專利名稱：使用非擴(kuò)增dna的直接snp檢測的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測樣品中目標(biāo)核酸分子的方法，該樣品中包含具有比擴(kuò)增的核酸分子更高的生物復(fù)雜度的核酸分子，例如在基因組DNA中。具體地，本發(fā)明涉及使用納米粒子標(biāo)記的探針檢測SNP的方法和探針。本發(fā)明也涉及檢測生物學(xué)有機(jī)體，具體為樣品中的細(xì)菌病原體如葡萄球菌DNA，和檢測抗生素抗性基因，如賦予抗生素甲氧西林(methicillin)抗性的mecA基因的方法。
背景技術(shù)：
在不同個體中觀測到的基因組DNA之間的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)或者單堿基變異不僅構(gòu)成了遺傳多樣性的基礎(chǔ)，也被認(rèn)為是疾病傾向的標(biāo)記，可用于更好地進(jìn)行疾病控制、增加對疾病狀況的理解、以及最終促進(jìn)發(fā)現(xiàn)更有效的藥物。因此，為了這個共同的目標(biāo)，即發(fā)展可以快速可靠地鑒別SNPs的方法，正在進(jìn)行著大量努力。由于人類基因組DNA固有的復(fù)雜度(單倍體基因組＝3×109bp)和相關(guān)的敏感性的需要，大多數(shù)的這些努力都需要通過如PCR等方法進(jìn)行目標(biāo)擴(kuò)增。直接在人類基因組DNA中檢測SNPs的能力將使檢測簡單化，并且消除SNP鑒別中與目標(biāo)擴(kuò)增相關(guān)的誤差。
可以采用許多方法鑒定單核苷酸多態(tài)性，包括DNA測序、限制性酶分析、或特異性位點(diǎn)雜交。但是，對SNP和突變的高通量基因組范圍的篩選，需要高度精確和靈敏地同時分析多個位點(diǎn)的能力。為了提高靈敏度和特異性，目前檢測單核苷酸的高通量方法依賴于涉及目標(biāo)核酸樣品擴(kuò)增的步驟，通常采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)(參見，例如，Nikiforov等，公布于1997年10月21日的U.S.Pat.No.5,679,524；McIntosh等，公布于1998年12月30日的PCT申請WO 98/59066；Goelet等，公布于1995年5月11日的PCT申請WO 95/12607；Wang等，1998，Science 2801077-1082；Tyagi等，1998，Nature Biotechnol.1649-53；Chen等，1998，Genome Res.8549-556；Pastinen等，1996，Clin.Chem.421391-1397；Chen等，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.9410756-10761；Shuber等，1997，Hum.Mol.Gen.6337-347；Liu等，1997，Genome Res.7389-398；Livak等，Nature Genet.9341-342；Day和Humphries，1994，Anal.Biochem.222389-395)。之所以PCR擴(kuò)增對基于SNP的傳統(tǒng)雜交是必要的，主要有兩個原因第一，當(dāng)獲得每個單倍體基因組具有3,000,000,000個堿基對的人總DNA時，含有SNP位點(diǎn)的目標(biāo)序列僅僅代表了總DNA的非常小的一部分。例如，20個堿基對的目標(biāo)序列僅僅代表了總DNA的0.00000033％(正常的基因組有兩個目標(biāo)序列拷貝，但是他們具有不同的SNP位點(diǎn)，并因此被認(rèn)為是不同的位點(diǎn))。因此，由于靈敏度的不足，少數(shù)微生物的通常的DNA樣品對于許多的現(xiàn)有技術(shù)來講是不夠的。然而，更重要的原因是，足夠短的以致于允許區(qū)分單個堿基的寡核苷酸與20個堿基的目標(biāo)序列的雜交并非專一地與目標(biāo)區(qū)雜交，而是在較小程度上與基因組中其他的區(qū)域結(jié)合。由于非目標(biāo)DNA的壓倒性數(shù)量，非特異性雜交制造了很大的背景，以致于掩蓋了特異性信號。因此，一個目標(biāo)區(qū)的擴(kuò)增就成了顯著減少非特異性序列的必要步驟。此擴(kuò)增步驟稱為“復(fù)雜度簡化(complexity reduction)”。然而，PCR技術(shù)的保真度是有限的。PCR引物對的組合傾向于產(chǎn)生假反應(yīng)產(chǎn)物或者在一些特定區(qū)域是不成功的。另外，當(dāng)非目標(biāo)序列被復(fù)制后，或者由于錯誤結(jié)合而使錯誤被導(dǎo)入目標(biāo)序列時，終產(chǎn)物中的錯誤數(shù)就隨著每個循環(huán)的PCR擴(kuò)增呈指數(shù)上升。這樣，在搜尋核酸群體中的罕見變異時，PCR錯誤就可能是一個基本的缺點(diǎn)。
最后，使用目標(biāo)擴(kuò)增的缺點(diǎn)是每個SNP位點(diǎn)都必須分開擴(kuò)增。而由于人類基因組中可能有數(shù)百萬的SNP，因此，這成為無法完成的任務(wù)。即便擴(kuò)增的方法和策略是圍繞SNP-位點(diǎn)特異性擴(kuò)增問題，當(dāng)前的技術(shù)發(fā)展水平也只能同時鑒定總SNP中的很小比例(少于0.1％)(見，例如，Kennedy等，2003，Nature Biotechnol.211233-1237)。Whitehead生物醫(yī)學(xué)研究院(Whitehead Institute for Biomedical Reserch)的Eric Lander和人類基因組計(jì)劃的其中一個領(lǐng)導(dǎo)者指出，舍棄目標(biāo)擴(kuò)增是基因組范圍SNP篩選中最重大的挑戰(zhàn)之一(見Lander E.1999，Nature Genetics Suppl.213-4)。因此，現(xiàn)有技術(shù)中還需要更加靈敏、有效、成本低的檢測樣品中SNP的方法，這樣的方法不需要目標(biāo)擴(kuò)增或者復(fù)雜度簡化。
DNA突變的鑒定對于微生物的鑒定也是重要的(見Edwards等，J.Clin.Micro.393047-3051)。例如，葡萄球菌屬包括至少38個不同的種，這些種中的大多數(shù)在醫(yī)院感染中被鑒定(Edwards等，J.Clin.Micro.393047-3051)。因此，微生物的快速鑒定和物種形成分析(speciation)對鑒定感染源是重要的，感染源的鑒定幫助確定病人的治療方法、以及在流行病學(xué)意義上識別感染的發(fā)作和醫(yī)院病原體的交叉?zhèn)鞑?Olive和Bean，1999，J.Clin.Micro.371661-1669)。基于生化測試的鑒別細(xì)菌的傳統(tǒng)方法通常時間較長(1＞天)并且常常無法精確鑒別具體物種(Hamels等，2001，Biotechniques 311364-1372)。因此，大量的工作都專注于發(fā)展更加快速、精確、并且代價更小的基于核酸序列鑒定的具體細(xì)菌物種鑒別方法，尤其是醫(yī)院病原體如葡萄球菌。相同家族或?qū)俚奈⑸锇到y(tǒng)發(fā)生上保守的編碼相同蛋白的基因(Hamels等，2001，Biotechniques 311364-1372)。盡管來自相同家族的基因序列通常是高度保守的，但還是鑒別出了多種基因(如16S rRNA)之中的種特異性序列突變。已經(jīng)發(fā)展出靶向16S rRNA基因可變區(qū)的寡核苷酸探針用于實(shí)時PCR檢測來鑒定多種凝固酶陰性和陽性葡萄球菌物種(Edwards等，J.Clin.Micro.393047-3051)。
另外，已經(jīng)發(fā)展了微陣列通過PCR擴(kuò)增的femA基因序列來鑒定葡萄球菌屬、種和抗生素抗性(Hamels等，2001，Biotechniques 311364-1372)。微陣列包含識別femA基因中種特異性序列變異(三個或更多個堿基的序列變異)的寡核苷酸探針，femA基因與5種臨床相關(guān)的葡萄球菌菌種(金黃色葡萄球菌(S.aureus)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、溶血葡萄球菌(S.haemolyticus)、人型葡萄球菌(S.hominis)、腐生葡萄球菌(S.saprophyticus))有關(guān)，而靶向相同基因保守區(qū)的寡核苷酸探針用于葡萄球菌屬的鑒別。然而，微陣列和基于實(shí)時PCR的檢測的一個主要的缺點(diǎn)就是需要PCR，這使得無論是從臨床還是從成本的觀點(diǎn)來看都不太理想(見上述用于SNP鑒定的PCR討論)。因此，現(xiàn)有技術(shù)中仍然需要更加靈敏、有效、成本更低的用于檢測和分析樣品中的生物學(xué)微生物的方法，這樣的方法不需要目標(biāo)擴(kuò)增或者復(fù)雜度簡化。
發(fā)明概述本發(fā)明提供檢測樣品中目標(biāo)核酸序列的方法，其中樣品包含比擴(kuò)增的核酸分子更高生物復(fù)雜度的核酸分子，目標(biāo)核酸序列與已知核酸序列至少有一個單核苷酸的不同。例如，一個單核苷酸的差異就可以是一個單核苷酸多態(tài)性。
一方面，不包括前期目標(biāo)擴(kuò)增或復(fù)雜度簡化的檢測樣品中目標(biāo)核酸序列的方法包括下述步驟a)提供結(jié)合有捕獲寡核苷酸的可尋址基板，其中捕獲寡核苷酸具有與目標(biāo)核酸序列的第一部分的至少一部分互補(bǔ)的序列；b)提供包含探測寡核苷酸的探測探針，其中探測寡核苷酸具有與步驟(a)中的目標(biāo)核酸序列的第二部分的至少一部分互補(bǔ)的序列；c)在捕獲寡核苷酸能夠與目標(biāo)核酸序列的第一部分有效雜交，以及探測探針能夠與目標(biāo)核酸序列的第二部分有效雜交的條件下，使樣品與基板和探測探針接觸；和d)檢測捕獲寡核苷酸和探測探針是否與目標(biāo)核酸序列的第一和第二部分雜交。
另一方面，不包括前期目標(biāo)擴(kuò)增或復(fù)雜度簡化的檢測樣品中目標(biāo)核酸序列的方法包括下述步驟a)提供結(jié)合有許多捕獲寡核苷酸的可尋址基板，其中捕獲寡核苷酸具有與目標(biāo)核酸序列的一個或一個以上部分互補(bǔ)的序列；b)提供包含探測寡核苷酸的探測探針，其中探測寡核苷酸具有與步驟(a)中不被基板上的捕獲寡核苷酸識別的目標(biāo)核酸序列的一個或一個以上部分互補(bǔ)的序列；c)在捕獲寡核苷酸能夠與目標(biāo)核酸序列的一個或一個以上部分有效雜交，以及探測探針能夠與不被捕獲寡核苷酸識別的目標(biāo)核酸序列的一個或一個以上部分有效雜交的條件下，使樣品與基板和探測探針接觸；和d)檢測捕獲寡核苷酸和探測探針是否與目標(biāo)核酸序列雜交。
本發(fā)明也提供了鑒定樣品中單核苷酸多態(tài)性的方法，其中樣品中包含比擴(kuò)增的核酸分子更高生物復(fù)雜度的核酸分子。
一方面，不包括前期目標(biāo)擴(kuò)增或復(fù)雜度簡化的鑒定樣品中單核苷酸多態(tài)性的方法包括步驟a)提供結(jié)合有至少一個捕獲寡核苷酸的可尋址基板，其中所述的至少一個捕獲寡核苷酸具有與包含特定多態(tài)性的核酸靶物的至少一部分互補(bǔ)的序列；b)提供結(jié)合有探測寡核苷酸的探測探針，其中探測寡核苷酸具有與步驟(a)的核酸靶物的至少一部分互補(bǔ)的序列；c)在捕獲寡核苷酸能夠與核酸靶物有效雜交，以及探測探針能夠與核酸靶物有效雜交的條件下，使樣品與基板和探測探針接觸；和d)檢測捕獲寡核苷酸和探測探針是否與核酸靶物雜交。
另一方面，不包括前期目標(biāo)擴(kuò)增或復(fù)雜度簡化的鑒定樣品中單核苷酸多態(tài)性的方法包括步驟a)提供結(jié)合有多個捕獲寡核苷酸的可尋址基板，其中捕獲寡核苷酸具有與核酸靶物的多個部分互補(bǔ)的序列，每個部分都包含特定的多態(tài)性；b)提供含有探測寡核苷酸的探測探針，其中探測寡核苷酸具有與步驟(a)的核酸靶物的至少一部分互補(bǔ)的序列，核酸靶物不被基板上的捕獲寡核苷酸所識別；c)在捕獲寡核苷酸能夠與核酸靶物的多個部分有效雜交，以及探測探針能夠與核酸靶物有效雜交的條件下，使樣品與基板和探測探針接觸；和d)檢測捕獲寡核苷酸和探測探針是否與核酸靶物雜交。
在一個實(shí)施方案中，目標(biāo)核酸的核苷酸差異或者單核苷酸多態(tài)性能夠被結(jié)合于基板上的捕獲寡核苷酸或者探測寡核苷酸所識別。
在另一個實(shí)施方案中，樣品中的目標(biāo)核酸分子包含基因組DNA、基因組RNA、表達(dá)的RNA、質(zhì)粒DNA、線粒體或其他細(xì)胞器官DNA、游離的細(xì)胞DNA、病毒DNA或病毒RNA、或者上述兩種或兩種以上的混合物。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法中所使用的基板可以包含許多捕獲寡核苷酸，每個捕獲寡核苷酸能夠識別一個或一個以上不同的單核苷酸多態(tài)性或核苷酸差異，樣品可以包含一個以上的核酸靶物，每一個核酸靶物都包含不同的單核苷酸多態(tài)性或核苷差異，能夠與許多捕獲寡核苷酸中的其中一個雜交。此外，本發(fā)明的方法可以提供一個或一個以上類型的探測探針，每一類型的探測探針都結(jié)合有探測寡核苷酸，能夠與不同的核酸靶物雜交。
在一個實(shí)施方案中，樣品可以與探測探針接觸，以使存在于樣品中的核酸靶物與探測探針上的探測寡核苷酸雜交，然后，可以將結(jié)合于探測探針上的核酸靶物與基板接觸，以使核酸靶物與基板上的捕獲寡核苷酸雜交。任選地，樣品可以與基板接觸，以使樣品中的核酸靶物與捕獲寡核苷酸雜交，然后，與捕獲寡核苷酸結(jié)合的核酸靶物可以與探測探針接觸，以使核酸靶物與探測探針上的探測寡核苷酸雜交。在另一個實(shí)施方案中，樣品可以同時與探測探針和基板接觸。
在另一個實(shí)施方案中，探測寡核苷酸可以包含可探測的標(biāo)記。該標(biāo)記可以是，例如，熒光的、發(fā)光的、發(fā)磷光性、放射性的、或者是納米粒子，可以將探測寡核苷酸連接于樹枝狀高分子(dendrimer)、分子聚集體(molecular aggregate)、量子點(diǎn)(quantum dot)、或者珠子。所述標(biāo)記可通過例如光子學(xué)、電子學(xué)、聲學(xué)、光聲、重力、電化學(xué)、電光、質(zhì)譜、酶學(xué)、化學(xué)、生物化學(xué)、或者物理學(xué)手段探測。
在一個實(shí)施方案中，探測探針可以是結(jié)合有探測寡核苷酸的納米粒子探針。納米粒子可由貴重金屬如金或銀制成。納米粒子可以使用例如光學(xué)或平板掃描儀檢測。掃描儀可連接在電腦上，電腦上安裝了能夠計(jì)算灰度值的軟件，所計(jì)算的灰度值提供檢測到的核酸量的定量值。在由金、銀或其他金屬制成的能夠促使自動金屬顯影(autometallography)的納米粒子所在位置，可以通過銀染高靈敏度地檢測以目標(biāo)核酸分子的方式與納米粒子結(jié)合的基板。任選地，可以通過檢測納米粒子散射的光來檢測與納米粒子結(jié)合的基板。
在另一個實(shí)施方案中，可以將附著于基板的寡核苷酸置于兩個電極之間，納米粒子可以由電導(dǎo)體材料做成，本發(fā)明的方法的步驟(d)可以包括檢測導(dǎo)電性的變化。在另一個實(shí)施方案中，其中每一個都能夠識別不同的目標(biāo)核酸序列的許多寡核苷酸附著于基板上的斑點(diǎn)陣列中，每個寡核苷酸斑點(diǎn)都位于兩個電極之間，納米粒子可以由電導(dǎo)體材料做成，本發(fā)明的方法的步驟(d)可以包括檢測導(dǎo)電性的變化。電極可以由例如金制成，納米粒子也由金制成。可選地，基板可以和銀染區(qū)(silver stain)接觸以產(chǎn)生導(dǎo)電性的變化。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可以用來區(qū)分兩個或兩個以上同屬的物種。一方面，這些物種可以有兩個或兩個以上不連續(xù)核苷酸的不同。另一方面，這些物種可以有兩個或兩個以上連續(xù)核苷酸的不同。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的目標(biāo)核酸序列可以是葡萄球菌基因的一部分。這個實(shí)施例方案一個方面，葡萄球菌可以是例如金黃色葡萄球菌(S.aureus)、溶血葡萄球菌(S.haemolyticus)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、里昂葡萄球菌(S.lugdunensis)、人型葡萄球菌(S.hominis)、腐生葡萄球菌(S.saprophyticus)。因此，本發(fā)明的方法可以用于葡萄球菌的物種形成分析(例如區(qū)分不同種類的葡萄球菌)。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的目標(biāo)核酸序列可以是mec A基因的一部分。因此，本發(fā)明的方法可以用于鑒定甲氧西林(methicillin)抗性菌株。
在本發(fā)明的另外一個實(shí)施方案中，目標(biāo)核酸序列、捕獲寡核苷酸、和/或探測寡核苷酸可以包括SEQ ID NO17，SEQ ID NO18，SEQ IDNO19，SEQ ID NO20，SEQ ID NO21，SEQ ID NO22，SEQ ID NO23，SEQID NO24，SEQ ID NO25，SEQ ID NO26，SEQ ID NO27，SEQ ID NO28，SEQ ID NO29，SEQ ID NO30，SEQ ID NO31，SEQ ID NO32，SEQ IDNO33，SEQ ID NO34，SEQ ID NO35，SEQ ID NO36，SEQ ID NO37，SEQID NO38，SEQ ID NO39，SEQ ID NO40，SEQ ID NO41，SEQ ID NO42，SEQ ID NO43，SEQ ID NO44，SEQ ID NO45，SEQ ID NO46，SEQ ID NO47，SEQ ID NO48，SEQ ID NO49，SEQ ID NO50，SEQ ID NO51，SEQ IDNO52，SEQ ID NO53，SEQ ID NO54，SEQ ID NO55，SEQ ID NO56，SEQID NO57，SEQ ID NO58，SEQ ID NO59，SEQ ID NO60，SEQ ID NO61，SEQ ID NO62，SEQ ID NO63，SEQ ID NO64，SEQ ID NO65，SEQ ID NO66，SEQ ID NO67，SEQ ID NO68，SEQ ID NO69，SEQ ID NO70，SEQ IDNO71，SEQ ID NO72，SEQ ID NO73，SEQ ID NO74，SEQ ID NO75，SEQ ID NO76，SEQ ID NO77，或SEQ ID NO78所列出的序列。
通過以下對一些優(yōu)選實(shí)施方案和權(quán)利要求更為詳細(xì)的描述，本發(fā)明具體的優(yōu)選實(shí)施方案將會更明顯。


圖1為本發(fā)明一步雜交法示意圖。
圖2為本發(fā)明兩步雜交法示意圖。
圖3示意性顯示納米粒子標(biāo)記的探測探針、結(jié)合于基板的野生型或突變型捕獲探針和野生型靶物的雜交復(fù)合體。為了檢測SNP，測試在適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行，在該實(shí)驗(yàn)條件下可以保留完好匹配的復(fù)合體(左)而阻止含有錯配的復(fù)合體的形成(右)。
圖4顯示用未擴(kuò)增的人類基因組DNA[(a)部分]或者鮭精DNA[(b)部分]，在具有野生或突變的因子V基因捕獲探針的Superaldehyde片上進(jìn)行的因子V基因(1691 G->A)的SNP檢測。(c)部分是在野生型或突變型捕獲探針存在下，進(jìn)行人類基因組DNA和非特定鮭精DNA的檢測信號強(qiáng)度分析的總結(jié)圖。
圖5顯示為使本發(fā)明的方法能夠區(qū)分有一個核苷酸(SNP位點(diǎn))差異的兩個目標(biāo)核酸而調(diào)節(jié)雜交條件的重要性。
圖6(a)、(b)和(c)顯示可以設(shè)計(jì)陣列(捕獲探針序列)和雜交條件，以致于可以在同一陣列和同樣的雜交條件下檢測一個以上的SNP類型，在不依賴于輸入DNA的條件下，使野生型和突變型DNA之間的SNP辨別成為可能。
圖7顯示在CodeLink載片上，在不同甲酰胺濃度條件下，以雜交的方法用非擴(kuò)增人基因組DNA((a)部分)進(jìn)行因子V突變基因(1691 G->A)的SNP檢測，CodeLink載片上排列了野生型和突變型因子V基因捕獲探針。(b)部分圖表對人類基因組DNA檢測信號強(qiáng)度分析進(jìn)行了概括，該檢測信號強(qiáng)度分析是在野生型或突變型捕獲探針存在下，在不同甲酰胺濃度下雜交之后進(jìn)行的。
圖8顯示在經(jīng)最佳調(diào)整的條件下，人野生型DNA只在野生型探針上產(chǎn)生信號，而人突變型DNA只在突變型捕獲探針上產(chǎn)生信號。
圖9(a)-(d)顯示圖8中理想(中間的)雜交條件的定量數(shù)據(jù)。
圖10(a)和(b)顯示可以使用非常少量的(少于1毫克)人總DNA來辨別SNP。圖10也顯示了捕獲寡核苷酸的設(shè)計(jì)和嚴(yán)格條件下的適當(dāng)匹配對于捕獲(和探測)探針的長度和核苷酸成分的重要性。
圖11(a)和(b)顯示使用本發(fā)明的方法，在一個載片上的10個單獨(dú)雜交中，在基因組DNA中進(jìn)行SNP檢測的結(jié)果。10個雜交中匹配和錯配凈信號強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)偏差沒有重疊，意味著對于每一個雜交反應(yīng)，都能夠可靠地確定輸入DNA的SNP基因型。
圖12(a)和(b)顯示使用本發(fā)明的方法在整個基因組DNA中進(jìn)行多重SNP鑒定的結(jié)果，其中檢測因子V、因子II和MTHFR基因的基因型。
圖13(a)和(b)顯示在患者樣品GM16028的整個基因組DNA中進(jìn)行多重SNP鑒定的結(jié)果，其顯示了本發(fā)明的方法鑒定單一個體中因子V、因子II和MTHFR基因的雜合SNP基因型的能力。
圖14(a)和(c)顯示在患者樣品GM00037的整個基因組DNA中進(jìn)行多重SNP檢測的結(jié)果，其顯示本發(fā)明的方法鑒定單一個體對一個基因是野生的(本例中為因子V)、對另一個基因(本例中是因子II)是雜合的、對第三個基因(本例中為MTHFR)是突變的能力。
圖15(a)-(f)顯示三個不同的研究者對兩個單獨(dú)的患者樣品實(shí)施本發(fā)明的方法的結(jié)果。
圖16(a)-(b)顯示使用固定在玻璃片上的mecA 2和mecA 6捕獲寡核苷酸，對源于葡萄球菌基因組DNA的mecA基因的特異性檢測結(jié)果，其中葡萄球菌基因組DNA分離于甲氧西林抗性(mecA+)金黃色葡萄球菌細(xì)胞，mecA 4標(biāo)記的金納米粒子作為探測探針。分離于甲氧西林敏感(mecA-)金黃色葡萄球菌細(xì)胞的葡萄球菌基因組DNA用作陰性對照。以已知量的PCR擴(kuò)增的mecA基因(標(biāo)記為MRSA 281bp的281個堿基對片段(281 base-pairfragment labeled MRSA 281bp))用作陽性對照。(a)部分顯示一系列來自微陣列孔的掃描圖像，微陣列孔含有數(shù)量不等的甲氧西林抗性基因組DNA靶物(75-300百萬拷貝)，陽性對照和陰性對照樣品與其相同。(b)部分是顯示樣品數(shù)據(jù)分析的圖表。通過減去相應(yīng)的陰性對照斑點(diǎn)的信號來繪制甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌基因組DNA的凈信號。在所有的線條中，水平黑線代表相對于含有甲氧西林敏感性金黃色葡萄球菌基因組DNA的陰性對照斑點(diǎn)的三個標(biāo)準(zhǔn)偏差。本圖顯示對來自總細(xì)菌基因組DNA的mec A的特異性檢測。
圖17用源于金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌(ATCC編號分別為700699和35984)的PCR擴(kuò)增子(amplicon)或基因組DNA例示葡萄球菌物種形成分析。為了檢測總基因組DNA，在陣列雜交之前，采用超聲降解法使DNA樣品片段化。(a)部分是一系列來自微陣列孔的掃描圖像，微陣列含有Tuf 372bp擴(kuò)增子或基因組DNA(300ng，～8.0E7拷貝)。水(無靶物)用作對照。陣列板包括結(jié)合在其上的Tuf 3和Tuf 4捕獲探針。金納米粒子標(biāo)記的Tuf 2探針用作探測探針。(b)部分提供了代表(a)部分所示的樣品數(shù)據(jù)分析的圖表。水平黑線代表相對于背景的三個標(biāo)準(zhǔn)偏差。(c)部分Tuf 372bp擴(kuò)增子或者基因組DNA(8.0E7拷貝)。陣列板包括結(jié)合在其上的Tuf 5和Tuf 6捕獲探針。(d)部分提供了代表(c)部分所示的樣品數(shù)據(jù)分析的圖表。水平黑線代表相對于背景的三個標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖18(a)-(c)提供了實(shí)施例4-6中所用的281個堿基對的金黃色葡萄球菌mecA、450個堿基對的金黃色葡萄球菌coa、142個堿基對的金黃色葡萄球菌Tuf、372個堿基對的金黃色葡萄球菌Tuf和372個堿基對的表皮葡萄球菌Tuf的PCR擴(kuò)增子的序列。
圖19(a)-(j)例示使用PCR擴(kuò)增的靶物進(jìn)行葡萄球菌物種形成分析和mecA基因檢測，PCR擴(kuò)增的靶物取自商業(yè)上可獲得的葡萄球菌株ATCC 35556、ATCC 35984、ATCC 12228、ATCC 700699、和ATCC 15305。(a)、(c)、(e)、(g)和(i)部分是來自微陣列孔的一系列掃描圖像，微陣列含有代表5個基因組樣品的16S、Tuf或mecA基因中任何一個的PCR產(chǎn)物。(b)、(d)、(f)和(h)部分是代表5個樣品數(shù)據(jù)分析的一系列圖表。所有線條中，水平黑線代表相對于背景的三個標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖20(a)-(f)例示使用超聲降解的基因組DNA靶物進(jìn)行葡萄球菌物種形成分析及mec A檢測，基因組DNA靶物來自商業(yè)上可獲得的葡萄球菌株系A(chǔ)TCC 35984、ATCC 700699和ATCC 12228。(a)、(c)和(e)部分是微陣列孔的一系列掃描圖像，微陣列含有來自ATCC 35984、ATCC 700699或ATCC12228中任一個的基因組DNA。陣列板包括結(jié)合有陰性雜交對照的16S 12、mecA 6、Tuf 3、Tuf 4、Tuf 10捕獲探針。金納米粒子標(biāo)記的16S 13、mecA4和Tuf2探針用作探測探針。(b)、(d)和(f)部分是代表三個樣品數(shù)據(jù)分析的一系列圖表。所有線條中，水平黑線代表相對于背景的三個標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖21為顯示用基因組DNA靶物進(jìn)行mec A基因檢測的敏感性界限的圖表。使用表3中的序列，在5x SCC、0.05％Tween 20、0.01％BSA、15％v/v甲酰胺和200pM納米粒子探針條件下，45℃1.5小時，以進(jìn)行ATCC700699基因組樣品的mec A基因檢測的數(shù)據(jù)分析。圖21顯示50μl反應(yīng)體系中(34ng總基因組DNA)330fM的檢測界限。圖中80處的水平線代表相對于背景的三個標(biāo)準(zhǔn)偏差。
實(shí)施本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案除非上下文另有要求，單數(shù)術(shù)語應(yīng)當(dāng)包括復(fù)數(shù)術(shù)語，復(fù)數(shù)術(shù)語應(yīng)當(dāng)包括單數(shù)術(shù)語。
除非另外指出，下述的術(shù)語同本說明書所使用的一致，應(yīng)當(dāng)理解為具有下述含義這里使用的“核酸序列”，“核酸分子”，或者“核酸”指這里定義的一個或一個以上寡核苷酸或多核苷酸。這里使用的“目標(biāo)核酸分子”或“目標(biāo)核酸序列”是指寡核苷酸或多核苷酸，該寡核苷酸或多核苷酸包含本發(fā)明方法使用者所要檢測的樣品中的序列。
此處術(shù)語“多核苷酸”的意思是至少10個堿基長度的單鏈或雙鏈核酸多聚體。在某些實(shí)施方案中，包括多聚核苷酸在內(nèi)的核苷酸可以是核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或是他們中任何一種的修飾形式。所述的修飾包括堿基修飾如溴尿苷，核糖修飾如阿拉伯糖苷和2’，3’-二脫氧核糖，以及核苷間鍵修飾如硫代磷酸酯(phosphorothioate)、二硫代磷酸酯(phosphorodithioate)、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯(phosphorodiselenoate)、phosphoroanilothioate、phoshoraniladate和氨基磷酸酯(phosphoroamidate)。術(shù)語“多核苷酸”尤其包括單鏈和雙鏈形式的DNA。
此處術(shù)語“寡核苷酸”指包括天然產(chǎn)生的核苷酸，以及通過天然和/或非天然產(chǎn)生的寡核苷酸鍵連接在一起的修飾核苷酸。寡核苷酸是多核苷酸的子集，包含通常為單鏈、具有200或更少堿基長度的成員。在某些實(shí)施方案中，寡核苷酸長10至60個堿基。在某些實(shí)施方案中，寡核苷酸長12、13、14、15、16、17、18、19、或者20至40個堿基。寡核苷酸可以是單鏈或雙鏈的，例如，用于基因突變體的構(gòu)建時。關(guān)于編碼蛋白質(zhì)的序列，本發(fā)明的寡核苷酸可以為有義或反義寡核苷酸。
術(shù)語“天然產(chǎn)生的核苷酸”包括脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。術(shù)語“修飾的核苷酸”包括糖基團(tuán)被修飾或取代的核苷酸或類似的核苷酸。術(shù)語“寡核苷酸鍵”包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、phosphoroanilothioate、phoshoraniladate、氨基磷酸酯之類的寡核苷酸鍵。參見，例如，LaPlanche等，1986，Nucl.Acids Res.，149081；Stec等，1984，J.Am.Chem.Soc.，1066077；Stein等，1988，Nucl.Acids Res.，163209；Zon等，1991，Anti-Cancer Drug Design，6539；Zon等，1991，OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUESA PRACTICAL APPROACH，pp.87-108(F.Eckstein，Ed.)，Oxford University Press，Oxford England；Stec等，U.S.Pat.No.5,151,510；Uhlmann和Peyman，1990，Chemical Reviews，90543，其中公開的內(nèi)容在此一并作為任何目的的參考。寡核苷酸可以包括可探測的標(biāo)記，以便能夠探測寡核苷酸或其雜交。
本發(fā)明的方法中所使用的“可尋址基板”可以是任何能夠結(jié)合寡核苷酸的表面。這樣的表面包括但不限于玻璃、金屬、塑料或者是包被了功能基團(tuán)的材料，其中功能基團(tuán)設(shè)計(jì)用于結(jié)合寡核苷酸。包被可以比單分子層厚；事實(shí)上，包被可以包括足夠厚的多孔滲水材料以形成多孔滲水的三維結(jié)構(gòu)，寡核苷酸可以擴(kuò)散至此三維結(jié)構(gòu)并結(jié)合在其內(nèi)表面。
此處所用術(shù)語“捕獲寡核苷酸”指結(jié)合于基板的寡核苷酸，其包含可以將互補(bǔ)核苷酸序列或基因定位(即，在樣品中雜交)于目標(biāo)核酸分子上的核酸序列，并因此使目標(biāo)核酸分子以雜交的方式通過捕獲寡核苷酸附著于基板上。合適的但非限制性的捕獲寡核苷酸的例子包括DNA、RNA、PNA、LNA、或者他們的組合。捕獲寡核苷酸可以包括天然序列或合成序列，具有或不具有修飾的核苷酸。
本發(fā)明的“探測探針”可以是能夠附著一個或一個以上探測寡核苷酸的任何載體，其中的一個或一個以上探測寡核苷酸包含與特定核酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。載體本身可以作為標(biāo)記使用，或者可以包含可探測標(biāo)記或者由可探測標(biāo)記所修飾，或者探測寡核苷酸可以攜帶這樣的標(biāo)記。適于本發(fā)明方法的載體包括但不限于納米粒子、量子點(diǎn)、樹枝狀高分子(dendrimers)、半導(dǎo)體、珠子、上轉(zhuǎn)換或下轉(zhuǎn)換熒光粉(up-or down-convertingphosphors)、大分子蛋白質(zhì)、油脂、碳水化合物、或任何尺寸足夠的適當(dāng)?shù)臒o機(jī)或有機(jī)分子、或其組合。
此處所用的“探測寡核苷酸(detector oligonucleotide)”或“探測寡核苷酸(detection oligonucleotide)”是如此定義的寡核苷酸其包含可將互補(bǔ)核苷酸序列或基因定位(即，在樣品中雜交)于目標(biāo)核酸分子上的核酸序列。探測寡核苷酸的適當(dāng)?shù)牡窍拗菩缘睦影―NA、RNA、PNA、LNA、或其組合。探測寡核苷酸可以包括天然序列或合成序列，具有或不具有修飾的核苷酸。
此處所使用的術(shù)語“標(biāo)記”指可以通過光子學(xué)、電子學(xué)、電光學(xué)、磁、重力、聲學(xué)、酶學(xué)、或其它物理或化學(xué)手段探測的可探測標(biāo)記。術(shù)語“標(biāo)記的”指通過如結(jié)合放射性標(biāo)記核苷或者將可探測標(biāo)記附著于寡核苷酸來結(jié)合這樣的可探測標(biāo)記。
此處所用的“樣品”指包含核酸的、能夠用于本發(fā)明方法的任何數(shù)量的物質(zhì)。例如，此樣品可以是生物學(xué)樣品或者可以從源于人、動物、植物、真菌、酵母、細(xì)菌、病毒、組織培養(yǎng)物或病毒培養(yǎng)物或其組合的生物樣品提取得到。它們可以包含或者提取自固體組織(例如骨髓、淋巴結(jié)、腦、皮膚)、體液(例如血清、血液、尿、唾液、精液或淋巴液)、骨骼組織、或者個體細(xì)胞?？蛇x地，樣品可以包含純化的或部分純化的核酸分子，和例如緩沖劑和/或試劑，此緩沖劑和/或試劑用于得到能夠成功實(shí)施本發(fā)明方法的適當(dāng)條件。
本發(fā)明的一個實(shí)施例中，樣品中的目標(biāo)核酸分子可以包含基因組DNA、基因組RNA、表達(dá)的RNA、質(zhì)粒DNA、細(xì)胞核酸或源于細(xì)胞器官(如線粒體)或寄生蟲的核酸，或其組合。
此處所用的核酸分子的“生物復(fù)雜度”指存在于核酸分子中的非重復(fù)核苷酸序列的核苷酸數(shù)目，例如，Lewin所著GENE EXPRESSION 2，SecondEditionEukaryotic Chromosomes，1980，John Wiley & Sons，New York中所述，在此一并作為參考。例如，一個包含非重復(fù)序列的30個堿基的簡單寡核苷酸其復(fù)雜度為30。含有4,200,000個堿基對的大腸桿菌(E.coli)基因組復(fù)雜度為4,200,000，因?yàn)樗旧蠜]有重復(fù)序列。然而，人類基因組具有類似的3,000,000,000個堿基對，其中很多是重復(fù)序列(例如大約2,000,000,000個堿基對)。類似地人類基因組的總復(fù)雜度(即，非重復(fù)核苷數(shù))為1,000,000,000。
核酸分子如DNA分子的復(fù)雜度不依賴于不同重復(fù)序列的數(shù)目(即，存在于核酸分子中的每一不同序列的拷貝數(shù))。例如，如果一個DNA具有1個長a個核苷酸的序列，5個拷貝的長b個核苷酸的序列，以及50個拷貝的長c個核苷酸的序列，其復(fù)雜度為a+b+c，序列a的重復(fù)頻率為1，序列b的重復(fù)頻率為5，序列c的重復(fù)頻率為10。
可以通過計(jì)算DNA的Cot1/2以實(shí)驗(yàn)手段確定給定DNA中不同序列的總長度，可以由下面的公式表示，Cot1/2=1k]]>其中C是單鏈DNA在時間t1/2時的濃度(反應(yīng)完1/2時)，k為速度常數(shù)。Cot1/2代表DNA的兩條互補(bǔ)鏈一半復(fù)性時所需的數(shù)值。通常地，以Cot曲線方式表示DNA的復(fù)性，Cot曲線繪制出了保持單鏈的DNA的分?jǐn)?shù)(fraction)(C/Co)相對于Cot的常用對數(shù)(log)的圖或者復(fù)性DNA的分?jǐn)?shù)(1-C/Co)相對于Cot的常用對數(shù)的圖。Cot曲線是由Britten和Kohne于1968年提出的(1968，Science 161529-540)。Cot曲線顯示，每條復(fù)性的序列的濃度決定了給定DNA的復(fù)性率。與此對照，Cot1/2代表存在于反應(yīng)中的不同序列的總長度。
DNA的Cot1/2與其復(fù)雜度成比例。因此，可以通過將其Cot1/2與已知復(fù)雜度的標(biāo)準(zhǔn)DNA的Cot1/2對比，來完成DNA復(fù)雜度的確定。通常，用于確定DNA復(fù)雜度的標(biāo)準(zhǔn)DNA為大腸桿菌DNA，其具有與其基因組長度(4.2×106個堿基對)一致的復(fù)雜度，因?yàn)榇竽c桿菌基因組中的每個序列都被認(rèn)為是唯一的。因此，下面的公式可用于確定DNA的生物復(fù)雜度。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了可靠的檢測和區(qū)分(即，鑒定)總?cè)薉NA中具有核苷酸突變(如，單核苷酸多態(tài)性)的目標(biāo)核酸分子的方法，此方法不需要首先通過PCR或任何其他方法優(yōu)選對具體的DNA序列擴(kuò)增以進(jìn)行酶學(xué)復(fù)雜度簡化。具體地，本發(fā)明的方法包含雜交條件組合(包括反應(yīng)體積、鹽、甲酰胺、溫度、以及測試方式)、結(jié)合于基板的捕獲寡核苷酸序列、探測探針、以及足夠靈敏的目標(biāo)核酸分子檢測手段，其中目標(biāo)核酸分子同時由捕獲寡核苷酸和探測探針?biāo)R別。
如實(shí)施例中所顯示的，本發(fā)明首次提供了通過一步雜交法成功檢測總?cè)祟怐NA中單核苷酸多態(tài)性的方法，該方法不需要前期的擴(kuò)增或復(fù)雜度簡化以選擇性富集目標(biāo)序列，也不需要任何酶反應(yīng)的幫助，該一步雜交法包括兩個雜交事件目標(biāo)序列的第一部分與捕獲探針的雜交，以及所述目標(biāo)序列的第二部分與探測探針的雜交。圖1顯示一步雜交法示意圖。如上面所討論的，兩個雜交事件均發(fā)生在同一反應(yīng)中。靶物可以首先結(jié)合在捕獲寡核苷酸上，然后再與探測探針如示意圖中所示的納米粒子雜交，或者靶物可以首先與探測探針結(jié)合，然后再與捕獲寡核苷酸雜交。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了可靠地檢測和區(qū)分(即鑒定)總DNA中具有一個或一個以上不連續(xù)核苷突變的目標(biāo)核酸分子的方法，此方法不需要首先通過PCR或任何其他方法優(yōu)選對特定的DNA序列擴(kuò)增以進(jìn)行酶學(xué)復(fù)雜度簡化。例如，本發(fā)明的方法可用于區(qū)分來自同一屬的兩個或兩個以上不同物種的兩個或兩個以上目標(biāo)核酸分子，其中這些物種有兩個或兩個以上不連續(xù)核苷酸的差異，可使用具有一個或一個以上核苷酸差異的捕獲寡核苷酸和/或具有一個或一個以上核苷酸差異的探測寡核苷酸來區(qū)分。本發(fā)明的方法也可用于區(qū)分同一屬中有兩個或兩個以上連續(xù)核苷酸差異的兩個或兩個以上物種。
在一個實(shí)施方案中，可以使用兩步雜交法實(shí)施本發(fā)明的方法。圖2顯示兩步雜交法示意圖。這個方法中，雜交事件發(fā)生在兩個單獨(dú)的反應(yīng)中。靶物首先結(jié)合在捕獲寡核苷酸上，清除所有的非結(jié)合核酸后，進(jìn)行第二次雜交，第二次雜交提供可特異地結(jié)合于捕獲的目標(biāo)核酸的第二部分的探測探針。
涉及兩步雜交法的本發(fā)明的方法在第一次雜交事件(即目標(biāo)核酸分子的捕獲)期間，無需賦予探測探針某些獨(dú)特的適應(yīng)性特征(諸如高的Tm和納米粒子探針的快速熔解行為)即可實(shí)施，因?yàn)榉磻?yīng)是在兩個步驟中發(fā)生的。第一個步驟沒有嚴(yán)格到足以僅僅捕獲所需的目標(biāo)序列的程度。因此，提供第二個步驟(探測探針的結(jié)合)來獲得所需的針對目標(biāo)核酸分子的特異性。這兩個識別性雜交事件的組合允許所有針對目標(biāo)核酸分子的特異性。然而為了獲得這個敏銳的特異性，所選擇的雜交條件是非常嚴(yán)格的。在這樣的嚴(yán)格條件下，只有少量的靶物和探測探針被捕獲探針?biāo)东@。靶物的量通常很小以致于標(biāo)準(zhǔn)的熒光方法不能檢測到，因?yàn)樗谎诼裼诒尘爸?。因此，對本發(fā)明來說，使用適當(dāng)設(shè)計(jì)的探測探針檢測這些少量的靶物是很重要的。本發(fā)明所描述的探測探針存在于載體部分，通常被修飾成包含許多的探測寡核苷酸，這樣使得此探測探針的雜交動力學(xué)增強(qiáng)。第二，探測探針還用一個或一個以上高靈敏度的標(biāo)記部分來標(biāo)記，這些高靈敏度的標(biāo)記部分與適當(dāng)?shù)臋z測工具一起，允許檢測數(shù)量很小的捕獲靶物-探測探針復(fù)合體。因此，正是因?yàn)檫m當(dāng)?shù)卣{(diào)整了所有因素，同時使用高靈敏度的檢測系統(tǒng)，才使得該方法能夠?qū)嵤?br> 本發(fā)明的兩步雜交法可以包含將此處描述的任何探測探針用于檢測步驟。在優(yōu)選實(shí)施方案中，納米粒子探針用于本方法的第二個步驟中。第二個雜交步驟中使用納米粒子探針的地方和嚴(yán)格性條件與第一步中相同，納米粒子探針上的探測寡核苷酸可以比捕獲寡核苷酸長。這樣，納米粒子探針的獨(dú)特特征(高Tm和快速熔解行為)所必需的條件就不再需要了。
一步和兩步雜交法與本發(fā)明中適當(dāng)設(shè)計(jì)的捕獲寡核苷酸和探測探針一起，提供了相對于以前的檢測樣品中目標(biāo)核酸序列的方法來說，新的、意料不到的優(yōu)勢。尤其是，本發(fā)明的方法不需要擴(kuò)增步驟，此擴(kuò)增步驟的目的是將樣品中靶物數(shù)量最大化，同時減少非目標(biāo)序列的相對濃度以增加結(jié)合靶物的可能性，如基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的檢測方法就需要這樣的擴(kuò)增步驟。無需前期目標(biāo)序列擴(kuò)增的特異性檢測提供了巨大的有利條件。例如，擴(kuò)增經(jīng)常導(dǎo)致研究或診斷實(shí)驗(yàn)室的污染，導(dǎo)致假陽性測試結(jié)果。PCR或其他的目標(biāo)擴(kuò)增需要特別培訓(xùn)的人員、昂貴的酶和專門的設(shè)備。最重要的是，擴(kuò)增的效率會隨每一個目標(biāo)序列和引物對而變化，導(dǎo)致確定存在于基因組中的目標(biāo)序列或目標(biāo)序列的相對量時出現(xiàn)錯誤甚至失敗。另外，本發(fā)明的方法涉及很少的步驟，并因而比基于凝膠的核酸靶物檢測方法，如Southern和Northern印跡測試方法，更加容易實(shí)施也更加有效。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了檢測樣品中目標(biāo)核酸序列的方法，其中樣品包含生物復(fù)雜度比擴(kuò)增的核酸分子的生物復(fù)雜度更高的核酸分子，目標(biāo)核酸序列與已知的核酸序列至少有一個核苷酸的差異，該方法包括步驟a)提供結(jié)合有捕獲寡核苷酸的可尋址基板，其中捕獲寡核苷酸可以識別目標(biāo)核酸序列的第一部分的至少一部分；b)提供包含探測寡核苷酸的探測探針，其中探測寡核苷酸能夠與步驟(a)中的目標(biāo)核酸序列的第二部分的至少一部分雜交；c)在捕獲寡核苷酸能夠特異地、選擇性地與目標(biāo)核酸序列的第一部分有效雜交，以及探測探針能夠特異地、選擇性地與目標(biāo)核酸序列的第二部分有效雜交的條件下，使樣品與基板和探測探針接觸；和d)檢測捕獲寡核苷酸和探測探針是否與目標(biāo)核酸序列的第一部分和第二部分雜交。在另一個實(shí)施方案中，可尋址基板上結(jié)合有許多捕獲寡核苷酸，能夠識別目標(biāo)核酸序列的多個部分，包含探測寡核苷酸的一個或一個以上探測探針能夠與目標(biāo)核酸序列的一個或一個以上部分雜交，不能被捕獲寡核苷酸所識別。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了鑒定樣品中單核苷酸多態(tài)性的方法，其中樣品包含生物復(fù)雜度比擴(kuò)增的核酸分子的生物復(fù)雜度更高的核酸分子。該方法包括步驟a)提供結(jié)合有至少一個捕獲寡核苷酸的可尋址基板，其中所述的至少一個捕獲寡核苷酸能夠識別包含特定多態(tài)性的核酸靶物；b)提供結(jié)合有探測寡核苷酸的探測探針，其中探測寡核苷酸能夠與步驟(a)的核酸靶物的至少一部分雜交；c)在捕獲寡核苷酸能夠特異地、選擇性地與核酸靶物有效雜交，以及探測探針能夠特異地、選擇性地與核酸靶物有效雜交的條件下，使樣品與基板和探測探針接觸；和d)檢測捕獲寡核苷酸和探測探針是否與核酸靶物雜交。在另一個實(shí)施方案中，可尋址基板結(jié)合有許多捕獲寡核苷酸，能夠識別目標(biāo)核酸序列的多個部分，包含探測寡核苷酸的探測探針能夠與目標(biāo)核酸序列的一部分雜交，而不被捕獲寡核苷酸所識別。
本發(fā)明的方法可以區(qū)分僅有一個核苷酸差異的兩個序列。因此，在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可用于檢測具有至少一個核苷酸突變的具體目標(biāo)核酸分子。在優(yōu)選實(shí)施方案中，此突變是單核苷酸多態(tài)性(SNP)。
在另一個實(shí)施方案中，探測寡核苷酸可以被可探測地標(biāo)記。標(biāo)記多核苷酸的不同方法是現(xiàn)有技術(shù)中已知的，可以方便地應(yīng)用于此處描述的方法中。在特定的實(shí)施例中，本發(fā)明的可探測標(biāo)記可以是熒光的、發(fā)光的、拉曼(Raman)活性的、發(fā)磷光的、放射性的、或者在散射光中有效的、具有獨(dú)特的質(zhì)量的標(biāo)記，或者是其它的具有一些其它容易探測的特定的可探測物理或化學(xué)特性的標(biāo)記，為了增強(qiáng)所述的可探測特性，該標(biāo)記可以聚集或者一個或一個以上的拷貝附著于載體上，諸如樹枝狀高分子(dendrimer)、分子聚集體、量子點(diǎn)或者珠子。標(biāo)記允許通過例如光子學(xué)、電子學(xué)、聲學(xué)、光聲學(xué)、重力、電化學(xué)、酶學(xué)、化學(xué)、拉曼(Raman)、或者質(zhì)譜手段探測。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的探測探針可以是結(jié)合有探測寡核苷酸的納米粒子探針。由于源于其尺寸的獨(dú)特物理化學(xué)特性，納米粒子成為非常感興趣的研究對象。由于這些特性，納米粒子為比傳統(tǒng)檢測方法更敏感、特異性更強(qiáng)、更有成本優(yōu)勢的新型生物傳感器的發(fā)展提供了很有前景的途徑。合成納米粒子的方法和研究由其衍生的特性的方法學(xué)在過去10間得到了廣泛的發(fā)展(Klabunde，editor，Nanoscale Materials in Chemistry，WileyInterscience，2001)。然而，由于納米粒子和生物分子這兩種迥異的材料之間固有的不相容性，因而缺乏用感興趣的生物分子功能化納米粒子的強(qiáng)有力的方法，并因此導(dǎo)致納米粒子在生物學(xué)意義上的應(yīng)用受到限制。已經(jīng)發(fā)展出用修飾的寡核苷酸功能化納米粒子的高效方法。見U.S.Patent No.6,361,944和6,417,340(assigneeNanosphere，Inc.)，將其整體一并作為參考。該方法得到由寡核苷酸高度功能化的納米粒子，其具有令人驚訝的粒子穩(wěn)定性和雜交特性。由其溶液穩(wěn)定性可證實(shí)所得的DNA修飾的粒子是非常強(qiáng)有力的，其中溶液穩(wěn)定性包括電解濃度的提高、對離心或冷凍的穩(wěn)定性、以及重復(fù)加熱和冷卻時的熱穩(wěn)定性。這個裝載方法是可控制可修改的。功能化不同大小和成分的納米粒子，以及向納米粒子上裝載寡核苷酸識別序列可通過裝載方法來控制。合適的但非限制性的納米粒子的例子包括U.S.專利No.6,506,564，國際專利申請No.PCT/US02/16382，提交于2003年5月7日的U.S.專利申請No.10/431,341，以及國際專利申請No.PCT/US03/14100中所描述的那些納米粒子，所有這些文獻(xiàn)此處整體一并作為參考。
前述的制備DNA修飾的納米粒子，尤其是DNA修飾的金納米粒子探針的裝載方法，已使針對寡核苷酸的新的比色意義上的方案得到發(fā)展。這個方法基于兩個金納米粒子探針與感興趣的DNA靶物的兩個不同區(qū)域的雜交。由于每一個探針被多個具有相同序列的寡核苷酸功能化，因而當(dāng)存在足夠的靶物時，靶物的結(jié)合導(dǎo)致目標(biāo)DNA/金納米粒子探針聚集體的形成。由于粒子間距離的縮短，DNA靶物的識別導(dǎo)致比色改變。此比色改變可以用UV-vis分光光度計(jì)通過光學(xué)手段監(jiān)測或者用裸眼視覺監(jiān)測。另外，當(dāng)溶液濃縮至膜上時顏色加深。因此，簡單的比色改變提供了存在或不存在特定DNA序列的證據(jù)。使用這個測試，可以檢測到飛摩爾(femtomole)量和納摩爾濃度的模型DNA靶物以及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增的核酸序列。重要地，金探針/DNA靶物復(fù)合體顯示了非?？焖俚娜劢廪D(zhuǎn)變，使之成為高度特異的DNA靶物標(biāo)記。在模型系統(tǒng)中，一個堿基的插入、刪除、或者錯配可以通過基于顏色和溫度的斑點(diǎn)測試(spot test)或者通過分光光度法監(jiān)視聚集體的熔解轉(zhuǎn)變很容易地檢測到(Storhoff等，J.Am.Chem.Soc.，120，1959(1998))。也可參見，例如，U.S.Patent No.5,506,564。
由于急速的熔解轉(zhuǎn)變，當(dāng)雜交和檢測在非常嚴(yán)格的條件下(例如，比完好匹配的探針/靶物的熔解溫度低一度)進(jìn)行時，即使存在錯配的靶物，也可以檢測到匹配完好的靶物。伴隨著例如通過分子熒光團(tuán)標(biāo)記觀測到的更寬的熔解轉(zhuǎn)變，在與熔解溫度接近的溫度條件下的雜交和檢測將導(dǎo)致明顯的信號丟失，因?yàn)樘结?靶物復(fù)合體的部分熔解導(dǎo)致較低的靈敏度，同時由于錯配探針信號的影響，錯配探針/靶物復(fù)合體的部分雜交也導(dǎo)致較低的特異性。因此，納米粒子探針提供了檢測特異性更高的核酸檢測方法。
如此處所述，納米粒子探針，尤其是金納米粒子探針，令人驚訝且出乎意料地適合于基因組DNA的直接SNP檢測，且無需擴(kuò)增。首先，在納米粒子寡核苷酸探測探針中觀測到的非常快速的熔解轉(zhuǎn)變轉(zhuǎn)化為具有空前的、令人驚訝的檢測特異性，即使在人類基因組背景下也能夠允許單個堿基的辨別。第二，在基于DNA微陣列的測試中，基于銀的信號放大方法可進(jìn)一步提供超高的靈敏度提升。
在本發(fā)明方法中可以使用例如光學(xué)或平板掃描儀來檢測納米粒子。掃描儀可以連接到電腦上，電腦上裝載了能夠計(jì)算灰度值的軟件，計(jì)算得到的灰度值提供所檢測的核酸量的定量值。
適當(dāng)?shù)膾呙鑳x包括那些用于將文檔掃描至電腦中的、能夠以反射方式(例如平板掃描儀)工作的掃描儀、其他能夠執(zhí)行這項(xiàng)功能的或者使用相同的光學(xué)器件裝置、任何類型的灰度敏感測定裝置、以及經(jīng)改裝用于掃描本發(fā)明的基板的標(biāo)準(zhǔn)掃描儀(例如，經(jīng)改裝的包含基板支撐物的平板掃描儀)(目前，尚未發(fā)現(xiàn)能夠使用以傳輸模式工作的掃描儀)。掃描儀的分辨率必須足夠大，以使基板上的反應(yīng)區(qū)大于掃描儀的單個像素。在測試中產(chǎn)生的可檢測變化相對于基板能夠被觀測到的前提下(例如，銀染中產(chǎn)生的灰斑，可以在白色背景下觀測到，但不能在灰色背景下觀測到)，掃描儀可以與任何基板一起使用。掃描儀可以是黑白掃描儀或者優(yōu)選彩色掃描儀。
最優(yōu)選地，所述掃描儀是用于將文檔掃描入電腦的標(biāo)準(zhǔn)彩色掃描儀類型。這樣的掃描儀價格便宜，商業(yè)上容易獲得。例如，可以使用EpsonExpression 636(600×600dpi)、UMAX Astra 1200(300×300dpi)、或者M(jìn)icrotec 1600(1600×1600dpi)。掃描儀連接到電腦上，電腦中裝有處理掃描基板獲得的圖像的軟件。此軟件可以是商業(yè)上容易獲得的標(biāo)準(zhǔn)軟件，如Adobe Photoshop 5.2和Corel Photopaint 8.0。使用這些軟件計(jì)算灰度值提供了量化測試結(jié)果的手段。
這些軟件也可以給有色斑點(diǎn)加上彩色數(shù)字，可以得到掃描的圖像(如，打印輸出)，查看這些圖像可以得到核酸存在的定性測定結(jié)果、核酸的量，或者兩者均有。另外還發(fā)現(xiàn)，可以通過從代表陽性結(jié)果的顏色中減去代表陰性結(jié)果的顏色來提高測試的靈敏度。
電腦可以是標(biāo)準(zhǔn)個人電腦，其在商業(yè)上容易獲得。這樣，當(dāng)在基板上進(jìn)行測試時，使用連接于裝有標(biāo)準(zhǔn)軟件的標(biāo)準(zhǔn)電腦的標(biāo)準(zhǔn)掃描儀，提供了方便、容易、價格低廉的檢測和定量核酸的手段。掃描(圖像)也可以存儲在電腦中，保留結(jié)果記錄，以便進(jìn)一步參考或使用。當(dāng)然，如果需要的話，可以使用更加復(fù)雜的裝置和軟件。
可以與任何類型的催化銀還原的納米粒子一起使用銀染。貴重金屬(如，金和銀)制成的納米粒子是優(yōu)選的。見Bassell等，J.Cell Biol.，126，863-876(1994)；Braun-Howland等，Biotechniques，13，928-931(1992)。如果用于核酸檢測的納米粒子不催化銀的還原，那么可以將銀離子與核酸結(jié)合來催化還原。見Braun等，Nature，391，775(1998)。還有，已知銀染區(qū)可以與核酸上的磷酸基團(tuán)反應(yīng)。
銀染可用于產(chǎn)生或增強(qiáng)基板上進(jìn)行的任何測試中的可探測的變化，包括上面描述的那些。具體地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)銀染極大地提高了使用單一類型納米粒子的測試的靈敏度，以致于常?？梢圆皇褂眉{米粒子層、聚合探針層和核心探針層。
在另一個實(shí)施方案中，附著于基板的寡核苷酸可以置于兩個電極之間，納米粒子可以由導(dǎo)電材料制成，本發(fā)明方法中步驟(d)可以包括檢測導(dǎo)電性的變化。在另一個實(shí)施方案中，斑點(diǎn)陣列中的許多寡核苷酸附著于基板上，其中的每一個寡核苷酸都可以識別不同目標(biāo)核酸序列，每個寡核苷酸斑點(diǎn)都位于兩個電極之間，納米粒子由導(dǎo)電材料制成，本發(fā)明方法中步驟(d)包括檢測導(dǎo)電性的變化。電極可以由例如金制成，納米粒子也由金制成?？蛇x地，基板可以與銀染區(qū)接觸以產(chǎn)生導(dǎo)電性變化。
在具體的實(shí)施方案中，樣品中的核酸分子具有高于擴(kuò)增核酸分子的生物復(fù)雜度。本領(lǐng)域技術(shù)人員使用如Lewin，GENE EXPRESSION 2，SecondEditionEukaryotic Chromosomes，1980，John Wiley & Sons，New York中所描述的方法能夠很容易地測定目標(biāo)核酸序列的生物復(fù)雜度，該文獻(xiàn)此處一并作為參考。
雜交動力學(xué)絕對依賴于共反應(yīng)物(reaction partners)即必須雜交的鏈的濃度。在給定量的提取自細(xì)胞樣品的DNA中，總基因組、線粒體(如果存在的話)、以及染色體外成分(如果存在的話)的DNA的量僅僅是幾微克。因此，要雜交的共反應(yīng)物的實(shí)際濃度將依賴于這些共反應(yīng)物的大小和所提取的DNA的復(fù)雜度。例如，比較不同來源不同復(fù)雜度的DNA樣品時，每一基因組中存在一個拷貝的30個堿基的目標(biāo)序列存在不同的濃度。例如，同一目標(biāo)序列在1微克總?cè)祟怐NA中的濃度比在1微克細(xì)菌DNA中的濃度大約低1000倍，比存在于1微克小質(zhì)粒DNA樣品中的含量低約1,000,000倍。
人類基因組的高復(fù)雜度(1×109個核苷酸)要求異常高的特異性，因?yàn)榛蚪MDNA中有冗余和類似序列。例如，為了從全部人類基因組中區(qū)分出具有25聚寡核苷酸的捕獲鏈，需要具有40,000,000∶1的區(qū)分能力的特異性程度。另外，由于在25聚捕獲序列中，野生型和突變型靶物僅僅有一個堿基的差異，因而，為了成功進(jìn)行基因分型(genotyping)，需要區(qū)分具有96％同源性的兩個靶物。本發(fā)明令人驚訝地、出人意料地提供了有效、特異、靈敏地檢測與擴(kuò)增的核酸分子相比，具有更高復(fù)雜度的目標(biāo)核酸分子的方法。
源于人類組織的樣品中目標(biāo)核酸分子的生物復(fù)雜度狀況為1,000,000,000，但可能高于或低于植物或動物基因組10倍。優(yōu)選地，生物復(fù)雜度為大約50,000至5,000,000,000。最優(yōu)選地，生物復(fù)雜度為大約1,000,000,000。
在一個實(shí)施方案中，雜交條件對于捕獲寡核苷酸和/或探測寡核苷酸與目標(biāo)核酸序列的特異性、選擇性雜交是有效的，在這樣的雜交條件下，可以檢測到單一堿基的錯配，即使在所述目標(biāo)核酸是具有50,000或50,000以上生物復(fù)雜度的核酸樣品的一部分的情況下，例如下面實(shí)施例中所顯示的。
本發(fā)明的方法可以進(jìn)一步用于鑒定具體的生物學(xué)微生物物種(如葡萄球菌)和/或用于檢測賦予抗生素抗性的基因(例如，賦予抗生素甲氧西林抗性的mec A基因)。
甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌菌株(MRSA)已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)第一位的醫(yī)院病原體。美國大型教學(xué)醫(yī)院中，所有醫(yī)院來源的葡萄球菌感染中超過40％與這些細(xì)菌有關(guān)。最近它們已經(jīng)在較小型的醫(yī)院中流行(在具有200至500個床位的醫(yī)院中發(fā)生率為20％)，還有育嬰家庭(Wenzel等，1992，Am.J.Med.91(Supp 3B)221-7)。MRSA菌株不尋常的也是最不幸的特性是它們獲得額外的抗性因子的能力，所述抗性因子可抑制這些菌株對其他用于化療的抗生素的易感性。現(xiàn)在，這樣的多抗性菌株在世界范圍內(nèi)流行，這種病原體的最“先進(jìn)”形式攜帶有對大多數(shù)可用抗菌劑的抗性機(jī)制(Blumberg等，1991，J.Inf.Disease，Vol.63，pp.1279-85)。
甲氧西林抗性的主要遺傳成分是所謂的mec A基因。這個基因在一段未知的，非葡萄球菌起源的DNA片段上發(fā)現(xiàn)，很可能是由祖先MRSA細(xì)胞從外源獲得。mec A基因編碼名為PBP2A的青霉素(penicillin)結(jié)合蛋白(PBP)(Murakami和Tomasz，1989，J.Bacteriol.Vol.171，pp.874-79)，該蛋白對整個beta內(nèi)酰胺家族抗生素具有非常低的親和性。目前來看，PBP2A是一類“替代性”細(xì)胞壁合成酶，可以在正常PBP(細(xì)胞壁合成的正常催化劑)補(bǔ)充物由于環(huán)境中的beta內(nèi)酰胺抗生素而完全失活無法再行使功能時，接管葡萄球菌中至關(guān)重要的細(xì)胞壁合成任務(wù)。早期的轉(zhuǎn)座子失活實(shí)驗(yàn)證實(shí)了mecA基因的重要屬性和其抗生素抗性表型基因產(chǎn)物PBP2A，這個實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)座子Tn551轉(zhuǎn)入mec A基因。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果是，抗性水平從親本細(xì)菌中的最小抑制濃度(MIC)值1600μg/ml顯著下降至轉(zhuǎn)座子突變體中約4μg/ml的低值(Matthews和Tomasz，1990，Antimicrobial Agents and Chemotherapy，Vol.34，pp.1777-9)。
隨著抗生素抗性株系的增加，以及由凝固酶陰性葡萄球菌種引起的感染數(shù)的增加，醫(yī)院中的葡萄球菌感染變得更加難以治療。由于許多用于確定物種(物種形成分析)和抗生素抗性的測試需要很長的時間，這些感染的有效治療方法減少了。有了物種和抗生素抗性狀況的快速鑒定，對病人的治療進(jìn)程就可以更早實(shí)施，并且更少地使用廣譜抗生素。因此，很顯然需要快速地、高度靈敏地、選擇性地鑒定和區(qū)分葡萄球菌物種的方法和/或檢測mec A基因的方法。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于葡萄球菌物種形成分析和/或甲氧西林抗性基因(mec A)檢測的寡核苷酸序列和其反義互補(bǔ)序列，以及使用這些序列的納米粒子標(biāo)記探針、方法、以及試劑盒。這些設(shè)計(jì)的序列對葡萄球菌種或mec A基因具有高度的靈敏度和選擇性，其中mec A基因產(chǎn)生某些形式的抗生素抗性。這些序列可用于mec A基因檢測或者葡萄球菌物種形成分析的預(yù)定目的，也可用作其他系統(tǒng)的陰性對照。目前，可以如下述實(shí)施例中所示，將Tuf3和Tuf4、或者Tuf5和Tuf6中任一探針組與探針Tuf 2一起，用來將金黃色葡萄球菌與表皮葡萄球菌區(qū)分開。序列標(biāo)記的16S用于檢測葡萄球菌屬中包含的16S rRNA或者DNA的存在。如標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺化學(xué)法等傳統(tǒng)方法可用于制備這些序列作為捕獲探針和/或納米粒子標(biāo)記探針。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，這些序列可用于使用非擴(kuò)增基因組DNA的葡萄球菌物種形成分析和/或mec A檢測方法中。本發(fā)明的mec A基因序列已用于在當(dāng)前的測試條件和方式下，檢測雙鏈PCR產(chǎn)物濃度低至1×10-13M(100fM，3×106個拷貝)，超聲降解總基因組DNA含量少至33ng(1×107個拷貝)的50μl反應(yīng)體系中的mec A基因(見圖21)。測試中使用PCR擴(kuò)增基因產(chǎn)物或者總細(xì)菌基因組DNA也檢測了用于金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌物種形成分析的Tuf基因序列的靈敏度和特異性。目前確定的更低的檢測界限為50μl反應(yīng)體系中，雙鏈PCR產(chǎn)物1×10-12M(1pM，或者3×107個拷貝)，超聲降解基因組DNA 150ng(5×107個拷貝)(見圖20)。實(shí)施這些測試的條件在下面描述。本發(fā)明的方法使用未經(jīng)前期復(fù)雜度簡化或者目標(biāo)擴(kuò)增的細(xì)菌基因組DNA，通過區(qū)分具有一個或一個以上堿基差異的DNA序列，令人驚訝地提供了有效、靈敏、特異地檢測不同葡萄球菌物種的方法。
在本發(fā)明的另外一個實(shí)施方案中，當(dāng)使用PCR擴(kuò)增子時，可以使用第二個納米粒子探針代替如PCT/US01/46418(Nanosphere，Inc.，Assignee)中所述的附著于陣列基板的捕獲序列，其整體一并作為參考。當(dāng)目標(biāo)DNA與兩個納米粒子探針雜交導(dǎo)致顏色變化時，該系統(tǒng)可以通過光學(xué)方法檢測(例如顏色或光散射)。這種類型的測試可用于上述測試中所述的葡萄球菌物種鑒定或mec A基因檢測目的。
實(shí)施例將通過下面的說明性實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。以舉例的方式提供這些實(shí)施例并非要以任何方式限制本發(fā)明。在這些實(shí)施例中，所有的百分比如果是固體則為重量百分比，如果是液體則為體積百分比，如果沒有說明，所有的溫度均為攝氏度。
實(shí)施例1使用納米粒子探針在非擴(kuò)增基因組DNA中鑒定SNP的一步雜交法和兩步雜交法用提交于1997年7月21日的PCT/US97/12783、提交于2000年6月26日的PCT/US00/17507、提交于2001年1月12日的PCT/US01/01190中描述的方法制備用于檢測目標(biāo)因子II、MTHFR和因子V序列的金納米粒子寡核苷酸探針，這些文獻(xiàn)整體一并作為參考。圖3從概念上闡述了使用具有野生型或突變型捕獲探針寡核苷酸的DNA微陣列，將結(jié)合有寡核苷酸的金納米粒子探針用于檢測目標(biāo)DNA的用途。結(jié)合于納米粒子的寡核苷酸序列與目標(biāo)序列的一部分互補(bǔ)，而結(jié)合于玻璃芯片的捕獲寡核苷酸序列與目標(biāo)序列的另一部分互補(bǔ)。在雜交條件下，納米粒子探針、捕獲探針和目標(biāo)序列結(jié)合在一起形成復(fù)合體?？梢杂脗鹘y(tǒng)銀染增強(qiáng)所得復(fù)合體的檢測信號。
(a)金納米粒子的制備如Frens，1973，Nature Phys.Sci.，24120和Grabar，1995，Anal.Chem.67735所述，金膠體(直徑13nm)通過使用檸檬酸鹽還原HAuCl4來制備。簡單地說，所有的玻璃器具都在王水(3份HCl，1份HNO3)中洗凈，用Nanopure H2O沖洗，然后使用前用烘箱干燥。HAuCl4和檸檬酸鈉購自Aldrich化學(xué)藥品公司(Aldrich Chemical Company)。水合HAuCl4(1mM，500mL)用于攪動回流。然后，快速加入38.8mM檸檬酸鈉(50mL)。溶液顏色從淺黃色變?yōu)樽霞t色(burgundy)，回流持續(xù)15分鐘。冷卻至室溫后，使用MicronSeparations Inc.的1微米過濾器過濾紅色溶液。使用Hewlett Packard 8452A型二極管陣列分光光度計(jì)以紫外-可見(UV-vis)光譜學(xué)方法，同時使用Hitachi8100型透射電子顯微鏡以透射電子顯微術(shù)(TEM)確定金膠體的特征。當(dāng)與具有10-35核苷酸范圍的靶物和探針寡核苷酸序列聚集時，直徑15nm的金粒子會產(chǎn)生可見的顏色變化。
(b)寡核苷酸合成用ABI 8909DNA合成儀，在單柱模式下，采用亞磷酰胺化學(xué)法[Eckstein，F(xiàn).(ed.)Oligonucleotides and AnaloguesA Practical Approach(IRL Press，Oxford，1991)]，合成1微摩爾量的與MTHFR、因子II或因子V DNA序列片段互補(bǔ)的捕獲探針寡核苷酸。捕獲序列包含任何3′-氨基修飾劑，此3′-氨基修飾劑在陣列處理過程中作為共價粘附的活性基團(tuán)。通過下述的標(biāo)準(zhǔn)DNA合成方案合成寡核苷酸。具有3′-氨基修飾劑附著于固體支撐物上的柱子、標(biāo)準(zhǔn)核苷酸亞磷酰胺和試劑從Glen Research獲得。為了幫助純化，沒有將最后的二甲氧三苯甲基(DMT)保護(hù)基團(tuán)從寡核苷酸上切除。合成后，使用氨水將DNA從固體支撐物上裂解下來，結(jié)果產(chǎn)生在3’端包含游離胺的DNA分子。以0.03M Et3NH+OAc-緩沖液(TEAA)，pH7，1％/min梯度的95％CH3CN/5％TEAA，用裝有反相柱(多孔層實(shí)心球粒(Vydac))的Agilent 1100系列裝置進(jìn)行反相HPLC層析。流速1mL/min，260nm進(jìn)行UV檢測。緩沖液收集蒸發(fā)后，室溫下用80％乙酸處理30min，將DMT從寡核苷酸上裂解掉。然后將溶液蒸發(fā)至接近干燥，加入水，使用乙酸乙酯將裂解的DMT從寡核苷酸水溶液中萃取掉。在260nm吸光度處測定寡核苷酸的量，通過分析反相HPLC來評估最終的純度。
測試MTHFR基因中使用的捕獲序列如下MTHFR野生型，5′GATGAAATCGGCTCCCGCAGAC-NH23′(MTHFR-SNP/Cap6-WT22；SEQID NO1)，和MTHFR突變體，5′ATGAAATCGACTCCCGCAGACA-NH23′(MTHFR-SNP/Cap7-mut22；SEQ ID NO2)。與因子V基因相對應(yīng)的捕獲寡核苷酸如下因子V野生型，5′TGG ACA GGC GAG GAA TAC AGGTAT-NH23′(FV-Cap-WT24；SEQ ID NO3)，和因子V突變體，5′CTG GACAGG CAA GGA ATA CAG GTA TT-NH23′(FV-Cap-mut26；SEQ ID NO4)。因子II野生型5′CTCAGCGAGCCTCAATGCTCCC-NH23′(FII-SNP/Cap1-WT22；SEQ ID NO5)，和因子II突變體，5′CTCTCAGCAAGCCTCAATGCTCC-NH23′(FII-SNP/Cap1-mut23；SEQ IDNO6)。
設(shè)計(jì)用于檢測因子II、MTHFR和因子V基因的探測探針寡核苷酸包含類固醇二硫鍵，5′端接有識別序列。探針的序列如下F II探針，5′Epi-TCCTGG AAC CAA TCC CGT GAA AGA ATT ATT TTT GTG TTT CTA AAA CT3′(FII-Pro I-47；SEQ ID NO7)，MTHFR探針，5′Epi-AAA GAT CCC GGGGAC GAT GGG GCA AGT GAT GCC CAT GTC GGT GCA TGC CTT CACAAA G 3′(MTHFR-Pro II-58；SEQ ID NO8)，因子V探針，5′Epi-CCA CAGAAA ATG ATG CCC AGT GCT TAA CAA GAC CAT ACT ACA GTG A 3′(FV-Pro 46；SEQ ID NO9)。
依據(jù)經(jīng)過如下修改的所述捕獲探針合成方法來合成探針寡核苷酸。首先，使用帶有代表3′端識別序列的適當(dāng)核苷酸的支撐物代替氨基修飾劑柱子。第二，使用包含類固醇二硫化物(steroid disulfide)的修飾的亞磷酰胺(phosphoramidite)將5′端類固醇環(huán)狀二硫化物(steroid-cyclic disulfide)導(dǎo)入連接步驟(參見Letsinger等，2000，Bioconjugate Chem.11289-291和PCT/US01/01190(Nanosphere，Inc.)，這些內(nèi)容整體一并作為參考)?？梢酝ㄟ^以下方法制備亞磷酰胺在脫水條件下，將表雄甾酮(epiandrosterone)(0.5g)、1，2-二噻烷-4，5-二醇(0.28g)、和甲苯(30mL)中的對甲基苯磺酸(p-toluenesulfonic acid)(15mg)溶液回流7小時(Dean Starkapparatus)；然后在減壓條件下去除甲苯，殘液置于乙酸乙酯中。此溶液用水洗滌，硫酸鈉干燥，濃縮成糖漿狀殘液，將其在戊烷/醚中靜置過夜，得到白色固體狀、Rf值(TLC，硅片，醚作為抽提液)為0.5的類固醇二硫代縮酮(steroid-dithioketal)化合物(400mg)；相對照，同樣條件下獲得的表雄甾酮和1，2-二噻烷-4，5-二醇的Rf值分別為0.4和0.3。從戊烷/醚中重結(jié)晶得到白色粉末狀、mp 110-112℃，1H NMR，δ3.6(1H，C3OH)，3.54-3.39(2H，m 2OCH的二噻烷環(huán))，3.2-3.0(4H，m 2CH2S)，2.1-0.7(29H，m steroid H)；C23H36O3S2(M+H)的質(zhì)譜(ES+)計(jì)算值為425.2179，實(shí)測值為425.2151.Anal.(C23H37O3S2)S計(jì)算值15.12；實(shí)測值15.26。為了制備類固醇二硫化物縮酮亞磷酰胺衍生物(steroid-disulfide ketal phosphoramidite derivative)，將類固醇二硫代縮酮(100mg)溶于THF(3mL)，在干冰酒精浴中冷卻，連續(xù)加入N，N-二異丙基乙胺(80μL)和β-氰乙基氯二異丙基亞磷酰胺(β-cyanoethylchlorodiisopropylphosphoramidite)(80μL)；然后，混合液加熱至室溫，攪動2小時，與乙酸乙酯(100mL)混合，用5％水合NaHCO3和水洗滌，用硫酸鈉干燥，濃縮至干燥。殘留物置于最小量的二氯甲烷中，-70℃加入己烷使之沉淀，真空干燥；產(chǎn)物100mg；31P NMR 146.02。DNA合成完成后，在氨水條件下，將連接表雄甾酮二硫化物(epiandrosterone-disulfide)的寡核苷酸從支撐物上脫保護(hù)，依照上述方法使用反相柱在HPLC上純化。
(c)寡核苷酸附著于金納米粒子上4μM寡核苷酸溶液和～14nM的15nm檸檬酸鹽穩(wěn)定化的金納米粒子膠體溶液在終體積為2mL的溶液中先保溫24小時以制備探針。室溫下，溶液中的鹽濃度在40小時內(nèi)逐步升高至0.8M。所得溶液通過0.2μm醋酸纖維素濾膜，13,000G旋轉(zhuǎn)20分鐘?；{米粒子探針。去除懸浮物后，將粒化物重懸于水中。在最后步驟，將探針溶液再次粒化，并重懸于探針存儲緩沖液(10mM phos，100mM NaCl，0.01％w/v NaN3)。在基于520nm(ε＝2.4×108M-1cm-1)吸光值估算濃度后，將濃度調(diào)整至10nM。
下述特異用于因子II、MTHFR和因子V DNA的納米粒子-寡核苷酸共軛物以此方式制備因子II探針金-S′-5′-[TCC TGG AAC CAA TCC CGT GAA AGA ATTATT TTT GTG TTT CTA AAA CT-3′]n(FII-ProI-47；SEQ ID NO10)MTHFR探針金-S′-5′-[AAA GAT CCC GGG GAC GAT GGG GCA AGTGAT GCC CAT GTC GGT GCA TGC CTT CAC AAA G-3′]n(MTHFR-II58；SEQ ID NO11)因子V探針金-S′-5′-[CCA CAG AAA ATG ATG CCC AGT GCT TAACAA GAC CAT ACT ACA GTG A-3′]n(FV-46；SEQ ID NO12)S′指通過表雄甾酮二硫化物基團(tuán)制備的連接單元；n代表識別寡核苷酸的數(shù)目。
(d)DNA微陣列的制備使用GMS417陣列排布機(jī)(Affymetrix)將捕獲鏈排列于Superaldehyde載片(Telechem)或者CodeLinke載片(Amersham，Inc.)上。將排列斑點(diǎn)的布置設(shè)計(jì)為允許在每一個載片上進(jìn)行多個雜交，這樣的設(shè)計(jì)可通過用硅樹脂墊片(Grace Biolabs)將載片分割為單獨(dú)的測試孔的方法獲得。野生型和突變型在廠商提供的成斑緩沖液中三倍成斑。依據(jù)廠商推薦的方案進(jìn)行載片的排列后處理。
(e)雜交因子V SNP檢測測試方法采用下述的方案進(jìn)行因子V SNP檢測?；蛐蜑榧兒弦吧偷某暯到獾娜颂ケPDNA，或者鮭精DNA(Sigma)用乙醇沉淀，溶解于10nM FV探針溶液。在混合物中加入其他成分，最終的雜交混合物(5μL)包含3xSSC、0.03％Tween20、23％甲酰胺、5nM FV探針、和10μg人DNA、或者參照說明。99℃、4分鐘的加熱變性步驟之后，將雜交混合物加至檢測孔。將陣列于50℃保溫90分鐘。室溫下將陣列浸入0.5M NaNO3、0.05％ Tween 20一分鐘，由此開始雜交后的沖洗。去除墊片，再次于0.5M NaNO3/0.05％Tween 20溶液中沖洗檢測載片，室溫下保溫3分鐘(2x)，保溫時輕微攪動。如上所述，載片用銀增強(qiáng)溶液染色，在旋轉(zhuǎn)干燥機(jī)上干燥，于Array Worx生物芯片閱讀器(Model no.AWE，Applied Precision Inc.，Issaquah，WA，U.S.A.)上成像。
(f)結(jié)果因子V SNP檢測圖4顯示在Superaldehyde載片上，人類基因組DNA中因子V基因的SNP辨別。測試陣列包含野生型和突變型捕獲斑。頂部顯示的陣列與野生型人類基因組DNA雜交，底部的陣列與超聲降解的鮭精DNA雜交。野生型斑點(diǎn)的信號明顯高于與野生型人類基因組DNA雜交的突變型斑點(diǎn)的信號，顯示其為與因子V純合型野生基因型。在雜交條件下，沒有觀測到鮭精DNA雜交信號，以其作為測試對照。還用陣列在CodeLink載片上進(jìn)行了SNP辨別。
所設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)顯示野生型捕獲斑上的雜交并非歸因于其他一些序列，而是特異于包含人類因子V基因的基因組。使用人類野生型總DNA，在野生型捕獲斑觀測到了所期望的強(qiáng)雜交信號，而在突變斑觀測到了大約弱了3倍的信號。然而，當(dāng)抽提自鮭精的基因組DNA作為靶物時，沒有觀測到信號，因?yàn)榇薉NA不包含人類因子V基因。
圖5顯示了為使此方法能夠區(qū)分兩個具有1個核苷酸(SNP位點(diǎn))差異的目標(biāo)核酸(本例來自具有因子V基因突變的純合型患者)中而調(diào)整雜交條件的重要性。必須確定甲酰胺與SSC緩沖鹽濃度的適當(dāng)平衡以使目標(biāo)序列優(yōu)先結(jié)合其同源捕獲探針(例如Mut-A或Mut-B序列)。另外，圖5顯示了雜交中不同大小的捕獲寡核苷酸序列的影響。Mut-A序列長26個核苷酸，Mut-B序列長21個核苷酸。結(jié)果顯示在15％FM/1XSSC條件下特異性信號具有顯著差異，而在25％FM/6XSSC條件下沒有差異，兩個探針都產(chǎn)生了具有很好辨別能力的強(qiáng)信號。
為了確定在同樣條件下，是否能夠檢測樣品中一個以上的SNP類型，檢測了基因組DNA中野生型和突變型因子II和因子V基因的存在。正常人類(wt)基因組DNA、附著于基板上的捕獲寡核苷酸和納米粒子探針一起，40℃混合于35％FM和4X SSC中1小時。在因子II和因子V基因的野生型捕獲斑中優(yōu)先產(chǎn)生信號(圖6)。當(dāng)使用因子II為純合突變型而因子V為純合野生型的個體的總基因組DNA時，同樣雜交條件下的同樣陣列，在因子II突變型捕獲斑和因子V野生型捕獲斑優(yōu)先產(chǎn)生信號，清楚無誤地鑒定了此人在這兩個基因的SNP構(gòu)型上的遺傳組成(圖6)。這個結(jié)果顯示，可以設(shè)計(jì)捕獲寡核苷酸序列和雜交條件，使在同樣的雜交條件下，能夠在同一陣列中檢測一個以上的SNP類型。并且，野生型和突變型DNA的SNP辨別也是可能的，并不依賴于輸入DNA是正常來源還是突變來源。
兩步雜交法為了確定不同的嚴(yán)格條件對SNP辨別的影響，做了更多的試驗(yàn)。在測試中使用不同百分比的甲酰胺，使檢測陣列在不同的嚴(yán)格條件下雜交(圖7)。伴隨著嚴(yán)格程度的增加，出現(xiàn)信號丟失，而這轉(zhuǎn)而使信號的特異性得到提升。在沒有靶物的對照中幾乎觀測不到信號。測定斑點(diǎn)中信號的定量顯示，野生型斑點(diǎn)的信號比突變型斑點(diǎn)的信號高3-6倍(圖7B)。這些結(jié)果同時為基因組DNA中SNP的辨別不需要任何的目標(biāo)擴(kuò)增策略(的觀點(diǎn))提供支持。
將不同長度包括20、21、24、或者26個核苷酸(FV-WT20(SEQ ID NO13)5′(GGACAGGCGAGGAATACAGG)-(PEG)x3-NH2，3′FV-mut21(SEQID NO14)5′(TGGACAGGCAAGGAATACAGG)-(PEG)x3-NH23′，F(xiàn)V-wt24(SEQ ID NO15)5′TGG ACA GGC GAG GAA TAC AGG TAT-NH23′，F(xiàn)V-mut26(SEQ ID NO16)5′CTG GAC AGG CAA GGA ATA CAG GTATT-NH23′)的捕獲寡核苷酸按上述方法印于CodeLink載片上，加至5μg正常人胎盤基因組DNA(Sigma，St.Louis，MO)或者因子V突變?nèi)嘶蚪MDNA(分離自貯藏庫培養(yǎng)物GM14899，因子V缺陷，Coriell Institute)。在第一步，將載片和DNA置于20％FM、30％FM或40％FM，和4X SSC/0/04％Tween中40℃保溫2小時。然后，室溫下將載片在2XSSC中沖洗3分鐘。沖洗后，將識別因子V的探測寡核苷酸與納米粒子探針一起加入，然后將混合物40℃保溫1小時。按照上述方法銀染檢測信號。結(jié)果顯示，在經(jīng)最佳調(diào)整的條件下(本例中為30％FM)，人野生型DNA只在野生型探針上產(chǎn)生信號，而人突變型DNA只在突變捕獲探針產(chǎn)生信號(圖8)。改變條件的嚴(yán)格程度導(dǎo)致辨別能力的喪失(嚴(yán)格程度過低)或者信號的喪失(嚴(yán)格程度過高)。圖9顯示圖8中優(yōu)選(中間的)雜交條件的定量數(shù)據(jù)。
然后使用不同濃度的DNA在最佳條件下重復(fù)試驗(yàn)。如圖10中所看到的，DNA濃度為0.5μg、1.0μg和2.5μg時SNP辨別是成功的。因此，此方法能夠用很少量(少于1微克)的人總DNA檢測SNP。這些結(jié)果也顯示了捕獲寡核苷酸設(shè)計(jì)，以及嚴(yán)格條件與捕獲(和探測)探針的長度和核苷成分適當(dāng)匹配的重要性。
通過在一個載片的不同孔中用5μg野生型完整基因組DNA進(jìn)行10個相同的雜交，測定了兩步雜交法的可重復(fù)性。如圖11所示，10個單獨(dú)雜交中匹配和錯配的凈信號強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)偏差不重疊，顯示對于每一個雜交反應(yīng)，都可以可靠地確定輸入DNA的SNP構(gòu)型。
接下來，用該方法檢測因子V、因子II和MTHFR的SNP和制備相同樣品中的野生型基因。在上述的雜交條件下，將因子V、因子II或者M(jìn)THFR的捕獲寡核苷酸與5μg的完整基因組DNA一起保溫。第二步中加入專門用于檢測因子V、因子II或者M(jìn)THFR的納米粒子探針。此試驗(yàn)的結(jié)果如圖12-14所示，其顯示相同條件下，在單一陣列中可以同時分析至少3個不同基因的SNP構(gòu)型。圖13顯示了患者DNA樣品(GM16028)中此多元SNP檢測的結(jié)果，該結(jié)果是，對于每一個基因來講都是雜合的。圖14顯示了患者多元SNP檢測的結(jié)果，此患者因子II是雜合的，因子V為野生型，MTHFR為突變的。此方法精確地鑒定了此患者的基因型(患者樣品GM00037)。這些結(jié)果顯示辨別能力是足夠強(qiáng)的，能夠辨別純合與雜合突變基因。例如，對于任何給定的SNP來說，一個人可以是純合的野生型、突變型或者是雜合型(即一個野生型基因和一個突變型基因)。三個單獨(dú)的SNP位點(diǎn)的這三種不同情形可以在單獨(dú)的一次測試中正確地分別鑒定。結(jié)果顯示本發(fā)明的方法能夠同時鑒定單一樣品中的多個SNP。然而本試驗(yàn)中只鑒定了三個SNP，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠認(rèn)識到這僅僅是一個代表性數(shù)目。在同一陣列中是能夠檢測更多的SNP位點(diǎn)的。
除了這些試驗(yàn)，兩個不同的實(shí)驗(yàn)者還使用這些實(shí)施例中所述的方法，分別將8個不同的載片與來自2個不同病人的DNA雜交(病人GM14899的DNA為每個載片1個陣列，病人GM1600的DNA為每個載片2個陣列)。對于2個基因中的每一個(因子II和因子V)和每個類型的捕獲探針(突變型或者野生型)，每個陣列有4個重復(fù)斑點(diǎn)。將凈信號強(qiáng)度平均、分類，然后從最低信號強(qiáng)度開始繪圖。對于錯配信號(每張圖中的較低值)，將標(biāo)準(zhǔn)偏差加至平均凈信號三次。突變型和相應(yīng)野生型的信號總是位于彼此的上面。如圖15所示，即使是最小的信號強(qiáng)度，匹配的凈信號也總是比錯配的凈信號加上三倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差大。因此，在每一個例子中，都能夠以大于99％的可靠性來測定SNP的正確構(gòu)型。這些結(jié)果進(jìn)一步顯示了此處所述方法的強(qiáng)大及其可重復(fù)性。
實(shí)施例2本發(fā)明方法的雜交條件現(xiàn)有技術(shù)中描述的用于有效雜交反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)推薦方案(T.Maniatis，E.F.Fritsch，and J.Sambrook in“Molecular Cloning，A Laboratory Manual”，ColdSpring Harbor Laboratory，1982，p324)主要是規(guī)定雜交溫度低于Tm～10-20攝氏度，此Tm根據(jù)所選擇的雜交條件，包括鹽和甲酰胺濃度，計(jì)算得到。計(jì)算Tm值有不同的方法，每種方法都以準(zhǔn)確的寡核苷酸序列和緩沖液條件為基礎(chǔ)。例如，可以利用計(jì)算機(jī)程序進(jìn)行這種計(jì)算，這些程序可以從商業(yè)途徑或在線獲得，例如所開發(fā)的并保存在Wayne州立大學(xué)網(wǎng)站上的HYTHERTM服務(wù)器。發(fā)明人將HYTHERTM服務(wù)器上的所有可用的程序用于進(jìn)行這些計(jì)算，得到了捕獲探針和探測探針(即寡核苷酸)的Tm值。如表1所示，捕獲探針的Tm值低于或者非常接近于選擇用于雜交的溫度(即40℃)。因此，在這些條件下，可以預(yù)期雜交效率是很低的。另外，捕獲寡核苷酸直接附著于基板表面，即，沒有連接序列，這意味著最靠近表面的寡核苷酸可能無法參與與目標(biāo)序列的雜交，因此進(jìn)一步降低有效Tm值?；诂F(xiàn)有技術(shù)的教導(dǎo)，本發(fā)明方法中所使用的條件出人意料地獲得了高效的雜交，尤其是在目標(biāo)序列只是人類基因組所代表的復(fù)雜DNA混合物的一個很微小的片段(例如1/100,000,000或者1million′s％)的情況下。
表1

實(shí)施例3納米粒子-寡核苷酸共軛探針的制備本實(shí)施例中，制備了用于mec A和Tuf基因靶物PCR擴(kuò)增的代表性納米粒子-寡核苷酸共軛探測探針。使用申請于1997年7月21日的PCT/US97/12783、申請于2000年6月26日的PCT/US00/17507、申請于2001年1月12日的PCT/US01/01190中所描述的方法制備用于檢測目標(biāo)mec A或Tuf基因序列的金納米粒子-寡核苷酸探針，這些文獻(xiàn)整體一并作為參考。
(a)金納米粒子的制備如Frens，1973，Nature Phys.Sci.，24120和Grabar，1995，Anal.Chem.67735所述，金膠體(直徑13nm)通過使用檸檬酸鹽還原HAuCl4來制備。簡單地說，所有的玻璃器具都在王水(3份HCl，1份HNO3)中洗凈，用Nanopure H2O沖洗，然后在使用前烘箱干燥。HAuCl4和檸檬酸鈉購自Aldrich化學(xué)藥品公司(Aldrich Chemical Company)。水合HAuCl4(1mM，500mL)用于攪動回流。然后，快速加入38.8mM檸檬酸鈉(50mL)。溶液顏色從淺黃色變?yōu)樽霞t色(burgundy)，回流持續(xù)15分鐘。冷卻至室溫后，使用MicronSeparations Inc.的1微米過濾器過濾紅色溶液。使用Hewlett Packard 8452A型二極管陣列分光光度計(jì)以紫外-可見(UV-vis)光譜學(xué)方法，同時使用Hitachi8100型透射電子顯微鏡以透射電子顯微術(shù)(TEM)確定金膠體的特征。當(dāng)與具有10-35核苷酸范圍的靶物和探針寡核苷酸序列聚集時，直徑13nm的金粒子會產(chǎn)生可見的顏色變化。
(b)類固醇二硫化物的合成用Milligene Expedite DNA合成儀，在單柱模式下，采用亞磷酰胺化學(xué)法[Eckstein，F(xiàn).(ed.)Oligonucleotides and AnaloguesA Practical Approach(IRL Press，Oxford，1991)]的，合成1微摩爾量的與mecA和Tuf DNA序列互補(bǔ)的寡核苷酸。所有的溶液均購自Milligene(DNA合成級(DNA synthesisgrade))。平均連接效率從98至99.8％不等，為幫助純化，沒有將最后的二甲氧三苯甲基(DMT)保護(hù)基團(tuán)從寡核苷酸上裂解掉。
為便于探針序列與靶物的雜交，探針序列的5’端包括作為間隔區(qū)的脫氧腺苷寡核苷酸(除了Tuf2探針具有da10peg，其他所有探針均為da15peg)。
為了產(chǎn)生5’端類固醇環(huán)狀二硫化物寡核苷酸衍生物(見Letsinger等，2000，Bioconjugate Chem.11289-291和PCT/US01/01190(Nanosphere，inc.)其公開的內(nèi)容整體一并作為參考)，用環(huán)狀二噻烷連接的表雄甾酮亞磷酰胺在Applied Biosystems的自動合成儀上進(jìn)行最后的連接反應(yīng)，環(huán)狀二噻烷連接的表雄甾酮亞磷酰胺由1，2-二噻烷-4，5-二醇、表雄甾酮和甲苯中的對甲苯磺酸(PTSA)制得。亞磷酰胺試劑可按如下方法制備表雄甾酮(0.5g)、1，2-二噻烷-4，5-二醇(0.28g)和甲苯(30mL)中的對甲苯磺酸(15mg)的溶液在脫水條件下回流7小時(Dean Stark apparatus)。然后在減壓條件下去除甲苯，將殘液置于乙酸乙酯。將此溶液用水洗滌，硫酸鈉干燥，濃縮為糖漿狀殘液，在戊烷/醚中靜置過夜，得到白色固體狀類固醇二硫代縮酮化合物(400mg)；Rf值(TLC，硅片，醚作為抽提液)為0.5；相對照，同樣條件下獲得的表雄甾酮和1，2-二噻烷-4，5-二醇的Rf值分別為0.4和0.3。從戊烷/醚中重結(jié)晶得到白色粉末狀、mp 110-112℃，1H NMR，δ3.6(1H，C3OH)，3.54-3.39(2H，m2OCH的二噻烷環(huán))，3.2-3.0(4H，m 2CH2S)，2.1-0.7(29H，m類固醇H)；C23H36O3S2(M+H)的質(zhì)譜(ES+)計(jì)算值為425.2179，實(shí)測值為425.2151.Anal.(C23H37O3S2)S計(jì)算值15.12；實(shí)測值15.26。為了制備類固醇二硫化物酮亞磷酰胺衍生物，將類固醇二硫代縮酮(100mg)溶于THF(3mL)，在干冰酒精浴中冷卻，連續(xù)加入N，N-二異丙基乙胺(80μL)和β-氰乙基氯二異丙基亞磷酰胺(80μL)；然后，混合液加熱至室溫，攪動2小時，與乙酸乙酯(100mL)混合，用5％水合NaHCO3和水洗滌，用硫酸鈉干燥，濃縮至干燥。殘留物置于最小量的二氯甲烷中，-70℃加入己烷使之沉淀，真空干燥；產(chǎn)物100mg；31P NMR 146.02。在不去除最后的DMT的情況下，在AppliedBiosystems自動基因合成儀上合成表雄甾酮二硫化物連接的寡核苷酸。完成后，在氨水條件下，將表雄甾酮二硫化物連接的寡核苷酸從支撐物上脫保護(hù)，用反相柱在HPLC上純化。
用0.03M Et3NH+OAc-緩沖液(TEAA)，pH 7，1％/min梯度的95％CH3CN/5％TEAA，在裝備有Hewlett Packard ODS hypersil柱(4.6×200mm，顆粒大小為5mm)的Dionex DX500系統(tǒng)上進(jìn)行反相HPLC。流速為1mL/min，在260nm處進(jìn)行UV檢測。用制備型HPLC純化DMT保護(hù)的未修飾寡核苷酸。緩沖液收集蒸發(fā)后，用80％乙酸室溫下處理30min將DMT從寡核苷酸上裂解掉。將溶液蒸發(fā)至接近干燥，加入水，用乙酸乙酯將裂解的DMT從寡核苷酸水溶液中萃取出來。在260nm吸光度處測定寡核苷酸的量，用反相HPLC評估最終的純度。
(c)微陣列制備在DNA合成儀上按照下面的標(biāo)準(zhǔn)DNA合成方案合成含有3’-氨基和5’-氨基的DNA。通過在ArrayIt緩沖液添加物(plus)(Catalog no.MSP，CompanynameTelechem，citySunnyvale，StateCA)中印入(printing)1mM DNA溶液，將胺修飾的DNA附著于乙醛微陣列載片上。用具有500個微米打印針的Affymetrix GMS 417陣列排布機(jī)將微陣列在載片上定向。具有乙醛功能化表面的微陣列載片購自Telechem(catalog no.SMM，city Sunnyvale，stateCA)。印入后，在周圍環(huán)境溫度下，將載片放入潮濕的小室中12-18小時。移去載片并將其真空干燥30分鐘至2小時。然后將載片在0.2％w/v SDS中沖洗兩次，在水中沖洗兩次以除去任何殘留的非結(jié)合DNA。然后，將載片置于2.5M硼氫化鈉溶于含20％v/v 100％乙醇的1X PBS的溶液中浸泡處理5分鐘。然后用0.2％w/v SDS沖洗三次，用水沖洗兩次，離心干燥。
(d)寡核苷酸附著于金納米粒子按照上面A部分所述方法制備的檸檬酸鹽穩(wěn)定化金納米粒子膠體溶液(約10nM)與按照B部分所述方法制備的硫修飾-a15 peg-探針寡核苷酸(4μM)混合，室溫下將其于20ml的閃爍瓶中靜置6小時。將pH 7.0的0.1M磷酸氫鈉緩沖液和5.0M NaCl都加至溶液中，得到0.01M磷酸氫鈉和0.1M NaCl的溶液，將其再靜置16小時。以梯度方式加入氯化鈉，36小時內(nèi)使NaCl濃度達(dá)到0.8M，所得的溶液再保溫18小時。將溶液均分至1ml eppendorf管，在Eppendorf Centrifuge 5414中14,000rpm離心25分鐘，得到非常淺的粉紅色上清液，其中包含了大部分的寡核苷酸(260nm處吸光度值所顯示的)連同7-10％的膠體金(520nm處吸光度值所顯示的)，在試管的底部是致密的、黑色凝膠狀殘留物。移去上清液，在所需水緩沖液中重懸殘留物。本實(shí)施例中，所使用的緩沖液包括0.1M NaCl、10mM檸檬酸鈉和0.01％疊氮鈉，pH值為7。
下面的納米粒子-寡核苷酸探測探針和特異于mecA和Tuf DNA的胺修飾DNA捕獲探針以此種方式制備此處，寡核苷酸探針可以用胺修飾并固定于玻璃載片上作為捕獲探針，或者用表雄甾酮連接物修飾并固定在金顆粒上作為探測探針。換句話說，寡核苷酸和它的反向互補(bǔ)序列可互換用作捕獲探針或納米粒子探測探針。
(a)探測探針探針Tuf 1金-S′-5′-[a15PEG-ttctatttccgtactactgac-3′]n(SEQ ID NO17)探針Tuf 2金-S′-5′-[a15peg-ttctatttccgtactactgacgtaact-3′]n(SEQ ID NO18)探針Tuf 35′-[胺-peg3-ccattcttctcaaactatcgt-3′](SEQ ID NO19)探針Tuf 45′-[胺-peg3-ccattcttcactaactatcgc-3′](SEQ ID NO20)探針Tuf 55′-[胺-peg3-cacactccattcttctcaaact-3′](SEQ ID NO21)探針Tuf 65′-[胺-peg3-cacactccattcttcactaact-3′](SEQ ID NO22)探針Tuf 75′-[胺-peg3-atatgacttcccaggtgac-3′](SEQ ID NO23)探針Tuf 85′-[胺-peg3-gtagatacttacattcca-3′](SEQ ID NO24)探針Tuf 95′-[胺-peg3-gttgatgattacattcca-3′](SEQ ID NO25)探針Tuf 105′-[胺-peg3-ccattcttcactaactaccgc-3′](SEQ ID NO26)探針Tuf 115′-[胺-peg3-catacgccattcttcactaact-3′](SEQ ID NO27)探針Tuf 155′-[胺-peg3-ccattcttctctaactatcgt-3′](SEQ ID NO28)探針Tuf 165′-[胺-peg3-ccattcttcacaaactatcgt-3′](SEQ ID NO29)探針Tuf 175′-[胺-peg3-ccattcttcagtaactatcgc-3′](SEQ ID NO30)探針Tuf 185′-[胺-peg3-ccattcttcagtaactaccgc-3′](SEQ ID NO31)探針Tuf 195′-[胺-peg3-ccattcttctcaaactaccgc-3′](SEQ ID NO32)探針Tuf 205′-[胺-peg3-ccattcttctctaactaccgt-3′](SEQ ID NO33)探針Tuf 215′-[胺-peg3-catacgccattcttcagtaact-3′](SEQ ID NO34)探針Tuf 225′-[胺-peg3-cacactccattcttcagtaact-3′](SEQ ID NO35)探針Tuf 235′-[胺-peg3-catactccattcttcactaact-3′](SEQ ID NO36)探針Tuf 245′-[胺-peg3-catacaccattcttctcaaact-3′](SEQ ID NO37)探針Tuf 255′-[胺-peg3-catactccattcttctctaact-3′](SEQ ID NO38)探針Tuf 265′-[胺-peg3-cacactccattcttcacaaact-3′](SEQ ID NO39)探針Tuf 275′-[胺-peg3-cacactccattcttctctaact-3′](SEQ ID NO40)探針mecA 15′-[胺-peg3-tcgatggtaaaggttggc-3′](SEQ ID NO41)探針mecA 25′-[胺-peg3-atggcatgagtaacgaagaatata-3′](SEQ ID NO42)探針mecA 3金-S′-5′-[胺-peg3-aaagaacototgotcaacaag-3′]n(SEQ ID NO43)探針mecA 4金-S′-5′-[胺-peg3-gcacttgtaagcacaccttcat-3′]n(SEQID NO44)
探針mecA 65′-[胺-peg3-ttccagattacaacttcacca-3′](SEQ ID NO45)探針16S 125′-[胺-peg3-gttcctccatatctctgcg-3′](SEQ ID NO46)探針16S 13金-S′-5’-[胺-peg3-atttcacogotacacatg-3′]n(SEQ ID NO47)s′表示經(jīng)由表雄甾酮二硫化物基團(tuán)制備的連接單元；n代表納米粒子-寡核苷酸共軛物制備中使用的不同數(shù)目的寡核苷酸。
表2


實(shí)施例4用金納米粒子探針檢測來自細(xì)菌基因組DNA的mec A基因序列本實(shí)施例中，描述了在陣列布局中，使用以金納米粒子檢測為基礎(chǔ)的檢測mec A基因序列的方法。具有作為捕獲探針的mecA 2和mecA 6寡核苷酸的微陣列板與mecA 4寡核苷酸探測探針標(biāo)記的金納米粒子一起使用。微陣列板、捕獲探針和探測探針按照實(shí)施例3所述的方法制備。
如實(shí)施例3所述方法制備的附著有寡核苷酸探針的金納米粒子(直徑13nm)用于顯示與三成分三明治測試形式的透明基板雜交的mec A DNA的存在。然后，附著有探針寡核苷酸的納米粒子和分離自甲氧西林抗性(MecA+)或甲氧西林敏感性(MecA-)金黃色葡萄球菌細(xì)菌細(xì)胞的基因組DNA靶物共雜交于這些基板上。因此，納米粒子在表面上的存在顯示檢測到了mec A基因序列，見圖16。在所測試的靶物量(250ng(7.5E7個拷貝)-1μg(3.0E8))，用裸眼不能觀察到附著的納米粒子。為了便于對雜交于基板表面的納米粒子進(jìn)行觀察，采用了信號放大方法，在該方法中用對苯二酚催化還原銀離子，在載片表面上形成銀金屬。盡管在組織化學(xué)顯微術(shù)研究中這個方法已被用于放大蛋白質(zhì)和抗體共軛的金納米粒子(Hacker，in Colloidal GoldPrinciples，Methods，and Applications，M.A.Hayat，Ed.(Academic Press，SanDiego，1989))，vol.1，chap.10；Zehbe等，Am.J.Pathol.150，1553(1997))，但是其在定量DNA雜交測試中的用途是新的(Tomlinson等，Anal.Biochem.，171217(1988))。此方法不僅使表面覆蓋率非常低的納米粒子探針能夠通過平板掃描儀或用裸眼觀測到，也允許定量染色區(qū)上基于銀染放大的金探針散射光的靶物雜交。很明顯，在所測試每一個基因組DNA的量上，從含有甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌基因組DNA的樣品得到的信號強(qiáng)度比從含有甲氧西林敏感性金黃色葡萄球菌基因組DNA得到信號強(qiáng)度高得多。這表明，此檢測方法學(xué)可在復(fù)雜細(xì)菌基因組DNA背景的存在下，用于mec A基因的特異性檢測，見圖16。這個結(jié)果是納米粒子寡核苷酸共軛物的不尋常特點(diǎn)，它使核酸的超靈敏和選擇性檢測成為可能。也應(yīng)當(dāng)注意到，該方法不需要酶學(xué)靶物或者信號放大方法，它提供了從細(xì)菌基因組DNA樣品中檢測基因的新方法。
(a)目標(biāo)DNA制備分離自葡萄球菌細(xì)菌細(xì)胞的純化的總基因組DNA購自ATCC(AmericanType Culture Collection)。如實(shí)施例5(見下面)中所述，在陣列雜交之前，總基因組DNA通過超聲降解片段化以剪切DNA分子。
(b)MecA基因檢測測試(ii)測試方法含量范圍為250ng-1μg的細(xì)菌基因組DNA和lnM納米粒子探針的反應(yīng)混合物在1×雜交緩沖液(5×SSC，0.05％Tween 20)中制備。將反應(yīng)混合物加熱至95℃5分鐘。隨后，將10-25μL的反應(yīng)混合物加至微陣列表面，40℃及90％的相對濕度條件下雜交2小時。微陣列表面在室溫下，以5×SSC、0.05％Tween 20洗滌30秒。干燥微陣列，并用商業(yè)級銀增強(qiáng)劑溶液(silverenhancer solution)(銀增強(qiáng)劑試劑盒(Silver Enhancer Kit)，Catalog No.SE-100，Sigma，St.Louis)進(jìn)行銀接觸顯色4分鐘。然后，將銀染的微陣列盤洗滌、干燥并用Arrayworx掃描儀(Model No.AWE，Applied Precision，Inc.，Issaquah，WA)成像。
實(shí)施例5用細(xì)菌基因組DNA和金納米粒子標(biāo)記的Tuf探針進(jìn)行葡萄球菌物種形成分析本實(shí)施例中，通過辨別與金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌菌種相應(yīng)的Tuf基因序列進(jìn)行葡萄球菌物種形成分析。從分離自金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌細(xì)菌細(xì)胞的總基因組DNA擴(kuò)增的Tuf 372bp PCR擴(kuò)增子作為陽性對照來顯示陣列的序列特異性。在單獨(dú)的雜交反應(yīng)中，將分離自金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌細(xì)菌細(xì)胞的總基因組DNA片段化，并將其與微陣列板雜交。微陣列板包括結(jié)合在其上的Tuf 3、Tuf 4或者Tuf 5和Tuf 6捕獲探針。Tuf 2寡核苷酸標(biāo)記的金納米粒子用作探測探針。按照實(shí)施例3描述的方法制備微陣列板、捕獲和探測探針。用傳統(tǒng)PCR擴(kuò)增方法制備Tuf 372bp擴(kuò)增子。
(a)目標(biāo)DNA制備按照如下方法制備基因組DNA分離自培養(yǎng)的葡萄球菌細(xì)菌細(xì)胞的基因組DNA購自ATCC(American Type Culture Collection)。將＞10μg部分的干燥DNA于體積為200μl的無DNA酶的水中再次水合。然后使用Misonix，超聲細(xì)胞破碎儀(Ultrasonic cell disruptor)XL Farmingdale，NY，以12次，每次約0.5秒的2瓦功率的脈沖，將其超聲降解。使用商業(yè)上可獲得的來自Molecular Probes的Picogreen試劑盒測定總DNA濃度，并在Tecanspectrafluor plus熒光板讀數(shù)器上讀數(shù)。在Agilent 2100生物分析儀(Bioanalyzer)上進(jìn)行掃描分析(smear analysis)，由此測得的DNA片段的大小為平均1.5Kb。用傳統(tǒng)PCR擴(kuò)增技術(shù)，從金黃色葡萄球菌或表皮葡萄球菌基因組DNA中制備了陽性對照tuf基因372堿基對PCR擴(kuò)增子。
(b)Tuf基因檢測測試方法在單獨(dú)的雜交孔中，將分離自表皮葡萄球菌或金黃色葡萄球菌細(xì)菌細(xì)胞(8.0E07個拷貝，～250ng)的片段化總基因組DNA和1nM納米粒子探針混合于1x雜交緩沖液(5X SSC，0.05％Tween 20)中。同一基因組DNA樣品的PCR擴(kuò)增Tuf基因片段作為陽性對照，與探針和緩沖液混合于玻璃載片上的單獨(dú)雜交孔中。將反應(yīng)混合物加熱至95℃5分鐘。隨后，將50μl反應(yīng)混合物加至微陣列表面，45℃及90％相對濕度條件下雜交1.5小時。微陣列表面室溫下在0.5M NaNO3中沖洗30秒。干燥微陣列，并用商業(yè)級銀增強(qiáng)劑溶液(Silver Enhancer Kit，Catalog No.SE-100，Sigma，St.，Louis，MO)進(jìn)行銀接觸顯色4分鐘。然后沖洗銀染的微陣列板，干燥，用Arrayworx掃描儀(Model No.AWE，Applied Precision，Issaquah，WA)將陣列上的銀染放大納米粒子探針的散射光成像并量化。
Tuf3和Tuf4捕獲探針的結(jié)果如圖17(a)和(b)所示，Tuf5和Tuf6捕獲探針的結(jié)果如圖17(c)和(d)所示。使用Tuf3和Tuf4捕獲探針組，當(dāng)基因組DNA與陣列雜交時，觀測到了陣列上對應(yīng)于葡萄球菌種金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的特異性信號。這有力地證明了，在總基因組DNA存在下，區(qū)分這些緊密相關(guān)的序列不需要通過PCR進(jìn)行tuf基因靶物的復(fù)雜度簡化和擴(kuò)增。使用Tuf3和Tuf4捕獲探針組，也觀測到了對應(yīng)于適當(dāng)物種的信號，但是與錯配捕獲序列有一些交叉反應(yīng)，由此導(dǎo)致較低的識別率。這表明序列設(shè)計(jì)對于物種的精確鑒定是至關(guān)重要的。
實(shí)施例6用PCR擴(kuò)增子和金納米粒子標(biāo)記mec A和Tuf寡核苷酸作為探測探針進(jìn)行葡萄球菌物種形成分析和甲氧西林抗性測試本實(shí)施例中，所設(shè)計(jì)的用于鑒定葡萄球菌的屬、種、以及抗生素抗性狀況的陣列由來自16S rRNA基因(屬)、Tuf基因(金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、和腐生葡萄球菌的種特異性捕獲種)和mec A基因(抗生素抗性狀況)的序列制成。注意到表皮葡萄球菌和腐生葡萄球菌捕獲探針只有一個核苷酸差異，而金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌捕獲探針有三個核苷酸的差異。微陣列板包括所有下述序列16S 12、mecA 6、Tuf 3、Tuf 4、Tuf 10捕獲探針和結(jié)合在其上的一個陰性雜交捕獲探針。金納米粒子標(biāo)記的Tuf 2、mecA 4、和16S 12探針用作探測探針。微陣列板、捕獲探針和探測探針按照實(shí)施例4所述方法制備。用PCR擴(kuò)增的來自各種甲氧西林抗性和甲氧西林敏感性葡萄球菌物種(金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌)的基因序列測試陣列的特異性。用于測試的特異性PCR擴(kuò)增基因片段如圖18所示(mecA 281、16S 451、和Tuf 372)。源于圖18所示的不同葡萄球菌物種的Tuf基因序列從GenBank獲得。
靶物制備
使用標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增方法制備PCR擴(kuò)增的基因產(chǎn)物。
測試每個反應(yīng)體系包括50μl 5x SSC、0.05％Tween 20、0.01％BSA、200pM的每種納米粒子探針、和15％甲酰胺以及750pM的每種目標(biāo)擴(kuò)增子。試劑在40℃和90％濕度條件下雜交1小時。室溫下在0.5M NaNO3中洗滌微陣列表面30秒。干燥微陣列，并用商業(yè)級銀增強(qiáng)劑溶液(Silver Enhancer Kit，Catalog No.SE-100，Sigma，St.Louis，MO)進(jìn)行銀接觸顯色4分鐘。然后沖洗銀染的微陣列板，干燥，用Arrayworx掃描儀(Model No.AWE，AppliedPrecision，Issaquah，WA)成像。
結(jié)果如圖19(a)和(b)所示。當(dāng)采用標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增方法時，用顯示陣列序列特異性的PCR擴(kuò)增子正確地鑒定了所選擇的五個葡萄球菌樣品(見如下表3)的物種和甲氧西林抗性狀況。
表3

實(shí)施例7使用基因組DNA和金納米粒子標(biāo)記的mecA、16S和Tuf探針進(jìn)行葡萄球菌物種形成分析和甲氧西林抗性測試此實(shí)施例中，使用分離自金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的細(xì)菌細(xì)胞的總基因組DNA進(jìn)行葡萄球菌的屬、種和抗生素抗性狀況的鑒定。所測試的基因組DNA樣品由ATCC表示的特征如上述表3中所述。實(shí)施例6中測試用的微陣列板和探測探針也用于本實(shí)施例。以實(shí)施例3中描述的方法制備微陣列板和捕獲及探測探針。按照實(shí)施例5的方法制備基因組DNA樣品。每個反應(yīng)體系包括50μl 5x SSC、0.05％Tween 20、0.01％BSA、200pM的每種納米粒子探針、和15％甲酰胺以及3.3ng/μl的超聲降解基因組DNA。試劑在40℃和90％濕度條件下雜交2小時。室溫下在0.5M NaNO3中洗滌微陣列表面30秒。干燥微陣列，并用商業(yè)級銀增強(qiáng)劑溶液(Silver EnhancerKit，Catalog No.SE-100，Sigma，St.，Louis)進(jìn)行銀接觸顯色4分鐘。然后沖洗銀染的微陣列板，干燥，用Arrayworxt掃描儀(Model No.AWE，AppliedPrecision，Issaquah，WA)成像。
結(jié)果如圖20所示。很明顯，以每個樣品中僅在正確的捕獲探針位點(diǎn)處高出背景三倍標(biāo)準(zhǔn)偏差的凈信號強(qiáng)度為基礎(chǔ)，正確地鑒定了所測試的三個基因組DNA的葡萄球菌菌種和抗生素抗性狀況。這個實(shí)驗(yàn)顯示，當(dāng)葡萄球菌基因組DNA與陣列雜交，以及被銀染放大的金納米粒子探針標(biāo)記時，即便是Tuf基因內(nèi)單個核苷酸的突變也能夠被檢測到。因此，通過這個無需任何基于酶的目標(biāo)擴(kuò)增(如PCR)或信號放大(辣根過氧化物酶)方法的新的檢測方法學(xué)，可以對給定基因序列中只有少至單個核苷酸差異的生物學(xué)微生物進(jìn)行物種形成分析。
將已知量的分離自甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌細(xì)胞的總基因組DNA滴加至測試體系(assay)中，測量來自mecA基因捕獲探針的凈信號強(qiáng)度，如圖21，以此測量測試敏感度。最低可檢測量為34ng，對應(yīng)于約1千萬個基因組拷貝。所描述的檢測方法的進(jìn)一步優(yōu)化應(yīng)當(dāng)能夠檢測到更少量的基因組DNA。
應(yīng)當(dāng)理解前述公開的內(nèi)容著重于本發(fā)明的某些具體實(shí)施方案，與其等價的所有修改或替換都包括在本發(fā)明的精神和范圍之內(nèi)，如附加的權(quán)利要求中所列出那樣。
權(quán)利要求
1.檢測樣品中目標(biāo)核酸序列的方法，所述樣品包含相對于擴(kuò)增的核酸分子更高生物復(fù)雜度的核酸分子，目標(biāo)核酸序列與一個或一個以上核酸序列至少有一個核苷酸不同，該方法包括步驟a)提供結(jié)合有捕獲寡核苷酸的可尋址基板，其中捕獲寡核苷酸具有與目標(biāo)核酸序列的第一部分的至少一部分互補(bǔ)的序列；b)提供包含探測寡核苷酸的探測探針，其中探測寡核苷酸具有與步驟(a)的目標(biāo)核酸序列的第二部分的至少一部分互補(bǔ)的序列；c)在捕獲寡核苷酸能夠與目標(biāo)核酸序列的第一部分有效雜交，探測探針能夠與目標(biāo)核酸序列的第二部分有效雜交，以及允許區(qū)分目標(biāo)序列與具有至少一個核苷酸不同的所述的一個或一個以上核酸序列的條件下，使樣品與基板和探測探針接觸；和d)檢測捕獲寡核苷酸和探測探針是否與目標(biāo)核酸序列的第一和第二部分雜交。
2.權(quán)利要求1的方法，其中目標(biāo)核酸序列包含單核苷酸多態(tài)性。
3.權(quán)利要求1的方法，其中單一核苷酸的不同被結(jié)合于基板的捕獲寡核苷酸識別。
4.權(quán)利要求1的方法，其中單一核苷酸的不同被探測寡核苷酸識別。
5.權(quán)利要求1的方法，其中目標(biāo)核酸分子包含基因組DNA、基因組RNA、表達(dá)的RNA、質(zhì)粒DNA、線粒體或其他細(xì)胞器官DNA、游離的細(xì)胞DNA、病毒DNA或病毒RNA、或者上述兩個或兩個以上的混合物。
6.權(quán)利要求1的方法，其中基板包含許多捕獲寡核苷酸，其中每一個都能夠識別不同的單核苷酸多態(tài)性。
7.權(quán)利要求1的方法，其中樣品包含一個以上的核酸靶物，其中每一個核酸靶物都包含一個或一個以上不同的單核苷酸多態(tài)性。
8.權(quán)利要求1的方法，其中提供了一個或一個以上類型的探測探針，其中每一個探測探針都有與之結(jié)合的探測寡核苷酸，能夠與不同的核酸靶物雜交。
9.權(quán)利要求1的方法，其中將樣品與探測探針接觸，以使存在于樣品中的核酸靶物與探測探針上的探測寡核苷酸雜交，然后將結(jié)合于探測探針的核酸靶物與基板接觸以使核酸靶物與基板上的捕獲寡核苷酸雜交。
10.權(quán)利要求1的方法，其中將樣品與基板接觸以使存在于樣品中的核酸靶物與捕獲寡核苷酸雜交，然后將結(jié)合于捕獲寡核苷酸的核酸靶物與探測探針接觸，以使核酸靶物與探測探針上的探測寡核苷酸雜交。
11.權(quán)利要求1的方法，其中樣品同時與探測探針和基板接觸。
12.權(quán)利要求1的方法，其中探測寡核苷酸包含可探測標(biāo)記。
13.權(quán)利要求12的方法，其中探測標(biāo)記允許通過光子學(xué)、電子學(xué)、聲學(xué)、光聲、重力、電化學(xué)、電光(electro-optic)、質(zhì)譜、酶學(xué)、化學(xué)、生物化學(xué)、或者物理學(xué)手段探測。
14.權(quán)利要求12的方法，其中標(biāo)記是熒光的。
15.權(quán)利要求12的方法，其中標(biāo)記是發(fā)光的。
16.權(quán)利要求12的方法，其中標(biāo)記是發(fā)磷光的。
17.權(quán)利要求12的方法，其中標(biāo)記是放射性的。
18.權(quán)利要求12的方法，其中標(biāo)記是納米粒子。
19.權(quán)利要求12的方法，其中標(biāo)記是樹枝狀高分子。
20.權(quán)利要求12的方法，其中標(biāo)記是分子聚集體。
21.權(quán)利要求12的方法，其中標(biāo)記是量子點(diǎn)。
22.權(quán)利要求12的方法，其中標(biāo)記是珠子。
23.權(quán)利要求1的方法，其中探測探針是結(jié)合有探測寡核苷酸的納米粒子探針。
24.權(quán)利要求23的方法，其中納米粒子由貴重金屬制成。
25.權(quán)利要求24的方法，其中納米粒子由金或銀制成。
26.權(quán)利要求25的方法，其中納米粒子由金制成。
27.權(quán)利要求23的方法，其中檢測包括將基板與銀染區(qū)接觸。
28.權(quán)利要求23的方法，其中檢測包括檢測由納米粒子散射的光。
29.權(quán)利要求23的方法，其中檢測包括用光掃描儀觀測。
30.權(quán)利要求23的方法，其中檢測包括用平板掃描儀觀測。
31.權(quán)利要求29或30的方法，其中掃描儀連接于電腦上，電腦上裝載有能夠計(jì)算灰度值的軟件，所計(jì)算的灰度值提供所檢測核酸的量的定量值。
32.權(quán)利要求23的方法，其中附著于基板上的寡核苷酸位于兩個電極之間，納米粒子由電導(dǎo)體材料制成，并且步驟(d)包括檢測導(dǎo)電性的改變。
33.權(quán)利要求32的方法，其中電極由金制成，納米粒子也由金制成。
34.權(quán)利要求32的方法，其中基板與銀染區(qū)接觸，產(chǎn)生了導(dǎo)電性的改變。
35.權(quán)利要求23的方法，其中每一個都能夠識別不同的目標(biāo)核酸序列的許多寡核苷酸附著于基板上的斑點(diǎn)陣列中，每個寡核苷酸斑點(diǎn)都位于兩個電極之間，納米粒子由電導(dǎo)體材料制成，并且步驟(d)包括檢測導(dǎo)電性的改變。
36.權(quán)利要求35的方法，其中電極由金制成，納米粒子也由金制成。
37.權(quán)利要求35的方法，其中基板與銀染區(qū)接觸以產(chǎn)生導(dǎo)電性的改變。
38.檢測樣品中一個或一個以上目標(biāo)核酸序列的方法，所述樣品包含比擴(kuò)增的核酸分子生物復(fù)雜度更高的核酸分子，一個或一個以上目標(biāo)核酸序列中的每一個與已知核酸序列都至少有一個核苷酸不同，該方法包括步驟a)提供結(jié)合有許多捕獲寡核苷酸的可尋址基板，其中捕獲寡核苷酸具有與一個或一個以上目標(biāo)核酸序列的一個或一個以上部分互補(bǔ)的序列；b)提供一個或一個以上包含探測寡核苷酸的探測探針，其中探測寡核苷酸具有與步驟(a)的一個或一個以上目標(biāo)核酸序列的一個或一個以上部分互補(bǔ)的序列；c)在捕獲寡核苷酸能夠與一個或一個以上目標(biāo)核酸序列的一個或一個以上部分有效雜交，探測探針能夠與一個或一個以上目標(biāo)核酸序列的部分有效雜交，以及允許區(qū)分具有至少一個核苷酸差異的目標(biāo)核酸序列的條件下，使樣品與基板和探測探針接觸；和d)檢測任何的捕獲寡核苷酸和探測探針是否與任何的目標(biāo)核酸序列雜交。
39.權(quán)利要求38的方法，其中目標(biāo)核酸序列包含單核苷酸多態(tài)性。
40.權(quán)利要求38的方法，其中單一核苷酸的差異由結(jié)合于基板的捕獲寡核苷酸所識別。
41.權(quán)利要求38的方法，其中單一核苷酸的差異由探測寡核苷酸所識別。
42.權(quán)利要求38的方法，其中目標(biāo)核酸分子包含基因組DNA、基因組RNA、表達(dá)的RNA、質(zhì)粒DNA、線粒體或其他細(xì)胞器官DNA、游離的細(xì)胞DNA、病毒DNA或病毒RNA、或者上述兩個或兩個以上的混合物。
43.權(quán)利要求38的方法，其中基板包含許多捕獲寡核苷酸，其中每一個捕獲寡核苷酸都能夠識別不同的單核苷酸多態(tài)性。
44.權(quán)利要求38的方法，其中樣品包含一個以上的核酸靶物，其中每一個都包含不同的單核苷酸多態(tài)性。
45.權(quán)利要求38的方法，其中提供了一個或一個以上類型的探測探針，其中每一個核酸靶物都結(jié)合有探測寡核苷酸，能夠與不同的核酸靶物雜交。
46.權(quán)利要求38的方法，其中將樣品與探測探針接觸，以使存在于樣品中的核酸靶物與探測探針上的探測寡核苷酸雜交，然后將結(jié)合于探測探針的核酸靶物與基板接觸以使核酸靶物與基板上的捕獲寡核苷酸雜交。
47.權(quán)利要求38的方法，其中將樣品與基板接觸以使存在于樣品中的核酸靶物與捕獲寡核苷酸雜交，然后將結(jié)合于捕獲寡核苷酸的核酸靶物與探測探針接觸，以使核酸靶物與探測探針上的探測寡核苷酸雜交。
48.權(quán)利要求38的方法，其中樣品同時與探測探針和基板接觸。
49.權(quán)利要求38的方法，其中探測探針包含可探測標(biāo)記。
50.權(quán)利要求49的方法，其中探測標(biāo)記允許通過光子學(xué)、電子學(xué)、聲學(xué)、光聲、重力、電化學(xué)、電光、質(zhì)譜、酶學(xué)、化學(xué)、生物化學(xué)、或者物理學(xué)手段探測。
51.權(quán)利要求49的方法，其中標(biāo)記是熒光的。
52.權(quán)利要求49的方法，其中標(biāo)記是發(fā)光的。
53.權(quán)利要求49的方法，其中標(biāo)記是發(fā)磷光的。
54.權(quán)利要求49的方法，其中標(biāo)記是放射性的。
55.權(quán)利要求49的方法，其中標(biāo)記是納米粒子。
56.權(quán)利要求49的方法，其中標(biāo)記是樹枝狀高分子。
57.權(quán)利要求49的方法，其中標(biāo)記是分子聚集體。
58.權(quán)利要求49的方法，其中標(biāo)記是量子點(diǎn)。
59.權(quán)利要求49的方法，其中標(biāo)記是珠子。
60.權(quán)利要求38的方法，其中探測探針是結(jié)合有探測寡核苷酸的納米粒子探針。
61.權(quán)利要求60的方法，其中納米粒子由貴重金屬制成。
62.權(quán)利要求61的方法，其中納米粒子由金或銀制成。
63.權(quán)利要求62的方法，其中納米粒子由金制成。
64.權(quán)利要求60的方法，其中檢測包括將基板與銀染區(qū)接觸。
65.權(quán)利要求60的方法，其中檢測包括觀測由納米粒子散射的光。
66.權(quán)利要求60的方法，其中檢測包括用光掃描儀觀測。
67.權(quán)利要求60的方法，其中檢測包括用平板掃描儀觀測。
68.權(quán)利要求66或67的方法，其中掃描儀連接于電腦上，電腦上裝載有能夠計(jì)算灰度值的軟件，所計(jì)算的灰度值提供所檢測核酸的量的定量值。
69.權(quán)利要求60的方法，其中附著于基板上的寡核苷酸位于兩個電極之間，納米粒子由電導(dǎo)體材料制成，并且步驟(d)包括檢測導(dǎo)電性的改變。
70.權(quán)利要求69的方法，其中電極由金制成，納米粒子也由金制成。
71.權(quán)利要求69的方法，其中基板與銀染區(qū)接觸以產(chǎn)生導(dǎo)電性的改變。
72.權(quán)利要求60的方法，其中每一個都能夠識別不同的目標(biāo)核酸序列的許多寡核苷酸附著于基板上的斑點(diǎn)陣列中，每個寡核苷酸斑點(diǎn)都位于兩個電極之間，納米粒子由電導(dǎo)體材料制成，并且步驟(d)包括檢測導(dǎo)電性的改變。
73.權(quán)利要求72的方法，其中電極由金制成，納米粒子也由金制成。
74.權(quán)利要求72的方法，其中基板與銀染區(qū)接觸以產(chǎn)生導(dǎo)電性的改變。
75.鑒定樣品中單核苷酸多態(tài)性的方法，所述樣品包含比擴(kuò)增的核酸分子生物復(fù)雜度更高的核酸分子，該方法包括步驟a)提供結(jié)合有至少一個捕獲寡核苷酸的可尋址基板，其中所述的至少一個捕獲寡核苷酸具有與包含特定多態(tài)性的核酸靶物的至少一部分互補(bǔ)的序列；b)提供結(jié)合有探測寡核苷酸的探測探針，其中探測寡核苷酸具有與步驟(a)的核酸靶物的至少一部分互補(bǔ)的序列；c)在捕獲寡核苷酸能夠與核酸靶物有效雜交，探測探針能夠與核酸靶物有效雜交，以及允許區(qū)分具有單一核苷酸差異的靶物的條件下，使樣品與基板和探測探針接觸；和d)檢測捕獲寡核苷酸和探測探針是否與核酸靶物雜交。
76.權(quán)利要求75的方法，其中多態(tài)性由結(jié)合于基板的捕獲寡核苷酸所識別。
77.權(quán)利要求75的方法，其中多態(tài)性由探測寡核苷酸所識別。
78.權(quán)利要求75的方法，其中樣品中的核酸分子包含基因組DNA、基因組RNA、表達(dá)的RNA、質(zhì)粒DNA、線粒體或其他細(xì)胞器官DNA、游離的細(xì)胞DNA、病毒DNA或病毒RNA、或者上述兩個或兩個以上的混合物。
79.權(quán)利要求75的方法，其中基板包含許多捕獲寡核苷酸，其中每一個捕獲寡核苷酸都能夠識別不同的單核苷酸多態(tài)性。
80.權(quán)利要求75的方法，其中樣品包含一個以上的核酸靶物，其中每一個核酸靶物都包含一個或一個以上不同的單核苷酸多態(tài)性。
81.權(quán)利要求75的方法，其中提供了一個或一個以上類型的探測探針，其中每一個探測探針都結(jié)合有探測寡核苷酸，能夠與不同的核酸靶物雜交。
82.權(quán)利要求75的方法，其中將樣品與探測探針接觸，以使存在于樣品中的核酸靶物與探測探針上的探測寡核苷酸雜交，然后將結(jié)合于探測探針的核酸靶物與基板接觸以使核酸靶物與基板上的捕獲寡核苷酸雜交。
83.權(quán)利要求75的方法，其中將樣品與基板接觸以使存在于樣品中的核酸靶物與捕獲寡核苷酸雜交，然后將結(jié)合于捕獲寡核苷酸的核酸靶物與探測探針接觸，以使核酸靶物與探測探針上的探測寡核苷酸雜交。
84.權(quán)利要求75的方法，其中樣品同時與探測探針和基板接觸。
85.權(quán)利要求75的方法，其中探測探針包含可探測標(biāo)記。
86.權(quán)利要求85的方法，其中探測標(biāo)記允許通過光子學(xué)、電子學(xué)、聲學(xué)、光聲、重力、電化學(xué)、電光、質(zhì)譜、酶學(xué)、化學(xué)、生物化學(xué)、或者物理學(xué)手段探測。
87.權(quán)利要求85的方法，其中標(biāo)記是熒光的。
88.權(quán)利要求85的方法，其中標(biāo)記是納米粒子。
89.權(quán)利要求85的方法，其中標(biāo)記是發(fā)光的。
90.權(quán)利要求85的方法，其中標(biāo)記是發(fā)磷光的。
91.權(quán)利要求85的方法，其中標(biāo)記是放射性的。
92.權(quán)利要求85的方法，其中標(biāo)記是樹枝狀高分子。
93.權(quán)利要求85的方法，其中標(biāo)記是分子聚集體。
94.權(quán)利要求85的方法，其中標(biāo)記是量子點(diǎn)。
95.權(quán)利要求85的方法，其中標(biāo)記是珠子。
96.權(quán)利要求75的方法，其中探測探針是結(jié)合有探測寡核苷酸的納米粒子探針。
97.權(quán)利要求96的方法，其中納米粒子由貴重金屬制成。
98.權(quán)利要求97的方法，其中納米粒子由金或銀制成。
99.權(quán)利要求98的方法，其中納米粒子由金制成。
100.權(quán)利要求96的方法，其中檢測包括將基板與銀染區(qū)接觸。
101.權(quán)利要求96的方法，其中檢測包括檢測由納米粒子散射的光。
102.權(quán)利要求96的方法，其中檢測包括用光掃描儀觀測。
103.權(quán)利要求96的方法，其中檢測包括用平板掃描儀觀測。
104.權(quán)利要求102或103的方法，其中掃描儀連接于電腦，電腦上裝載有能夠計(jì)算灰度值的軟件，所計(jì)算的灰度值提供所檢測核酸的量的定量值。
105.權(quán)利要求96的方法，其中附著于基板上的寡核苷酸位于兩個電極之間，納米粒子由電導(dǎo)體材料制成，并且步驟(d)包括檢測導(dǎo)電性的改變。
106.權(quán)利要求105的方法，其中電極由金制成，納米粒子也由金制成。
107.權(quán)利要求105的方法，其中基板與銀染區(qū)接觸以產(chǎn)生導(dǎo)電性的改變。
108.權(quán)利要求96的方法，其中每一個都能夠識別不同的單核苷酸多態(tài)性的許多寡核苷酸附著于基板上的斑點(diǎn)陣列中，每個寡核苷酸斑點(diǎn)都位于兩個電極之間，納米粒子由電導(dǎo)體材料制成，并且步驟(d)包括檢測導(dǎo)電性的改變。
109.權(quán)利要求108的方法，其中電極由金制成，納米粒子也由金制成。
110.權(quán)利要求109的方法，其中基板與銀染區(qū)接觸以產(chǎn)生導(dǎo)電性的改變。
111.鑒定樣品中一個或一個以上單核苷酸多態(tài)性的方法，所述樣品包含比擴(kuò)增的核酸分子生物復(fù)雜度更高的核酸分子，該方法包括步驟a)提供結(jié)合有許多捕獲寡核苷酸的可尋址基板，其中捕獲寡核苷酸具有與核酸靶物的多個部分互補(bǔ)的序列，每個所述的部分都包含特定的多態(tài)性；b)提供包含探測寡核苷酸的一個或一個以上探測探針，其中探測寡核苷酸具有與步驟(a)的核酸靶物其中之一的至少一部分互補(bǔ)的序列，該核酸靶物不被基板上的捕獲寡核苷酸所識別；c)在捕獲寡核苷酸能夠與核酸靶物的多個部分有效雜交，探測探針能夠與核酸靶物有效雜交，以及允許區(qū)分具有單一核苷酸差異的靶物的條件下，使樣品與基板和探測探針接觸；和d)檢測任何的捕獲寡核苷酸和探測探針是否與任何的核酸靶物雜交。
112.權(quán)利要求111的方法，其中多態(tài)性由結(jié)合于基板的捕獲寡核苷酸所識別。
113.權(quán)利要求111的方法，其中多態(tài)性由探測寡核苷酸所識別。
114.權(quán)利要求111的方法，其中樣品中的核酸分子包含基因組DNA、基因組RNA、表達(dá)的RNA、質(zhì)粒DNA、線粒體或其他細(xì)胞器官DNA、游離的細(xì)胞DNA、病毒DNA或病毒RNA、或者上述兩個或兩個以上的混合物。
115.權(quán)利要求111的方法，其中基板包含許多捕獲寡核苷酸，其中每一個都能夠識別一個或一個以上不同的單核苷酸多態(tài)性。
116.權(quán)利要求111的方法，其中樣品包含一個以上的核酸靶物，其中每一個都包含不同的單核苷酸多態(tài)性。
117.權(quán)利要求111的方法，其中提供了一個或一個以上類型的探測探針，其中每一個都結(jié)合有探測寡核苷酸，能夠與不同的核酸靶物雜交。
118.權(quán)利要求111的方法，其中將樣品與探測探針接觸，以使存在于樣品中的核酸靶物與探測探針上的探測寡核苷酸雜交，然后將結(jié)合于探測探針的核酸靶物與基板接觸以使核酸靶物與基板上的捕獲寡核苷酸雜交。
119.權(quán)利要求111的方法，其中將樣品與基板接觸以使存在于樣品中的核酸靶物與捕獲寡核苷酸雜交，然后將結(jié)合于捕獲寡核苷酸的核酸靶物與探測探針接觸，以使核酸靶物與探測探針上的探測寡核苷酸雜交。
120.權(quán)利要求111的方法，其中樣品同時與探測探針和基板接觸。
121.權(quán)利要求111的方法，其中探測寡核苷酸包含可探測標(biāo)記。
122.權(quán)利要求121的方法，其中探測標(biāo)記允許通過光子學(xué)、電子學(xué)、聲學(xué)、光聲、重力、電化學(xué)、電光、質(zhì)譜、酶學(xué)、化學(xué)、生物化學(xué)、或者物理學(xué)手段探測。
123.權(quán)利要求121的方法，其中標(biāo)記是熒光的。
124.權(quán)利要求121的方法，其中標(biāo)記是發(fā)光的。
125.權(quán)利要求121的方法，其中標(biāo)記是發(fā)磷光的。
126.權(quán)利要求121的方法，其中標(biāo)記是放射性的。
127.權(quán)利要求121的方法，其中標(biāo)記是納米粒子。
128.權(quán)利要求121的方法，其中標(biāo)記是樹枝狀高分子。
129.權(quán)利要求121的方法，其中標(biāo)記是分子聚集體。
130.權(quán)利要求121的方法，其中標(biāo)記是量子點(diǎn)。
131.權(quán)利要求121的方法，其中標(biāo)記是珠子。
132.權(quán)利要求111的方法，其中探測探針是結(jié)合有探測寡核苷酸的納米粒子探針。
133.權(quán)利要求132的方法，其中納米粒子由貴重金屬制成。
134.權(quán)利要求133的方法，其中納米粒子由金或銀制成。
135.權(quán)利要求134的方法，其中納米粒子由金制成。
136.權(quán)利要求132的方法，其中檢測包括將基板與銀染區(qū)接觸。
137.權(quán)利要求132的方法，其中檢測包括檢測由納米粒子散射的光。
138.權(quán)利要求132的方法，其中檢測包括用光掃描儀觀測。
139.權(quán)利要求132的方法，其中檢測包括用平板掃描儀觀測。
140.權(quán)利要求138或139的方法，其中掃描儀連接于電腦，電腦上裝載有能夠計(jì)算灰度值的軟件，所計(jì)算的灰度值提供所檢測核酸的量的定量值。
141.權(quán)利要求132的方法，其中附著于基板上的寡核苷酸位于兩個電極之間，納米粒子由電導(dǎo)體材料制成，并且步驟(d)包括檢測導(dǎo)電性的改變。
142.權(quán)利要求141的方法，其中電極由金制成，納米粒子也由金制成。
143.權(quán)利要求141的方法，其中基板與銀染區(qū)接觸以產(chǎn)生導(dǎo)電性的改變。
144.權(quán)利要求141的方法，其中每一個都能夠識別不同的單核苷酸多態(tài)性的許多寡核苷酸附著于基板上的斑點(diǎn)陣列中，每個寡核苷酸斑點(diǎn)都位于兩個電極之間，納米粒子由電導(dǎo)體材料制成，并且步驟(d)包括檢測導(dǎo)電性的改變。
145.權(quán)利要求144的方法，其中電極由金制成，納米粒子也由金制成。
146.權(quán)利要求146的方法，其中基板與銀染區(qū)接觸以產(chǎn)生導(dǎo)電性的改變。
147.權(quán)利要求1、38、75或111的方法，其中更高的生物復(fù)雜度大于約50,000。
148.權(quán)利要求1、38、75或111的方法，其中更高的生物復(fù)雜度為約50,000-50,000,000,000。
149.權(quán)利要求1、38、75或111的方法，其中更高的生物復(fù)雜度為約1,000,000,000。
150.權(quán)利要求1或38的方法，其中目標(biāo)核酸序列是生物學(xué)微生物基因的一部分。
151.權(quán)利要求1或38的方法，其中目標(biāo)核酸序列是葡萄球菌基因的一部分。
152.權(quán)利要求151的方法，其中葡萄球菌是金黃色葡萄球菌、溶血葡萄球菌、表皮葡萄球菌、里昂葡萄球菌、人型葡萄球菌、或腐生葡萄球菌。
153.權(quán)利要求151的方法，其中目標(biāo)核酸序列是Tuf基因的一部分。
154.權(quán)利要求151的方法，其中目標(biāo)核酸序列是femA基因的一部分。
155.權(quán)利要求151的方法，其中目標(biāo)核酸序列是16S rRNA基因的一部分。
156.權(quán)利要求151的方法，其中目標(biāo)核酸序列是hsp60基因的一部分。
157.權(quán)利要求151的方法，其中目標(biāo)核酸序列是sodA基因的一部分。
158.權(quán)利要求1或38的方法，其中目標(biāo)核酸序列是mecA基因的一部分。
159.權(quán)利要求1或38的方法，其中目標(biāo)核酸序列包含SEQ ID NO17，SEQ ID NO18，SEQ ID NO19，SEQ ID NO20，SEQ ID NO21，SEQ ID NO22，SEQ ID NO23，SEQ ID NO24，SEQ ID NO24，SEQ ID NO26，SEQ IDNO27，SEQ ID NO28，SEQ ID NO29，SEQ ID NO30，SEQ ID NO31，SEQ ID NO32，SEQ ID NO33，SEQID NO34，SEQ ID NO35，SEQ ID NO36，SEQ ID NO37，SEQ ID NO38，SEQ ID NO39，SEQ ID NO40，SEQ IDNO41，SEQ ID NO42，SEQ ID NO43，SEQ ID NO44，SEQ ID NO45，SEQ ID NO46，SEQ ID NO47，SEQ ID NO48，SEQ ID NO49，SEQ ID NO50，SEQ ID NO51，SEQ ID NO52，SEQ ID NO53，SEQ ID NO54，SEQ IDNO55，SEQ ID NO56，SEQ ID NO57，SEQ ID NO58，SEQ ID NO59，SEQ ID NO60，SEQ ID NO61，SEQ ID NO62，SEQ ID NO63，SEQ ID NO64，SEQ ID NO65，SEQ ID NO66，SEQ ID NO67，SEQ ID NO68，SEQ IDNO69，SEQ ID NO70，SEQ ID NO71，SEQ ID NO72，SEQ ID NO73，SEQ ID NO74，SEQ ID NO75，SEQ ID NO76，SEQ ID NO77，或SEQ IDNO78中所列出的序列。
160.權(quán)利要求1或38的方法，其中，至少其中一個探測寡核苷酸包含SEQ ID NO17，SEQ ID NO18，SEQ ID NO19，SEQ ID NO20，SEQ ID NO21，SEQ ID NO22，SEQ ID NO23，SEQ ID NO24，SEQ ID NO24，SEQ IDNO26，SEQ ID NO27，SEQ ID NO28，SEQ ID NO29，SEQ ID NO30，SEQID NO31，SEQ ID NO32，SEQ ID NO33，SEQ ID NO34，SEQ ID NO35，SEQ ID NO36，SEQ ID NO37，SEQ ID NO38，SEQ ID NO39，SEQ ID NO40，SEQ ID NO41，SEQ ID NO42，SEQ ID NO43，SEQ ID NO44，SEQ IDNO45，SEQ ID NO46，SEQ ID NO47，SEQ ID NO48，SEQ ID NO49，SEQID NO50，SEQ ID NO51，SEQ ID NO52，SEQ ID NO53，SEQ ID NO54，SEQ ID NO55，SEQ ID NO56，SEQ ID NO57，SEQ ID NO58，SEQ IDNO59，SEQ ID NO60，SEQ ID NO61，SEQ ID NO62，SEQ ID NO63，SEQ ID NO64，SEQ ID NO65，SEQ ID NO66，SEQ ID NO67，SEQ ID NO68，SEQ ID NO69，SEQ ID NO70，SEQ ID NO71，SEQ ID NO72，SEQ IDNO73，SEQ ID NO74，SEQ ID NO75，SEQ ID NO76，SEQ ID NO77，或SEQ ID NO78中所列出的序列。
161.權(quán)利要求1的方法，其中捕獲寡核苷酸包含SEQ ID NO17，SEQID NO18，SEQ ID NO19，SEQ ID NO20，SEQ ID NO21，SEQ ID NO22，SEQ ID NO23，SEQ ID NO24，SEQ ID NO24，SEQ ID NO26，SEQID NO27，SEQ ID NO28，SEQ ID NO29，SEQ ID NO30，SEQ ID NO31，SEQ IDNO32，SEQ ID NO33，SEQID NO34，SEQ ID NO35，SEQ ID NO36，SEQID NO37，SEQID NO38，SEQ ID NO39，SEQ ID NO40，SEQ ID NO41，SEQ ID NO42，SEQ ID NO43，SEQ ID NO44，SEQ ID NO45，SEQ ID NO46，SEQ ID NO47，SEQ ID NO48，SEQID NO49，SEQ ID NO50，SEQ IDNO51，SEQ ID NO52，SEQ ID NO53，SEQ ID NO54，SEQ ID NO55，SEQ ID NO56，SEQ ID NO57，SEQ ID NO58，SEQ ID NO59，SEQ ID NO60，SEQ ID NO61，SEQ ID NO62，SEQ ID NO63，SEQ ID NO64，SEQ IDNO65，SEQ ID NO66，SEQ ID NO67，SEQ ID NO68，SEQ ID NO69，SEQ ID NO70，SEQ ID NO71，SEQ ID NO72，SEQ ID NO73，SEQ ID NO74，SEQ ID NO75，SEQ ID NO76，SEQ ID NO77，或SEQ ID NO78中所列出的序列。
162.權(quán)利要求38的方法，其中，至少其中一個捕獲寡核苷酸包含SEQID NO17，SEQ ID NO18，SEQ ID NO19，SEQ ID NO20，SEQ ID NO21，SEQ ID NO22，SEQ ID NO23，SEQ ID NO24，SEQ ID NO24，SEQ ID NO26，SEQ ID NO27，SEQ ID NO28，SEQ ID NO29，SEQ ID NO30，SEQ IDNO31，SEQ ID NO32，SEQ ID NO33，SEQ ID NO34，SEQ ID NO35，SEQ ID NO36，SEQ ID NO37，SEQ ID NO38，SEQ ID NO39，SEQ ID NO40，SEQ ID NO41，SEQ ID NO42，SEQ ID NO43，SEQ ID NO44，SEQ IDNO45，SEQ ID NO46，SEQ ID NO47，SEQ ID NO48，SEQ ID NO49，SEQ ID NO50，SEQ ID NO51，SEQ ID NO52，SEQ ID NO53，SEQID NO54，SEQ ID NO55，SEQ ID NO56，SEQ ID NO57，SEQ ID NO58，SEQ IDNO59，SEQ ID NO60，SEQID NO61，SEQ ID NO62，SEQ ID NO63，SEQID NO64，SEQ ID NO65，SEQ ID NO66，SEQ ID NO67，SEQ ID NO68，SEQ ID NO69，SEQ ID NO70，SEQ ID NO71，SEQ ID NO72，SEQ ID NO73，SEQ ID NO74，SEQ ID NO75，SEQ ID NO76，SEQ ID NO77，或SEQID NO78中所列出的序列。
163.權(quán)利要求38的方法，其中，至少其中一個目標(biāo)核酸序列是葡萄球菌基因的一部分，并且至少其中一個目標(biāo)核酸序列是mecA基因的一部分。
164.權(quán)利要求38的方法，其中該方法用于區(qū)分同一屬中兩個或兩個以上種。
165.權(quán)利要求164的方法，其中所述種有兩個或兩個以上不連續(xù)核苷酸的不同。
166.權(quán)利要求164的方法，其中所述種有兩個或兩個以上連續(xù)核苷酸的不同。
167.權(quán)利要求164的方法，其中所述種有至少一個核苷酸的不同。
全文摘要
本發(fā)明提供檢測樣品中目標(biāo)核酸分子的方法，所述樣品包含具有比擴(kuò)增的核酸分子更高生物復(fù)雜度的核酸分子。具體地，本發(fā)明提供檢測樣品中單核苷酸多態(tài)性(SNP)的方法和探針，所述樣品包含具有比擴(kuò)增的核酸分子更高生物復(fù)雜度的核酸分子。
文檔編號G01N33/00GK1878874SQ200380109533
公開日2006年12月13日 申請日期2003年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月12日
發(fā)明者鮑奕佳, 薩達(dá)卡·S·馬拉, 尤維·米勒, 詹姆斯·J·斯托霍夫, 蘇珊·R·赫策爾 申請人:內(nèi)諾斯佩爾公司