì)譜法高靈敏度定量肽的制作方法
發(fā)明技術(shù)領(lǐng)域及背景本發(fā)明涉及用于對(duì)如人血漿等的復(fù)雜樣品中的蛋白進(jìn)行評(píng)價(jià)的定量分析。本發(fā)明可用于分析來(lái)自單一個(gè)體來(lái)源的樣品，也可用于評(píng)價(jià)群體中特定蛋白質(zhì)的水平，并可用于分析來(lái)自目標(biāo)人群的集合樣品。
需要對(duì)各種復(fù)雜蛋白質(zhì)樣品中(例如人血漿中)的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析。通常，這些分析以免疫試驗(yàn)的方式進(jìn)行，利用了相對(duì)于靶蛋白的特定抗體作為特異性試劑和檢測(cè)試劑。新的方法，特別是涉及用同位素標(biāo)記的肽進(jìn)行內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)化的方法，使得質(zhì)譜法(MS)提供了這樣的定量肽和蛋白質(zhì)的分析(如現(xiàn)在MS用于測(cè)定低分子量藥物代謝產(chǎn)物)。然而，當(dāng)應(yīng)用于非常復(fù)雜的混合物時(shí)，如那些自全血漿蛋白消化到肽的的復(fù)雜混合物時(shí)，存在著MS動(dòng)態(tài)范圍和試驗(yàn)敏感性的問(wèn)題。本發(fā)明通過(guò)以下方式處理了這一問(wèn)題提供對(duì)敏感性的改進(jìn)，及有效平衡了含有高量及低量蛋白質(zhì)樣品的消化液中監(jiān)控肽的豐度，從而使得可同時(shí)測(cè)定復(fù)雜樣品中的低量和高量蛋白。
能幫助擴(kuò)增診斷學(xué)上有用的蛋白質(zhì)組的一個(gè)重要的進(jìn)展是同時(shí)將許多蛋白測(cè)定一起用作一個(gè)組，以便于將模式的改變與疾病或治療關(guān)聯(lián)，而不是依賴于單獨(dú)解釋的單個(gè)蛋白標(biāo)記物。幾種科研工作對(duì)該方法提供了數(shù)據(jù)支持。(參見(jiàn)Jellum、Bjornson、Nesbakken、Johansson和Wold，J Chromatogr 217231-7，1981。)人們努力使用后一種方法在后標(biāo)準(zhǔn)化20種分析物的血清化學(xué)組中檢測(cè)疾病標(biāo)志物，但可能是由于該分析物的間接特性及其較少的數(shù)量，該努力收效甚微。
一段時(shí)間以來(lái)已建立了多變的蛋白質(zhì)標(biāo)記物的概念和使用方法。需要說(shuō)明的是為什么該方法未曾有效進(jìn)入到臨床實(shí)踐中去。
雖然蛋白質(zhì)組學(xué)可顯示并有時(shí)測(cè)定許多種蛋白質(zhì)，現(xiàn)有技術(shù)(例如2D凝膠)已難于應(yīng)用于大量足夠大的樣品來(lái)在研究水平上證明臨床相關(guān)性。使用現(xiàn)有測(cè)驗(yàn)的另一方法對(duì)于確定檢測(cè)組的疾病相關(guān)性通常太昂貴。在血漿的單個(gè)樣品中全部可測(cè)得七十種蛋白，但使用單個(gè)試驗(yàn)的商業(yè)成本是$10896.30。這樣最終，多分析物診斷的成功與科學(xué)工作的成本相同。
質(zhì)譜法(MS)已解決了通過(guò)2D凝膠和其他方法溶解析的蛋白的鑒別問(wèn)題，并也為復(fù)雜蛋白混合物的分析提供了顯得穩(wěn)定的通用方法。在以后的分類中，可區(qū)別兩種通常的方法第一，對(duì)樣品中的蛋白質(zhì)和肽經(jīng)其檢測(cè)或識(shí)別而獲得“無(wú)偏見(jiàn)的”發(fā)現(xiàn)，及第二，對(duì)蛋白質(zhì)或肽進(jìn)行定量測(cè)定，通常需要某種額外的標(biāo)準(zhǔn)化物。
質(zhì)譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)復(fù)雜樣品中蛋白質(zhì)的能力依賴于存在通常源于DNA測(cè)序工作的大的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)，除了下述一種值得注意的例外。由于這些數(shù)據(jù)庫(kù)越來(lái)越全面，至少在理論上該方法為蛋白質(zhì)發(fā)現(xiàn)提供了一種通常的解決方案。到目前為止，MS工作已為蛋白質(zhì)組問(wèn)題審查了三種基本的窗口(window)全蛋白質(zhì)、通過(guò)體外消化蛋白(例如，用胰蛋白酶)獲得的肽片段、及天然存在的肽(低分子量蛋白組或肽組)。
可用稱為SELDI-TOF(為表面強(qiáng)化的激光解吸電離飛行時(shí)間)質(zhì)譜的方法分析全蛋白質(zhì)，該質(zhì)譜法是MALDI-TOF(基質(zhì)強(qiáng)化的激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜)的變體，在該方法中用基于對(duì)派生的MS靶的蛋白質(zhì)親和力的化學(xué)分級(jí)來(lái)將樣品的復(fù)雜性降低至全蛋白MS可解析一系列單個(gè)峰的水平。該方法的嚴(yán)重缺點(diǎn)在于全蛋白MS分析不直接提供基于序列的識(shí)別(有許多蛋白質(zhì)接近給定的質(zhì)量)，因此沒(méi)有其他有效的工作，嚴(yán)格意義上說(shuō)未識(shí)別作為標(biāo)志發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)峰。尤其是，沒(méi)有離散的識(shí)別，一般不可能說(shuō)明一種峰是一個(gè)蛋白質(zhì)分析物或?qū)y(cè)定值轉(zhuǎn)換為典型的免疫分析形式。然而，由于這已通過(guò)基于某些單克隆抗體的成功分析(其中靶蛋白質(zhì)未識(shí)別)清楚顯示，如果該技術(shù)允許該分析在任何目標(biāo)實(shí)驗(yàn)室中重復(fù)(現(xiàn)在顯示正在進(jìn)行的工作)，此點(diǎn)不對(duì)臨床使用造成重大限制。
更通用的方法包括將蛋白質(zhì)消化(例如用胰蛋白酶)為可進(jìn)一步在質(zhì)譜儀中斷裂(MS/MS)的肽，從而產(chǎn)生基于序列的識(shí)別。該方法可與電噴霧(ESI)或MALDI電離一同使用，并通常在一維或多維色譜分級(jí)后應(yīng)用該方法從而在任意給定的瞬間降低導(dǎo)入MS中的肽的復(fù)雜性。多維色譜、離子化、質(zhì)譜及數(shù)據(jù)分析的優(yōu)化系統(tǒng)(例如，多維蛋白質(zhì)識(shí)別技術(shù)，或Yates的“MudPIT”方法也稱為獵槍蛋白質(zhì)組學(xué))已顯示在一次分析中可檢測(cè)并識(shí)別～1500個(gè)酵母蛋白(Washburn、Wolters和Yates，Nat Biotechnol 19242-7，2001)，而結(jié)合傅里葉變換離子回旋加速器共振(FTICR)MS極高分辨率的一維LC分離可識(shí)別細(xì)菌中多于1900種的不同開(kāi)放閱讀框(即，預(yù)測(cè)的蛋白)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。在人的尿液中，一種比上述微生物樣品更像血漿的樣品，Patterson在ESI-MS/MS之前使用一維LC分離來(lái)檢測(cè)源于124種不同基因產(chǎn)物的751種序列。最近，Adkins等人已使用結(jié)合MS的兩種色譜分離法來(lái)識(shí)別人血清中的總共490種不同的蛋白質(zhì)(Adkins等人，Molec CellProteomics 1947-955(22002))，因而實(shí)質(zhì)擴(kuò)增了該蛋白質(zhì)組。這樣的方法應(yīng)具有能力來(lái)處理血漿中的許多蛋白的大量轉(zhuǎn)譯后修飾特性，如能顯示表征在老化的人晶狀體中發(fā)生的非常復(fù)雜的轉(zhuǎn)譯后修飾所說(shuō)明的。
通常在腎過(guò)濾截點(diǎn)之下并因而通常收集于尿液或血透析液的天然肽，提供了在血漿蛋白質(zhì)組低質(zhì)量端的許多情況的補(bǔ)充寫照。可從患有晚期腎病并進(jìn)行透析治療的患者中收集上千升人血透析液(Schepky、Bensch、Schulz-Knappe和Forssmann，Biomed Chromatogr 890-4，1994)，盡管它只含有50μg/ml蛋白質(zhì)/肽材料，它提供了低于45kd的蛋白質(zhì)和肽的大量來(lái)源。通過(guò)將色譜和MS方法結(jié)合已分析了這樣的材料，從而分辨了大約5000種不同的肽，包括75種不同蛋白質(zhì)的片段。55％的片段源自血漿蛋白和整體的7％代表肽激素、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞生長(zhǎng)因子。
上述蛋白質(zhì)發(fā)現(xiàn)方法集中于識(shí)別復(fù)雜樣品中的肽和蛋白質(zhì)，但它們一般都顯示了低質(zhì)量的精確度和再現(xiàn)性。肽離子化的這種公知特異性質(zhì)很大一部分是由于一種肽的存在可影響離子化并由此影響其他的信號(hào)強(qiáng)度的強(qiáng)度。這已成為用質(zhì)譜法進(jìn)行精確定量的主要障礙。然而，通過(guò)使用穩(wěn)定的同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)物可克服該問(wèn)題。以適當(dāng)高濃縮的形式(＞98原子％)在商業(yè)上至少可獲得四種適合的同位素(2H、13C、15N、18O)。通常，最終應(yīng)獲得如同用內(nèi)標(biāo)物在藥物代謝物MS測(cè)定中所獲得的豐度同樣精確的豐度數(shù)據(jù)(變異系數(shù)＜1％)。在二十世紀(jì)八十年代，制備18O標(biāo)記的腦啡肽并用于ppb水平上測(cè)定組織中的這些肽。在二十世紀(jì)九十年代，開(kāi)發(fā)了GC/MS方法來(lái)準(zhǔn)確定量穩(wěn)定的同位素標(biāo)記的氨基酸，以及由此的體內(nèi)標(biāo)記的人肌肉及血漿的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)代謝。如果有適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)或肽標(biāo)記方案，這些方法的極度敏感和準(zhǔn)確性表明穩(wěn)定的同位素方法可用于定量的蛋白組學(xué)研究。
在過(guò)去的三年，已研究了許多這樣的標(biāo)記策略。最直接的方法(在生物合成過(guò)程中，標(biāo)記的結(jié)合達(dá)到了高取代水平)已成功應(yīng)用于微生物(Lahm和Langen，Electrophoresis 212105-14，2000；Oda，Huang，Cross，Cowburn和Chait，Proc Natl Acad Sci USA 966591-6，1999)和培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，但由于成本和倫理道德的原因不可能直接用于人類。一種相關(guān)的方法(可應(yīng)用于人蛋白質(zhì))是現(xiàn)在通用的化學(xué)合成在特定位置含有重同位素的監(jiān)測(cè)肽。也已研制了合成后的方法來(lái)標(biāo)記肽，從而用后來(lái)混合并通過(guò)MS一起分析的標(biāo)記/未標(biāo)記對(duì)來(lái)區(qū)分源于“內(nèi)部對(duì)照”樣品的肽與那些源于試驗(yàn)樣品的肽。這些方法包括Aebersold的同位素親和標(biāo)簽(ICAT)方法及用氘化丙烯酰胺和N標(biāo)記肽硫氫化物、用氘化乙酸標(biāo)記伯氨基、n端特異性試劑、肽羧基的全甲基化酯化及斷裂過(guò)程中在胰蛋白酶處理的肽c端加入一對(duì)18O標(biāo)記物。
因?yàn)橥ㄟ^(guò)測(cè)定釋放進(jìn)入血漿中的高豐度組織蛋白可在少量組織中檢測(cè)嚴(yán)重病理，所以少量蛋白質(zhì)，如組織泄漏蛋白，是重要的。正常個(gè)體血漿中存在的心臟肌球素(Mb)為1-85ng/ml，而心肌梗塞卻使之提高到200-1100ng/ml，而用溶血纖維蛋白治療梗塞卻使之上升至3000ng/ml。一般局部作用(在感染或發(fā)炎部位)的細(xì)胞因子可能在它們正常的血漿濃度(或甚至相關(guān)于大量局部釋放后達(dá)到較高的水平)無(wú)活性，因?yàn)樗鼈儚摩蘬或ml組織體積稀釋為17L組織間隙液。因此，雖然它們?cè)谘獫{中存在并不顯示細(xì)胞破裂，但它們也在感測(cè)泄漏的標(biāo)志物之列。用于進(jìn)行這種測(cè)定的商業(yè)上有用的方法是本發(fā)明的目的。
將穩(wěn)定的同位素標(biāo)記的肽內(nèi)標(biāo)物結(jié)合抗肽抗體富集步驟從而進(jìn)行基于MS定量肽分析的這種原始思想于1989年由Jardine等人發(fā)表(Lisek、Bailey、Benson、Yaksh和Jardine，Rapid Commun MassSpectrom 343-6，1989)。該參考文件披露了使用單一合成的穩(wěn)定的同位素標(biāo)記的肽(物質(zhì)P序列)插入神經(jīng)組織，然后(在從組織中提取后)結(jié)合到固定化抗物質(zhì)P特異性抗體上，從而富集神經(jīng)肽物質(zhì)P并最終用MS定量。通過(guò)天然肽離子流與同樣序列的內(nèi)部標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)肽之比計(jì)算底物P的量即，顯示單一分析物肽標(biāo)準(zhǔn)/抗體富集過(guò)程的全部元素。Jardine等人使用了10倍分子過(guò)量的標(biāo)記形式的物質(zhì)P作為內(nèi)標(biāo)和載體，并用快原子轟擊(FAB)選擇的離子監(jiān)測(cè)(SIM)MS測(cè)定質(zhì)量。如所報(bào)道的，Jardine的方法僅用于內(nèi)源肽而不用于體外所制備的蛋白質(zhì)片段(例如，一種或多種較大蛋白質(zhì)的胰蛋白酶消化產(chǎn)物)。離線進(jìn)行抗體捕獲，濃縮洗脫液，然后加到C18毛細(xì)管柱上，從該毛細(xì)管柱將其洗脫到ESI源。
Nelson等人(Intrinsic Bioprobes公司)雖然沒(méi)有提到應(yīng)用于來(lái)自靶蛋白消化的肽，但他們已開(kāi)發(fā)了相似的方法，通過(guò)使用抗體來(lái)富集特定蛋白，然后用MS進(jìn)行檢測(cè)(用或不用外加的同位素標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn))。他們用抗體從血漿中富集蛋白，并用馬b2M(來(lái)自加入的馬血清)作為內(nèi)標(biāo)物從而分析了人β-2小球蛋白(Kiernan、Tubbs、Nedelkov、Niederkofler和Nelson，Biochem Biophys Res.Commun 297401，2002；Niederkofler、Tubbs、Gruber、Nedelkov、Kiernan、Williams和Nelson，Anal.Chem.733294-9，2001a)。Nelson(美國(guó)專利5955729)已用內(nèi)標(biāo)肽加入到親和純化的天然肽樣品中，但在這種情況下，標(biāo)準(zhǔn)肽具有與分析物不同的序列并且不結(jié)合在同一抗體上。穩(wěn)定的同位素標(biāo)記肽和抗肽抗體現(xiàn)在都是常用的試劑，可從多種商業(yè)來(lái)源獲得。
自1995年以來(lái)，單一肽已用作復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物中母體蛋白(通過(guò)蛋白水解消化作用該肽來(lái)自該蛋白)存在的代表，基于例如MALDI-PSD(Griffin、MacCoss、Eng、Blevins、Aaronson及Yates，Rapid CommunMass Spectrom 91546-51，1995)或離子陷阱(Yates、Eng、McCormack和Schieltz，Anal Chem.671426-36，1995)，MS/MS譜。
Regnier等人已從事“鮮明特征肽”定量方法(Chakraborty和Regnier，J.Chromatogr A949173-84，2002a；Chakraborty和Regnier，J.Chromatogr A.949173-84，2002a；Zhang、Sioma、Wang和Regnier，Anal.Chem.735142-9，2001a)，及已公開(kāi)的專利申請(qǐng)的主題(Regnier，F(xiàn).E.、X.Zhang等人，US2002/0037532)，其中蛋白質(zhì)樣品由酶消化為肽，用蛋白質(zhì)活性試劑的不同同位素形式進(jìn)行差異標(biāo)記，通過(guò)選擇性富集柱進(jìn)行純化，并使用MALDI或ESI-MS結(jié)合進(jìn)行MS分析。該方法包括了本發(fā)明的一些特征，但特別選擇使用了消化物中肽的合成后標(biāo)記來(lái)產(chǎn)生內(nèi)標(biāo)(使得未知肽可進(jìn)行分析)，并且描述了應(yīng)用抗體作為富集特異性特征組肽而不是單一肽的一種方式“限定為抗原的蛋白質(zhì)或肽氨基酸序列部分也可作為內(nèi)生親和配體，如果該內(nèi)生氨基酸序列為原始混合物中的多于一種蛋白質(zhì)所共有，該配體特別有用。在那種情況下，為含有內(nèi)生抗原序列的多肽的家族選擇的多克隆抗體或單克隆抗體可用作為捕獲物質(zhì)”(Regnier、F.E.、X.Zhang等人，US2002/0037532)。
Scrivener、Barry等人(Scrivener、Barry、Platt、Calvert、Masih、Hextall、Soloviev和Terrett，Proteomics 3122-128，2003；Barry等人，美國(guó)專利申請(qǐng)2002/0055186)已用固定于陣列的抗體從消化物中富集肽來(lái)通過(guò)MALDI MS進(jìn)行檢測(cè)。該方法需要將抗體以特定的空間形式固定以便于進(jìn)行MALDI MS分析(通常是在平面基質(zhì)表面上的陣列)，并且該方法不包括靶肽的標(biāo)記型式作為定量分析內(nèi)標(biāo)。
Gygi使用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的合成的肽來(lái)定量在1-D凝膠上分離的蛋白質(zhì)消化物中的磷酸化與非磷酸化肽的水平(Stemmann、Zou、Gerber、Gygi和Kirschner，Cell 107715-26，2001)，并且已描述了用于肽定量的方法(WO03016861)，該方法使用Jardine途徑并外加更高的質(zhì)譜分辨率(選擇的反應(yīng)監(jiān)測(cè)方法[SRM]，其中通過(guò)第一質(zhì)量分析儀分離所需的肽，肽在飛行中斷裂并且用第二質(zhì)量分析儀檢測(cè)特定的片段)。在MS之前，用通常的分離法(例如，反向LC)而不是特異性的捕獲試劑(如抗體)來(lái)分離肽。
通過(guò)化學(xué)合成可制成標(biāo)準(zhǔn)品。Crowther在1994年公開(kāi)了一種類似的方法(Anal.Chem.662356-61，1994)使用氘化的合成內(nèi)標(biāo)來(lái)檢測(cè)血漿中的肽藥物。Rose使用合成的穩(wěn)定同位素標(biāo)記的胰島素來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化MS法而用于定量胰島素(小蛋白或大肽)，在該過(guò)程中通過(guò)反相色譜來(lái)分離受阻的樣品從而使樣品分級(jí)?，F(xiàn)在通過(guò)完全化學(xué)合成法可制成甚至較大的蛋白。
用抗體來(lái)親和捕獲蛋白質(zhì)和肽的幾種方式是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。已將抗體結(jié)合蛋白消化從而消除非抗原決定簇肽，然后用MS法洗脫并識(shí)別抗原決定簇肽(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 879848-52，1990)。已使用DNA(而不是Ab)結(jié)合嬰兒尿中的乳鐵蛋白用于進(jìn)行MS分析(Pediatr.Res.29243-50，1991)。
以前用捕獲在抗體上的抗原決定簇肽及隨后的MS法已對(duì)蛋白質(zhì)間的相互作用繪制了圖譜(Methods Mol.Biol.146439-52，2000)。已開(kāi)發(fā)了方法通過(guò)在進(jìn)行MS前使固定化Ab從消化液中除去結(jié)合(抗原決定簇)肽用于識(shí)別肽抗原決定簇(J.Am.Soc.Mass Spectrom 11746-50，2000)。
已使用在磁珠上的抗體來(lái)結(jié)合所選擇的蛋白質(zhì)，然后消化該蛋白質(zhì)并用MS分析肽(J.Am.Soc.Mass Spectrom 9208-15，1998)。Hurst研制了一種用固相抗體親和捕獲蛋白質(zhì)配體(αTNF)然后用MS進(jìn)行分析的方法(Anal.Chem.714727-33，1999)。Wehland通過(guò)結(jié)合抗體和其他蛋白質(zhì)來(lái)濃縮肽，從而識(shí)別線性結(jié)合的抗原決定簇(Anal.Biochem.275162-70，1999)。
Naylor研究了一種類似的方法用于在MS前分離轉(zhuǎn)鐵蛋白從而測(cè)定糖基化變體(Anal.Biochem.296122-9，2001)。Clarke和Naylor公開(kāi)了(Clarke、Crow、Younkin和Naylor，Anal.Biochem.29832-9，2001)一種方法，其中通過(guò)抗體將40個(gè)氨基酸的β淀粉樣肽捕獲到16個(gè)氨基酸上，吸脫并用MS進(jìn)行定量分析。該方法不包括使用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)物。
Thibault在進(jìn)行MS前使用微液流裝置來(lái)將c-myc肽捕捉在抗體上，檢測(cè)受阻肽達(dá)到20ng/ml(Mol.Cell Proteomics 1157-68，2002)。
自1975年起使用固定化多克隆抗體柱的再循環(huán)免疫親和就已知。使用固定在CNBr活化的瓊脂糖或商業(yè)可獲得的POROS支持物(AppliedBiosystems公司)上的抗體、多克隆抗體已顯示可再循環(huán)幾百次而不會(huì)喪失底物特異性結(jié)合能力。
本發(fā)明將幾種現(xiàn)有技術(shù)所引的方法用于一個(gè)完全不同的組合中。在后面的說(shuō)明中，本發(fā)明針對(duì)通常意義上的蛋白質(zhì)、肽或其他生物分子的定量，因此所披露的本發(fā)明決不限于血清和其他體液的分析。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種經(jīng)濟(jì)的流通型方法來(lái)檢測(cè)靶蛋白在樣品中的量。用抗體制劑(不論是多克隆或是單克隆，或其他等價(jià)的特定結(jié)合劑)來(lái)進(jìn)行捕獲從而富集特定的監(jiān)測(cè)肽(在復(fù)雜蛋白質(zhì)樣品的水解蛋白消化物中要進(jìn)行定量的蛋白質(zhì)的一種特定肽片段)和內(nèi)標(biāo)肽(同樣的化學(xué)結(jié)構(gòu)但包括穩(wěn)定的同位素標(biāo)記物)。當(dāng)吸脫入適宜的質(zhì)譜儀中時(shí)，對(duì)天然(來(lái)源于樣品)和內(nèi)標(biāo)(同位素標(biāo)記)肽進(jìn)行定量，并且對(duì)它們所測(cè)得的豐度比例用于計(jì)算監(jiān)控肽和其母體蛋白在起始樣品中的量。這不同于使用較小特異性的親和方法來(lái)捕獲共有某特性(如糖基化、含有半胱氨酸或賴氨酸殘基、磷酸化)的一類監(jiān)測(cè)肽；也不同于使用選擇存在于特定細(xì)胞部分中的、具有相似的天然分子量(例如大小排阻層析)、電荷等等的分析物的另一種分級(jí)形式。這種特異性種類分級(jí)方法已由包括Regnier的其他人開(kāi)發(fā)，其目的和實(shí)踐將稍減小提供給MS的混合物的復(fù)雜度，因而使得不超出其分辨率和敏感度，而不是對(duì)于每種親和結(jié)合劑(通常是抗體)的單一肽。在本發(fā)明中，目的是用給定的抗體或其他結(jié)合劑選擇源自復(fù)雜蛋白樣品消化物的單個(gè)靶蛋白(或其他分析物)的單一肽。本發(fā)明提供了進(jìn)行多路肽測(cè)定的方法，用于有效選擇監(jiān)測(cè)肽的序列，并進(jìn)而增加測(cè)定的有效性。
本發(fā)明的公開(kāi)也教導(dǎo)了具有結(jié)合劑的支持物，該結(jié)合劑可自樣品收集各種濃度的靶肽和蛋白質(zhì)。通過(guò)選擇性使用結(jié)合劑和一定數(shù)量的這樣的試劑，可能獲得樣品中很少量的靶肽/蛋白質(zhì)的大部分，而僅僅結(jié)合了一小部分以高濃度存在于樣品中的靶肽/蛋白質(zhì)。這種改進(jìn)的方法通過(guò)限制導(dǎo)入分光計(jì)的洗脫液中的靶蛋白或肽的濃度范圍促進(jìn)了MS讀數(shù)的有效性和準(zhǔn)確性。
附圖簡(jiǎn)述

圖1.每個(gè)抗體結(jié)合表面包括盤(此處為圓盤)中孔的內(nèi)腔，通過(guò)刻凹槽使內(nèi)腔表面積增大。圖1說(shuō)明了在含抗體的孔或管中作出凹槽以增加表面積。
圖2顯示了盤8中孔內(nèi)結(jié)合表面的設(shè)置，該盤含有齒緣9使其受控旋轉(zhuǎn)。顯示了16個(gè)含抗體的孔10，4個(gè)空孔11，繞軸12排列。
圖3顯示了一組盤8如何排列為堆疊17，其具有空的對(duì)齊的端帽16和18。所結(jié)合的抗體示為19。
圖4.圖4顯示了排列并加載盤的設(shè)置，其中用在經(jīng)31計(jì)算機(jī)控制下驅(qū)動(dòng)的裝置30交替擠壓并擴(kuò)張球管28中的抗體溶液29，從而將該液體往復(fù)擠過(guò)管32、33、34，向上通過(guò)管35進(jìn)入球管36中。由于存在孔38，擠過(guò)37的溶液未在球管36中建立起壓力。因而可將抗體施加到一系列盤中的每一個(gè)上的單孔中，重復(fù)該過(guò)程將抗體(通常是不同特異性的)施加到其他孔中。對(duì)刻了凹槽的內(nèi)腔表面進(jìn)行化學(xué)修飾以便于結(jié)合抗體。一旦將抗體加入了孔中，可洗滌這些孔并且抗體在適當(dāng)?shù)奈恢酶稍铩Ｈ缓蟛痖_(kāi)堆疊的盤產(chǎn)生一系列相同的載有抗體的肽捕獲盤。
圖5.在使用中，如圖5所示，盤39在空盤41和42之間持為40，含有對(duì)齊的孔。該設(shè)置使盤41和42固定而盤40可通過(guò)使用具有齒緣9的外部裝置轉(zhuǎn)動(dòng)。
圖6.圖6顯示了該系統(tǒng)在一個(gè)分析循環(huán)中的操作，其中具有齒緣64的盤63包括16個(gè)含抗體的孔65和4個(gè)空孔70-73。
圖7顯示了整合的整個(gè)系統(tǒng)，具有結(jié)合到盤分析儀75上的質(zhì)譜儀74，然后通過(guò)76制成并控制供給的盤，全部過(guò)程在計(jì)算機(jī)77的控制下。
圖8描述了在樣品消化液(A)中具有寬范圍濃度的一系列肽分析物的豐度，加入內(nèi)標(biāo)肽，該內(nèi)標(biāo)肽濃度類似于所期望的分析物濃度(B)，在從抗體結(jié)合介質(zhì)捕獲并洗脫后平均這些濃度。
圖9描述了以相似濃度存在的肽分析物的組如何一起進(jìn)行處理以便于節(jié)約使用內(nèi)標(biāo)物。
圖10顯示了如何從組中選擇監(jiān)測(cè)肽組(天然肽為實(shí)條，標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)物為陰影線的條)，這些組在質(zhì)量上不重疊，因而可以分別定量。
圖11描述了以不同濃度使用不同質(zhì)量的多個(gè)內(nèi)標(biāo)肽來(lái)提供用于定量樣品肽分析物的工作曲線。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了一種流通型方法用于識(shí)別并定量樣品中的肽和/或蛋白質(zhì)。雖然將上述披露的許多方法結(jié)合到本發(fā)明的方法中去，但以前未披露過(guò)這樣有商業(yè)化用途的方法。
本發(fā)明通過(guò)使用監(jiān)控蛋白和抗肽抗體來(lái)檢測(cè)蛋白分析物的方法來(lái)進(jìn)行說(shuō)明，雖然其他試劑組可類似地用于檢測(cè)其他種分析物分子。本公開(kāi)自始至終，術(shù)語(yǔ)“分析物”和“配體”可以是任何各種的不同的分子，或人們需要在樣品中測(cè)定或定量的組分、部分、片段或不同分子的區(qū)域。術(shù)語(yǔ)“監(jiān)測(cè)片段”可以指分析物的任何部分，上至并包括全部分析物，該片段可通過(guò)可重復(fù)的斷裂過(guò)程產(chǎn)生(或者如果監(jiān)控片段是整個(gè)分析物則不需要片段化)，該片段的量或濃度可用作分析物量或濃度的代表。術(shù)語(yǔ)“監(jiān)測(cè)肽”是指選作蛋白質(zhì)或肽的監(jiān)測(cè)片段的肽。
術(shù)語(yǔ)“結(jié)合劑”和“受體”可以是大量不同分子、生物細(xì)胞或聚合體中的任何種，這些詞可以互換使用。關(guān)于這一點(diǎn)，結(jié)合劑結(jié)合要檢測(cè)的分析物以便于在檢測(cè)前將其富集，且以特定性的方式進(jìn)行使得只結(jié)合并富集一種分析物。蛋白質(zhì)、多肽、肽、核酸(寡聚核苷酸和多核苷酸)、抗體、配體、多糖、微生物、受體、抗生素、試驗(yàn)化合物(特別是那些通過(guò)組合化學(xué)產(chǎn)生的)，每一種都可以是結(jié)合劑。
術(shù)語(yǔ)“抗體”可以是任何物種的任何類免疫球蛋白分子、或任何其衍生的分子、或任何其他由保守分子構(gòu)架的變異構(gòu)成以便特異性結(jié)合分析物或監(jiān)測(cè)片段的特異性結(jié)合劑。術(shù)語(yǔ)“抗肽抗體”可以是任何種抗體(在前述一般意義上)，該抗體結(jié)合特定的肽、監(jiān)測(cè)肽、或用于從樣品或已處理的樣品進(jìn)行富集的其他監(jiān)測(cè)片段。通常，此處對(duì)抗體的任何利用理解為也可通過(guò)上述限定的結(jié)合劑而實(shí)現(xiàn)的目的。
術(shù)語(yǔ)“結(jié)合”包括任何物理連接或密切關(guān)聯(lián)，其可以是永久的或暫時(shí)的。通常，可逆結(jié)合包括以下方面電荷相互作用、氫鍵、疏水力、范德華力等等，其促進(jìn)目標(biāo)分子和待測(cè)分析物之間進(jìn)行物理連接。在結(jié)合引起化學(xué)反應(yīng)發(fā)生的狀況下，“結(jié)合”反應(yīng)是短暫的。如果反應(yīng)可以隨后返向釋放監(jiān)測(cè)片段，則由結(jié)合劑和分析物之間的接觸引起的反應(yīng)也在用于本發(fā)明目的結(jié)合的定義中。
術(shù)語(yǔ)“內(nèi)標(biāo)物”、“同位素標(biāo)記的監(jiān)測(cè)片段”、或“同位素標(biāo)記的監(jiān)測(cè)肽”可以是任何相應(yīng)監(jiān)測(cè)片段或監(jiān)測(cè)肽的下述變化形式1)作為監(jiān)控片段或監(jiān)測(cè)肽的等價(jià)物被適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合劑進(jìn)行識(shí)別和2)通過(guò)直接分子量檢測(cè)或通過(guò)片段質(zhì)量檢測(cè)(例如，通過(guò)MS/MS分析)，或是通過(guò)其他同等的方式，以某種可通過(guò)質(zhì)譜法區(qū)分的方式與之進(jìn)行區(qū)分。
術(shù)語(yǔ)“特異性監(jiān)測(cè)肽”指在抗體(或其他結(jié)合劑)接觸區(qū)具有獨(dú)特序列的肽，它源自單基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。具有該序列非實(shí)質(zhì)性改變的肽，如單一氨基酸取代(可發(fā)生在自然產(chǎn)生的多態(tài)性中)、接觸區(qū)域外的取代或不會(huì)實(shí)質(zhì)性影響結(jié)合的肽的化學(xué)修飾(包括糖基化、磷酸化和其他已知的翻譯后修飾)，都包括在該術(shù)語(yǔ)中。每一種抗體制劑(或其他結(jié)合劑)用于富集單一的監(jiān)測(cè)肽作為單一蛋白質(zhì)分析物的代表物。為了檢測(cè)并定量測(cè)定蛋白質(zhì)分析物，本發(fā)明使用抗肽抗體(或任何其他可逆結(jié)合大約5-20個(gè)殘基的特異性肽序列的結(jié)合性實(shí)體)來(lái)從肽混合物中捕獲特異性肽，例如從通過(guò)水解蛋白酶(如胰蛋白酶)或化學(xué)試劑(如溴化氫)由蛋白質(zhì)混合物(如人血清)的特異性斷裂產(chǎn)生的肽混合物中。通過(guò)將特異性肽結(jié)合到抗體上(抗體通常連接到固相支持物上)，然后洗滌抗體肽復(fù)合物，最后將結(jié)合的肽洗脫成為小體積(通常通過(guò)酸性溶液，如10％醋酸獲得)，本發(fā)明有可能富集在整個(gè)消化物中以小濃度存在的且因此相對(duì)于存在于混合物中更大量的肽背景而不可用簡(jiǎn)單質(zhì)譜法(MS)或液相色譜-MS(LC-MS)系統(tǒng)檢測(cè)的特異性肽。這種富集步驟用于捕獲高、中或低豐度的肽，并將它們提供給MS進(jìn)行分析因而它舍棄了關(guān)于起始混合物中肽的相對(duì)豐度的信息以便于增加檢測(cè)的敏感性。然而這種在蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域具有很大價(jià)值的豐度信息可以通過(guò)使用同位素稀釋方法而得到再現(xiàn)本發(fā)明用這樣的方法(優(yōu)選使用穩(wěn)定的同位素)結(jié)合特異性肽的富集，從而提供了一種用于定量分析肽的方法，包括分析低豐度肽。
本方法將產(chǎn)生將進(jìn)行測(cè)定的肽的結(jié)合了一或多種質(zhì)量不同于主要的自然同位素的同位素的一種形式，從而形成標(biāo)記的肽變體，該標(biāo)記肽變體與存在于混合物中的天然肽化學(xué)性質(zhì)相同(或近似相同)，但卻由于它變化的肽質(zhì)量(同位素的標(biāo)記)仍可通過(guò)質(zhì)譜儀進(jìn)行區(qū)分。產(chǎn)生標(biāo)記肽的優(yōu)選方法是化學(xué)合成，其中通過(guò)結(jié)合含有氫、碳、氧或氮的重同位素的氨基酸前體引入同位素標(biāo)記物而制成與天然肽相同的肽。該同位素肽變體用作內(nèi)標(biāo)物，在用抗體捕獲進(jìn)行富集之前以一種已知濃度加到樣品肽混合物中。從而抗體根據(jù)它們?cè)跇悠分械南鄬?duì)量一起捕獲并富集天然和標(biāo)記的肽(由于它們的化學(xué)性質(zhì)相同而具有彼此之間無(wú)差異的親和性)。由于標(biāo)記的肽以已知濃度加入，通過(guò)最終MS分析測(cè)得的天然形式和標(biāo)記形式的量之間的比率使得可以計(jì)算在樣品混合物中的天然肽濃度。這樣，本發(fā)明可以測(cè)定復(fù)雜混合物中低豐度肽的量，并且由于肽通常通過(guò)蛋白質(zhì)混合物的定量(完全)斷裂而產(chǎn)生，可以推導(dǎo)出蛋白質(zhì)混合物中的母體蛋白質(zhì)的豐度。本發(fā)明可延伸為包括平行測(cè)定多個(gè)肽，并且通過(guò)計(jì)算機(jī)控制而自動(dòng)化從而為蛋白質(zhì)測(cè)定提供通用系統(tǒng)。因此產(chǎn)生新的特異性蛋白分析僅需要生成肽特異性抗體和標(biāo)記的肽類似物。本發(fā)明的關(guān)鍵特征是本發(fā)明旨在建立對(duì)于先以選擇的特定蛋白的定量分析，而不是解決兩或多種樣品的所有未知成分之間的比較問(wèn)題。這種對(duì)特異性分析的關(guān)注使產(chǎn)生相對(duì)于每個(gè)監(jiān)測(cè)肽的特異性抗體(原則上一個(gè)抗體對(duì)每個(gè)分析結(jié)合一種肽)具有了吸引力現(xiàn)在產(chǎn)生成千上萬(wàn)的可能抗肽抗體是不具有吸引力的，例如，這些抗體需要包括可能的人蛋白質(zhì)的所有范圍。由于此原因，前面所述方法還未集中于抗肽抗體，而卻替代地使用了通常的親和概念，其通過(guò)識(shí)別配體、標(biāo)記物或該類物質(zhì)所共有的特征而結(jié)合并富集所有的這類肽，例如，用固定化的金屬親和層析(IMAC)選擇磷酸肽作為一組、用抗磷酸酪氨酸抗體選擇含抗磷酸酪氨酸肽作為一組、或者用凝集素選擇糖肽作為一組。本發(fā)明的目的是提供特意使用不同抗體(或其他等價(jià)的選擇性結(jié)合劑)富集每一種肽序列的方法。
另一目的是以非常接近的相同豐度并不含其他無(wú)關(guān)肽的方式傳送一系列不同的監(jiān)測(cè)肽(通過(guò)相應(yīng)系列的特異性抗體來(lái)選擇的)到質(zhì)譜儀上。通過(guò)對(duì)一系列肽的豐度進(jìn)行平衡，該方法確保所有的肽都在質(zhì)譜儀動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)并且可將該動(dòng)態(tài)范圍在跨越肽分析物的真實(shí)動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)優(yōu)化使用。如果MS系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)范圍為1000(根據(jù)MS的類型100到10000的范圍是典型的)，該方法確保所有提供給MS的肽在該范圍的中間水平，從而使得最優(yōu)化其檢測(cè)天然和同位素標(biāo)記的形態(tài)相對(duì)豐度增加或減小的能力。如果提供給MS的肽是不同的豐度(例如相對(duì)濃度為1，0.001和1000)，那么MS將很難檢測(cè)這三種肽的天然及同位素標(biāo)記形式之間的等價(jià)的數(shù)量差異。通過(guò)“拉平”肽的豐度分布，充分加強(qiáng)了質(zhì)譜儀定量分析的分辨率。
雖然在選擇最優(yōu)肽來(lái)監(jiān)控每種蛋白質(zhì)的過(guò)程中一些技術(shù)是有用的，但是相對(duì)于產(chǎn)生高親合抗體和進(jìn)行通常夾心型定量免疫分析所需的其他要素所需的大量成本，本方法通用并且不昂貴。它可與低容量免疫分析技術(shù)競(jìng)爭(zhēng)，作為一種測(cè)定混合物(如人血清或血漿)中十到上百種特異性蛋白質(zhì)的手段。
優(yōu)選的實(shí)施例結(jié)合1)已有的用于產(chǎn)生及親和純化抗體的方法，該抗體緊密但可逆地結(jié)合短肽序列；2)用于將復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物消化產(chǎn)生短肽的已有方法；3)用于合成含同位素標(biāo)記的限定肽的已有方法；4)用于有效循環(huán)親和色譜而重復(fù)捕獲及傳遞肽的已有方法；和5)用于Ms測(cè)定標(biāo)記和未標(biāo)記(源自樣品的)肽的比率的已有方法，來(lái)產(chǎn)生定量測(cè)定。此處，用血漿蛋白質(zhì)作為示例來(lái)描述該結(jié)合的方法。除了以新的方式結(jié)合單獨(dú)的步驟，我們還描述了多路傳輸并自動(dòng)化這種試驗(yàn)的新方法，及優(yōu)化選擇監(jiān)測(cè)肽序列的方式。對(duì)其它蛋白質(zhì)或肽混合物的應(yīng)用對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見(jiàn)的。使用除了抗體以外的肽結(jié)合劑(例如，RNA適體、肽體等等)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員也是顯而易見(jiàn)的。同樣將顯而易見(jiàn)的是該概念推廣到其他生物分子的定量檢測(cè)，如核苷酸和低聚糖，或推廣到到任何分子實(shí)體，該分子實(shí)體可以是1)以同位素標(biāo)記形式產(chǎn)生，并且2)可產(chǎn)生與之可逆結(jié)合的結(jié)合劑。
單一分析物實(shí)施例(1)在最簡(jiǎn)單的實(shí)施方案中，對(duì)每個(gè)人們希望在血漿中測(cè)定的蛋白質(zhì)進(jìn)行下面的步驟以便于產(chǎn)生特定的定量分析系統(tǒng)。出發(fā)點(diǎn)是蛋白質(zhì)鑒定，通常表示為序列數(shù)據(jù)庫(kù)(如SwissProt或Genbank)中的登錄號(hào)。該步驟是選擇監(jiān)控蛋白(步驟a)使用蛋白質(zhì)的已知序列，人們?cè)谄渲羞x擇一種或多種肽片段作為“監(jiān)測(cè)肽”。雖然用所需的酶通過(guò)切割產(chǎn)生的任何肽都是一種可能的選擇，但通過(guò)一組設(shè)計(jì)為選擇肽的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)定義良好的監(jiān)測(cè)肽，該肽可以高產(chǎn)量化學(xué)合成，可在適宜的質(zhì)譜儀中進(jìn)行定量檢測(cè)，并且當(dāng)用作抗原時(shí)可引發(fā)抗體。一組有用的標(biāo)準(zhǔn)如下所示1該肽具有由所需蛋白水解酶(例如，胰蛋白酶)切割蛋白質(zhì)而產(chǎn)生的序列。應(yīng)用通常可獲得的軟件可以容易地從蛋白質(zhì)序列計(jì)算所有可能的胰蛋白酶肽。
2該肽應(yīng)是完全親水性的，在通常用于酶消化和親和層析的溶劑中是可溶的?；趶耐ǔ？色@得的軟件程序?qū)γ糠N肽所得到的計(jì)算結(jié)果選擇親水性肽。一般，親水性肽是那些含有較多極性氨基酸(組氨酸、賴氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸)和較少疏水性氨基酸(色氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸)的肽。
3由于可加入c-末端半胱氨酸以方便綴合免疫原并且在肽中存在兩個(gè)半胱氨酸可能導(dǎo)致不利的二聚作用和交聯(lián)，因此該肽應(yīng)優(yōu)選不含半胱氨酸。
4肽應(yīng)通過(guò)電噴霧(ESI)或矩陣輔助的激光解吸(MALDI)離子化作用很好地進(jìn)行離子化。該特性可用軟件程序估計(jì)或通過(guò)目的蛋白消化物的MS分析而試驗(yàn)確定以了解哪種肽以最高相對(duì)量被檢測(cè)。
5該肽在抗體產(chǎn)生的物種中是具有免疫原性的。對(duì)下面的肽具有通常更好的免疫原性，即那些親水性的肽(與上述第(2)點(diǎn)一致)；該肽包括由第二結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)的彎曲；該肽不包括糖化位點(diǎn)；并且該肽在長(zhǎng)度上為10-20個(gè)氨基酸。
6在該肽中不應(yīng)包括任何在靶蛋白質(zhì)中普遍存在的序列多態(tài)性(也就是遺傳變異體)位點(diǎn)(由于如果變異體肽未以期望的質(zhì)量出現(xiàn)，這可能影響對(duì)各蛋白質(zhì)量的估計(jì))。
7該肽不應(yīng)與靶生物體的任何其他肽具有顯著的同源性(例如通過(guò)BLAST序列比較程序確定的)。該特性應(yīng)可減小抗體捕獲步驟中的任何來(lái)自非靶蛋白質(zhì)的肽的干擾。
根據(jù)這些標(biāo)準(zhǔn)可容易地評(píng)估來(lái)自靶蛋白質(zhì)的所有可能的肽并且選擇最優(yōu)平衡本方法的需要的一種或多種肽。尤其是，對(duì)有限組分析物(如在血漿中的抑制蛋白質(zhì))直接產(chǎn)生所有肽及其衍生特性的數(shù)據(jù)庫(kù)，并使用該數(shù)據(jù)庫(kù)作為選擇監(jiān)測(cè)肽的基礎(chǔ)。以蛋白質(zhì)分析物的已知氨基酸序列開(kāi)始，有效的算法可構(gòu)建所有可能的胰蛋白肽，這些肽通過(guò)蛋白質(zhì)的胰蛋白酶消化作用產(chǎn)生。這些胰蛋白酶肽序列作為記錄存儲(chǔ)于數(shù)據(jù)庫(kù)中，并對(duì)其他可能的切割酶和試劑產(chǎn)生的相似記錄進(jìn)行存儲(chǔ)?？捎昧硗獾乃惴ㄓ?jì)算每種肽的各種不同的物理及生物特性，包括長(zhǎng)度、質(zhì)量、在中性pH下的靜電荷、采取二級(jí)結(jié)構(gòu)的趨勢(shì)、親水性等等。對(duì)每種肽可將這些衍生數(shù)據(jù)制成表格，并且額外進(jìn)行集合計(jì)算以產(chǎn)生與作為監(jiān)控蛋白成功可能性有關(guān)的優(yōu)先分值。將這些優(yōu)先分值分類來(lái)為每種蛋白質(zhì)選擇優(yōu)選的待選監(jiān)測(cè)肽。
也可能將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)加到優(yōu)先化中。例如，可能通過(guò)合成所有來(lái)自蛋白質(zhì)的各胰蛋白酶肽序列產(chǎn)生并將這些肽固定在膜上的陣列中。然后用全蛋白質(zhì)的抗體或用抗蛋白質(zhì)混合物(包括靶蛋白)的抗體混合物探測(cè)這樣的陣列，通過(guò)用第二標(biāo)記抗體二次染色對(duì)抗體與各種肽的結(jié)合進(jìn)行顯示與定量，從而可用發(fā)光、熒光或比色染色法檢測(cè)(PEPSCAN方法{Carter Methods Mol.Biol.36207-223(1994)。然后那些定位于檢測(cè)到抗體結(jié)合的地方的肽因此顯示可以引發(fā)抗體應(yīng)答。這樣使用PEPSCAn的主要限制是需要存在對(duì)于所選蛋白質(zhì)的抗體，或?qū)τ诤x蛋白質(zhì)的混合物的抗體。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)是一種以前研究過(guò)的蛋白質(zhì)時(shí)，這樣的抗體可以獲得或者它可在選擇最優(yōu)監(jiān)控蛋白時(shí)產(chǎn)生。
產(chǎn)生同位素監(jiān)測(cè)肽(步驟b)然后制作所選擇肽的同位素標(biāo)記的形式，其中保留了化學(xué)結(jié)構(gòu)，但用同位素代替一個(gè)或多個(gè)原子，以使得MS可將標(biāo)記的肽與普通肽(含有各元素同位素的天然豐度)相區(qū)分。例如，氮-15可替代天然的氮-14導(dǎo)入合成肽的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)。該合成肽超出的重量等于替代的氮數(shù)量的原子量單位。應(yīng)仔細(xì)制備該肽，以使得加入的質(zhì)量單位數(shù)是已知的并已確定(即，以一種標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)生的所有材料具有盡可能相同范圍的質(zhì)量—例如，通過(guò)使用高富集的氨基酸同位素變異體)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，由氮-15標(biāo)記的氨基酸前體(取代＞98％)用于肽合成過(guò)程的一個(gè)或多個(gè)位置從而與天然肽相比導(dǎo)入4-10個(gè)額外的質(zhì)量單位。這樣的氮-15標(biāo)記的氨基酸前體(或其碳-13標(biāo)記的等價(jià)物)作為FMOC衍生物可商業(yè)獲得，適于直接用于通常的商業(yè)肽合成工具。用通常的LC法純化最終產(chǎn)生的標(biāo)記的監(jiān)測(cè)肽(通常達(dá)到＞90％純度)，并用MS對(duì)其進(jìn)行表征以確保正確的序列和質(zhì)量。
產(chǎn)生抗肽抗體(步驟c)免疫動(dòng)物以生產(chǎn)抗肽抗體，將同樣的肽(標(biāo)記或未標(biāo)記，如果這是所盼望的，更加經(jīng)濟(jì))偶聯(lián)到載體蛋白(例如鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)；不與人蛋白質(zhì)同源)上，并用于通過(guò)已知方案免疫動(dòng)物(如兔、雞、山羊或綿羊)，該免疫方案有效產(chǎn)生抗肽抗體。為了方便，用于免疫及抗體純化的肽優(yōu)選含有加到監(jiān)控蛋白序列上的額外的c-端殘基(此處簡(jiǎn)化為MONITOR)，例如n端-MONITOR-lys-gly-ser-gly-cys-c端。所產(chǎn)生的延伸的監(jiān)測(cè)肽可方便地偶聯(lián)載體KLH，該載體KLH在先已與異雙功能試劑反應(yīng)，以使得多個(gè)SH-活性基團(tuán)結(jié)合到載體上。在用肽進(jìn)行典型的免疫時(shí)(該肽現(xiàn)作為載體蛋白上的半抗原)，產(chǎn)生的多克隆抗血清含有針對(duì)該肽、針對(duì)載體及針對(duì)其他非特異性抗原決定簇的抗體。或者，在本領(lǐng)域中有許多已知方法來(lái)偶聯(lián)肽，用于抗體產(chǎn)生的載體有或無(wú)任何擴(kuò)充或修飾，且可使用任何這樣的方法。同樣，存在已知的方法通過(guò)用載體上的肽免疫動(dòng)物以外的方式來(lái)產(chǎn)生抗肽抗體。只要對(duì)于監(jiān)測(cè)肽產(chǎn)生適宜的特異性可逆結(jié)合劑，可使用任何變化的方法。
然后，通過(guò)在含緊密結(jié)合的肽的柱上進(jìn)行親和純化而從該抗血清中制備特異性的抗肽抗體。通過(guò)將一等分量的延伸的監(jiān)測(cè)肽與硫醇活化固相支持物(例如，商業(yè)可獲得的丙基硫氧嘧啶瓊脂糖)反應(yīng)可容易地制備這樣的柱。將粗提抗血清加到該柱上，然后洗滌該柱并最終暴露于10％醋酸(或其他低pH、高pH、或高促溶劑濃度的洗脫緩沖液)來(lái)特異性洗脫抗肽抗體。中和或從洗脫緩沖液分離這些抗體(為防止變性)，并且再生該柱達(dá)到生理?xiàng)l件以便于需要時(shí)對(duì)更多抗血清進(jìn)行應(yīng)用。
將肽特異性抗體最終固定在柱、珠或其他表面上用作肽特異性親和捕獲劑。在優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)制造者的說(shuō)明，抗肽抗體固定于商業(yè)可獲得的蛋白質(zhì)A-衍生的POROS層析介質(zhì)(應(yīng)用生物系統(tǒng))上并且通過(guò)與二甲基庚二亞胺(pimelimidate)共價(jià)交聯(lián)共價(jià)固定在該支持物上。所產(chǎn)生的固相介質(zhì)可特異性從肽混合物(例如，血清或血漿的胰蛋白酶水解液)中結(jié)合監(jiān)測(cè)肽，并且洗滌步驟后，在和緩的洗脫條件(例如，10％醋酸)下釋放監(jiān)測(cè)肽。然后將該柱恢復(fù)至中性pH從而再生該柱用于另一樣品的再次使用，本領(lǐng)域公知的方法可使之重復(fù)上百次。
抗肽抗體優(yōu)選的親和性在100-100,000,000范圍內(nèi)。需要較高的親和性來(lái)富集更低量的肽，也就是說(shuō)，捕獲低濃度肽。
將樣品消化為肽(步驟d)將人們希望測(cè)定的血漿樣品中的所選蛋白由適宜的蛋白酶(在此為胰蛋白酶)消化完全從而產(chǎn)生肽(包括在步驟1中所選擇的監(jiān)測(cè)肽)。對(duì)于其序列于靶蛋白序列中只顯示一次的監(jiān)測(cè)肽，該消化應(yīng)產(chǎn)生同指定樣品中所存在的靶蛋白分子相同數(shù)量的監(jiān)測(cè)肽。通過(guò)以下步驟進(jìn)行消化首次先使蛋白質(zhì)樣品變性(例如，用尿素或鹽酸胍)，減少蛋白質(zhì)中的二硫鍵(例如，用二硫蘇糖醇或巰基乙醇)，烷基化半胱氨酸(例如，通過(guò)加入碘乙酰胺)，通過(guò)加入更多二硫蘇糖醇或巰基乙醇淬滅過(guò)剩的碘乙酰胺，最后(在除去或稀釋變性物后)加入所選擇的蛋白質(zhì)水解酶(例如，胰蛋白酶)，然后進(jìn)行孵育使得消化進(jìn)行。在孵育后，通過(guò)加入化學(xué)抑制劑(例如，DFP或PMSF)，或通過(guò)使胰蛋白酶變性(加熱或加入變性劑，或使用兩者)或除去(如果胰蛋白酶在固體支持物上)胰蛋白酶而終止胰蛋白酶的反應(yīng)。破壞胰蛋白酶的活性是重要的以避免后來(lái)由于殘留在樣品中的蛋白質(zhì)水解酶活性產(chǎn)生對(duì)抗體的破壞。
加入同位素標(biāo)記的監(jiān)測(cè)肽內(nèi)標(biāo)物(步驟e)然后將量取的等分的同位素標(biāo)記的合成監(jiān)測(cè)肽以接近或大于(如果標(biāo)準(zhǔn)物作為低豐度肽的載體)等分樣品中所期望的相同“天然”肽的量加入到量取的等分消化樣品肽混合物中。在加入后，監(jiān)測(cè)肽在樣品中以兩種形式存在(天然的及同位素標(biāo)記的)?；诩尤氲臄?shù)量和已知的等分體積將準(zhǔn)確知道同位素標(biāo)記形式的濃度。
通過(guò)抗體捕獲及洗脫富集監(jiān)測(cè)肽(步驟f)使肽混合物(帶有所加入的同位素標(biāo)記監(jiān)測(cè)肽的消化物)與肽特異性親和捕獲劑接觸，該捕獲劑優(yōu)選與監(jiān)測(cè)肽結(jié)合但不會(huì)區(qū)分標(biāo)記與未標(biāo)記形式(由于同位素取代物不會(huì)影響抗體的結(jié)合親和性)。在洗滌步驟后(例如，磷酸鹽緩沖液)，然后洗脫結(jié)合的肽(例如，用10％醋酸，或用水和乙腈的混合液)以進(jìn)行MS分析。如果需要，親合性支持物可以制備再生以用于另一樣品。假設(shè)在高通量分析應(yīng)用中，循環(huán)使用固定的抗體結(jié)合數(shù)百次，如果不是數(shù)千次，將是有利的?，F(xiàn)在的證據(jù)顯示，當(dāng)用5％或10％醋酸洗脫抗原并且對(duì)酸的總接觸量較短(例如，在用中性pH緩沖液在生前少于一分鐘)時(shí)，兔多克隆抗體可循環(huán)至少200次。在固定抗體床在尺寸上低于微升的毛細(xì)管柱的形式中，接觸酸的持續(xù)時(shí)間可更進(jìn)一步減少，可能會(huì)進(jìn)一步延長(zhǎng)固定的抗體吸收劑的壽命。
通過(guò)抗體對(duì)于肽的親合常數(shù)及通過(guò)肽和抗體兩者的濃度來(lái)控制對(duì)肽的捕獲效應(yīng)。我們特別關(guān)注結(jié)合抗體的肽片段。相關(guān)通用方程為Ab+Pep＝AbPep，
Ka＝[AbPeb]/([Ab]×[Pep])Ka×[Ab]＝[AbPep]/[Pep][Ab]、[Pep]和[AbPep]分別是Ab、Pep、AbPep的濃度；Ka是在給定的溶液條件下控制結(jié)合反應(yīng)的親合常數(shù)。在本實(shí)施方案中，我們特別關(guān)注低豐度肽(由于高量肽相對(duì)容易捕獲)，這樣我們令抗體以最大可獲得濃度存在于固相支持物上([Ab]＝對(duì)于結(jié)合到蛋白A衍生POROS樹(shù)脂的IgG接近10-5M)。由于在該濃度下100fmol的Ab僅占據(jù)1nL POROS，并且雖然以通常的標(biāo)準(zhǔn)看所使用的柱非常小，實(shí)際上其比這大得多，該抗體的存在相當(dāng)過(guò)量于肽，且我們可以假設(shè)任何可獲得的[AbPep]水平不會(huì)有效減小[Ab]，該[Ab]可假設(shè)為常數(shù)(10-5M)。通?？闺目贵w具有106-108范圍的親合常數(shù)。因此抗體結(jié)合的肽與游離肽的量的比例([AbPep]/[Pep])為Ka×[Ab]＝106-108×10-5＝10-103)。這樣甚至在相當(dāng)?shù)偷挠H合性(Ka＝106)的情況下，肽的主要部分(90％)應(yīng)結(jié)合到抗體上，而高親合性抗體則給出99.9％抗體結(jié)合。該比例不依賴于抗體濃度，因?yàn)榭贵w捕獲任何可獲得的肽，并且主要通過(guò)檢測(cè)器的敏感性確定該敏感性。
上述計(jì)算應(yīng)用于平衡結(jié)合。親合常數(shù)Ka是“結(jié)合速率”Kon和“解離速率”Koff的商(Ka＝Kon/Koff)。由于主要由擴(kuò)散(分子撞到另一分子上)確定，對(duì)所有的肽-抗體結(jié)合反應(yīng)，Kon是相似的。通常Kon值為105-106M-1sec-1，此處我們假設(shè)更守恒的值(106)。從該值和上述所使用的通常Ka值(106-108)，我們可計(jì)算Koff值的范圍1-0.01/秒或換句話說(shuō)為1-100秒。如果在肽離開(kāi)后，該肽可再連接到另一結(jié)合位點(diǎn)上，那么它可在另一相似的時(shí)間段保持結(jié)合。因此，如果裝載和洗滌相對(duì)較快并且假設(shè)有過(guò)量的結(jié)合位點(diǎn)(抗體)用于再次結(jié)合，在裝載和洗滌期間肽可能留在柱上。因?yàn)橄疵摋l件(例如，低pH)改變肽與抗體之間的相互作用并急劇增加解離速度，所以洗脫非?？焖?。由于這個(gè)原因，甚至在快速循環(huán)的親和層析過(guò)程中觀察到結(jié)合到固定化抗體柱上的抗原以尖銳峰帶洗脫。這樣鋒面表現(xiàn)使得捕獲肽的洗脫體積很小，特別是如果柱長(zhǎng)與柱直徑的比例大的情況下。通過(guò)例如直徑為100微米長(zhǎng)度為3mm(長(zhǎng)度/直徑＝30，體積＝～25nL)的毛細(xì)管固定化抗體柱滿足后者的需要。在這樣的柱中，肽區(qū)在1mm區(qū)域中洗脫，其具有8nl體積。如果10μL血漿樣品的消化液可裝載于柱上，那么以上述高效率捕獲的監(jiān)測(cè)肽洗脫為8nL，則本發(fā)明方法獲得1000倍的濃度增加，并同時(shí)除去了大量潛在的干擾性肽材料。
由于該步驟使得源于樣品中低豐度蛋白質(zhì)的低豐度肽富集和濃縮，因此富集步驟是本方法的重要步驟。理論上，該富集方法僅將監(jiān)測(cè)肽供給MS，并使它的檢測(cè)成為純粹MS敏感性的問(wèn)題，而不是相對(duì)于許多其他潛在的更大豐度存在于整個(gè)消化物中的肽背景的檢測(cè)監(jiān)測(cè)肽問(wèn)題。該方法有效地?cái)U(kuò)展了在樣品及其消化液中存在其它高豐度蛋白和肽的情況下MS檢測(cè)器的檢測(cè)敏感性并有效擴(kuò)展了動(dòng)態(tài)范圍。
通過(guò)MS分析所捕獲的監(jiān)測(cè)肽(步驟g)將在上述步驟富集的監(jiān)測(cè)肽(包括天然和同位素標(biāo)記的形式)優(yōu)選通過(guò)電噴霧離子化供給到質(zhì)譜儀的入口中去。在優(yōu)選實(shí)施方案中，肽在洗脫緩沖液(例如，10％醋酸)中直接導(dǎo)入質(zhì)譜儀?；蛘?，將監(jiān)測(cè)肽加到反相(例如，C18)柱上，并梯度(例如，在水中的乙腈/三氟乙酸)洗脫到質(zhì)譜儀(也就是LC/MS)的電噴霧源。質(zhì)譜可以是離子阱、三重四極、ESI-TOF、Q-TOF型設(shè)備、或適宜質(zhì)量分辨(＞1000)和靈敏度的任何其他設(shè)備。
對(duì)于兩種形式的監(jiān)測(cè)肽(天然和標(biāo)記的)MS測(cè)定離子電流(離子數(shù)量)作為時(shí)間的函數(shù)。對(duì)每種質(zhì)量類型，離子電流在時(shí)間上積分(理論上只要監(jiān)測(cè)肽出現(xiàn)在質(zhì)譜上)，計(jì)算天然和同位素標(biāo)記形式的積分?jǐn)?shù)。
計(jì)算樣品內(nèi)每種監(jiān)測(cè)肽的豐度(步驟h)計(jì)算標(biāo)記和未標(biāo)記(天然的)監(jiān)測(cè)肽之間的數(shù)量比例。由于加入的標(biāo)記肽的量是已知的，那么用該測(cè)定比例乘標(biāo)記的監(jiān)測(cè)肽的已知濃度可計(jì)算源自樣品消化物的天然監(jiān)測(cè)肽的量。通過(guò)假設(shè)消化液中監(jiān)測(cè)肽的量與該肽源于的母體蛋白的量相同(或近似相關(guān))，可獲得樣品中該蛋白量的計(jì)算。
為檢測(cè)并補(bǔ)償樣品消化過(guò)程完成性的變化，可選擇一系列消化監(jiān)測(cè)肽，該監(jiān)測(cè)肽顯示消化過(guò)程的進(jìn)展。由于樣品消化液在水解蛋白酶對(duì)血漿蛋白比率之間的差異、消化時(shí)間和溫度的差異、樣品的內(nèi)源蛋白酶抑制劑含量的差異、或內(nèi)源蛋白酶水平或活性的差異，消化的完成性可以有所不同。尤其是，人們可以進(jìn)行時(shí)程實(shí)驗(yàn)，在該實(shí)驗(yàn)中用胰蛋白酶消化血漿樣品(在血漿蛋白還原并烷基化作用后)，一系列釋放肽中的每種的數(shù)量作為時(shí)間的函數(shù)測(cè)定。一些肽在消化過(guò)程初期釋放，可能是由于它們位于靶蛋白的表面并由于該肽末端的切割位點(diǎn)與蛋白酶接觸并于消化早期達(dá)到了它們的最大終濃度。其他肽在消化過(guò)程晚一些時(shí)候釋放，可能是由于它們形成了靶蛋白的核心部分或由于形成該肽末端的切割位點(diǎn)不在完整靶蛋白的表面暴露，因此這些肽在消化過(guò)程晚些時(shí)候顯示并在晚些時(shí)候達(dá)到它們的最大終濃度。也發(fā)生了以下情況一些水解蛋白肽從后來(lái)在溶液中切割的靶蛋白上釋放，并由于該肽進(jìn)一步被切割為其他更短的肽而引起消化液中該肽濃度先增加后減小。通過(guò)在這樣的時(shí)間過(guò)程中測(cè)定一系列特定肽的時(shí)間比濃度性質(zhì)，人們可選擇一起定出血漿消化過(guò)程狀態(tài)精確測(cè)定的消化液監(jiān)測(cè)肽。如果這種的肽是一種或一些蛋白質(zhì)的產(chǎn)物，那么這樣肽群體的應(yīng)用就增加，從而肽之間的豐度比例反映了消化過(guò)程而不是親代蛋白質(zhì)間的濃度差異。通過(guò)在接下來(lái)的單一樣品消化液中測(cè)定所選擇的消化監(jiān)測(cè)肽，人們可計(jì)算消化過(guò)程中在何處捕獲各樣品，對(duì)所涉及的樣品種類有效產(chǎn)生消化過(guò)程的標(biāo)準(zhǔn)化標(biāo)度。該信息結(jié)合對(duì)于每種將用于樣品分析的監(jiān)測(cè)肽的釋放的時(shí)間過(guò)程知識(shí)(相對(duì)于參考消化液中消化監(jiān)測(cè)肽的釋放)，當(dāng)特定的樣品不完全消化為同樣程度時(shí)，這使得可以校正監(jiān)測(cè)肽的豐度。
通過(guò)使用多級(jí)肽捕獲法進(jìn)一步增強(qiáng)了該方法的特異性和敏感性。在多級(jí)方法的一個(gè)實(shí)施方案中，基于下面的原理可使用兩個(gè)不同的連續(xù)捕獲步驟首先在針對(duì)該肽N端部分的抗體上捕獲，從該第一抗體洗脫并中和后，在針對(duì)該肽C端部分的第二抗體(A2)上捕獲。由于用于制造抗肽抗體的免疫原通常由通過(guò)附于所需監(jiān)測(cè)肽序列上(通常由一些間隔殘基與監(jiān)測(cè)肽序列相隔)的半胱氨酸殘基連接在大載體蛋白(例如，鑰孔血藍(lán)蛋白或清蛋白)上的肽構(gòu)成，因此可制成這樣的N-端或C-端抗體。如果半胱氨酸包含在免疫肽的N-端，導(dǎo)致N-端連接到載體的表面，那么將使監(jiān)測(cè)肽序列的C-端暴露用于識(shí)別和抗體產(chǎn)生。相反的，如果半胱氨酸包含在免疫肽的C-端，導(dǎo)致C-端與載體表面連接，那么將使監(jiān)測(cè)肽序列的N-端暴露用于識(shí)別和抗體產(chǎn)生。由于抗體常識(shí)別3-6個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度，并由于監(jiān)測(cè)肽常常為8-15個(gè)氨基酸長(zhǎng)度，出現(xiàn)以下情況是高度可能的由N-端及C-端抗體識(shí)別的抗原決定簇實(shí)質(zhì)上不同，這將對(duì)監(jiān)測(cè)肽提供分離的但特異性的識(shí)別。任何通過(guò)與監(jiān)測(cè)肽序列N-端部分的某些相似性結(jié)合到第一(例如N端)抗體上的雜質(zhì)(其他肽)極不可能也與C-端抗體結(jié)合。使用兩個(gè)不同的富集過(guò)程通常會(huì)產(chǎn)生與兩個(gè)分離的富集步驟的積相等的純化作用如果N-端抗體結(jié)合1/104消化肽(作為雜質(zhì)，即除了所需的監(jiān)測(cè)肽以外的)，并且C-端抗體也結(jié)合1/104消化肽(作為雜質(zhì)，即除了所需的監(jiān)測(cè)肽以外的)，那么作為兩個(gè)分離的富集步驟的這些抗體的相繼結(jié)合可能結(jié)合1/108非監(jiān)測(cè)肽。如果N-端和C-端抗體都結(jié)合大部分的監(jiān)測(cè)肽(例如，每一步驟為90％)，那么兩步捕獲的最終結(jié)果是81％的監(jiān)測(cè)肽回收，僅0.000001％(1/108)的其他結(jié)合肽。
其他多級(jí)富集方法也是有利的。第一抗體可以針對(duì)表面肽或整個(gè)肽，可用于捕獲來(lái)自血漿的天然蛋白，之后可將蛋白質(zhì)消化為肽和通過(guò)第二抗肽抗體捕獲監(jiān)測(cè)肽。
或者，相繼的消化方法可用于與兩個(gè)抗肽抗體相結(jié)合。此處，用第一蛋白酶消化血漿樣品，產(chǎn)生由第一抗肽抗體結(jié)合的監(jiān)測(cè)肽序列的第一種形式。洗脫該肽后，用第二蛋白酶將之切割，產(chǎn)生兩個(gè)(或可能更多的)新肽，其中每一種具有至少一個(gè)新的末端(第一監(jiān)測(cè)肽先前的C-端片段具有新的N-末端，先前的N-端片段具有新的C-末端)。第二抗肽抗體用于捕獲一個(gè)這樣新暴露的末端序列(一個(gè)在第二消化步驟之前并未暴露的末端)用于MS檢測(cè)。作為示例，該方法的一種操作涉及選擇通過(guò)賴氨酸和/或N-或C-端結(jié)合的監(jiān)測(cè)肽序列，在該序列中存在一個(gè)精氨酸殘基。使用lys-C(其優(yōu)先在賴氨酸殘基處而非精氨酸處切割)作為第一蛋白酶，制成第一抗肽抗體來(lái)識(shí)別該序列C端賴氨酸部分(例如，經(jīng)N-端半胱氨酸連接載體而成免疫肽)。用胰蛋白酶(該蛋白在賴氨酸和精氨酸之處都切割)進(jìn)行的第二消化作用在該肽的內(nèi)部精氨酸處斷裂，產(chǎn)生兩個(gè)片段，其中一個(gè)片段具有新的C-端序列(以精氨酸結(jié)束)并且該片段由第二抗肽抗體識(shí)別。該方法實(shí)際上使用了三個(gè)特異性步驟(第一抗體、第二蛋白酶、第二抗體)從而進(jìn)一步加強(qiáng)了最終檢測(cè)過(guò)程的整體特異性。在使用兩個(gè)蛋白酶的多級(jí)系統(tǒng)時(shí)，存在捕獲并檢測(cè)兩種(或更多的，如果第二蛋白酶進(jìn)行多于一次的切斷)“子代”肽分別作為相互證實(shí)的試驗(yàn)的機(jī)會(huì)。可使用具有不同特異性的蛋白酶的任何組合。
兩種蛋白酶的多級(jí)系統(tǒng)的一個(gè)特定的有趣事實(shí)是其中第一蛋白酶作用發(fā)生在體內(nèi)，在樣品中的部分天然蛋白分子中產(chǎn)生斷裂的系統(tǒng)。例如，這樣的蛋白酶的作用可以顯示一種疾病過(guò)程或?qū)τ谥委煹挠幸骓憫?yīng)。一種所需的測(cè)定可能是被斷裂分子的一部分。通過(guò)用不在體內(nèi)蛋白酶的位點(diǎn)切割的蛋白酶(體外蛋白酶)消化血漿樣品可獲得該結(jié)果，產(chǎn)生天然蛋白質(zhì)的片段(肽)，其中一個(gè)片段含有該體內(nèi)切割位點(diǎn)。針對(duì)監(jiān)測(cè)肽N端(或者是C-端)的抗肽抗體捕獲整個(gè)監(jiān)測(cè)肽和來(lái)自體內(nèi)斷裂的較短的形式。監(jiān)測(cè)肽在長(zhǎng)形式和短形式之間的豐度比例(優(yōu)選通過(guò)相對(duì)于同樣的穩(wěn)定同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)物肽定量每一種)給定親代蛋白質(zhì)的未斷裂形式與體內(nèi)斷裂形式之比。
上述所有多級(jí)方法使用同位素標(biāo)級(jí)肽作為內(nèi)標(biāo)物，通過(guò)與第一單一分析物實(shí)施方案同樣的方式應(yīng)用于定量肽。
基本操作的自動(dòng)化(2)優(yōu)選結(jié)合基本操作步驟d、e、f和g為自動(dòng)化過(guò)程，將計(jì)算機(jī)控制的液體操作系統(tǒng)應(yīng)用于步驟d、e和f，并將計(jì)算機(jī)控制的質(zhì)譜儀應(yīng)用于步驟g。在該方法中，計(jì)算機(jī)化的液體操作系統(tǒng)進(jìn)行樣品的還原和烷基化、加入胰蛋白酶、孵育、淬滅胰蛋白酶活性并加入標(biāo)記的肽標(biāo)準(zhǔn)物。
在一種形式中，計(jì)算機(jī)化的液體操作系統(tǒng)然后將準(zhǔn)備好的消化樣品加到對(duì)監(jiān)測(cè)肽特異性的抗體上(優(yōu)選在固體支持物上)，移走消化物，在它的支持物上洗滌抗體，最后將所捕獲的肽直接洗脫入質(zhì)譜儀進(jìn)行步驟g。可以非常小的體積(例如10μl)進(jìn)行該洗脫，且因此將全部洗脫樣品逐漸灌輸?shù)組S以獲得最大的敏感度。
或者可以離線進(jìn)行步驟f，產(chǎn)生可隨后導(dǎo)入質(zhì)譜儀進(jìn)行測(cè)量的一系列富集的肽樣品。由于載有數(shù)百樣品的MALDI靶盤可離線制備并在此后導(dǎo)入MS中，當(dāng)MALDI MS用于檢測(cè)和定量這些肽時(shí)，該方法特別適用。
步驟a-h的整個(gè)過(guò)程可作為統(tǒng)一的分析過(guò)程而用于定量樣品中蛋白質(zhì)。
多分析物測(cè)定的平行的實(shí)施方案在第一個(gè)平行的實(shí)施方案中，在一種裝置中用各種抗體一次一個(gè)地選擇各種監(jiān)測(cè)肽而測(cè)定多種蛋白質(zhì)，該裝置使得連續(xù)的抗體間斷地洗脫入MS(當(dāng)其抗體在適當(dāng)?shù)奈恢眠M(jìn)行洗脫時(shí)，連續(xù)測(cè)定每種監(jiān)測(cè)肽)。在該方案中，不是用層析分離法來(lái)分離含有一系列監(jiān)測(cè)肽的混合物(在所有情況下連同它們所加入的同位素標(biāo)記的形式)，人們使用液流或機(jī)械方式來(lái)將每種抗體放置在其固體支持物上進(jìn)入洗脫路徑(通常10％醋酸的洗脫液流導(dǎo)入到MS中)?？捎脠D1-7所示的設(shè)置為旋轉(zhuǎn)腔室的多個(gè)小抗體柱來(lái)實(shí)現(xiàn)這種基本的實(shí)施方案。
在該實(shí)施例中，最耗費(fèi)時(shí)間并且昂貴的兩個(gè)過(guò)程是制備被消化的微樣品以及制備和使用結(jié)合要分析的肽的固定化的抗體表面。因而，人們希望僅制備一份或很少的要分析樣品的消化液，并將其加到許多免疫吸收支持物或表面上，該數(shù)量對(duì)測(cè)定所需數(shù)量監(jiān)測(cè)肽(靶蛋白質(zhì))是有效并必須的。由于結(jié)合與擴(kuò)散相關(guān)，一個(gè)目的是使肽消化樣品在相對(duì)大的表面擴(kuò)散，以及有效地進(jìn)行施加和去除。最初有兩個(gè)限制是明顯的。首先是吸收表面的容量和多特異性，其次是當(dāng)將進(jìn)行檢測(cè)的數(shù)量增加導(dǎo)致它們的更大稀釋時(shí)，質(zhì)譜對(duì)同時(shí)定量大量不同分析物的限制。這樣，如果使用最大多價(jià)吸收性表面，那么它對(duì)任意一種分析物的容量就非常小，且每種結(jié)合劑只有很少數(shù)量存在。并且，由于分析物的數(shù)量上升至極大的數(shù)量，MS不可能分辨所有存在的物質(zhì)。在結(jié)合自動(dòng)操作的本實(shí)施方案中，目的是讓消化樣品通過(guò)一系列不同的免疫吸收性支持物，每一種支持物含有一個(gè)或多個(gè)不同的特異性抗體，在封閉系統(tǒng)中以如下方式設(shè)置所有支持物都與樣品接觸，然后洗脫過(guò)量的樣品。在該步驟后，分離分立的支持物，每一支持物分別有效洗脫到電噴霧MS系統(tǒng)中。免疫吸收性支持物必須以如下方式設(shè)計(jì)將抗體連接到它們的大組上(也就是它們制造的關(guān)鍵步驟)的操作可平行進(jìn)行并具有高度再生性。
在開(kāi)始的設(shè)計(jì)中，使用十六個(gè)包含不同表面的不同免疫吸收支持物，且期望十種不同抗體混合物會(huì)連接到每一個(gè)上，對(duì)每種分析組給出總共160種不同的要分析的蛋白質(zhì)。每一種抗體結(jié)合表面包括盤(此處為圓盤)中小孔的內(nèi)腔，且通過(guò)開(kāi)槽而使內(nèi)腔表面積增加。圖1表明對(duì)含抗體的孔或管開(kāi)槽以增加表面積。
圖2顯示含有齒緣9的盤8中的孔內(nèi)的結(jié)合表面設(shè)置為使它進(jìn)行受控制的旋轉(zhuǎn)。所顯示的是16個(gè)含抗體的孔10，4個(gè)空孔11，它們繞軸12對(duì)齊。
圖3顯示一組盤8對(duì)齊為堆疊17，有空的對(duì)齊的端帽16和18。結(jié)合的抗體示為19。
圖4顯示對(duì)齊并裝載盤的設(shè)置，其中通過(guò)由31計(jì)算機(jī)控制驅(qū)動(dòng)的裝置30對(duì)在球管28中的抗體溶液29進(jìn)行交替擠壓和擴(kuò)散，從而將液體往復(fù)推過(guò)管32、33和34，且向上通過(guò)管35進(jìn)入球管36。由于存在孔38，壓過(guò)37的溶液不會(huì)在球管36中建立壓力。這樣將抗體加到一系列盤中的每一個(gè)上的單孔中，并重復(fù)該過(guò)程將抗體(通常是不同種類的)加到其他孔上。對(duì)開(kāi)槽的內(nèi)腔表面進(jìn)行化學(xué)修飾以便于結(jié)合抗體。一旦將抗體加入，可洗滌該孔并在原位使抗體干燥。然后拆開(kāi)堆疊的盤產(chǎn)生一系列同樣的載有抗體的肽捕獲盤。
在使用中，如圖5所示，盤39在空盤41和42之間持為40，其含有對(duì)齊的孔。該設(shè)置保持盤41和42穩(wěn)定，而盤40可通過(guò)具有齒緣9的外部裝置的設(shè)置而進(jìn)行旋轉(zhuǎn)。
圖6顯示了在一個(gè)分析循環(huán)中操作該系統(tǒng)，其中具有齒緣64的盤63含有十六個(gè)含抗體的孔65和四個(gè)空孔70-73。含抗體的孔通過(guò)上下空盤中的縫隙交替相連，用虛線66表示下面的縫隙而用非虛線67表示上面的連接，連接入口68，通過(guò)經(jīng)上(67)和下(66)連接縫隙的蛇形連接穿過(guò)所有含抗體的孔65，通過(guò)69流出制成了連續(xù)路徑。這使得樣品消化液往復(fù)泵過(guò)所有的孔，然后排出，并將孔組進(jìn)行洗滌。這些部件在圖6b中顯示為通過(guò)盤的圓形截面。在下一操作中，移動(dòng)可旋轉(zhuǎn)的盤63使得裝載抗體的管69與盤41和42的管70對(duì)齊，并且將洗液流過(guò)。向前指引一步將管69移到位置71，在位置71洗脫液(如10％醋酸)用于分離所結(jié)合的肽并將它們傳輸?shù)劫|(zhì)譜儀上或中間的捕獲點(diǎn)，如反相柱。下一個(gè)指引將試管69帶進(jìn)有位置72的寄存器，其中緩沖液流過(guò)以再生抗體并在暴露于洗脫液后使它穩(wěn)定。如此將每種不同的含抗體管(或孔)引導(dǎo)通過(guò)該狀態(tài)，產(chǎn)生16個(gè)順序的連續(xù)洗脫到MS中。
圖7顯示了整個(gè)系統(tǒng)如何整合，質(zhì)譜儀74與盤分析器75連接，然后通過(guò)自動(dòng)取樣器76供給樣品，全部處于計(jì)算機(jī)77的控制下。
可形成含抗體的孔以使得將抗體(或其他結(jié)合劑)裝載于它們的內(nèi)表面上(如所示)或它們可以用結(jié)合有抗體的多孔單片材料填充，產(chǎn)生較大的表面積從而有較高的抗體分子局部濃度?？赏ㄟ^(guò)以下方式形成這樣的單片支持物原位聚合、燒結(jié)預(yù)制的顆粒、將預(yù)形成的多孔桿通過(guò)摩擦配合插入每一孔、或通過(guò)其他方法。在抗體結(jié)合到內(nèi)表面的情況下，這些表面可以是圓柱形的(如通常的管)或它們可以通過(guò)各種方式形成網(wǎng)狀以增加內(nèi)表面積。
在必須使用多種不同分析部件(如盤)的臨床化學(xué)中，最重要的問(wèn)題是確定在位置上的部件是正確的部件。成為該系統(tǒng)一部分的注意是能質(zhì)量控制和陽(yáng)性識(shí)別結(jié)合位點(diǎn)的能力。由于標(biāo)準(zhǔn)物的混合物加到每一個(gè)肽的消化樣品中，其中只有一些結(jié)合到每一載有抗體的結(jié)合表面上，因此這就實(shí)現(xiàn)為該系統(tǒng)的自動(dòng)化特征。因而通過(guò)質(zhì)譜對(duì)從每個(gè)表面(孔)洗脫的肽進(jìn)行分析提供了對(duì)表面的抗體及它們的操作條件的陽(yáng)性識(shí)別。該方面確定了該盤含有正確的抗體特異性。外加的任選特征是在制造過(guò)程中在每個(gè)帶有抗體的相應(yīng)肽的孔裝載抗體在此情況下，在任何樣品加載前，盤中的每個(gè)孔可洗脫到MS，通過(guò)MS識(shí)別這些洗脫肽而證實(shí)抗體的特異性。
或者，以其他方式執(zhí)行該多抗體分離洗脫方法，例如使用電磁裝置使包被抗體的反磁性顆粒移過(guò)所需的位置(取樣、洗滌、洗脫到MS中)?？墒褂萌缦略O(shè)置的固定化抗肽抗體陣列設(shè)置在平面上以使得從覆蓋的液體體積捕獲肽；設(shè)置在針狀物上以使得從浸漬它們的容器中捕獲肽；或設(shè)置在微液流裝置的分離的微容器中以使得可連通多個(gè)液流通道。多個(gè)機(jī)械及電磁溶液顯然存在以下問(wèn)題使多個(gè)分別固定的抗體與樣品接解，洗滌它們，然后通過(guò)暴露于其后移入MS的液流單獨(dú)洗脫它們。
在第二平行實(shí)施方案中，該方法應(yīng)用于一系列不同質(zhì)量的監(jiān)測(cè)肽(A-L)，用于同時(shí)測(cè)定一系列蛋白質(zhì)(a-l)(圖8A)。在該情況下，將預(yù)定量的標(biāo)記肽的混合物(基于樣品中各蛋白質(zhì)期望的相對(duì)豐度)加到樣品消化液中(圖8B實(shí)條代表天然肽，虛線條代表加入的穩(wěn)定同位素標(biāo)記監(jiān)測(cè)肽)。用一系列捕獲抗體來(lái)恰好地捕獲這些監(jiān)測(cè)肽(天然的及標(biāo)記的形式)。這些抗體(在適當(dāng)?shù)墓滔嘟橘|(zhì)上)優(yōu)選以相對(duì)量組合以使得捕獲近似相等量的每種監(jiān)測(cè)肽，而與這些肽在消化液中的量無(wú)關(guān)，因此在洗脫到MS中時(shí)產(chǎn)生了近似等摩爾的監(jiān)測(cè)肽混合物(圖8C)。如果抗體親和性高，那么通過(guò)制備柱或近似等量的每種抗體固定在其上的其他親和性支持物，并使足夠量的樣品消化液通過(guò)該支持物使得所有抗體可結(jié)合達(dá)到飽和，而實(shí)現(xiàn)該目的。如果一種或多種抗體具有較低的親和性，那么需要更多該抗體以便于獲得捕獲及釋放肽的近似相等的化學(xué)計(jì)量。高豐度監(jiān)測(cè)肽的大部分將不結(jié)合(超過(guò)了在支持物上的捕獲抗體的量)，而低豐度的肽僅飽和各自的捕獲抗體而未有顯現(xiàn)于流通(未結(jié)合)的部分。通過(guò)使監(jiān)測(cè)肽在豐度上更接近相等(相比于與它們?cè)跇悠分锌赡芫哂械姆浅２幌嗤呢S度)，LC和MS的動(dòng)態(tài)范圍限制不再成為主要問(wèn)題。如果監(jiān)測(cè)肽(天然和標(biāo)記形式)的質(zhì)量足夠不同以使得MS可解析分辨并定量全部監(jiān)測(cè)肽(以兩種形式)，可以通過(guò)導(dǎo)入MS直接分析監(jiān)測(cè)肽的該組合。使一系列監(jiān)測(cè)肽更接近相等摩爾是允許多路(多分析物)質(zhì)譜法檢測(cè)中主要的進(jìn)步。
或者，結(jié)合的監(jiān)測(cè)肽可施加于LC/MS以使得僅有一種或一些監(jiān)測(cè)肽同時(shí)導(dǎo)入到MS，且可對(duì)MS進(jìn)行預(yù)編程以接連尋找每一監(jiān)測(cè)肽。這樣，為測(cè)定一系列監(jiān)測(cè)肽(代表一系列蛋白質(zhì)分析物)，將全部相應(yīng)的同位素標(biāo)記肽標(biāo)準(zhǔn)物加入消化液中(如上所述通過(guò)計(jì)算機(jī)化的液體操作系統(tǒng)制備)，并然后將洗脫的肽(現(xiàn)在由一系列帶有它們相應(yīng)標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)物的監(jiān)測(cè)肽)導(dǎo)入層析柱(如C18反相柱，也在計(jì)算機(jī)控制下形成部分層析系統(tǒng))并從該反相柱上由梯度(通常含有0.05％三氟乙酸的0-70％乙腈水溶液)洗脫(通常經(jīng)過(guò)5-30分鐘)。將輸出(柱的洗脫液)導(dǎo)入質(zhì)譜儀，結(jié)果是任意一次只出現(xiàn)一種或一些監(jiān)測(cè)肽，這樣使MS可單獨(dú)測(cè)定每一種而不存在其他監(jiān)測(cè)肽的潛在干擾。進(jìn)行起始操作，在起始操作的過(guò)程中，通過(guò)掃描所有洗脫肽的質(zhì)量確定每一監(jiān)測(cè)肽的洗脫時(shí)間。在接下來(lái)的操作中，可將LC/MS系統(tǒng)編程為查看已知質(zhì)量的標(biāo)記和未標(biāo)記形式的監(jiān)測(cè)肽的正確洗脫時(shí)間，因而將更多的測(cè)定時(shí)間給予目的監(jiān)測(cè)肽而不是掃描所有的肽質(zhì)量。
以此方式，使用捕獲抗體進(jìn)行富集的該披露方法可平行對(duì)許多蛋白質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，在樣品中具有非常不同的相對(duì)豐度的一系列蛋白質(zhì)可在單次MS或LC/MS操作中進(jìn)行定量。監(jiān)測(cè)肽豐度的均衡化(“化學(xué)計(jì)量平衡”)是關(guān)鍵的思想，且它克服了用MS定量的關(guān)鍵性問(wèn)題，即現(xiàn)有系統(tǒng)可獲得的有限的動(dòng)態(tài)范圍。
在第三平行實(shí)施例中，測(cè)定在樣品中具有不同豐度的一系列蛋白質(zhì)，但我們希望對(duì)大量蛋白質(zhì)節(jié)省使用標(biāo)記監(jiān)測(cè)肽。(圖9)。例如，血清白蛋白、補(bǔ)體C2和甲狀腺球蛋白在人血清中的豐度不同，相差的級(jí)數(shù)接近1000倍(在濃度上相對(duì)為106∶103∶1)。如果用酶(如胰蛋白酶)將血漿樣品消化為肽，那么來(lái)源于這三種蛋白質(zhì)的監(jiān)測(cè)肽在數(shù)量上也以同樣的系數(shù)而不同(假設(shè)全部消化)。現(xiàn)在建議的定量方法的基礎(chǔ)是1)選擇適宜化學(xué)性質(zhì)的至少一種肽來(lái)代表每一種將進(jìn)行測(cè)定的蛋白質(zhì)(監(jiān)測(cè)肽)；2)以相同于天然肽(來(lái)源于樣品)的濃度加入同位素標(biāo)記形式的每種監(jiān)測(cè)肽，因而提供了一種內(nèi)部定量標(biāo)記物，其在質(zhì)譜儀中可通過(guò)質(zhì)量進(jìn)行區(qū)分但與天然肽化學(xué)性質(zhì)相同；3)通過(guò)捕獲將每一監(jiān)測(cè)肽(天然和同位素標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)物)富集在特異性抗肽抗體上，并在洗滌后洗脫；及4)在質(zhì)譜儀中分析所富集的監(jiān)測(cè)肽，從而確定測(cè)定的天然對(duì)同位素標(biāo)記的肽的比例。該比例給出了原始分析蛋白質(zhì)相對(duì)與加入的同位素標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)物的數(shù)量。
在該實(shí)施方案中，注意由于優(yōu)選以與等價(jià)天然肽(實(shí)條，圖9中的系列1)相同濃度加入標(biāo)記肽標(biāo)準(zhǔn)物(虛線條，圖9中的系列2)；也就是，內(nèi)標(biāo)物以相同于所定量的監(jiān)測(cè)肽的濃度而存在，那么白蛋白監(jiān)測(cè)肽必須以1000倍C2監(jiān)測(cè)肽的量及1000000倍甲狀腺球蛋白的量加入(由于這三種蛋白質(zhì)通常以該相對(duì)濃度存在)。當(dāng)甲狀腺球蛋白肽可檢測(cè)時(shí)，1000000倍高濃度的白蛋白監(jiān)測(cè)肽無(wú)疑是太過(guò)量了，并且加入對(duì)于甲狀腺球蛋白監(jiān)測(cè)肽所需量的1000000倍浪費(fèi)了標(biāo)記的白蛋白監(jiān)測(cè)肽(該肽通常通過(guò)合成制成)。因此在該實(shí)施方案中(圖9C)，制備了血漿肽消化液的三種子樣品一種未稀釋的(加入其中的是所需量的甲狀腺球蛋白標(biāo)記監(jiān)測(cè)肽，及組3豐度類型中的其他蛋白的監(jiān)測(cè)肽圖9)，第二種稀釋了大約1000倍(組2，在其中我們加入了大約同樣數(shù)量的標(biāo)記的補(bǔ)體C2監(jiān)測(cè)肽)，第三種稀釋了大約1000000倍(組1，在其中加入了白蛋白監(jiān)測(cè)肽)。這樣產(chǎn)生了稀釋樣品，其中檢測(cè)較高量、中量及低量組蛋白質(zhì)，從而需要較少的相應(yīng)標(biāo)記監(jiān)測(cè)肽。在用抗體捕獲和洗脫后，使肽恢復(fù)到近似相同的相對(duì)豐度回收(圖9C)。
在實(shí)踐中，組的數(shù)量(稀釋組)依賴于標(biāo)記肽需要保存的程度，可以大于三。在優(yōu)選的實(shí)施例中，通過(guò)將監(jiān)測(cè)肽根據(jù)樣品中蛋白質(zhì)的各種豐度的種類分組而實(shí)現(xiàn)該原則，將監(jiān)測(cè)肽分為5個(gè)豐度組，每一組只含蓋100倍范圍的蛋白質(zhì)豐度(其加起來(lái)在數(shù)量上跨越10,000,000,000倍)。使組中每一蛋白質(zhì)的標(biāo)記監(jiān)測(cè)肽混合成其成分在彼此的100倍范圍內(nèi)的混合物(根據(jù)樣品中蛋白質(zhì)所期望的相對(duì)豐度設(shè)定相對(duì)豐度)。制備未稀釋的等分和樣品肽消化液的4個(gè)稀釋液(每一個(gè)相對(duì)于后一個(gè)100倍)，在富集和分析步驟(上述4和5)之前將5種標(biāo)記的監(jiān)測(cè)肽混合物加到各稀釋液中。這樣該方法以操作5個(gè)分析物而不是一個(gè)分析物的成本而對(duì)于高豐度蛋白質(zhì)只需要更少的監(jiān)測(cè)肽。由于下述給出的原因，其與其他優(yōu)化因素一致，無(wú)論用什么方法那都限制一個(gè)步驟中分析的肽的數(shù)量。
該實(shí)施方案的主要因素是根據(jù)樣品中各靶蛋白的預(yù)期豐度將肽分成幾組。使用所披露的發(fā)明從探索性研究(掃描一系列這樣的稀釋液以觀察在那一組中可檢測(cè)給定的監(jiān)測(cè)肽)中，或從包括公開(kāi)數(shù)據(jù)的其他定量測(cè)定獲得所需的豐度信息。將所需的數(shù)據(jù)組織成數(shù)據(jù)庫(kù)，與其他標(biāo)準(zhǔn)一起使用來(lái)選擇最佳的監(jiān)測(cè)肽組，通過(guò)復(fù)雜標(biāo)準(zhǔn)使用數(shù)據(jù)庫(kù)系統(tǒng)的能力用來(lái)篩選、排列并分類硅肽中的成千上萬(wàn)種待測(cè)物。
在第四平行實(shí)施例中(圖10)，基于肽的質(zhì)量以如下方式將監(jiān)測(cè)肽分成幾組一組中的肽不重疊。這樣的一組標(biāo)準(zhǔn)示例如下所示假設(shè)選作蛋白a監(jiān)測(cè)肽的肽具有質(zhì)量A(以原子質(zhì)量單位(amu)或道爾頓)并為此示例單獨(dú)帶電(也就是以A的M/Z值檢測(cè))，并且相應(yīng)的同位素標(biāo)記監(jiān)測(cè)肽A具有A+6的質(zhì)量，并且可以假設(shè)兩種肽在它們的譜上具有一系列質(zhì)量類似物，比親代質(zhì)量上升擴(kuò)展了5個(gè)質(zhì)量單位(由于公知的各種穩(wěn)定同位素的天然頻率的結(jié)合)。因此，這些肽的肽峰值相對(duì)于天然肽(圖10中的實(shí)條)在范圍{A，A+1，A+2，A+3，A+4，A+5}上擴(kuò)展，且相對(duì)于穩(wěn)定同位素標(biāo)準(zhǔn)物(圖10中的虛線條)在范圍{A+6，A+7，A+8，A+9，A+10，A+11}上擴(kuò)展，或者換句話說(shuō)在A到A+11amu范圍上。那么假設(shè)人們從具有質(zhì)量A+12的另一蛋白質(zhì)b選擇監(jiān)測(cè)肽B該肽B的質(zhì)量變化峰值將沒(méi)有一個(gè)與肽A的質(zhì)量變化峰值重疊。同樣，人們選擇理想間隔至少12amu的一系列監(jiān)測(cè)肽。這樣，50個(gè)肽的系列可設(shè)置在1000-1600的質(zhì)量范圍內(nèi)。在實(shí)踐中，可用于選擇的肽將不會(huì)理想設(shè)置，并因此可能會(huì)結(jié)合不超過(guò)10個(gè)來(lái)跨越該理論測(cè)定范圍而不發(fā)生重疊。這樣，通過(guò)MS可一次對(duì)這10個(gè)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量，該類是可同時(shí)測(cè)定的一組蛋白質(zhì)。由于肽組將一次導(dǎo)入MS，需要MS可有效地以高運(yùn)行循環(huán)掃描所需的質(zhì)量范圍。在所披露的檢測(cè)方案中，這10個(gè)監(jiān)測(cè)肽加到天然樣品肽消化液中，且可一起用相應(yīng)的10個(gè)抗體來(lái)富集這10個(gè)肽以進(jìn)行分析。
該實(shí)施例的關(guān)鍵元素是基于不重疊質(zhì)量選擇相互協(xié)調(diào)的監(jiān)測(cè)肽的組。
在第五平行實(shí)施例中，結(jié)合上述第三和第四實(shí)施方案。此處，我們選擇同時(shí)滿足下列情況的監(jiān)測(cè)肽組1)在樣品中的親代蛋白質(zhì)豐度類中具有相似性，及2)不重疊的質(zhì)量。這些標(biāo)準(zhǔn)可與披露于基礎(chǔ)單一分析物實(shí)施方案中的其他標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合(親水性、適宜的大小、缺少某些氨基酸，等等)。將如此產(chǎn)生的這些類最優(yōu)化以用于所披露的測(cè)定方法中。它們將可在一個(gè)MS操作中定量的蛋白質(zhì)數(shù)量最大化，并使通常昂貴的穩(wěn)定同位素標(biāo)記的監(jiān)測(cè)肽的耗費(fèi)最小化。這些允許多個(gè)監(jiān)測(cè)肽一次檢測(cè)的策略可與自動(dòng)化方法結(jié)合，以允許大量分析物常規(guī)檢測(cè)。
其他實(shí)施方案另外的一系列實(shí)施方案在可選擇的方法中使用抗肽抗體。
其他實(shí)施例利用通過(guò)MS/MS技術(shù)獲得的作為“從頭”序列的試驗(yàn)觀察的部分肽序列數(shù)據(jù)代替來(lái)源于現(xiàn)存數(shù)據(jù)庫(kù)的序列用于監(jiān)測(cè)肽的設(shè)計(jì)。
另一實(shí)施例(圖11)對(duì)給定的監(jiān)測(cè)肽分析物使用多個(gè)同位素標(biāo)記肽，以一系列水平加入從而生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。在該實(shí)施方案中，合成每種監(jiān)測(cè)肽的兩種或更多形式，其具有不同同位素質(zhì)量。如果該肽序列含有例如3個(gè)組氨酸，該肽(IV1)的一種形式含有單一的同位素標(biāo)記的HIS殘基(6×碳-13；比天然的凈重6道爾頓)，而第二種形式(IV2)含有兩個(gè)，而第三種形式(IV3)含有全部三種重同位素形式的組氨酸。因此這三種修飾的肽比天然形式重6、12、18道爾頓。那么，人們可以在樣品中加入的IV1的量等于1/5的天然形式的期望的量，IV2的量等于所期望的天然水平，IV3的量等于2倍的天然水平。這樣監(jiān)測(cè)肽的MS譜顯示四個(gè)分離的解析形式，三個(gè)同位素標(biāo)記形式給出了覆蓋所期望值周圍10倍范圍的內(nèi)標(biāo)物曲線。以此方式，在每一樣品中可相對(duì)于內(nèi)標(biāo)物曲線測(cè)定監(jiān)測(cè)肽。顯然，標(biāo)記的氨基酸與適宜同位素標(biāo)記的任何組合可結(jié)合以設(shè)計(jì)標(biāo)記的在任何質(zhì)量增加的范圍上不同于天然肽并彼此不同的監(jiān)測(cè)肽。
其他實(shí)施方案利用了監(jiān)測(cè)肽中改造產(chǎn)生的特異性的特性，其設(shè)計(jì)為便于用氧-18標(biāo)記監(jiān)測(cè)肽。在此情況下(假設(shè)用胰蛋白酶作為分裂酶)，不用同位素標(biāo)記的氨基酸合成監(jiān)測(cè)肽的擴(kuò)展形式，但在此形式中所加入的c-端殘基開(kāi)始于賴氨酸或精氨酸殘基(例如，n端-MONITOR-lys-gly-ser-gly-cys-c端，如在第一優(yōu)選實(shí)施方案中)。通過(guò)在存在氧-18的水溶液中用胰蛋白酶切割該肽，氧-18的兩個(gè)原子(比天然的重4道爾頓)將被導(dǎo)入最終的監(jiān)測(cè)肽。該方法的優(yōu)點(diǎn)是只需要制造單一形式的監(jiān)測(cè)肽同樣的擴(kuò)展形式可用于免疫、抗體親和純化并作為MS內(nèi)標(biāo)物(在斷裂及氧18導(dǎo)入后)，因而潛在地減少了成本?？蓸?gòu)建其他類似的適于其他酶切割的構(gòu)建體，如果它們斷裂的機(jī)理適于同位素標(biāo)記的導(dǎo)入。
另一實(shí)施方案利用了由標(biāo)記天然肽(來(lái)源于參考樣品的消化液)而不是化學(xué)合成(如上述第一優(yōu)選實(shí)施方案所述)而制備的同位素標(biāo)記監(jiān)測(cè)肽。在該方法中，接下來(lái)進(jìn)行分析的該種參考樣品用同樣的酶或試劑進(jìn)行消化，其中該酶或試劑用于隨后的樣品(例如，胰蛋白酶)而產(chǎn)生肽。然后使這些肽與含同位素標(biāo)記的化學(xué)衍生試劑反應(yīng)。例如，該肽可與氘化碘乙酰胺反應(yīng)，從而將一種標(biāo)記導(dǎo)入所有含半胱氨酸的肽?；蛘?，在用胰蛋白酶斷裂前用氘化碘乙酰胺還原并烷基化樣品蛋白。用未標(biāo)記的碘乙酰胺還原并烷基化要分析的樣品，以使得樣品和標(biāo)記的監(jiān)測(cè)肽在化學(xué)上相同。將標(biāo)記的監(jiān)測(cè)肽混合物(基本上是參考樣品的標(biāo)記的消化液)通常以相同的比例加到試驗(yàn)樣品的消化液中，并使產(chǎn)生的混合物用于對(duì)所選擇監(jiān)測(cè)肽的抗體富集。在該情況下，從靶蛋白質(zhì)中的含半胱氨酸的肽中選擇監(jiān)測(cè)肽。產(chǎn)生的MS讀數(shù)顯示了監(jiān)測(cè)肽(及從而的靶蛋白)在參考樣品和試驗(yàn)樣品之間的豐度比例。由于在該實(shí)施例中，通過(guò)監(jiān)測(cè)肽的化學(xué)修飾導(dǎo)入標(biāo)記物，優(yōu)選通過(guò)用類似修飾的肽進(jìn)行免疫接種而產(chǎn)生富集抗體肽免疫原可以是含半胱氨酸的肽，其中用碘乙酰胺烷基化半胱氨酸?？捎闷渌瘜W(xué)方式在各種氨基酸上導(dǎo)入其他標(biāo)記，或特異性地導(dǎo)入n-端或c-端組。在每一種情況下，對(duì)試驗(yàn)樣品肽進(jìn)行同樣的修飾(只要適宜，或者在消化前或者在消化后，但不具有同位素標(biāo)記)并針相對(duì)適宜修飾的合成肽產(chǎn)生抗體。
或者，用噬菌體展示或其他體外技術(shù)選擇針對(duì)監(jiān)測(cè)肽的抗體。
進(jìn)一步的實(shí)施方案利用多克隆抗體、噬菌體展示抗體(單鏈或Fab)，單功能區(qū)抗體、親和體或其他化學(xué)一致性的蛋白質(zhì)作為肽結(jié)合劑。
在另一可選擇實(shí)施方案中，從母體蛋白質(zhì)消化液而不通過(guò)化學(xué)合成制備免疫肽。
在另一可選擇的實(shí)施方案中，免疫肽可在表達(dá)體系(如大腸桿菌、桿狀病毒、酵母菌)或體外轉(zhuǎn)譯體系(如兔網(wǎng)織紅細(xì)胞、麥芽或大腸桿菌溶菌產(chǎn)物)中作為融合蛋白合成，而不通過(guò)化學(xué)合成。如果需要，可在融合蛋白中產(chǎn)生所需的肽多個(gè)樣板，可通過(guò)結(jié)合的親和標(biāo)記物(例如，F(xiàn)LAG肽或多組氨酸標(biāo)記物)進(jìn)行分離，并可在后來(lái)從融合蛋白上切割(例如，經(jīng)胰蛋白酶)并通過(guò)液體層析或其他方法進(jìn)行純化。用類似的方法通過(guò)將標(biāo)記的氨基酸整合到合成系統(tǒng)中而產(chǎn)生同位素標(biāo)記的監(jiān)測(cè)肽。
在另一可選擇的實(shí)施方案中，富集監(jiān)測(cè)肽(天然和同位素標(biāo)記的)加到靶上用于在MALDI質(zhì)譜儀中進(jìn)行MS分析。
另一實(shí)施方案利用熒光檢測(cè)代替了MS檢測(cè)，并使用了共價(jià)熒光標(biāo)記(例如與半胱氨酸反應(yīng)的Cy3和Cy5染色標(biāo)記)來(lái)標(biāo)記樣品肽和所加入的監(jiān)測(cè)肽。在此情況下，針對(duì)連接染料的抗原產(chǎn)生抗肽抗體，并如下述方式選擇該抗肽抗體它們相對(duì)相等地結(jié)合該兩種形式(例如，Cy3和Cy5)。直接對(duì)來(lái)自抗體的肽的洗脫液進(jìn)行最終的熒光比例檢測(cè)(如果該抗體具有足夠的特異性來(lái)排斥所有的其他肽)，或者緊隨另一分離步驟(例如，反相LC或毛細(xì)管電泳)，在該分離步驟中，Cy3和Cy5肽表現(xiàn)如果不相同，至少表現(xiàn)為可再生的及可解釋的方式(以使得可以可靠預(yù)測(cè)兩種形式的監(jiān)測(cè)肽的洗脫位置用于測(cè)定)。
另一實(shí)施方案利用熒光檢測(cè)，其中用標(biāo)記物(例如，Cy5)標(biāo)記合成的監(jiān)測(cè)肽標(biāo)準(zhǔn)物，并且使樣品消化液保持未標(biāo)記。在該實(shí)施方案中，源于樣品的監(jiān)測(cè)肽與熒光標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)肽競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合相應(yīng)的抗肽抗體。如此使用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，從結(jié)合到抗肽并隨后從抗體洗脫的標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)肽的數(shù)量可推斷源于樣品的肽的濃度。在親代蛋白的高樣品濃度(在消化液中監(jiān)測(cè)肽的濃度高)下較少的標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)肽發(fā)生結(jié)合，并反之亦然。然后分離該熒光標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)肽，并用毛細(xì)管電泳及特別是用于DNA測(cè)序的多通道裝置(例如，ABI3700，Amersham MegaBACE)非常靈敏地進(jìn)行檢測(cè)。
實(shí)施例通過(guò)結(jié)合來(lái)自教科書(shū)、診斷分析目錄及收集的科學(xué)文獻(xiàn)的信息構(gòu)建了在人血漿中通過(guò)各種方式檢測(cè)的289種蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)庫(kù)。將這些蛋白質(zhì)的氨基酸序列下載并以文本字段存儲(chǔ)于微軟Access數(shù)據(jù)庫(kù)中。通過(guò)產(chǎn)生蛋白質(zhì)水解酶片段列表的宏程序在Excel電子表格中處理每一個(gè)蛋白質(zhì)序列。對(duì)每一肽序列計(jì)算一系列參數(shù)，包括長(zhǎng)度、質(zhì)量、在中性pH時(shí)的預(yù)期凈電荷、總帶電基團(tuán)、Hopp-Woods親水性(HWH)和標(biāo)準(zhǔn)化的HWH(HWH/氨基酸數(shù)量)，以及Cys、Trp、Pro和Met殘基的數(shù)量?；谙旅嬗蒃xcel宏估計(jì)的要求進(jìn)行可用的肽的第一次選擇長(zhǎng)度＞7并＜14個(gè)殘基，沒(méi)有Cys、Met或Trp殘基，標(biāo)準(zhǔn)HWH＞-0.5并＜0.5，且質(zhì)量＞800。將結(jié)果(肽序列及所計(jì)算的參數(shù))存儲(chǔ)在數(shù)據(jù)庫(kù)中。這樣派生出總共10204種肽，其中751種符合起始的需要。
為證明原理試驗(yàn)，為四種蛋白質(zhì)分析物中的每一種選擇一種監(jiān)測(cè)肽TNF、IL-6、血紅素蛋白和α-1-抗胰凝乳蛋白酶。當(dāng)來(lái)自蛋白質(zhì)的多種肽都適合起始要求時(shí)，對(duì)含有脯氨酸(由于期望該氨基酸增加免疫原性)的肽給出優(yōu)先選擇。對(duì)每一序列所產(chǎn)生的合成肽具有四個(gè)殘基的伸長(zhǎng)(GSGC或CGSG)，這使得經(jīng)末端Cys殘基與鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)載體結(jié)合。在TNFα肽的情況下，合成兩種形式的監(jiān)測(cè)肽一種具有N-端延伸，另一種具有C-端延伸(所有其他的肽攜帶C-端延伸)。該肽序列(下劃線為延伸)是IL-6 具有C端延伸GSGC的殘基83-94血紅素蛋白 具有C端延伸GSGC的殘基92-102α-1-抗胰凝乳蛋白酶具有C端延伸GSGC的殘基307-314TNF-αC-端 具有C端延伸GSGC的殘基66-78每一種肽連接到白蛋白載體上，并根據(jù)短期免疫方案注射兩只兔。通過(guò)ELISA試驗(yàn)使用固定在微孔盤上的肽監(jiān)控抗體的產(chǎn)生。對(duì)每種肽，將來(lái)自兩只兔抗血清中較好的那種的多克隆抗體(基于更高的ELISA信號(hào)顯示更多或更高親和性的抗體)在含硫醇的瓊脂糖上以適當(dāng)方向固定肽的柱上進(jìn)行免疫親和純化。
將免疫純化抗體以定向方式固定在POROS蛋白G樹(shù)脂上(AppliedBiosystems)。一旦抗體通過(guò)蛋白A與抗體分子Fc部分的特異性相互作用而連接，則根據(jù)生產(chǎn)者的說(shuō)明通過(guò)與鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)接觸實(shí)現(xiàn)共價(jià)交聯(lián)。洗滌該抗肽抗體POROS(APA-POROS)支持物并將其保存在4℃。
用壓有1000psig氦的高壓瓶將含有該支持物的毛細(xì)管微柱(1厘米×100微米)包在預(yù)制的裝有玻璃料的毛細(xì)管(New Objectives)中。攜帶著針對(duì)上述試驗(yàn)的前四個(gè)肽的兔多克隆AB的支持物分別與四種各自標(biāo)記的監(jiān)測(cè)肽的混合物接觸。洗滌該支持物并用10微升10％醋酸將結(jié)合肽洗脫到毛細(xì)管C18反相柱，其后通過(guò)在0.05甲酸中的0％-70％CAN梯度洗脫到Qtrap(Applied Biosystem)MS系統(tǒng)的ESI源。平均起來(lái)，抗體支持物顯示對(duì)“正確”監(jiān)測(cè)肽的100倍的富集。
權(quán)利要求
1.一種用于定量樣品中至少一種靶蛋白數(shù)量的方法，包括以下步驟1)將樣品消化以提供肽，2)制備至少一種經(jīng)標(biāo)記的含所述靶蛋白亞序列的監(jiān)測(cè)肽從而提供內(nèi)標(biāo)物，3)將含已知量的標(biāo)記的合成肽的步驟2)產(chǎn)物的一等份加到步驟1)產(chǎn)物中去，4)將步驟3)產(chǎn)物裝載在至少一種支持物上，該支持物上連接有至少一種結(jié)合至少一種監(jiān)測(cè)肽的結(jié)合劑，5)洗滌步驟4)的支持物以除去未結(jié)合的肽，6)從結(jié)合到支持物上的結(jié)合劑上洗脫監(jiān)測(cè)肽，7)將存在于步驟6)所得洗脫液中的至少一種監(jiān)測(cè)肽進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)從而通過(guò)與標(biāo)記的合成標(biāo)準(zhǔn)物比較而確定消化液中監(jiān)測(cè)肽的數(shù)量。
2.如權(quán)利要求1的方法，其中標(biāo)記物是穩(wěn)定的同位素或其混合物。
3.如權(quán)利要求2的方法，其中同位素是15N。
4.如權(quán)利要求2的方法，其中同位素是13C。
5.如權(quán)利要求2的方法，其中同位素是18O。
6.如權(quán)利要求1的方法，其中在步驟4)中，結(jié)合劑是抗體。
7.如權(quán)利要求6的方法，其中該抗體是單克隆抗體。
8.如權(quán)利要求6的方法，其中該抗體是多克隆抗體。
9.如權(quán)利要求1的方法，其中在步驟4)中，結(jié)合劑是RNA適體。
10.如權(quán)利要求1的方法，其中結(jié)合劑是可再循環(huán)的結(jié)合劑。
11.如權(quán)利要求1的方法，其中固體支持物由珠子構(gòu)成。
12.如權(quán)利要求1的方法，其中固體支持物是填充柱。
13.如權(quán)利要求1的方法，其中固體支持物是單片多孔支持物。
14.如權(quán)利要求1的方法，其中支持物具有至少一個(gè)開(kāi)口，所述開(kāi)口具有將結(jié)合劑結(jié)合在其上的表面。
15.如權(quán)利要求1的方法，其中結(jié)合劑結(jié)合在其上的支持物具有親水可塑性。
16.如權(quán)利要求1的方法，其中支持物是網(wǎng)孔。
17.如權(quán)利要求1的方法，其中支持物是凝膠。
18.如權(quán)利要求1的方法，其中結(jié)合劑結(jié)合在其上的支持物具有疏水可塑性表面。
19.如權(quán)利要求1的方法，其中流路是可重構(gòu)的流路。
20.如權(quán)利要求1的方法，其中可在步驟4)的裝載和步驟6)的洗脫之間對(duì)流路進(jìn)行調(diào)整，以使得每個(gè)支持物單獨(dú)洗脫。
21.如權(quán)利要求1的方法，其中在步驟7)中，在導(dǎo)入質(zhì)譜儀后使肽斷裂。
22.如權(quán)利要求1的方法，其中在步驟7)中，肽不斷裂，而該肽以它們導(dǎo)入質(zhì)譜儀中的形式檢測(cè)。
23.如權(quán)利要求1的方法，其中用不同的標(biāo)記原子標(biāo)記特定的合成的監(jiān)測(cè)肽，以使得具有相同氨基酸序列的標(biāo)記的監(jiān)測(cè)肽在質(zhì)量上有所不同。
24.如權(quán)利要求1的方法，其中在步驟2)制備至少兩種不同的標(biāo)記的監(jiān)測(cè)肽，將標(biāo)記的監(jiān)測(cè)肽混合物加到步驟1)產(chǎn)物中，且其后在步驟4)將步驟3)產(chǎn)物裝載于帶有多種結(jié)合劑的支持物系統(tǒng)上，至少一種這樣的結(jié)合劑優(yōu)先結(jié)合特定的監(jiān)測(cè)肽。
25.如權(quán)利要求24的方法，其中選擇不同的監(jiān)測(cè)肽以優(yōu)化質(zhì)譜儀的差示檢測(cè)。
26.如權(quán)利要求1的方法，其中在步驟2)中制備至少兩種不同的標(biāo)記的監(jiān)測(cè)肽，將標(biāo)記的監(jiān)測(cè)肽混合物加到步驟1)產(chǎn)物中，且其后在步驟4)將步驟3)產(chǎn)物順序裝載于支持物上，每一支持物具有優(yōu)選與一種特定序列結(jié)合的結(jié)合劑，其后將每一支持物進(jìn)行洗脫，且其后將每一洗脫樣品分別導(dǎo)入質(zhì)譜儀中。
27.一種用于從樣品中捕獲相似量的兩種或更多種不同監(jiān)測(cè)肽的方法，該樣品含有寬泛變化濃度的不同監(jiān)測(cè)肽，該方法包括以下步驟1)使樣品蛋白質(zhì)片段化，2)產(chǎn)生標(biāo)記的監(jiān)測(cè)肽，3)將步驟1)產(chǎn)物加到含有已知量的標(biāo)記監(jiān)測(cè)肽的步驟2)產(chǎn)物中，4)制備至少一種支持物，該支持物具有至少一種結(jié)合樣品中較豐富的肽的小部分的結(jié)合劑及至少一種結(jié)合樣品中較少量肽的更高比例部分的結(jié)合劑，5)將步驟3)產(chǎn)物裝載于步驟4)所制備的支持物上，6)洗滌步驟5)的支持物，然后7)從該支持物上洗脫該肽從而獲得監(jiān)測(cè)肽，及8)使步驟7)的洗脫物進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。
28.一種用于從肽樣品中收集一種以上監(jiān)測(cè)肽的支持物系統(tǒng)，其中樣品中的至少一種監(jiān)測(cè)肽以比至少另一種監(jiān)測(cè)肽大許多的濃度存在，所述支持物具有連接在其上的第一結(jié)合劑和第二結(jié)合劑，該第一結(jié)合劑施加到所述支持物上以只結(jié)合高濃度監(jiān)測(cè)肽的小部分，而第二結(jié)合劑施加到所述支持物上以結(jié)合樣品中低濃度的監(jiān)測(cè)肽的較高比例部分。
29.如權(quán)利要求28的支持物，其中每種結(jié)合的監(jiān)測(cè)肽比例量依賴于每種結(jié)合劑的量。
30.如權(quán)利要求28的支持物，其中每種結(jié)合的監(jiān)測(cè)肽比例量依賴于每種結(jié)合劑的親和性。
31.一種含有至少一種標(biāo)記監(jiān)測(cè)肽的試劑盒，其中該試劑盒進(jìn)一步含有至少一種結(jié)合劑用于捕獲至少一種監(jiān)測(cè)肽。
32.一種測(cè)定樣品蛋白水解消化過(guò)程的方法，包括以下步驟1)選擇來(lái)源于樣品中一種已知蛋白序列的至少兩種監(jiān)測(cè)肽，其中已知至少一種所述的監(jiān)測(cè)肽相對(duì)于至少一種其他的監(jiān)測(cè)肽在參考消化的時(shí)間過(guò)程中較早釋放。2)在消化過(guò)程中的一個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定所述監(jiān)測(cè)肽的數(shù)量，及3)用數(shù)學(xué)方法比較所述監(jiān)測(cè)肽的相對(duì)量從而計(jì)算反映消化相對(duì)于所述參考消化的時(shí)間過(guò)程已進(jìn)行程度的指數(shù)。
33.如權(quán)利要求32的方法，進(jìn)一步包括使用所述指數(shù)來(lái)確定為推斷樣品中至少一種蛋白質(zhì)的量的目的的樣品消化的可接受性，其中所述推斷基于對(duì)源自所述蛋白質(zhì)序列的至少一種監(jiān)測(cè)肽的測(cè)定。
34.如權(quán)利要求32的方法，進(jìn)一步包括使用所述指數(shù)來(lái)校正所述消化液中至少一種監(jiān)測(cè)肽的測(cè)定，從而估計(jì)如果該消化已進(jìn)行至與在所述參考消化時(shí)間過(guò)程中的特定的點(diǎn)參考消化液的相同程度時(shí)所獲得的測(cè)定。
35.一種確定樣品中至少一種靶蛋白數(shù)量的方法，包括以下步驟1)將樣品消化以提供肽，2)制備至少一種經(jīng)標(biāo)記的含所述靶蛋白序列的合成監(jiān)測(cè)肽從而提供內(nèi)標(biāo)物，3)將含已知量的標(biāo)記的監(jiān)測(cè)肽的步驟2)產(chǎn)物的一等份加到步驟1)產(chǎn)物中，4)將步驟3)產(chǎn)物裝載在至少一種支持物上，該支持物在其上連接有至少一種結(jié)合至少一種監(jiān)測(cè)肽的結(jié)合劑，5)洗滌步驟4)的支持物以除去未結(jié)合的肽，6)從結(jié)合于步驟4)的支持物上的結(jié)合劑上洗脫監(jiān)測(cè)肽，7)將步驟6)洗脫的監(jiān)測(cè)肽裝載于其上連接有至少一種結(jié)合劑的第二支持物上，該結(jié)合劑不同于步驟4)的結(jié)合劑并與至少一種監(jiān)測(cè)肽結(jié)合，8)洗滌步驟7)的支持物從而除去未結(jié)合的肽，9)從結(jié)合于步驟7)中的支持物上的結(jié)合劑上洗脫監(jiān)測(cè)肽，及10)使步驟9)獲得的洗脫液進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)從而通過(guò)與標(biāo)記的合成標(biāo)準(zhǔn)物比較而確定在洗脫液中監(jiān)測(cè)肽的數(shù)量。
36.一種表征樣品中靶蛋白結(jié)構(gòu)的方法，所述方法包括如下步驟1)使所述樣品的一等份進(jìn)行變性操作，2)消化步驟1)產(chǎn)物，3)消化所述樣品的未經(jīng)變性的第二等份，4)制備至少一種經(jīng)標(biāo)記的含所述靶蛋白序列的合成監(jiān)測(cè)肽從而提供內(nèi)標(biāo)物，5)對(duì)步驟2)產(chǎn)物加入已知量的步驟4)產(chǎn)物，6)對(duì)步驟3)產(chǎn)物加入相同的已知量的步驟4)產(chǎn)物，7)將步驟5)和6)的每一種產(chǎn)物裝載到分離的支持物上，所述支持物在其上連接有至少一種結(jié)合所述監(jiān)測(cè)肽的結(jié)合劑，8)洗滌步驟7)中制備的各種支持物，9)從每種支持物上洗脫所述肽，10)使步驟9)獲得的每種洗脫液進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，及11)比較每種洗脫液中監(jiān)測(cè)肽的數(shù)量。
37.如權(quán)利要求1的方法，其中在步驟2)中，監(jiān)測(cè)肽是合成肽。
38.如權(quán)利要求1的方法，其中通過(guò)天然肽的化學(xué)修飾導(dǎo)入該標(biāo)記物。
39.如權(quán)利要求38的方法，其中化學(xué)修飾將額外的原子結(jié)合到監(jiān)測(cè)肽上。
40.如權(quán)利要求39的方法，其中選擇結(jié)合劑來(lái)結(jié)合監(jiān)測(cè)肽經(jīng)化學(xué)修飾的結(jié)構(gòu)。
41.如權(quán)利要求40的方法，其中將樣品肽進(jìn)行同樣的化學(xué)修飾但不導(dǎo)入標(biāo)記物。
42.如權(quán)利要求31的試劑盒，其另外含有支持物。
43.如權(quán)利要求42的試劑盒，其中結(jié)合劑連接于支持物上。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于測(cè)定樣品中靶蛋白數(shù)量的經(jīng)濟(jì)的流通型方法。用一種抗體制劑(不論是多克隆、單克隆或任何等價(jià)的特定結(jié)合劑)來(lái)捕獲并從而富集特定的監(jiān)測(cè)肽(在復(fù)雜蛋白樣品的蛋白水解液中要定量的蛋白質(zhì)的特定肽片段)及內(nèi)標(biāo)肽(具有同樣的化學(xué)結(jié)構(gòu)但包括穩(wěn)定的同位素標(biāo)記)。當(dāng)洗脫到適宜的質(zhì)譜儀中時(shí)，對(duì)天然的(源于樣品的)和內(nèi)標(biāo)(同位素標(biāo)記)肽進(jìn)行定量，其所測(cè)定的豐度比較用計(jì)算起始樣品中監(jiān)控肽及其母體蛋白的數(shù)量。
文檔編號(hào)G01NGK1714145SQ200380103688
公開(kāi)日2005年12月28日 申請(qǐng)日期2003年10月2日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月3日
發(fā)明者諾曼·利·安德森 申請(qǐng)人:諾曼·利·安德森