專(zhuān)利名稱(chēng)：Gpi抗原酶聯(lián)免疫法體外定量測(cè)定診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及GPI(葡萄糖6磷酸異構(gòu)酶，Glucose-6-phosphateisomerase)抗原酶免疫法體外定量測(cè)定診斷試劑盒、制備方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)患者、約64％的健康人群和類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎未控制的患者在血清中和關(guān)節(jié)腔積液內(nèi)存在GPI。主要是體內(nèi)T細(xì)胞系統(tǒng)和B淋巴細(xì)胞系統(tǒng)產(chǎn)生分泌大量GPI抗原進(jìn)入血清和關(guān)節(jié)腔內(nèi)，使得血清中和關(guān)節(jié)腔內(nèi)GPI濃度升高，這是類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎獨(dú)特的自身免疫生理功能。在RA患者高效價(jià)的GPI存在，常伴有嚴(yán)重的關(guān)節(jié)功能受限。提示預(yù)后不良或治療過(guò)程中藥物沒(méi)有起到一定作用。當(dāng)RA患者用藥物治療好轉(zhuǎn)，血清和關(guān)節(jié)腔積液中GPI降低，關(guān)節(jié)腫痛減輕。2001年nature immunology雜志首次發(fā)表文章，從鼠自然生成類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的k/Bx NT細(xì)胞神經(jīng)未稍細(xì)胞基因中得到GPI，然后從人類(lèi)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中也得到相同的GPI，而且在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎所含高濃度抗原都是一致，幾乎完全為GPI同一酵素酶。到2002-2003年世界各國(guó)都對(duì)GPI進(jìn)行類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、消化道癌癥、紅斑狼瘡很多分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究基因克隆和藥物治療等等。但至今未有能直接應(yīng)用于臨床檢測(cè)GPI的診斷試劑或試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種快速、靈敏地定量檢測(cè)人血清或人關(guān)節(jié)腔積液GPI的體外診斷試劑盒及制備方法。
本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問(wèn)題是公開(kāi)上述試劑盒在制備臨床判斷類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)、消化道癌癥和紅斑狼瘡及治療效果試劑中的應(yīng)用。
本發(fā)明GPI診斷試劑盒是以GPI抗原免疫動(dòng)物，得到相應(yīng)的抗人GPI抗血清，采取免疫標(biāo)記吸咐技術(shù)抗原抗體結(jié)合反應(yīng)原理制成的診斷試劑盒。
本發(fā)明所述的GPI抗原是指GPI純蛋白抗原或GPI多肽合成抗原；所述的免疫動(dòng)物包括各種免疫動(dòng)物如綿羊、兔子、豚鼠等。
本發(fā)明GPI診斷試劑盒中采用的GPI抗體是GPI蛋白抗體、GPI多肽抗體或兩種抗體的組合抗體；其中采用GPI蛋白抗體和GPI多肽抗體結(jié)合應(yīng)用可增加測(cè)試靈敏度。
本發(fā)明公開(kāi)的GPI診斷試劑盒的制備包括下列步驟1、抗體制備取健康免疫動(dòng)物，用GPI抗原進(jìn)行免疫，第一次以抗原加卡介苗和福氏佐劑研勻，注射動(dòng)物頸淋巴結(jié)或皮下肌肉組織，每二周一次，共免疫4-5次，抗原量抗原量根據(jù)動(dòng)物體重增減，免疫最后一次的二周后采血，動(dòng)物抗人血清用飽和硫酸銨二級(jí)沉淀后上離子交換層析柱，得到動(dòng)物抗人GPI IgG抗體，測(cè)定效價(jià)，冷凍備用；2、抗體標(biāo)記取GPI IgG抗體采用常規(guī)過(guò)碘酸鈉法標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶；3、包被抗體聚苯乙烯微孔板制備取標(biāo)記的GPI IgG抗體，工作濃度于50mM，pH9.5碳酸鹽條件下加入聚苯乙烯微孔，每孔100微升，并于2-8℃條件放置約40小時(shí)；取出用生理鹽水洗滌5次，烘干，用鋁箔袋密封包裝。
4.其它應(yīng)用試劑(1)包被液0.05mol pH9.5碳酸鹽溶液；(2)洗滌液0.8％氯化鈉-0.05％ Tween 20；(3)稀釋液0.15mol pH7.2磷酸鹽-氯化鈉溶液；(4)顯色緩沖液0.05mol pH5.0磷酸鹽-檸檬酸溶液；(5)顯色劑鄰苯二銨；(6)終止液2mol硫酸溶液。
GPI診斷試劑盒具體操作方法為每次實(shí)驗(yàn)每塊包被抗體聚苯乙烯微孔板設(shè)GPI參考標(biāo)準(zhǔn)品(0、0.16、0.33、1.0、2.0微克/毫升)5孔及空白孔1孔，其余各孔加待檢人血清樣品，每孔加樣100微升。置37℃，保持1小時(shí)，取出用洗滌液洗滌5次，拍干。除空白孔外，其余各孔加酶標(biāo)記抗體100微升。置37℃，保持1小時(shí)，取出用洗滌液洗滌5次，拍干。各孔加底物顯色液100微升。置37℃，保持15分鐘，各孔加終止液50微升。
結(jié)果判斷(1)采用酶標(biāo)檢測(cè)儀，主波長(zhǎng)492nm副波長(zhǎng)630nm，以GPI參考標(biāo)準(zhǔn)品0微克/毫升校零，測(cè)定各孔吸光度值。
(2)以GPI參考標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)示值為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
(3)以待檢各孔的吸光度值查標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得出相應(yīng)的檢測(cè)結(jié)果。
本發(fā)明試劑盒操作簡(jiǎn)便，測(cè)試靈敏，重現(xiàn)性好。經(jīng)大量試驗(yàn)檢測(cè)獲得類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的測(cè)定參考范圍為(以每毫升GPI微克計(jì))0.16微克/ml以下為陰性，0.16微克/ml-0.33微克/ml為可疑，0.33微克/ml為陽(yáng)性。
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。


圖1、實(shí)施例7測(cè)定范圍曲線(xiàn)圖2、GPI標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1、抗體制備取健康雄性的50kg重成年綿羊，用GPI純化蛋白抗原進(jìn)行免疫。第一次以抗原加卡介苗和福氏佐劑研勻，注射綿羊頸淋巴結(jié)和皮下肌肉組織，每二周一次，共免疫4-5次，抗原量5mg/次。免疫最后一次的二周后采血，羊抗人血清用飽和硫酸銨二級(jí)沉淀后上離子交換層析柱，得到羊抗人GPI蛋白IgG抗體，測(cè)定效價(jià)，冷凍備用。
取健康雄性的50kg重成年綿羊，用GPI多肽抗原進(jìn)行免疫。第一次以抗原加卡介苗和福氏佐劑研勻，注射綿羊頸淋巴結(jié)和皮下肌肉組織，每二周一次，共免疫4-5次，抗原量5mg/次。免疫最后一次的二周后采血。羊抗人血清用飽和硫酸銨二級(jí)沉淀后上離子交換層析柱，得到羊抗人GPI IgG多肽抗體，測(cè)定效價(jià)，冷凍備用。
實(shí)施例2、取健康雄性的成年兔子(5kg)，用GPI純化蛋白抗原進(jìn)行免疫。第一次以抗原加卡介苗和福氏佐劑研勻，注射兔子皮下肌肉組織，每二周一次，共免疫4次，抗原量0.5mg/次。免疫最后一次的二周后采血。羊抗人血清用飽和硫酸銨二級(jí)沉淀后上離子交換層析柱，得到兔抗人GPI蛋白IgG抗體，測(cè)定效價(jià)，冷凍備用。
取健康雄性的成年兔子(5kg)，用GPI多肽抗原進(jìn)行免疫。第一次以抗原加卡介苗和福氏佐劑研勻，注射兔子皮下肌肉組織，每二周一次，共免疫4次，抗原量0.5mg/次。免疫最后一次的二周后采血。羊抗人血清用飽和硫酸銨二級(jí)沉淀后上離子交換層析柱，得到兔抗人GPI IgG多肽抗體，測(cè)定效價(jià)，冷凍備用。
實(shí)施例3、取健康雄性的成年豚鼠，用GPI純化蛋白抗原進(jìn)行免疫。第一次以抗原加卡介苗和福氏佐劑研勻，注射豚鼠皮下肌肉組織，每二周一次，共免疫4次，抗原量0.1mg/次。免疫最后一次的二周后采血。羊抗人血清用飽和硫酸銨二級(jí)沉淀后上離子交換層析柱，得到鼠抗人GPI蛋白IgG抗體，測(cè)定效價(jià)，冷凍備用。
取健康雄性的成年豚鼠，用GPI多肽抗原進(jìn)行免疫。第一次以抗原加卡介苗和福氏佐劑研勻，注射豚鼠皮下肌肉組織，每二周一次，共免疫4次，抗原量0.1mg/次。免疫最后一次的二周后采血。羊抗人血清用飽和硫酸銨二級(jí)沉淀后上離子交換層析柱，得到鼠抗人GPIIgG肽抗體，測(cè)定效價(jià)，冷凍備用。
實(shí)施例4、抗體標(biāo)記取實(shí)施例1-3中任一方法獲得的GPI IgG多肽抗體和GPI IgG蛋白抗體各50％采用常規(guī)過(guò)碘酸鈉法標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶，(1)GPI抗體(2mg/ml)0.9ml，加0.1mol pH9.5 NaAc；(2)辣根過(guò)氧化物酶10mg溶解于1.0ml 1.0mmol pH4.0 NaAc。
(3)加0.1mol過(guò)碘酸鈉0.1ml，1.6mmol乙二醇0.1ml于上述辣根過(guò)氧化物酶溶液。
(4)將上述辣根過(guò)氧化物酶溶液與抗體混合攪拌1-2小時(shí)。
(5)加0.1mol四氫硼化鈉0.1ml于4℃靜止30分鐘。
(6)用50％飽和硫酸銨沉淀分離標(biāo)記物。
(7)標(biāo)記物用50％丙三醇——PBS溶解，并于冷凍儲(chǔ)藏。
實(shí)施例5、包被抗體聚苯乙烯微孔板制備取實(shí)施例4獲得的標(biāo)記的GPI IgG抗體，工作濃度于50mM，pH9.5碳酸鹽條件下加入聚苯乙烯微孔，每孔100微升，并于2-8℃條件放置約40小時(shí)。取出用生理鹽水洗滌5次，烘干，用鋁箔袋密封包裝。
實(shí)施例6、GPI試劑盒標(biāo)準(zhǔn)1試劑包被抗體聚苯乙烯微孔板固相抗GPI抗體。
酶標(biāo)記抗體酶標(biāo)記抗GPI抗體、0.15mol pH7.2磷酸鹽-氯化鈉溶液。
洗滌液(10×)8％氯化鈉-0.5％ Tween 20。
顯色緩沖液0.05mol pH5.0磷酸鹽-檸檬酸溶液。
顯色劑鄰苯二銨。
終止液2mol硫酸溶液。
2儀器酶標(biāo)檢測(cè)儀(吸光度測(cè)定精度0.0——2.0A±0.001A)。
3分析方法雙抗體夾心法原理定量測(cè)定(ELISA法)。
4樣品要求人血清或人關(guān)節(jié)腔積液。
5技術(shù)要求
采用酶標(biāo)檢測(cè)儀，主波長(zhǎng)492nm副波長(zhǎng)630nm。
6.計(jì)算方法以GPI參考標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)示值為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
以待檢各孔的吸光度值查標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得出相應(yīng)的檢測(cè)結(jié)果。
7.性能要求7.1物理性狀外觀各液體組份應(yīng)清晰透明，包裝無(wú)滲漏，密封袋無(wú)漏氣。
7.2試劑空白吸光度在主波長(zhǎng)492nm副波長(zhǎng)630nm處，室溫，15分鐘，試劑空白吸光度應(yīng)≤0.15A。
7.3分析靈敏度取GPI標(biāo)準(zhǔn)每毫升0.16微克檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果±20％。
7.4準(zhǔn)確度取GPI標(biāo)準(zhǔn)每毫升0.33微克、檢測(cè)結(jié)果±15％。
7.5精密度1.0微克 CV≤15％。
7.6測(cè)定范圍2.0微克范圍內(nèi)呈線(xiàn)性，線(xiàn)性誤差應(yīng)≤15％，測(cè)定吸光度值與標(biāo)示值的相關(guān)系數(shù)r≥0.99。
8.實(shí)驗(yàn)方法8.1物理性狀目測(cè)試劑盒各組份外觀，結(jié)果應(yīng)符合本標(biāo)準(zhǔn)7.1條款要求。
8.2試劑空白吸光度以含10％小牛血清生理鹽水為空白樣品進(jìn)行檢測(cè)，按規(guī)定操作，以顯色底物空白校零，記錄吸光度，重復(fù)三次取平均值，結(jié)果應(yīng)符合本標(biāo)準(zhǔn)7.2條款要求。
8.3分析靈敏度檢測(cè)GPI標(biāo)準(zhǔn)每毫升0.08微克，重復(fù)三次取平均值，結(jié)果應(yīng)符合本標(biāo)準(zhǔn)7.3條款要求。
8.4準(zhǔn)確度檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品，GPI標(biāo)準(zhǔn)每毫升0.33微克、，重復(fù)三次，取平均值，結(jié)果應(yīng)符合本標(biāo)準(zhǔn)7.4條款要求。
8.5精密度(重復(fù)性)取GPI含量約每毫升1.0微克的血清檢測(cè)進(jìn)行20次測(cè)定(N＝20)，求出20次吸光度變化均值x和標(biāo)準(zhǔn)差S，按下式計(jì)算變異系數(shù)(CV)，結(jié)果應(yīng)符合本標(biāo)準(zhǔn)7.5條款要求。
CV%=Sx‾×100%]]>8.6測(cè)定范圍取GPI標(biāo)準(zhǔn)每毫升0.08微克、0.16微克、0.33微克、1.0微克、2.0微克，每一濃度重復(fù)檢測(cè)三次，取平均值，結(jié)果應(yīng)符合本標(biāo)準(zhǔn)7.6條款要求。
實(shí)施例7、測(cè)試實(shí)例基本參數(shù)采用酶標(biāo)檢測(cè)儀，主波長(zhǎng)492nm副波長(zhǎng)630nm，以GPI參考標(biāo)準(zhǔn)品0微克/毫升校零，測(cè)定各孔吸光度值。
使用方法(1)每次實(shí)驗(yàn)每塊包被抗體聚苯乙烯微孔板設(shè)GPI參考標(biāo)準(zhǔn)品(0、0.16、0.33、1.0、2.0微克/毫升)5孔及空白孔1孔，其余各孔加待檢血清樣品，每孔加樣100微升。置37℃，保持1小時(shí)，取出用洗滌液洗滌5次，拍干。
(2)除空白孔外，其余各孔加酶標(biāo)記抗體100微升。置37℃，保持1小時(shí)，取出用洗滌液洗滌5次，拍干。
(3)各孔加底物顯色液100微升。置室溫避光，保持15分鐘，加終止液50微升，吸光度(OD)0.80查表樣品GPI含量0.52微克/ml。
結(jié)果判斷(1)采用酶標(biāo)檢測(cè)儀，主波長(zhǎng)492nm副波長(zhǎng)630nm，以GPI參考標(biāo)準(zhǔn)品0微克/毫升校零，測(cè)定各孔吸光度值。
(2)以GPI參考標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)示值為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(圖2)。
(3)樣品OD(吸光度)0.80，查標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖，樣品GPI值0.52微克/ml，此患者血清中GPI含量0.52微克/ml，類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎陽(yáng)性。(見(jiàn)圖1)實(shí)施例8、健康9人參考值1、測(cè)定范圍曲線(xiàn)見(jiàn)圖22、精密度1.0微克/ml重復(fù)20次。

3、參考值測(cè)定健康人300例，其參考范圍0.16微克/ml以下為陰性，0.16微克/ml-0.33微克/ml為可疑，0.33微克/ml為陽(yáng)性。
權(quán)利要求
1.GPI抗原酶免疫法體外定量測(cè)定診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒是以GPI抗原免疫動(dòng)物，得到相應(yīng)的抗人GPI抗血清，采取免疫標(biāo)記吸咐技術(shù)制成的診斷試劑盒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于其中所述的GPI抗原是GPI純蛋白抗原或GPI多肽合成抗原。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于其中所述的免疫動(dòng)物為各種免疫動(dòng)物包括綿羊、兔子或豚鼠。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒的制備方法，其特征在于該試劑盒的制備包括下列步驟1)抗體制備取健康免疫動(dòng)物，用GPI抗原進(jìn)行免疫，第一次以抗原加卡介苗和福氏佐劑研勻，注射動(dòng)物頸淋巴結(jié)或皮下肌肉組織，每二周一次，共免疫4-5次，免疫最后一次的二周后采血，動(dòng)物抗人血清用飽和硫酸銨二級(jí)沉淀后上離子交換層析柱，得到動(dòng)物抗人GPI IgG抗體，測(cè)定效價(jià)，冷凍備用；2)抗體標(biāo)記取GPI IgG抗體采用常規(guī)過(guò)碘酸鈉法標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶；3)包被抗體聚苯乙烯微孔板制備取標(biāo)記的GPI IgG抗體，工作濃度于50mM，pH9.5碳酸鹽條件下加入聚苯乙烯微孔，每孔100微升，并于2-8℃條件放置約40小時(shí)；取出用生理鹽水洗滌5次，烘干，用鋁箔袋密封包裝；4)其它應(yīng)用試劑(1)包被液0.05mol pH9.5碳酸鹽溶液；(2)洗滌液0.8％氯化鈉-0.05％Tween 20；(3)稀釋液0.15mol pH7.2磷酸鹽—氯化鈉溶液；(4)顯色緩沖液0.05mol pH5.0磷酸鹽—檸檬酸溶液；(5)顯色劑鄰苯二銨；(6)終止液2mol硫酸溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述試劑盒的制備方法，其特征在于用于包被的標(biāo)記的GPI IgG抗體是GPI蛋白抗體、GPI多肽抗體或兩種抗體的組合抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒在制備臨床判斷類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎及治療效果中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及GPI(葡萄糖6磷酸異構(gòu)酶，Glucose－6－phosphateisomerase)抗原酶聯(lián)免疫法體外定量測(cè)定診斷試劑盒、制備方法及應(yīng)用。GPI診斷試劑盒是以GPI抗原免疫動(dòng)物，得到相應(yīng)的抗人GPI抗血清，采取免疫標(biāo)記吸咐技術(shù)抗原抗體結(jié)合反應(yīng)原理制成的診斷試劑盒。該試劑盒可用于臨床判斷類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)及治療效果。
文檔編號(hào)G01N33/547GK1558239SQ200410016140
公開(kāi)日2004年12月29日 申請(qǐng)日期2004年2月5日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月5日
發(fā)明者劉中令, 陸梅生, 劉穎冰 申請(qǐng)人:上海北加生化試劑有限公司, 劉中令, 陸梅生, 劉穎冰