專利名稱：表面處理的制作方法
發(fā)明
背景技術(shù)：
領(lǐng)域本發(fā)明一般性地涉及表面處理，并具體涉及通過分子化學(xué)吸附(molecular chemisorption)處理表面，例如生物傳感器(biosensor)表面的方法和裝置。
相關(guān)技術(shù)生物傳感器陣列的制備通常涉及將生物分子圖案化沉積(patterneddeposition)到表面上。靈敏性、再現(xiàn)性和選擇性是生物傳感器品質(zhì)的重要方面。靈敏性通常是通過有效捕獲目標分子的化學(xué)吸附的捕獲分子的致密層獲得的。再現(xiàn)性通常取決于可高度再現(xiàn)的錨定化學(xué)(anchoring chemistry)和捕獲分子的良好品質(zhì)圖案。選擇性通常取決于目標分子的高度選擇性和其它分子的低的非選擇性吸附。由于后者占待檢測信號的30％，因而限制生物傳感器的效用。
生物偶聯(lián)(Bioconjugation)涉及連接體分子以形成具有各單一組分的組合性質(zhì)的復(fù)合物(complex)。天然和合成化合物以及它們的活化物(activities)可以化學(xué)結(jié)合，以設(shè)計具有所需性能的物質(zhì)。例如，與復(fù)合混合物中的目標分子結(jié)合的蛋白質(zhì)可以與能夠被檢測的另一分子交聯(lián)，形成可追蹤的偶聯(lián)物。該檢測成分提供了目標成分的可見性，以制備可以在通過各種方法后定位的復(fù)合物，或用于測量的復(fù)合物。
生物偶聯(lián)影響了生命科學(xué)的眾多領(lǐng)域。應(yīng)用交聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生具有特殊活性的新型偶聯(lián)物使得能夠化驗用于檢測細胞成分和治療疾病的微量物質(zhì)。將一個分子與另一個分子化學(xué)連接的能力產(chǎn)生了服務(wù)于研究、診斷和治療市場的成長工業(yè)。生物檢定的一個重要部分現(xiàn)在是通過使用與溶液中、細胞中或組織中的特定分析物相互作用的偶聯(lián)物進行的。偶聯(lián)物分子、反應(yīng)物系統(tǒng)和生物偶聯(lián)物技術(shù)的應(yīng)用概述于G.T.Hermanson的″BioconiugateTechniques″，Academic Press，San Diego，1996。
用于生物環(huán)境中的表面見于分子和細胞生物學(xué)技術(shù)中，例如在細胞培養(yǎng)、隱形眼鏡、植入的假體、導(dǎo)管和用于儲存蛋白質(zhì)的容器中酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme Linked Inmmunosorbent Assay，ELISA)用的底物(substrates)。許多這樣的表面經(jīng)過自發(fā)吸附而快速涂覆有蛋白質(zhì)層。某些具有有利的效果。其它是不利的。對于鑒別用于抵抗蛋白質(zhì)吸附的生物″惰性″材料存在更多的興趣。用于引入這種抵抗性的常規(guī)表面處理法涉及用聚(乙二醇)(PEG)涂覆表面。例如，參見J.M.Harris編輯的Poly(ethylene glycol)ChemistryBiotechnical and Biomedical Applications，Plenum，New York，1992。PEG的進一步詳細信息，參見Gombotz，W.R.等人的J.Biomed.Matter.Res.15，1547-1562(1991)?？商鎿Q的方法涉及牛血清清蛋白的預(yù)吸附。然而，該方法存在蛋白質(zhì)隨時間變性或蛋白質(zhì)與其它分子交換的問題。因此，該方法不適合應(yīng)用于通過質(zhì)譜(mass)或伯胺檢測蛋白質(zhì)存在的生物傳感器。短鏈PEG低聚物(n＝2-7)的自組合單層也顯示出抵抗蛋白質(zhì)吸附。例如，參見Mrksich，M.和Whitesides，G.M.，Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.25，55-78(1996)。然而，企圖吸附的蛋白質(zhì)會壓縮PEG并使PEG去溶劑化。這些作用都是非常不利的。參見，例如Jeon，S.I.和Andrade，J.D.″Protein surfaceinteractions in the presence of polyethylene oxideeffect of Protein size″、J.Coll.Interface Sci.142，159-166(1991)；和Jeon，S.I.，Lee，J.H.，Adrade，J.D.和deGennes，P.G.，″Protein surface interactions in the presence of polyethyleneoxidesimplified theory″，J.Coll.Interface Sci.142，149-158(1991))。
生物傳感器表面通常由硼硅酸鹽玻璃形成?，F(xiàn)在將描述將捕獲分子，例如抗體或DNA低聚物結(jié)合到生物傳感器表面的各種常規(guī)方案。
參考圖1A，在一種常規(guī)方案中，直接化學(xué)吸附或物理吸附將捕獲分子10結(jié)合到表面20上。表面20由相對短的連接體分子30官能化。例如，表面20可以胺官能化的。連接體30將捕獲分子10固定在表面20上。一般可以通過嚴格洗滌除去也存在于表面20上的不需要的分子，以優(yōu)化生物傳感器的選擇性。然而，洗滌可以除去物理吸附的分子。化學(xué)吸附的分子更耐洗。參考圖1B，該方案留下了許多暴露的連接體30。這導(dǎo)致其它分子40的更多非特異性化學(xué)吸附或物理吸附。這降低了生物傳感器的選擇性。通過特定相互作用結(jié)合的分子與通過非特異性相互作用結(jié)合的分子的比例降低了。盡管捕獲分子10的選擇性可能在溶液中高，其它分子40的存在使許多檢測方法復(fù)雜。此外，捕獲分子10的直接物理吸附或化學(xué)吸附限制了分子活動性(mobility)。極少捕獲分子10具有全部功能性。因此降低了捕獲分子10的靈敏性。在捕獲分子10用于結(jié)合檢驗(binding assay)時，通常降低了結(jié)合效率。親合常數(shù)和結(jié)合動力學(xué)隨化學(xué)吸附的取向而變化。這導(dǎo)致較少的目標分子70，例如結(jié)合到表面20的抗原。而且，在不同表面之間具有更高的結(jié)合可變性。如果使用的檢測方案不能區(qū)分目標分子70和其它分子40，那么顯著降低了生物傳感器的有效特異性。這在無標記和標記檢測方案中都是很普通。嚴格洗滌不總能解決該問題，這是因為在非特異性結(jié)合期間，合作效應(yīng)事實上是不可逆的。
參考圖1C，在另一常規(guī)方案中，捕獲分子10通過間隔物分子(spacermolecule)50化學(xué)吸附到表面20。如前面所指出的，捕獲分子10的化學(xué)吸附允許更嚴格的洗滌過程，如此減少了非特異物理吸附的分子。間隔物50比前面參考圖1A所述的連接體30長。間隔物50將捕獲分子10束縛到表面20上。然而，間隔物50還允許捕獲分子10相對于表面20的受限移動。這允許捕獲分子10增加活性。改善了捕獲分子10的活動性并由此改善了其功能性。因此增加了通過間隔物50化學(xué)吸附的捕獲分子10的結(jié)合效率。然而，參考圖1D，暴露表面20和間隔物50允許其它分子40的非特異性結(jié)合。非特異性結(jié)合可以如圖1B排列所示的大致相同的量出現(xiàn)。
參考圖1E，在圖1C方案的改進中，在生物相容分子60的海洋內(nèi)，捕獲分子20通過間隔物50錨定到表面20。生物相容分子60可抵抗其它分子40的非特異性吸附，這改善了表面20的有效特異性。參考圖IF，因為表面20更少暴露，所以減少了非特異性結(jié)合。只有間隔物50和捕獲分子10提供了其它分子40的非特異性結(jié)合位置。通過除去非特異結(jié)合分子40多于特異性結(jié)合分子10，嚴格洗滌能夠進一步改善特異性。
生物傳感器對非特異性吸附的敏感性還取決于使用的標記和檢測方案。例如，夾心ELISA檢驗不敏感，這是因為測量的信號僅僅取決于目標抗原分子10的數(shù)目和標記抗體用來結(jié)合到表面20的特異性。該方法是惰性的，因為其涉及雙重選擇性檢測。然而，無標記檢測方案對非特異性吸附到表面20的其它分子40更敏感。這些方案通過質(zhì)量或折射率測量存在于表面20上的蛋白質(zhì)/DNA。在非特異性吸附上，比夾心ELISA生物傳感器需要更多的控制。當通過化學(xué)標記技術(shù)檢測結(jié)合分子時，對非特異性吸附和特異信號產(chǎn)生的控制也很重要。當化學(xué)標記顯示出與化學(xué)吸附中涉及的化學(xué)基團的交叉反應(yīng)性時，特別需要這種控制?？梢约尤胝系K物(barrier)以防止接近這些基團。然而，非特異性吸附的BSA阻斷(blocking)不總是可能的，因為BSA產(chǎn)生信號并降低生物傳感器的“有效”選擇性。
核酸適體(aptamers)可用于生物傳感器制造，因為它們可以形成三維結(jié)構(gòu)。適體也可以以可接收的親合性和特異性結(jié)合一定范圍的目標分子。同樣，適體可以以與蛋白質(zhì)分子相似的方式發(fā)揮作用。例如，適體能夠由于配體-結(jié)合改變結(jié)構(gòu)。有許多可用于生物傳感器陣列的不同受體。然而，適體由于許多原因而特別有用。其原因之一是適體能夠比抗體更容易地設(shè)計。在選擇后，適體可以降低到30-60核苷酸殘基核心序列，而不降低結(jié)合功能。另一原因是可以通過化學(xué)合成容易地導(dǎo)入修飾，例如熒光報道分子。另一原因是適體結(jié)構(gòu)主要是沃森-克里克(Watson-Crick)堿基配對功能。二級結(jié)構(gòu)相互作用允許適體比抗體更容易地轉(zhuǎn)變?yōu)槭荏w。
參考圖2A，在制造前述參考圖1F的生物傳感器的常規(guī)方法中，以胺官能化的適體120形式的捕獲分子交聯(lián)到玻璃表面20上。該表面首先用APTS(3-氨丙基三乙氧基硅烷)100官能化。然后通過以雙官能琥珀酰亞胺交聯(lián)劑(BS3)110形式的間隔物進行上述交聯(lián)。
在捕獲分子10的這種化學(xué)吸附后，剩下的交聯(lián)間隔物50和胺表面20用單官能化的琥珀酰亞胺封閉以覆蓋胺，和用乙醇胺封閉以飽和未反應(yīng)的琥珀酰亞胺基團。任何殘留的表面積可以用PEG處理。這些后-化學(xué)吸附步驟降低了非特異性蛋白質(zhì)吸附。然而，如前面所指出的，在捕獲分子10和間隔物50之間的空間仍然可以反應(yīng)。這些空間接收非特異性蛋白質(zhì)吸附。BS3間隔物對于許多蛋白質(zhì)太短，并產(chǎn)生前面參考圖1A所述的問題。此外，官能化、交聯(lián)和封閉步驟都涉及將表面20在不同環(huán)境浴中暴露于不同的環(huán)境中。該方法是費力、費時并浪費原料的。
需要提供用于以改善的捕獲分子的活性、可接近性、容量和特異性，進行捕獲分子的化學(xué)吸附的方法。具體地，需要提供用于制造生物傳感器的方法，該方法不可逆地將捕獲分子結(jié)合到生物傳感器表面；對捕獲分子提供充分的活動性和可接近性，以保留功能性；并使目標抗原或其它分子的非特異性吸附最小化。還需要提供用于制備生物傳感器的方法，該方法的人工、耗時和材料浪費都較小。
發(fā)明概述本發(fā)明提供在表面上產(chǎn)生生物分子單層的方法，包括以下步驟將該表面與雙異官能團試劑(heterobifunctional reagent)的溶液反應(yīng)，其中該試劑具有第一官能團和第二官能團，該第一官能團能夠與表面基團形成共價鍵，該第二官能團與雙同官能團聚合物(homobifunctional polymer)形成共價鍵，以獲得自組裝單層；以及然后將該單層與生物分子反應(yīng)。
本文中使用的術(shù)語生物分子指具有生物功能性的分子。例如，生物分子可以為胺官能化的。同樣地，生物分子可以包括核酸適體衍生物。優(yōu)選地，包括過量的雙同官能團聚合物。優(yōu)選在暴露于該表面前，混合雙異官能團試劑與雙同官能團聚合物。表面可以是玻璃、金屬等。雙異官能團試劑優(yōu)選為氨基烷基三烷氧基硅烷。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，雙異官能團試劑為3-氨丙基三乙氧基硅烷。然而，雙異官能團試劑可以為烷基硫醇。雙異官能團試劑的第二官能團優(yōu)選與雙同官能團聚合物的一個官能團反應(yīng)，以在它們之間形成共價鍵。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，雙同官能團聚合物的官能團是N-羥基琥珀酰亞胺基團。雙同官能團聚合物可以為雙同官能團聚乙二醇。生物分子可以與雙同官能團聚合物的一個官能團反應(yīng)，以在它們之間形成共價鍵。在生物分子和雙同官能團聚合物之間形成的共價鍵優(yōu)選為酰胺鍵。
本發(fā)明的另一方面提供了具有表面層的生物傳感器，其是通過在表面上產(chǎn)生生物分子單層的方法形成的，該方法包括以下步驟使該表面與雙異官能團試劑的溶液反應(yīng)，以獲得自組裝單層，該試劑具有第一官能團和第二官能團，該第一官能團能夠與表面基團形成共價鍵，該第二官能團與雙同官能團聚合物形成共價鍵；和然后使該單層與捕獲分子反應(yīng)。
本發(fā)明的另一方面提供生物傳感器陣列，該陣列包括生物分子在底物上的圖案化的沉積物(patterned deposit)，其中圖案化的沉積物是通過在表面上產(chǎn)生生物分子單層的方法形成的，該方法包括以下步驟使該表面與雙異官能團試劑的溶液反應(yīng)，以獲得自組裝單層，該試劑具有第一官能團和第二官能團，該第一官能團能夠與表面基團形成共價鍵，該第二官能團與雙同官能團聚合物形成共價鍵；和然后使該單層與捕獲分子反應(yīng)。
本發(fā)明的另一方面提供生物芯片，該生物芯片具有通過在表面上產(chǎn)生生物分子單層的方法形成的表面層，該方法包括以下步驟使該表面與雙異官能團試劑的溶液反應(yīng)，以獲得自組裝單層，該試劑具有第一官能團和第二官能團，該第一官能團能夠與表面基團形成共價鍵，該第二官能團與雙同官能團聚合物形成共價鍵；和然后使該單層與生物分子反應(yīng)。
本發(fā)明的另一方面提供生物芯片陣列，該陣列包括生物分子在底物上的圖案化的沉積物，其中圖案化的沉積物是通過在表面上產(chǎn)生生物分子單層的方法形成的，該方法包括以下步驟使該表面與雙異官能團試劑的溶液反應(yīng)，以獲得自組裝單層，該試劑具有第一官能團和第二官能團，該第一官能團能夠與表面基團形成共價鍵，該第二官能團與雙同官能團聚合物形成共價鍵；和然后使該單層與生物分子反應(yīng)。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，提供用于將捕獲分子結(jié)合到生物傳感器表面的簡單的兩步化學(xué)方法。該方法使用在各端具有琥珀酰亞胺基團的雙同官能團PEG交聯(lián)劑，將捕獲分子化學(xué)吸附到表面上，其密度合再現(xiàn)性比迄今為止可能獲得的更高。該方法改善了生物檢定的靈敏性和選擇性。還提供了用于高產(chǎn)率、經(jīng)濟性地處理生物傳感器表面的流程和裝置。
在特別優(yōu)選的本發(fā)明實施方式中，提供將間隔物分子結(jié)合到干凈玻璃表面的方法。該方法涉及雙異官能團試劑，例如3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTS)與雙同官能團聚合物，例如雙同官能團琥珀酰亞胺末端官能化的PEG聚合物之間的不對稱反應(yīng)。在無水溶劑中進行該反應(yīng)。使用高濃度以有利于生物分子反應(yīng)。本發(fā)明還提供用于將少量預(yù)反應(yīng)試劑施加到玻璃表面以便節(jié)省昂貴的試劑的裝置。


現(xiàn)在將參考附圖，通過實施例，描述本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，附圖中圖1A為顯示表面上捕獲分子的直接吸附的生物傳感器表面剖視圖；圖1B為顯示其它分子對圖1A所示排列的非特異性化學(xué)吸附的表面的剖視圖；圖1C為顯示捕獲分子經(jīng)過間隔物分子的化學(xué)吸附的表面剖視圖；圖1D為顯示其它分子對圖1C所示的排列的非特異性化學(xué)吸附的表面剖視圖；圖1E為顯示在生物相容分子的海洋中，捕獲分子經(jīng)過間隔物分子錨定到表面上的表面剖視圖；
圖1F為顯示其它分子對圖1E所示排列的非特異性化學(xué)吸附的表面剖視圖；圖1G為本發(fā)明優(yōu)選實施方式的剖視圖，其中捕獲分子通過組合的錨定物/間隔物錨定到表面；圖1H為顯示其它分子對圖1G所示排列的非特異性化學(xué)吸附的剖視圖；圖2A為顯示將胺官能化的適體通過雙官能琥珀酰亞胺交聯(lián)劑(BS3)結(jié)合到APTS(3-氨丙基三乙氧基硅烷)官能化的玻璃表面的流程圖；圖2B為顯示將胺官能化的適體結(jié)合到玻璃表面的流程圖，其中該表面用APTS(氨丙基三甲氧基硅烷)和雙同官能團PEG N-羥基琥珀酰亞胺交聯(lián)劑(NHS)在DMSO中的預(yù)處理溶液處理；圖2C顯示在DMSO中將APTS(氨丙基三甲氧基硅烷)結(jié)合到雙同官能團PEG N-羥基琥珀酰亞胺交聯(lián)劑(NHS)的一端的反應(yīng)；圖3為顯示氨丙基三乙氧基硅烷與NHS PEG的反應(yīng)的NMR譜圖；圖4A為用于處理生物傳感器表面的流體單元(fluid cell)的平面圖；圖4B為流體單元的側(cè)面圖；圖4C為流體單元的另一平面圖；圖5A為經(jīng)處理表面的像片；圖5B為熒光與相應(yīng)于圖5A的表面的數(shù)據(jù)點之間的曲線；圖5C為另一經(jīng)處理表面的像片；和圖5D為熒光與相應(yīng)于圖5B的表面的數(shù)據(jù)點之間的曲線。
優(yōu)選實施方式詳述參考圖1G，在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，提供生物傳感器，其中捕獲分子10經(jīng)過起到生物相容性分子80作用的組合錨定物/間隔物，被錨定到玻璃生物傳感器表面20上。
現(xiàn)在參考圖1H，生物相容性分子80抵抗其它分子40的非特異性吸附，并還充當交聯(lián)劑。這進一步減少了潛在的非特異性吸附位置。有利地，多余的生物相容性分子80提供捕獲分子40的側(cè)向間隔而不留下暴露的底表面20。施加的捕獲分子10的濃度決定了表面活化作用的密度。在操作中，目標分子70經(jīng)過捕獲分子80結(jié)合到表面20。
一起參考圖2B和2C，在本發(fā)明優(yōu)選實施方式中，用APTS(氨丙基三甲氧基硅烷)200和雙同官能團PEG N-羥基琥珀酰亞胺交聯(lián)劑(NHS)210在二甲基亞砜(DMSO)中的預(yù)處理溶液處理玻璃表面20。NHS交聯(lián)劑210具有兩個NHS官能團，在每一端有一個官能團。在一端，第一NHS官能團結(jié)合到APTS 200。在另一端，第二NHS官能結(jié)合到胺官能化的適體220。在兩種情況下，通過共價鍵結(jié)合。
圖3顯示NMR譜圖，其解釋了APTS 200與NHS PEG 210的反應(yīng)。示出的分子是該反應(yīng)的結(jié)果。
在本發(fā)明列舉的特別優(yōu)選的方法中，圖3所指的反應(yīng)首先是如下進行的在42-48℃下，于DMSO溶液中，從APTS和以(a，w)NHS-PEG 2000 Rapp聚合物形式的雙同官能團PEG，制備NHS-PEG-三乙氧基硅烷形式的雙異官能團試劑。將DMSO中的300微升80mM的雙同官能團NHS-PEG與DMSO中的200微升120mM的APTS、300微升DMSO中的6微升APTS混合。這產(chǎn)生了兩種物質(zhì)的濃度都為48mM的等摩爾混合物。將該混合物加熱到46和50℃之間，并使反應(yīng)進行30～60分鐘。然后將所得物轉(zhuǎn)移到在兩個預(yù)處理玻璃表面之間的窄縫隙中，并保持60～120分鐘。利用毛細作用促進混合物進入縫隙直至充滿縫隙。理想地在高溫下填充縫隙。否則，混合物的粘度太高。用1份濃硫酸(Fluka)和2份過氧化氫(Fluka puriss)的混合物處理表面幾小時，然后用去離子水洗滌。硫酸和過氧化氫的混合物有時稱作‘piranha溶液’，在混合過程中將其加熱到沸點。
仍然參考圖3，進行30分鐘后，NMR顯示90％以上的胺基團與PEG上的NHS基團反應(yīng)，并且沒有檢測到游離的APTS，檢測閾為10％。統(tǒng)計學(xué)地形成了未反應(yīng)的NHS-PEG和雙同官能團三乙氧基硅烷PEG的雙同官能團副產(chǎn)物。然而，這些并不干擾化學(xué)吸附。這是因為NHS-PEG不能化學(xué)吸附到玻璃上。雙同官能團三乙氧基硅烷PEG可能僅僅稀釋了NHS-PEG的密度，并在隨后的蛋白質(zhì)吸附步驟中裂解為Si-(OH)3。
圖4A～C顯示了用于使用高濃度相對昂貴的連接體/間隔物生物相容性分子，例如前述的那些，處理玻璃表面20的流體單元。參考圖4A和4B，表面20通過100-300微米厚的外周襯墊300隔開并密封。襯墊300可以由特富龍(Telfon)形成。參考圖4C，然后通過毛細管力，從150微升體積的一側(cè)用反應(yīng)性混合物填充流體單元。特別地，通過毛細作用將該混合物吸入到表面20之間并由襯墊300限定的縫隙中。因此處理了表面20。
本文前面所述的技術(shù)優(yōu)于常規(guī)技術(shù)，這是因為原位制備了雙異官能團試劑。無需進一步純化。這特別有利，因為通過常規(guī)技術(shù)純化硅烷化的PEG，例如色譜法即使不是不可能也是非常難的。不含水的條件防止了APTS的聚合并有利于調(diào)節(jié)表面20的常規(guī)處理。試劑的原位制備提供了新鮮的反應(yīng)性中間體，該中間體不會由于儲存而降解或聚合。在50mM PEG和APTS的混合物中的高濃度改善了生物分子的反應(yīng)速度。這允許制備該試劑而沒有不需要的降解。NHS的濃度比APTS的高有助于驅(qū)動APTS與NHS基團的反應(yīng)至完全。毛細管縫隙通過消除擴散限制增加了表面反應(yīng)的速度。因為在混合物中基本上沒有梯度，表面20的處理更均勻。表面20之間表面和體積比例越大，聚合反應(yīng)降低得越多，越有利于三乙氧基硅烷與表面20的反應(yīng)。這些反過來可能會降低檢測方案的特異性，例如通過CBQCA或NHS-若丹明檢測伯胺。在混合物中存在的低水平的APTS顯著降低了檢測伯胺的背景水平。
通過用濾紙除去溶液，然后用DMSO洗滌三次，停止在表面20之間試劑的反應(yīng)。洗滌除去了未反應(yīng)的雙異官能團分子以及聚合產(chǎn)物和雙同官能團副產(chǎn)物。然后拆開表面20，并用氮氣吹干以除去痕量DMSO。然后將捕獲分子10結(jié)合到新鮮的NHS-活化表面20上?？蛇x擇地，表面20可以在干燥氬氣中儲存幾天。
如本文中前面描述的經(jīng)處理的玻璃表面20可錨定具有氨基端基(5′或3′端)的寡核苷酸、蛋白質(zhì)和其它NH2-官能化的分子。在特別優(yōu)選的本發(fā)明實施方式中，通過用氨基官能化的化合物的水溶液填充施用到NHS-活化表面20的PDMS微觀流體網(wǎng)狀物，進行化學(xué)吸附。寡核苷酸在含有10％DMSO和15-20％PEG(MW＝1000)的水溶液中化學(xué)吸附到表面20。在化學(xué)反應(yīng)期間，20mM寡核苷酸的濃度對表面20提供了由寡核苷酸特別均勻的覆蓋，并且剩下的基本未受干燥的影響。
圖5A～5D示例了使用使本發(fā)明具體化的表面官能化可獲得的改善的均一性。圖5A顯示圖案化的TAMRA標記的18-聚的DNA低聚物分子的熒光圖像，該分子通過NHS-PEG-APTS偶聯(lián)物間隔物化學(xué)吸附到表面。淺色條紋顯示化學(xué)吸附的低聚物分子。圖5B為從圖5A表面計算的熒光的曲線，顯示點內(nèi)(intraspot)標準偏差＜2％和點間(interspot)標準偏差＜4％。在該情況下，對在圖像中分布的45個單獨區(qū)域平均的熒光強度計數(shù)為9748+-350。變化率小于4％。對于一個區(qū)域，平均600象素。即使在洗滌和雜會循環(huán)過程中圖案化的精度仍然保持穩(wěn)定。
參考圖5C和5D，通過其中的圖像和圖表證明。通過使適體沿垂直線路軌跡進行圖案化的化學(xué)吸附，并通過使標記的16-聚的低聚物底劑沿間隔的水平軌跡進行圖案化的雜化，產(chǎn)生淺色方塊區(qū)域。9個區(qū)域平均的熒光圖像計數(shù)為21539+-1085。變化率為5％。對于一個區(qū)域，平均784象素。
本文中僅僅通過實施例的方式描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式。對本領(lǐng)域技術(shù)人員很明顯本發(fā)明可以有更多的實施方式。
權(quán)利要求
1.在表面上產(chǎn)生生物分子單層的方法，包括以下步驟使該表面與雙異官能團試劑的溶液反應(yīng)，以獲得自組裝單層，該試劑具有第一官能團和第二官能團，該第一官能團能夠與表面基團形成共價鍵，該第二官能團與雙同官能團聚合物形成共價鍵；以及然后將該單層與生物分子反應(yīng)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中生物分子是胺官能化的。
3.權(quán)利要求1的方法，其中生物分子包括核酸適體衍生物。
4.權(quán)利要求1的方法，還包括過量的雙同官能團聚合物。
5.權(quán)利要求1的方法，其中在暴露于表面前，混合雙異官能團試劑和雙同官能團聚合物。
6.權(quán)利要求1的方法，其中表面是玻璃表面。
7.權(quán)利要求1的方法，其中表面是金屬表面。
8.權(quán)利要求1的方法，其中雙異官能團試劑是氨基烷基三烷氧基硅烷。
9.權(quán)利要求8的方法，其中雙異官能團試劑為3-氨丙基三乙氧基硅烷。
10.權(quán)利要求1的方法，其中雙異官能團試劑為烷基硫醇。
11.權(quán)利要求1的方法，其中雙異官能團試劑的第二官能團與雙同官能團聚合物的一個官能團反應(yīng)，以在它們之間形成共價鍵。
12.權(quán)利要求11的方法，其中雙同官能團聚合物的官能團為N-羥基琥珀酰亞胺基團。
13.權(quán)利要求1的方法，其中雙同官能團聚合物為雙同官能團聚乙二醇。
14.權(quán)利要求1的方法，其中生物分子與雙同官能團聚合物的一個官能團反應(yīng)以在它們之間形成共價鍵。
15.權(quán)利要求14的方法，其中在生物分子和雙同官能團聚合物之間形成的共價鍵為酰胺鍵。
16.一種具有表面層的生物傳感器，其是通過在表面上產(chǎn)生生物分子單層的方法形成的，該方法包括以下步驟使該表面與雙異官能團試劑的溶液反應(yīng)，以獲得自組裝單層，該試劑具有第一官能團和第二官能團，該第一官能團能夠與表面基團形成共價鍵，該第二官能團與雙同官能團聚合物形成共價鍵；以及然后使該單層與捕獲分子反應(yīng)。
17.一種生物傳感器陣列，該陣列包括生物分子在底物上的圖案化的沉積物，其中圖案化的沉積物是通過在表面上產(chǎn)生生物分子單層的方法形成的，該方法包括以下步驟使該表面與雙異官能團試劑的溶液反應(yīng)，以獲得自組裝單層，該試劑具有第一官能團和第二官能團，該第一官能團能夠與表面基團形成共價鍵，該第二官能團與雙同官能團聚合物形成共價鍵；以及然后使該單層與捕獲分子反應(yīng)。
18.一種生物芯片，該生物芯片具有通過在表面上產(chǎn)生生物分子單層的方法形成的表面層，該方法包括以下步驟使該表面與雙異官能團試劑的溶液反應(yīng)，以獲得自組裝單層，該試劑具有第一官能團和第二官能團，該第一官能團能夠與表面基團形成共價鍵，該第二官能團與雙同官能團聚合物形成共價鍵；以及然后使該單層與生物分子反應(yīng)。
19.一種生物芯片陣列，其包括生物分子在底物上的圖案化的沉積物，其中圖案化的沉積物是通過在表面上產(chǎn)生生物分子單層的方法形成的，該方法包括以下步驟使該表面與雙異官能團試劑的溶液反應(yīng)，以獲得自組裝單層，該試劑具有第一官能團和第二官能團，該第一官能團能夠與表面基團形成共價鍵，該第二官能團與雙同官能團聚合物形成共價鍵；以及然后使該單層與生物分子反應(yīng)。
全文摘要
本發(fā)明披露了用于在生物傳感器表面上制備生物分子單層的方法，包括以下步驟使生物傳感器表面與雙異官能團試劑的溶液反應(yīng)，以獲得自組裝單層，該試劑具有第一官能團和第二官能團，該第一官能團能夠與生物傳感器表面基團形成共價鍵，該第二官能團與雙同官能團聚合物形成共價鍵；以及然后將該單層與生物分子反應(yīng)。
文檔編號G01N33/543GK1720096SQ200380105197
公開日2006年1月11日 申請日期2003年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月4日
發(fā)明者瑟奇·阿蒙托夫, 布魯諾·米歇爾, 薩莉·斯旺森, ?？啤の譅柗?申請人:國際商業(yè)機器公司